ES2322880B1 - Electrodo biologico con la enzima hidrogenasa, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. - Google Patents
Electrodo biologico con la enzima hidrogenasa, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Electrodo biológico con la enzima hidrogenasa,
procedimiento de obtención y sus aplicaciones.
En la presente invención se protegen electrodos
biológicos modificados con enzimas hidrogenasas (ánodos) mediante
los cuales es posible obtener energía eléctrica del hidrógeno en
una configuración típica de pilas de combustible; asimismo, con
estos electrodos modificados con hidrogenasa (cátodos) es posible
producir hidrógeno a partir de agua en una configuración típica de
célula electroquímica. Igualmente se describe los procedimientos de
fabricación y sus aplicaciones.
Description
Electrodo biológico con la enzima hidrogenasa,
procedimiento de obtención y sus aplicaciones.
La presente invención se relaciona con
electrodos biológicos para pilas de combustible de hidrógeno como
alternativa a otros catalizadores de oxidación de hidrógeno tales
como platino y otros metales, y también para la generación de
hidrógeno en celdas electrolíticas. Por tanto, se relaciona con la
biotecnología, ingeniería genética y más concretamente con el uso
de enzimas como biocatalizadores y más en particular como
biocatalizadores redox y más en particular con la biotecnología de
la producción y utilización de hidrógeno.
Un debate de acuciante actualidad gira en torno
al tipo de combustible que se usará en el futuro para sostener la
actividad humana, que ha pasado de utilizar sucesivamente y de modo
mayoritario la madera, el carbón y luego el petróleo y el gas
natural, en un lapso de tiempo relativamente corto. En la
actualidad la tendencia es a diversificar las fuentes, con una
progresiva utilización del metano, y con la mente puesta en las
energías renovables, entre las que el hidrógeno obtenido a partir
del agua es considerado por algunos como una fuente
"inagotable" de energía, bien que al día de hoy el petróleo
sigue siendo la materia prima a partir de la que se obtiene el
hidrógeno que consumimos. Junto a la naturaleza del combustible a
emplear, se debate el modo más conveniente para su utilización; a
este respecto, interesa destacar que en cualquier escenario que se
considere, e independientemente del combustible utilizado, se hace
una apuesta clara por la implantación de las Pilas de Combustible
como uno de los medios más seguro, limpio y eficaz de convertir la
energía contenida en esos combustibles en electricidad (M.S.
Dreseselhaus and I.L. Thomas, Alternative energy
technologies. Nature, 414, 332-337 (2001)). En
este contexto cabe resaltar el hecho de que en los últimos años se
ha asistido a una intensa investigación en Biopilas de Combustible
llamadas así porque en los electrodos de la pila interviene
elementos biológicos, enzimas redox o células microbianas en ánodos
y en cátodos (G. Tayhas, R. Palmore, and G.M. Whitesides,
Microbial and Enzymatic Biofuel Cells in Enzymatic
conversion of biomass for fuel production, M.E. Himmel, J.O. Baker
and R.P. Overend, eds., American Chemical Society Symposium series,
nº 566, ACS, Washington, DC., 271-290, 1994). En
una reciente revisión, A. Heller da cuenta del estado de la
investigación en el campo de las biopilas de combustible
enzimáticas, en las que son mayoría las que utilizan como
combustible glucosa y oxígeno. Generalmente se basan en un diseño
en el que se conectan electrodos modificados con los enzimas
glucosa oxidasa y lacasa en los que, respectivamente, se oxida la
glucosa en el ánodo, con la concomitante reducción del oxígeno
hasta agua en el cátodo. Hay que tener en cuenta que en estas
biopilas de combustible se suelen utilizar mediadores redox (en
disolución o en forma de polímeros redox) para transportar
electrones entre los centros activos de los respectivos enzimas y
los electrodos (A. Heller, Miniature biofuel cells, Phys.
Chem. Chem. Phys., 6, 209-216, 2004).
La primera biopila de combustible que utiliza
hidrógeno y oxígeno descrita por S. Tsujimura (S. Tsujimura, M.
Fujita, H. Tatsumi, K. Kano, T. Ikeda,
Bioelectrocatalysis-based dihydrogen/dioxygen
fuel cell operating at physiological pH, Phys. Chem. Chem.
Phys., 3, 1331-1335, 2001) utiliza células
bacterianas de Desulfovibrio vulgaris como catalizador de
consumo de hidrógeno en el ánodo; además añade el compuesto metil
viológeno como mediador redox entre las bacterias y el
electrodo.
Más recientemente se ha publicado una patente
(United States Patent Application 20040214053, A1, October 28,
2004, Foreing Application data: Aug 24, 2001, GB, nº 0120698.6)
sobre una biopila de combustible biológica, que emplea hidrógeno
como combustible, en el que el ánodo está recubierto con la
hidrogenasa de tipo Ni-Fe purificada a partir de
extractos de la bacteria Allochromatium vinosum. Muy
importante, en relación con nuestra patente, es que en esta
invención el enzima se deposita por adsorción en presencia de
polímeros catiónicos sobre el electrodo de carbón lo que da lugar a
electrodos funcionales pero fueron poco estables. Previamente se
habían publicado artículos científicos en los que enzimas
hidrogenasa de distintos microorganismos se han depositado sobre
electrodos mediante diferentes tipos de uniones no covalentes:
(a) Por adsorción en carbón vítreo (glassy
carbon), con ó sin adiciones de sulfato de polimixina B (Butt, J.
N.; Filipiak, M.; Hagen, W. R. Direct Electrobiochemistry of
Megasphaera elsdenii iron hydrogenase: Definition of the
enzyme's catalytic operating potential and quantitation of the
catalytic behaviour over a continuous potential range. Eur. J.
Biochem. 245, 116-122, 1997). En este documento
se obtienen corrientes eléctricas en atmósfera de hidrógeno, pero
las corrientes no son persistentes lo que atribuyen bien a pérdida
de proteína o a una orientación no favorable de los centros redox
del enzima respecto a la superficie del electrodo;
(b) por adsorción en grafito pirolítico
"edge" con adición de sulfato de polimixina B, (Pershad, H.R.,
Duff, J.L.D., Heering, H. A., Duin, E. C., Albracht, S.P.J.,
Armstrong, F.A. Catalytic electron transport in Allochromatium
vinosum [Ni-Fe]-hydrogenase:
Application of voltametry in detecting redox-active
centres and establishing that hydrogen oxydation is very fast even
at potentials close to the reversible H^{+}/H_{2} value
Biochemistry, 38, 8992-8999, 1999). Estos
autores demuestran que la hidrogenasa de Ni-Fe que
estudian, que es muy similar a la utilizada en la presente
invención, es extremadamente activa, aun cuando no saben si tiene
más de una capa de enzima y no saben la orientación, a diferencia
de nosotros que por nuestro método se obtiene una sola monocapa y
con las moléculas en la orientación favorable para el intercambio
de corriente con el electrodo.
