DE60319677T2

DE60319677T2 - Redoxenzyme-tragender biosensor

Info

Publication number: DE60319677T2
Application number: DE60319677T
Authority: DE
Inventors: Itamar Willner; Eugenii Katz; Maya Zayats
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 2002-02-04
Filing date: 2003-01-30
Publication date: 2009-03-26
Anticipated expiration: 2023-01-31
Also published as: EP1472361A1; EP1472361B1; DE60319677D1; WO2003066886A1; JP2005517164A; ATE389027T1; AU2003207970A1; US7018518B2; US20030148169A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Bioelektronik und bezieht sich auf elektrisch leitende Festkörpermatrizen (die hier als „Elektroden" bezeichnet werden), die Redox-Enzyme tragen, sodass eine elektrische Ladung zwischen der Oberfläche der Elektrode und den Enzymen fließen kann, was dieselben katalytisch aktiv macht. Durch die Erfindung wird auch ein Verfahren zum Herstellen der Elektroden sowie von Vorrichtungen, Systemen und Verfahren, die derartige Elektroden verwenden, bereitgestellt.
VERWANDTER STAND DER TECHNIK
Die Technik, die als Hintergrund der vorliegenden Erfindung für relevant erachtet wird, umfasst Folgendes:

1. Habermuller, L., Mosbach, M., Schuhmann, W., Fresenius, J.; Anal. Chem., 366: 560–568, 2000.
2. Heller, A., Acc. Chem. Res., 23: 128–134, 1990.
3. Willner, I., Katz, E., Willner, B., Electroanalysis, 9: 965–977, 1997.
4. Chef, T., Barton, S.C., Binyamin, G., Gao, Z.Q., Zhang, Y.C., Kim, H.H., Heller, A., J. Am. Chem. Soc., 123: 8630–8631, 2001.
5. Katz, E., Willner, I., Kotlyar, A.B., J. Electroanal. Chem., 479: 64–68, 1999.
6. Willner, I., Heleg-Shabtai, V., Katz, E., Rau, H.K., Haehnel, W., I. am. Chem. Soc., 121: 6455–6468, 1999.
7. Willner, I., Katz, E., Riklin, A., Kahser, R., J. Am. Chem. Soc., 114: 10965–10966, 1992.
8. Willner, I., Riklin, A., Shoham, B., Rivenzon, D., Katz, F., Adv. Mater., 5: 912–915, 1993.
9. Gregg, A.A., Heller, A., J. Phys. Chem., 95: 5970–5975, 1991.
10. Cosnier, S., Innocent, C., Jouanneau, Y., Anal. Chem., 66: 3198–3201, 1994.
11. Badia, A., Carlini, R., Fernandez, A., Battaglini, F., Mikkelsen, S.R., English, A.M., J. Am. Chem. Soc., 115: 7053–7060, 1993.
12. Willner, I., Heleg-Shabtai, V., Blonder, R., Katz, E., Tao, G., Buckmann, A.F., Heller, A., J. Am. Chem. Soc., 118: 10321–10322, 1996.
13. WO 97/45720
14. Katz, E., Riklin, A., Heleg-Shabtai, V., Willner, I., Buckmann, A.F., Anal. Chim. Acta, 385: 45–58, 1999.
15. Buckmann, A.F., Wray, V., Stocker, A., in McCormick, D.B. (Hrsg.), Methods in Enzymology: Vitamins and Coenzymes, Academic Press, 280(1): 360, 1997.
