ES2214620T3

ES2214620T3 - Electrodos electroquimicos y fotoquimicos y su utilizacion.

Info

Publication number: ES2214620T3
Application number: ES97922016T
Authority: ES
Inventors: Itamar Willner; Eugeny Katz; Ron Blonder; Vered Heleg-Shabtai
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1996-05-27
Filing date: 1997-05-27
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2017-05-27
Also published as: ATE257943T1; IL118432A; EP1002229B1; DE69727250D1; US6350368B1; WO1997045720A1; EP1002229A1; IL118432A0; AU2786997A; DE69727250T2

Abstract

Se describen electrodos que llevan en su superficie enzimas FAD dependientes. El FAD se modifica para incluir un grupo funcional o resto que afecta a las propiedades de la enzima. El grupo funcional o resto puede ser un resto de enlace a través del cual se inmoviliza el complejo de enzima - FAD en el electrodo; puede ser un grupo mediador electrónico para transferir electrones entre el electrodo y el FAD; o puede ser un grupo fotoisomerizable que puede sufrir fotoisomerización y producir un cambio del ritmo de la actividad catalítica inducida eléctricamente de la enzima. Los electrodos pueden utilizarse en sistemas electroquímicos para deformar analitos en un medio líquido o para registrar señales ópticas.

Description

Electrodos electroquímicos y fotoquímicos y su utilización.

Campo de la invención

La presente invención se refiere, generalmente, al campo de la bioelectrónica y se refiere a matrices sólidas conductoras de la electricidad (que en este documento se denominarán "electrodos") que llevan enzimas redox de manera que una carga eléctrica puede fluir entre la superficie del electrodo y las enzimas haciéndolas catalíticamente activas. La invención proporciona también un proceso para preparar los electrodos, así como dispositivos, sistemas y métodos que usan dichos electrodos. Según una realización, la invención se aplica para determinar la presencia y opcionalmente la concentración de un analito en un medio líquido. Según otra realización, las enzimas inmovilizadas se pueden activar por la luz en dos estados biocatalíticos distintos, permitiendo así la transducción y amplificación de las señales ópticas grabadas, completando así las funciones de "lectura" y "escritura", haciendo que dichos electrodos sean útiles para almacenar y procesar información óptica.

Técnica anterior

La técnica anterior que se cree relevante como antecedente para la presente invención consiste en lo siguiente:

1. Degani, Y., Heller, A., J. Am. Chem. Soc., 110: 2615, 1988.

2. Willner, I., Katz, E., Riklin, A., Kasher, R., J. Am. Chem. Soc., 114: 10965, 1992.

3. Willner et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.443.701.

4. Lion-Dagan, M., Katz, E., Willner, I., J. Amer. Chem. Soc., 116: 7913, 1994.

5. Willner, I., Lion-Dagan, M., Marx-Tibbon, S., Katz, E., J. Amer. Chem. Soc., 117: 6581, 1995.

6. Willner, I. y Rubin, S., Angen. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 367, 1996.

7. Willner, I., Riklin, A., Shoham, B., Rivenson, D., Katz, E., Adv. Mater., 5: 912, 1993.

8. Massey, V., Hemmerich, P., en Flavins and Flavoproteins, V. Massey & C.H. Williams (Eds.), Elsevier, Amsterdam, 83-96, 1982.

9. Walsh, C., Fisher, J., Spencer, R., Graham, D.W., Ashton, W.T., Brown, J.E., Brown, R.D., Rogers, E.F., Biochemistry, 78: 1942, 1978.

10. Bückmann, A.F., Erdmann, H., Pietzch, M., Hall, J.M., Bannister, J.V. en K. Kuneoyagi (Ed.), Flavins and Flavoproteins, Gruyter, Berlin, p. 597, 1994.

11. Riklin, A., Katz, E., Willner, I., Stocker, A., Bückmann, A.F., Nature, 376: 672, 1995.

12. Willner, I., Liondagan, M., Marxtibbon, S., Katz, E., J. Amer. Chem. Soc., 117: 6581, 1995.

13. Namba, K., Suzuki, S., Bull. Chem. Soc. Jpn., 48: 1323, 1975.

14. Katz, E., Schlereth, D.D., Schmidt, H.L., J. Electroanal. Chem., 367:59, 1994.

Antecedentes de la invención

El acoplamiento covalente de grupos activos redox (ferroceno, bipiridinio, etc.) a restos de aminoácidos de enzimas redox produce biocatalizadores que se comunican eléctricamente con electrodos de enzimas "conectadas"^{(1-3)} eléctricamente. Las enzimas modificadas por grupos fotoisomerizables (por ejemplo, nitroespiropirano/nitromerocianina) muestran diferentes actividades enzimáticas para los diferentes estados fotoisoméricos^{(4,5)} generados por inducción luminosa. El uso de biocatalizadores fotoactivables como matrices activas para grabaciones ópticas y dispositivos optobioeléctricos se revisó recientemente^{(6)}.

Las enzimas conectadas eléctricamente se utilizaban para determinar analitos en células electroquímicas por unión del electrobiocatalizador a los electrodos^{(3,7)}. En todos los sistemas descritos, las unidades electroactivas o fotoactivas funcionales se distribuyen aleatoriamente alrededor de la proteína. La efectividad del contacto eléctrico entre el centro redox de la enzima y el electrodo es limitada. En consecuencia, la velocidad de transferencia de electrones entre el centro redox de la enzima es relativamente lenta. Esto da como resultado reacciones de transferencia de electrones que compiten con co-sustratos (por ejemplo, oxígeno) o sustratos que interfieren (por ejemplo, oxidación de ácido úrico o ácido ascórbico). En consecuencia, la magnitud de las corrientes resultantes que ensayan los analitos respectivos son moderadamente bajas y el análisis se tiene que llevar a cabo en un ambiente libre de oxígeno. Se debe tener especial cuidado para eliminar cualquier reactivo interferente del medio de análisis.

Para la mayoría de enzimas (por ejemplo, flavoenzimas) se puede retirar el cofactor FAD de la proteína nativa para dar la apoproteína desplegada que se puede reconstituir de nuevo con el cofactor natural o los cofactores FAD modificados químicamente para dar la enzima bioactiva^{(8-10)}. La reconstitución de las apoflavoenzimas con un cofactor FAD unido a un grupo mediador de electrones generaba una "electroenzima" que presentaba contacto eléctrico con las superficies del electrodo. La transferencia mediada por electrones activa las enzimas reconstituidas para la oxidación electrocatalítica de sus sustratos^{(11)}.

Los electrodos enzimáticos para determinación electroquímica de un analito pueden operar como dispositivos analíticos invasivos o no invasivos. Para los análisis invasivos, los electrodos se deben construir de sustancias biocompatibles no peligrosas, y los electrodos se deben fabricar como agujas finas para omitir el dolor tras la penetración invasiva. La pequeña área superficial de los electrodos se debe compensar con una elevada actividad eléctrica de los biocatalizadores sensibles para dar respuestas de corriente medibles.

Las funciones de las enzimas modificadas por unidades fotoisomerizables sustituidas aleatoriamente sólo se activan de manera incompleta por señales externas de luz. La estructura de perturbación del ambiente de la proteína del centro redox activo de las enzimas se ve afectado sólo parcialmente por unidades fotoisomerizables remotas. Esto da sólo una desactivación parcial e incompleta de la enzima fotoisomerizable^{(12)}.

Descripción general de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método y un sistema electroquímico para determinar la presencia y opcionalmente la concentración de un analito en un medio líquido.

Otro objeto más de la invención es proporcionar electrodos para usar en dicho método y sistema. Es particularmente un objeto de la invención proporcionar dichos electrodos que comprenden una matriz sólida conductora de la electricidad que lleva enzimas inmovilizadas de manera que la carga y el flujo eléctrico entre el electrodo y las enzimas hace a la enzima catalíticamente activa, catalizando una reacción en la que el analito a analizar se transforma en un producto.

Otro objeto más de la invención es proporcionar dichos electrodos con un transporte de electrones elevado y eficaz entre el electrodo y las enzimas de manera que el electrodo es prácticamente insensible a la presencia de otros agentes redox interferentes, es decir, hay un mínimo de reacciones redox no específicas.

Otro objeto más de la invención es proporcionar electrodos enzimáticos en los que las entidades inmovilizadas sobre los electrodos no son tóxicas ni inmunogénicas, permitiendo el uso del electrodo en análisis invasivo.