(c) Enzyme electrokinetics: Hydrogen evolution
and oxidation by Allochromatium vinosum
[Ni-Fe]-hydrogenase. Leger, C.;
Jones, A. K.; Roseboom, W.; Albracht, S. P. J.; Armstrong, F. A.
Biochemistry. 41, 15736-15746, 2002. En este
documento se usa el mismo electrodo que en el trabajo anterior,
grafito pirolítico "edge" por adorción.
(d) Direct and electrically wired
bioelectrocatalysis by hydrogen from Thiocapsa
roseopersicina. Morozov, S. V.; Karyakina, E. E.; Zorin, N. A.;
Varfolomeyev, S. D.; Cosnier, S.; Karyakin, A. A.
Bioelectrochemistry 55, 169-171, 2002. Aquí
se emplea carbón vítreo y filamentos de carbón, por adsorción
física.
(e) Inhibition and aerobic kinetics of
Desulfovibrio fructosovorans NiFe hydrogenase studied by
protein film voltammetry. Leger, C.; Dementin, S.; Bertrand, P.;
Rousset, M.; Guigliarelli, B. J. Am. Chem. Soc. 126,
12162-12172, 2004. Aquí se emplean grafito
pirolítico "edge" por adsorción física.
(f) Hydrogenases from the hyperthrmophilic
bacterium Aquilex aeolicus: electrocatalysis of the hydrogen
production/consumption reactions at carbon electrodes. Lojou, E.;
Giudici-Orticoni, M. T.; Bianco, P. J.
Electroanal. Chem., 577, 79-86, 2005. Se realiza
sobre grafito y con enzimas hipertermofílicas, no estudian la
estabilidad, pero no hay unión covalente.
(g) Design and characterization of redox enzyme
electrodes: new perspectives on established techniques with
application to an extremophile hydrogenase. Johnston, W.; Cooney,
M. J.; Liaw, B. Y.; Sapra, R.; Adams, M. W. W. Enzyme Microb.
Technol., 36, 540-549, 2005. Estos autores
depositan un enzima hipertermofílico sobre papel de carbón
pirolítico poroso y sobre grafito empaquetado en columna, también
por adsorción directa. En todos los casos en que han estudiado la
estabilidad de los electrodos las respuestas electrocatalíticas no
fueron persistentes y los autores han atribuido esta disminución de
la actividad catalítica de los electrodos a la pérdida de enzima
hidrogenasa de la superficie del electrodo donde se mantenía a
través de interacciones débiles, principalmente de tipo
electrostático, o a desplazamiento de la hidrogenasa adsorbida por
otras especies de la disolución.
En resumen, en otros trabajos no existen
estudios de estabilidad de la enzima y en ninguno de los trabajos
publicados, hay inmovilización de enzima hidrogenasa por unión
covalente tal como se describe en esta patente por primera vez.
\vskip1.000000\baselineskip
Un objeto de la presente invención lo constituye
un electrodo biológico, en adelante electrodo biológico de la
presente invención, basado en la utilización de una enzima tipo
hidrogenasa, de Ni-Fe o de tipo "sólo Fe", como
catalizador de oxidación de hidrógeno, unida covalente a un
electrodo de un material conductor de electricidad a través de,
respectivamente, residuos carboxílicos ó residuos amino expuestos en
su superficie ó introducidos mediante procedimientos químicos
adecuados en la superficie de dichos electrodos.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el electrodo biológico de la presente invención
utilizado como catalizador electroquímico de producción de
hidrógeno.
Otro objeto particular de la invención lo
constituye el electrodo biológico de la invención en el que la
enzima hidrogenasa contiene motivos de afinidad localizados en
lugares específicos de su superficie que permiten su inmovilización
orientada sobre el electrodo conductor. Por ejemplo, determinados
complejos metálicos poseen afinidad por agrupamientos de histidinas
que pueden introducirse mediante técnicas de ingeniería genética en
la hidrogenasa.
Así, un objeto particular de la presente
invención lo constituye el electrodo biológico de la invención en
el que el material de electrodo conductor utilizado es un material
metálico, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la
invención, perteneciente al siguiente grupo: oro, cobre, plata o
platino.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el electrodo biológico de la invención en el que el
material de electrodo utilizado es un material carbonáceo, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención,
perteneciente al siguiente grupo: carbón vítreo, carbón pirolítico
"basal", carbón pirolítico borde ("edge"), hilo de carbón
y tela de carbón.
Una realización particular de la presente
invención lo constituye el electrodo biológico de la invención en
el que la enzima tipo hidrogenasa es aislada de la bacteria
Desulfovibrio gigas E.C.1.18.89.1 (la secuencia de aa del
enzima utilizada tiene el código PDB 1H2A de referencia en la base
de datos Protein Data Bank)y el electrodo es oro (ver
ejemplo 1).
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye el electrodo biológico de la invención en
el que la enzima tipo hidrogenasa es aislada de la bacteria
Desulfovibrio gigas E.C.1.18.89.1 (la secuencia de aa del
enzima utilizada tiene el código PDB 1H2A de referencia en la base
de datos Protein Data Bank) y el electrodo es de carbón pirolítico
"edge" (ver ejemplo 2).
Otra realización particular de la invención
contempla el electrodo biológico de la invención está constituido
por un electrodo de material carbonáceo modificado con grupos
carboxilos que se modifica además con
N,N-bis(carboxymetil)-L-lisina
que forman complejos del tipo nitrilotriacético con iones Ni, Cu ó
Co (estos complejos metálicos poseen afinidad por agrupamientos de
histidinas) y una enzima hidrogenas modificada o mutada que
comprende un motivo de histidinas en lugares adecuados de la
superficie de la enzima, permitiendo así una correcta
inmovilización de las moléculas de hidrogenasa con respecto al
electrodo.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento de obtención del electrodo biológico de
la invención con el electrodo conductor de material de carbón, en
adelante procedimiento de obtención de un electrodo de carbón de la
invención, basado en las siguientes etapas:
a) modificación del electrodo de carbón por
electroreducción de un arilderivado de sales de diazonio en medio
aprótico o en medio acuoso ácido, que genera grupos amino
primarios,
b) unión covalente de las moléculas de
hidrogenasa en tampón fosfato entre 0.01 y 1.0 M, pH entre 5.0 y
9.0, a través de sus grupos carboxilos activados con
N-hidroxisuccinimida en presencia de
etilcarbodiimida soluble durante un periodo adecuado, y
c) lavado posterior del electrodo con tampón
fosfato.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el procedimiento de obtención de un electrodo de
carbón de la invención donde el arilderivado de sales de diazonio
del punto a) pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el
alcance de la invención al siguiente grupo: sal de
nitrobenzildiazonio y el
2,5-dimetoxy-4-([4-nitrofenil]azo)bencenodiazonio.
