DE69727250T2 - Elektrochemische und photochemische elektroden und deren verwendung - Google Patents

Elektrochemische und photochemische elektroden und deren verwendung Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet der Bioelektronik und betrifft elektrisch leitfähige feste Matrizen (welche hierin als "Elektroden" bezeichnet werden), welche Redoxenzyme tragen, so dass eine elektrische Ladung zwischen der Oberfläche der Elektrode und den Enzymen fließen kann und sie katalytisch aktiv macht. Des Weiteren wird durch die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Elektroden bereitgestellt, wie auch Vorrichtungen, Systeme und Verfahren, welche solche Elektroden nutzen. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform wird die Erfindung für die Bestimmung der Gegenwart und optional der Konzentration eines Analyten in einem flüssigen Medium verwendet. Gemäß einer anderen Ausführungsform können die immobilisierten Enzyme mit Hilfe von Licht in zwei unterschiedliche biokatalytische Zustände geschaltet werden; dadurch werden Übertragung und Amplifikation von aufgezeichneten optischen Signalen ermöglicht wird, wodurch "Lese" ("read")- und "Schreib" ("write")-Funktionen erfüllt werden und solche Elektroden in der Speicherung und Verarbeitung von optischer Information anwendbar sind.
  • Stand der Technik
  • Der Stand der Technik, von dem geglaubt wird, dass er als Hintergrund für die vorliegende Erfindung relevant ist, besteht aus den folgenden Dokumenten:
    • 1. Degani, Y., Heller, A., J. Am. Chem. Soc., 110: 2615, 1988.
    • 2. Willner, I., Katz, E., Riklin, A., Kasher R., J. Am. Chem. Soc., 114: 10965, 1992.
    • 3. Willner et al., US-Patent Nr. 5,443,701.
    • 4. Lion-Dagan, M., Katz, E., Willner, I., J. Am. Chem. Soc., 116: 7913, 1994.
    • 5. Willner, I., Lion-Dagan, M., Marx-Tibbon, S., Katz, E., J. Am. Chem. Soc., 117: 6581, 1995.
    • 6. Willner, I. und Rubin, S., Angen. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 367, 1996.
    • 7. Willner, I., Riklin, A., Shoham, B., Rivenson, D., Katz, E., Adv. Mater., 5: 912, 1993.
    • 8. Massey, V., Hemmerich, P., in Flavins and Flavoproteins, V. Massey & C. H. Williams (Hrsg.), Elsevier, Amsterdam, 83–96, 1982.
    • 9. Walsh, C., Fisher, J., Spencer, R., Graham, D. W., Ashton, W. T., Brown, J. E., Brown, R. D., Rogers, E. F., Biochemistry, 78: 1942, 1978.
    • 10. Bückmann, A. F., Erdmann, H., Pietzch, M., Hall, J. M., Bannister, J. V. in K. Kuneoyagi (Ed.), Flavins and Flavoproteins, Gruyter, Berlin, S. 597, 1994.
    • 11. Riklin, A., Katz, E., Willner, I., Stocker, A., Bückmann, A. F., Nature, 376: 672, 1995.
    • 12. Willner, I., Liondagan, M., Marxtibbon S., Katz, E., J. Am. Chem. Soc., 117: 6581, 1995.
    • 13. Namba, K., Suzuki, S., Bull. chem. Soc. Jpn., 48: 1323, 1975.
    • 14. Katz, E., Schlereth, D. D., Schmidt, H. L., J. Electroanal. Chem., 367: 59, 1994.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Covalentes Anbinden von redoxaktiven Gruppen (Ferrocen, Bipyridinium, etc.) an Aminosäurereste von Redoxenzymen erzeugt Biokatalysatoren, welche elektrisch mit elektrischen Elektroden kommunizieren, die mit den Enzymen elektrisch "verdrahtet" sind(1–3). Enzyme, die mit photoisomerisierbaren Gruppen (beispielsweise Nitrospiropyran/Nitromerocyan) modifiziert sind, zeigen unterschiedliche enzymatische Aktivitäten für die verschiedenen lichtinduziert generierten Photoisomerzustände(4,5). Die Verwendung von Biokatalysatoren, welche photo-schaltbar sind, als aktive Matrizen für optische Aufzeichnungen und optobioelektrische Hilfsmittel wurde kürzlich rezensiert(6).
  • Elektrisch verdrahtete Enzyme wurden für die Bestimmung von Analyten in elektrochemischen Zellen durch Anbinden der Elektrobiokatalyse an die Elektroden eingesetzt(3,7). In all diesen beschriebenen Systemen sind die funktionell elektroaktiven oder photoaktiven Einheiten zufällig um das Protein verteilt. Die Effektivität des elektrischen Kontakts zwischen dem Redoxzentrums des Enzyms und der Elektrode ist limitiert. Als ein Ergebnis ist die Rate des Elektronentransfers zwischen dem Redoxcenter des Enzyms relativ gering. Das resultiert in kompetitiven Elektronentransferreaktionen mit Cosubstraten (beispielsweise Sauerstoff) oder in der Störung von Substraten (beispielsweise in der Oxidation von Harnsäure oder Ascorbinsäure). Als ein Ergebnis ist die Größenordnung der resultierenden Ströme, welche die entsprechenden Analyte abfragen, mäßig schwach und die Analyse muss in einer sauerstofffreien Umgebung durchgeführt werden. Besonders musste darauf geachtet werden, dass jegliche Art von beeinträchtigenden Reagenzien aus dem Analysemedium eliminiert wurde.
  • Für viele Enzyme (beispielsweise Flavoenzyme) kann der FAD-Cofaktor aus dem nativen Protein entfernt werden, wodurch ein ungefaltetes Apo-Protein entsteht, welches mit dem natürlichen Cofaktor oder chemisch modifizierten FAD-Cofaktoren wieder zurück rekonstituiert werden kann, um das bioaktive Enzym darzustellen(8–10). Die Rekonstituierung von Apo-Flavoenzymen mit einem FAD-Cofaktor, welches an eine Elektronen vermittelnde Gruppe gebunden ist, generierte eine "Elektro-Enzym", den elektrischen Kontakt mit den Elektrodenoberflächen herstellte. Vermittelter Elektronentransfer aktiviert die rekonstituierten Enzyme hinsichtlich der elektrokatalytischen Oxidation ihrer Substrate(11).
  • Enzymelektroden für die elektrochemische Bestimmung eines Analyten können als nicht-invasive oder invasive analytische Vorrichtung operieren. Für invasive Analysen müssen die Elektroden aus biokompatiblen nicht-gefährlichen Substanzen aufgebaut sein, und die Elektroden müssen als dünne Nadeln fabriziert sein, um Schmerz beim invasiven Eindringen auszuschließen. Die geringe Oberflächenfläche der Elektroden muss durch eine hohe elektrische Aktivität der Biokatalysatoren mit Sensorfunktion kompensiert werden, um messbare Stromantworten zu erzielen.
  • Die Funktionen der Enzyme, welche durch zufällig substituierte photoisomerisierbare Einheiten modifiziert sind, werden nur unvollständig durch externe Lichtsignale geschaltet. Die störende Struktur der Proteinumgebung des aktiven Redoxzentrums der Enzyme wird nur zum Teil von den entfernt gelegenen photoisomerisierbaren Einheiten beeinflusst. Dies führt nur zu einer teilweisen, unvollständigen Funktion, bzw. zur Deaktivierung des photoisomerisierbaren Enzyms(12).
  • Allgemeine Beschreibung der Erfindung
  • Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein elektrochemisches Verfahren und ein System zur Bestimmung der Gegenwart und optional der Konzentration eines Analyten in einem flüssigen Medium zur Verfügung zu stellen.
  • Es ist darüber hinaus eine Aufgabe der Erfindung, Elektroden für die Anwendung in solch einem Verfahren bzw. System zur Verfügung zu stellen. Es ist insbesondere eine Aufgabe der Erfindung, solche Elektroden zur Verfügung zu stellen, welche eine feste, elektrisch leitfähige Matrix umfassen, die immobilisierte Enzyme trägt, so dass elektrische Ladung und elektrischer Fluss zwischen der Elektrode und den Enzymen die Enzyme katalytisch aktiv enthält, wobei sie eine Reaktion katalysieren, in welcher der Analyt, welcher abgefragt werden soll, in ein Produkt umgewandelt wird.
  • Es darüber hinaus eine Aufgabe der Erfindung, solche Elektroden zur Verfügung zu stellen, welche hohen und effizienten Elektronentransport zwischen Elektrode und den Enzymen aufweisen, so dass die Elektrode essentiell unsensitiv auf die Gegenwart von anders gearteten beeinträchtigenden Redoxreagenzien ist; d. h., es tritt ein Minimum von nicht-spezifischen Redoxreaktionen auf.
  • Es darüber hinaus eine Aufgabe der Erfindung, Enzymelektroden zur Verfügung zu stellen, worauf die Gegenstände, welche auf den Elektroden immobilisiert sind, nicht-toxisch sind und nicht-immunogen sind, was die Verwendung der Elektrode in der invasiven Analyse ermöglicht.
  • Es ist des Weiteren eine Aufgabe der Erfindung, Enzymelektroden zur Verfügung zu stellen, mit Enzymen, welche photoschaltbar sind und immobilisiert auf eine Elektrodenoberfläche sind, und geeignet sind in der Aufzeichnung von optischen Signalen sowie in der Übertragung von aufgezeichneten optischen Signalen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Verwendungen von Elektroden der Erfindung zur Verfügung zu stellen, ebenso wie Verfahren für deren Herstellungen.
  • Andere Aufgaben der Erfindung werden aus der Beschreibung im Folgenden deutlich.
  • Die vorliegende Erfindung weist zwei Aspekte auf: ein Aspekt, der hier als der "erste Aspekt" bezeichnet wird, in welchen die Elektrode verwendbar für die Bestimmung der Gegenwart und optional der Konzentrationen des Analyten in einem flüssigen Medium ist, und ein zweiter Aspekt, welcher hier im Folgenden als "zweiter Aspekt" bezeichnet wird, in welchem die elektrische Antwort auf die Elektrode photoreguliert wird (d. h., der Grad der elektrischen Antwort ist mit Hilfe der Einstrahlung von Licht bei einer bestimmten Wellenlänge kontrollierbar), was die Verwendung der Elektrode in der Aufzeichnung von optischen Signalen und in der elektrischen Übermittelung von aufgezeichneten optischen Signalen ermöglicht. Beide Aspekte der vorliegenden Erfindung sind dahingehend auf einen gemeinsamen Nenner zu bringen, dass die Elektroden immobilisierte Enzyme tragen und dahingehend, dass die Enzyme funktionalisierte Cofaktoren aufweisen, d. h., Cofaktoren, welche durch die Addition der funktionellen Gruppe oder eines funktionellen Restes modifiziert sind (solche Enzyme werden zeitweise als "funktionalisierte Enzyme" bezeichnet).