Otro objeto más de la invención es proporcionar electrodos enzimáticos con enzimas fotoactivables inmovilizadas sobre la superficie del electrodo, para usar en la grabación de señales ópticas y en la transducción de señales ópticas grabadas.

Otro objeto de la invención es proporcionar usos de los electrodos de la invención así como sus procesos de preparación.

Otros objetos de la invención se aclararán a partir de la siguiente descripción.

La presente invención tiene dos aspectos: un aspecto, que en este documento se denominará "primer aspecto", en el que el electrodo es útil para determinar la presencia y opcionalmente la concentración de un analito en un medio líquido; y otro aspecto, que en este documento se denominará "segundo aspecto" en el que la respuesta eléctrica del electrodo está fotorregulada (es decir, el grado de respuesta eléctrica se puede controlar por irradiación de luz a una longitud de onda específica) permitiendo el uso del electrodo en la grabación de señales ópticas y la transducción eléctrica de las señales ópticas grabadas. Ambos aspectos de la presente invención comparten un denominador común, pues los electrodos llevan enzimas inmovilizadas y las enzimas tienen cofactores funcionalizados, es decir, cofactores modificados añadiendo un grupo o resto funcional (dichas enzimas se denominan, en ocasiones, "enzimas funcionalizadas").

Según la invención, una enzima funcionalizada se puede obtener reconstituyendo una apoenzima (una enzima con su cofactor) con un FAD modificado por la adición de un grupo o resto funcional ("FAD funcionalizado").

Según otra realización el grupo o resto funcional es un resto de unión que puede asociarse químicamente con, unirse a o adsorberse químicamente sobre la superficie del electrodo. Según otra realización, el grupo o resto funcional es un grupo mediador de electrones que es un grupo capaz de cambiar reversiblemente su estado redox y transferir electrones de y al FAD. Según otra realización el grupo funcionalizado es un grupo fotoisomerizable que puede cambiar su estado de isomerización tras la fotoestimulación. Es posible también, según las otras realizaciones de la invención que el FAD funcionalizado tenga más de un grupo o resto funcional, por ejemplo, un resto de unión y un grupo mediador de electrones, o un resto de unión y un grupo fotoisomerizable, etc.

En el caso de un FAD funcionalizado que tiene un grupo mediador de electrones, y particularmente cuando el FAD funcionalizado tiene tanto un resto de unión como un grupo mediador de electrones, hay una transferencia de electrones muy eficaz entre el electrodo y el FAD, dando una velocidad de renovación de enzima que se aproxima a las consideraciones teóricas máximas. Dicho electrodo que es particularmente útil según el primer aspecto de la invención, da lugar a una respuesta eléctrica muy alta a un cambio en la concentración de analito. Además, la elevada velocidad de renovación hace al electrodo prácticamente insensible a los agentes interferentes tales como agentes oxidantes o reductores no específicos, por ejemplo, oxígeno, ácido ascórbico, ácido úrico, etc.

Según el primer aspecto de la invención, el FAD funcionalizado comprende, preferiblemente, un grupo mediador de electrones. Debe observarse que cuando el FAD funcionalizado en la enzima funcionalizada usado en el primer aspecto no comprende un grupo mediador de electrones, hay un grupo mediador de electrones que puede estar moviéndose libremente en solución o inmovilizado independientemente sobre la superficie del electrodo, junto al FAD modificado.

Según el segundo aspecto de la invención, cuando el FAD funcionalizado tiene un grupo fotoisomerizable, las enzimas tiene dos estados catalíticos que representan los estados "ACTIVADO" y "DESACTIVADO". Esto permite "escribir" un fotosuceso sobre la superficie del electrodo, que después el electrodo "memoriza" mediante el estado fotoisomerizable inducido del cofactor funcionalizado y después el electrodo puede "leer" este estado midiendo un cambio en la respuesta eléctrica.

En el método y el sistema de la invención, los cambios en la concentración del analito en el caso del primer aspecto o un cambio en el estado de isomerización en el segundo aspecto dan lugar a un cambio en la respuesta eléctrica. El término "respuesta eléctrica" que se usa en este documento denota el comportamiento corriente-tensión de un electrodo, por ejemplo, la corriente de respuesta o el flujo de carga de un electrodo aplicando un cierto potencial, etc. La respuesta eléctrica se puede determinar midiendo la corriente o el flujo de carga, en condiciones de corriente alterna o corriente continua.

En lo sucesivo, el término "determinar" o "determinación" se usará para denominar la determinación sólo de la presencia o para determinar la presencia y la concentración de un analito en un medio líquido.

En lo sucesivo, se usará también el término "reconstitución" para hacer referencia a la unión conjunta de una apoenzima (enzima sin su cofactor) con un cofactor para obtener una enzima funcionalizada. Según la invención, la reconstitución de la enzima se lleva a cabo con un cofactor FAD funcionalizado sintético. El término "enzima funcionalizada reconstituida" se usará para denominar una enzima obtenida por reconstitución de una apoenzima con un cofactor funcionalizado.

La enzima funcionalizada reconstituida con un FAD funcionalizado tendrá propiedades que estarán influenciadas por el tipo de modificación del FAD. Por ejemplo, una enzima funcionalizada que tiene un FAD que comprende un grupo de unión con un resto de unión y que tiene un grupo mediador de electrones será electrobiocatalíticamente activa y capaz de recibir electrones directamente desde o transferir electrones al electrodo (dependiendo de si cataliza en una ruta de reducción u oxidación, respectivamente), sin necesidad de un grupo mediador de electrones diferente. Dicha enzima funcionalizada presenta un contacto eléctrico muy eficaz con el electrodo con una renovación de la enzima que se aproxima a la consideración teórica máxima. Una enzima funcionalizada con un FAD funcionalizado que tiene un grupo fotoisomerizable tendrá diferentes propiedades electrobiocatalíticas, dependiendo del estado de isomerización del grupo fotoisomerizable; las propiedades catalíticas de la enzima se pueden controlar, por lo tanto, mediante la luz.

Según los contenidos de la invención se proporciona, por lo tanto, un electrodo que lleva enzimas dependientes de FAD sobre su superficie, las enzimas tienen un FAD funcionalizado, que es un FAD modificado por la adición de un grupo o resto funcional, que es uno o más del grupo compuesto por:

(a): un resto de unión que puede asociarse químicamente con, unir a o adsorber químicamente sobre el electrodo, inmovilizándose la enzima sobre el electrodo por unión del grupo de unión a la superficie del electrodo;

(b): un grupo mediador de electrones que puede transferir electrones entre la superficie del electrodo y el FAD; y

(c): un grupo fotoisomerizable que puede cambiar de un estado de isomerización a otro por exposición a luz de una primera longitud de onda, dicha fotoisomerización puede aumentar o disminuir la actividad catalítica inducida eléctricamente.

Los electrodos preferidos para usar según el primer aspecto de la invención son aquellos en los que el FAD funcionalizado comprende un resto de unión y un grupo mediador de electrones. Típicamente, el grupo mediador de electrones se intercala entre el resto de unión y el resto del FAD funcionalizado, permitiendo de esta manera una transferencia de electrones rápida y eficaz entre la superficie del electrodo y el FAD.

En electrodos para usar según el segundo aspecto de la invención, las enzimas funcionalizadas se pueden unir a veces al electrodo mediante un grupo unido a un residuo superficial de la proteína en uno de sus extremos y que tiene un resto de unión en el otro extremo. Alternativamente, el FAD funcionalizado puede comprender un grupo fotoisomerizable y un resto de unión unido al electrodo.

La presente invención proporciona también un proceso de preparación de un electrodo que tiene enzimas redox dependientes de FAD inmovilizadas sobre el mismo, comprendiendo el proceso:

(a): preparar apoenzimas tratando una enzima dependiente de FAD para retirar el cofactor FAD de la misma;

(b): preparar un FAD funcionalizado por unión covalente a un resto de unión que puede asociarse químicamente con, unirse a o adsorberse químicamente sobre la superficie del electrodo;

(c): hacer reaccionar el FAD funcionalizado con el electrodo en condiciones tales que el FAD modificado se inmovilice sobre el electrodo por asociación, unión o adsorción química del resto de unión sobre la superficie del electrodo; y

(d): hacer reaccionar el electrodo obtenido en (c) con la apoenzima en condiciones tales que la apoenzima se combine con el FAD modificado para dar enzimas funcionales inmovilizadas.

