DE69733353T2

DE69733353T2 - Immunsuppressive wirkstoffe und verfahren

Info

Publication number: DE69733353T2
Application number: DE69733353T
Authority: DE
Inventors: Mao You QI; H. John MUSSER; M. John FIDLER
Original assignee: Pharmagenesis Inc
Current assignee: Pharmagenesis Inc
Priority date: 1996-03-01
Filing date: 1997-02-28
Publication date: 2006-02-02
Anticipated expiration: 2017-03-01
Also published as: CA2248266A1; HK1019444A1; US5663335A; EP0907652A1; JP2001504437A; CN1246121A; CN1133637C; AU2061397A; DK0907652T3; ES2242214T3; ATE296304T1; EP0907652B1; JP4267697B2; WO1997031920A1; WO1997031921A1; DE69733353D1; AU712241B2; AU2125897A; PT907652E; CA2248266C

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen und Verfahren zur Verwendung in der immunsuppressiven und entzündungshemmenden Behandlung und zum Reduzieren der männlichen Zeugungsfähigkeit.
Literatur

Bradley, L., in SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY, W.H. Freeman and Company, San Francisco, S. 162-164 (1980).
Briggs, J.D., Immunol. Lett. 29(1-2):89-94 (1991).
Hasan, R. et al., Transplantation 54:408 (1992).
Kennedy, M.S. et al., Am. J. Med. 78:978 (1983).
Keown, P.A., Clin. Transplants 205-223 (1991).
Kocienski, P.J., PROTECTING GROUPS, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1994).
Kupchan, S.M. et al., J. Am. Chem. Soc. 94:7194 (1972).
Kupchan, S.M. et al., US-Patent Nr. 4,005,108 (1977).
Lipsky, P.E. et al., US-Patent Nr. 5,294,443 (1994).
Ma, P.-C. et al., J. Chin. Pharm. Sci. 1:12 (1992).
Mishell, B. et al., Hrsg., in SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY W. H Freeman and Co., San Francisco, CA (1980).
Morris, R.E., Transplant Proc. 23(6):2722-2724 (1991).
Morris, R.E. et al., Transplant Proc. 23(1):238-240 (1991).
Mossmann, T., J. of Immunological Methods 65:55 (1983).
Murase, N. et al., Transplantation 55:701 (1993).
O'Gara, A. and Defrance, T., in LABORATORY METHODS IN IMMUNOLOGY, Zola, H., Hrsg., CRC Press (1990).
Ono und Lindsey, J. Thor. Cardiovasc. Surg. 57(2):225-29 (1969).
Platt, J.L. et al., Immunology Today 11(12):450 (1990).
Pu, L. et al., Zhongguo Yaoli Xuebao 11:76 (1990).
Roberts, J.P. et al., Ann. Rev. Med. 40:287 (1989).
Schumacher, H.R., Hrsg., in PRIMER ON THE RHEUMATIC DISEASES, Neunte Ausg., Arthritis Foundation, Atlanta, GA (1988).
Storb, R., „Pathophysiology and Prevention of Graft-Versus-Host Disease," in ADVANCES IN IMMUNOBIOLOGY: BLOOD CELL ANTIGENS AND BONE MARROW TRANSPLANTATION, McCullogh, J. und Sandler, S. G., Herausgeber, Alan R. Liss, Inc., New York, S. 337 (1984).
Storb, R., Blood 66:698 (1985).
Storb, R. et al., N. Engl. J. Med. 314:729 (1986).
Thomas, E. D. et al., N. Engl. J. Med. 292:832 (1975).
Wang, J. und Morris, R. E., Transplantation Proc. 23:699 (1991). Weiden, P. L. et al., „Graft-Versus-Host Disease in Allogeneic Marrow Transplantation," in BIOLOGY OF BONE-MARROW TRANSPLANTATION, Gale, R. P. und Fox, C. F., Hrsg., Academic Press, New York, S. 37 (1980).
Zheng, J. et al., Zhongguo Yixue Kexueyuan Xuebao 13:391 (1991).
Zheng, J. et al., Zhongguo Yixue Kexueyuan Xuebao 16:24 (1994).

Hintergrund der Erfindug
Das Immunsystem dient als die Hauptverteidigung des Körpers gegen durch eindringende Organismen verursachte Krankheiten. Dieses komplexe System bekämpft Krankheit durch Abtöten von Eindringlingen wie Bakterien, Viren, Parasiten oder Krebszellen, wohingegen es die normalen Gewebe des Körpers unversehrt lässt. Die Fähigkeit des Immunsystems, die normalen Gewebe des Körpers, oder selbst, von fremdem oder Krebsgewebe, oder nicht-selbst, zu unterscheiden, ist ein wesentliches Merkmal der normalen Funktion des Immunsystems. Ein zweites wesentliches Merkmal ist das Gedächtnis, die Fähigkeit, sich an einen bestimmten fremden Eindringling zu erinnern, und eine gesteigerte Abwehrreaktion aufzubieten, wenn der Eindringling nach einer früheren Begegnung zurückkommt. Der Verlust des Erkennens eines bestimmten Gewebes als selbst und die nachfolgende, gegen das Gewebe gerichtete Immunantwort rufen schwere Krankheit hervor.
Eine Autoimmunerkrankung ergibt sich daraus, dass das Immunsystem die körpereigenen Organe oder Gewebe angreift, was einen klinischen Zustand, verbunden mit der Zerstörung dieses Gewebes, hervorruft. Ein gegen das Gelenkauskleidungs-Gewebe gerichteter Autoimmun-Angriff führt zu rheumatoider Arthritis; ein Angriff gegen die Erregungsleitungsfasern des Nervensystems führt zu multipler Sklerose. Die Autoimmunerkrankungen teilen höchstwahrscheinlich eine gemeinsame Pathogenese und die Notwendigkeit einer sicheren und wirksamen Therapie.
Rheumatoide Arthritis ist eine der häufigsten der Autoimmunerkrankungen. Aktuelle Behandlungen nutzen drei allgemeine Arzneistoffklassen (Schumacher, 1988): entzündungshemmende Arzneimittel (Aspirin, nicht-steroidale Entzündungshemmer und niedrigdosierte Kortikosteroide); krankheitsmodifizierende antirheumatische Arzneistoffe, bekannt als "DMARDs" (Antimalariamittel, Goldsalze, Penicillamin und Sulfasalazin), und Immunsuppressiva (Azathioprin, Chlorambucil, hochdosierte Kortikosteroide, Cyclophosphamid, Methotrexat, Stickstofflost, 6-Mercaptopurin, Vincristin, Hydroxyharnstoff und Cyclosporin A). Keiner der verfügbaren Arzneistoffe ist vollständig wirksam und die meisten sind durch starke Toxizität begrenzt.
Außer ihrer Verwendung bei der Behandlung von Autoimmun-Leiden sind Immunsuppressiva auch bei der Behandlung oder Vorbeugung von Transplantatabstoßung verwendet worden. Organtransplantation, die menschliche Organspender und menschliche Empfänger (Allotransplantate) und nicht-menschliche Primatenspender und menschliche Empfänger (Xenotransplantate) einbezieht, hat beträchtliche medizinische und wissenschaftliche Aufmerksamkeit gefunden (Roberts, 1989; Platt, 1990; Keown, 1991; Wang und Morris, 1991; Hasan, 1992; Murase, 1993). Diese Bemühungen war weitgehend auf die Ausschaltung, oder zumindest Reduktion, des Problems der Abstoßung des transplantierten Organs gerichtet. In Abwesenheit einer ausreichenden immunsuppressiven Therapie wird das transplantierte Organ von dem Wirt-Immunsystem zerstört.
Ein anderes Hindernis bei der Transplantation, welches im Besonderen Knochenmarktransplantate (KMT) begrenzt, ist die Transplantat-Wirt-Erkrankung (GVHD). GVHD ist ein Zustand, in dem transplantierte Knochenmarkzellen die Zellen des Empfängers angreifen (Thomas, 1975; Storb, 1984). Viele KMT-Patienten, die HLA-identisches Knochenmark, das sich in der Lymphocyten-Mischreaktion (MLR) als negativ erweist, erhalten, entwickeln immer noch GVHD, vermutlich wegen einer Disparität zwischen dem Empfänger und Spender bei polymorphen nicht-HLA-Determinanten. Ein großer Teil der an GVHD leidenden Individuen sterben als Folge von GVHD (Weiden et al., 1980).
Derzeit schließen die am häufigsten verwendeten Mittel zur Vorbeugung von Transplantatabstoßung Kortikosteroide, Antimetaboliten, die die Lymphocytenproliferation durch Hemmen der DNA- und RNA-Synthese reduzieren, wie Azathioprin, immunsuppressive Arzneistoffe wie Cyclosporin A, das speziell die T-Zell-Aktivierung hemmt, und spezifische Antikörper, die gegen T-Lymphocyten oder Oberflächenrezeptoren, die deren Aktivierung vermitteln, gerichtet sind, ein (Briggs, 1991; Kennedy, 1983; Storb, 1985; Storb et al., 1986). Alle diese Arzneistofftherapien sind in der Wirksamkeit begrenzt, zum Teil weil die zur wirksamen Behandlung von Transplantatabstoßung benötigten Dosen die Anfälligkeit des Patienten für Infektionen durch eine Vielfalt von opportunistischen Eindringlingen erhöhen und zum Teil wegen direkter Toxizität und anderen Nebenwirkungen. Beispielsweise ist Cyclosporin A, gegenwärtig das am häufigsten verwendete Mittel, signifikant toxisch für die Niere. Diese Nephrotoxizität begrenzt die Menge an Arzneistoff, die sicher gegeben werden kann.
Vor kurzem ist für eine Reihe von Verbindungen aus der chinesischen Heilpflanze Tripterygium Wilfordii (TW) immunsuppressive Wirkung nachgewiesen worden. Repräsentative Verbindungen, die aus TW isoliert worden sind, schließen Triptolid, 16-Hydroxytriptolid, Triptophenolid, Tripdiolid und Celastrol, wie beispielsweise in Lipsky et al. (1994) und Zheng et al. (1991; 1994) beschrieben, ein. Jedoch waren die Verabreichung und therapeutische Wirksamkeit dieser Verbindungen durch ihre geringe Wasserlöslichkeit begrenzt.
Eine Methode zur Verbesserung der Wirksamkeit dieser Verbindungen ist, sie in Gemischen aus Ethanol und polyethoxyliertem Rizinusöl (z.B. „CREMOPHOR EL") zu formulieren, was nachfolgende Verdünnung in physiologischer Kochsalzlösung zur intravenösen Verabreichung erlaubt. Jedoch haben solche Formulierungen unter der hohen Toxizität, bedingt durch die hohe Konzentration an Lösungsvermittler, die erforderlich ist, um diese Verbindungen zu lösen, gelitten. Beispielsweise ist das Verhältnis von Lösungsvermittler (Ethanol plus „CREMOPHOR EL") zu Triptolid in solchen Formulierungen typischerweise in der Größenordnung von 1000:1 oder größer, bedingt durch die schlechte Löslichkeit von Triptolid (Morris, 1991; Morris et al., 1991). Die Standardisierung von Dosierungsmengen ist bei einer Suspension auch problematischer als bei einer Lösung.