  • In Übereinstimmung mit der Erfindung kann ein funktionaliertes Enzym durch die Rekonstitution eines Apo-Enzyms (ein Enzym mit einem Cofaktor) mit einem FAD rekonstituiert werden, welches durch die Addition einer funktionellen Gruppe oder eines funktionellen Restes modifiziert wurde ("funktionelles FAD").
  • Gemäß einer Ausführungsform der funktionellen Gruppe oder des funktionellen Restes ist ein bindender Rest in der Lage, mit der Oberfläche der Elektrode chemisch zu assoziieren, dort anzuhaften oder auf diese Oberfläche chemisorbiert zu werden. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die funktionelle Gruppe oder der funktionelle Rest eine Elektronen vermittelnde Gruppe, welche eine Gruppe darstellt, die in der Lage ist, reversibel ihren Redoxzustand zu ändern und Elektronen von und zum FAD zu transferieren. In Übereinstimmung mit einer weiteren Ausführungsform ist die funktionalisierte Gruppe eine photoisomerisierbare Gruppe, welche ihren Isomerisierungszustand durch Photostimulation ändern kann. Es ist ebenso in Übereinstimmung mit anderen Ausführungsformen der Erfindung möglich, dass es funktionalisierte FAD mehr als eine funktionelle Gruppe oder einen funktionellen Rest aufweist, d. h., einen bindenden Rest und eine Elektronen vermittelnde Gruppe, oder einen bindenden Rest und eine photoisomerisierbare Gruppe, etc.
  • In dem Fall, dass das funktionalisierte FAD eine Elektronen vermittelnde Gruppe aufweist, und besonders in einem solchen Fall, wo das funktionalisierte FAD sowohl eine bindende Gruppe und eine Elektronen vermittelnde Gruppe aufweist, besteht ein hocheffizienter Elektronentransfer zwischen der Elektrode und dem FAD, was zu einer Enzymumsatzrate führt, welche maximale theoretische Berechnungen erreicht. Solch eine Elektrode, welche insbesondere in Übereinstimmung mit dem ersten Aspekt der Erfindung verwendbar ist, führt zu einer sehr großen elektrischen Antwort auf eine Veränderung in der analytischen Konzentration. Darüber hinaus macht die hohe Umsatzrate die Elektrode essentiell insensitiv gegenüber beeinflussenden Agenzien, wie z. B. nicht-spezifisch oxidierenden oder reduzierenden Agenzien, beispielsweise Sauerstoff, Ascorbinsäure, Harnsäure, etc.
  • In Übereinstimmung mit dem ersten Aspekt der Erfindung umfasst das funktionale FAD vorzugsweise eine Elektronen vermittelnde Gruppe. Es sollte festgehalten werden, dass dort, wo das funktionalisierte FAD in dem funktionalisierten Enzym, welches in dem ersten Aspekt verwendet wird, keine Elektronen vermittelnde Gruppe enthält, eine Elektronen vermittelnde Gruppe vorhanden ist, welche frei beweglich in Lösung oder unabhängig immobilisiert auf der Oberfläche der Elektrode Seite an Seite mit dem modifizierten FAD sein kann.
  • In Übereinstimmung mit dem zweiten Aspekt der Erfindung haben, wo das funktionalisierte FAD eine photoisomerisierbare Gruppe aufweist, haben Enzyme zwei katalytische Zustände, welche "AN"- und "AUS"-Zustände repräsentieren ("ON" and "OFF"). Das ermöglicht das "Schreiben" ("writing") eines photoisomerisierbaren Zustandes des funktionalisierten Cofaktors, und dieser Zustand kann dann von Elektrode "gelesen" ("read") werden, dadurch dass eine Veränderung in der elektrischen Antwort gemessen wird.
  • In dem Verfahren und dem System der Erfindung führen die Veränderungen in der Konzentration des Analyten im Fall des ersten Aspektes oder eine Veränderung in dem Photoisomerisationszustand für den Fall des zweiten Aspektes zu einer Veränderung hinsichtlich der elektrischen Antwort. Die Bezeichnung "elektrische Antwort" ("electrical response"), welche hier verwendet wird, bezeichnet das Strom-Spannungsverhalten der Elektrode, beispielsweise die Stromantwort oder den Fluss der Ladung der Elektrode unter einem bestimmten angewandten Potenzial, etc. Die elektrische Antwort kann bestimmt werden, indem der Strom oder der Ladungsfluss unter Wechselstrom- oder Gleichstrom-Zuständen gemessen werden.
  • Im Folgenden werden die Bezeichnungen "Bestimmen" oder "Bestimmung" verwendet, um sowohl die Bestimmung von lediglich der Gegenwart wie auch die Bestimmung von der Gegenwart zusammen mit der Konzentration des Analyten in einem flüssigen Medium zu bezeichnen.
  • Im Folgenden wird auch Gebrauch gemacht von der Bezeichnung "Rekonstitution", welche sich auf das Miteinanderverknüpfen eines Apo-Enzyms (eines Enzyms ohne seinen Cofaktor) mit einem Cofaktor bezieht, um ein funktionalisiertes Enzym zu erhalten. In Übereinstimmung mit der Erfindung wird die Rekonstitution des Enzyms mit einem synthetischen funktionalisierten FAD-Cofaktor durchgeführt. Die Bezeichnung "rekonstituiertes funktionalisiertes Enzym" wird verwendet werden, um ein Enzym zu bezeichnen, welches durch Rekonstitution eines Apo-Enzyms mit einem funktionalisierten Cofaktor erhalten wurde.
  • Das funktionalisierte Enzym, das mit dem funktionalisierten FAD rekonstituiert wurde, wird Eigenschaften aufweisen, welche von dem Typ der FAD-Modifikation beeinflusst werden werden. Beispielsweise wird ein funktionalisiertes Enzym, welches ein FAD aufweist, das eine verbrückende Gruppe mit einem bindenden Rest umfasst, und welches eine Elektronen vermittelnde Gruppe aufweist, elektrobiokalatytisch aktiv sein und in der Lage sein, direkt Elektronen von der Elektrode aufzunehmen oder Elektronen auf die Elektrode zu übertragen (abhängend davon, ob es als Katalysator in einem Reduktionsreaktionsweg bzw. in einem Oxidationsreaktionsweg fungiert), ohne dass ein Bedarf für eine separate Elektronen vermittelnde Gruppe besteht. Solch ein funktionalisiertes Enzym zeigt einen hocheffizienten elektrischen Kontakt mit der Elektrode mit einem Enzymumsatz, welcher maximal-theoretische Berechnungen erreicht. Ein funktionalisiertes Enzym mit einem funktionalisierten FAD, welches eine photoisomerisierbare Gruppe aufweist, wird verschiedene elektrobiokatalytische Eigenschaften aufweisen, je nachdem, welcher Isomerisationszustand der photoisomerisierbaren Gruppe vorliegt; die katalytischen Eigenschaften des Enzyms können also durch Licht kontrolliert werden.
  • In Übereinstimmung mit der Lehre der Erfindung wird folglich eine Elektrode bereitgestellt, welche FAD-abhängige Enzyme an ihrer Oberfläche trägt, wobei die Enzyme ein funktionalisiertes FAD aufweisen, welches ein FAD ist, das durch die Addition einer funktionellen Gruppe oder eines funktionellen Restes modifiziert ist, welche eine oder mehrere aus der Gruppe darstellen, die aus Folgendem besteht:
    • (a) eine Bindungsgruppe, die chemisch mit der Elektrode assoziieren kann, sich an die Elektrode anlagern kann oder chemisch an die Elektrode absorbieren kann, wobei das Enzym auf der Elektrode durch Bindung der Bindungsgruppe an die Oberfläche der Elektrode immobilisiert ist;
    • (b) eine Elektronenvermittlergruppe, die Elektronen zwischen der Oberfläche der Elektrode und dem FAD transferieren kann; und
    • (c) eine photoisomerisierbare Gruppe, die sich von einem Isomerisierungszustand in einen anderen durch Aussetzen an Licht einer ersten Wellenlänge verändern kann, wobei die Photoisomerisierung entweder die elektrisch induzierte katalytische Aktivität erhöht oder verringert.
  • Bevorzugte Elektroden für die Verwendung in Übereinstimmung mit dem ersten Aspekt der Erfindung sind solche, in welchen das funktionalisierte FAD sowohl einen bindenden Rest als auch eine Elektronen vermittelnde Gruppeumfasst. Typischerweise wird die Elektronen vermittelnde Gruppe in Form eines Sandwiches zwischen dem bindenden Rest und dem übrigen Teil des funktionalisierten FAD bereitgestellt, wodurch effizienter und schneller Elektronentransfer zwischen der Oberfläche der Elektrode und dem FAD ermöglicht wird.
  • In den Elektroden, welche in Übereinstimmung mit dem zweiten Aspekt der Erfindung verwendet werden, können die funktionalisierten Enzyme zeitweise an die Elektrode gebunden sein unter Verwendung einer Gruppe, welche an die Oberflächenreste des Proteins an ihrem einen Ende gebunden ist und einen bindenden Rest an ihrem anderen Ende aufweist. Alternativ kann das funktionalisierte FAD sowohl eine photoisomerisierbare Gruppe und einen bindenden Rest gebunden an die Elektrode aufweisen. Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren ein Verfahren zur Herstellung einer Elektrode zur Verfügung, welche FAD-abhängige Redoxenzyme immobilisiert darauf aufweist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (a) die Herstellung von Apo-Enzymen durch die Behandlung eines FAD-abhängigen Enzyms in einer Weise, dass der FAD-Cofaktor daraus entfernt wird;
    • (b) die Herstellung eines funktionalisierten FAD durch kovalente Bindung an einen Bindungsbereich, der zur chemischen Assoziation mit, zur Anlagerung an oder zu einer Chemisorption an die Oberfläche der Elektrode in der Lage ist;
    • (c) das Reagieren des funktionalisierten FAD mit einer Elektrode unter Bedingungen, so dass das modifizierte FAD auf der Elektrode durch chemische Assoziation, Anlagerung oder Adsorption an den Bindungsbereich auf der Oberfläche der Elektrode immobilisiert wird; und
    • (d) das Reagieren der in (c) erhaltenen Elektrode mit dem Apo-Enzym unter Bedingungen, bei denen das Apo-Enzym mit dem modifizierten FAD kombiniert, um funktionelle immobilisierte Enzyme zu ergeben.
  • Es versteht sich, dass in dem oben genannten Verfahren die Schritte (a) und (b) umgekehrt werden können. Des Weiteren ist es zeitweise möglich, zuerst das Apo-Enzym mit dem modifizierten FAD zu kombinieren und erst dann den gesamten Komplex auf der Oberfläche der Elektrode zu immobilisieren.