Como se entenderá, en el proceso anterior, se pueden invertir las etapas (a) y (b). Además, a veces es posible combinar en primer lugar la apoenzima con el FAD modificado y sólo entonces inmovilizar todo el complejo sobre la superficie del electrodo.

Cuando el FAD funcionalizado comprende otros grupos funcionales, es decir, un grupo mediador de electrones o un grupo fotoisomerizable, estos se pueden incluir, a priori, en el FAD modificado antes de inmovilizarlo sobre el electrodo, o se pueden añadir al FAD modificado después de la inmovilización. Un esquema de inmovilización preferido para preparar un electrodo para usar según el primer aspecto, comprende:

(a): tratar un electrodo para obtener una monocapa que comprende un grupo mediador de electrones, teniendo el grupo mediador de electrones un resto de unión que es capaz de asociarse, unirse o adsorberse químicamente a la superficie del electrodo, el tratamiento comprende la unión del resto de unión sobre la superficie del electrodo;

(b): hacer reaccionar el electrodo obtenido en (a) con un FAD tal que el FAD se inmoviliza sobre el electrodo por unión química al grupo mediador de electrones;

(c): hacer reaccionar el electrodo obtenido en (b) con la apoenzima en condiciones en las que la apoenzima se combina con el componente FAD del FAD modificado.

La presente invención proporciona también, por otra de sus características, un sistema electroquímico para determinar la presencia de un analito en un medio líquido, comprendiendo el sistema:

(a): un electrodo que lleva sobre su superficie enzimas dependientes de FAD, las enzimas pueden catalizar una reacción redox en la que un analito se transforma en un producto, las enzimas comprenden un FAD funcionalizado que tiene un resto de unión que se asocia químicamente con, se une a o se adsorbe químicamente sobre la superficie del electrodo;

(b): un grupo mediador de electrones que puede transferir electrones entre la superficie del electrodo y el FAD, el grupo mediador de electrones puede

(ba): formar parte de o unirse covalentemente al FAD funcionalizado,

(bb): inmovilizarse independientemente sobre la superficie del electrodo,

(bc): unirse covalentemente a la enzima, o

(bd): moverse libremente (es decir, que no está inmovilizado) en un medio que rodea al electrodo; y

(c): un circuito eléctrico para cargar el electrodo y medir la respuesta eléctrica.

Como se entenderá, la especificidad del analito del sistema se determina por el tipo de enzima inmovilizada.

La presente invención proporciona, además, un método para determinar la presencia de un analito en un medio líquido, comprendiendo el método:

(a): proporcionar un sistema electroquímico como el definido anteriormente;

(b): introducir una muestra de dicho medio líquido en la célula electroquímica del sistema;

(c): cargar el electrodo y medir la respuesta eléctrica; un cambio en la respuesta eléctrica comparada con la respuesta eléctrica en las mismas condiciones en un medio de control que no comprende el analito, indica la presencia del analito en el sistema.

Los electrodos según el primer aspecto de la invención presentan velocidades de renovación elevadas que se aproximan a las concentraciones teóricas y son, por tanto, prácticamente insensibles a diversos agentes de oxidación o reducción no específicos tales como oxígeno, etc. Este es particularmente el caso de los electrodos de la invención cuando el grupo mediador de electrones forma parte de o está unido covalentemente al FAD funcionalizado. Dichos electrodos son adecuados, por lo tanto, para llevar a cabo la medida en un ambiente no protegido, por ejemplo, las medidas realizadas in vivo. Un ejemplo particular es un electrodo en forma de aguja que se puede insertar en una vena sanguínea y medir continuamente el parámetro deseado, por ejemplo, el nivel de glucosa. Todas las entidades de la superficie de los electrodos, es decir, las enzimas, se pueden preparar de manera que sean idénticas a las que normalmente están presentes en el interior del cuerpo y según esto, típicamente no habrá inmunorespuesta o efecto tóxico que, de otra manera, sería el resultado a una exposición continua a una entidad
extraña.

Los electrodos y sistemas para la medida continua in vivo de diversos parámetros, son particularmente preferidos según el primer aspecto de la invención.

Las enzimas que se pueden usar según la invención incluyen glucosa oxidasa (GOD), en cuyo caso el analito será glucosa; D-aminoácido oxidasa (DAAO), en cuyo caso el analito es un D-aminoácido (por ejemplo, D-alanina); lactato oxidasa (LacOx), en cuyo caso el analito es ácido láctico; glutatión reductasa (GR), en cuyo caso el analito es glutatión oxidado; y otras muchas flavoenzimas.

Según un segundo aspecto de la invención se proporciona un sistema electroquímico para grabar señales ópticas que tienen una primera longitud de onda y la transducción eléctrica de las señales grabadas, teniendo el sistema una célula electroquímica que comprende:

(a) un electrodo que lleva enzimas redox dependientes de FAD inmovilizadas, la enzima:

(aa): tiene un FAD funcionalizado que comprende un grupo fotoisomerizable que cambia de estado de isomerización de un primer estado a un segundo estado tras la fotoestimulación con luz de la primera longitud de onda, un cambio en el estado de isomerización que da lugar a un cambio en la tasa de actividad catalítica de la enzima redox,

(ab): está inmovilizada sobre la superficie del electrodo mediante un grupo de unión que

(aba): forma parte de o está unido covalentemente al FAD funcionalizado, o

(abb): está unido covalentemente a un resto externo sobre la superficie de la enzima;

(b) un grupo mediador de electrones que puede transferir electrones entre el electrodo y el FAD, el grupo mediador de electrones está

(ba): moviéndose libremente en el medio que rodea al electrodo,

(bb): inmovilizado independientemente sobre la superficie del electrodo;

(bc): unido covalentemente a la enzima, o

(bd): unido covalentemente a o formando parte del FAD modificado;

(c) un sustrato para la actividad catalítica de la enzima; y

(d) un circuito eléctrico para cargar el electrodo y medir la respuesta eléctrica.

Preferiblemente, el grupo fotoisomerizable se puede isomerizar de manera inversa exponiéndolo a luz de regiones con longitudes de onda distintas. Por lo tanto, la irradiación luminosa a una primera longitud de onda cambiará el estado de isomerizacion de un primer estado a un segundo estado, mientras que la luz de una segunda longitud de onda cambiará el estado de isomerización entre el segundo estado y el primer estado. Según esto, el sistema puede comprender una fuente luminosa que irradia luz a la segunda longitud de onda para cambiar el estado de isomerización del segundo de vuelta al primero. Por lo tanto, el sistema grabará sucesos luminosos a una primera longitud de onda y se puede reajustar mediante una segunda longitud de onda emitida por la fuente luminosa del
sistema.

La presente invención proporciona, además, según el segundo aspecto, un método para grabar señales ópticas, que tiene una primera longitud de onda y una transducción eléctrica de las señales ópticas grabadas, comprendiendo el método:

(a): proporcionar un sistema electroquímico según se ha definido anteriormente;

(b): exponer el electrodo a la fuente luminosa;

(c): cargar el electrodo y medir la respuesta eléctrica; un cambio en la respuesta eléctrica indica exposición a luz que tiene dicha primera longitud de onda.

La presente invención proporciona también un procedimiento para preparar electrodos para usar según el segundo aspecto de la invención, el procedimiento comprende:

(a): preparar la apoenzima tratando una enzima dependiente de FAD de manera que se retira el FAD de la misma;

(b): preparar un FAD modificado por unión covalente de un grupo capaz de unirse o enlazarse a un grupo fotoisomerizable;

(c): hacer reaccionar el FAD modificado con el grupo fotoisomerizable para dar un FAD fotoisomerizable;

(d): combinar la apoenzima con el FAD fotoisomerizable para dar una enzima redox fotoisomerizable; y

(e): proporcionar un electrodo que lleva grupos inmovilizados sobre el mismo y hacer reaccionar las enzimas reconstituidas con los electrodos de manera que las enzimas se unan covalentemente al grupo de unión.