16. James, T.D., Sandanayake, K., Shinkai, S., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 35: 1911–1922, 1996.
17. Lorand, J.P., Edwards, J.O., J. Org. Chem. 24, 76–88, 1959.
18. Katz, E., Willner, I., Langmuir 13: 3364–3373, 1997.
19. Natasimba, K., Wingard, LB, Anal. Chem. 58, 2984–2987, 1986.
20. Alvarez-Icaza, M., Schmid, RD, Bio electrochemistry and Bioenergetics 33: 191–199, 1994.

Auf die Elemente der obigen Liste wird durch Anführen ihrer Nummer aus der Liste Bezug genommen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Redox-Enzyme elektrisch mit Elektroden in Kontakt zu bringen ist ein Hauptziel für die Entwicklung von amperometrischen Biosensoren^1-3, Biobrennstoffzellen^4-5 und Bioelektronikelementen⁶. Es wurden integrierte in elektrischen Kontakt gebrachte Enzym-Elektroden hergestellt, indem eine Elektronenvermittlergruppe mit dem der Elektrode zugeordneten Enzym verknüpft wurde^7-8, und indem Redox-Enzyme in redoxaktiven Polymeren, die an Elektroden angeordnet waren, immobilisiert wurden^9-10 Die Wirksamkeit der Elektronentransferkommunikation bei diesen Systemen ist jedoch erheblich geringer als die Elektronentransferumsatzraten der Enzyme mit ihren eigentlichen Substraten¹¹. Dies wird auf eine zufällige, nicht optimale Modifizierung der Redox-Proteine durch die elektroaktiven Relais-Einheiten und auf die zufällige Ausrichtung der Enzyme bezüglich des Elektrodenträgers zurückgeführt³. Es wurde bereits gezeigt^12-14, dass die Rekonstitution eines Apo-Flavoenzyms, Apo-Glukoseoxidase (Apo-GOx), auf einer Relais-FAD(Flavin-Adenin-Dinukleotid)-Monoschicht, die einer Elektrode zugeordnet ist, eine ausgerichtete, elektrisch in Kontakt stehende Enzym-Elektrode mit einer noch nie dagewesenen, wirksamen Elektronentransferkommunikation liefert, die der Elektronentransferumsatzrate des Enzyms mit seinem eigentlichen Substrat (Sauerstoff) nahekommt. Diese effiziente elektrische Kommunikation zwischen dem rekonstituierten Oberflächenbioelektrokatalysator und der Elektrode wurde ausgenutzt, um Enzym-Elektroden für einen Glukose-Sensor^12-14 und für eine Glukose-basierte Biobrennstoffzelle⁵ zu entwickeln. Für die Erzeugung der Relais-FAD-Monoschicht bei diesen Systemen ist die kovalente Bindung einer synthetischen Aminoethyl-FAD-Einheit an die Relais-Komponente ein wichtiger Schritt. Die komplizierte Synthese dieses Kofaktors¹⁵ sorgte jedoch dafür, dass diese Vorgehensweise nur begrenzten praktischen Nutzen aufwies.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der Erfindung wird das Problem des Koppelns einer Elektronenvermittlergruppe mit einem Enzymcofaktor durch die Verwendung von Boronsäure oder einem Boronsäurederivat als eine Verknüpfungsgruppe zwischen dem Cofaktor und einer Elektronenvermittlergruppe gelöst. Boronsäure ist ein aktiver Ligand für die Assoziation von cis-Diolen und insbesondere von cis-Diolen, die zu zyklischen Sacchariden gehören¹⁶. Es hat sich herausgestellt, dass Boronsäurederivate den direkten Elektronentransport mit Glukoseoxidase verstärken^19-20. Gemäß der Erfindung bindet Boronsäure oder ein Boronsäurederivat an zwei cis-Hydroxy-Gruppen des Cofaktors und an die Elektronenvermittlergruppe.
Gemäß der Erfindung wird eine Elektrode bereitgestellt, die immobilisierte Gruppen mit der allgemeinen Formel: V-W-X-Y-Z trägt, wobei
V ein Bindungsbaustein ist, welcher mit der Elektrode chemisch verbunden werden kann, an der Elektrode befestigt werden kann oder chemisch auf die Elektrode sorbieren kann;
W eine Elektronenvermittlergruppe ist, welche Elektronen zwischen der Elektrode und Y transferieren kann;
X eine Verknüpfungsgruppe ist;
Y ein Cofaktor eines Redox-Enzyms ist, welcher, wenn er nicht an X gebunden ist, mindestens ein Paar cis-Hydroxy-Gruppen aufweist; und
Z ein Redox-Enzym ist;
dadurch gekennzeichnet, dass X ein Boronsäurederivat ist.
Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel hat X die Formel
wobei R ein aliphatischer oder aromatischer Baustein ist, z. B. Phenyl, Naphthyl oder Alkyl, der optional mit mindestens einer Carboxy-, Carbonyl-, Amino-, Hydroxy- oder Thio-Gruppe substituiert ist.
Gemäß einem spezifischen Ausführungsbeispiel ist X ein Aminophenylboronsäurederivat.
Typische Cofaktoren sind FAD, NAD⁺ und NADP⁺. Beispiele für Enzyme sind Glukoseoxidase, Laktatdehydrogenase und Äpfelsäureenzym (Malatdehydrogenase), Fruktosedehydrogenase, Alkoholdehydrogenase, Cholinoxidase und dergleichen.
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Herstellen der Elektroden, das Merkmale aufweist, wie sie im Folgenden unter Bezugnahme auf das im Folgenden beschriebene spezifische Ausführungsbeispiel umrissen sind. Insbesondere liefert die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer Elektrode, welche immobilisierte Redox-Enzyme Z trägt, umfassend:

(i) das Bilden einer Schicht auf der Oberfläche der Elektrode, umfassend Gruppen der Formel V-W-X-Y, wobei V ein Bindungsbaustein ist, welcher mit der Elektrode chemisch verbunden werden kann, an der Elektrode befestigt werden kann oder chemisch auf die Elektrode sorbieren kann, und W eine Elektronenvermittlergruppe ist, welche Elektronen zwischen der Elektrode und Y transferieren kann, Y ein Cofaktor des Enzyms ist und X eine Verknüpfungsgruppe ist;
(ii) das In-Kontakt-Bringen dieser Elektrode mit einem oder mehreren Enzymmolekülen, denen ein Cofaktor fehlt, um diese Enzyme mit dem Cofaktor zu komplexieren, um immobilisierte Gruppen V-W-X-Y-Z zu erhalten, wobei Z ein katalytisch funktionales Enzym ist, welches eine Redoxreaktion katalysieren kann; wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass der Cofaktor mindestens ein Paar cis-Hydroxy-Gruppen aufweist und das Verfahren das Binden des Cofaktors an die Elektronenvermittlergruppe durch eine Gruppe X umfasst, wobei X ein Boronsäurederivat ist.