  • Wo das funktionalisierte FAD anders funktionellen Gruppen umfasst, d. h., eine Elektronen vermittelnde Gruppe oder eine photoisomerisierbare Gruppe, kann es sein, dass a priori diese in den modifizierten FAD enthalten sind, bevor es auf der Elektrode immobilisiert wird oder sie können zu dem modifizierten FAD nach erfolgter Immobilisierung hinzugefügt werden. Ein bevorzugtes Immobilisierungsschema zum Herstellen einer Elektrode für die Anwendung gemäß dem ersten Aspekt umfasst Folgendes:
    • (a) das Behandeln einer Elektrode, um eine Monoschicht zu erhalten, die eine Elektronenvermittlergruppe umfasst, wobei die Elektronenvermittlergruppe einen Bindungsbereich aufweist, der zur chemischen Assoziation mit, Anlagerung an oder chemischen Adsorption an die Oberfläche der Elektrode in der Lage ist, wobei die Behandlung die Bindung des Bindungsbereiches an die Oberfläche der Elektrode umfasst;
    • (b) das Reagieren der in (a) erhaltenen Elektrode mit einem FAD, so dass das FAD auf der Elektrode durch chemische Anlagerung an die Elektronenvermittlergruppe immobilisiert wird;
    • (c) das Reagieren der in (b) erhaltenen Elektrode mit dem Apo-Enzym eines FAD-abhängigen Enzyms unter Bedingungen, bei denen das Apo-Enzym mit der FAD-Komponente des immobilisierten FAD kombiniert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren in einer weiteren ihrer Facetten ein elektrochemisches System zur Bestimmung der Gegenwart eines Analyten in einem flüssigen Medium bereit, wobei das System Folgendes umfasst:
    • (a) eine Elektrode, welche auf ihrer Oberfläche FAD-abhängige Enzyme trägt, wobei die Enzyme in der Lage sind, eine Redoxreaktion zu katalysieren, in welcher ein Analyt in ein Produkt umgewandelt wird, die Enzyme ein funktionalisertes FAD umfassen, welches einen bindenden Rest aufweist, der chemisch assoziiert ist mit, angebunden ist an oder chemisorbiert ist auf der Oberfläche der Elektrode;
    • (b) eine Elektronen vermittelnde Gruppe, welche Elektronen zwischen der Oberfläche der Elektrode und dem FAD übertragen kann, wobei die Elektronen vermittelnde Gruppe entweder
    • (ba) einen Teil des funktionalisierten FADs ausbildet oder daran kovalent gebunden ist,
    • (bb) unabhängig auf der Oberfläche der Elektrode gebunden ist,
    • (bc) kovalent an das Enzym gebunden ist,
    • (bd) frei beweglich (d. h. nicht immobilisiert) in einem Medium vorliegt, welches die Elektrode umgibt; und
    • (c) einen elektrischen Stromkreis zum Beladen der Elektrode und zum Messen der elektrischen Antwort.
  • Es ist verständlich, dass die Spezifität des Analyten des Systems durch den Typus des immobilisierten Enzyms bestimmt wird.
  • Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren ein Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines Analyten in einem flüssigen Medium zur Verfügung, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (a) das Zurverfügungstellen eines Systems wie oben definiert;
    • (b) das Einführen einer Probe von besagtem Flüssigkeitsmedium in die elektrochemische Zelle des Systems;
    • (c) das Laden der Elektrode und das Messen der elektrischen Reaktion, wobei eine Änderung in der elektrischen Reaktion im Vergleich zu einer elektrischen Reaktion unter der gleichen Bedingung in einem Kontrollmedium, das den Analyten nicht umfasst, das Vorhandensein des Analyten in dem System anzeigt;
  • Elektroden in Übereinstimmung mit dem ersten Aspekt der Erfindung zeigen hohe Umsatzraten, welche theoretische Konzentrationen erreichen und folglich essentiell insensitiv gegenüber verschiedenen nicht-spezifisch oxidierenden oder reduzierenden Agenzien sind, wie z. B. Sauerstoff, etc. Dies ist insbesondere der Fall in Elektroden der Erfindung, wo die Elektronen vermittelnde Gruppe einen Teil des funktionalisierten FADs ausbildet oder kovalent daran angebunden ist. Solche Elektroden sind folglich geeignet zur Durchführung einer Messung in einer nicht geschützten Umgebung, beispielsweise zur Messung, welche in vivo durchgeführt werden. Ein besonderes Beispiel ist eine Elektrode in der Form einer Nadel, welche in eine Blutvene eingebracht werden kann und einen gewünschten Parameter kontinuierlich messen kann, z. B. den Glucosespiegel. All die Gegenstände auf der Oberfläche der Elektroden, d. h. die Enzyme, können identisch zu solchen gemacht werden, welchen normalerweise im Körper vorhanden sind und dementsprechend wird üblicherweise keine Immunantwort oder jegliche Art von toxischem Effekt vorhanden sein, welche anderenfalls aus einer kontinuierlichen Exposition gegenüber einem fremden Gegenstand resultieren.
  • Elektronen und Systeme für kontinuierliche in vivo-Messung von verschiedenen Parametern sind besonders bevorzugt in Übereinstimmung mit dem ersten Aspekt der Erfindung.
  • Enzyme, welche in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden können, schließen Glucoseoxidase (GOD), wobei in diesem Fall der Analyt Glucose sein wird; D-Aminosäurenoxidase (D-aminoacid oxidase, DAAO), wobei in diesem Fall der Analyt eine D-Aminosäure (beispielsweise D-Alanin) ist; Lactatoxidase (LacOx), wobei in diesem Fall der Analyt Milchsäure sein wird; Glutathionreductase (GR), wobei in diesem Fall der Analyt oxidiertes Glutathion ist; sowie viele weitere Flavoenzyme, ein.
  • In Übereinstimmung mit einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein elektrochemisches System für die Aufzeichnung von optischen Signalen zur Verfügung gestellt, welche eine erste Wellenlänge aufweisen, und für die elektronische Übertragung der aufgezeichneten Signale, wobei das System eine elektrochemische Zelle aufweist, die Folgendes umfasst:
    • (a) eine Elektrode, die immobilisierte FAD-abhängige Redox-Enzyme trägt, wobei das Enzym:
    • (aa) ein funktionalisiertes FAD aufweist, das eine photoisomerisierbare Gruppe umfasst, welche ihren Isomerisierungszustand von einem ersten in einen zweiten Zustand in Folge von Photostimulation durch Licht einer ersten Wellenlänge ändert, wobei eine Veränderung in dem Isomerisierungszustand eine Veränderung der Rate der katalytischen Aktivität des Redoxsystems bewirkt,
    • (bb) immobilisert auf der Oberfläche der Elektrode durch eine Verknüpfungsgruppe ist, welche entweder
    • (aba) ein Teil des funktionalisierten FAD ist oder kovalent angebunden an das funktionalisierte FAD ist, oder
    • (abb) kovalent angebunden an eine externe Gruppe auf der Oberfläche des Enzyms ist;
    • (b) eine Elektronen vermittelnde Gruppe, welche Elektronen zwischen der Elektrode und dem FAD transferieren kann, wobei die Elektronen vermittelnde Gruppe entweder
    • (ba) frei beweglich in dem Medium der Umgebung der Elektrode ist,
    • (bb) unabhängig auf der Oberfläche der Elektrode immobilisiert ist,
    • (bc) kovalent an das Enzym angebunden ist, oder
    • (bd) kovalent angebunden an modifiziertes FAD oder ein Teil von modifiziertem FAD ist;
    • (c) ein Substrat für die katalytische Aktivität des Enzyms; und
    • (d) einen elektrischen Stromkreis zum Laden der Elektrode und zum Messen der elektrischen Antwort.
  • Vorzugsweise kann die photoisomerisierbare Gruppe reversibel isomerisert werden durch Exposition gegenüber Licht von verschiedenen Wellenlängen-Regionen. Folglich wird Lichtanregung bei einer ersten Wellenlänge den Isomerisierungszustand von einem ersten Zustand in einen zweiten Zustand ändern, wohingegen Licht einer zweiten Wellenlänge den Isomerisierungszustand von einem zweiten Zustand in einen ersten Zustand ändern wird. Folglich wird das System Lichtereignisse bei einer ersten Wellenlän ge aufzeichnen und kann mit einer zweiten Wellenlänge emittiert von der Lichtquelle des Systems dann zurückgesetzt werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt in Übereinstimmung mit einem zweiten Aspekt der Erfindung ein Verfahren zum Aufzeichnen optischer Signale zur Verfügung, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
    • (a) das Zurverfügungstellen eines Systems wie oben definiert;
    • (b) Exponieren der Elektrode gegenüber einer Lichtquelle;
    • (c) das Laden der Elektrode und das Messen der elektrischen Reaktion, wobei eine Änderung in der elektrischen Antwort die Exposition gegenüber Licht, welches besagte erste Wellenlänge aufweist, anzeigt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Verfügung zum Herstellen von Elektroden zur Anwendung in Übereinstimmung mit dem zweiten Aspekt der Erfindung, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    • (a) Herstellen eines Apo-Enzyms durch Behandeln eines FAD-abhängigen Enzyms so, dass das FAD daraus entfernt wird;
    • (b) Herstellen eines modifizierten FADs durch kovalentes Binden einer Gruppe, welche in der Lage ist, an eine photoisomerisierbare Gruppe anzuhaften oder daran gebunden zu werden;
    • (c) Reagieren des modifizierten FADs mit der photoisomerisierbaren Gruppe, um ein photoisomerisierbares FAD zu erhalten;
    • (d) Kombinieren des Apo-Enzyms mit dem photoisomerisierbaren FAD, um ein rekonstituiertes photoisomerisierbares Redoxenzym zu erhalten; und
    • (e) Bereitstellen einer Elektrode, welche verbindende Gruppen immobilisiert darauf trägt und Reagieren der rekonstituierten Enzyme mit den Elektroden, so dass die Enzyme kovalent an die verbindenden Gruppen gebunden werden.
  • Ein weiteres Verfahren zur Herstellung einer Elektrode in Übereinstimmung mit einem zweiten Aspekt umfasst Folgendes:
    • (a) Herstellen eines Apo-Enzyms zur Behandlung eines FAD-abhängigen Enzyms, so dass das FAD von jenem entfernt wird;
    • (b) Herstellen eines modifizierten FADs durch kovalentes Anbinden einer Gruppe, welche in der Lage ist, an einer photoisomerisierbaren Gruppe anzuhaften oder an diese zu binden;
    • (c) Reagieren der Elektrode mit einer verbindenden Gruppe, welche einen bindenden Rest aufweist, der in der Lage ist, mit der Elektrode assoziieren, chemisch zu binden oder chemisch zu sorbieren und eine funktionelle Einheit aufweist, die in der Lage ist, an die photoisomerisierbaren Gruppe zu binden, wobei die Reaktion unter solchen Bedingungen steht, dass besagter bindender Rest mit der Oberfläche der Elektrode assoziiert chemisch bindet oder chemisorbiert;
    • (d) Reagieren der Elektrode, die in Schritt (c) erhalten wurde, mit einer photoisomerisierbaren Gruppe;
    • (e) Reagieren der Elektrode, die in Schritt (d) erhalten wurde mit dem modifizierten FAD, das in Schritt (b) erhalten wurde, so dass eine Monoschicht erhalten wird, welche immobilisierte photoisomeriserbare FAD-Gruppen auf der Elektrode aufweist; und
    • (f) Reagieren der Apo-Enzyme mit der Elektrode, die in (e) unter Bedingungen erhalten wurde, in welchen das Enzym auf der Oberfläche der Elektrode rekonstituiert wird, wodurch photoaktive Redoxenzyme immobilisiert auf der Elektrode entstehen.
