KR20120040872A - 배향성을 갖는 복층 구조의 효소 연료 전지용 전극 및 이의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 효소 연료 전지의 단위 면적당 전력량 증가를 위해 전극 재료인 탄소나노튜브(CNT)에 부착된 산화 반응 효소에 다시 동일한 효소를 중첩적으로 부착한 효소 연료 전지 및 이의 제조 방법에 대한 것이다.
본 발명에서는 화학적 처리를 통하여 전극 물질의 표면에 화학적 작용기를 부착한 후 이를 단백질과 화학적으로 결합을 형성시킴으로써 효소를 고정화하였다. 또한, 고정화 단계에서 효소의 활성점을 마스킹하여 활성점이 전극 물질에 직접적으로 부착하는 것을 방지할 수 있도록 하였다. 또한 단층으로 결합된 효소에 화학적인 방법으로 효소를 결합시킴으로써 복층의 효소를 부착하였다.
궁극적으로 전극 물질에 효소의 활성점이 부착되는 것을 방지하고 복층 구조로 효소를 부착시킴으로써 효소 전극의 성능을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서는 화학적 처리를 통하여 전극 물질의 표면에 화학적 작용기를 부착한 후 이를 단백질과 화학적으로 결합을 형성시킴으로써 효소를 고정화하였다. 또한, 고정화 단계에서 효소의 활성점을 마스킹하여 활성점이 전극 물질에 직접적으로 부착하는 것을 방지할 수 있도록 하였다. 또한 단층으로 결합된 효소에 화학적인 방법으로 효소를 결합시킴으로써 복층의 효소를 부착하였다.
궁극적으로 전극 물질에 효소의 활성점이 부착되는 것을 방지하고 복층 구조로 효소를 부착시킴으로써 효소 전극의 성능을 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 효소 연료 전지용 전극 및 이의 제조방법에 대한 것이다. 상세하게는 효소 연료 전지의 단위 면적당 전력량 증가를 위해 전극 재료인 탄소나노튜브(CNT)에 부착된 산화 반응 효소에 다시 동일한 효소를 중첩적으로 부착한 효소 연료 전지 및 이의 제조 방법에 대한 것이다.
효소 연료 전지, 특히 글루코스 산화 효소를 이용한 연료 전지는 인체 이식형 의료기기의 전원으로 사용 가능성이 있어 많은 관심을 받고 있으나 이로부터 발생되는 전력량이 낮은 문제점이 있다. 특히, 이를 인체 이식형 전원으로 사용하기 위해서는 효소 연료 전지의 크기를 수 마이크로 미터 이하로 줄여야 하는데, 이 경우, 발생 전력량이 더욱 감소되어 인체 이식형 의료기기에 충분한 전원을 공급하는데 어려움이 있다. 효소 연료 전지의 성능을 향상시키기 위해서는 이의 핵심 요소인 효소 전극의 성능을 향상시켜야 한다. 효소 전극은 전기가 잘 통하는 전극에 효소를 고정화하여 제조되는데, 효소의 고정화 단계가 매우 중요하다. 효소를 전극 물질에 고정화하는데 있어서, 성능을 향상시키기 위하여 고려해야 할 몇 가지 사항들이 있다. 첫째, 일반적으로 효소는 물리적 흡착 또는 화학적 결합에 의해 전극 물질에 고정화될 수 있는데, 장기간 부착이 가능하기 위해서는 화학적 결합에 의한 고정화가 좋다. 둘째, 글루코스를 산화시켜 전기를 발생시키는 데 있어서, 효소의 활성점과 그 곁에 존재하는 환원 보조 인자인 FDA가 그 역할을 한다. 효소 고정화 단계에서 이러한 FDA를 내포하고 있는 활성점이 전극 물질에 직접 부착하게 되면, 용액에 존재하는 글루코스와 쉽게 접촉할 수 없게 되어 성능이 감소할 수 있다. 셋째, 화학적 전극 물질에 효소를 부착할 때, 단일층으로 결합하게 되어 전극 단위 면적당 부착할 수 있는 효소의 양이 한계가 있다.
본 발명에서는 화학적 처리를 통하여 전극 물질의 표면에 화학적 작용기를 부착한 후 이를 단백질과 화학적으로 결합을 형성시킴으로써 효소를 고정화하였다. 또한, 고정화 단계에서 효소의 활성점을 마스킹하여 활성점이 전극 물질에 직접적으로 부착하는 것을 방지할 수 있도록 하였다. 또한 단층으로 결합된 효소에 화학적인 방법으로 효소를 결합시킴으로써 복층의 효소를 부착하였다.