Gemäß einem spezifischen Ausführungsbeispiel umfasst das Verfahren das Bilden einer Schicht von Gruppen V-W, anschließend das Binden von Y daran durch die Vermittlung von X, gefolgt von einer Rekonstitution des Redox-Enzyms Z an der Elektrode, um schließlich immobilisierte Gruppen V-W-X-Y-Z zu erhalten, wobei das Enzym Z beim Katalysieren einer Redoxreaktion katalytisch aktiv ist. Das Verfahren gemäß diesem Ausfürungsbeispiel umfasst:

(i) das Bilden einer Schicht auf der Oberfläche der Elektrode, umfassend Gruppen der Formel V-W, wobei V ein Bindungsbaustein ist, welcher mit der Elektrode chemisch verbunden werden kann, an der Elektrode befestigt werden kann oder chemisch auf die Elektrode sorbieren kann, und W eine Elektronenvermittlergruppe ist, welche Elektronen zwischen der Elektrode und einem Cofaktor Y des Enzyms transferieren kann;
(ii) das Binden von Y an die Gruppen; und
(iii) das In-Kontakt-Bringen der Elektrode mit einem oder mehreren Enzymmolekülen, denen ein Cofaktor fehlt, um diese Enzyme mit dem Cofaktor zu komplexieren, um funktionelle Enzyme zu erhalten, welche eine Redoxreaktion katalysieren können; wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass

Gemäß einem spezifischen Ausführungsbeispiel umfasst ((ii)) bei dem im Vorhergehenden genannten Verfahren das Binden einer Boronsäure oder eines Boronsäurederivats an die Gruppen V-W, die auf der Elektrode immobilisiert sind, um immobilisierte Gruppen V-W-R-B-(OH)₂ zu erhalten, und anschließendes Binden von Y an die immobilisierten Gruppen V-W-R-B-(OH)₂, um immobilisierte Gruppen V-W-R-B^–-(OH)-Y zu erhalten.
Gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel umfasst ((ii)) das Binden einer Gruppe der Formel R-B-(OH)₂ an Y, um ein erstes Bindungsprodukt R-B^–(OH)-Y zu erhalten, und anschließendes Binden des ersten Bindungsprodukts an immobilisierte Gruppen V-W, um immobilisierte Gruppen V-W-R-B^–(OH)-Y zu erhalten.
Die Erfindung betrifft auch Vorrichtungen und Systeme, die die Elektrode der Erfindung verwenden, wie z. B. Biosensoren und Brennstoffzellen, wobei die Elektrode eine der Komponenten derselben ist. Z. B. kann ein Biosensorsystem oder eine andere Vorrichtung, die die Elektrode der Erfindung verwendet, nützlich sein zum Nachweis eines Agens, bei dem es sich um ein Substrat des Redox-Enzyms handelt. Das Agens kann auch in situ oder ex vivo nachgewiesen werden, z. B. durch Einführen des Biosensors in ein Blutgefäß usw. durch einen Katheter.
Wie zu erkennen ist, umfassen Vorrichtungen und Systeme, die die Elektrode verwenden, auch andere Komponenten, wie z. B. eine Bezugselektrode, die relevante elektrische/elektronische Schaltungsanordnung usw. Im Fall des Biosensors der Erfindung umfasst diese Vorrichtung/dieses System z. B. normalerweise auch ein Modul, das mit der Elektrode verbunden ist, um die Elektrode mit Energie zu versorgen und die Antwort zu erfassen.
Eine Brennstoffzelle, die die Elektrode der Erfindung verwendet, kann durch die Redoxreaktion, die durch das Enzym durchgeführt wird, das an der Elektrode befestigt ist, mit Energie versorgt werden. Somit weist eine derartige Brennstoffzelle auch ein Medium, normalerweise ein wässriges Medium, auf, das ein Substrat für das Enzym umfasst. Infolge der sich ergebenden Redoxreaktion wird die Elektrode mit elektrischer Energie versorgt.
Die Elektrode gemäß der Erfindung kann aus einer elektrisch leitenden Substanz, wie z. B. Gold, Platin, Silber, leitfähiges Glas, wie z. B. Indiumzinnoxid (ITO), mit funktionalisiertem Alkoxysilan an der äußeren Oberfläche (eine Silanisierung einer ITO-Elektrode kann z. B. durch einen Rückfluss der Elektrode in einer Argonatmosphäre mit 3-Aminopropyltriethoxysilan in Trockentoluen und anschließendes Trocknen in einem Ofen erfolgen), hergestellt oder mit derselben beschichtet sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Um die Erfindung zu verstehen und einen Einblick zu gewinnen, wie dieselbe in die Praxis umgesetzt werden kann, wird nun ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel, nur als nicht einschränkendes Beispiel, unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben. Es zeigen:
1 den Aufbau einer rekonstituierten GOx-Elektrode und die bioelektrokatalytische Oxidation von Glukose an dieser Elektrode;
2A ein zyklisches Voltammogramm einer PQQ-FAD-funktionalisierten Au-Elektrode bei einer Potentialabtastrate von 200 mV sec^–1: (a) vor der Rekonstitution, (b) nach der Rekonstitution mit GOx;
2B zyklische Voltammogramme der GOx-rekonstituierten, PQQ-FAD-funktionalisierten Au-Elektrode (geometrische Fläche 0,3 cm², Rauhigkeitsfaktor ca. 1,3) in Anwesenheit unterschiedlicher Glukosekonzentrationen: (a) 0 mM, (b) 5 mM, (c) 10 mM, (d) 15 mM, (e) 20 mM, (f) 25 mM, (g) 35 mM, (h) 40 mM, (i) 50 mM; Potentialabtastrate 2 mV s^–1. Daten wurden in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, unter Ar aufgezeichnet. Kasten: Kalibrierungskurve der elektrokatalytischen Ströme (E = 0,2 V gegen SCE) bei unterschiedlichen Glukosekonzentrationen;