  • Enzyme, welche gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung verwendet werden können, schließen diejenigen ein, welche in Verbindung mit dem ersten Aspekt oben erwähnt wurden.
  • Eine verbindende Gruppe, welche in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um ein FAD auf der Oberfläche einer Elektrode zu immobilisieren, kann die folgende allgemeine Formel (I) aufweisen: Z-R1-Q (I);worin:
    Z eine bindende Gruppe ist und in dem Fall, dass die Elektrode aus Gold, Platin oder Silber besteht, eine Schwefel enthaltende Gruppe repräsentiert, welche in der Lage ist, chemisch mit besagtem Metall zu assoziieren, daran anzuhaften oder chemische Sorption auf besagtem Metall einzugehen; und in dem Fall, dass die Elektrode aus Glas besteht, Methoxy- oder Alkoxysilanreste repräsentiert, welche in der Lage sind, eine chemische Assoziation, Anhaften oder chemische Sorption auf besagtem Glas einzugehen;
    R1 repräsentiert eine verbrückende Gruppe;
    Q ist eine funktionelle Gruppe, die in der Lage ist, eine kovalente Bindung mit einer Gruppe in dem katalytischen Peptid oder in der Porphyringruppe einzugehen.
  • Z, für den Fall, dass das Elektrodenmaterial aus Metall besteht, kann beispielsweise ein Schwefelatom sein, welches aus einer Thiolgruppe, einer Disulfidgruppe, einer Sulfonatgruppe oder einer Sulfatgruppe erhalten wird.
  • R1 kann eine kovalente Bindung darstellen oder kann ein Peptid oder ein Polypeptid sein oder kann ausgewählt sein aus einer sehr großen Vielzahl an geeigneten Gruppen, wie z. B. Alkylen, Alkenylen, Alkinylenphenyl-enthaltende Ketten und vielen anderen.
  • Besondere Beispiele von R1 sind eine chemische Bindung oder eine Gruppe, welche die folgende Formel (IIa), (IIb), (IIc) oder (IId) aufweist
    Figure 00170001
    -R2-NH- II(b)
    Figure 00170002
    wobei
    R2 oder R3 identisch sein können oder verschieden und lineare oder verzweigte Alkylene, Alkenylene, Alkinylene, welche 1–16 Kohlenstoffatome aufweisen, darstellen oder eine kovalente Bindung darstellen,
    A und B identisch oder verschieden sein können und O oder S repräsentieren,
    Ph eine Phenylgruppe ist, welche optional substituiert sein kann, beispielsweise um ein oder mehrere Mitglieder ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SO3 – oder Alkylgruppen.
  • Q kann beispielsweise eine Amingruppe darstellen, die in der Lage ist, mit einem Carboxylrest eine Bindung einzugehen; eine Carboxylgruppe, die in der Lage ist, mit einem Aminrest eine Verbindung einzugehen; ein Isocyanat oder eine Isothiocyanatgruppe oder eine Acylgruppe, welche in der Lage ist, an einen Aminrest zu binden; oder eine Halogengruppe, welche in der Lage ist, an die Hydroxygruppe des Polypeptids zu binden. Besondere Beispiele sind die Gruppen -NH2-COOH; -N=C=S; N=C=O; oder eine Acylgruppe, welche die folgende Formel aufweist -Ra-CO-G, worin G ein Wasserstoff, ein Halogen, wie z. B. Cl oder OH, ORb, eine
    Figure 00180001
    -Gruppe ist oder eine
    Figure 00180002
    Gruppe; Ra und Rb jeweils voneinander unabhängig eine C1-C12-Alkyl- oder Alkenyl- oder eine Phenyl-enthaltende Kette, welche optional substituiert ist, beispielsweise mit Halogen, sind.
  • Besondere Beispiele von solchen verbindenden Gruppen sind diejenigen mit den folgenden Formel (III)–(IX):
    Figure 00180003
    Figure 00190001
    worin n eine ganze Zahl zwischen 1 und 6 ist.
  • Das Verknüpfen des FAD mit einer Elektronen vermittelnden Gruppe oder einer photoisomerisierbaren Gruppe wie auch das Verknüpfen des Elektronenvermittlers direkt auf dem Enzym kann mit Hilfe einer verknüpfenden Gruppe, welche die folgende Formel (X) aufweist, erreicht werden: Q1-R1-Q2 (X) worin R1 die gleiche Bedeutung, wie oben aufgezeigt, aufweist und Q1 und Q2 unabhängig voneinander die Bedeutungen, welche oben für Q gegeben wurden, aufweisen.
  • Beispiele von Elektronen vermittelnde n Gruppen, welche in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden können, sind Ferrocene, Pyrrolochinolinchinon, Chinon, N,N'-Dialkyl-4,4'-bipyridiniumsalze und viele andere.
  • Die verknüpfenden Gruppen können zeitweise ebenso eine andere funktionelle Gruppe umfassen, beispielsweise eine Elektronen vermittelnde Gruppe, oder eine photoisomerisierbare Gruppe. Eine verbindende Gruppe in Übereinstimmung mit solchen Ausführungsformen kann die folgende allgemeine Formel (XI) aufweisen Z-F-R1-Q (XI)worin Z, R1 und Q die Bedeutungen, wie oben erläutert, aufweisen und F die funktionelle Gruppe ist.
  • Beispiele von photoisomerisierbaren Gruppen, welche in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden können, sind Nitrospiropyran, Azobenzen, Thiophenfulgid und viele weitere Verbindungen, welche photoisomerisierbar von einem zu dem anderen Zustand und zurück durch Bestrahlung mit Licht von zwei verschiedenen Wellenlängenregionen sind.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun weiter erläutert in den folgenden speziellen Ausführungsformen und Abbildungen.
  • Kurze Beschreibung der Abbildungen
  • 1 zeigt die Struktur von N6-(2-Aminoethyl)-FAD.
  • 2A und 2B zeigen den letzten synthetischen Schritt in der Herstellung von FAD-Ferrocendiad.
  • 3A zeigt den letzten synthetischen Schritt in der Herstellung von FAD-Spiropyrandiad (FAD-SP).
  • 3B zeigt die beiden photoisomerisierbaren Zustände von FAD-SP.
  • 4 zeigt die Herstellung von Glucoseoxidase-Apo-Enzym und seine Rekonstitution mit FAD-Ferrocendiad.
  • 5A zeigt die Herstellung von Glucoseoxidase-Apo-Enzym und seine Rekonstitution mit FAD-Spiropyrandiad und die Photoisomerisation des rekonstituierten Enzyms;
  • 5B zeigt die beiden photoisomerisierten Zustände des modifizierten FAD.
  • 6 zeigt das Schema der Immobilisierung von GOD, wenn es mit FAD-Spiropyrandiad rekonstituiert ist, auf einer Goldelektrode, um eine GOD-Monoschicht auszubilden.
  • 7 zeigt das Schema der Modifizierung einer Goldelektrode mit einer FAD-Monoschicht und die bioelektrokatalytische Glucoseoxidation unter Verwendung dieser Enzymelektroden:
  • 7A zeigt eine Elektrode in Übereinstimmung mit der ersten Ausführungsform der Erfindung mit Elektronen vermittelnder Gruppe, welche frei beweglich in dem Medium vorliegt;
  • 7B zeigt ein Enzym in Übereinstimmung mit den kombinierten ersten und zweiten Ausführungsformen mit einer Elektronen vermittelnde n Gruppe (PQQ), welche kovalent an die FAD-Gruppe gebunden ist.
  • 8 zeigt die Struktur von Pyrollochinolinchinon (PQQ).
  • 9 zeigt Cyclovoltammogramme: (a) FAD-Ferrocen (siehe 4) adsorbiert auf einer Gold-Arbeitselektrode (von einer 1 – 10–5 molaren Ausgangslösung). (b) FAD-Ferrocen rekonstituiertes GOD in Lösung (1,75 mg/ml) (siehe 12) unter Verwendung einer Cystaminmonoschicht-modifizierten Goldelektrode. Hintergrund: 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,3 unter Argon. Spannungsscanrate 1,5 V/s.
  • 10 zeigt Cyclovoltammogramme von mit FAD-Ferrocen rekonstituiertem GOD in Lösung (1,75 mg/ml) und verschiedene Konzentrationen von Glucose: (a) 0 mM, (b) 1 mM, (c) 3 mM, (d) 20,5 mM. Alle Experimente wurden in 0,1 M Phosphatpuffer, bei pH 7,3, bei 35°C; unter Argon, unter Verwendung einer Cystamin-modifizierten Goldelektrode durchgeführt. Spannungsscanrate, 2 mV/s.
  • 11 zeigt die Spitzenanodenströme von verschiedenen Glucosekonzentrationen in einem Experiment, wie desjenigen, welches in 10 gezeigt ist.
  • 12 zeigt das bioelektrokatalytische Oxidationsschema von Glucose unter Verwendung von FAD-Ferrocen rekonstituiert mit GOD ("Elektroenzym").
  • 13 zeigt Cyclovoltammogramme von mit FAD-Ferrocen rekonstituierter D-Aminosäureoxidase (DAAO) in Lösung (0,38 mg/ml) in der Gegenwart von D-Alanin: (a) 0 mM, (b) 2 mM, (c) 9 mM. Experimente wurden in 0,1 M Pyrophosphatpuffer, bei pH 8,5; bei 25°C; unter Argon durchgeführt. Spannungsscanrate, 2 mV/s.
  • 14 zeigt Cyclovoltammogramme der biokatalysierten Oxidation von Glucose, 5·10–2 M, und Ferrocencarboxylsäure, 5·10–4 M, in der Gegenwart von: (a) FAD-SP-GOD, 0,46 mg/ml, (b) FAD-MRH+-GOD, 0,46 mg/ml. Alle diese Experimente wurden in einer 0,1 M Phosphatpufferlösung, bei pH 7,0, bei 37°C, unter Argon aufgezeichnet. Spannungsscanrate, 5 mV/s.
  • 15 zeigt bioelektrokatalytische Oxidationsschemata von Glucose unter Verwendung von mit FAD-SP rekonstituiertem GOD (photoschaltbares Enzym).