Otro proceso para preparar un electrodo según un segundo aspecto, comprende:

(a): preparar una apoenzima tratando una enzima dependiente de FAD para retirar el FAD de la misma;

(b): preparar un FAD modificado por unión covalente de un grupo que se puede unir o enlazar a un grupo fotoisomerizable;

(c): hacer reaccionar el electrodo con un grupo de unión que tiene un resto de unión que se puede asociar, unir o adsorber químicamente al electrodo y que tiene una unidad funcional capaz de unirse a un grupo fotoisomerizable, transcurriendo la reacción con la condición de que dicho resto de unión se asocia, une químicamente o adsorbe a la superficie del electrodo;

(d): hacer reaccionar el electrodo obtenido en (c) con un grupo fotoisomerizable;

(e): hacer reaccionar el electrodo obtenido en (d) con el FAD modificado obtenido en (b), para obtener una monocapa que comprende restos FAD fotoisomerizables inmovilizados sobre el electrodo; y

(f): hacer reaccionar las apoenzimas con el electrodo obtenido en (e) con la condición de que cuando la enzima se reconstituya sobre la superficie del electrodo dará enzimas redox fotoactivas inmovilizadas sobre el electrodo.

Las enzimas que se pueden usar según el segundo aspecto de la invención incluyen las mencionadas anteriormente con respecto al primer aspecto.

Un grupo de unión que se puede usar según la presente invención para inmovilizar un FAD sobre la superficie de un electrodo, puede tener la siguiente fórmula general (I):

(I)Z-R^{1}-Q

en la que:

Z es un resto de unión que en el caso de que el electrodo esté fabricado con oro, platino o plata, representa un resto que contiene azufre que puede asociarse químicamente con, unirse a o quimosorberse sobre dicho metal; y en el caso de que el electrodo esté fabricado con vidrio, representa restos metoxi o alcoxisilano que pueden asociarse o unirse químicamente o quimisorberse sobre dicho vidrio;

R^{1} representa un grupo conector;

Q es un grupo funcional que puede formar un enlace covalente con un resto en el péptido catalítico o en el grupo porfirina.

Z, cuando el material del electrodo es un metal, puede ser, por ejemplo, un átomo de azufre obtenido de un grupo tiol, un grupo disulfuro, un grupo sulfonato o un grupo sulfato.

R^{1} puede ser un enlace covalente o puede ser un péptido o polipéptido o se puede seleccionar entre una gran variedad de grupos adecuados tales como alquileno, alquenileno, alquenilenfenilo que contiene cadenas, y muchos otros.

Los ejemplos particulares de R^{1} son un enlace químico o un grupo que tiene las siguientes fórmulas (IIa), (IIb), (IIc) o (IId)

II(a)-R^{2} -

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{A}}

-

II(b)-R^{2}-NH-

II(c)-R^{2}-N=CH-R^{3}-

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{A}}

II(d)-R-NH-

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{A}}

-NH-Ph-CH=CH-Ph-NH-

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{B}}

-

en las que

R^{2} o R^{3} pueden ser iguales o diferentes y representan un alquileno, alquenileno, alquinileno lineal o ramificado con 1 a 16 átomos de carbono o representan un enlace covalente,

A y B pueden ser iguales o diferentes y representan O o S,

Ph es un grupo fenilo que está sustituido opcionalmente, por ejemplo, por uno o más miembros seleccionados del grupo compuesto por SO_{3}^{-} o grupos alquilo.

Q puede ser, por ejemplo, un grupo amino que se puede unir a un resto carboxilo; un grupo carboxilo, que se puede unir a un resto amina; un grupo isocianato o isotiocianato que se puede unir a un resto amina; o un grupo haluro que se puede unir a restos hidroxi del polipéptido. Los ejemplos particulares son los grupos -NH_{2}-COOH; -N=C=S; N=C=O; o un grupo acilo que tiene la fórmula -R^{a}-CO-G, en la que G es hidrógeno, un halógeno tal como Cl o es OH, OR^{b}, un grupo

-O \

\uelm{C}{\uelm{\para}{O}}

-R^{b}

o un grupo

1

; R^{a} y R^{b} son, independientemente, un alquilo o alquenilo con 1 a 12 átomos de carbono que contiene una cadena que está sustituida opcionalmente, por ejemplo, por halógeno.

Los ejemplos particulares de dicho grupo de unión son los que tienen las siguientes fórmulas (III)-(IX):

2

3

4

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

8

en las que n es un entero entre 1 y 6.

La unión de FAD con un grupo mediador de electrones o un grupo fotoisomerizable, así como la unión de los mediadores de electrones directamente sobre la enzima, se puede conseguir mediante un grupo conector que tiene la siguiente fórmula (X):

(X)Z-F-R^{1}-Q

en la que R^{1} tiene el mismo significado indicado anteriormente y Q^{1} y Q^{2} tienen, independientemente, uno de los significados dados anteriormente para Q.

Los ejemplos de grupos mediadores de electrones que se pueden usar según la invención son ferroceno, pirroloquinolinquinona, quinona, sales de N,N'-dialquil-4,4'-bipiridinio y muchos otros.

El grupo de unión puede comprender a veces otro grupo funcional, tal como un grupo mediador de electrones o un grupo fotoisomerizable. Un grupo de unión según dichas realizaciones puede tener la siguiente fórmula general
(XI)

(XI)Q^{1}-R^{1}-Q^{2}

en la que Z, R^{1} y Q tienen el significado dado anteriormente, y F es el grupo funcional.

Los ejemplos de grupos fotoisomerizables que se pueden usar según la invención son nitroespiropirano, azobenceno, fulguro de tiofeno, y muchos otros compuestos que se fotoisomerizan desde un estado a otro estado y vuelven por irradiación luminosa con dos regiones de longitudes de onda diferentes.

La presente invención se ilustra en mayor medida a continuación en las siguientes realizaciones y dibujos específicos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra la estructura de N^{6}-(2-aminoetil)-FAD.

Las Fig. 2A y 2B muestran la última etapa de la síntesis en la preparación de díada FAD-ferroceno.

La Fig. 3A muestra la última etapa de la síntesis en la preparación de la díada FAD-espiropirano (FAD-SP).

La Fig. 3B muestra los dos estados fotoisoméricos de FAD-SP.

La Fig. 4 muestra la preparación de la apoenzima glucosa oxidasa y su reconstitución con la díada FAD-ferroceno.

La Fig. 5A muestra la preparación de la apoenzima glucosa oxidasa y su reconstitución con la díada FAD-espiropirano y la fotoisomerización de la enzima reconstituida;

La Fig. 5B muestra los dos estados fotoisoméricos del FAD modificado.

La Fig. 6 muestra el esquema de inmovilización de GOD reconstituida con la díada FAD-espiropirano, sobre un electrodo de oro para formar una monocapa de oro.

La Fig. 7 muestra el esquema de modificación de un electrodo de oro con una monocapa de FAD y la oxidación bioelectrocatalítica de la glucosa usando estos electrodos enzimáticos:

La Fig. 7A muestra un electrodo según la primera realización de la invención con un grupo mediador de electrones que se mueve libremente en el medio;

La Fig. 7B muestra una enzima según la combinación de las realizaciones primera y segunda con un grupo mediador de electrones (PQQ) unido covalentemente al grupo FAD.

La Fig. 8 muestra la estructura de pirroloquinolinquinona (PQQ).

La Fig. 9 muestra voltamogramas cíclicos: (a) FAD-ferroceno (véase la Fig. 4) adsorbido sobre un electrodo de trabajo de oro (de una solución madre 1\cdot10^{-5} M). (b) GOD reconstituida con FAD-ferroceno en solución (1,75 mg ml^{-1}) (véase la Fig. 12) usando un electrodo de oro modificado con una monocapa de cistamina. Fondo: tampón fosfato 0,1 M, pH 7,3, en atmósfera de argón. Velocidad potencial de exploración, 1,5 V s^{-1}.

La Fig. 10 muestra voltamogramas cíclicos de GOD reconstituida con FAD-ferroceno en solución (1,75 mg ml^{-1}) y diferentes concentraciones de glucosa: (a) 0 mM, (b) 1 mM, (c) 3 Mm, (d) 20,5 mM. Todos los experimentos se llevaron a cabo en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,3 a 35ºC; en atmósfera de nitrógeno, usando un electrodo de oro modificado con cistamina. Velocidad potencial de exploración, 2 mV s^{-1}.

La Fig. 11 muestra los picos de corrientes anódicas a diferentes concentraciones de glucosa en un experimento como el mostrado en la Fig. 10.

La Fig. 12 muestra el esquema de oxidación bioelectrocatalítica de la glucosa usando GOD reconstituida con FAD-ferroceno ("electroenzima").

La Fig. 13 muestra voltamogramas cíclicos de D-aminoácido oxidasa reconstituida con FAD-ferroceno (DAAO) en solución (0,38 mg/ml) en presencia de D-alanina: (a) 0 mM, (b) 2 mM, (c) 9 mM. Los experimentos se llevan a cabo en tampón pirofosfato 0,1 M, pH 8,5; 25ºC; en atmósfera de argón. Velocidad potencial de exploración,
2 mV s^{-1}.