Es wäre deshalb wünschenswert, immunsuppressive Verbindungen mit verbesserter Wasserlöslichkeit und geringer Toxizität bereitzustellen. Außerdem wäre es wünschenswert, dass solche Verbindungen in ihrer wasserlöslichen Form immunsuppressive Wirkung entfalten oder dass sie durch Stoffwechselprozesse in vivo in eine immunsuppressive Form umwandelbar sind. Es wäre weiterhin wünschenswert, Verbindungen mit verbesserter Wasserlöslichkeit bereitzustellen, die als Mittel gegen Zeugungsfähigkeit verwendbar sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung schließt, in einer Ausführungsform, eine Verbindung mit der Struktur der nachstehenden Formel 1
ein,
wobei X¹ OH oder OR¹ ist, und X² und X³ unabhängig OH, OR¹ oder H sind, mit der Maßgabe, dass mindestens ein Rest aus X¹, X² und X³ OR¹ ist und mindestens ein Rest aus X² und X³ H ist; und
R¹ -C(O)-Y-Z ist, wobei
Y eine verzweigte oder unverzweigte C₁-C₆-Alkyl- oder Alkenylkette ist; und
Z COOR², NR³R^3' oder ⁺NR⁴R^4'R^4'' ist, wobei R² ein Kation ist; R³ und R^3' unabhängig H oder verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₆-Alkyl, Hydroxyalkyl oder Alkoxyalkyl sind, oder R³ und R^3' zusammengenommen einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring bilden, dessen Ringatome aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt sind, wobei die Ringatome 2 bis 6 Kohlenstoffatome, ein oder mehrere Stickstoffatome und gegebenenfalls ein oder mehrere Sauerstoff- oder Schwefelatome einschließen und wobei der Ring unsubstituiert ist oder mit einem oder mehreren aus R⁵, OR⁵, NR⁵R⁶, SR⁵, NO₂, CN, C(O)R⁵, C(O)NR⁵R⁶, OC(O)R⁵, OC(O)NR⁵R⁶ und Halogen (Fluor, Chlor, Brom oder Iod) ausgewählten Resten substituiert ist, wobei R⁵ und R⁶ unabhängig Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkenyl sind; und R⁴, R^4' und R^4'' unabhängig verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₆-Alkyl, Hydroxyalkyl oder Alkoxyalkyl sind.
In einer allgemeinen Ausführungsform ist die Verbindung ein Derivat von Triptolid, wobei X₁ OH oder OR₁ mit vorstehend angegebener Bedeutung ist und X² und X³ H sind. In einer zweiten allgemeinen Ausführungsform ist die Verbindung ein Derivat von 16-Hydroxytriptolid, wobei X₁ und X₃ OH oder OR₁ sind und X₂ H ist. In einer dritten allgemeinen Ausführungsform ist die Verbindung ein Derivat von Tripdiolid (2-Hydroxytriptolid), wobei X₁ und X₂ OH oder OR₁ sind und X³ H ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist Z COOH oder COOR², wobei R² ein Metallion ist, vorzugsweise Na⁺ oder K⁺. In einer alternativen Ausführungsform ist R² ein positiv geladenes Amin, vorzugsweise Lysin, Triethylamin oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan. Vorzugsweise ist R² Na⁺, Tris(hydroxymethyl)aminomethan oder Lysin und Y ist eine C₁-C₄-Alkylkette.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist Z NR³R^3', wobei R³ und R^3' unabhängig H oder verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₆-Alkyl sind oder zusammen einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring bilden, der 2 bis 6 Kohlenstoffatome, ein oder mehrere Stickstoffatome und gegebenenfalls ein oder mehrere Sauerstoff- oder Schwefelatome enthält. Vorzugsweise ist Z Dimethylamino, Diethylamino oder N-Morpholino und Y ist eine C₁-C₄-Alkylkette.
Wo Z eine quartäre oder protonierte tertiäre Aminogruppe ist, schließt die Verbindung auch ein anionisches Gegenion ein. Das anionische Gegenion ist vorzugsweise ein Halogenid oder ein Carboxylat-, Sulfonat, oder Sulfat-enthaltendes Ion. Stärker bevorzugt ist das Gegenion Chlorid, Bromid, Acetat, Oxalat, Maleat, Fumarat, Methansulfonat oder Toluolsulfonat.
In einer anderen Ausführungsform schließt die Erfindung ein Verfahren zum Bewirken von Immunsuppression bei einem Patienten ein, wobei eine Zusammensetzung, wie vorstehend beschrieben, an einen Patienten verabreicht wird, der einer solchen Behandlung bedarf. Das Verfahren ist zur Hemmung von Allotransplantat-Abstoßung, Xenotransplantat-Abstoßung und Transplantat-Wirt-Erkrankung verwendbar und bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und das Verfahren sind auch für die Behandlung von Asthma, sowohl von intrinsischen als auch extrinsischen Manifestationen, verwendbar. Zur Behandlung von Asthma wird die Zusammensetzung vorzugsweise durch Inhalation verabreicht. Die Zusammensetzung und das Verfahren können auch zur Behandlung von anderen entzündlichen Beschwerden wie posttraumatischer Entzündung, einschließlich begleitender posttraumatischer Entzündung bei Kopf- oder Halsverletzung, verwendet werden.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Reduzieren der männlichen Zeugungsfähigkeit bei einem männlichen Säuger, insbesondere Menschen, durch Verabreichen einer Verbindung gemäß vorstehender Formel 1 an den Säuger in einer Menge, die wirksam ist, die Zeugungsfähigkeit des Säugers zu hemmen, bereit.
In anderen Ausführungsformen schließt die Erfindung Arzneimittel und Medikamente zur immunsuppressiven Behandlung, entzündungshemmenden Behandlung und zum Reduzieren der männlichen Zeugungsfähigkeit ein. Solche Zusammensetzungen schließen eine Verbindung gemäß vorstehender Formel 1 in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel ein. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Vehikel ein wässriger Träger.
Diese und andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden vollständiger offenbar werden, wenn die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Schema zur Herstellung einer erfindungsgemäßen carboxylgruppenhaltigen Triptolidverbindung;
2 zeigt ein Schema zur Herstellung von erfindungsgemäßen Aminoderivaten von Triptolid;
3 zeigt ein Schema zur Herstellung von Mono- und Diaminoesterderivaten von 16-Hydroxytriptolid;
4 zeigt ein Schema zur Herstellung eines 14-Aminoesterderivats von 16-Hydroxytriptolid mittels Schützen und Entschützen der 16-Hydroxylgruppe;
5A zeigt ein Diagramm der Überlebenszeit eines Allotransplantats für unbehandelte Tiere (gefüllte Quadrate) und für Tiere, die mit zwei unterschiedlichen Mengen an Triptolidsuccinattris(hydroxymethyl)aminomethansalz (YM-273) behandelt wurden (offene und gefüllte Kreise);
5B zeigt ein Diagramm der Überlebenszeit eines Allotransplantats für unbehandelte Tiere (gefüllte Quadrate) und für Tiere, die mit zwei unterschiedlichen Mengen von Triptolidsuccinatnatriumsalz (YM-274) behandelt wurden (offene und gefüllte Dreiecke);
6 zeigt ein Diagramm der Überlebenszeit eines Allotransplantats für unbehandelte Tiere (gefüllte Quadrate) und für Tiere, die mit Triptolid (T10, offene Quadrate), Triptolidsuccinattris(hydroxymethyl)aminomethansalz (YM-273, gefüllte Kreise) und Triptolidsuccinatnatriumsalz (YM-274, gefüllte Dreiecke) behandelt wurden;
7 zeigt die Wirkung des Behandelns von männlichen Mäusen mit variierenden Dosen an Triptolidsuccinat (YM-272) auf das Hodengewicht (mittlere und rechte Säule), verglichen mit unbehandelten Mäusen (linke Säule), wobei der Mittelwert (schattierte Bereiche) und die Standardabweichung des Mittelwerts (SA, leere Bereiche) für Gruppen von 5-6 Mäusen gezeigt werden; und
8 zeigt die Wirkung des Behandelns von männlichen Mäusen mit variierenden Dosen an Triptolidsuccinat (YM-272) auf die vergangene Zeit vom Beginn des Zusammenlebens bis zur ersten Geburt von Nachkommen, verglichen mit unbehandelten Mäusen, wobei der Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwerts (SA) für Gruppen von 5 Mäusen gezeigt werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Die nachstehenden Begriffe haben die folgenden Bedeutungen, sofern nicht anders angegeben.
„Triptolidderivate" oder „Triptolidanaloga" bezeichnet Derivate von Triptolid, 16-Hydroxytriptolid und Tripdiolid (2-Hydroxytriptolid), die an einer oder mehreren Hydroxylgruppen, wie vorstehend beschrieben, derivatisiert sind.
„Alkyl" bezeichnet ein vollständig gesättigtes, monovalentes oder divalentes Radikal, das Kohlenstoff und Wasserstoff enthält und welches cyclisch, verzweigt oder eine gerade (unverzweigte) Kette sein kann. Beispiele für Alkylreste sind Methyl, Ethyl, n-Butyl, n-Heptyl, Isopropyl, 2-Methylpropyl, Cyclopropyl, Cyclopropylmethyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclopentylethyl und Cyclohexyl.
„Niederalkyl" bezeichnet ein Alkylradikal von ein bis vier Kohlenstoffatomen, wofür Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl und t-Butyl als Beispiel dienen.
„Alkenyl" bezeichnet ein monovalentes oder divalentes, ungesättigtes, vorzugsweise monoungesättigtes, Radikal, das Kohlenstoff und Wasserstoff enthält und welches cyclisch, verzweigt oder eine gerade Kette sein kann. „Niederalkenyl" bezeichnet ein solches Radikal mit ein bis vier Kohlenstoffatomen.
„Ein 5- bis 7-gliedriger heterocyclischer Ring, dessen Ringatome aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt sind, wobei die Ringatome 2 bis 6 Kohlenstoffatome und ein oder mehrere Stickstoffatome einschließen", bezeichnet einen heterocyclischen Ring, dessen Ringatome ein oder mehrere Stickstoffatome und gegebenenfalls ein oder mehrere Sauerstoff- oder Schwefelatome einschließen. Beispiele sind Piperidin, Piperazin, Morpholin, Pyrrolidin, Thiomorpholin und Imidazol.
„Alkoxyalkyl" bezeichnet einen Alkylrest mit vorstehend angegebener Bedeutung, der zusätzlich einen Alkoxysubstituenten enthält. Vorzugsweise ist der Alkylanteil des Alkyloxysubstituenten ein Niederalkylrest.
Der Begriff „Säuger" soll seine gewöhnliche Bedeutung haben und schließt Menschen, Hunde, Katzen, Kühe, Schafe, Mäuse, Ratten und dergleichen ein.
Für den Zweck der aktuellen Offenbarung wird für Triptolid und Triptolidanaloga das folgende Nummerierungs-Schema verwendet:
II. Synthese der Triptolidanaloga
Dieser Abschnitt beschreibt die Synthese von erfindungsgemäßen Verbindungen, wie durch vorstehende Formel 1 definiert. Im Allgemeinen sind die Verbindungen Esterderivate von Triptolid, Tripdiolid oder 16-Hydroxytriptolid, wobei die angefügten Estersubstituenten ein oder mehrere Amino- oder Carboxylatgruppen einschließen. Die Verbindungen besitzen größere Wasserlöslichkeit als die nicht-derivatisierten Ausgangsverbindungen und sind als Prodrugs für immunsuppressive, entzündungshemmende Anwendungen und Anwendungen gegen die männliche Zeugungsfähigkeit verwendbar.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können aus Triptolid, Tripdiolid oder 16-Hydroxytriptolid, erhalten aus dem Wurzelxylem der chinesischen Heilpflanze Tripterygium Wilfordii (TW) oder aus anderen bekannten Quellen, hergestellt werden. Die TW-Pflanze wird in der Provinz Fujiang und anderen südlichen Provinzen von China gefunden; TW-Pflanzenmaterial kann generell in China erhalten werden oder über Handelsquellen in den Vereinigten Staaten. Verfahren zur Herstellung von Triptolid, Tripdiolid und 16-Hydroxytriptolid sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden beispielsweise bei Kupchan et al. 972), Kupchan et al. (1977), Lipsky et al. (1994), Pu et al. (1990) und Ma et (1al. (1992) beschrieben.