Una realización particular de la invención lo
constituye el procedimiento de obtención de la invención en el que
el paso de unión covalente de b) se realiza en tampón fosfato 0.01
M, pH 6.0 en presencia de N-hidroxisuccinimida 1 mM
y etilcarbodiimida 2 mM, durante 90 minutos de incubación.
Otra realización particular de la invención lo
constituye un procedimiento de obtención del electrodo de carbón
donde el electrodo es un electrodo de carbón pirolítico "edge"
modificado previamente con el reactivo tetrafluoborato
4-nitrobenceno diazonio (según el método descrito
por P. Allonge y colaboradores en Journal of the American Chemical
Society, 119, 201-207, 1997) que se pone en
contacto con una disolución 27 \muM de hidrogenasa purificada de
Desulfovibrio gigas en tampón fosfato 0.01 M, pH 6.0 en
presencia de N-hidroxisuccinimida 1 mM y
etilcarbodiimida 2 mM, durante 90 minutos de incubación en esta
disolución y lavado posterior del electrodo con tampón fosfato.
Este electrodo biológico se activa a temperatura ambiente en
atmósfera de hidrógeno durante 5 horas.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un segundo procedimiento de obtención del electrodo de
carbón de la invención basado en la modificación de superficies de
materiales de carbono mediante irradiación con plasma para generar
carboxilos que convenientemente modificados con diaminas, por
ejemplo en presencia de carbodiiimida, y eventualmente
N-hydroxisuccinimida dan lugar a recubrimientos con
aminas primarias.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento de obtención del electrodo biológico de
la invención con el electrodo conductor metálico, en adelante
procedimiento de obtención de un electrodo metálico de la
invención, mediante la modificación del metal, oro por ejemplo,
consistente en un recubrimiento con una monocapa de moléculas
alquiltioles bifuncionales que llevan en uno de sus extremos grupos
tioles con tendencia a la quimisorción y en el otro extremo grupos
funcionales que reaccionan con grupos funcionales expuestos en la
enzima hidrogenasa para su inmovilización orientada.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso del electrodo biológico de la invención, en
adelante uso de la invención, en la fabricación de un ánodo de una
pila de combustible o de un cátodo de una celda electroquímicas.
De forma análoga forman parte de la presente invención una pila de
combustible o una celda electrolítica que comprenda el electrodo
biológico de la invención.
La presente invención se enfrenta al problema de
proporcionar nuevos electrodos biológicos para pilas de
combustible que sean estables en condiciones de operación.
En la presente invención se describe por primera
vez la obtención de un electrodo biológico estable y eficaz
mediante la unión covalente de residuos carboxílicos superficiales
de la enzima hidrogenasa expuestos de la superficie del enzima con
aminas primarias introducidas mediante procedimientos químicos
adecuados en la superficie de un electrodo de material metálico o
carbonoso que sirve de anclaje de las enzimas. Un resultado
sobresaliente de la investigación llevada a cabo, objeto de la
presente invención, ha sido el desarrollo de un procedimiento
eficaz para la inmovilización orientada de moléculas del enzima
hidrogenasa de Desulfovibrio gigas sobre la superficie de un
electrodo, por ejemplo, de carbón pirolítico que ha sido modificado
con compuestos químicos reactivos tales que unen covalentemente las
moléculas del enzima, con una orientación tal, que se generan
corrientes eléctricas cuando hay hidrógeno en la atmósfera. En
ausencia de enzima, o con el electrodo sin modificar, dichas
corrientes no se observan. Además, estos electrodos biológicos
también catalizan la producción de hidrógeno, cuando se les aplica
un potencial catódico adecuado (Ejemplo 2).
Además, el procedimiento de inmovilización (o
anclaje) de las moléculas de hidrogenasa, descrito en la presente
invención, permite obtener un electrodo biológico en el que las
moléculas del enzima están óptimamente orientadas sobre la
superficie del electrodo de manera que pueden catalizar la oxidación
de la molécula de hidrógeno, o la reducción de protones, sin
necesidad de la incorporación al sistema de mediadores redox, bien
solubles o inmovilizados, ya sean monoméricos ó poliméricos. Con
este procedimiento las moléculas de hidrogenasa se unen
orientadamente a la superficie del electrodo, en función del pH y de
la fuerza iónica del medio de la reacción de acoplamiento (Ejemplo
2).
La enzima utilizada presenta motivos de unión
con afinidad específicamente por otros motivos generados en la
superficie de los electrodos, con la finalidad de que tras la
interacción entre ambos motivos, bien sea unión covalente,
electrostática, de van der Waals, adopte una orientación
preferencial con respecto a la superficie del electrodo que facilite
la transferencia de electrones entre ambas entidades, electrodo y
enzima; esta orientación preferencial se consolida mediante
entrecruzamiento químico a través de los respectivos grupos químicos
funcionales enzima-electrodo de manera que el enzima
queda firmemente anclada a la superficie del electrodo en una
orientación preferencial de sus centros redox que facilita
transferencia directa de electrones entre el electrodo soporte y el
enzima.
Estos biocatalizadores permiten la generación de
corriente eléctrica a partir de hidrógeno y la generación
electrolítica de hidrógeno a partir de agua empleando hidrogenasas
como catalizador electroquímico también como alternativa al empleo
de catalizadores no biológicos. La utilización de estos
catalizadores biológicos, capaces de activar la molécula de
hidrógeno, en pilas de combustible de hidrógeno podría competir con
otros catalizadores comúnmente empleados para oxidar hidrógeno en
el ánodo de un pila de combustible, o generar hidrógeno en el
cátodo de una celda electroquímica debido al elevado precio de
estos metales nobles y/ó a su condición de materiales poco
abundantes, mientras que las hidrogenasas son inagotables ya que se
produce en organismos vivos perpetuables por reproducción
biológica. Estos aspectos son importantes porque se espera que el
precio de los metales que se utilizan en la actualidad para dichos
fines, aumente considerablemente a medida que se extienda la
utilización del hidrógeno como combustible limpio. Por el
contrario, la producción de hidrogenasas, tanto las comúnmente
conocidas como de "Fe-Ni" o las conocidas como
de "sólo-Fe", es un proceso susceptible de
mejoras biotecnológicas con el consiguiente abaratamiento de los
precios de las enzimas producidas mediante cultivos microbianos o
de algas.