궁극적으로 전극 물질에 효소의 활성점이 부착되는 것을 방지하고 복층 구조로 효소를 부착시킴으로써 효소 전극의 성능을 향상시킬 수 있다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 다공성 탄소 재료로 이루어진 전자 도체, 상기 전자 도체에 고정된 제1 효소 및 전자 전달 매개체를 포함하는 제1 효소층, 상기 제1 효소층의 제1 효소에 결합된 제2 효소 및 전자 전달 매개체를 포함하는 제2 효소층을 포함하여 상기 제1 효소 및 제2 효소는 각각 하나 이상의 활성점을 가지며, 상기 각 활성점에 기질이 부착되어 마스킹 되어있는 것을 특징으로 하는 효소 연료 전지용 전극을 제공한다.
여기에서, 상기 다공성 탄소 재료는 카르복시기가 도입되도록 개질된 것을 특징으로 하는 것이다.
여기에서, 상기 탄소 재료는 탄소 나노 튜브(CNT)인 것을 특징으로 하는 것이다.
여기에서, 상기 제1 효소 또는 제2 효소, 또는 제1 및 제2 효소는 산화 효소인 것을 특징으로 하는 것이다.
여기에서, 상기 산화 효소는 글루코스 산화 효소인 것을 특징으로 하는 것이다.
여기에서, 상기 기질은 글루코스 또는 글루콘산인 것을 특징으로 하는 것이다.
여기에서, 상기 전자 전달 매개체는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD)인 것을 특징으로 하는 것이다.
또한, 본 발명은 a) 전자 도체인 탄소 재료에 카르복시기가 도입되도록 상기 탄소 재료를 개질시키는 단계, b) 상기 전자 도체에 제1 효소를 고정시켜 제1 효소층을 형성하는 단계 및 c) 상기 제1 효소에 제2 효소를 결합시켜 제2 효소층을 형성하는 단계를 포함하며, 상기 b) 단계를 수행하기 전, 및 상기 c) 단계를 수행하기 전에 상기 제1 효소 및 제2 효소의 활성점에 기질을 부착시켜 활성점을 마스킹 하는 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극 제조 방법을 제공한다.
여기에서, 상기 b) 단계는 개질된 전자 도체와 제1 효소의 결합을 매개하는 링커(lingker) 물질을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 것이다.
여기에서, 상기 링커 물질은 EDC(N-ehtyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide) 및 NHS(N-hydroxy-succinidide)인 것을 특징으로 하는 것이다.
여기에서, 상기 a) 단계는 상기 다공성의 탄소 재료와 산용액의 혼합물을 초음파 처리하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 것이다.
여기에서, 상기 탄소 재료는 탄소 나노 튜브인 것을 특징으로 하는 것이다.
여기에서, 상기 효소 또는 제2 효소, 또는 제1 및 제2 효소는 산화 효소인 것을 특징으로 하는 것이다.
여기에서, 상기 산화 효소는 글루코스 산화 효소인 것을 특징으로 하는 것이다.
여기에서, 상기 기질은 글루코스 또는 글루콘산인 것을 특징으로 하는 것이다.
여기에서 상기 제1 효소 또는 제2 효소, 또는 상기 제1 효소 및 제2 효소는 각 효소의 활성점에 전자 전달 매개체가 부착되어 있는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기의 전극을 애노드로 포함하는 효소 연료 전지용 전지를 제공한다. 마지막으로 본 발명은 상기 방법으로 제조된 전극을 애노드으로 포함하는 효소 연료 전지용 전지를 제공한다.
본 발명에 따른 효소 연료 전지용 전극은 효소가 다층으로 고정화됨으로써 전극의 단위 면적당 효소의 담지량이 증가되어 발생되는 전력량이 증가되는 효과를 갖는다. 또한, 고정화 단계에서 효소의 활성점을 마스킹하여 고정화 효소의 효소-기질 간 반응성을 높여 전지의 효율을 높이는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 효소 연료 전지용 전극을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 또 다른 실시형태에 따른 연료 전지용 전극으로서 효소층이 3층으로 형성되어 있는 전극을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 전극에 고정된 효소에 있어서 마스킹 전후 효소 활성점의 배향을 개략적으로 도시한 것이다.
도 4은 본 발명의 포도당 산화를 이용하여 효소 연료전지용 전극의 전기 화학적 성능 특성을 나타낸 것으로 전압변화에 따른 전류의 생성량을 나타낸 것이다.
도 5는 글루코스 산화효소가 MWCNT에 고정된 것을 확인하는 FT-IR 그래프를 도시한 것이다.