Syntheseschemata zur Herstellung erfindungsgemäßer carboxylgruppenhaltiger Derivate von Triptolid werden in 1 gezeigt. Mit Bezug auf den in der Abbildung gezeigten oberen Reaktionsweg wird Triptolid (1) mit einem Überschuss einer Dicarbonsäure der Form HO₂C(CH₂)_mCO₂H, wobei m 1 bis 4 ist, in Gegenwart eines Kupplungsmittels wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und einer katalytischen Menge eines Acylierungskatalysators wie 4-(Dimethylamino)pyridin (DMAP) umgesetzt. Die Reaktionsbedingungen sind wirksam, eine oder beide Carboxylatgruppen in der Dicarbonsäure für die Umsetzung mit der 14-Hydroxylgruppe von (1) zu aktivieren, so dass das Esterprodukt (2) gebildet wird. Restliches, an die freie Carboxylgruppe in (2) angelagertes DCC kann durch die Zugabe von Wasser freigesetzt werden, vorzugsweise unter basischen Bedingungen.
Ein zweites Verfahren zur Herstellung carboxylgruppenhaltiger Derivate von (1) wird in dem unteren Reaktionsweg in 1 gezeigt. Bei dieser Methode wird (1) mit einem ausgewählten Dicarbonsäureanhydrid umgesetzt, unter Bedingungen, die wirksam sind, dass die 14-Hydroxylgruppe von (1) eine der Anhydrid-Carbonylgruppen angreift, um Produkt (2) hervorzubringen. Beispielhafte Bedingungen für diese Methode können in Beispiel 1 gefunden werden.
Allgemeiner gesagt können die in 1 veranschaulichten Verfahren verwendet werden, um Triptolidderivate gemäß vorstehender Formel 1, wobei X₂ und X₃ H sind und X₁ -C(O)Y-Z (d.h. R₁ in Formel 1) ist, wobei Y eine verzweigte oder unverzweigte C₁-C₆-Alkyl- oder -Alkenylkette ist und Z COOR² ist, wobei R² ein Kation ist, herzustellen.
2 veranschaulicht ein Verfahren zur Herstellung von Aminoesterderivaten von Triptolid. Triptolid (1) wird mit einer Amin-substituierten Carbonsäure, R_NCO₂H, in Gegenwart eines Kupplungsmittels (z.B. DCC) und eines Acylierungskatalysators (z.B. DMAP) umgesetzt. Diese Reaktionsbedingungen können verwendet werden, um eine Reihe von Amino-Derivaten herzustellen, je nach dem Aminosäure-Ausgangsmaterial. Beispielsweise liefert Umsetzung von (1) mit N,N-Dimethylglycin das Esterprodukt (3a), wie in 2 gezeigt und in Beispiel 5 beschrieben. Gleichermaßen liefert Umsetzung von (1) mit 3-(N,N-Diethylamino)propionsäure, 4-Pyrrolidinobuttersäure oder 5-Morpholinopentansäure Produkt (3b), (3c) oder beziehungsweise (3d), wie in Beispielen 7-9 ausführlich beschrieben. Erfindungsgemäße Aminsalze werden durch Behandlung mit einer ausgewählten Säure, wie in Beispiel 6, oder durch Verwendung einer Ammoniumsalzform von R_NCO₂H in dem Kupplungsschritt wie in Beispielen 7 und 8 ohne weiteres hergestellt.
Somit ist ersichtlich, dass die Methode in 2 verwendet werden kann, um Aminoderivate gemäß Struktur (3) in 2 durch Verwendung der geeigneten Ausgangsmaterialien herzustellen, wobei R_N die Form Y-Z hat, wie in der Zusammenfassung der Erfindung definiert, Y eine verzweigte oder unverzweigte C₁-C₆-Alkyl- oder -Alkenylkette ist, Z NR³R^3' oder ⁺NR⁴R^4'R^4'' ist, R³ und R^3' unabhängig H oder verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₆-Alkyl, Hydroxyalkyl oder Alkoxyalkyl sind oder zusammengenommen einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring bilden, der 2 bis 6 Kohlenstoffatome, ein oder mehrere Stickstoffatome und gegebenenfalls ein oder mehrere Sauerstoff- oder Schwefelatome enthält und wobei der Ring unsubstituiert ist oder mit einem oder mehreren aus R⁵, OR⁵, NR⁵R⁶, SR⁵, NO₂, CN, C(O)R⁵, C(O)NR⁵R⁶, OC(O)R⁵, OC(O)NR⁵R⁶ und Halogen (Fluor, Chlor, Brom oder Iod) ausgewählten Resten substituiert ist, wobei R⁵ und R⁶ unabhängig Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkenyl sind; und R⁴, R^4' und R^4'' unabhängig verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₆-Alkyl, Hydroxyalkyl oder Alkoxyalkyl sind. In dem Fall, in dem Z NR³R^3' ist, wobei R³ und R^3' zusammen einen heterocyclischen Ring bilden, schließen bevorzugte Ringeinheiten Morpholin, Piperidin, Pyrrolidin und Piperazin ein.
Überdies, obwohl 1 und 2 Reaktionsschemata veranschaulichen, die Triptolid als Ausgangsmaterial verwenden, ist es selbstverständlich, dass ähnliche Synthese-Reaktionsschemata verwendet werden können, um entsprechende Esterderivate von 16-Hydroxytriptolid und Tripdiolid herzustellen.
3 veranschaulicht Synthesemethoden zur Herstellung von Mono- und Diesterderivaten von 16-Hydroxytriptolid (4), einer Verbindung, die zwei freie Hydroxylgruppen enthält. Wie aus der Abbildung gesehen werden kann, enthält Verbindung (4) eine Hydroxylgruppe an der 14-Position, welche an ein sekundäres Kohlenstoffatom gebunden ist, und eine zweite Hydroxylgruppe an der 16-Position, welche an ein primäres Kohlenstoffatom gebunden ist. Da die Hydroxylgruppe an der 16-Position aus sterischen Gründen reaktiver ist als die 14-Hydroxylgruppe, können Mono- und Diesterderivate unter Verwendung geeigneter Reaktionsbedingungen selektiv hergestellt werden.
Wie in dem oberen Reaktionsweg von 3 gezeigt, ergibt Umsetzung von (4) mit einer stöchiometrischen Menge einer ausgewählten Carbonsäure den an der 16-Position derivatisierten Monoester (5), während die 14-Hydroxylgruppe frei bleibt. Im Gegensatz dazu ist, wie in dem unteren Reaktionsweg gezeigt, Umsetzung von (4) mit einem Überschuss der Carbonsäure wirksam, um beide Hydroxylgruppen zu derivatisieren, was den Diester (6) liefert.
Monoesterderivate von 16-Hydroxytriptolid (4) an der 14-Position, eher als an der 16-Position, können mit der in 4 gezeigten allgemeinen Methode hergestellt werden. Diese Methode nutzt die größere Reaktivität der 16-Hydroxylgruppe gegenüber Elektrophilen aus, wodurch die 16-Hydroxylgruppe selektiv mit einer Schutzgruppe (PRT) geschützt werden kann, wie in dem ersten Schritt von 4 gezeigt. Die geschützte Verbindung (7) wird danach mit einer ausgewählten Carbonsäure (RCO₂H) umgesetzt, um die 14-Hydroxylgruppe zu verestern, was Verbindung (8) bildet. Die Schutzgruppe wird danach durch Entschützen entfernt, um den gewünschten 14-Monoester (9) zu ergeben. Geeignete Hydroxyl-Schutzgruppen für die Zwecke des Schützen/Entschützen-Schemas in 4 sind bekannt und werden beispielsweise von Kocienski (1994) beschrieben. Eine bevorzugte Schutzgruppe ist ein Benzylether, der durch katalytische Hydrierung entfernt werden kann (Kocienski, 1994, S. 46). Wahlweise kann ein t-Butyldimethylsilylether verwendet werden. Dieser Rest kann z.B. durch Behandlung mit Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) entfernt werden.
Selektive einfache Derivatisierung von Tripdiolid (2-Hydroxytriptolid) ist wegen der ähnlichen Reaktivität der zwei sekundären Hydroxylgruppen schwieriger. Demgemäß können die 2- und 14-Monoester als ein Gemisch hergestellt werden, entweder durch (1) Umsetzen von Tripdiolid mit einer vergleichbaren Menge an Carbonsäure (z.B. 1 bis 3 Äquivalente) oder (2) kurzes Umsetzen von Tripdiolid mit überschüssiger Carbonsäure, schnell gefolgt von Zugabe überschüssigen Alkohols (z.B. Ethanol), um die überschüssige Carbonsäure zu quenchen. In beiden Fällen kann ein Gemisch aus Mono- und Diesterformen erhalten werden, welche danach mit chromatographischen Standardverfahren wie HPLC getrennt werden können.
Metallsalze und Aminsalze der erfindungsgemäßen Amino- und Carboxylester-Verbindungen werden durch Umsetzung mit oder Austausch gegen ein geeignetes Gegenion ohne weiteres hergestellt, wie in Beispielen 2-4 und 6 beschrieben. Im Fall der Carboxylester-Verbindungen wie (2) schließen geeignete Gegenionen Natrium- und Kaliumionen ein sowie organische Amine wie Mono-, Di-, Tri- oder Tetraalkylamine, wobei die Alkylreste Niederalkyl- oder -Alkoxyreste sind.
III. Stabilität der Triptolidderivate
Natrium-Triptolidsuccinat, bezeichnet als YM-274, wurde in D₂O gelöst und die wässrige Lösung wurde bei Raumtemperatur gelagert. Protonen-NMR-Spektren wurden in Intervallen aufgenommen, wie in Beispiel 10A beschrieben, und zeigten, dass die Verbindung nach drei Monaten in Lösung unverändert war. Nach fünf Monaten wurde eine gewisse Zersetzung beobachtet.
Die Stabilität von Triptolidsuccinat in Blutserum wurde bestimmt, wie in Beispiel 10B ausführlich beschrieben. In dieser Untersuchung wurde eine Lösung von Triptolidsuccinat (YM-262, freie Säure) in DMSO mit Rattenserum gemischt und bei 37°C inkubiert. Das Gemisch wurde periodisch mit Dünnschichtchromatographie (DC) geprüft, um die Hydrolyse des Triptolidsuccinats über die Zeit zu verfolgen. Innerhalb der ersten 3 bis 5 Minuten blieb das meiste des Triptolidsuccinats erhalten (R_f =0,45). Nach 15 Minuten war der Triptolidsuccinatfleck weggegangen und ein neuer Fleck, der Triptolid entspricht, war aufgetaucht (R_f = 0,60). Zuletzt, nach 45 Minuten, war der Triptolidfleck auch verschwunden und nur Material mit niedrigem R_f-Wert (Bestandteile des Blutserums und Zersetzungsprodukte) blieb übrig. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Triptolidester im Serum hydrolisiert wird und das freie Triptolid in weniger als einer Stunde freisetzt.