3 ein Schema eines Vergleichsexperiments, bei dem die Boronsäureverknüpfungsgruppe ohne eine PQQ-Zwischengruppe direkt an die Elektrode gebunden wurde: (a) Rekonstitution einer nicht versteiften FAD-Monoschicht mit GOx und die biokatalytische Oxidation von Glukose durch die Enzym-Elektrode in Anwesenheit von Ferrocencarbonsäure (4) als Diffusionsvermittler; (b) Aufbau einer versteiften FAD-Monoschicht und ihre chronoamperometrische Reduktion;
4 einen Graph, der einen chronoamperometrischen Übergangsstrom zeigt, der der Reduktion der versteiften FAD-Monoschicht nach Erfolgen eines Potentialschrittes von –0,4 V auf –0,6 V entspricht; Kasten: halblogarithmische Darstellung des chronoamperometrischen Übergangs. Die Daten wurden in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, unter Ar aufgezeichnet;
5 den Aufbau der rekonstituierten Äpfelsäureenzym(Malatdehydrogenase)-Elektrode und die bioelektrokatalytische Oxidation von Malat an dieser Elektrode;
6 den Aufbau der rekonstituierten Laktatdehydrogenase(LDH)-Elektrode und die bioelektrokatalytische Oxidation von Laktat an dieser Elektrode; und
7 einen Graph, der zyklische Voltammogramme der Elektrode von 5 zeigt. Die Kurven a–d zeigen zyklische Voltammogramme der Enzym-Elektrode in Anwesenheit von unterschiedlichen Malatkonzentrationen: (a) 0 mM, (b) 0,25 mM, (c) 0,5 mM, (d) 1 mM. Die zyklischen Voltammogramme wurden in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, als Grundelektrolyt unter Argon mit der Potentialabtastrate 5 mV s^–1 aufgezeichnet. Der Kasten zeigt eine Kalibrierungskurve der amperometrischen Antworten (bei E = 0,3 V gegen SCE), die bei unterschiedlichen Malatkonzentrationen gemessen wurden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Boronsäure ist ein aktiver Ligand für die Assoziation von cis-Diolen und insbesondere von cis-Diolen, die zu zyklischen Sacchariden gehören¹⁶. Die FAD-Monoschicht gemäß der vorliegenden Erfindung ist an einer Elektrode angeordnet, z. B. einer Au-Elektrode, wie es in 1 skizziert ist. Zunächst wird Pyrrolochinolinchinon, PQQ, (1), kovalent an eine Cystamin-Monoschicht gebunden, die an der Elektrode angeordnet ist. An die sich ergebende Monoschicht wird 3-Aminophenylboronsäure (2), 1 × 10^–3 M, unter Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC), 5 × 10^–3 M, als Verknüpfungsreagens in 0,1 M HEPES-Puffer, pH = 7,3, kovalent gebunden. Die sich ergebende Elektrode wird mit 1 × 10^–3 M FAD (3) behandelt, um den Boronsäure-FAD-Komplex an der Monoschichtanordnung zu erhalten.
2A, Kurve (a), zeigt das zyklische Voltammogramm der sich ergebenden Monoschicht, die aus PQQ-FAD gebildet ist. Die beiden Redoxwellen entsprechen der quasi-reversiblen Reaktion der FAD-(E° = –0,50 V gegen SCE) bzw. der PQQ-(E° = –0,13 V) Einheiten, pH = 7,0. Eine coulometrische Untersuchung der Redoxwellen der elektroaktiven Einheiten zeigt, dass die Oberflächenbedeckung der PQQ- und FAD-Einheiten 1,8 × 10^–10 mol·cm^–2 bzw. 1,6 × 10^–10 mol·cm^–2 beträgt (das molare PQQ:FAD-Verhältnis beträgt ca. 1:0,9). Die Behandlung der PQQ-Boronsäurederivat-FAD-funktionalisierten Elektrode mit Apo-GOx führt zur Oberflächenrekonstitution des Proteins an der funktionalisierten Elektrode, 2A, Kurve (b).
Mikrogravimetrische Quarzkristall-Mikrowaagen-Messungen nach der Rekonstitution von Apo-GOx an einem piezoelektrischen Au/Quarz-Kristall (AT-Cut, 9 MHz), der mit der PQQ-FAD-Monoschicht modifiziert wurde, zeigen eine Oberflächenbedeckung des Enzyms, die 2 × 10^–12 mol·cm^–2 entspricht, sodass sich eine dicht gepackte Monoschicht zeigt. 2B zeigt die zyklischen Voltammogramme der sich ergebenden oberflächenrekonstituierten Enzym-Elektrode in Anwesenheit von unterschiedlichen Glukosekonzentrationen. Ein elektrokatalytischer Anodenstrom wird in Anwesenheit von Glukose beobachtet, was darauf schließen lässt, dass das oberflächenrekonstituierte Enzym in elektrischem Kontakt mit der Elektrode steht, und dass das Enzym bezüglich der Oxidation von Glukose bioelektrokatalytisch aktiv ist. Der elektrokatalytische Anodenstrom wird bei dem Redoxpotential der PQQ-Einheiten beobachtet, was zeigt, dass PQQ die Oxidation von FADH₂ vermittelt, das bei der Oxidation von Glukose gebildet wird.
2B, Kasten, zeigt die abgeleitete Kalibrierungskurve, die den Strömen entspricht, die durch das Enzym-Elektroden-System von 1 gewandelt werden, bei unterschiedlichen Glukosekonzentrationen. Die Stromantwort ist bei Glukosekonzentrationen, die 60 mM übersteigen, gesättigt. Der gesättigte Stromwert entspricht der höchsten Umsatzrate des Biokatalysators. Aus der bekannten Oberflächenbedeckung des Enzyms, und da der Sättigungswert der Stromdichte bekannt ist (i_max = 140 μA·cm^–2), wird geschätzt, dass die Elektronentransferumsatzrate bei 25°C bei ca. 700 s^–1 liegt. Dieser Wert ist der Elektronentransferumsatzrate von Glukoseoxidase mit O₂, ihrem eigentlichen Substrat, ähnlich¹⁷.