도 6은 CNT 개질 메커니즘을 개략적으로 도시한 것이다.
도 7은 EDC 및 NHS를 함께 사용한 매개 반응의 메커니즘을 도시한 것이다.
도 8은 제1 효소층이 전자 도체에 고정되는 반응 매커니즘을 도시한 것이다.
도 9는 제2 효소층을 형성하는 반응 매커니즘을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 또 다른 실시형태에 따른 연료 전지용 전극으로서 효소층이 3층으로 형성되어 있는 전극을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 전극에 고정된 효소에 있어서 마스킹 전후 효소 활성점의 배향을 개략적으로 도시한 것이다.
도 4은 본 발명의 포도당 산화를 이용하여 효소 연료전지용 전극의 전기 화학적 성능 특성을 나타낸 것으로 전압변화에 따른 전류의 생성량을 나타낸 것이다.
도 5는 글루코스 산화효소가 MWCNT에 고정된 것을 확인하는 FT-IR 그래프를 도시한 것이다.
도 6은 CNT 개질 메커니즘을 개략적으로 도시한 것이다.
도 7은 EDC 및 NHS를 함께 사용한 매개 반응의 메커니즘을 도시한 것이다.
도 8은 제1 효소층이 전자 도체에 고정되는 반응 매커니즘을 도시한 것이다.
도 9는 제2 효소층을 형성하는 반응 매커니즘을 개략적으로 도시한 것이다.
이하 본 발명의 구체적인 실시형태에 대해서 도면을 참조하면서 설명한다.
도 1에는 본 발명의 일 실시형태에 따른 효소 연료 전지용 전극을 도시한 것이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 연료 전지용 전극은, 전자 도체; 상기 전자 도체에 고정된 효소 및 전자 전달 매개체를 포함하는 제1 효소층; 및 상기 제1 효소층의 효소에 결합된 효소 및 전자 전달 매개체를 포함하는 제2 효소층;을 포함한다. 바람직하게는 상기 제1 효소층 및 제2 효소층의 각 효소들의 활성점에 해당 효소에 대해 특이적으로 반응하는 기질을 부착시킴으로써 상기 각 효소의 활성점이 마스킹 되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 전자 도체는 전자를 전도하는 물질이므로 양호한 전기 전도성을 갖는 재료로 구성되는 것이 바람직하다. 특히 적합한 전자 도체는 탄소계 물질로 구체적으로는 탄소 섬유, 탄소 페이퍼, 카본 블랙, 탄소 분말, 단일벽 탄소 튜브, 이중벽 탄소 튜브, 탄소 나노 튜브 어레이가 포함된다.
본 발명에 따른 전극의 일 실시예에 따르면, 상기 전자 도체는 다공성 탄소 재료인것이다. 상기 다공성 탄소 재료는 전도성을 보유할 뿐만 아니라 다공성 특성상 비표면적이 높아 단위 면적당 효소의 담지량이 높고, 따라서 반응 면적을 증가시키는데 도움이 된다. 구체적으로 상기 다공성 탄소 재료는 탄소 나노 튜브(CNT)인 것으로, 단일벽 탄소 나노 튜브(SWCNT) 또는 다중벽 탄소 나노 튜브(MWCNT)가 포함된다.
본 발명에 따른 효소 연료 전지용 전극에 사용되는 상기 CNT는 카르복시기(-COOH)가 도입되도록 개질된 것이다. 원래 CNT와 같은 탄소 재료는 반응성이 없어 직접적으로 단백질 효소와 결합하지 못하므로 효소를 고정시키기 위해서는 작용기를 부가하여 효소와의 반응성을 높일 필요가 있다. CNT에 카르복시기(-COOH)를 도입하기 위해 공지의 이온성 기능기화 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로는 질산과 황산을 1:3의 부피비로 혼합한 산용액을 처리하는 방법을 사용하는 것이다(M.A. Hamon). 도 6은 카르복시기를 도입하는 CNT 개질 매커니즘을 개략적으로 도시한 것이다.
상기와 같은 방법으로 CNT에 카르복시기가 도입되면 이 카르복시기가 단백질 효소의 N-말단의 아미노기와 반응하여 아마이드 결합에 의해 효소를 고정하게 된다.