La Fig. 14 muestra voltamogramas cíclicos de la oxidación bioelectrocatalizada de la glucosa, 5\cdot10^{-2} M y ácido carboxílico de ferroceno, 5\cdot10^{-4}, en presencia de: (a) GOD-FAD-SP, 0,46 mg/ml, (b) GOD-FAD-MRH^{+}, 0,46 mg/ml. Todos los experimentos se grabaron en un tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0, 37ºC, en atmósfera de argón. Velocidad potencial de exploración, 5 mV s^{-1}.

La Fig. 15 muestra esquemas de oxidación bioelectrocatalítica de glucosa usando GOD reconstituida con FAD-SP (enzima fotoactivable).

La Fig. 16 muestra una representación de Lineweaver-Burk para las curvas de saturación-corriente: (i) GOD-FAD-SP (?); (ii) GOD-FAD-MRH^{+} (?).

La Fig. 17 muestra las diferentes formas isométricas que proporcionan los estados "ACTIVADO" (izquierda) y "DESACTIVADO" (derecha) para GOD-FAD-SP monocapa inmovilizado.

La Fig. 18 muestra voltamogramas cíclicos de diferentes actividades enzimáticas para la oxidación de glucosa estando GOD-FAD-SP monocapa inmovilizado en diferentes estados isoméricos. Concentración de glucosa, 50 mM. Velocidad potencial de exploración, 5 mM s^{-1}.

La Fig. 19 muestra la transducción amperométrica cíclica de las señales ópticas grabadas por la GOD fotoisomerizable reconstituida monocapa inmovilizada sobre un electrodo de hielo; (?) estado SP, (?) estado MRH^{+}.

La Fig. 20 muestra voltamogramas cíclico de GOD reconstituida sobre un electrodo de oro monocapa modificado con FAD: (a) sólo solución de electrolito de fondo; (b) en presencia de ácido carboxílico de ferroceno, 4 10^{-4} M; (c) con ácido carboxílico de ferroceno y glucosa añadida, 5 10^{-2} M. Todos los experimentos se grabaron en atmósfera de argón en tampón fosfato 0,01 M y sulfato sódico 0,1, pH 7,0, 35ºC, velocidad de exploración 5 mV s^{-1}.

La Fig. 21 muestra voltamogramas cíclico del electrodo de oro con monocapa de la díada PQQ-FAD (a) y monocapa de la díada PQQ-FAD después de la reconstitución con apo-GOD (b). Todos los experimentos se grabaron en atmósfera de argón en tampón fosfato 0,01 M y sulfato sódico 0,1, pH 7,0, 25ºC, velocidad de exploración 50 mV s^{-1}.

La Fig. 22 muestra voltamogramas cíclico de GOD reconstituida sobre el electrodo monocapa de la díada PQQ-FAD; sin glucosa (a) y en presencia de glucosa 80 mM (b). Todos los experimentos se grabaron en atmósfera de argón en tampón fosfato 0,01 M y sulfato sódico 0,1, pH 7,0, 35ºC, velocidad de exploración 5 mV s^{-1}.

La Fig. 23 muestra respuestas amperométricas de GOD reconstituida sobre el electrodo con monocapa de la díada PQQ-FAD: (a) en presencia de glucosa; y (b) en presencia de glucosa 50 mM, en ausencia de O_{2}; (c) en presencia de glucosa 50 mM en una solución saturada con aire; (d) en presencia de glucosa 50 mM, ácido ascórbico 0,1 mM en una solución saturada con aire. Las corrientes se determinaron por cromoamperometría a una potencia final de 0,0V vs. SCE. El electrolito consistía en tampón fosfato 0,01 M y sulfato sódico 0,1 M, pH 7,0, siendo la temperatura de medida 35 \pm 0,5ºC.

Descripción de las realizaciones específicas

Las siguientes realizaciones específicas pretenden ilustrar la invención y se deben interpretar como que limitan su alcance. El especialista valorará sin duda que estas realizaciones específicas son un ejemplo del alcance completo de la invención, como se ha definido anteriormente.

Ejemplos 1. Etapas de la síntesis química y preparaciones bioquímicas 1.1 Última etapa de síntesis en la preparación de un derivado de FAD-ferroceno

El FAD derivado de amino, N^{6}-(2-aminoetil)-FAD (Fig. 1) se sintetizó según los resultados del procedimiento^{(10)} publicado recientemente. Se sintetizó ácido N-(2-metilferroceno)caproico como se ha descrito recientemente^{(7)}. Se hizo reaccionar N^{6}-(2-aminoetil)-FAD (10 mg, 1,1\cdot10^{-5} mol) con ácido N-(2-metilferroceno)caproico (18 mg, 5,5\cdot10^{-5} mol) en presencia de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC, Aldrich; 11,6 mg, 5,5\cdot10^{-5} mol) como reactivo de acoplamiento y sal N-hidroxi-3-sulfosuccinimida de sodio (NSI, Aldrich; 13,2 mg, 5,5\cdot10^{-5} mol) como promotor (Fig. 2). La reacción de acoplamiento se realizó en 1 ml de tampón HEPES 0,1 M, pH 7,4 durante 3 horas a temperatura ambiente. El producto se purificó en una columna Sepadex G10 usando agua como eluyente. La separación de los compuestos originales sin reaccionar se llevó a cabo mediante cromatografía en capa fina (TLC) R_{g} = 0,49, 0,69, 0,93 para amino-FAD, Fc-COOH y la díada FAD-Fc, respectivamente). La estructura de FAD-Fc se confirmó mediante el espectro ^{1}H-RMN.

1.2 Última etapa de síntesis en la preparación de un derivado de FAD-espiropirano

El derivado carboxílico de espiropirano, 1,-(\beta-carboximetil)-3',3'-dimetil-6-nitro[2H-1]benzopiran-2,2'-indolina, SP-COOH, se sintetizó como se ha descrito hasta ahora (Namba y Suzuki, Bul. Chem. Soc. Jpn., 48: 1323,
1975)^{(13)}. La díada que incluye el amino-FAD y el componente fotoisomerizable (FAD-SP) se preparó de manera similar a la descrita anteriormente para FAD-Fc usando SP-COOH como componente carboxílico para acoplar con el amino-FAD (Fig. 3). El producto se purificó mediante TLC preparativa sobre placas de SiO_{2} usando isopropanol:H_{2}O como eluyente. El FAD modificado con nitroespiropirano pone de manifiesto propiedades fotoisomerizables reversibles. La iluminación de FAD-SP, 360 nm < ? < 380 nm ("hv" en la Fig. 3) da el estado del isómero nitromerocianina-FAD, FAD-MRH^{+}, que presenta una banda de absorción en la región de 320-560 nm que corresponde a las bandas solapantes de los cromóforos MRHP^{+} (520 nm) y FAD (355 nm, 460 nm). La irradiación de las solución de MRH^{+}-FAD, ?>475 nm ("hv_{1}" en la Fig. 3) da una solución amarilla que presenta una banda de absorción de FAD a ?=360 nm, 447 nm y la absorción SP característica en la región UV. La fotoisomerización entre FAD-SP y FAD-MRH^{+} es reversible (Fig. 3).

1.3 Preparaciones de apoenzimas

La apoglucosa oxidasa (apo-GOD) se preparó de manera similar a la descrita hasta ahora (Morris y Buckler en Methods in Enzymology, Vol. 92, Parte E, (J.J. Langone y V. Van Vunakis, Eds.), Academia Press, Inc. P/p. 415-417, 1983) acidificando una solución de glucosa oxidasa, GOD (de Aspergillus Níger, E.C. 1.1.3.4) a pH = 1,7, seguida de separación en una columna Sephadex G-25 y purificación adicional con carbón-dextrano, y dializando contra tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0, durante 24 horas a 4ºC.

La apoproteína proveniente de D-aminoácido oxidasa (DAAO; de riñón de cerdo, E.C. 1.4.3.3) se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito hasta ahora (Massy y Curti, J. Biol. Chem., 241: 3417, 1966) de la siguiente manera: la enzima se dializó contra tampón pirofosfato 0,1 M, pH 8,5, que contenía KBr 1 M y 3\cdot10^{-3} MEDTA, seguido de diálisis contra un tampón pirofosfato 0,1 M, pH 8,5 y finalmente se purificó de la misma manera que apo-GOD. Ninguna de esta dos apoproteínas muestra actividad enzimática.