  • 16 zeigt einen Lineweaver-Burk-Plot für die Sättigungsstromkurven: (i) FAD-SP-GOD (
    Figure 00220001
    ); (ii) FAD-MRH+-GOD (O).
  • 17 zeigt verschiedene isomere Formen, welche "AN"- (links) und "AUS"- (rechts) Zustände für das einschichtige mobilisierte FAD-SP-GOD zur Verfügung stellen.
  • 18 zeigt Cyclovoltammogramme von verschiedenen elektroenzymatischen Aktivitäten für Glucoseoxidation durch monoschichtig immobilisiertes FAD-SP-GOD, welches in verschiedenen isomeren Zuständen vorliegt. Glucosekonzentration, 50 mM. Spannungsscanrate, 5 mV/s.
  • 19 zeigt eine cyclische amperometrische Übertragung von optischen Signalen, aufgezeichnet durch die rekonstituierte photoisomerisierbare GOD-Monoschicht, welche auf einer Goldelektrode immobilisiert ist; (O) SP-Zustand, (☐) MRH+-Zustand.
  • 20 zeigt Cyclovoltammogramme von GOD, welches auf einer FAD-modifizierten Monoschicht-Goldelektrode rekonstituiert wurde: (a) Hintergrundelektrolytlösung alleine; (b) in der Gegenwart von Ferrocencarboxylsäure, 4·10–4 M; (c) mit Ferrocencarboxylsäure und hinzugefügter Glucose, 5·10–2 M. Alle Experimente wurden unter Argon in 0,01 M Phosphatpuffer und 0,1 Natriumsulfat aufgezeichnet, pH 7,0, 35°C, Spannungsscanrate 5 mV/s.
  • 21 zeigt Cyclovoltammogramme der PQQ-FAD-Diad-Monoschicht-Au-Elektrode (a) und von der PQQ-FAD-Diadmonoschicht nach Rekonstitution mit Apo-GOD (b). Alle Experimente wurden unter Argon unter 0,01 M Phosphatpuffer und 0,1 Natriumsulfat, bei pH 7,0, 25°C und einer Spannungsscanrate von 50 mV/s durchgeführt.
  • 22 zeigt Cyclovoltammogramme von GOD, welches auf der PQQ-FAD-Diad-Monoschichtelektrode rekonstituiert wurde; ohne Glucose (a) und in der Gegenwart von 80 mM Glucose (b). Alle Experimente wurden unter Argon in 0,01 M Phosphatpuffer und 0,1 M Natriumsulfatpuffer bei pH 7,0, 35°C und einer Spannungsscanrate von 5 mV/s aufgezeichnet.
  • 23 zeigt amperometrische Antworten von GOD, welches auf der PQQ-FAD-Diad-Monoschicht-Elektrode rekonstituiert wurde, bei verschiedenen Glucosekonzentrationen. Die Ströme wurden mit Hilfe von Chronoamperometrie bei einer letztendlichen Spannung von +0,2 V und 35°C bestimmt.
  • 24 zeigt eine amperometrische Antwort, produziert von GOD, welches auf einer PQQ-FAD-Monoschicht rekonstituiert wurde: (a) in der Abwesenheit von Glucose; und (b) in der Gegenwart von 50 mM Glucose, in der Abwesenheit von O2; (c) in der Gegenwart von 50 mM in einer Lösung, welche mit Luft gesättigt war; (d) in der Gegenwart von 50 mM, 0,1 mM Ascorbinsäure in Lösung gesättigt mit Luft. Ströme wurden durch Chronoamperometrie bei einer letztendlichen Spannung von 0,0 V vs. SCE bestimmt. Der Elektrolyt bestand aus 0,01 M Phosphatpuffer und 0,1 M Natriumsulfat, bei pH 7,0 und einer Messtemperatur, welche 35 ± 0,5°C betrug.
  • Beschreibung der speziellen Ausführungsformen
  • Die folgenden speziellen Ausführungsformen sind dazu gedacht, die Erfindung zu illustrieren und sollen nicht dazu dienen, den Umfang zu begrenzen. Der Fachmann wird keinen Zweifel hegen, dass diese speziellen Ausführungsformen ein Beispiel des gesamten Umfangs der Erfindung, wie oben definiert, darstellen.
  • Beispiele
  • 1. Chemische Syntheseschritte und biochemische Herstellungen
  • 1.1 Letzter Syntheseschritt bei der Herstellung von FAD-Ferrocenderivat
  • Amino-derivatisiertes FAD, N6-(2-aminoethyl)-FAD, (1) wurde in Übereinstimmung mit den Ergebnissen eines früheren Verfahrens synthetisiert(10). N-(2-Methylferrocen)capronsäure wurde, wie kürzlich beschrieben(7), synthetisiert. N6-(2-Aminoethyl)-FAD (10 mg, 1,1·10–5 mol) wurde mit N-(2-Methyl-ferrocen)capronsäure (18 mg, 5,5·10–5 mol) in der Gegenwart von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC, Aldrich; 11,6 mg, 5,5·10–5 mol) als ein Kupp lungsreagens und N-Hydroxy-3-sulfosuccinimidnatriumsalz (NSI, Aldrich; 13,2 mg, 5,5·10–5 mol) als einem Promotor (2) zur Reaktion gebracht. Die Kupplungsreaktion wurde in 1 ml von 0,1 M HEPES-Puffer bei pH 7,4 für 3 Std. bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Produkt wurde auf einer Sephadex G10-Säule unter Verwendung von Wasser als Eluent aufgereinigt. Die Abtrennung von nicht-reagierten Originalverbindungen wurde mit Hilfe einer Dünnschichtchromatografie (TLC) Rg = 0,49, 0,69, 0,93 für Amino-FAD, Fc-COOH bzw. das Diad-FAD-Fc durchgeführt. Die Struktur von FAD-Fc wurde durch H1-NMR-Spektrum bestätigt.
  • 1.2 Letzter Syntheseschritt in der Herstellung von FAD-Spiropyranderivat
  • Das Carboxylderivat von Spiropyran, 1'-(β-Carboxymethyl)-3',3'-dimethyl-6-nitro[2H-1]benzopyran-2,2'-indolin, SP-COOH, wurde, wie bislang beschrieben, hergestellt (Namba und Suzuki, Bul. Chem. Soc. Jpn, 48: 1323, 1975)(13). Das Diad, welches das Amino-FAD und die photoisomerisierbare Komponente (FAD-SP) enthielt, wurde in ähnlicher Weise, wie oben beschrieben, für FAD-Fc hergestellt, nämlich unter Verwendung von SP-COOH als Carboxylkomponente zur Kupplung mit dem Amino-FAD (3). Das Produkt wurde durch präparative TLC auf SiO2-Platten aufgereinigt, wobei Isopropanol : H2O (7 : 3) als Fließmittel verwendet wurde. Das Nitrospiropyran-modifizierte FAD zeigt reversible photoisomerisierbare Eigenschaften. Bestrahlung von FAD-SP bei einer Wellenlänge 360 nm < λ < 380 nm ("hv1" in 3), erzeugt den Nitromerocyanin-FAD-Isomerzustand, FAD-MRH+, welcher eine Absorptionsbande in der Region von 320–560 nm ausweist, welche zu den überlappenden Banden von MRHP+ (520 nm) und FAD (355 nm, 460 nm)- Chromophoren korrespondiert. Die Bestrahlung von MRH+-FAD-Lösung bei einer Wellenlänge λ > 475 nm ("hv2" in 3) erzeugt eine gelbe Lösung, welche die FAD-Absorptionsbande bei λ = 360 nm, 447 nm und die charakteristische SP-Absorption in der UV-Region aufzeigt. Die Photoisomerisation zwischen dem FAD-SP und dem FAD-MRH+ ist reversibel (3).
  • 1.3 Apo-Enzymherstellungen
  • Apo-Glucoseoxidase (Apo-GOD) wurde in ähnlicher Weise, wie bisher beschrieben, hergestellt (Morris und Buckler in Methods in Enzymology, Vol. 92, Part E, (J. J. Langone und V. Van Vunakis, Eds.), Academic Press, Inc. S. 415–417, 1983), nämlich durch An säuern einer Glucoseoxidase, GOD, Lösung (von Aspergillus niger, E.C. 1.1.3.4) bis pH = 1,7, gefolgt von Abtrennen auf einer Sephadex G-25-Säule und weiteren Aufreinigen mit Charcoal-dextran und Dialyse gegen 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,0 für 24 Stunden bei 4°C.
  • Das Apo-Protein, welches von der D-Aminosäureoxidase (D-aminoacid oxidase, DAAO; aus Schweinenieren, E.C. 1.4.3.3) gewonnen wurde, wurde hergestellt unter Befolgen eines ähnlichen Verfahrens, wie bisher beschrieben (Massey und Curti, J. Biol. Chem., 241: 3417, 1966) wie folgt: das Enzym wurde gegen eine 0,1 M Phosphatpufferlösung bei pH 8,5, enthaltend 1 M KBr und 3·10–3 MEDTA dialysiert, worauf eine Dialyse gegen einen 0,1 M Pyrophosphatpuffer bei pH 8,5 folgte und eine anschließende Aufreinigung in derselben Art und Weise wie für Apo-GOD. Beide Apo-Proteine zeigen keinerlei enzymatische Aktivität.
  • 1.4 Rekonstitution der Apo-Enzyme mit Diads: FAD-Fc und FAD-SP
  • Das Apo-GOD wurde mit FAD-Fc-Diad reagiert, um die mit Ferrocen-FAD rekonstituierte Glucoseoxidase zu erzeugen (4). Die Rekonstitution wurde in 3 ml an 0,1 M Na-Phosphatpuffer unter Rühren bei pH 7,0, enthaltend 9,6 mg (5,16·10–5 mol) Apo-GOD und 0,8 mg (6,7·10–4 mol) FAD-Fc, für 4 Std. bei Raumtemperatur durchgeführt, worauf eine Inkubation bei 4°C über Nacht folgte. Die Lösung wurde zweimal durch Filtration durch einen Filter mit einem Cut von 10000 filtriert und anschließend gegen 0,1 M Na-Phosphatpuffer bei pH 7,0 für einen Tag dialysiert. Die Beladung des rekonstituierten GOD wurde spektroskopisch als ein Molekühl des FAD-Fc-Diads pro Enzymuntereinheit bestimmt. Die Aktivität des rekonstituierten GOD war etwa 40% derjenigen des nativen GODs.
  • Das Apo-DAAO wurde mit dem FAD-Fc-Diad rekonstituiert und anschließend in ähnlicher Weise, wie oben für das Apo-GOD beschrieben, aufgereinigt. Die Beladung des rekonstituierten DAAO war etwa ein Molekül des FAD-Fc-Diads pro Enzym. Die Aktivität des rekonstituierten GODs betrug etwa 20%, verglichen mit der des nativen GODs.