또한, 상기 CNT의 카르복시기와 효소의 N 말단 간의 아미노기와의 아마이드 결합의 반응성을 높이기 위해 링커 물질을 사용할 수 있다. 상기 링커 물질의 예로는 EDC(N-ehtyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide), DCC(dicyclohexylcarbodiimid), DIC(disisopropylcarbodiimid)등이 포함된다. 이 중 EDC(N-ehtyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)에 의해 유도되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 EDC(N-ehtyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)와 NHS(N-hydroxy-succinidide)를 함께 사용하는 반응에 의해 유도되는 것이다. 도 7은 EDC 및 NHS를 함께 사용한 매개 반응의 메카니즘을 개략적으로 도시한 것이다.
본 발명의 구체적인 일 실시형태에 따르면 상기 전극은 기질을 산화시켜 자유 전자를 발생시킨 후 전자 도체를 통해 전자를 전기회로에 공급하는 애노드로 이용되는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 애노드는 기질의 산화를 촉매하는 산화환원효소를 포함하는 전극을 의미한다. 상기 산화 전극은 기질의 산화를 통해 전기회로에 전자를 공급하는 것이다.
산화환원효소(oxidoreductase)는 환원제(reductant), 즉 수소 또는 전자 공여체(donor)로부터 산화제 (oxidant), 즉 수소 또는 전자 수용체(acceptor)로의 전자의 전달을 촉매하는 효소를 의미한다. 산화환원효소는 '공여체:수용체 산화환원효소(donor:acceptor oxidoreductase)'라고 명명하는 것이 바람직하나, 흔히 '공여체 탈수소효소(donor dehydrogenase)' 또는 '수용체 환원효소(acceptor reductase)'라고 일컬어지고 있다. 특히, 산소가 수용체인 경우, 산화환원효소는 '공여체 산화효소(donor oxidase)'라고 불리기도 한다.
본 발명의 한 측면에서, 상기 산화전극에 포함되는 산화환원효소는 기질을 산화시켜 전자를 공급할 수 있는 산화환원효소라면 어떠한 것이든 이용가능하다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 산화전극에 포함되는 산화환원효소는 예를 들어, 글루코스 산화효소, 글루코스 탈수소효소, 알코올 산화환원 효소, 알데히드 탈수소효소, CHCH산화환원 효소, 아미노산 산화환원 효소, CH-NH 산화환원 효소, 락테이트 탈수소효소, 락토오스 탈수소효소,피루베이트 탈수소효소, 포르메이트 탈수소효소 및 포름알데히드 탈수소효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 산화환원효소일 수 있다. 효소 연료 전지의 연료로서 사용하고자 하는 기질의 종류에 따라 상기 효소의 종류는 달라질 수 있을 것이다. 효소의 기질은 당, 탄수화물, 유기산, 알코올, 지방산, 탄화수소, 케톤, 알데히드, 아미노산, 단백질 및 핵산과 같은 유기 화합물이다.
본 발명의 구체적인 일 실시형태에 따르면, 상기 산화전극에 포함되는 산화환원효소는 글루코스 산화효소일 수 있다. 글루코스 산화효소는 글루코스를 글루코노락톤으로 산화시키면서 전자를 방출하는 것이다.
또한 상기 글루코스 산화효소는 전자 전달 매개체로서 효소의 각 활성점에 효소 1 분자당 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 2 분자가 부착되어 있는 것을 특징으로 한다.
상기 전자 전달 매개체는 기질의 산화로 인해 발생된 전자를 전자 도체에 전달하기 위해 사용되는 것으로 전자를 수용하거나 제공할 수 있는 화합물이다. 본 발명은 효소의 보조인자(cofactor)를 전자 전달 매개체로 사용할 수 있다. 상기 보조인자는 전자를 수용하여 환원형을 형성할 수 있는 산화형을 가질 수 있으며, 환원형은 또한 전자를 제공하여 산화형을 생성할 수 있다. 상기 전자 전달 매개체로 사용되는 보조인자는 고정화되는 효소의 내부로 확산되거나 고정되는 효소의 내부로 삽입되어 위치하는 것을 특징으로 한다. 사용되는 효소의 종류에 따라 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; NADP), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드( Nicotinamide Adenine Dinucleotide; NAD) 또는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD) 등과 같은 보조 인자(산화형/환원형)가 전자 전달 매개체로 사용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시형태에 따르면, 상기 고정되는 효소가 글루코스 산화효소인 경우, 생물체 내 환경을 근거로 하였을 때, 상기 전자 전달 매개체는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)이며, 이는 효소 내에서 산화형(FAD+) 또는 환원형(FADH2)으로 존재할 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이 상기 플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드는 상기 글루코스 산화 효소의 활성점 부근에 두 분자가 부착되어 있는 것을 특징으로 한다. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드인산 또는 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드의 경우, 효소를 이용한 연료 전지용 전극의 제조시 상기 보조 인자를 별도로 첨가하여야 하나 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드의 경우에는 자연 상태에서 글루코스 산화효소와 같은 주효소에 부착되어 있으므로 본 발명에 따른 전극 제조시 이를 글루코스 산화효소와 별도로 첨가하는 단계를 필요로 하지 않는다. 이하 설명되는 실시예에서 사용된 글루코스 산화 효소는 곰팡이인 아스파질러스 나이저(Aspergillus niger)에서 유래된 야생형 효소로 FAD가 부착되어 시판중인 것이다(SIGMA-ALDRICH 사 제품).