1.4 Reconstitución de apoenzimas con díadas: FAD-Fc y FAD-SP

La apo-GOD se hizo reaccionar con la díada FAD-Fc para generar la glucosa oxidasa reconstituida con ferroceno-FAD (Fig. 4). La reconstitución se realizó en 3 ml de tampón Na-fosfato agitado, 0,1 M, pH 7,0, que contenía 9,6 mg (5,16\cdot10^{-5} mol) de apo-GOD y 0,8 mg (6,7\cdot10^{-4} mol) FAD-Fc durante 4 horas a temperatura ambiente seguido de incubación durante una noche a 4ºC. La solución se purificó dos veces por filtración a través de un filtro con un corte de 10.000 y después se dializó contra tampón Na-fosfato 0,1 M, pH 7,0 durante un día. La carga de GOD reconstituido se determinó espectroscópicamente como una molécula de díada FAD-Fc por subunidad enzimática. La actividad de la GOD reconstituida fue de aproximadamente el 40% de dicha GOD nativa.

La apo-DAAO se reconstituyó con la díada FAD-Fc y después se purificó de manera similar a la descrita anteriormente para la apo-GOD. La carga de DAAO reconstituida fue de aproximadamente una molécula de díada FAD-Fc por enzima. La actividad de la GOD reconstituida fue de aproximadamente el 20% de la GOD nativa.

La reconstitución de la apo-GOD con la díada FAD-SP (Fig. 5) se llevó a cabo por tratamiento de la apo-GOD con la díada (proporción molar 1:10) en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0, con agitación vigorosa durante 24 horas, 25ºC. El producto se dializó contra tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0, durante 30 horas. La carga del cofactor FAD-SP fue de aproximadamente 1 por cada una de las subunidades enzimáticas. La GOD reconstituida presenta aproximadamente el 80% de la actividad de la GOD nativa. La GOD reconstituida con FAD-SP, 360 nm < ? < 380 nm, da el estado del isómero merocianina que se puede volver a isomerizar usando iluminación a ?>475 nm (Fig. 5).

2. Caracterización del electrodo y ajustes electroquímicos

Se usaron electrodos de oro (hilo de Au de 0,5 mm de diámetro, que tiene un área geométrica de aproximadamente 0,2 cm^{2}; coeficiente de rugosidad de aproximadamente 1,2 u hoja de Au con un área geométrica de 0,4 cm^{2}; coeficiente de rugosidad de aproximadamente 15) para todas las modificaciones y medidas. El electrodo de oro rugoso se obtuvo por tratamiento con mercurio líquido y posterior disolución de la capa amalgamada en ácido nítrico concentrado (Katz et al., J. Electroanal. Chem., 367: 59, 1994). Se usó un voltamograma cíclico grabado en H_{2}SO_{4} 0,5 M para determinar la pureza de la superficie del electrodo justo antes de la modificación. El área superficial real del electrodo y los coeficientes de rugosidad se estimaron a partir del mismo voltamograma cíclico integrando el pico catódico para la reducción electroquímica de la capa de óxido sobre la superficie del electrodo (Woods en A.J. Bard (Ed.), Electroanalytical Chemistry, Dekker, New Cork, p. 1, 1978).

Las medidas electroquímicas se llevaron a cabo usando un potenciostato (EG&G) VersaStat) conectado a un ordenador personal (programa para investigación electroquímica de EG&G, modelo 270/250). Todas las medidas se llevaron a cabo en una célula electroquímica de tres compartimentos que comprende el electrodo modificado químicamente como electrodo de trabajo, un electrodo auxiliar de carbono vítreo aislado por un vidrio sinterizado y un electrodo saturado de calomelano (SCE) conectado al volumen de trabajo con un capilar Luggin. Todos los potenciales se presentan con respecto a este electrodo de referencia. Se burbujeó argón para retirar el oxígeno de las soluciones en la célula electroquímica. Durante las medidas, la célula se termoajustó usando agua circulada en una camisa alrededor de la célula (la temperatura se indica en cada uno de los ejemplos experimentales a continuación).

3. Modificación del electrodo 3.1 Pretratamiento

Para retirar una capa orgánica previa y para regenerar una superficie metálica desnuda, el electrodo se trató con una solución en ebullición de KOH 2M durante 1 hora, después se enjuagó con agua y se almacenó en ácido sulfúrico concentrado. Inmediatamente antes de la modificación, el electrodo se enjuagó con agua, se empapó durante 10 min en ácido nítrico concentrado y después se enjuagó de nuevo con agua.

3.2 Modificación del electrodo con cistamina

Se empapó un electrodo limpio de oro desnudo en una solución de cistamina 0,02 M (2,2'-diaminodietildisulfuro, Aldrich) en agua durante 2 horas. Después se enjuagó vigorosamente el electrodo con agua para retirar la cistamina sin absorber.

3.3 Inmovilización en monocapa de la GOD fotoactivable reconstituida con FAD-SP

Se funcionalizó un electrodo de oro con grupos éster activos por quimisorción de ditio-bis-(succinimidilpropionato) (DSP, Aldrich) (Willner et al., 1992^{2}; Katz, E., J. Electroanal. Chem., 191: 257, (1990)) y después el electrodo se trató con la GOD reconstituida con FAD-SP (4 mg por 1 ml de tampón fosfato 0,01 M, pH 7,0) durante 1 hora (Fig. 6). El electrodo enzimático se enjuagó con tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0 y se usó inmediatamente para medidas electroquímicas.

3.4 Modificación del electrodo con una monocapa de FAD

Se adsorbió una monocapa de éster activo de ácido lipoico (1 hora, temperatura ambiente) sobre un electrodo de oro rugoso a partir de una solución 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO). El electrodo resultante se enjuagó dos veces con DMSO y una vez con agua para retirar las moléculas adsorbidas físicamente. Después, el electrodo modificado
se trató con una solución de N^{6}-(2-aminoetil)-FAD 5 mM en tampón HEPES 0,1, pH 7,3 durante 1 hora y finalmente se enjuagó varias veces con agua (Fig. 7A).

3.5 Modificación del electrodo con una monocapa de PQQ-FAD

La modificación del electrodo con pirroloquinolinquinona, PQQ (Fig. 8) se realizó como se ha descrito reciente-
mente^{(14)}. Se empapó un electrodo de Au modificado con monocapa de cistamina durante 3 horas en una solución de tampón HEPES 0,01 M, pH 7,3, que contenía PQQ 1 mM (Sigma). Después se enjuagó vigorosamente con agua el electrodo modificado para retirar de su superficie las moléculas de PQQ adsorbidas físicamente no acopladas. El electrodo funcionalizado con PQQ obtenido se trató con una solución de N^{6}-(2-aminoetil) -FAD 5 mM en tampón HEPES 0,1, pH 7,3 en presencia de EDC 10 mM durante 1 hora y finalmente se enjuagó vigorosamente de nuevo con agua (Fig. 7B).

3.6 Reconstitución de apo-GOD sobre las superficies del electrodo funcionalizadas con FAD o PQQ-FAD

Cada electrodo funcionalizado con FAD (FAD sólo y PQQ-FAD) se trató con una solución de apo-GOD (aproximadamente 3 mg/ml en tampón de fosfato, 0,1 M, pH 7,0) con agitación vigorosa durante 4 horas a temperatura ambiente y después durante 16 horas a 4ºC. Después el electrodo modificado se enjuagó con tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0 y se usó inmediatamente para medidas electroquímicas (Fig. 7A&B).

4. Resultados 4.1 Electroenzima: GOD reconstituida con FAD-Fc

La díada FAD-Fc presenta en una solución tampón acuosa dos ondas reversibles características a -0,50 y 0,35 V (vs SCE) (Fig. 9). Estas ondas corresponden al proceso redox de dos electrones de FAD y a la reacción redox de un electrón del ferroceno, respectivamente. El proceso electroquímico presenta una fuerte adsorción de la díada FAD-Fc sobre el electrodo de Au sin modificar. El voltamograma cíclico de la GOD reconstituida con FAD-Fc sólo muestra el proceso redox reversible de la unidad ferroceno, que implica que el componente ferroceno se comunica con el electrodo en el que componente FAD embebido en la enzima carece de comunicación eléctrica directa con el electrodo (Fig. 9).