  • Die Rekonstitution des Apo-GODs mit dem FAD-SP-Diad (5) wurde durch die Behandlung des Apo-GODs mit dem Diad (molares Verhältnis 1 : 10) in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,0 unter heftigem Schütteln für 24 Std. bei 25°C durchgeführt. Das Produkt wurde gegen 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,0 für 30 Std. dialysiert. Die Beladung des FAD-SP-Cofaktors war ungefähr 1, bezogen auf jede der Enzymuntereinheiten. Rekonstituiertes GOD zeigt etwa 80% der Aktivität des nativen GODs. Das rekonstituierte GOD zeigt photoisomerisierbare Eigenschaften. Bestrahlung des GODs, welches mit FAD-SP rekonstituiert wurde, bei einer Wellenlänge von 360 nm < λ < 380 nm führt zu einem Merocyaninisomerzustand, welcher unter Verwendung einer Bestrahlung mit einer Wellenlänge von λ > 475 nm zurückisomerisiert werden kann (5).
  • 2. Elektrodencharakterisation und elektrochemische Setups
  • Goldelektroden (0,5 mm Durchmesser Golddraht, welcher eine geometrische Fläche von ungefähr 0,2 cm2 aufwies; einen Rauhigkeitskoeffizienten von ungefähr 1,2 oder eine Goldfolie einer geometrischen Fläche von ungefähr 0,4 cm2 und einem Rauhig keitskoeffizienten von ungefähr 15) wurden für alle Modifikationen und Messungen verwendet. Die raue Goldelektrode wurde durch eine Behandlung mit flüssigem Quecksilber und einer weiteren Auflösung der Amalgamschicht in konzentrierter Salpetersäure erhalten (Katz et al., Electroanal. Chem., 367: 59, 1994) Ein Cyclovoltammogramm, aufgezeichnet in 0,5 M H2SO4 wurde verwendet, um die Reinheit der Elektrodenoberfläche unmittelbar vor der Modifikation zu bestimmen. Die reale Elektrodenoberfläche und die Koeffizienten der Rauhigkeit wurden aus dem gleichen Cyclovoltammogramm abgeschätzt durch Integrieren der Kathodenpeaks für die elektrochemische Reduktion der Oxidschicht auf der Elektrodenoberfläche (Woods in A. J. Bard (Ed.), Electroanalytical Chemistry, Dekker, New York, S. 1, 1978).
  • Elektrochemische Messungen wurden unter Verwendung eines Potentiostats ((EG&G) VersaStat) durchgeführt, welcher mit einem Personalcomputer (EG&G research electrochemistry software model 270/250) verbunden war. Alle diese Messungen wurden in einer elektrochemischen Zelle mit drei Kompartimenten durchgeführt, welche eine chemisch modifizierte Elektrode als Arbeitselektrode aufwiesen, eine gläserne Kohlenstoffhilfselektrode isoliert durch eine Glasfritte und eine gesättigte Calomelelektrode (SCE) verknüpft mit dem Arbeitsvolumen mit einer Lugginkapillare. Alle Potenziale wurden relativ zur Reverenzelektrode aufgezeichnet. Ein Argonblubberer wurde eingesetzt, um Sauerstoff aus der Lösung der elektrochemischen Zelle zu entfernen. Während der Messungen wurde die Zelle thermostatisiert, wobei ein Wasserkreislauf in einer Ummantelung um die Zelle herum verwendet wurde (die Temperatur wird in jedem der unten aufgeführten experimentellen Beispiele angezeigt).
  • 3. Elektrodenmodifikation
  • 3.1 Vorbehandlung
  • Um eine frühere organische Schicht zu entfernen und eine reine Metalloberfläche zu regenerieren, wurde die Elektrode mit einem kochenden 2 M Lösung von KOH für 1 Std. behandelt, anschließend mit Wasser gewaschen und in konzentrierter Schwefelsäure aufbewahrt. Unmittelbar vor der Modifikation wurde die Elektrode mit Wasser gespült, 10 min in konzentrierte Salpetersäure getaucht und dann anschließend wieder mit Wasser gespült.
  • 3.2 Elektrodenmodifikation mit Cystamin
  • Eine saubere, reine Goldelektrode wurde in eine Lösung von 0,02 M Cystamin eingetaucht (2,2'-Diaminodiethyldisulfid, Aldrich) in Wasser für 2 Std. eingetaucht. Die Elektrode wurde dann sorgfältig mit Wasser gewaschen, um nicht-absorbiertes Cystamin zu entfernen.
  • 3.3 Monoschichtimmobilisierung auf dem photoschaltbaren GOD, rekonstituiert mit FAD-SP
  • Eine Goldelektrode wurde mit einer aktiven Estergruppe durch Chemisorption von Dithio-bis-(succinimidylpropionat) (DSP, Aldrich) (Willner et al., 19922; Katz, E., J. Electroanal. Chem., 191: 257, (1990)) funktionalisiert und die Elektrode wurde anschließend mit dem GOD, welches mit FAD-SP rekonstituiert war (4 mg pro 1 ml von 0,01 M Phosphatpuffer bei pH 7,0) für 1 Std. (6) behandelt. Die Enzymelektrode wurde mit 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,0 gespült und sofort für elektrochemische Messungen verwendet.
  • 3.4 Elektrodenmodifikation mit einer FAD-Monoschicht
  • Eine Liponsäure-aktivierte Monoschicht wurde (1 Std., bei Raumtemperatur) auf einer rauen Goldoberfläche aus 10 mM Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) adsorbiert. Die resultierende Elektrode wurde zweimal mit 5 mM N6-(2-Aminoethyl)-FAD-Lösung in 0,1 HEPES-Puffer bei pH 7,3 für 1 Std. behandelt und anschließend mehrmals mit Wasser gespült (7A).
  • 3.5 Elektrodenmodifizierung mit einer PQQ-FAD-Monoschicht
  • Die Elektrodenmodifikation mit Pyrrolochinolinchinon, PQQ, (8) wurde, wie kürzlich beschrieben(14), durchgeführt. Eine Cystamin-Au-Monoschicht-modifizierte Elektrode wurde für 3 Std. in 0,01 M HEPES-Pufferlösung eingetaucht, bei pH 7,3, enthaltend 1 mM PQQ (Sigma). Anschließend wurde die modifizierte Elektrode sorgfältig mit Wasser gespült, um von seiner Oberfläche ungebundene physisch sorbierte PQQ-Moleküle zu entfernen. Die erhaltene PQQ-funktionalisierte Elektrode wurde mit 5 mM N6-(2-Aminoethyl)-FAD-Lösung in 0,1 HEPES-Puffer bei pH 7,3 in Gegenwart von 10 mM EDC für 1 Std. behandelt und anschließend sorgsam wieder mit Wasser gespült (7B).
  • 3.6 Apo-GOD-Rekonstitution auf FAD oder PQQ-FAD-funktionalisierten Elektrodenoberflächen
  • Jede FAD-funktionalisierte Elektrode (FAD allein und PQQ-FAD) wurde mit Apo-GOD-Lösung (ungefähr 3 mg/ml in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,0) unter heftigem Schütteln für 4 Stunden bei Raumtemperatur behandelt und anschließend für 16 Stunden bei 4°C. Anschließend wurde die modifizierte Elektrode mit 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,0 gespült und sofort für die elektrochemischen Messungen verwendet (7A & B).
  • 4. Ergebnisse
  • 4.1 Elektroenzym: GOD-rekonstituiert mit FAD-Fc
  • Das FAD-Fc-Diad zeigt in einer wässrigen Pufferlösung zwei charakteristische reversible Wellen bei –0,50 und 0,35 V (vs. SCE) (9). Diese Wellen korrespondieren mit dem Zwei-Elektronen-Redoxprozess von FAD bzw. der Ein-Elektronen-Redoxreaktion des Ferrocens. Der elektrochemische Prozess zeigt starke Adsorption des FAD-Fc-Diads auf der unmodifizierten Au-Elektrode. Das Cyclovoltammogramm von FAD-Fc-rekonstituiertem GOD zeigt nur den reversiblen Redoxprozess der Ferroceneinheit, was impliziert, dass die Ferrocenkomponente mit der Elektrode kommuniziert, wohingegen die im Enzym eingebundene FAD-Komponente keine direkte elektrische Kommunikation mit der Elektrode eingeht (9).
  • Eine Cystamin-modifizierte Elektrode wurde für elektrochemische Messungen auf dem rekonstituierten GOD verwendet, um zu verhindern, dass das Protein adsorbierte, was in der Enzymdenaturierung resultieren könnte. 10 zeigt die elektrokatalytischen anodischen Ströme, entwickelt durch das FAD-Fc-rekonstituierte GOD in der Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von hinzugefügter Glucose.
  • Die Kalibrationskurve, welche den Anodenstrom bei verschiedenen Konzentrationen zeigt, ist in 11 dargestellt. Die elektrobiokatalysierte Oxidation von Glucose kann unter Verwendung des Michaelis-Menten-Modells (Imax = 4 μA und Km = 2,9 mM, wobei Imax der Sättigungsstrom und Km die Michaelis-Menten-Konstante sind) analysiert werden. Wenn man die Oberflächenfläche und den Rauhigkeitsfaktor der arbeitenden Elektrode mit berücksichtigt, korrespondiert die maximale Stromdichte mit Imax = 8,3 μA/cm2. Zum Vergleich erreicht Glucoseoxidase unter vergleichbaren Bedingungen in der Gegenwart von Ferrocencarboxylsäure die Werte Km = 3,3 mM und Imax = 6,3 μA/cm2. Es kann also gefordert werden, dass die Rekonstitution vom Apo-GOD mit dem Ferrocen-modifizierten FAD ein semisynthetisches Elektroenzym bewerkstelligt, welches elektrische Kommunikation zwischen Elektrode und der biokatalytischen aktiven Stelle demonstriert (12).
  • Das rekonstituierte DAAO zeigt elektrische Kommunikation mit der Elektrodenoberfläche und elektrokatalytische Anodenströme wurden in der Gegenwart von D-Alanin als Substrat beobachtet. 13 zeigt die Cyclovoltammogramme, welche nach der Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von D-Alanin zu einer Lösung, welche das FAD-Fc-DAAO enthält, beobachtet wurde. Die entsprechende Kalibrationskurve wurde in ähnlicher Art und Weise unter Verwendung des Michaelis-Menten-Modells analysiert und die Werte Imax = 3,96 μA/cm2 und Km = 2,0 mM wurden für das semisynthetische elektroaktive DAAO erhalten. Ähnlich wie bei dem rekonstituierten GOD fungiert dieses rekonstituierte Enzym folglich ebenso als ein Elektroenzym.