IV. Biologische Aktivität
Eine Reihe von erfindungsgemäßen Succinatsalzderivaten wurde unter Verwendung mehrerer biologischer Tests auf immunsuppressive Wirkung untersucht. Die getesteten Verbindungen waren carboxylgruppenhaltige Ester von Triptolid, hergestellt durch Succinylierung von Triptolid, gefolgt von Salzbildung, wie in Beispielen 1 bis 4 ausführlich beschrieben, mit den folgenden Bezeichnungen: freie Säure, YM-262; Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)-Salz, YM-273; Natriumsalz, YM-274 und L-(+)-Lysinsalz, YM-276. Triptolidsuccinat (freie Säure, YM-262) wurde auch auf Wirkungen gegen die Zeugungsfähigkeit getestet.
A. Hemmung der IL-1-Wirkung
Die Fähigkeit der vorstehenden Verbindungen, die zellproliferative Wirkung von IL-1β in vitro zu unterdrücken (O'Gara, 1990), wurde untersucht, wie in Beispiel 11 beschrieben. Mausthymocyten in Kultur wurden mit IL-1β in Gegenwart von Phytohämagglutinin (PHA) und steigenden Konzentrationen von Triptolid (Kontrolle) und Triptolidderivaten stimuliert. Die Zellen wurden für 72 Stunden kultiviert und während der letzten 18 Stunden mit tritiummarkiertem Thymidin inkubiert. Die DNA-Synthese wurde durch Messen des Einbaus von radiomarkiertem Thymidin bewertet. Die Ergebnisse, ausgedrückt als IC₅₀ (Konzentration, die wirksam ist, 50% Unterdrückung der Proliferation zu bewirken), werden in Tabelle I gezeigt.
Tabelle I: IL-1-Test
Mit Bezug auf Säule 3 in Tabelle I zeigte Triptolid einen IC₅₀-Wert von etwa 0,005 nMol/ml, was darauf hindeutet, das die freie (underivatisierte) Verbindung ein potenter Hemmstoff der IL-1β-Wirkung ist. Die freie Säure und Salzformen des Triptolid-l4-succinylesters zeigten in diesem in-vitro-Test IC₅₀-Werte, die annähernd 45- bis 150-fach höher waren, als die des freien Triptolids. Alle Esterderivate zeigten geringe Zytotoxizität (Tabelle II, Säule 4), wie mit dem MTT-Test (Beispiel 13) gemessen.
B. Lymphocyten-Mischreaktion (MLR)
Hemmung der Zellproliferation durch die vorliegenden Verbindungen wurde in der Lymphocyten-Mischreaktion (MLR) (Bradley, 1980; Mishell, 1980) getestet. Milzzellen von weiblichen C57BL/6-Mäusen, die „Responder"-Zellen, wurden präpariert und alleine oder in Gegenwart variierender Konzentrationen der Testverbindungen mit von weiblichen Balb/C-Mäusen präparierten, bestrahlten Milzzellen, den „Stimulator"-Zellen, co-kultiviert. Vorherige Bestrahlung der Stimulatorzellen machte es ihnen unmöglich zu proliferieren. Eine Probe der Responderzellen wurde auch bestrahlt, zur Verwendung als eine Kontrolle. Die nicht-bestrahlten Responderzellen proliferieren in Gegenwart der allogenen Stimulatorzellen. Nach einer 78-stündigen Inkubation wurde tritiummarkiertes Thymidin zu den gemischten Zellkulturen zugegeben und der Einbau des markierten Nucleotids in die DNA wurde als Index der Zellproliferation gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle II gezeigt.
Tabelle II: MLR-Test
Wie gesehen werden kann, waren die Daten in diesem in-vitro-Test insofern qualitativ ähnlich zu den mit dem IL-1-Test in vorstehender Tabelle I erhaltenen Werten, als dass die freie Säure und die Salzformen des Triptolid-l4-succinylesters IC₅₀-Werte zeigten, die annähernd 40- bis 125-fach höher waren als die des freien Triptolids. Wie in Tabelle II gezeigt, zeigten alle Esterderivate geringe Zytotoxizität und viel geringere Toxizität als das freie Triptolid, wie mit dem MTT-Test (Beispiel 13) gemessen.
C. Überleben eines Herz-Allotransplantats
Die erfindungsgemäße Behandlung von Transplantatabstoßung wird für Abstoßung eines Allotransplantats durch das in Beispiel 14 verwendete in-vivo-Herztransplantationsmodell veranschaulicht. Das Verfahren bezieht ein gut charakterisiertes Rattenmodellsystem (Ono und Lindsey, 1969) ein, in dem ein transplantiertes Herz an den großen Bauchgefäßen eines allogenen Empfängertiers angebracht wird und die Lebensfähigkeit des transplantierten Herzens durch die Fähigkeit des Herzens, in dem Empfängertier zu schlagen, beurteilt wird.
In einer Untersuchung wurde den Tieren von einem Tag vor bis 14 Tage nach Herztransplantation entweder Kontroll-Lösung (5% Ethanol, 10 ml/kg), Triptolid (bezeichnet als T10) oder jeweils zwei Konzentrationen von YM-273 und YM-274 durch intraperitoneale Injektionen verabreicht. Es gab drei Tiere in jeder Gruppe, außer der Kontrollgruppe, in der fünf Tiere verwendet wurden. Die Ergebnisse werden in 5A und 5B gezeigt.
Wie aus 5A gesehen werden kann, gab YM-273 bei einer Dosierungshöhe von 0,1 mg/kg (offene Kreise) eine mittlere Überlebenszeit von 7 Tagen, ähnlich wie die mit der Kontrollgruppe erhaltenen Ergebnisse. Jedoch zeigte eine Dosierung von 0,4 mg/kg (gefüllte Kreise) eine wesentliche Verbesserung gegenüber der Kontrolle, mit einer mittleren Überlebenszeit von 24 Tagen.
Mit Bezug auf 5B, gab YM-274, mit einer Dosierungshöhe von 0,0837 mg/kg (offene Dreiecke) verabreicht, eine mittlere Überlebenszeit von 10 Tagen, wohingegen eine Dosierung von 0,33 mg/kg (gefüllte Dreiecke) eine mittlere Überlebenszeit von annähernd 50 Tagen gab.
6 vergleicht die immunsuppressive Wirkung der höheren Dosen von YM-273 und YM-274, vorstehend beschrieben, mit äquivalenten Dosen (auf molarer Basis) von Triptolid (T-10). Wie gesehen werden kann, war die erhaltene mittlere Überlebenszeit im Anschluss an Verabreichung der Succinatderivate YM-273 (Tris-Salz) ein bisschen besser als die mit dem underivatisierten Triptolid gesehene und war wesentlich besser (50 ± 7 Tage) im Fall des Succinatderivats YM-274 (Natriumsalz).
Die vorstehenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass die erfindungsgemäßen wasserlöslichen Esterverbindungen signifikante immunsuppressive Wirkung in vivo aufweisen. Wie in vorstehendem Abschnitt III beschrieben, wurde Triptolidsuccinat im Blutserum innerhalb von etwa 15 Minuten zu Triptolid hydrolisiert. Es ist wahrscheinlich, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen dadurch als Prodrugs dienen, dass die Esterreste in vivo abgespalten werden, um die aktivere, underivatisierte Triptolidverbindung hervorzubringen.
D. Hemmung der männlichen Zeugungsfähigkeit
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch wirksam beim Reduzieren oder Hemmen männlicher Zeugungsfähigkeit, wobei Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung an einen männlichen Säuger wirksam ist, die Potenz des männlichen Samens zu reduzieren, wodurch die Befruchtung reduziert oder blockiert wird. Triptolidsuccinat (YM-262) wurde auf Hemmung der Zeugungsfähigkeit bei männlichen BDF1-Mäusen gemäß den in Beispiel 15 beschriebenen Protokollen getestet. Die Verbindung wurde intraperitoneal (i.p.) in einer physiologischen Kochsalzlösung unter Verwendung eines Zyklus von täglicher Verabreichung für 5 Tage, gefolgt von einer zweitägigen Einstellung der Behandlung, verabreicht. Die Dosishöhen betrugen 0,04 oder 0,13 mg/kg/Tag. Der Zyklus wurde vor Beurteilung der physiologischen Wirkungen (Hodengewicht) und der reproduktiven Leistung für 5 Wochen wiederholt.
Wie in 7 gezeigt, brachte Verabreichung von 0,13 mg/kg/Tag von YM-262 gemäß dem vorstehenden Zeitplan eine Reduktion des Hodengewichts von annähernd 13% im Vergleich zur mit physiologischer Kochsalzlösung behandelten Gruppe hervor.
Die Wirkung der Verbindung auf die Zeugungsfähigkeit wurde mit Gruppen von fünf männlichen Mäusen, die gemäß dem gleichen Zeitplan behandelt wurden, getestet. Jedes Männchen wurde mit zwei Weibchen untergebracht, beginnend an Tag 32, nach Beendigung der YM-262-Behandlung.
Die Zeit vom Beginn des Zusammenlebens bis zur Geburt der Würfe wird in 8 gezeigt. Die mit physiologischer Kochsalzlösung behandelte (Kontroll-) Gruppe brachte den ersten Wurf nach einem Mittelwert von 24 Tagen hervor, vier Tage länger als der erwartete Trächtigkeitszeitraum (etwa 20 Tage), wie für die physiologische Kochsalzlösungs-Kontrollgruppe festgestellt. Der Wert für die Gruppe, die YM-262 mit 0,04 mg/kg/Tag erhielt, betrug 28 Tage (eine 17%ige Verzögerung), was auf einen annähernd viertägigen Zeitraum unproduktiver Paarung hindeutet. Für die Gruppe, die YM-262 mit 0,13 mg/kg/Tag erhielt, betrug die Zeit vom Zusammenleben bis zur Geburt 45 Tage, eine 88%ige Zunahme der Trächtigkeitszeit, verglichen mit der Kontrollgruppe.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass YM-262-Behandlung mit 0,13 mg/kg/Tag über einen Zeitraum von 32 Tagen die Wiederherstellung der Zeugungsfähigkeit nach Beendigung der Therapie um 21 Tage verzögerte. Darüber hinaus war die Wirkung gegen die Zeugungsfähigkeit reversibel, da der Einstellung der Verabreichung des Arzneistoffs erfolgreiche Schwangerschaften folgten. Es ist selbstverständlich, dass längere Zeiträume männlicher Unfruchtbarkeit durch fortgesetzte Verabreichung von erfindungsgemäßen Triptolidverbindungen erzielt werden können. Die Verbindungen können für verbesserte Wirkungen mit anderen Mitteln gegen Zeugungsfähigkeit verabreicht werden.
V. Therapeutika
Formulierungen, die die erfindungsgemäßen Triptolidanaloga enthalten, können die Form von festen, halbfesten, lyophilisierten Pulver- oder flüssigen Darreichungsformen annehmen, wie beispielsweise Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulver, Formulierungen mit verlängerter Freisetzung, Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Zäpfchen, Retentionsklistiere, Cremes, Salben, Lotionen, Aerosole oder dergleichen, vorzugsweise als einzeldosierte Arzneiformen, geeignet zur einfachen Verabreichung von genauen Dosen.
Die Zusammensetzungen schließen typischerweise einen herkömmlichen pharmazeutischen Träger oder Exzipienten ein und können zusätzlich andere Heilmittel, Träger, Hilfsstoffe und dergleichen einschließen. Vorzugsweise wird die Zusammensetzung zu etwa 0,5 bis 75 Gewichts-% aus einer erfindungsgemäßen Verbindung oder Verbindungen bestehen, wobei der Rest aus geeigneten pharmazeutischen Exzipienten besteht. Für orale Verabreichung schließen solche Exzipienten Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Saccharin-Natrium, Talkum, Cellulose, Glucose, Gelatine, Saccharose, Magnesiumcarbonat und dergleichen in pharmazeutischer Qualität ein. Falls gewünscht, kann die Zusammensetzung auch geringfügige Mengen nicht-toxischer Hilfssubstanzen wie Netzmittel, Emulgatoren oder Puffer enthalten.