Se usó un electrodo modificado con cistamina para las medidas electroquímicas de la GOD reconstituida para evitar la adsorción de proteína que podría dar como resultado la desnaturalización de la enzima. La Fig. 10 muestra las corrientes anódicas electrocatalíticas desarrolladas por la GOD reconstituida con FAD-Fc en presencia de diferentes concentraciones de glucosa añadida. En la Fig. 11 se da la curva de calibración, que muestra la corriente anódica a diferentes concentraciones. La oxidación electrobiocatalizada de la glucosa se puede analizar en términos del modelo de Michaelis-Menten (I_{max}=4 \muA y K_{m}=2,9 mM, en la que I_{max} es la corriente de saturación y K_{m} es la constante de Michaelis-Menten). Considerando el área superficial y el factor de rugosidad del electrodo de trabajo, la densidad máxima de corriente corresponde a I_{max}=8,3 \muA/cm^{2}. Para comparar, la glucosa oxidasa nativa en condiciones comparables en presencia de ácido carboxílico de ferroceno da los valores K_{m}=3,3 mM y I_{max}=6,3 \muA/cm^{2}. Se puede concluir, por lo tanto, que la reconstitución de apo-GOD con el FAD modificado con ferroceno da una electroenzima semisintética que presenta comunicación eléctrica entre el electrodo y el sitio activo del biocatalizador (Fig. 12).

La DAAO reconstituida mostró comunicación eléctrica con la superficie del electrodo y se observaron corrientes anódicas electrocatalíticas en presencia de D-alanina como sustrato. La Fig. 13 muestra los voltamogramas cíclicos observados tras la adición de diferentes concentraciones de D-alanina a la solución que contiene la DAAO FAD-Fc. La curva de calibración respectiva se analizó de manera similar en términos del modelo de Michaelis-Menten y los valores I_{max}=3,96 \muA/cm^{2} y K_{m}=2,0 mM provienen de la DAAO electroactiva semisintética. De manera similar a la GOD reconstituida, esta enzima reconstituida funciona también como electroenzima.

4.2 La reconstitución de apo-glucosa oxidasa con un cofactor FAD modificado con nitroespiropirano da un biocatalizador fotoactivable

La apo-GOD reconstituida con la díada FAD-SP fotoisomerizable no tiene comunicación directa no mediada con un electrodo. Por lo tanto, la oxidación bioelectrocatalítica de glucosa usando esta enzima reconstituida se estudió en presencia de mediadores de transferencia de electrones que se pueden mover por difusión (derivados de ferroceno: ácido carboxílico de ferroceno, ácido dicarboxílico de ferroceno y dimetilaminoetilferroceno). La enzima reconstituida se aplica en forma solubilizada o inmovilizada como monocapa (véase 3.3). La Fig. 14 muestra los voltamogramas cíclicos obtenidos tras la oxidación electrobiocatalizada de glucosa en presencia de ácido carboxílico de ferroceno como mediador difusional de la transferencia de electrones y la GOD reconstituida con FAD-SP. La corriente anódica electrocatalítica en presencia de GOD reconstituida con FAD-MRH^{+} se potencia en aproximadamente un 25% si se compara con la GOD reconstituida con FAD-SP, lo que implica una mayor actividad de GOD-FAD-MRH^{+}. Las corrientes anódicas desarrolladas por los sistemas en presencia de glucosa son diferentes para ambos estados isoméricos: SP y MRH^{+}: el sistema está "ACTIVADO" y "DESACTIVADO" (Fig. 15). El análisis cinético detallado de Michaelis-Menten de los rendimientos biocatalíticos de GOD-FAD-SP y GOD-FAD-MRH^{+} en presencia de diferentes concentraciones de ácido carboxílico de ferroceno se muestra en la Fig. 16. Los dos estados fotoisoméricos de la enzima ponen de manifiesto valores similares de I_{max}=6,9\cdot10^{-6} A, siendo los valores de K_{m} de los dos estados de la enzima sustancialmente diferentes (7,82 M^{-1} y 2,57 M^{-1} para GOD-FAD-SP y GOD-FAD-MRH^{+}, respectivamente). Estos resultados implican que la velocidad de transferencia de electrones de la oxidación del cofactor FAD por el catión ferrocenilio tiene una efectividad similar en los dos estados fotoisoméricos de la GOD reconstituida, aunque las interacciones del mediador de electrones con la proteína para conseguir la configuración apropiada para la transferencia de electrones son diferentes para cada isómero. Para concentraciones bajas de los mediadores de transferencia de electrones la diferencia en la actividad biocatalítica fue mayor y esta diferencia dependió del tipo de mediador de transferencia de electrones usado. Por ejemplo, la diferencia de actividades enzimáticas para los estados SP y MRH^{+} fue incluso mayor si se usaba dimetilaminoetilferroceno como mediador de transferencia de electrones (no se muestran los resultados).

La GOD reconstituida con FAD-SP se montó como monocapa y se aplicó para oxidación biocatalítica de glucosa en presencia de un mediador de transferencia de electrones que se puede mover por difusión. La monocapa se puede transformar en dos estados isoméricos diferentes mediante luz (Fig. 17). La Fig. 18 muestra voltamogramas cíclicos para la activación y desactivación reversible del electrodo modificado con monocapa para la oxidación bioelectrocatalítica de la glucosa mediante luz. La activación (sistema biocatalítico que comprende la GOD reconstituida y el mediador difusional está en estado "ACTIVADO") y la desactivación (el sistema está en estado "DESACTIVADO") se puede repetir, reversiblemente, muchas veces (Fig. 19).

4.3 Conexión eléctrica de glucosa oxidasa por reconstitución de monocapas de FAD modificado montadas sobre electrodos de Au

El electrodo modificado sólo con el componente FAD (véase 3.4) se usó para reconstituir la apo-GOD directamente en la zona interfacial. El FAD inmovilizado puso de manifiesto un voltamograma cíclico reversible característico, Eº (a pH=7,0)=-0,50 V vs SCE. La velocidad interfacial de transferencia de electrones constante entre el electrodo y la unidad FAD fue de aproximadamente 230 s^{-1} y la concentración en superficie de las unidades FAD sobre el electrodo fue de aproximadamente 3\cdot10^{-11} mol/cm^{2} que corresponde a un recubrimiento monocapa empaquetado no muy densamente. Sin embargo, la GOD reconstituida sobre el electrodo no mostró actividad biocatalítica en ausencia de mediadores de transferencia de electrones. Esto es el resultado de la incapacidad de los electrones para transferirse entre el electrodo y las unidades FAD incorporadas a la apoproteína. Debe observarse que las distancias entre el electrodo y los centros electroquímicos de la unidad FAD dependen de la movilidad de las unidades FAD. Las unidades FAD libres (no incorporadas a la proteína) se inmovilizan mediante largos separadores flexibles, son móviles y por lo tanto, pueden intercambiar electrones con el electrodo; pero las unidades FAD ya incorporadas a la proteína pierden su movilidad y están a gran distancia desde la superficie del electrodo y, por lo tanto, no se pueden comunicar eléctricamente con el electrodo. Sin embargo, la actividad biocatalítica se puede conseguir en presencia de un mediador de transferencia de electrones que se puede mover por difusión (Fig. 20).