Die effiziente Elektronentransferumsatzrate des rekonstituierten Enzyms hat bedeutende Folgen für die Eigenschaften der Enzym-Elektrode. Sauerstoff beeinträchtigt die amperometrische Antwort der Enzym-Elektrode in Anwesenheit von Glukose nicht. Ebenso werden die amperometrischen Antworten der Elektrode (E = 0,0 V gegen SCE) in Anwesenheit von Glukose durch 20 mM Ascorbinsäure oder 20 mM Harnsäure, häufigen Störsubstanzen bei Glukoseerfassungselektroden, nicht beeinträchtigt. Das heißt, die nicht-spezifische Oxidation der Störsubstanzen hat eine geringe Auswirkung (< 5%) auf die Ströme, die von der Glukoseoxidation stammen.
Bei einem Vergleichsexperiment, das in 3 skizziert ist, wurde 3-Aminophenylboronsäure (2) direkt mit einer Cysteinsäure-Monoschicht, die an der Au-Elektrode angeordnet war, verknüpft. Der Cofaktor FAD wurde dann mit dem Boronsäureliganden verknüpft, und Apo-GOx wurde auf die Monoschicht rekonstituiert. Die sich ergebende oberflächenrekonstituierte Enzym-Elektrode steht nicht in direkter elektrischer Kommunikation mit der Elektrode, obwohl das Enzym in einer biologisch aktiven Konfiguration rekonstituiert ist, die durch die bioelektrokatalysierte Oxidation von Glukose in Anwesenheit von Ferrocencarbonsäure (4) als Diffusionselektronenvermittler offensichtlich ist. Dieses Kontrollexperiment zeigt deutlich, dass die PQQ-Einheiten bei dem integrierten System, das in 1 schematisch gezeigt ist, den Elektronentransport zwischen der FAD-Redoxstelle und der Elektrodenoberfläche vermitteln.
Der FAD-Cofaktor umfasst die Diol-Funktionalitäten der Riboseeinheit und der linearen Glyceroleinheit. Frühere Untersuchungen¹⁷ haben gezeigt, dass die Assoziationskonstante der Saccharideinheit bezüglich des Boronsäureliganden wesentlich höher ist als diejenige des linearen Polyols. Bislang wurde eine einzige Bindungsart des FAD-Cofaktors mit dem Boronsäureliganden durch chronoamperometrische Experimente bestätigt. Die 3-Aminophenylboronsäure-Komponente wurde mit der thiolierten Cysteinsäure-Monoschicht, die der Au-Elektrode zugeordnet war, kovalent verbunden, und die Monoschicht trat in Wechselwirkung mit FAD, um den Boronatkomplex zu liefern. Die sich ergebende Monoschicht wurde mit C₁₄H₂₉SH in Ethanollösung (1 mM, 2 h) versteift (3(b)). Es wurde bereits gezeigt¹⁸, dass die Grenzflächen-Elektronentransferratenkonstanten bezüglich elektroaktiver Einheiten bei Monoschichtkonfigurationen empfindlich gegenüber ihrer räumlichen Trennung von der Elektrode und gegenüber der Bindungsart sind. Die Bindung von FAD an den Boronsäureliganden auf die beiden möglichen Arten würde einen chronoamperometrischen Übergang mit einer biexponentiellen Kinetik liefern, die den Elektronentransferratenkonstanten bezüglich der zwei Bindungsarten der FAD-Einheiten entspricht.
4 zeigt den chronoamperometrischen Übergang, der der Reduktion der FAD-Einheit entspricht. Der Übergangsstrom, der einem einzigen exponentiellen Verfall folgt (4, Kasten), lässt auf eine einzige Assoziationsart der FAD-Einheit schließen.
Spezifische Beispiele für Cofaktoren sind die natürlich vorkommenden Cofaktoren FAD und NAD(P)⁺, die cis-Hydroxy-Gruppen in den Molekülen aufweisen. Diese Hydroxy-Gruppen werden gemäß der Erfindung verwendet, um die Cofaktoren unter Verwendung von Boronsäure oder einem Boronsäurederivat, wie z. B. Aminophenylboronsäure, die spezifisch an die cis-Hydroxy-Gruppen bindet, kovalent an die modifizierte Elektrode zu binden. Nach einer weiteren Rekonstitution von Enzymen, die mit dem jeweiligen Cofaktor wirksam sind, werden die immobilisiertes Enzym enthaltenden Strukturen an den Elektroden erhalten.
Der FAD-Cofaktor, der gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung verwendet wird, dringt nach dem Rekonstitutionsprozess tief in das Enzymmolekül ein, was eine starke (aber trotzdem nichtkovalente) Bindung des Enzymmoleküls an die Elektrode liefert.
Die NAD(P)⁺-Cofaktoren (d. h. NAD⁺ oder NADP⁺) dringen nicht in die jeweiligen Enzyme ein und liefern nur eine schwache, vorübergehende Bindung der Enzyme an den Elektroden. Um den vorübergehenden Affinitätskomplex mit den Enzymen zu stabilisieren, werden die zugeordneten Enzymmoleküle bevorzugt vernetzt, nachdem sie mit der Cofaktor-Monoschicht an der Elektrodenoberfläche einen Komplex gebildet haben, wobei ein bifunktioneller Vernetzer, z. B. Glutardialdehyd, verwendet wird, der in der Lage ist, mit Aminogruppen zu reagieren.