Flüssige Zusammensetzungen können durch Lösen oder Dispergieren des Triptolidanalogons (etwa 0,5 % bis etwa 20 %) und wahlweise pharmazeutischer Hilfsstoffe in einem Träger wie beispielsweise wässrige physiologische Kochsalzlösung, wässrige Dextrose, Glycerin oder Ethanol, um eine Lösung oder Suspension zu bilden, hergestellt werden.
Die Zusammensetzung kann an einen Patienten peroral, transdermal oder parenteral, z.B. durch intravenöse, subkutane, intraperitoneale oder intramuskuläre Injektion, verabreicht werden. Zur Verwendung in einer flüssigen Zubereitung zur oralen Anwendung kann die Zusammensetzung als eine Lösung, Suspension, Emulsion oder ein Sirup hergestellt werden, die/der entweder in flüssiger Form oder in einer getrockneten Form, geeignet zur Hydratation in Wasser oder normaler physiologischer Kochsalzlösung, geliefert wird. Für parenterale Verabreichung wird eine injizierbare Zusammensetzung zur parenteralen Verabreichung typischerweise das Triptolidanalogon in einer geeigneten intravenösen Lösung wie sterile physiologische Salzlösung enthalten. Wenn die Zusammensetzung in Form von festen Zubereitungen zur peroralen Verabreichung eingesetzt wird, können die Zubereitungen Tabletten, Granulate, Pulver, Kapseln oder dergleichen sein. In einer Tablettenformulierung wird die Zusammensetzung typischerweise mit Zusatzstoffen formuliert, z.B. einem Exzipienten, wie eine Saccharid- oder Cellulosezubereitung, einem Bindemittel wie Stärkekleister oder Methylcellulose, einem Füllstoff, einem Sprengmittel und anderen Zusatzstoffen, die typischerweise gewöhnlich bei der Herstellung arzneilicher Zubereitungen verwendet werden.
Die hohe Wasserlöslichkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen macht sie besonders vorteilhaft für das Verabreichen in wässriger Lösung, z.B. durch intraperitoneale Injektion. Lösungsuntersuchungen, die zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass sich die erfindungsgemäßen Verbindungen ohne weiteres in wässriger Lösung lösen, wenn die Verbindungen in gepulverter Form hergestellt werden. Somit sind die Verbindungen besonders geeignet für Tabletten- oder Kapsel-Formulierungen. Erfindungsgemäße Zusammensetzung oder Medikamente können auch als eine Suspension in einem Lipid (z.B. ein Triglycerid oder ein polyethoxyliertes Rizinusöl wie „CREMOPHOR EL") oder Phospholipid, in einer Liposomensuspension oder in einer wässrigen Emulsion formuliert werden.
Die Verbindung kann auch durch Inhalation, in Form von Aerosolpartikeln, entweder fest oder flüssig, vorzugsweise von atembarer Größe, verabreicht werden. Solche Partikel sind ausreichend klein, um auf Inhalation hin durch den Mund und Kehlkopf und in die Luftröhrenäste und Lungenbläschen zu passieren. Im Allgemeinen sind Partikel atembar, die sich in der Größe von etwa 1 bis 10 Mikrometer bewegen und vorzugsweise weniger als etwa 5 Mikrometer groß sind.
Zusammensetzungen, die atembare, trockene Partikel des mikronisierten Wirkstoffs enthalten, können durch Mahlen des trockenen Wirkstoffs und Schicken der mikronisierten Zusammensetzung durch ein 400-Mesh-Sieb, um große Agglomerate zu zerbrechen oder auszusondern, hergestellt werden. Die feste Teilchen-Form des Wirkstoffs kann ein Dispergiermittel enthalten, um die Bildung eines Aerosols zu erleichtern. Ein geeignetes Dispergiermittel ist Lactose, die mit dem Wirkstoff in einem geeigneten Verhältnis (z.B. einem 1:1-Gewichtsverhältnis) gemischt werden kann.
Jedes Gerät, das Medikamentenaerosole mit festen Teilchen erzeugt, kann verwendet werden, um die festen Partikel zu verabreichen. Solche Generatoren wie der DeVilbiss-Vernebler (DeVilbiss Co., Somerset, Pa.) bringen Partikel hervor, die atembar sind, wie vorstehend erklärt, und erzeugen ein Aerosolvolumen, das eine vorbestimmte abgemessene Dosis eines Medikaments enthält, mit einer Geschwindigkeit, die zur Verabreichung an Menschen geeignet ist. Flüssige Zusammensetzungen zur Inhalation umfassen den Wirkstoff, dispergiert in einem wässrigen Träger, wie sterile pyrogen-freie physiologische Kochsalzlösung oder steriles pyrogen-freies Wasser. Falls gewünscht, kann die Zusammensetzung mit einem Treibgas zur Unterstützung beim Sprühen der Zusammensetzung und Bilden eines Aerosols gemischt werden.
Verfahren zur Herstellung solcher Dosierungsformen sind bekannt oder werden für Fachleute offensichtlich sein; beispielsweise siehe Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Die zu verabreichende Zusammensetzung wird eine Menge der ausgewählten Verbindung in einer pharmazeutisch wirksamen Menge zum Bewirken von Immunsuppression oder Reduktion der Zeugungsfähigkeit bei einem Patienten enthalten.
V. Behandlungsmethode
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in der Immunsuppressionstherapie, im Besonderen in der Therapie zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung, Transplantat-Wirt-Erkrankung (GVHD) oder Transplantatabstoßung, insbesondere Allotransplantat-Abstoßung oder Xenotransplantat-Abstoßung, eingesetzt werden. Die Zusammensetzungen sind auch verwendbar zur Hemmung männlicher Zeugungsfähigkeit, zur Behandlung von sowohl intrinsischen als auch extrinsischen Formen von Asthma und zur Behandlung von anderen entzündlichen Beschwerden wie posttraumatische Entzündung.
Nachstehende Tabelle III listet Autoimmunerkrankungen auf, die für die Immuntherapie geeignet sind.
TABELLE III
Bei der Behandlung eines Autoimmun-Leidens wird dem Patienten die Zusammensetzung periodisch gegeben, z.B. ein- bis zweimal pro Woche mit einer Dosierungshöhe, die ausreicht, die Symptome zu reduzieren und den Komfort des Patienten zu verbessern.
Zur Behandlung rheumatoider Arthritis kann die Zusammensetzung durch intravenöse Injektion oder durch direkte Injektion in das betroffene Gelenk verabreicht werden. Der Patient kann in wiederholten Intervallen von wenigstens 24 Stunden über einen mehrwöchigen Zeitraum im Anschluss an den Ausbruch der Krankheitssymptome bei dem Patienten behandelt werden.
Für die Behandlung von systemischem Lupus erythematodes (SLE), als ein anderes Beispiel, kann die Zusammensetzung über orale oder parenterale Verabreichung wie intravenöse Verabreichung (i.v.) verabreicht werden.
Die Dosis, die verabreicht wird, liegt vorzugsweise im Bereich von 1 bis 25 mg/kg Körpergewicht des Patienten pro Tag, wobei niedrigere Mengen für die parenterale Verabreichung bevorzugt sind und höhere Mengen für die perorale Verabreichung bevorzugt sind. Optimale Dosierungen können mit Routineversuchen gemäß auf dem Fachgebiet bekannter Verfahren bestimmt werden.
Zur Therapie bei der Transplantatabstoßung wie Allotransplantat- oder Xenotransplantatabstoßung ist das Verfahren insbesondere für die Behandlung der Abstoßung von Herz-, Nieren-, Leber-, Zell- und Knochenmarktransplantaten gedacht. Das Verfahren kann auch bei der Behandlung von Transplantat-Wirt-Erkrankung (GVHD), in der transplantierte Immunzellen den allogenen Wirt angreifen, verwendet werden. Die Anfangsbehandlung wird perioperativ verabreicht. Außerdem kann die Zusammensetzung ständig verabreicht werden, um Transplantatabstoßung zu verhindern, oder bei der Behandlung akuter Episoden von später Transplantatabstoßung. Wie vorstehend, beträgt die verabreichte Dosis vorzugsweise 1 bis 25 mg/kg Körpergewicht des Patienten pro Tag, wobei niedrigere Mengen für die parenterale Verabreichung und höhere Mengen für die perorale Verabreichung bevorzugt sind. Die Dosis kann geeignet, je nach der Reaktion des Patienten, und über den Behandlungszeitraum, je nach der Fähigkeit des Patienten, Infektionen zu widerstehen, erhöht oder erniedrigt werden.
Die Behandlung wird typischerweise perioperativ angefangen, entweder bald vor oder bald nach dem operativen Transplantationsverfahren, und wird mit einem täglichen Dosierungsplan für einen Zeitraum von mindestens mehreren Wochen zur Behandlung von akuter Transplantatabstoßung fortgesetzt. Während des Behandlungszeitraums kann der Patient periodisch auf die Höhe der Immunsuppression getestet werden, z.B. mit einer Lymphocyten- Mischreaktion, die allogene Lymphocyten einbezieht, oder durch Entnehmen einer Biopsie des transplantierten Gewebes.
In einer anderen Ausführungsform schließt die Erfindung für immunsuppressive Behandlungen wie vorstehend diskutiert ein Verfahren zur Unterdrückung von Allotransplantatabstoßung, Xenotransplantat-Abstoßung oder Transplantat-Wirt-Erkrankung bei einem Wirtspatienten ein, wobei eine erfindungsgemäße Verbindung gleichzeitig mit einem anderen immunsuppressiven Arzneistoff verabreicht wird. Das Verfahren schließt Verabreichen eines Immunsuppressivums wie Cyclosporin A, FK506, Azathioprin, Rapamycin, Mycophenolsäure oder eines Glucocorticoids in einer Menge an den Patienten ein die wesentlich geringer ist als die Dosis, die benötigt wird, um wirksam Unterdrückung der Allotransplantatabstoßung zu erzielen, wenn die Verbindung alleine verabreicht wird. Ein Verstärker, umfassend ein Triptolidanalogon der Formel 1, wie vorstehend beschrieben, wird in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, Allotransplantat-Abstoßung, Xenotransplantat-Abstoßung oder GVHD in dem Wirt zu unterdrücken, wenn er in Kombination mit der immunsuppressiven Verbindung verabreicht wird. Mit „eine Menge, die wesentlich geringer ist als die Dosis, die benötigt wird, um wirksam Unterdrückung der Allotransplantatabstoßung (oder Xenotransplantat-Abstoßung oder Abstoßung, bedingt durch GVHD) zu erzielen, wenn die Verbindung alleine verabreicht wird" ist eine Menge des Immunsuppressivums gemeint, welche unter 50% und vorzugsweise weniger als 33%, der Menge beträgt, die andernfalls verabreicht würde, falls es ohne ein erfindungsgemäßes Triptolidanalogon verwendet wird. Allotransplantat- oder Xenotransplantat-Abstoßung wird in einem Wirt „wirksam unterdrückt" oder „unterdrückt", wenn die Überlebenszeit des Transplantats in dem Wirt um einen statistisch bedeutungsvollen Zeitraum über die Überlebenszeit in dem Wirt in Abwesenheit einer Immunsuppressionstherapie verlängert wird. Typischerweise ist eine wirksame Unterdrückung der Transplantat-Abstoßung ein Zeitraum von mindestens oder mehreren Wochen und kann bis zu mehreren Monaten oder mehr betragen. Wahlweise werden die Triptolidverbindung („Verstärker") und der immunsuppressive Arzneistoff in solchen Mengen verabreicht, dass die resultierende Immunsuppression größer ist, als man aus der Summe der Wirkungen, die mit dem alleine verwendeten immunsuppressiven Arzneistoff und der alleine verwendeten Triptolidverbindung erhalten werden, erwarten oder erhalten würde.