Por lo tanto, un objeto de la presente invención
lo constituye un electrodo biológico, en adelante electrodo
biológico de la presente invención, basado en la utilización de una
enzima tipo hidrogenasa, de Ni-Fe o de tipo "sólo
Fe", como catalizador de oxidación de hidrógeno, unida covalente
a un electrodo de un material conductor de electricidad a través
de, respectivamente, residuos carboxílicos ó residuos amino
expuestos en su superficie ó introducidos mediante procedimientos
químicos adecuados en la superficie de dichos electrodos.
El término "enzima tipo hidrogenasa" tal
como se utiliza en la presente invención se refiere a una
hidrogenasa del tipo Ni-Fe o del tipo
sólo-Fe aisladas de microorganismos - especialmente
bacterias, hongos y algas-activadores de hidrógeno,
así conocidas por la naturaleza de su centro activo,
respectivamente, un agrupamiento de un ión Fe con otro ión Ni o
sólo iones de Fe, además de otros elementos no metálicos como
azufre, carbono, nitrógeno y oxígeno ("Hydrogen as a fuel:
learning from nature". R. Cammack, M. Fery and R. Robson
editors. Taylor and Francis, London and New York, 2001,
"Hydrogenases", Coordination Chemistry Reviews, 249, números
15 y 16, 2005). Además, este término incluye aquellas enzimas o
péptidos tipo hidrogenasa obtenidos mediante ingenieria
recombinante.
Más concretamente, las enzimas tipo hidrogenasa,
tanto las comúnmente conocidas tipo "Fe-Ni",
como tipo "sólo-Fe", que se pueden utilizar en
la presente invención pueden ser aisladas de bacterias activadoras
de hidrógeno pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite
el alcance de la invención, al siguiente grupo:
- -
- especies reductoras de azufre, entre las que se incluyen, aunque no exclusivamente, las del género Desulfovibrio,
- -
- especies fijadoras de nitrógeno, entre las que se incluyen, aunque no exclusivamente, las del género Rhizobium, Bradyrhizobium, Azotobacter, Gloeocapsa,
- -
- metanogénicas, entre las que se incluyen, aunque no exclusivamente, las de los géneros Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina o Methanopyrus,
- -
- fermentativas, entre las que se incluyen, aunque no exclusivamente, las de los géneros Bacillus, Clostridium, o Escherichia,
- -
- quimiolitoautrofas, entre las que se incluyen, aunque no exclusivamente, las de los géneros Alcaligenes, Ralstonia, y el género Aquifex hipertermofilico,
- -
- fotosintéticas entre las que se incluyen, aunque no exclusivamente, las de los géneros Pyrococcus, Thermococcus ó
- -
- Thermotoga.
Otras enzimas tipo hidrogenasa que se pueden
utilizar en la presente invención pueden ser aisladas de algas,
tanto procariotas como eucariotas, que metabolizan hidrógeno,
pertenecientes, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de
la invención, a las siguientes especies: Scenedesmus obliquus,
Anabaena cilíndrica y Anabaena variabilis, Anacystis
nidulas, Synechocystis sp PCC 6803, Nostoc PCC73102 y
Synechococcus PCC6301.
Más ampliamente, en el alcance de la presente
invención se contempla el uso de hidrogenasas obtenidas a partir de
organismos pertenecientes a los siguientes grupos taxonómicos:
Crenarchaeota y Euryarchaeota dentro del dominio
Archea; Aquificales, Cyanobacteria, Firmicutes,
Proteobacteria y Thermotogales dentro del dominio
Bacteria; Ciliophora, Parabasalidea, Chlorophyta y
Fungi dentro del dominio Eukarya.
Por otro lado, pueden utilizarse una enzima con
actividad de hidrogenasa modificada de tal forma que presenta
motivos de afinidad localizados en lugares específicos de su
superficie que permitan su inmovilización orientada sobre el
electrodo conductor convenientemente modificado con motivos
complementarios de afinidad y así facilitar la comunicación
eléctrica del enzima y el electrodo.
Por lo tanto, un objeto particular de la
invención lo constituye el electrodo biológico de la invención en
el que la enzima hidrogenasa contiene motivos de afinidad
localizados en lugares específicos de su superficie que permiten su
inmovilización orientada sobre el electrodo conductor. Por ejemplo,
determinados complejos metálicos poseen afinidad por agrupamientos
de histidinas que pueden introducirse mediante técnicas de
ingeniería genética en la hidrogenasa.
Además, estas hidrogenasas pueden ser producidas
en especies microbianas nativas o bien a partir de especies
modificadas por técnicas de ingeniería genética ó eventualmente
producidas en sistemas complejos in vitro a partir de
secuencias génicas conocidas en el estado del arte o por
identificar en el futuro por un técnico experto en el sector de la
técnica.
El uso de enzimas con actividad hidrogenasa ya
conocidos, o de nuevas hidrogenasas, para el desarrollo del
electrodo biológico de la presente invención puede ser llevado a
cabo por un técnico experto en la materia con la información
descrita en la presente invención.
El término "material conductor" tal como se
utiliza en la presente invención se refiere a materiales
conductores de electricidad que pertenecen, a título ilustrativo y
sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo:
material metálico (oro, cobre, plata o platino) o material
carbonáceo (carbón vítreo, carbón pirolítico "basal", carbón
pirolítico borde ("edge"), hilo de carbón, tela de carbón
entre otros tipos de carbón conductor), y sobre cuya superficie
pueden introducirse aminas primarias mediante distintas técnicas
que permiten el anclaje con las enzimas.
Así, otro objeto particular de la presente
invención lo constituye el electrodo biológico de la invención en
el que el material de electrodo conductor utilizado es un material
metálico, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la
invención, perteneciente al siguiente grupo: oro, cobre, plata o
platino.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el electrodo biológico de la invención en el que el
material de electrodo utilizado es un material carbonáceo, a título
ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención,
perteneciente al siguiente grupo: carbón vítreo, carbón pirolítico
"basal", carbón pirolítico borde ("edge"), hilo de carbón
y tela de carbón.
Una realización particular de la presente
invención lo constituye el electrodo biológico de la invención en
el que la enzima tipo hidrogenasa es aislada de la bacteria
Desulfovibrio gigas E.C.1.18.89.1 (la secuencia de
aminoácidos del enzima utilizada tiene el código PDB 1H2A de
referencia en la base de datos Protein Data Bank) y el electrodo es
oro (ver ejemplo 1).
Otra realización particular de la presente
invención lo constituye el electrodo biológico de la invención en
el que la enzima tipo hidrogenasa es aislada de la bacteria
Desulfovibrio gigas E.C.1.18.89.1 (la secuencia de
aminoácidos del enzima utilizada tiene el código PDB 1H2A de
referencia en la base de datos Protein Data Bank) y el electrodo es
de carbón pirolítico "edge" (ver ejemplo 2).