Para mejorar el sistema descrito anteriormente, se usó un electrodo modificado con dos componentes redox: PQQ y FAD (véase 3.5). La Fig. 21 (curva a) muestra el voltamograma cíclico del electrodo modificado con monocapa de la díada PQQ-FAD. Consiste en dos ondas redox a Eº (a pH=7,0)=-0,125 y -0,50 V vs SCE correspondiente a la reducción de dos electrones de las unidades PQQ y FAD, respectivamente. La densidad superficial es aproximadamente 3\cdot10^{-11} mol/cm^{2} para cada componente de la monocapa. La monocapa PQQ-FAD se trató además con apo-GOD para producir la GOD reconstituida directamente sobre la zona interfacial modificada. La Fig. 21 (curva b) muestra el voltamograma cíclico del electrodo resultante después de la reconstitución. La onda redox característica de las unidades FAD disminuye radicalmente, mientras que la onda redox correspondiente al componente PQQ no cambia. Esto es consistente con el hecho de que el componente FAD embebido en la proteína como resultado de la reconstitución carece de comunicación eléctrica con la superficie del electrodo. La pequeña onda residual de FAD observada después de la reconstitución corresponde a unidades FAD libres que aún se comunican con el electrodo. A partir de la diferencia de la onda de FAD antes y después de la reconstitución, se estimó la densidad superficial de la GOD sobre la superficie del electrodo en aproximadamente 1,7\cdot10^{-12} mol/cm^{2}. La enzima reconstituida sobre la monocapa de la díada PQQ-FAD pone de manifiesto la comunicación eléctrica directa con el electrodo y es activa en la oxidación bioelectrocatalizada de glucosa. La Fig. 22 muestra los voltamogramas cíclicos del electrodo monocapa de GOD reconstituida con PQQ-FAD en ausencia (curva a) y presencia (curva b) de glucosa. Se observó una gran corriente anódica electrocatalítica, indicando la glucosa que la proteína reconstituida bioelectrocataliza la oxidación de glucosa muy eficazmente. El componente PQQ de la monocapa funciona como mediador de la transferencia de electrones entre el FAD incorporado a la proteína y el electrodo. Las corrientes anódicas electrocatalíticas desarrolladas por el sistema son controladas por la concentración de glucosa en el intervalo 5-80 mM (Fig. 23). El dioxígeno sólo afecta ligeramente a la transferencia de electrones de la GOD reconstituida por PQQ al electrodo (para glucosa 80 mM la corriente anódica disminuyó en presencia de oxígeno sólo aproximadamente un 5%) que es muy inusual para los biosensores de glucosa basados en GOD (no se muestran los resultados). La adición de ascorbato 0,1 mM (componente interferente habitual in vivo) al sistema que contiene glucosa 5 mM, no afectó a la respuesta amperométrica del electrodo. Estos resultados sugieren que la monocapa de GOD reconstituida con PQQ-FAD presenta una comunicación eléctrica eficaz con la superficie del electrodo que compite con las rutas interferentes.

4.4 Velocidad de renovación de GOD reconstituida sobre una monocapa de PQQ-FAD: sin interferencias de agentes reductores y oxidantes

El límite superior de la velocidad de renovación de la glucosa oxidasa a 25ºC es GOD \pm 100 s^{-1} (C. Bourdillon et al., J. Am. Chem. Soc., 115: 12264 (1993)) y la energía de activación es de 7,2 Kcal\cdotmol^{-1} (H.G. Eisenwiener, Naturwissenschaften 56: 563, (1969)). A la temperatura usada en las medidas electrobioquímicas mostradas en la Fig. 22 y en la Fig. 23, (35ºC) esto se traduce en una velocidad de renovación limitante de 900 \pm 150 s^{-1} a 35ºC. El recubrimiento superficial de la enzima reconstituida sobre el electrodo es de 1,7\cdot10^{-2} y usando la velocidad de renovación teórica a 35ºC, la densidad de corriente máxima que se puede observar desde el electrodo es de
290 \pm 60 \muA\cdotcm^{-2}. La Fig. 23 muestra que para una concentración de glucosa de 80 mM, la corriente observada es de 1,9 mA (para un electrodo con un área superficial de 0,4 cm^{2} y el factor de rugosidad de aproximadamente 20). Esto se traduce en una densidad de corriente experimental correspondiente a 300 \pm 100 \muA\cdotcm^{-2}, un valor que está en el intervalo de la velocidad de corriente limitante de la enzima. Esto está respaldado además por el hecho de que la corriente de respuesta es lineal con la concentración de glucosa, Fig. 23, lo que indica que la corriente está controlada por la difusión de glucosa al sitio activo y que los sitios FAD están en su forma oxidada a E^{\sim} 0,2 voltios.

La ausencia prácticamente total de interferencias de los reactivos redox circundantes se demuestra en la Fig. 24. Esto es el resultado de la velocidad de renovación tan alta de la enzima que la hace prácticamente insensible a las interferencias no específicas. Por lo tanto, un electrodo de este tipo se puede usar para la medida continua en un ambiente no protegido, por ejemplo, in vivo.

Claims

1. Un electrodo que tiene enzimas dependientes de FAD inmovilizadas sobre su superficie, las enzimas tienen un FAD funcionalizado, que es un FAD modificado por la adición de un grupo o resto funcional, que es uno o más de los siguientes grupos o restos:

(a): un resto de unión que puede asociarse químicamente con, unirse a o adsorberse químicamente sobre el electrodo, inmovilizándose la enzima sobre el electrodo por unión del grupo de unión a la superficie del electrodo;

2. Un electrodo de acuerdo con la Reivindicación 1, en el que el FAD funcionalizado comprende un resto de unión y un grupo mediador de electrones.

3. Un electrodo de acuerdo con la Reivindicación 2, para usar en la determinación in vivo de un analito.

4. Un proceso para preparar un electrodo que tiene enzimas redox dependientes de FAD inmovilizadas sobre el mismo, comprendiendo el proceso:

5. Un proceso para preparar un electrodo que tiene enzimas redox dependientes de FAD inmovilizadas sobre el mismo, comprendiendo el proceso:

(a): tratar un electrodo para obtener una monocapa que comprende un grupo mediador de electrones, teniendo el grupo mediador de electrones un resto de unión que es capaz de asociarse químicamente con, unirse a o adsorberse químicamente a la superficie del electrodo, el tratamiento comprende la unión del resto de unión sobre la superficie del electrodo;

(c): hacer reaccionar el electrodo obtenido en (b) con la apoenzima de una enzima dependiente de FAD en condiciones en las que la apoenzima se combina con el componente FAD del FAD inmovilizado.

6. Un proceso para preparar electrodos que comprende enzimas inmovilizadas con un grupo fotoisomerizable asociado que puede cambiar su estado de isomerización por exposición a la luz a una cierta longitud de onda, cambiando así la tasa de actividad catalítica inducida eléctricamente de la enzima, comprendiendo el proceso:

(a): preparar una apoenzima tratando una enzima dependiente de FAD de manera que se retira el FAD de la misma;

7. Un sistema electroquímico para determinar la presencia de un analito en un medio líquido, comprendiendo el sistema:

(b): un grupo mediador de electrones que puede transferir electrones entre la superficie del electrodo y el FAD;

8. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 7, en el que el grupo mediador de electrones forma parte de o está unido covalentemente al FAD funcionalizado.

9. Un sistema según la Reivindicación 7, en el que el grupo mediador de electrones se une covalentemente a la enzima.

10. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 7, en el que el grupo mediador de electrones se mueve libremente en un medio que rodea al electrodo.

11. Un método para determinar la presencia de un analito en un medio líquido, comprendiendo el método:

(a): proporcionar un sistema según la Reivindicación 7;

12. Un método de acuerdo con la Reivindicación 11, en el que la determinación del analito se realiza in vivo.

13. Un sistema electroquímico para grabar señales ópticas que tiene una primera longitud de onda y transducir las señales grabadas, teniendo el sistema una célula electroquímica que comprende:

(a): un electrodo que lleva enzimas redox dependientes de FAD inmovilizadas, la enzima: (aa) tiene un FAD funcionalizado que comprende un grupo fotoisomerizable que cambia de estado de isomerización de un primer estado a un segundo estado tras la fotoestimulación con luz de una primera longitud de onda, un cambio en el estado de isomerización que da lugar a un cambio en la tasa de actividad catalítica de la enzima redox, y (ab) está inmovilizada sobre la superficie del electrodo mediante un grupo de unión que

(aba): forma parte de o está unido covalentemente al FAD funcionalizado, o

(b): un grupo mediador de electrones que puede transferir electrones entre el electrodo y el FAD;

(c): un sustrato para la actividad catalítica de la enzima; y

(d): un circuito eléctrico para cargar el electrodo y medir la respuesta eléctrica.

14. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 13, en el que la enzima está inmovilizada sobre la superficie del electrodo mediante un grupo de unión que se une covalentemente a un resto externo sobre la superficie de la enzima.

15. Un sistema de acuerdo con la Reivindicación 13 ó 14, en el que el grupo mediador de electrones se mueve libremente en el medio que rodea al electrodo.

16. Un sistema de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 13-15, que comprende una fuente luminosa que emite luz a una segunda longitud de onda, dicha segunda longitud de onda fotoisomeriza el grupo fotoisomerizable del segundo estado al primer estado.

17. Un método para grabar señales ópticas que tienen una primera longitud de onda y transducir eléctricamente las señales ópticas grabadas, comprendiendo el método:

(a): proporcionar un sistema de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 13-16:

(b): exponer el electrodo a una fuente luminosa:

(c): cargar el electrodo y medir la respuesta eléctrica.

un cambio en la respuesta eléctrica indica la exposición a luz que tiene la primera longitud de onda.