Der immunsuppressive Arzneistoff und der Verstärker können beide in regelmäßigen Intervallen über einen Zeitraum von mindestens 2 Wochen verabreicht und können entweder peroral oder parenteral verabreicht werden. Die verabreichte Menge des Immunsuppressivums liegt typischerweise zwischen etwa 20% und 100% der Menge des Arzneistoffs, die benötigt wird, um Abstoßung in dem Wirt zu unterdrücken.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren der verstärkten immunsupprimierenden Therapie kann ein Triptolidanalogon der vorstehenden Formel 1 mit einem Immunsuppressivum zusammen in der gleichen Formulierung oder getrennt in separaten Formulierungen verabreicht werden. Wo separate Formulierungen verwendet werden, können das/die Triptolidanalogon oder -Verbindung und das Immunsuppressivum auf unterschiedlichen Wegen verabreicht werden.
Das Immunsuppressivum, das mit dem Triptolidanalogon verabreicht wird, ist vorzugsweise eines der folgenden:

(a) Cyclosporin A oder Cyclosporin C („Cyclosporin"), ein unpolares, cyclisches Oligopeptid;
(b) FK506, ein Pilz-Makrolid-Immunsuppressivum;
(c) Azathioprin oder 6-[(1-Methyl-4-nitro-1H-immidazol-5yl)thio]1H-purin;
(d) Methotrexat,
(e) Rapamycin, ein Pilz-Makrolid-Immunsuppressivum;
(f) Mycophenolsäure oder 6-(1,3-Dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-7-methyl-3-oxy-5-isobenzofuranyl)-4-methyl-4-hexansäure; und
(g) ein immunsupprimierendes Glucocorticoid wie Prednison oder Dexamethason.

Die Größenverhältnisse der zwei Bestandteile (Triptolidanalogon und Immunsuppressivum) liegen vorzugsweise im Bereich von 1:50 bis 50:1 nach Gewicht. Die immunsuppressive Verbindung ist vorzugsweise Cyclosporin A, verabreicht in einer Menge von weniger als 1/3 der gewöhnlichen unterdrückenden Dosis.
Für die Hemmung der männlichen Zeugungsfähigkeit kann die Verbindung durch intraperitoneale (i.p.) oder intravenöse Injektion oder vorzugsweise durch perorale Verabreichung mit einer Dosierung und Häufigkeit, die wirksam die Zeugungsfähigkeit des Patienten reduziert oder blockiert, verabreicht werden. Die verwendbare Dosis variiert als eine Funktion des Verabreichungswegs. Für menschliche Patienten wird die Dosis beispielsweise von 0,1 bis 15 mg/kg pro Tag für einen erwachsenen Patient variieren, wenn sie peroral verabreicht wird.
Bei der Behandlung von Asthma wird intranasale Verabreichung (Tropfen oder Spray), Inhalation eines Aerosols durch den Mund oder herkömmliche perorale Verabreichung generell bevorzugt. Der Wirkstoff kann auch als ein topisch angewendetes, flüssiges Medikament auf das respiratorische Flimmerepithel der Nase aufgetragen werden. Falls der Patient unfähig ist, zu schlucken, oder die orale Absorption anderweitig beeinträchtigt ist, wird der bevorzugte systemische Verabreichungsweg parenteral, intranasal oder topisch sein.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch nach dem Ausbruch von Asthma an ein Individuum verabreicht werden, um Atemschwierigkeiten zu reduzieren, oder sie können prophylaktisch, das heißt, bevor der Bronchospasmus bei einem Asthmaanfall beginnt, verabreicht werden, um dessen Auftreten vorzubeugen oder zu minimieren.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, aber in keiner Weise einschränken.
Beispiel 1
Triptolidsuccinat (YM-262)
Triptolid (100 mg) in 10 ml Pyridin wurde bei Raumtemperatur mit Bernsteinsäureanhydrid (150 mg) versetzt. Die Umsetzung wurde bei 85°C für 30 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre ausgeführt. Hexan (50 ml) wurde zu dem resultierenden Gemisch zugegeben, um ein Rohprodukt auszufällen, welches durch Filtration gesammelt und mit Hexan gewaschen wurde. Das Rohprodukt wurde aus Ether/Hexan umkristallisiert, was 90 mg (70%) Triptolidsuccinat (YM-262) ergab, Schmp. 111°-113°C.
IR(KBr): 3431,8, 2974,6, 1743,8, 1375,5, 1159,4, 1022,4 cm^-1. H¹-NMR (CDCl₃): 5,08 (1H, s, 14-CH), 4,67 (2H, s, 19-CH2), 3,82 (1H, d, 11-CH), 3,50 (1H, d, 12-CH), 3,43 (1H, d, 7-CH), 2,75 (5H, m, CH2CH2, 5-CH), 2,30 (1H, d-m, 15-CH), 2,15 (2H, m, 6-CH_a, 2-CH_a), 1,88 (2H, m, 2-CH_b, 6-CH_bB), 1,55 (1H, m, 1-CH_b), 1,20 (1H, m, 1-CH_a), 1,05 (3H, s, 20-CH3), 0,95 (3H, d, 16-CH₃), 0,83 (3H, d, 17-CH₃) ppm. MS (m/z): 461 (M+1).
Beispiel 2
Triptolidsuccinat-Trissalz (YM-273)
Triptolidsuccinat (20 mg) wurde mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan (5,3 mg) in 20 ml Wasser gemischt und für eine Stunde gerührt. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat wurde lyophilisiert, was 24 mg (96%) eines weißen Pulvers ergab.
IR(KBr): 3391, 2937,96, 1745,80, 1562,9, 1411,67, 1159, 1066,57, 1024,57 cm^-1. H¹-NMR (D₆-DMSO, ppm): 5,00 (1H, s, 14-CH), 4,85 (2H, d, 19-CH₂), 3,95 (1H, d, 11-CH), 3,70 (1H, d, 12-CH), 3,55 (1H, d, 7-CH), 3,30 (6H, s, 3CH₂O), 2,65 (1H, m, 5H), 2,45 (2H, m, CH2), 2,20 (3H, m, CH₂, 15-CH), 1,90 (4H, m, 6-CH2, 2-CH2), 1,34 (2H, br, 1-CH2), 0,95 (3H, s, 20-CH3), 0,88 (3H, d, 16-CH3), 0,75 (3H, d, 17-CH₃).
Beispiel 3
Triptolidsuccinat-Natriumsalz (YM-274)
Triptolidsuccinat (20 mg) wurde mit Natriumbicarbonat (3,65 mg) in 20 ml Wasser gemischt und für 30 Min. gerührt. Die Wasserlösung wurde filtriert und das Filtrat wurde lyophilisiert, was 20 mg (95%) weißes Pulver ergab.
IR(KBr): 3431,8, 2975,56, 1743,87, 1577,97, 1419,79, 1163,22, 1022,40 cm^-1. H¹-NMR (D₆-DMSO, ppm): 5,00 (1H, s, 14-CH), 4,85 (2H, d, 19-CH2), 3,95 (1H, d, 11-CH), 3,70 (1H, d, 12-CH), 3,55 (1H, d, 7-CH), 2,58 (1H, m, 5H), 2,45 (2H, m, CH2), 2,20 (3H, m, CH2, 15-CH), 1,90 (4H, m, 6-CH2, 2-CH2), 1,34 (2H, br, 1-CH2), 0,95 (3H, s, 20-CH3), 0,88 (3H, d, 16-CH3), 0,75 (3H, d, 17-CH3).
Beispiel 4
Triptolidsuccinat-Lysinsalz (YM-276)
Triptolidsuccinat (20 mg), gemischt mit L-(+)-Lysin (6,3 mg) in 20 ml Wasser, wurde für eine Stunde gerührt. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat wurde lyophilisiert, was 25 mg (95%) weißes Pulver ergab.
IR(KBr): 3431,8, 2934,0, 1743,9, 1560,6, 1399,9, 1147,6, 1018,6 cm^-1. H¹-NMR (D₆-DMSO, ppm): 5,00 (1H, s, 14-CH), 4,85 (2H,d,19-CH₂), 3,95 (1H,d,11-CH), 3,78 (1H, d, 12-CH), 3,55 (1H, d, 7-CH), 3,50 (6H, br, 2NH₃), 3,15 (1H, m, -CH), 2,70 (1H, m, 5H), 2,65 (1H, m, CH₂), 2,4 (2H, m, CH₂), 2,20 (3H, m, CH₂, 15-CH), 1,90 (4H, m, 6-CH₂, 2-CH₂), 1,40 (6H, m, CH₂CH₂CH₂), 1,34 (2H, br, 1-CH₂), 0,95 (3H, s, 20-CH₃), 0,88 (3H, d, 16-CH₃), 0,75 (3H, d, 17-CH₃) ppm.
Beispiel 5
Synthese des 14-N,N-Dimethylglycinatesters von Triptolid
In einen trockenen 100 mL-Rundkolben werden 1 Äq. Triptolid und jeweils 2 Äq. N,N-Dimethylglycin und DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) gegeben. Der Kolben wird unter eine Stickstoffatmosphäre gestellt und wasserfreies CH₂Cl₂ (getrocknet über P₂O₅) wird zugegeben, gefolgt von einer katalytischen Menge DMAP (4-Dimethylaminopyridin). Die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz wird durch Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffs, Entfernen des Lösungsmittels durch Abziehen und Chromatographieren des erhaltenen Feststoffs an Kieselgel aufgearbeitet.
Beispiel 6
Synthese des Methansulfonsäuresalzes des 14-N,N-Dimethylglycinatesters von Triptolid
In einen trockenen Rundkolben werden 1 Äq. des 14-N,N-Dimethylglycinatesters von Triptolid, wie in Beispiel 5 hergestellt, gegeben. Die Verbindung wird in wasserfreiem CH₂Cl₂ (destilliert von P₂O₅) gelöst und zu der so erhaltenen Lösung wird 1 Äq. einer Vorratslösung von Methansulfonsäure in Diethylether zugegeben. Das Lösungsmittel wird sofort entfernt, was einen weißen Feststoff ergibt.
Beispiel 7
Synthese des Hydrochloridsalzes des 14-(3-(N,N-Dimethylamino)propionat)esters von Triptolid
In einen trockenen 100 mL-Rundkolben werden 1 Äq. Triptolid und jeweils 2 Äq. N,N-Dimethylaminopropionsäure und DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) gegeben. Der Kolben wird unter eine Stickstoffatmosphäre gestellt und wasserfreies CH₂Cl₂ (getrocknet über P₂O₅) wird zugegeben, gefolgt von einer katalytischen Menge DMAP (4-Dimethylaminopyridin). Die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Lösungsmittel wird durch Abziehen entfernt. Das Rohprodukt wird danach an Kieselgel chromatographiert.