Otra realización particular de la invención lo
representa el electrodo biológico de la invención constituido por
un electrodo de material carbonáceo modificado con grupos
carboxilos que se modifica además con
N,N-bis(carboxymetil)-L-lisina
que forman complejos del tipo nitrilotriacético con iones Ni, Cu ó
Co (estos complejos metálicos poseen afinidad por agrupamientos de
histidinas) y una enzima hidrogenasa modificada o mutada que
comprende un motivo de histidinas en lugares adecuados de la
superficie de la enzima, permitiendo así una correcta inmovilización
de las moléculas de hidrogenasa con respecto al electrodo. Como
ejemplo de esta metodología para llevar a cabo este electrodo
biológico se cita una realización práctica que se ha llevado a cabo
con el enzima ferredoxin-NADP^{+} reductasa -
como modelo de enzima - sobre electrodos de oro funcionalizados con
complejos metálicos de Cu o Ni con cadenas de nitrilotriacético y
pares de histidina introducidas mediante técnicas de ingeniería
genética en regiones de la superficie del enzima, seleccionadas
para dar lugar, tras su inmovilización en la superficie del
electrodo a las orientaciones deseadas y en una orientación óptima
tiene actividad catalítica en ausencia de mediadores externos redox
(J. Madoz, J.M. Abad, J. Fernandez-Recio, M. Velez,
L. Vazquez, C. Gomez-Moreno, V.M. Fernández.
Modulation of electroenzymatic NADPH oxidation through oriented
immobilization of ferredoxin:NADP reductase onto modified gold
electrodes. Journal of the American Chemical Society (2000) 122:
9808-9817).
Por otra parte, el electrodo biológico de la
invención puede fabricarse, obtenerse o elaborarse de distintas
formas en función del material del electrodo conductor sea metálico
o carbón. Así, otro objeto de la presente invención lo constituye
un procedimiento de obtención del electrodo biológico de la
invención con el electrodo conductor de material de carbón, en
adelante procedimiento de obtención de un electrodo de carbón de la
invención, basado en las siguientes etapas:
a) modificación del electrodo de carbón por
electroreducción de un arilderivado de sales de diazonio en medio
aprótico o en medio acuoso ácido, que genera grupos amino
primarios,
b) unión covalente de las moléculas de
hidrogenasa en tampón fosfato entre 0.01 y 1.0 M, pH entre 5.0 y
9.0, a través de sus grupos carboxilos activados con
N-hidroxisuccinimida en presencia de
etilcarbodiimida soluble durante un periodo adecuado, y
c) lavado posterior del electrodo con tampón
fosfato.
Posteriormente, este electrodo biológico así
obtenido se activa a temperatura ambiente en atmósfera de hidrógeno
antes de su uso.
La funcionalización de electrodos de carbón con
una monocapa de grupos amino, o de grupos carboxilos se puede
llevar a cabo por métodos descrito por Saveant y colaboradores
mediante la reducción electroquímica de sales de aril diazonio
adecuadas (Delamar,M., Hitmi, R., Pinson, J., Saveant, J.M., J. Am.
Chem. Soc. 119, 201-207, 1992; Allongue, P.;
Delamar, M.; Desbat, B.; Fagebaume, O.; Hitmi, R.; Pinson, J.;
Saveant, J. M. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119,
201-207).
Asimismo, la funcionalización de la superficie
de electrodos de carbón con grupos carboxilos, puede llevarse a
cabo por otros métodos químicos. A título de ejemplo, mediante
tratamiento de superficies de carbón con plasma de oxígeno (J.I.
Paredes, A. Martínez-Alonso and J.M.D. Tascón, J.
Colloid Interf. Science 258, 276-282, 2003) ó
mediante oxidación directa con ácido nítrico ó peróxido de
hidrógeno (Detection of specific electronic interactions at the
interface aromatic hydrocarbon-graphite by immersion
calorimetry. B. Bachiller-Baeza, A.
Guerrero-Ruiz and I.
Rodríguez-Ramos. Studies on Surface Science and
Catalysis, en prensa) ó por tratamiento combinado químico y
electroquímico consistente en la oxidación electroquímica en
presencia de dicromato potásico (J. Bianco, J. Haladjian and C.
Bourdillon. J. Electroanalytical Chemistry, 293,
151-163 (1990).
Además, partiendo de estos electrodos
funcionalizados con grupos carboxilos es posible una modificación
química con diaminas (por ejemplo etilenediamina) para generar
grupos aminos libres terminales en unión covalente con la
superficie de carbón del electrodo.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye el procedimiento de obtención de un electrodo de
carbón de la invención donde el arilderivado de sales de diazonio
del punto a) pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el
alcance de la invención al siguiente grupo: sal de
nitrobenzildiazonio y el
2,5-dimetoxy-4-([4-nitrofenil]azo)bencenodiazonio.
En esta invención es clave el valor del pH (en
un rango entre 5.0 y 9.0) y de la fuerza iónica (correspondiente a
un rango de molaridad de tampón fosfato entre 0.01 y 1.0 M)
existentes durante la inmovilización covalente del enzima, para
orientarla adecuadamente y permitir la transferencia directa de
electrones al electrodo, habiéndose establecido unas condiciones
preferentes (ver ejemplo 2). Así, una realización particular de la
invención lo constituye el procedimiento de obtención de la
invención en el que el paso de unión covalente de b) se realiza en
tampón fosfato 0.01 M, pH 6.0 en presencia de
N-hidroxisuccinimida 1 mM y etilcarbodiimida 2 mM,
durante 90 minutos de incubación.
Otra realización particular de la invención lo
constituye un procedimiento de obtención del electrodo de carbón
donde el electrodo es un electrodo de carbón pirolítico "edge"
modificado previamente con el reactivo tetrafluoborato
4-nitrobenceno diazonio (según el método descrito
por P. Allonge y colaboradores en Journal of the American Chemical
Society, 119, 201-207, 1997) que se pone en
contacto con una disolución 27 \muM de hidrogenasa purificada de
Desulfovibrio gigas en tampón fosfato 0.01 M, pH 6.0 en
presencia de N-hidroxisuccinimida 1 mM y
etilcarbodiimida 2 mM, durante 90 minutos de incubación en esta
disolución y lavado posterior del electrodo con tampón fosfato. Este
electrodo biológico se activa a temperatura ambiente en atmósfera
de hidrógeno durante 5 horas.