Nicht einschränkende Beispiele für biokatalytische Elektroden gemäß der vorliegenden Erfindung bestehen aus: (a) einer Goldelektrode, (b) einer Cystamin-Monoschicht, die Aminogruppen für die Bindung der ersten Redox-Komponente des Systems liefert, (c) einer PQQ-Monoschicht, bei der es sich um die erste Redox-Komponente in dem System handelt, die einen Elektronentransfer von dem Cofaktor zu der Elektrode liefert, (d) Aminophenylboronsäure, die spezifisch zwischen Carboxyl-Gruppen, die durch PQQ geliefert werden, und cis-Hydroxy-Gruppen, die durch den Cofaktor geliefert werden, verbindet, (e) einer Cofaktor(FAD, NAD⁺ oder NADP⁺)-Monoschicht, die eine Befestigung und biokatalytische Tätigkeit der jeweiligen Enzyme liefert, (f) dem Enzym, das an der Cofaktor-Monoschicht rekonstituiert ist. Im Fall von FAD und Glukoseoxidase ist die Wechselwirkung allein stark genug, aber im Fall von NAD⁺ und Äpfelsäureenzym oder NADP⁺ und Laktatdehydrogenase sind die Wechselwirkungen nicht ausreichend stark und eine weitere Vernetzung wird angewandt, um den Enzymkomplex mit der NAD(P)⁺-Cofaktor-Monoschicht zu stabilisieren.
Der Aufbau des Systems, das aus Cystamin/PQQ/Aminophenylboronsäure/NADP⁺/Äpfelsäureenzym besteht, ist in 5 mit den folgenden Veränderungen gegenüber Cystamin/PQQ/Aminophenylboronsäure/FAD/Glukoseoxidase, das in 1 gezeigt ist, schematisch gezeigt: (a) NADP⁺ wird statt FAD zur Verknüpfung mit der Aminophenylboronsäure verwendet; (b) Äpfelsäureenzym, 1 g mL^–1, wurde 10 Minuten lang auf die NADP⁺-funktionalisierte Elektrode aufgebracht, und die sich ergebende Enzymschicht wurde 10 Minuten lang in einer Glutardialdehydlösung, 10% (v/v), vernetzt; dann wurde die Elektrode mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, gespült.
Das System, das aus Cystamin/PQQ/Aminophenylboronsäure/NAD⁺/Laktatdehydrogenase besteht, wird auf ähnliche Weise angeordnet (6), mit folgenden Änderungen: (a) NAD⁺ wurde für die Verknüpfung mit Aminophenylboronsäure verwendet; (b) Laktatdehydrogenase, 1 g mL^–1, wurde 10 Minuten lang auf die NAD⁺-funktionalisierte Elektrode aufgebracht, und die sich ergebende Enzymschicht wurde 10 Minuten lang in der Glutardialdehydlösung, 10% (v/v), vernetzt; dann wurde die Elektrode mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, gespült. Es sei darauf hingewiesen, dass FAD- und NADP⁺-Cofaktoren nur ein Paar cis-Hydroxy-Gruppen in den Molekülen haben, sodass dieselben nur eine möglichen Bindungsart an Aminophenylboronsäure aufweisen. Der NAD⁺-Cofaktor hat jedoch zwei Paare von cis-Hydroxy-Gruppen, die zwei unterschiedliche Bindungsarten liefern können, wie es in 6 gezeigt ist.
7 zeigt die bioelektrokatalytische Oxidation von Malat durch die Elektrode, die mit PQQ/Aminophenylboronsäure/NADP⁺/Äpfelsäureenzym funktionalisiert ist (siehe Schema 3). Die Kurven a–d zeigen zyklische Voltammogramme der Enzym-Elektrode in Anwesenheit von unterschiedlichen Malatkonzentrationen: (a) 0 mM, (b) 0,25 mM, (c) 0,5 mM, (d) 1 mM. Die zyklischen Voltammogramme wurden in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, als Grundelektrolyt unter Argon mit der Potentialabtastrate 5 mV s^–1 aufgezeichnet. Der Kasten zeigt eine Kalibrierungskurve der amperometrischen Antworten (bei E = 0,3 V gegen SCE), die bei unterschiedlichen Malatkonzentrationen gemessen wurden.
BEISPIELE
Die Elektrodenherstellung:
Aufbau der Au/Cystamin/PQQ/Aminophenylboronsäure/FAD/Glukoseoxidase-Elektrode
Eine Gold(Au)-Drahtelektrode (geometrische Fläche 0,3 cm², Rauhigkeitsfaktor 1,3) wurde mit einer Cystamin-Monoschicht modifiziert, indem die Elektrode 2 Stunden lang in eine 0,02 M Cystaminlösung in Wasser eingetaucht wurde; dann wurde die Elektrode 5 Mal mit Wasser gespült. Die Cystamin-modifizierte Elektrode wurde 2 Stunden lang mit Pyrrolochinolinchinon(PQQ)-1 mM-Lösung in 0,1 M HEPES-Puffer, pH 7,3, in Anwesenheit von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC), 5 mM, zur Reaktion gebracht; dann wurde die Elektrode 2 Mal mit 0,1 M HEPES-Puffer, pH 7,3, gespült. Die PQQ-funktionalisierte Au-Elektrode wurde in Anwesenheit von EDC, 5 mM, 2 Stunden lang mit Aminophenylboronsäure, 1 mM, in 0,1 M HEPES-Puffer, pH 7,3, zur Reaktion gebracht; dann wurde die Elektrode 2 Mal mit 0,1 M HEPES-Puffer, pH 7,3, gespült. Die PQQ/Aminophenylboronsäure-funktionalisierte Au-Elektrode wurde 2 Stunden lang mit FAD, 1 mM, in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, zur Reaktion gebracht; dann wurde die Elektrode 2 Mal mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, gespült. Die FAD-funktionalisierte Au-Elektrode wurde 5 Stunden lang mit Apo-Glukoseoxidase (Apo-GOx), 1 g mL^–1 in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, zur Wechselwirkung gebracht; dann wurde die enzymrekonstituierte Elektrode 2 Mal mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, gespült. Diese Prozedur ist in 1 dargestellt.