Beispiel 8
Synthese des Hydrochloridsalzes des 14-(4'-N-Pyrrolidino)butyrat)esters von Triptolid
In einen trockenen Rundkolben wird 1 Äq. Triptolid, 2 Äq. 4-Pyrrolidinobuttersäurehydrochloridsalz und wasserfreies CH₂Cl₂ (destilliert von P₂O₅) gegeben. Die so erhaltene Lösung wird unter eine Stickstoffatmosphäre gestellt und 2 Äq. DCC und eine katalytische Menge DMAP werden zugegeben. Die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der Ansatz wird durch Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstoffs, Entfernen des Lösungsmittels durch Abziehen und Chromatographieren des erhaltenen Feststoffs an Kieselgel aufgearbeitet.
Beispiel 9
Synthese des Bis-N,N-Dimethylglycinatesters von 16-Hydroxytriptolid
Die Titelverbindung wird durch die Umsetzung von 1 Äq. 16-Hydroxytriptolid, 3 Äq. N,N-Dimethylglycin, 3,3 Äq. DCC und 0,16 Äq. DMAP in wasserfreiem CH₂Cl₂, gefolgt von Aufarbeiten, synthetisiert, wie in dem vorigen Beispiel beschrieben.
Der Bis-N,N-dimethylglycinatester an den 2- und 14-Positionen von Triptolid wird auf ähnliche Weise aus Tripdiolid (2-Hydroxytriptolid) hergestellt.
Beispiel 10
Stabilität von Triptolidsuccinat (YM-262)
A. Stabilität in Wasser
Eine Lösung von Natrium-Triptolidsuccinat (YM-274) in D₂O wurde mit einer Konzentration von 3 mg/ml hergestellt und bei Raumtemperatur gelagert. Die Lösung wurde mit ¹H-NMR in Intervallen von 1, 3, 5, 15, 45, 90, 180 Minuten; 1, 7, 14 Tagen; und 1, 2, 3 und 5 Monaten analysiert. Es gab während der ersten drei Monate keine merkliche Veränderung in dem NMR-Spektrum. Eine gewisse Zersetzung war nach 5 Monaten offensichtlich.
B. Stabilität in Blutserum
Eine Lösung von Triptolidsuccinat (freie Säure, YM-262) in DMSO wurde mit einer Konzentration von 25 mg/ml hergestellt und 0,1 ml dieser Lösung wurden mit 0,5 ml Rattenserum gemischt. Das Gemisch wurde bei 37 °C inkubiert. Aliquote des Gemischs wurden bei 1, 3, 5, 15, 45 Minuten und 18 Stunden entnommen und mit Dünnschichtchromatographie (DC) analysiert. Die DC-Platten wurden in 1:5 CH₂Cl₂/Et₂O entwickelt. Nach Entwicklung wurden die Platten mit Ioddampf behandelt und unter einer UV-Lampe untersucht. Triptolid und Triptolidsuccinat wurden als Referenzverbindungen (R_f = 0,60 beziehungsweise 0,45) verwendet.
Nach 3 Minuten wurde nur Triptolidsuccinat mit DC nachgewiesen. Nach 15 Minuten war der Triptolidsuccinatfleck weggegangen (R_f = 0,45) und ein neuer Fleck, der Triptolid entspricht, tauchte auf (R_f = 0,60). Nach 45 Minuten war der Triptolidfleck auch verschwunden und nur Material mit niedrigem R_f-Wert (Bestandteile des Blutserums und Zersetzungsprodukte) blieb übrig.
Beispiel 11
Hemmung der IL-1-Wirkung auf murine Thymocyten
C3H/HeN-Mausthymocyten wurden präpariert und die Wirkung von IL-1 zusammen mit PHA, die die Proliferation von Thymocyten stimulieren, wurde unter Verwendung von Standardtechniken gemessen (O'Gara, 1990; Mishell, 1980). Drei bis sechs Wochen alte männliche C3H/HeN-Mäuse (Simonson Laboratory, Gilroy, CA) wurden durch CO₂-Inhalation geopfert. Die Thymusdrüsen wurden entnommen, von anhaftendem nicht-Thymusgewebe getrennt, in balancierter Hank-Salzlösung (HBSS, Gibco) unter Verwendung eines Glashomogenisators homogenisiert und mit 200 × g für 10 Minuten bei 15 °C zentrifugiert. Im Anschluss an einen zusätzlichen Waschvorgang in HBSS wurden die Thymocyten in RPMI 1640-Medium, das 50 μM 2-Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, nichtessentielle Aminosäuren, 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum enthielt, resuspendiert.
Die Zellen wurden in Mikrotiter-Gewebekulturplatten mit rundem Boden mit 96 Vertiefungen mit 6 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in einem Volumen von 100 μl kultiviert. Rekombinantes menschliches IL-1β (R & D Systems #201-LB) wurde zusammen mit Phytohämagglutinin P (PHA, Pharmacia) zu den Zellen in einem Volumen von 25 μl pro Vertiefung zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,08 ng/ml beziehungsweise 10 μg/ml zu erreichen. Die Proben wurden in DMSO gelöst (10 mg/ml), danach in Kulturmedium verdünnt. 25 Mikroliter der Testprobe wurden zu jeder Vertiefung zugegeben, um die Verbindungs-Endkonzentrationen für jeden Versuch zu erzielen. Zellen mit PHA zusammen mit IL-1 dienten als Kontrollen. Das Gesamtvolumen für jede Vertiefung betrug 150 μl.
Die Platten wurden bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator für 72 Stunden inkubiert. 50 Mikroliter Kulturmedium, das 0,5 μCi (³H)-Thymidin (Amersham, 49 Ci/mMol) enthielt, wurden vor den letzten 18 Stunden der Inkubation zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Zellen wurden danach geerntet und gezählt. Die Ergebnisse wurden als Zählimpulse pro Minute (CpM) pro 6 × 10⁵ Zellen angegeben.
Die folgende Formel wurde verwendet, um den Prozentsatz der Unterdrückung der IL-1-Aktivität zu berechnen, und die IC₅₀ (Konzentration der Probe, die 50% Unterdrückung der Proliferation ergibt) wurde verwendet, um die suppressive Wirkung der Probe anzugeben. %-Unterdrückung der IL-1-Aktivität = (1-Proben-CpM/(IL-1+PHA-Kontroll-CpM) × 100
Die Ergebnisse werden in vorstehender Tabelle I gezeigt.
Beispiel 12
Lymphocyten-Mischreaktions (MLR)-Test
In dieser Untersuchung waren die Responderzellen (R) Milzzellen von weiblichen C57BL/6-Mäusen und die Stimulatorzellen (S) waren Milzzellen von weiblichen Balb/C-Mäusen, die 6 bis 8 Wochen alt waren (Jackson, Bar Harbor, Maine). Die Milz wurde aseptisch aus den Mäusen entnommen und in 10 ml kalte HBSS in einer sterilen Petrischale gelegt. Die Milz wurde in Hälften geschnitten und vorsichtig zwischen den vereisten Enden von 2 sterilen Mikroobjektträgern gepresst. Die Zellsuspension wurde danach durch ein steriles Nylonnetz (Nytex, Tetco #HD-3-85) in ein konisches 15 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen filtriert und bei 200 × g für 10 Minuten in einer Beckman GPR-Tischzentrifuge (GH-3.7-Rotor) zentrifugiert. Im Anschluss an einen zusätzlichen Waschvorgang in HBSS wurden die Milzzellen in RPMI 1640-Medium (Gibco), das 50 μM 2-Mercaptoethanol, 2 mM Glutamin, 100 E/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum enthielt, resuspendiert.
Die Stimulatorzellen (S) und ein Teil der Responderzellen (R) wurden auf 10 × 10⁶ Zellen/ml verdünnt und mit 20 cGy mit einem Cesium-Irradiator (Department of Radiation Oncology, Stanford University, CA) bestrahlt, um die Proliferation zu hemmen. Die bestrahlten Zellen wurden einmal gewaschen, um jegliche toxische freie Radikale und deren Produkte, die sich aus der Bestrahlung ergaben, zu entfernen. Die Responderzellen (R), bestrahlten Stimulatorzellen (Sx) und bestrahlten Responderzelle (Rx) wurden alle auf 4 × 10⁶ Zellen/ml verdünnt.
In dem Test wurden 4 × 10⁵ R-Zellen mit 4 × 10⁵ Sx-Zellen in 200 μl Medium in Gewebekulturplatten mit rundem Boden mit 96 Vertiefungen co-kultiviert. 50 Mikroliter der Testproben mit verschiedenen Konzentrationen wurden zu den Zellen zugegeben. Die Vertiefungen, die keine Testproben erhielten, würden die maximale Proliferation erreichen. Mehrere Kontrollen wurden in dem Test verwendet. Die bestrahlten Responderzellen (Rx) wurden auch zu den Responderzellen mit und ohne die Testproben zugegeben. Rx oder Sx alleine wurden geprüft, um sicherzustellen, dass nach Bestrahlung keine Proliferation auftrat. Die spontane Proliferation von R wurde auch gemessen.
Die Kulturplatten wurden bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator für vier Tage inkubiert. Die Zellen wurden mit 1 μCi (³H)-Thymidin (Amersham, 49 Ci/mMol) in 20 μl Medium für die letzten 18 Stunden markiert. Die Zellen wurden danach geerntet und gezählt. Die Ergebnisse wurden als Zählimpulse pro Minute (CpM) pro Vertiefung angegeben. Der Prozentsatz der Unterdrückung und die IC₅₀ (Konzentration der Probe, die 50% Unterdrückung der Proliferation hervorbringt) wurden verwendet, um die suppressive Wirkung der Probe anzugeben. Die Proben-CpM wurden berechnet als (R + Sx + Probe)CpM – (R + Rx + Probe)CpM; die Kontroll-CpM wurden berechnet als (R + Sx)CpM – (R + Rx)CpM. Der Prozentsatz der Unterdrückung der MLR-Aktivität wurde berechnet als (1 – Proben-cpm/Kontroll-CpM) × 100. Die IC₅₀ wurde aus dem Prozentsatz der Unterdrückung bestimmt, um die suppressive Aktivität der Probe anzugeben. Die Ergebnisse werden in vorstehender Tabelle II gezeigt.
Beispiel 13
Beurteilung der Zytotoxizität
Die mögliche Zytotoxizität der Testproben wurde durch die Messung ihrer Wirkung auf die Reduktion von MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) durch kultivierte Zellen bewertet. MTT, eine gelbgefärbte Verbindung, wird durch mitochondriale Enzyme reduziert und bildet das lila kristalline Reduktionsprodukt Formazan, was einen Index der Zellatmung bei lebensfähigen Zellen sowie einen empfindlichen Test für Zytotoxizität (Mossmann, 1983) bereitstellt.
Die Zytotoxizität wurde bei kultivierten, menschlichen PBMC und Mausthymocyten bewertet. Eine Vorratslösung von MTT (Sigma) mit 5 mg/ml in phosphatgepufferter, physiologischer Kochsalzlösung, pH-Wert 7,4, wurde hergestellt und im Dunklen bei 4°C gelagert. PBMCs oder Thymocyten wurden mit verschiedenen Konzentrationen der Testproben in Gewebekulturplatten mit flachem Boden mit 96 Vertiefungen (Costar) unter den gleichen Bedingungen wie den vorstehend beschriebenen kultiviert, aber die Stimulantien (X-35 oder IL-1 + PHA) wurden durch geeignetes Medium ersetzt. Unbehandelte Zellen mit Medium alleine und ohne die Testproben wurden als Kontrollen verwendet. Nach Inkubation für 21 Stunden wurden 25 μl MTT-Lösung zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach zusätzlichen drei Stunden Inkubation wurde der Versuch durch Zugabe einer Lösung von 10% Natriumdodecylsulfat in 0,01 N HCl beendet. Im Anschluss an eine Inkubation über Nacht bei 37°C, um die Formazankristalle zu solubilisieren, wurde die optische Dichte bei 570-650 nm in einem Mikroplattenleser bestimmt. Die folgende Formel wurde verwendet, um die % der Toxizität zu berechnen: % der Toxizität = (1-Proben-OD./Kontroll-OD.) × 100 Die Proben wurden als zytotoxisch definiert, wenn die Toxizität in dem verwendeten Testsystem größer als 25% war. Die Ergebnisse werden in vorstehenden Tabellen I und II gezeigt.