Otro objeto particular de la presente invención
lo constituye un segundo procedimiento de obtención del electrodo
de carbón de la invención basado en la modificación de superficies
de materiales de carbono mediante irradiación con plasma para
generar carboxilos que convenientemente modificados con diaminas,
por ejemplo en presencia de carbodiiimida, y eventualmente
N-hydroxisuccinimida dan lugar a recubrimientos con
aminas primarias.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento de obtención del electrodo biológico de
la invención con el electrodo conductor metálico, en adelante
procedimiento de obtención de un electrodo metálico de la
invención, mediante la modificación del metal, oro, cobre, plata,
platino por ejemplo, consistente en un recubrimiento con una
monocapa de moléculas alquiltioles bifuncionales que llevan en uno
de sus extremos grupos tioles con tendencia a la quimisoción y en
el otro extremo grupos funcionales que reaccionan con grupos
funcionales expuestos en la enzima hidrogenasa para su
inmovilización orientada (J. Madoz, B. Kuznetsov, J.L. Garcia, J.
Medrano and V.M. Fernandez. Functionalization of gold surfaces for
specific and oriented attachment of a fused
b-Galactosidase and choline- receptor protein;
Journal of the American Chemical Society (1997) 119: 1043- 1051; J.
Madoz, J.M. Abad, J. Fernández-Recio, M. Velez, L.
Vazquez, C. Gómez-Moreno & V.M. Fernández.
Modulation of electroenzymatic NADPH oxidation through oriented
immobilization of Ferredoxin:NADP* reductase onto modified gold
electrodes. Journal of the American Chemical Society (2000) 122:
9808- 9817; ver ejemplo 1)).
Los electrodos biológicos de la invención
utilizados como ánodos permiten obtener energía eléctrica del
hidrógeno en una configuración típica de pilas de combustible;
asimismo, con estos electrodos biológicos como cátodos es posible
producir hidrógeno a partir de agua en una configuración típica de
célula electroquímica.
Así, otro objeto de la presente invención lo
constituye el uso del electrodo biológico de la invención, en
adelante uso de la invención, en la fabricación de un ánodo de una
pila de combustible o de un cátodo de una celda electroquímicas. De
forma análoga forman parte de la presente invención una pila de
combustible o una celda electrolítica que comprenda el electrodo
biológico de la invención.
Figura 1. Voltamograma cíclico obtenido con
un electrodo metálico de oro. Este electrodo que presenta una
superficie electroquímica de 0.18 cm^{2}. La curva inferior
corresponde a una medida llevada a cabo bajo nitrógeno (curva
continua) y la superior corresponde al mismo electrodo tras 5 horas
de incubación en atmósfera de hidrógeno (línea rayada).
Figura 2.- Voltamograma cíclico de un
electrodo de carbón pirolítico unido a una enzima hidrogenasa.
El trazo continuo corresponde a un electrodo control mantenido 30
minutos horas bajo nitrógeno antes del experimento electroquímico y
el trazo discontinuo corresponde a un electrodo similar tras haber
activado el enzima hidrogenasa durante cinco horas bajo
hidrógeno.
Ejemplo
1
Una realización particular de la presente
invención lo constituye el electrodo biológico de la invención en
el que la enzima tipo hidrogenasa es aislada de la bacteria
Desulfovibrio gigas, E.C.1.18.89.1 (Secuencia de aa del
enzima utilizada o referencia de la base de datos en el Protein
Data Bank tiene el código PDB 1H2A) y el electrodo es oro
policristalino en forma de hilo, pulido y lavado como se describe
en Fernández V.M. y colaboradores, (Journal of the American
Chemical Society, 119, 1043-1051, 1997) que
se sonica durante 15 minutos en etanol. A continuación se incuba
en 1 mM cistamina en etanol:agua 2:1 durante 20 horas; tras lavado
con tampón Hepes 10 mM pH 7.6, se sumerge en una disolución 0.8
micromolar de hidrogenasa de D. gigas conteniendo
N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-etilcarbodiimida
hidroclorhidrato y N-hydroxy succinimida 10 mM en
tampón Hepes, pH 7.6 durante 90 min a 25ºC.
A continuación se coloca en una celda
electroquímica típica de tres electrodos, el de referencia es uno
de Ag/ClAg, el contraelectrodo es uno de platino y el de trabajo
es el electrodo de oro modificado con la hidrogenasa. Se llevaron a
cabo voltamogramas cíclicos con un potenciostato Autolab 30 bajo
atmósfera controlada a 25ºC.
La Figura 1 muestra voltamogramas cíclicos
obtenidos con este electrodo que presenta una superficie
electroquímica de 0.18 cm^{2}. Las medidas fueron hechas en
tampón fosfato 100 mM, pH 8.0 a una velocidad de barrido de 20 mV/s
a temperatura de 25ºC. La curva inferior corresponde a una medida
llevada a cabo bajo nitrógeno (curva continua) y la superior
corresponde al mismo electrodo tras 5 horas de incubación en
atmósfera de hidrógeno (línea rayada).
Estos electrodos biológicos de oro han sido
funcionales tanto para la producción de hidrógeno (a partir de
protones y electrones suministrados por el electrodo) como para la
oxidación de hidrógeno presente en la disolución con la producción
concomitante de una corriente eléctrica, aunque la estabilidad
obtenida en esta realización concreta es menor que la observada en
el ejemplo siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se ha investigado en la preparación de
electrodos funcionales de hidrogenasas utilizando como electrodos
materiales carbonáceos, tales como carbón vítreo ó carbón
pirolítico. Estos electrodos convenientemente modificados mediante
tratamientos químicos, han permitido la unión covalente y duradera
de las moléculas de hidrogenasa aisladas de la bacteria
Desulfovibrio gigas purificada según el método de E.C.
Hatchikian y cols. (Characterization of the periplasmic hydrogenase
from Desulfovibrio gigas. E.C. Hatchikian, M. Brushi and J.
leGall, Biochemical and Biphysical Research Communications
82, 451-461(1978)).
En este ejemplo se crea una capa superficial de
aminas primarias en electrodos de carbón pirolítico obtenidos de
Pine Instruments, Inc. (USA) mediante reducción electroquímica de
sales de diazonio; en el ejemplo descrito, se hace reaccionar un
electrodo de carbón pirolítico "edge" (modificado previamente
con el reactivo tetrafluoborato 4-nitrobenceno
diazonio según el método descrito por P. Allonge y colaboradores en
Journal of the American Chemical Society, 119,
201-207, 1997), con una disolución 27 \muM de
hidrogenasa purificada de Desulfovibrio gigas en tampón
fosfato 0.01 M, pH 6.0 en presencia de
N-hidroxisuccinimida 1 mM y etilcarbodiimida 2 mM.