본 발명에 따른 효소 연료 전지용 전극은 전자 도체에 고정된 효소가 2층 이상 복수의 효소층을 이루고 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서는 상기 전자 도체와 직접 결합되어 있는 효소를 제1 효소라고 하며, 상기 제1 효소로 이루어진 효소층을 제1 효소층이라고 한다. 상기 제1 효소는 상기에서 언급한 산화 효소인 것이다. 구체적으로는 글루코스 산화효소일 수 있다. 상기 제1 효소층의 제1 효소는 제1 효소의 N-말단의 아미노기와 상기 전자 도체에 도입된 카르복시기와의 아마이드 결합을 통해 고정될 수 있다. 도 8은 제1 효소층이 전자 도체에 고정되는 반응 매커니즘을 개략적으로 도시한 것이다.
상기 제1 효소의 고정은 링커 물질인 EDC(N-ehtyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide)와 NHS(N-hydroxy-succinidide)를 함께 사용하는 매개 반응에 의해 유도되어 아마이드 결합의 반응성을 높일 수 있음은 상기한 바와 같다.
본 발명에 따른 연료 전지용 전극은 상기 제1 효소층에 제2 효소층이 결합되어 있는 형태인 것을 특징으로 한다. 상기 제2 효소층은 상기 제1 효소층의 제1 효소에 결합된 제2 효소를 포함하는 효소층이다. 제2 효소는 상기의 산화 효소일 수 있다. 또한, 제2 효소는 제1 효소와 같거나 다른 효소일 수 있는데, 제1 효소와 동일한 기능을 수행하는 것이 바람직하므로 제1 효소와 동일한 효소를 사용하는 것이 바람직하다.
제2 효소층을 형성하는 방법은 다음과 같다. 우선 제1 효소층이 형성된 전극에 EDC 및 NHS를 처리하여 제1 효소의 카르복시기가 활성화된 중간체를 형성한다. 여기에 제2 효소를 첨가하면 제1 효소의 중간체 형태의 활성화된 카르복시기와 제2 효소의 아민기가 아마이드 결합을 형성하여 결합하게 된다. 도 9은 상기 메커니즘을 도식화하여 나타낸 것이다.
본 발명에 따른 전극은 전자 도체에 상기와 같이 이중의 효소층이 형성되므로 단일의 효소층만으로 이루어지는 공지의 전극에 비해 단위 면적당 담지되는 효소의 양이 증가되며, 따라서 전지 단위 면적당 발생되는 전력량도 증가되는 효과가 있다.
상세한 방법을 기재하지는 않았으나, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 상기와 같은 효소-효소간 결합의 방법을 이용해서, 전극에 3층 이상의 복수의 효소층을 형성시키는 것이 가능할 것이다(도 2참조). 본 발명에 따른 전극의 구체적인 일 실시형태에 있어서, 글루코스 산화 효소를 사용하는 경우, 상기 기질은 글루코스인 것이다.
상기 제1 효소층의 제1 효소는 상기 전극에 고정되기 전에 각 효소의 활성점 부위에 상기 효소에 대해 특이적으로 반응하는 기질을 부착하여 활성점이 마스킹 되어 있는 형태인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 전극에 사용되는 전자 도체는 카르복시기(-COOH)가 생성되어 있는 것으로 효소의 활성점에 존재하는 아미노기와 쉽게 반응할 수 있다. 만일 효소의 활성점의 아미노기와 상기 전자 도체의 카르복시기가 반응하여 결합하게 되면 연료 기질의 산화 효율이 저하되는 단점이 있다. 따라서, 이를 방지하기 위해 전자 도체에 효소가 고정되는 동안 상기 효소 활성점의 아미노기와 CNT의 카르복시기가 반응하지 않도록 마스킹 물질로 활성점을 보호할 필요가 있다.