  • 4.2 Die Rekonstitution von Apo-Glucoseoxidase mit einem Nitrospiropyran-modifizierten FAD-Cofaktor führt zu einem photoschaltbaren Biokatalysator
  • Das Apo-GOD rekonstituiert mit photoisomerisierbarem FAD-SP-Diad weist keine direkte nicht-vermittelte elektrische Kommunikation mit einer Elektrode auf. Folglich wurde die biokatalytische Oxidation von Glucose, welche dieses rekonstituierte Enzym verwendete, in der Gegenwart von Vermittlern des Elektronentransfers, welche über Diffusion mobil waren (Ferrocenderivate: Ferrocenmonocarboxylsäure, Ferrocendicarboxylsäure und Dimethylaminoethylferrocen) untersucht. Das rekonstituierte Enzym wurde in der gelösten Form oder immobilisiert als Monoschicht (siehe 3.3) angewandt. 14 zeigt die Cyclovoltammogramme, welche für die elektrobiokatalytische Oxidation von Glucose in der Gegenwart von Ferrocencarboxylsäure als einen diffusionskontrollierten Elektronentransfervermittler und des FAD-SP-rekonstituierten GOD erhalten wurden. Der elektrokatalytische Anodenstrom in der Gegenwart von FAD-MRH+-rekonstituierten GOD ist ungefähr 25% vergrößert im Vergleich zu dem FAD-SP-rekonstituierten GOD, was auf die höhere Aktivität des FAD-MRH+-GOD hindeutet. Die Anodenströme, welche von diesen Systemen in der Gegenwart von Glucose entwickelt werden, sind für beide isomerischen Zustände unterschiedlich: SP und MRH+: das System ist "AN" und "AUS" (15). Die detaillierte Michaelis-Menten-kinetische Analyse der biokatalytischen Funktion von FAD-SP-GOD und FAD-MRH+-GOD in der Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von Ferrocencarboxylsäure ist in 16 dargestellt. Die beiden Photoisomerzustände des Enzyms weisen ähnliche Werte Imax = 6,9·10–6 A auf, wobei die Km-Werte der beiden Enzymzustände substanziell unterschiedlich sind (7,82 M–1 bzw. 2,57 M–1 für FAD-SP-GOD und FAD-MRH+-GOD). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Elektronentransferrate der Oxidation des FAD-Cofaktors durch das Ferrocenyliumkation von ähnlicher Effektivität in den beiden Photoisomerzuständen des rekonstituierten GOD ist, jedoch die Interaktionen des Elektronenvermittlers mit dem Protein zum Erhalt der geeigneten Konfiguration für das Elektronentransfer in beiden Isomeren unterschiedlich ist. Bei geringeren Konzentrationen der Elektronentranfervermittler war der Unterschied hinsichtlich der biokatalytischen Aktivität größer und dieser Unterschied hing von der Art und Weise des Elektronentransfervermittlers ab, welcher verwendet wurde. So war beispielsweise der Unterschied in der Enzymaktivitäten für SP- und MRH+-Zustände sogar größer, wenn Dimethylaminoethylferrocen als ein Elektronentransfervermittler verwendet wurde (Ergebnisse sind nicht gezeigt).
  • Das FAD-SP-rekonstituierte GOD wurde als eine Monoschicht präpariert und in der Gegenwart von diffusionsmobilen Elektronentransfervermittler zur biokatalytischen Glucoseoxidation verwendet. Die Monoschicht kann in zwei verschiedene isomerische Zustände mit Hilfe von Licht umgewandelt werden (17). 18 zeigt Cyclovoltammogramme für die reversible Aktivierung und Deaktivierung der um die Monoschicht modifizierten Elektrode für biokatalytische Glucoseoxidation mit Hilfe von Licht. Die Aktivierung (das biokatalytische System umfasst das rekonstituierte GOD und den diffusionskontrollierten Vermittler und ist im "AN"-Zustand) und Deaktivierung (das System ist im "AUS"-Zustand) kann in reversibler Art und Weise vielfach wiederholt werden (19).
  • 4.3 Elektrisches Verdrahten von Glucoseoxidase durch Rekonstitution von FAD-modifizierten Monoschichten, präpariert auf Au-Elektroden
  • Die Elektrode, welche mit der FAD-Komponente allein modifiziert worden war (siehe 3.4) wurde verwendet, um das Apo-GOD direkt auf der Oberfläche zu rekonstituieren. Das immobilisierte FAD zeigte ein charakteristisches reversibles Cyclovoltammogramm, E° (bei pH = 7,0) = –0,50 V vs. SCE. Die Elektronentransferrate auf der Oberfläche betrug Konstanz zwischen der Elektrode und der FAD-Einheit ca. 230 s–1 und die Oberflächenkonzentration der FAD-Einheiten auf der Elektrode betrug ca. 3·10–11 mol/cm2, was mit einer nicht-dicht-gepackten Monoschichtbedeckung korrespondiert. Jedoch zeigte das rekonstituierte GOD auf der Elektrode in keinster Weise irgendwelche biokatalytische Aktivität in Abwesenheit der Elektronentransfervermittler. Dies rührt von der Unfähigkeit der Elektronen her, zwischen der Elektrode und der FAD-Einheiten, welche in das Apo-Protein eingebracht sind, zu transferieren. Es sollte festgehalten werden, dass die Abstände zwischen der Elektrode und den elektrochemischen Zentren der FAD-Einheit von der Mobilität der FAD-Einheiten abhängt. Freie (nicht in das Protein eingebracht) FAD-Einheiten sind durch lange flexible Spacer immobilisiert, sind mobil und können folglich Elektronenaustausch mit der Elektrode eingehen; jedoch die FAD-Einheiten, welche bereits in das Protein eingebracht wurden, verloren die Mobilität und haben einen langen Abstand von der Elektrodenoberfläche und können folglich nicht elektrisch mit der Elektrode kommunizieren. Jedoch kann die biokatalytische Aktivität in der Gegenwart von einem Elektronentransfervermittler, welcher durch Diffusion mobil ist, erreicht werden (20).
  • Um das wie oben beschriebene System zu verbessern, wurde eine Elektrode, welche mit zwei Redoxkomponenten: PQQ und FAD modifiziert war, verwendet (siehe 3.5). 21 (Kurve a) zeigt das Cyclovoltammogramm der PQQ-FAD-Diadmonoschicht-modifizierten Elektrode. Es besteht aus zwei Redoxwellen bei E° (bei pH = 7,0) = –0,125 und –0,50 V vs. SCE, was mit der Zwei-Elektronen-Reduktion der PQQ- bzw. FAD-Einheiten korrespondiert. Die Oberflächendichte ist ca. 3·10–11 mol cm^P2 für jede Komponente der Monoschicht. Die PQQ-FAD-Monoschicht wurde weiter mit Apo-GOD behandelt, um das rekonstituierte GOD direkt auf der modifizierten Grenzfläche zu produzieren. 21 (Kurve b) zeigt das Cyclovoltammogramm der resultierenden Elektrode nach erfolgter Rekonstitution. Die Redoxwelle, welche für die FAD-Einheiten charakteristisch ist, wird drastisch verkleinert, wohingegen die Redoxwelle, welche mit der PQQ-Komponente korrespondiert, unverändert bleibt. Dies ist konsistent mit der Tatsache, dass die FAD-Komponente, welche in das Protein eingebunden ist als ein Ergebnis der Rekonstitution, keine elektrische Kommunikation mit der Elektrodenoberfläche eingeht. Der kleine Rest der FAD-Welle, welche nach der Rekonstitution beobachtet wurde, korrespondiert mit freien FAD-Einheiten, die noch immer mit der Elektrode kommunizieren. Aus dem Unterschied in der FAD-Welle vor und nach der Rekonstitution wurde die Oberflächendichte des GOD auf der Elektrodenoberfläche abgeschätzt auf einen ungefähren Wert von 1,7·10–12 mol/cm2. Das Enzym, welches auf der PQQ-FAD-Diadmonoschicht rekonstituiert wurde, zeigt direkte elektrochemische Kommunikation mit der Elektrode und ist aktiv in der bioelektrokatalysierten Oxidation von Glucose. 22 zeigt die Cyclovoltammogramme der PQQ-FAD-rekonstituierten GOD-Monoschichtelektrode in der Gegenwart (Kurve a) und in der Anwesenheit (Kurve b) von Glucose. Ein hoher elektrokatalytischer Anodenstrom wird mit Glucose beobachtet, was darauf hinweist, dass das rekonstituierte Protein die Glucoseoxidation sehr effizient bioelektrisch katalysiert. Die PQQ-Komponente der Monoschicht fungiert als ein Elektronentransfer-Vermittler zwischen dem FAD, welches in das Protein eingebracht ist, und der Elektrode. Die elektrokatalytischen Anodenströme, welche von diesem System entwickelt wurden, werden durch die Glucosekonzentration in einer Größenordnung von 5–80 mM kontrolliert (23). Die Gegenwart von diatomarem Sauerstoff beeinflusst den Elektronentransfer von dem rekonstituierten GOD durch PQQ zu der Elektrode nur in geringem Umfang (für 80 mM Glucose sank der Anodenstrom in der Gegenwart von Sauerstoff ungefähr nur um 5%), was sehr ungewöhnlich für Glucosebiosensoren, basierend auf GOD, ist (Ergebnisse nicht gezeigt). Der Zusatz von 0,1 mM Ascorbat (eine für gewöhnlich in vivo beeinträchtigende Komponente) zu dem System, welches 5 mM Glucose enthielt, hatte keinerlei Auswirkung auf die amperometrische Antwort der Elektrode. Diese Ergebnisse legen den Verdacht nahe, dass die rekonstituierte PQQ-FAD-GOD-Monoschicht effiziente elektrische Kommunikation mit der Elektrodenoberfläche zeigt, welche in Konkurrenz mit den beeinträchtigenden Reaktionswegen steht.
  • 4.4 Umsatzrate von GOD, rekonstituiert auf einer PQQ-FAD-Monoschicht: keinerlei Beeinträchtigung von oxidierenden und reduzierenden Agenzien
  • Die obere Grenze der Umsatzrate der Glucoseoxidase bei 25°C ist GOD ±100 s–1 (C. Bourdillon et al., J. Am. Chem. Soc., 115: 12264 (1993)) und die Aktivierungsenergie beträgt 7,2 Kcal/mol–1 (H. G. Eisenwiener, Naturwissenschaften, 56: 563, (1969)). Bei der Temperatur, welche in den elektrobiochemischen Messungen, die in 22 und 23 gezeigt sind, verwendet wurde (35°C), übersetzt sich dieser Wert auf eine limitierte Umsatzrate von 900 ± 150 s–1 bei 35°C. Die Oberflächenbedeckung des rekonstituierten Enzyms auf der Elektrode beträgt 1,7·10–2 und verwendet man die theoretische Umsatzrate bei 35°C, beträgt die maximale Stromdichte, welche von der Elektrode beobachtet werden kann, 290 ± 60 μA/cm2. 23 zeigt, dass bei einer Glucosekonzentration von 80 mM der beobachtete Strom 1,9 mA ist (für eine Elektrode mit einer Oberflächenfläche von 0,4 cm2 und einem Rauhigkeitsfaktor von ca. 20). Diese übersetzt sich in eine experimentelle Stromdichte, welche mit 300 ± 100 μA/cm2 korrespondiert, einem Wert, der innerhalb der Größenordnung der limitierenden Umsatzrate des Enzymes liegt. Dies wird des Weiteren durch die Tatsache unterstützt, dass die Stromantwort linear mit der Glucosekonzentration steigt; 23 zeigt, dass der Strom durch die Diffusion der Glucose zu der aktiven Stelle kontrolliert wird, und dass die FAD-Stellen in ihrer oxidierten Form bei E ~0,2 Volt existieren.