Tras 90 minutos de incubación en esta disolución el electrodo se
lava con tampón fosfato y a continuación se coloca en una celda
electroquímica típica de tres electrodos, uno de Ag/ClAg como
referencia, otro de platino como contra electrodo, y el electrodo
de carbón pirolítico modificado con la hidrogenasa como electrodo
de trabajo. Se llevaron a cabo voltamogramas cíclicos con un
potenciostato Autolab 30 bajo atmósfera controlada a 25ºC.
La Figura 2 presenta voltamogramas cíclicos de
oxidación catalítica de hidrógeno con los electrodos de grafito
pirolítico modificados covalentemente con hidrogenasas según el
procedimiento más arriba detallado. Las medidas se llevaron a cabo
a 25ºC, en tampón fosfato 100 mM, pH 8.0 a una velocidad de barrido
de 20 mV/s. El trazo continuo corresponde a un electrodo control
mantenido 30 minutos horas bajo atmósfera de nitrógeno antes del
experimento electroquímico. La línea punteada corresponde a un
voltamograma cíclico obtenido con el electrodo de hidrogenasa tras
haber activado el enzima hidrogenasa durante cinco horas bajo
hidrógeno; el voltamograma cíclico correspondiente al enzima
activado (trazo punteado), muestra claramente la actividad
catalítica de este electrodo, que es persistente incluso tras una
semana de trabajo en condiciones operativas (Figura 2).
Es importante destacar que en ninguno de estos
experimentos se ha añadido mediador redox. Los resultados son
concluyentes de la existencia de importantes corrientes de
oxidación de hidrógeno catalizada por el enzima hidrogenasa en una
orientación óptima para comunicarse electrónicamente con la
superficie del electrodo. Bajo las mismas condiciones, electrodos
en los que el enzima no se unió mediante enlace covalente no dieron
lugar a corriente detectable alguna, ni siquiera en presencia de
mediadores redox. Electrodos preparados similarmente a valores de
fuerza fónica alta no dieron lugar a corrientes medibles.
Se compararon las corrientes medidas en
presencia y en ausencia de mediadores con electrodos preparados
similarmente al del ejemplo pero a diferentes fuerzas fónicas. Los
resultados que se presentan a continuación indican que la actividad
aumenta cuando la fuerza fónica disminuye.
^{a)} La corriente catalítica se
midió a 0 V a partir de voltamogramas cíclicos similares a los de
la Figura 2 tras sustraer las corrientes medidas bajo nitrógeno,
antes de activar el electrodo con hidrógeno durante 5
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
Con estos electrodos se ha medido en continuo la
corriente generada en atmósfera de H2 a temperatura ambiente en el
laboratorio con un potencial aplicado a -0.4 V frente a un
electrodo de referencia de Ag/ClAg, obteniéndose más de un 90% de
estabilidad tras dos semanas de operación ininterrumpida.
En esta invención es importante el valor del pH
(en un rango entre 5.0 y 9.0) y de la fuerza iónica
(correspondiente a un rango de molaridad de tampón fosfato entre
0.01 y 1.0 M) existentes durante la inmovilización covalente del
enzima, para orientarla adecuadamente y permitir la transferencia
directa de electrones al electrodo lo que proporciona una gran
estabilidad del electrocatalizador en las condiciones de operación.
La estabilidad se ha medido en continuo, a potencial fijo bajo
corriente de hidrógeno a temperatura de 25º observándose que, tras
más de dos semanas en continuo, una actividad incluso superior a la
inicial, probablemente debido a una mayor activación de moléculas de
enzima (datos no mostrados).
El fundamento racional del método de
inmovilización de la hidrogenasa de Fe-Ni del que
la enzima de Desulfovibrio gigas puede considerase como
estructura tipo de estas hidrogenasas, objeto de la presente
invención, es la existencia de un fuerte momento dipolar en la
molécula de dicho enzima como consecuencia de una distribución
asimétrica de residuos de aminoácidos cargados en la superficie del
enzima. En particular el cluster redox distal de la proteína (un
agrupamiento [4Fe-4S] a través del cual el enzima
transfiere los electrones obtenidos de la oxidación de la molécula
de hidrógeno) está rodeado por una corona de residuos glutámicos.
Este dipolo permanente en la molécula de hidrogenasa resulta ser
esencial para una correcta transferencia de los electrones a la
molécula de citocromo c_{3} el aceptor fisiológico de este tipo
de hidrogenasas, que presenta un agrupamiento de lisinas que, con
sus cargas positivas, complementan las cargas de los glutámicos,
facilitando una correcta orientación de ambas proteínas y una
transferencia óptima de electrones entre las mismas.
Claims (22)
1. Electrodo biológico caracterizado
porque contiene una enzima tipo hidrogenasa, de
Ni-Fe o de tipo "sólo Fe", como catalizador de
oxidación de hidrógeno, unida covalente a un electrodo de un
material conductor de electricidad a través de, respectivamente,
residuos carboxílicos ó residuos amino expuestos en su superficie ó
introducidos en la superficie de dicho electrodo.
2. Electrodo biológico según la reivindicación 1
caracterizado porque la enzima tipo hidrogenasa es una
hidrogenasa aislada de microorganismos activadores de hidrógeno u
obtenida mediante ingeniería genética recombinante.
3. Electrodo biológico según la reivindicación 2
caracterizado porque la enzima tipo hidrogenasa es aislada
de bacterias activadoras de hidrógeno pertenecientes al siguiente
grupo:
- -
- especies reductoras de azufre, entre las que se incluyen, aunque no exclusivamente, las del género Desulfovibrio,
- -
- especies fijadoras de nitrógeno, entre las que se incluyen, aunque no exclusivamente, las del género Rhizobium, Gloeocapsa,
- -
- metanogénicas, entre las que se incluyen, aunque no exclusivamente, las de los géneros Methanobacterium, Methanococcus, Methanosarcina o Methanopyrus,
- -
- fermentativas, entre las que se incluyen, aunque no exclusivamente, las de los géneros Bacillus, Clostridium, o Escherichia,
- -
- quimiolitoautrofas, entre las que se incluyen, aunque no exclusivamente, las de los géneros Alcaligenes, Ralstonia, y el género Aquifex hipertermofílico,
- -
- fotosintéticas entre las que se incluyen, aunque no exclusivamente, las de los géneros Chromatium ó Rhodobacter ó Thiocapsa) hipertermofílicas (entre las que se incluye, aunque no exclusivamente las de los géneros Pyrococcus o Thermococcus ó Thermotoga).
4. Electrodo biológico según la reivindicación 2
caracterizado porque la enzima tipo hidrogenasa es aislada
de algas, tanto procariotas como eucariotas, que metabolizan
hidrógeno, pertenecientes a las siguientes especies: Scenedesmus
obliquus, Anabaena cilíndrica y Anabaena variabilis,
Anacystis nidulas, Synechocystis sp PCC 6803, Nostoc PCC73102 y
Synechococcus PCC6301.