상기 마스킹 물질은 활성점과 결합능력이 좋아야 할 뿐만 아니라 일정 시점 후에는 활성점에서 분리되어야 글루코스 산화를 통하여 전자를 발생시킬 수 있다. 상기 마스킹 물질로는 효소의 종류에 따라 적당한 것을 골라 사용할 수 있는데, 만일 고정되는 효소가 글루코스 산화 효소인 경우에는, 상기 글루코스 산화 효소의 활성점에 부착될 수 있는 것으로서, 글루코스 또는 글루콘산을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 효소의 활성점이 마스킹 되어 있는 경우에는 효소의 활성점이 효소가 결합된 전자 도체의 반대편으로 배향되기 때문에 상기 제1 효소층의 효소들이 전자 도체의 CNT와 직접 결합하는 것을 방지하여 효소의 산화 효율이 저하되는 문제를 해소할 수 있다(도 3).
상기 제2 효소도 제1 효소와 마찬가지로 효소의 활성점을 기질로 마스킹함으로써 전극의 성능을 향상시킬 수 있다. 하기의 실시예에서 상세하게 설명하겠지만, 제2 효소의 마스킹은 제1 효소와 결합에 의해 제2 효소층을 형성하는 단계에서 동시에 이루어질 수 있다. 제2 효소의 마스킹 물질로는 제2 효소에 특이적으로 결합하며, 일정 시점 후 제2 효소와 분리될 수 있는 것이 바람직하다. 본 발명에 다른 전극의 일 실시형태에 따르면, 제2 효소는 글루코스 산화 효소이며, 따라서, 제2 효소의 마스킹 물질은 글루코스인 것이 바람직하다. 또는 글루코스 대신, 또는 글루코스와 함께 글루콘산을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 효소 연료 전지용 전극의 대략적인 제조 방법은:
a) 전자 도체인 탄소 재료에 카르복시기가 도입되도록 상기 탄소 재료를 개질시키는 단계;
b) 상기 전자 도체에 제1 효소를 고정시켜 제1 효소층을 형성하는 단계; 및
c) 상기 제1 효소에 제2 효소를 결합시켜 제2 효소층을 형성하는 단계;를 포함한다.
이에 덧붙여 상기 b) 단계를 수행하기 전, 그리고, 상기 c) 단계를 수행하기 전에 상기 제1 효소 및 제2 효소의 활성점에 기질을 부착시켜 활성점을 마스킹 하는 단계를 수행하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 b) 단계는 개질된 전자 도체와 제1 효소의 반응성을 향상시키기 위해 링커 물질로 유도되는 것이 바람직하다.
이상과 같이 산화환원효소가 전자 도체에 2층 이상의 복층으로 고정된 효소 연료 전지용 전극에 대해 상세하게 설명하였다. 그러나 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 상기의 발명의 내용을 통해 빌리루빈 옥시데이즈(bilirubin oxidase), 퍼록시데이즈 (peroxidase), 또는 라케이즈 (laccase)와 같이 기질을 환원시킬 수 있는 효소를 전자 도체에 2층 이상 복층으로 고정시켜 캐소드(cathode)로 사용할 수 있다는 것을 용이하게 창안할 수 있을 것이다.
실시예
이하 하기의 실시예를 통해 본 발명의 연료 전지용 전극 및 이의 제조방법을 더욱 구체적으로 설명한다.
실시예
1
(1) CNT의 개질-카르복시기의 도입
10mg의 MWCNT를 산용액 4ml(황산:질산=3:1, 부피비)에 넣고 3시간 초음파 세척기에서 초음파를 가한 후 0.2㎕ 필터를 통과시켜 산 처리된 MWCNT를 회수하였다. 이를 증류수 20ml로 3번 세척한 후 60℃에서 건조시켜 카르복시기를 생성하였다.
(2) 링커 물질의 부착
상기 단계 1에서 회수된 MWCNT에 증류수 20ml를 넣은 후 분산도를 향상시키기 위해 초음파 세척기에서 10분간 초음파를 가하였다. 자기 교반기로 교반하며, MES 버퍼(pH=6.1)를 첨가하고(최종농도, 50mM), NHS를 첨가(최종 농도 1mg/mL)한 후, EDC(최종 농도 1mg/ml)를 첨가하였다. 상기 혼합액을 상온에서 30분간 교반한 후, 0.2㎛필터를 통과시키고, 증류수로 세 번 세척하여 링커(amine-reactive NHS ester)가 부착된 MWCNT를 얻었다.