Beispiel 14
Behandlung von Herztransplantatabstoßung:
Heterotope Ganzherz-Transplantation wurde gemäß dem Standardverfahren (Ono und Lindsey, 1969) ausgeführt. Die Spender (Braune Norway-Ratten, 200-255g, Charles River, Wilmington, MA) und Empfänger (adulte männliche Lewis-Ratten, 225-275g, Charles River) wurden mit Natriumpentobarbital (40 mg/kg) narkotisiert. Im Anschluss an ausreichende Spender-Antikoagulation unter Verwendung von Heparin wurde das Herztransplantat entnommen und bei 4°C in PhysioSol Irrigation Solution (Abbott Laboratories, N. Chicago, IL) gelagert. Die aufsteigende Aorta und Lungenschlagader wurden durchschnitten und die Hohlvene und die Lungenvenen wurden ligiert. Die Bauchschlagader und untere Hohlvene des Empfängers wurden durch einen medianen Bauchschnitt freigelegt. Die Herzschlagader und Lungenschlagader des Spenders wurden mit laufendem einfädigem 8-0 Nylonnahtmaterial (Ethilon, Inc., Somerville, NJ) mit einer End-zu-Seit-Anastomose an der infrarenalen Bauchschlagader beziehungsweise der unteren Hohlvene des Empfängers befestigt. Wegen der funktionellen Eigenschaften der Aortenklappe gelangte kein Blut in die linke Kammer, sondern floss vielmehr durch die Koronararterien zum rechten Vorhof, zu derungenschlagader und der Empfänger-Hohlvene. Die kalte ischämische Zeit betrug für alle Herztransplantate weniger als 45 Minuten. Der Herzschlag des Transplantats wurde durch Abtasten des Bauches überwacht. Der Zeitraum des funktionellen Transplantat-Überlebens wurde als die Anzahl von Tagen gemessen, während welcher Kontraktionen des Herztransplantats durch Abtasten des Bauches nachgewiesen werden konnten. Die Ergebnisse wurden durch direkte Betrachtung bei Bauchhöhleneröffnung bestätigt.
Die wie vorstehend beschrieben, erzeugten Empfängertiere des Herztransplantats (3-5 Tiere/Gruppe) wurden behandelt mit (i) Kontrolllösung (5% Ethanol, 10 ml/kg), (ii) YM-273 mit 0,10 mg/kg und 0,40 mg/kg (5A), (iii) YM-274 mit 0,084 und 0,33 mg/kg (5B) und (iv) und T10 (Triptolid) 0,25 mg/kg (6). Außer dass 6 die Ergebnisse für T10 zeigt, wiederholt sie die Ergebnisse aus 5A-5B für YM-273 und YM-274 mit 0,40 beziehungsweise 0,33 mg/kg, so dass deren Konzentrationen bezüglich T10 äquimolar waren. Alle Verbindungen wurden intraperitoneal verabreicht. Die Behandlung begann am Tag vor der Operation und wurde täglich fortgesetzt bis zum postoperativen Tag 14 oder bis zum Ende des Überlebens des Allotransplantats. Die Ergebnisse werden in 5A-5B und 6 gezeigt.
Beispiel 15
Wirkun von Triptolidsuccinat auf die Zeugungsgfähigkeit bei männlichen Mäusen
Triptolidsuccinat (YM-262) wurde bei männlichen BDF1-Mäusen unter Verwendung eines Zykluses von täglicher Verabreichung für 5 Tage, gefolgt von einer zweitägigen Einstellung der Behandlung, auf Kontrolle der Zeugungsfähigkeit getestet. Der Zyklus wurde vor Beurteilung der physiologischen Wirkungen und der reproduktiven Leistung für 5 Wochen wiederholt, mit Gaben an Tagen 0-4, 7-11, 14-18, 21-25 und 28-32.
Eine Dosierlösung von YM-262 wurde einmal in der Woche aus einer Vorratslösung in physiologischer Kochsalzlösung mit 1,0 mg/ml hergestellt und bei 4°C gelagert. Die Mäuse wurden intraperitoneal (i.p.) mit dem Vehikel aus physiologischer Kochsalzlösung oder mit YM-262 mit 0,04 oder 0,13 mg/kg/Tag in physiologischer Kochsalzlösung unter Verwendung einer sterilen 1 ml-Einwegplastikspritze und einer sterilen 25 oder 26 Gauge-Nadel zur subkutanen Injektion behandelt. Die Verbindung wurde in einem Volumen entsprechend 0,1 ml pro 10 g Maus-Körpergewicht verabreicht.
A. Wirkung auf das Hodengewicht
An Tag 32 wurden fünf oder sechs Mäuse aus jeder Dosisgruppe geopfert und die Hoden wurden entnommen und zur histologischen Analyse und Gewichtsbestimmung in Formalin gelagert. Der Durchschnitt beider Hoden wurde für jede Maus berechnet und der Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwerts (SA) wurden bestimmt. Diese Daten werden in 7 gezeigt.
Im Vergleich zur mit physiologischer Kochsalzlösung behandelten Kontrollgruppe wurde eine moderate (annähernd 13%) Abnahme des Hodengewichts bei den Mäusen beobachtet, die 0,1 mg/kg/Tag YM-262 erhielten.
B. Wirkung auf die Zeugungsfähigkeit
Die Zeugungsfähigkeit wurde mit fünf zusätzlichen männlichen Mäusen in jeder Behandlungsgruppe getestet. Die Männchen wurden an Tag 32, wonach keine weiteren YM-262-Behandlungen gegeben wurden, mit zwei Weibchen pro Männchen untergebracht. Das erste Weibchen in jedem Käfig, das einen Wurf zur Welt brachte, wurde mit ihrem Wurf in einen separaten Käfig gebracht und das übrige Weibchen wurde mit dem Männchen untergebracht. Alle männlichen Mäuse zeugten mit beiden Weibchen, mit denen sie zusammenlebten, Würfe. Die Nachkommen wurden, was Geburtsdatum, Geschlecht und Fellfarbe anbetrifft, einzeln aufgeführt.
Die Zeit vom Beginn des Zusammenlebens bis zur Geburt der Würfe wurde beurteilt und wird in 8 gezeigt. Außerdem werden der Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwerts (SA) gezeigt. Die mit physiologischer Kochsalzlösung behandelte (Kontroll-)Gruppe brachte den ersten Wurf nach einem Mittelwert von 24 Tagen hervor. Der Wert für die Gruppe, die YM-262 mit 0,03 mg/kg/Tag erhielt, betrug 28 Tage, eine 17%ige Verzögerung. Jedoch betrug die Zeit vom Zusammenleben bis zur Geburt 45 Tage für die Gruppe, die YM-262 mit 0,1 mg/kg/Tag erhielt, eine 88%ige Zunahme verglichen mit der Kontrollgruppe.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass YM-262-Behandlung mit 0,1 mg/kg/Tag über einen Zeitraum von 32 Tagen die Wiederherstellung der Zeugungsfähigkeit nach Beendigung der Therapie um 21 Tage verzögerte. Darüber hinaus war die Kontrolle der Zeugungsfähigkeit reversibel und es wird erwartet, dass fortgesetzte Behandlung die nachgewiesene Kontrolle der Zeugungsfähigkeit aufrechterhalten würde.
Obwohl die Erfindung mit Bezug auf spezielle Verfahren und Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist es selbstverständlich, dass verschiedene Abänderungen vorgenommen werden können, ohne von der Erfindung abzuweichen.

Claims

Verbindung der Struktur:
wobei X¹ OH oder OR¹ ist, und X² und X³ unabhängig OH, OR¹ oder H sind, mit der Maßgabe, daß mindestens ein Rest aus X¹, X² und X³ OR¹ ist und mindestens ein Rest aus X² und X³ H ist; und R¹ -C(O)-Y-Z ist, wobei Y eine verzweigte oder unverzweigte C₁-C₆-Alkyl- oder Alkenylkette ist; und Z COOH oder COOR², NR³R^3' oder ⁺NR⁴R^4'R^4'' ist, wobei R² ein Kation ist; R³ und R^3' unabhängig H oder verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₆-Alkyl, Hydroxyalkyl oder Alkoxyalkyl sind, oder R³ und R^3' zusammengenommen einen 5- bis 7-gliedrigen heterocyclischen Ring bilden, dessen Ringatome aus Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel ausgewählt sind, wobei die Ringatome 2 bis 6 Kohlenstoffatome, ein oder mehrere Stickstoffatome und gegebenenfalls ein oder mehrere Sauerstoff- oder Schwefelatome einschließen, und der Ring unsubstituiert ist oder mit einem oder mehreren aus R⁵, OR⁵, NR⁵R⁶, SR⁵, NO₂, CN, C(O)R⁵, C(O)NR⁵R⁶, OC(O)R⁵, OC(O)NR⁵R⁶ und Halogen ausgewählten Resten substituiert ist, wobei R⁵ und R⁶ unabhängig Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkenyl sind; und R⁴, R^4' und R^4'' unabhängig verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₆-Alkyl, Hydroxyalkyl oder Alkoxyalkyl sind.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei X² = X³ = H.
Verbindung gemäß Anspruch 1, wobei X² oder X³ = H.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Z COOH ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Z COOR² ist und R² ein Metallion oder ein organisches Amin ist.
Verbindung gemäß Anspruch 5, wobei das Metallion Na⁺ oder K⁺ ist.
Verbindung gemäß Anspruch 5, wobei das organische Amin Lysin, Triethylamin oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Z NR³R^3' ist und R³ und R^3' unabhängig H oder verzweigtes oder unverzweigtes C₁-C₆-Alkyl sind.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Z NR³R^3' in protonierter Form oder ⁺NR⁴R^4'R^4'' ist und die Verbindung ein anionisches Gegenion einschließt.
Verbindung gemäß Anspruch 9, wobei das anionische Gegenion Chlorid oder Bromid ist oder ein Carboxylation, Sulfonation oder Sulfation enthält oder Acetat, Oxalat, Maleat, Fumarat, Methansulfonat oder Toluolsulfonat ist.
Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei Y eine C₁-C₄-Alkylkette ist und Z COOR² oder Dimethylamino oder N-Morpholino ist.
Verbindung gemäß Anspruch 11, wobei R² Na⁺ oder Tris(hydroxymethyl)-ammoniummethan oder Lysin ist.
Arzneimittel umfassend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel.
Arzneimittel gemäß Anspruch 13, wobei das Vehikel ein wäßriger Träger ist.
Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines Arzneimittels zum Bewirken von Immunsuppression, Reduzieren der Zeugungsfähigkeit bei einem männlichen Säuger oder Behandeln von Asthma.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei die Immunsuppression Hemmung von Transplantatabstoßung, Hemmung von Transplantat-Wirt-Erkrankung oder Behandeln einer Autoimmunerkrankung umfaßt.
Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei die Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis ist.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei das Arzneimittel zur Behandlung von Asthma zur Verabreichung durch Inhalation ist.