5. Electrodo biológico según la reivindicación 1
caracterizado porque la enzima tipo hidrogenasa es una
enzima con actividad de hidrogenasa modificada con motivos de
afinidad localizados en lugares específicos de su superficie que
permiten su inmovilización orientada sobre el electrodo conductor
convenientemente modificado con motivos complementarios de
afinidad.
6. Electrodo biológico según la reivindicación 5
caracterizado porque la modificación consiste en un
agrupamiento de histidinas.
7. Electrodo biológico según la reivindicación 1
caracterizado porque el electrodo de material conductor
pertenece al siguiente grupo: material metálico o material
carbonáceo.
8. Electrodo biológico según la reivindicación 7
caracterizado porque el material metálico pertenece al
siguiente grupo: oro, cobre, plata o platino.
9. Electrodo biológico según la reivindicación 7
caracterizado porque el material carbonáceo pertenece al
siguiente grupo: carbón vítreo, carbón pirolítico "basal",
carbón pirolítico borde ("edge"), hilo de carbón, tela de
carbón, carbón microporoso, tamices moleculares carbonosos,
nanotubos de carbono, nanofibras de carbono.
10. Electrodo biológico según la reivindicación
1 caracterizado porque la enzima tipo hidrogenasa es la
enzima aislada de la bacteria Desulfovibrio gigas
E.C.1.18.89.1 (la secuencia de aminoácidos del enzima utilizada
tiene el código PDB 1H2A de referencia en la base de datos Protein
Data Bank) y el electrodo conductor es de oro.
11. Electrodo biológico según la reivindicación
1 caracterizado porque la enzima tipo hidrogenasa es la
enzima aislada de la bacteria Desulfovibrio gigas
E.C.1.18.89.1 (la secuencia de amonoácidos del enzima utilizada
tiene el código PDB 1H2A de referencia en la base de datos Protein
Data Bank) y el electrodo conductor es de carbón pirolítico
"edge".
12. Electrodo biológico según la reivindicación
1 caracterizado porque está constituido por un electrodo de
material carbonáceo modificado con grupos carboxilos que se
modifica además con
N,N-bis(carboxymetil)-L-lisina
que forman complejos del tipo nitrilotriacético con iones Ni, Cu ó
Co (estos complejos metálicos poseen afinidad por agrupamientos de
histidinas) y una enzima hidrogenasa modificada o mutada que
comprende un motivo de histidinas en lugares adecuados de la
superficie de la enzima.
13. Procedimiento de obtención del electrodo
biológico según las reivindicación 1 caracterizado porque el
electrodo conductor es de material carbonáceo y porque comprende
las siguientes etapas:
a) modificación del electrodo de carbón por
electroreducción de un arilderivado de sales de diazonio en medio
aprótico o en medio acuoso ácido, que genera grupos amino
primarios,
b) unión covalente de las moléculas de
hidrogenasa en tampón fosfato entre 0.01 y 1.0 M, pH entre 5.0 y
9.0, a través de sus grupos carboxilos activados con
N-hidroxisuccinimida en presencia de
etilcarbodiimida soluble durante un periodo adecuado, y
c) lavado posterior del electrodo con tampón
fosfato.
14. Procedimiento de obtención del electrodo
biológico según la reivindicación 13 caracterizado porque el
arilderivado de sales de diazonio del punto a) pertenece al
siguiente grupo: sal de nitrobenzildiazonio y el
2,5-dimetoxy-4-([4-nitrofenil]azo)bencenodiazonio.
15. Procedimiento de obtención del electrodo
biológico según la reivindicación 13 caracterizado porque el
paso de unión covalente se realiza en tampón fosfato 0.01 M, pH 6.0
en presencia de N-hidroxisuccinimida 1 mM y
etilcarbodiimida 2 mM, durante 90 minutos de incubación.
16. Procedimiento de obtención del electrodo
biológico según la reivindicación 13 caracterizado porque el
electrodo conductor es un electrodo de carbón pirolítico
"edge" modificado previamente con el reactivo tetrafluoborato
4-nitrobenceno diazonio que se pone en contacto con
una disolución 27 \muM de hidrogenasa purificada de
Desulfovibrio gigas en tampón fosfato 0.01 M, pH 6.0 en
presencia de N-hidroxisuccinimida 1 mM y
etilcarbodiimida 2 mM, durante 90 minutos de incubación en esta
disolución y lavado posterior del electrodo con tampón fosfato.
17. Procedimiento de obtención del electrodo
biológico según la reivindicación 13 caracterizado porque la
modificación de la superficie del electrodo de carbón de a) en
concreto de material carbonáceo se lleva a cabo mediante
irradiación con plasma para generar carboxilos que convenientemente
modificados con diaminas, en presencia de carbodiiimida, y
eventualmente N-hydroxisuccinimida recubren el
electrodo de aminas primarias.
18. Procedimiento de obtención del electrodo
biológico según la reivindicación 1 caracterizado porque el
electrodo conductor es metálico y porque la modificación del
electrodo metálico se lleva a cabo mediante un recubrimiento con una
monocapa de moléculas alquiltioles bifuncionales que llevan en uno
de sus extremos grupos tioles con tendencia a la quimisoción y en
el otro extremo grupos funcionales que reaccionan con grupos
funcionales expuestos en la enzima hidrogenasa para su
inmovilización orientada.
19. Procedimiento de obtención del electrodo
biológico según la reivindicación 18 caracterizado porque 1
electrodo metálico es de oro.
20. Uso del electrodo biológico según las
reivindicaciones 1 a la 12 en la fabricación de un ánodo de una
pila de combustible o de un cátodo de una celda
electroquímicas.
21. Pila de combustible caracterizada
porque comprende un electrodo biológico según las reivindicaciones
1 a la 12.
22. Celda electrolítica caracterizada
porque comprende un electrodo biológico según las reivindicaciones
1 a la 12.
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|---|---|---|---|
| ES200502386A ES2322880B1 (es) | 2005-09-30 | 2005-09-30 | Electrodo biologico con la enzima hidrogenasa, procedimiento de obtencion y sus aplicaciones. |
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| US12/088,740 US20090142649A1 (en) | 2005-09-30 | 2006-09-27 | Biological electrode with the hydrogenase enzyme, method of obtaining same and applications thereof |
| EP06807958A EP1939961A1 (en) | 2005-09-30 | 2006-09-27 | Biological electrode with the hydrogenase enzyme, method of obtaining same and applications thereof |
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| ES2322880A1 ES2322880A1 (es) | 2009-06-30 |
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