(3) 제1 효소층의 형성 및 제1 효소의 마스킹
포화농도(3M)의 글루코스 용액 또는 글루콘산 용액 30ml에 글루코스 산화 효소 30mg을 첨가하여 상온에서 30분간 교반하였다. 상기 글루코스 산화효소는 시판되는 G6125(시그마-알드리치 제품)로 아스파질러스 나이저(Aspergillus niger)에서 유래된 야생형 효소로, 상기 효소 1 분자당 2 분자의 FAD가 부착되어 있는 것이다. 이 과정에서 글루코스 산화 효소의 활성점을 글루코스 또는 글루콘산으로 포화되었다. 이 혼합용액에 상기 단계 2에서 회수한 링커가 부착된 MWCNT를 첨가한 후 3시간 동안 상온에서 교반하였다. 이를 0.2㎛필터를 통과시키고 증류수로 세 번 세척하여 글루코스 산화 효소가 부착된 MWCNT를 얻었다. 도 5에 도시한 바와 같이 FT-IR로 글루코스 산화효소가 MWCNT에 고정된 것을 확인하였다.
(4) 제2 효소층의 형성 및 제2 효소의 마스킹
상기 3 단계에서 회수된 글루코스 산화 효소가 고정된 MWCNT에 증류수 20ml를 넣은 후 자기 교반기로 교반하며 MES 버퍼(pH 6.1)(최종 농도, 50mM), NHS(최종 농도 1mg/ml), EDC(최종농도 1mg/ml)을 첨가하였다. 혼합액을 상온에서 30분간 교반한 후, 0.2㎛ 필터를 통과시키고 증류수로 세 번 세척하였다. 이를 글루코스 산화 효소(G6125, 시그마-알드리치 제품) 30mg이 첨가된 포화 농도(3M)의 글루코스 용액 또는 글루콘산 용액 30ml에 첨가하고 상온에서 3시간 교반하였다. 이 과정에서 단층의 글루코스 산화 효소에 새롭게 도입된 글루코스 산화 효소가 결합하여 복층의 글루코스 산화 효소가 결합된 MWCNT를 얻었고, 상기 글루코스 산화 효소의 활성점은 글루코스 또는 글루콘산으로 포화되었다.
비교예
1
실시예 1과 동일한 방법으로 링커(amine-reactive NHS ester)가 부착된 MWCNT를 얻었다. 글루코스 산화 효소(G6125, 시그마-알드리치 제품) 30mg이 포함된 수용액 30ml에 상기 링커가 부착된 MWCNT를 첨가한 후 3시간 동안 상온에서 교반하였다. 이를 0.2㎛필터를 통과시키고 증류수로 세 번 세척하여 글루코스 산화 효소가 부착된 MWCNT를 얻었다.
비교예
2
상기 비교예 1과 동일한 방법으로 글루코스 산화 효소가 부착된 MWCNT를 얻었다. 여기에 증류수 20ml를 넣은 후 자기 교반기로 교반하며 MES 버퍼(pH 6.1)(최종 농도, 50mM), NHS(최종 농도 1mg/ml), EDC(최종농도 1mg/ml)을 첨가하였다. 혼합액을 상온에서 30분간 교반한 후, 0.2㎛ 필터를 통과시키고 증류수로 세 번 세척하였다. 그 다음 이를 글루코스 산화 효소(G6125, 시그마-알드리치 제품) 30mg이 포함된 수용액 30 ml에 넣고 상온에서 3시간 교반하였다. 이렇게 하여 복층의 글루코스 산화 효소가 결합된 MWCNT를 얻었다. 각 층의 산화 효소는 마스킹 단계를 수행하지 않았다.
비교예
3
실시예 1 중 (1) 내지 (3) 단계만 수행하여 단층의 글루코스 산화 효소가 결합된 MWCNT를 얻었다.
실시예
1 및
비교예
1 내지 3의 효소 전극의 전기적 특성 비교 실험
골드 전극 표면을 사포로 문지르고 증류수로 깨끗이 세척한 후, 실시예 1 및 비교예 1 내지 3에서 회수된 글루코스 산화 효소가 고정화된 각 MWCNT 전극 약 1mg을 실버/에폭시 레진을 이용하여 세척된 전극 표면에 부착시켰다. 전극을 진공 오븐에 넣고 상온에서 1시간 건조시킨 후, 투석막(MW cutoff= 12,0000~14,000)으로 전극 표면을 감싸고 오링으로 고정시켰다. 전위차계(Potentiostat, CH Instrument)를 이용하여 실온에서 전압을 변화시키면서 발생되는 전류량을 측정하였다. 전극 셀에 100mM 인산칼륨 버퍼(Potassium phosphate buffer)(pH 7.0)에 KCl 20mM과 글루코스 10mM을 첨가한 용액 6mM을 채우고 세 개의 전극을 담가두었다. 측정 전극(working electrode)으로는 실시예 1 및 비교예 1 내지 3의 네 가지 효소전극 중 하나를 사용하고, 카운터전극은 백금와이어 이며, 레퍼런스 전극으로는 Ag/AgCl을 사용하였다. 스캔 속도는 50mV/s였다.