  • Das essenzielle Nichtauftreten einer Beeinträchtigung durch umgebende Redoxreagenzien wird in 24 demonstriert. Dies ist ein Ergebnis einer sehr hohen Umsatzrate des Enzyms, welches es essenziell unsensitiv gegen nicht-spezifische Beeinträchtigungen macht. Folglich kann eine Elektrode dieser Art für kontinuierliche Messungen in einer ungeschützten Umgebung, z. B. in vivo, verwendet werden.

Claims (17)

  1. Eine Elektrode mit auf ihrer Oberfläche immobilisierten FAD-abhängigen Enzymen, wobei die Enzyme ein funktionalisiertes FAD aufweisen, das ein FAD ist, das durch das Hinzufügen einer funktionellen Gruppe oder eines Bereiches modifiziert ist, die oder der eine oder mehrere der folgenden Gruppen oder Bereiche ist: (a) ein Bindungsbereich, der chemisch mit der Elektrode assoziieren kann, sich an die Elektrode anlagern kann oder chemisch an die Elektrode absorbieren kann, wobei das Enzym auf der Elektrode durch Bindung der Bindungsgruppe an die Oberfläche der Elektrode immobilisiert ist; (b) eine Elektronenvermittlergruppe, die Elektronen zwischen der Oberfläche der Elektrode und dem FAD transferieren kann; und (c) eine fotoisomerisierbare Gruppe, die sich von einem Isomerisierungszustand in einen anderen durch Aussetzen an Licht einer ersten Wellenlänge verändern kann, wobei die Fotoisomerisierung entweder die elektrisch induzierte katalytische Aktivität erhöht oder verringert.
  2. Eine Elektrode gemäß Anspruch 1, worin das funktionalisierte FAD einen Bindungsbereich und eine Elektronenvermittlergruppe umfasst.
  3. Eine Elektrode gemäß Anspruch 2 zur Verwendung in der in vivo-Bestimmung eines Analyten.
  4. Ein Verfahren zur Herstellung einer Elektrode mit FAD-abhängigen Redoxenzymen, die darauf immobilisiert sind, wobei der Prozess: (a) die Herstellung von Apo-Enzymen durch die Behandlung eines FAD-abhängigen Enzyms in einer Weise, dass der FAD-Cofaktor daraus entfernt wird; (b) die Herstellung eines funktionalisierten FAD durch kovalente Bindung an einen Bindungsbereich, der zur chemischen Assoziation mit, zur Anlagerung an oder zu einer chemischen Absorption an die Oberfläche der Elektrode in der Lage ist; (c) das Reagieren des funktionalisierten FAD mit einer Elektrode unter Bedingungen, so dass das modifizierte FAD auf der Elektrode durch chemische Assoziation, Anlagerung oder Adsorption an den Bindungsbereich auf der Oberfläche der Elektrode immobilisiert wird; und (d) das Reagieren der in (c) erhaltenen Elektrode mit dem Apo-Enzym unter Bedingungen, bei denen das Apo-Enzym mit dem modifizierten FAD kombiniert, um funktionelle immobilisierte Enzyme zu ergeben; umfasst.
  5. Ein Verfahren zur Herstellung einer Elektrode mit darauf immobilisierten FAD-abhängigen Redoxenzymen, wobei der Prozess: (a) das Behandeln einer Elektrode, um eine Monoschicht zu erthalten, die eine Elektronenvermittlergruppe umfasst, wobei die Elektronenvermittlergruppe einen Bindungsbereich aufweist, der zur chemischen Assoziation mit, Anlagerung an oder chemischen Adsorption an die Oberfläche der Elektrode in der Lage ist, wobei die Behandlung die Bindung des Bindungsbereiches an die Oberfläche der Elektrode umfasst; (b) das Reagieren der in (a) erhaltenen Elektrode mit einem FAD, so dass das FAD auf der Elektrode durch chemische Anlagerung an die Elektronenvermittlergruppe immobilisiert wird; (c) das Reagieren der in (b) erhaltenen Elektrode mit dem Apo-Enzym eines FAD-abhängigen Enzyms unter Bedingungen, bei denen das Apo-Enzym mit der FAD-Komponente des immobilisierten FAD kombiniert; umfasst.
  6. Ein Verfahren zur Herstellung von Elektroden, die immobilisierte Enzyme mit einer assoziierten fotoisomerisierbaren Gruppe umfassen, die ihren Isomerisierungszustand durch Aussetzen an Licht bei einer bestimmten Wellenlänge ändern kann, wodurch die Geschwindigkeit der elektrisch induzierten katalytischen Aktivität des Enzyms verändert wird, wobei das Verfahren: (a) das Herstellen eines Apo-Enzyms durch die Behandlung eines FAD-abhängigen Enzyms, um das FAD daraus zu entfernen; (b) das Herstellen eines modifizierten FAD durch kovalente Bindung einer Gruppe, die in der Lage ist, sich an eine fotoisomerisierbare Gruppe anzulagern oder zu binden; (c) das Reagieren des modifizierten FAD mit der fotoisomerisierbaren Gruppe, um ein fotoisomerisierbares FAD zu ergeben; (d) das Kombinieren des Apo-Enzyms mit dem fotoisomerisierbaren FAD, um ein rekonstituiertes fotoisomerisierbares Redoxenzym zu ergeben; und (e) das Zurverfügungstellen einer Elektrode, die darauf immobilisierte Verbindungsgruppen trägt, und das Reagieren der rekonstituierten Enzyme mit den Elektroden, so dass die Enzyme kovalent an die Verbindungsgruppen gebunden werden; umfasst.
  7. Ein elektrochemisches System zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Analyten in einem Flüssigkeitsmediums, wobei das System: (a) eine Elektrode, die auf ihrer Oberfläche FAD-abhängige Enzyme trägt, wobei die Enzyme in der Lage sind, eine Redoxreaktion zu katalysieren, in welcher ein Analyt in ein Produkt umgewandelt wird, wobei die Enzyme ein funktionalisiertes FAD mit einem Bindungsbereich umfassen, der chemisch assoziiert mit, angelagert an oder chemisch adsorbiert an die Oberfläche der Elektrode ist; (b) eine Elektronenvermittlergruppe, die Elektronen zwischen der Oberfläche der Elektrode und dem FAD transferieren kann; (c) ein elektrischer Stromkreis zum Laden der Elektrode und Messung der elektrischen Reaktion; umfasst.
  8. Ein System gemäß Anspruch 7, worin die Elektronenvermittlergruppe Teil von oder kovalent gebunden an das funktionalisierte FAD ist.
  9. Ein System gemäß Anspruch 7, worin die Elektronenvermittlergruppe kovalent an das Enzym gebunden ist.
  10. Ein System gemäß Anspruch 7, worin die Elektronenvermittlergruppe frei in einem Medium treibt, das die Elektrode umgibt.
  11. Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins eines Analyten in einem Flüssigkeitsmedium, wobei das Verfahren: (a) das Zurverfügungstellen eines Systems gemäß Anspruch 7; (b) das Einführen einer Probe von besagtem Flüssigkeitsmedium in die elektrochemische Zelle des Systems; (c) das Laden der Elektrode und das Messen der elektrischen Reaktion, einer Änderung in der elektrischen Reaktion im Vergleich zu einer elektrischen Reaktion unter der gleichen Bedingung in einem Kontrollmedium, das den Analyten nicht umfasst, was das Vorhandensein des Analyten in dem System anzeigt; umfasst.
  12. Ein Verfahren gemäß Anspruch 11, worin die Analytenbestimmung in vivo durchgeführt wird.
  13. Ein elektrochemisches System zur Aufnahme optischer Signale mit einer ersten Wellenlänge und einer elektrischen Weitergabe der aufgenommenen Signale, wobei das System eine elektrochemische Zelle aufweist, die: (a) eine Elektrode, die immobilisierte FAD-abhängige Redoxenzyme trägt, wobei die Enzyme: (aa) ein funktionalisiertes FAD aufweisen, das eine fotoisomerisierbare Gruppe umfasst, die ihren Isomerisierungszustand von einem ersten zu einem zweiten Zustand nach Fotostimulierung durch Licht der ersten Wellenlänge ändert, wobei eine Änderung in dem Isomerisierungszustand eine Änderung in der Geschwindigkeit der katalytischen Aktivität des Redoxenzyms bewirkt; und (ab) auf der Oberfläche der Elektrode durch eine Verbindungsgruppe immobilisiert sind, die entweder (aba) Teil von oder kovalent gebunden an das funktionalisierte FAD ist, oder (abb) kovalent an einen externen Bereich auf der Oberfläche des Enzyms gebunden ist; (b) eine Elektronenvermittlergruppe, die Elektronen zwischen der Elektrode und dem FAD transferieren kann; (c) ein Substrat für die katalytische Aktivität des Enzyms; und (d) einen elektrischen Stromkreis zum Laden der Elektrode und Messung der elektrischen Reaktion; umfasst.
  14. Ein System gemäß Anspruch 13, worin das Enzym auf der Oberfläche der Elektrode durch eine Verbindungsgruppe immobilisiert ist, die kovalent an einen externen Bereich auf der Oberfläche des Enzyms gebunden ist.
  15. Ein System gemäß Anspruch 13 oder 14, worin die Elektronenvermittlergruppe frei in dem Medium, das die Elektrode umgibt, treibt.
  16. Ein System gemäß einem der Ansprüche 13–15, umfassend einen Lichtschalter, der Licht bei einer zweiten Wellenlänge emittiert, wobei besagte zweite Wellenlänge die fotoisomerisierbare Gruppe von dem zweiten Zustand in den ersten Zustand fotoisomerisiert.
  17. Ein Verfahren zur Aufnahme von optischen Signalen mit einer ersten Wellenlänge und einer elektrischen Weitergabe der aufgenommenen optischen Signale, wobei das Verfahren: (a) das Zurverfügungstellen eines Systems gemäß einem der Ansprüche 13–16; (b) das Aussetzen der Elektrode an eine Lichtquelle; (c) das Laden der Elektrode und die Messung der elektrischen Reaktion, umfasst, wobei die elektrischen Reaktion verändert wird, was das Aussetzen an Licht mit besagter ersten Wellenlänge anzeigt.
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