Aufbau der Au/Cystamin/PQQ/Aminophenylboronsäure/NADP⁺/Äpfelsäureenzym-Elektrode
Eine Gold(Au)-Drahtelektrode (geometrische Fläche 0,3 cm², Rauhigkeitsfaktor 1,3) wurde mit einer Cystamin-Monoschicht modifiziert, indem die Elektrode 2 Stunden lang in 0,02 M Cystaminlösung in Wasser eingetaucht wurde; dann wurde die Elektrode 5 Mal mit Wasser gespült. Die Cystamin-modifizierte Elektrode wurde 2 Stunden lang mit Pyrrolochinolinchinon(PQQ)-1 mM-Lösung in 0,1 M HEPES-Puffer, pH 7,3, in Anwesenheit von EDC, 5 mM, zur Reaktion gebracht; dann wurde die Elektrode 2 Mal mit 0,1 M HEPES-Puffer, pH 7,3, gespült. Die PQQ-funktionalisierte Au-Elektrode wurde in Anwesenheit von EDC, 5 mM, 2 Stunden lang mit Aminophenylboronsäure, 1 mM, in 0,1 M HEPES-Puffer, pH 7,3, zur Reaktion gebracht; dann wurde die Elektrode 2 Mal mit 0,1 M HEPES-Puffer, pH 7,3, gespült. Die PQQ/Aminophenylboronsäure-funktionalisierte Au-Elektrode wurde 2 Stunden lang mit NADP⁺, 1 mM, in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, zur Reaktion gebracht; dann wurde die Elektrode 2 Mal mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, gespült. Die NADP⁺-funktionalisierte Au-Elektrode wurde 10 Minuten lang mit Äpfelsäureenzym (MalE), 1 g mL^–1, in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, zur Wechselwirkung gebracht; dann wurde die Enzym-Elektrode 10 Minuten lang mit 10%iger (v/v) Glutardialdehydlösung in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, behandelt; dann wurde die vernetzte Enzym-Elektrode 2 Mal mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, gespült. Diese Prozedur ist in 5 dargestellt.
Aufbau der Au/Cystamin/PQQ/Aminophenylboronsäure/NAD⁺/Laktatdehydrogenase-Elektrode
Eine Gold(Au)-Drahtelektrode (geometrische Fläche 0,3 cm², Rauhigkeitsfaktor 1,3) wurde mit einer Cystamin-Monoschicht modifiziert, indem die Elektrode 2 Stunden lang in eine 0,02 M Cystaminlösung in Wasser eingetaucht wurde; dann wurde die Elektrode 5 Mal mit Wasser gespült. Die Cystamin-modifizierte Elektrode wurde 2 Stunden lang mit Pyrrolochinolinchinon(PQQ)-1 mM-Lösung in 0,1 M HEPES-Puffer, pH 7,3, in Anwesenheit von EDC, 5 mM, zur Reaktion gebracht; dann wurde die Elektrode 2 Mal mit 0,1 M HEPES-Puffer, pH 7,3, gespült. Die PQQ-funktionalisierte Au-Elektrode wurde in Anwesenheit von EDC, 5 mM, 2 Stunden lang mit Aminophenylboronsäure, 1 mM, in 0,1 M HEPES-Puffer, pH 7,3, zur Reaktion gebracht; dann wurde die Elektrode 2 Mal mit 0,1 M HEPES-Puffer, pH 7,3, gespült. Die PQQ/Aminophenylboronsäure-funktionalisierte Au-Elektrode wurde 2 Stunden lang mit NAD⁺, 1 mM, in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, zur Reaktion gebracht; dann wurde die Elektrode 2 Mal mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, gespült. Die NAD⁺-funktionalisierte Au-Elektrode wurde 10 Minuten lang mit Laktatdehydrogenase (LDH), 1 g mL^–1, in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, zur Wechselwirkung gebracht; dann wurde die Enzym-Elektrode 10 Minuten lang mit 10%iger (v/v) Glutardialdehydlösung in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, behandelt; dann wurde die vernetzte Enzym-Elektrode 2 Mal mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, gespült. Diese Prozedur ist in 6 dargestellt.

Claims

Eine Elektrode, die immobilisierte Gruppen mit der allgemeinen Formel V-W-X-Y-Z trägt, worin V ein Bindungsbaustein ist, welcher mit der Elektrode chemisch verbunden werden kann, an der Elektrode befestigt werden kann oder chemisch auf die Elektrode sorbieren kann; W eine Elektronenvermittlergruppe ist, welche Elektronen zwischen der Elektrode und Y transferieren kann; X eine Verknüpfungsgruppe ist; Y ein Cofaktor eines Redox-Enzyms ist, welcher, wenn er nicht an X gebunden ist, mindestens ein Paar cis-Hydroxy-Gruppen aufweist; und Z ein Redox-Enzym ist; dadurch gekennzeichnet, dass X ein Boronsäurederivat ist.