실험 결과
도 4는 상기 각 전극을 이용한 네 가지 사이클릭 볼타모그램을 나타낸 그래프이다. 도 4에 나타낸 것과 같이, 300~370 mV에서 생성전류 피크가 보이는데, 이것은 FDA/FDAH2의 산화-환원 전위를 나타내는 것으로, 이 값이 클수록 단위 면적당 및 단위 시간당 발생되는 전자(전기)량이 많아 전극 성능이 높은 것이다. 상기 네 가지 방법(실시예 1 및 비교예 1 내지 3)에 의해 제조된 전극들의 값들이 비교되었다. 단층의 효소가 부착된 전극들의 경우, 마스킹을 통해 효소들을 고정하여 제조된 전극이 더 높은 수치를 나타내었다. 또한 이와 같은 방법에 의해 복층의 효소를 고정화한 실시에 1의 전극이 비교예 1 내지 3의 전극에 비해 가장 높은 수치를 나타내었다. 본 결과로부터 본 발명에서 제시한 효소 전극 제조 방법이 기존에 제시된 방법에 비해 훨씬 우수함을 알 수 있다.
Claims (19)
- 다공성 탄소 재료로 이루어진 전자 도체;
상기 전자 도체에 고정된 제1 효소 및 전자 전달 매개체를 포함하는 제1 효소층; 및
상기 제1 효소에 결합된 제2 효소 및 전자 전달 매개체를 포함하는 제2 효소층;을 포함하며,
상기 제1 효소 및 제2 효소는 각각 하나 이상의 활성점을 가지며, 상기 각 활성점은 기질이 부착되어 마스킹되어 있는 것을 특징으로 하는, 효소 연료 전지용 전극. - 제1항에 있어서,
상기 다공성 탄소 재료는 카르복시기가 도입되도록 개질된 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극. - 제1항에 있어서,
상기 탄소 재료는 탄소 나노 튜브(CNT)인 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극. - 제1항에 있어서,
상기 제1 효소 또는 제2 효소, 또는 제1 및 제2 효소는 산화 효소인 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극. - 제4항에 있어서,
상기 산화 효소는 글루코스 산화 효소인 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극. - 제1항에 있어서,
상기 기질은 글루코스 또는 글루콘산인 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극. - 제1항에 있어서,
상기 전자 전달 매개체는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD)인 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극. - a) 전자 도체인 탄소 재료에 카르복시기가 도입되도록 상기 탄소 재료를 개질시키는 단계;
b) 상기 전자 도체에 제1 효소를 고정시켜 제1 효소층을 형성하는 단계; 및
c) 상기 제1 효소에 제2 효소를 결합시켜 제2 효소층을 형성하는 단계;
를 포함하며,
상기 b) 단계를 수행하기 전, 및 상기 c) 단계를 수행하기 전에 상기 제1 효소 및 제2 효소의 활성점에 기질을 부착시켜 활성점을 마스킹 하는 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극 제조 방법. - 제8항에 있어서,
상기 b) 단계는 개질된 전자 도체와 제1 효소의 결합을 매개하는 링커(lingker) 물질을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극을 제조하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 링커 물질은 EDC(N-ehtyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide) 및 NHS(N-hydroxy-succinidide)인 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극을 제조하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 a) 단계는 상기 다공성의 탄소 재료와 산용액의 혼합물을 초음파 처리하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극을 제조하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 탄소 재료는 탄소 나노 튜브인 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극을 제조하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 제1 효소 또는 제2 효소, 또는 제1 및 제2 효소는 산화 효소인 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극을 제조하는 방법. - 제13항에 있어서,
상기 산화 효소는 글루코스 산화 효소인 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극을 제조하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 기질은 글루코스 또는 글루콘산인 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극을 제조하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 제1 효소 또는 제2 효소, 또는 제1 효소 및 제2 효소는 각 효소의 활성점에 전자 전달 매개체가 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극을 제조하는 방법. - 제16항에 있어서,
상기 전자 전달 매개체는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(flavin adenine dinucleotide, FAD)을 특징으로 하는 것인, 효소 연료 전지용 전극을 제조하는 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 전극을 애노드으로 포함하는 효소 연료 전지용 전지.
- 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법을 통해 제조된 전극을 애노드으로 포함하는 효소 연료 전지용 전지.
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