Eine Elektrode gemäß Anspruch 1, worin X die Formel
hat, worin R ein aliphatischer oder aromatischer Baustein ist, der optional mit mindestens einer Carboxy-, Carbonyl-, Amino-, Hydroxy- oder Thio-Gruppe substituiert ist.
Eine Elektrode gemäß Anspruch 1, worin X ein Aminophenylboronsäurederivat ist.
Eine Elektrode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Cofaktor ausgewählt ist aus FAD, NAD⁺ und NADP⁺.
Eine Elektrode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Enzym ausgewählt ist aus Glukoseoxidase, Laktatdehydrogenase und Apfelsäureenzym.
Eine Elektrode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Enzym vernetzt ist unter Verwendung eines bifunktionellen Vernetzers, der in der Lage ist mit Aminogruppen zu reagieren, um dessen Bindung an die Elektrode zu verbessern.
Eine Elektrode gemäß Anspruch 6, worin der Vernetzer Glutardialdehyd ist.
Eine Vorrichtung, umfassend eine Elektrode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
Eine Vorrichtung gemäß Anspruch 8, welche ein Biosensor ist.
Ein Biosensor gemäß Anspruch 9, umfassend eine elektronische Schaltung zum Ansteuern der Elektrode und Messen der Antwort.
Eine Vorrichtung gemäß Anspruch 8, welche eine Brennstoffzelle ist.
Eine Brennstoffzelle gemäß Anspruch 11, umfassend ein Substrat für das Redox-Enzym.
Ein Verfahren zum Herstellung einer Elektrode, welche immobilisierte Redox-Enzyme Z tragt, umfassend: (i) das Bilden einer Schicht auf der Oberfläche der Elektrode, umfassend Gruppen der Formel V-W-X-Y, worin V ein Bindungsbaustein ist, welcher mit der Elektrode chemisch verbunden werden kann, an der Elektrode befestigt werden kann oder chemisch auf die Elektrode sorbieren kann, und W eine Elektronenvermittlergruppe ist, welche Elektronen zwischen der Elektrode und Y transferieren kann, Y ein Cofaktor des Enzyms ist und X eine Verknüpfungsgruppe ist; (ii) das In-Kontakt-bringen dieser Elektrode mit einem oder mehreren Enzymmolekülen, denen ein Cofaktor fehlt, um diese Enzyme mit dem Cofaktor zu komplexieren, um immobilisierte Gruppen V-W-X-Y-Z zu erhalten, worin Z ein katalytisch funktionales Enzym ist, welches eine Redoxreaktion katalysieren kann; wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass der Cofaktor mindestens ein Paar cis-Hydroxy-Gruppen aufweist und das Verfahren das Binden des Cofaktors an die Elektronenvermittergruppe durch eine Gruppe X umfasst, wobei X ein Boronsäurederivat ist.
Ein Verfahren zum Herstellung einer Elektrode, welche immobilisierte Redox-Enzyme Z trägt, umfassend: (i) das Bilden einer Schicht auf der Oberfläche der Elektrode, umfassend Gruppen der Formel V-W, worin V ein Bindungsbaustein ist, welcher mit der Elektrode chemisch verbunden werden kann, an der Elektrode befestigt werden kann oder chemisch auf die Elektrode sorbieren kann, und W eine Elektronenvermittlergruppe ist, welche Elektronen zwischen der Elektrode und einem Cofaktor Y des Enzyms transferieren kann; (ii) das Binden von Y an die Gruppen durch die Vermittlung von X und (iii) das In-Kontakt-bringen der Elektrode mit einem oder mehreren Enzymmolekülen, denen ein Cofaktor fehlt, um diese Enzyme mit dem Cofaktor zu komplexieren, um funktionelle Enzyme zu erhalten, welche eine Redoxreaktion katalysieren können; wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass der Cofaktor mindestens ein Paar cis-Hydroxy-Gruppen aufweist und das Verfahren das Binden des Cofaktors an die Elektronenvermittlergruppe durch eine Gruppe X umfasst, wobei X ein Boronsäurederivat ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 13, worin X die Formel
hat, worin R ein aliphatischer oder aromatischer Baustein ist, der optional mit mindestens einer Carboxy-, Carbonyl-, Amino-, Hydroxy- oder Thio-Gruppe substituiert ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 15, worin R ausgewählt ist aus Phenyl-, Naphthyl- und Alkylgruppen, wobei die Gruppen optional mit mindestens einer Carboxy-, Carbonyl-, Amino-, Hydroxy- oder Thio-Gruppe substituiert sind.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 14, worin (ii) umfasst: das Binden einer Boronsäure oder eines Boronsäurederivats an die Gruppen V-W, die auf der Elektrode immobilisiert sind, um immobilisierte Gruppen V-W-R-B-(OH)₂ zu erhalten, und anschließendes Binden von Y an die immobilisierten Gruppen V-W-R-B-(OH)₂, um immobilisierte Gruppen V-W-R-B^–(OH)-Y zu erhalten.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 14, worin (ii) umfasst: das Binden einer Gruppe der Formel R-B-(OH)₂ an Y, um ein erstes Bindungsprodukt R-B^–(OH)-Y zu erhalten und anschließendes Binden des ersten Bindungsprodukts an immobilisierte Gruppen V-W, um immobilisierte Gruppen V-W-R-B^–(OH)-Y zu erhalten.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18, umfassend das Behandeln der Elektrode, um das Enzym zu vernetzen.