DE69701458T2 - Verwendung von buckminsterfulleren zur behandlung neurotoxischer verletzungen - Google Patents
Verwendung von buckminsterfulleren zur behandlung neurotoxischer verletzungenInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft carboxylierte Derivate der Formel
- C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)n I
- worin C&sub6;&sub0; Buckminsterfulleren bedeutet und n 1 bis 4 ist.
- Buckminsterfulleren C&sub6;&sub0; ist eine Kohlenstoffkugel mit einander abwechselnden 5- und 6-Kohlenstoffringen; die 30 Kohlenstoff-Doppelbindungen reagieren leicht mit Sauerstoff- Radikalen (Science 259, 1183-1185, 1991) und können so als ein freier Radikalfänger wirken. Natives C&sub6;&sub0; ist jedoch nur in einer begrenzten Anzahl von Lösungsmitteln, wie Toluol oder Benzol, löslich. Die gemäß der vorliegenden Erfindung geeigneten Verbindungen sind wasserlösliche Carboxyfullerene, d. h. Buckminsterfulleren, das einfach oder mehrfach mit Malonsäure derivatisiert wurde, oder die pharmazeutisch annehmbaren Malonsäuresalze, -ester und -amide, wobei die Methylengruppe der Malonsäure an zwei Kohlenstoffatome der Fullerenkugel gebunden ist. Die gemäß der vorliegenden Erfindung geeigneten Verbindungen sind daher C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)n und die entsprechenden Salze, Ester und Amide, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist. Beispiele zweier C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)n Isomerer, worin n = 3 ist, sind in Fig. I dargestellt. Diese Verbindungen wurden als "O-3a" und "R-3b" bezeichnet und sind die Säuren, die den Ethylestern entsprechen, welche in Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 437- 438, 1994, als Verbindungen 3a und 3b offenbart wurden. Die gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugten Verbindungen sind C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; und seine pharmazeutisch annehmbaren Salze, Ester und Amide. Die besonders bevorzugte Verbindung ist die Säure C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; selbst, insbesondere das Isomer O-3a.
- Überraschenderweise wurde gefunden, daß sie biologische freie Radikalfänger und neuroprotektive Mittel sind und somit die Glutamat-Rezeptor-vermittelten neuronalen Verletzungen und den durch Serummangel induzierten apoptotischen neuronalen Tod hemmen.
- Glutamat, der hauptsächliche exzitatorische Neurotransmitter im zentralen Nervensystem, ist für viele normale neurologische Funktionen, einschließlich Lern-Funktion und Gedächtnis, notwendig. Die Hyperaktivierung der Glutamat-Rezeptoren und die entstehenden exzitotoxischen neuronalen Verletzungen sind jedoch in die Pathogenese des neuronalen Verlusts im zentralen Nervensystem (ZNS) verwickelt, in deren Folge verschiedene akute Anfälle, einschließlich Hypoxie/Ischämie (Science 226, 850-852, 1984; Trends Pharmacol. Sci. 11, 379-387; Ann. Neurol. 19, 105-111, 1986; Science 247, 571-574, 1990); Traumata (Ann. Neurol. 23, 623-626, 1988); Epilepsie (Neurosci. 12, 557-567, 1984) und bestimmte neurodegenerative Erkrankungen (Science 227, 1496-1498, 1985; Neuron 1, 623-634, 1988; Trends Pharmac. Sci. 11, 379-387, 1990; Neurol. 40, 32-37, 1990; Ann. Neurol. 31, 119-130, 1992) auftreten.
- Durch reaktiven Sauerstoff hervorgerufene oxidative Belastung stellt einen anderen Verletzungsmechanismus dar, der in viele der gleichen akuten und chronischen Erkrankungen einbezogen ist (Stroke 9, 445-447, 1978; Proq. Brain Res. 63, 227-235, 1985; J. Neurosurq. 64, 803-807, 1986; Cerebrovas. Brain Mezab. Rev. 1, 165-211, 1989; Free Radic. Biol. Med. 6, 289-301, 1989; J. Neurochem. 59, 1609-1623, 1992). Reaktiver Sauerstoff (z. B. Superoxid-Radikal) könnte eine oxidative Schädigung zellulärer Bestandteile, wie die Peroxidation von Zellmembran-Lipiden, die Inaktivierung von Transport-Proteinen und die Hemmung der Energieerzeugung von Mitochondrien verursachen.
- Diese beiden Ereignisse, die Glutamat-Exzitotoxizität und die oxidative Belastung können miteinander verbunden sein; die Bildung reaktiven Sauerstoffs kann als direkte Folge der Überstimulierung des Glutamat-Rezeptors erfolgen (Soc. Neurosci. Abs. 18, 756, 1992; Nature 364, 535-537, 1993) und somit einen Bestandteil der Glutamat-Neurotoxizität vermitteln (Neuron. 1, 623-634, 1988; Science 262, 689-694, 1993). Exzitotoxizität kann ihrerseits durch freie Radikalfänger verringert werden, einschließlich Cu, Zn-Superoxid-Dismutase und Katalase (J. Neurochem. 49, 1222-1228, 1987; Acta Neurochirurgica 51, 245-247, 1990), des 21-Amino-Steroids "Lazaroids" (Neuron 5, 121-126, 1990), des Vitamin E Analogen Trolox (Brain Res. 639, 102-108, 1994), Spin-auslösender Mittel, wie Phenylbutyl-Nnitron (Brain Res. 574, 193-197, 1992), und des Ubichinon Analogen Idebenon (Neurosci. Lett. 178, 193-196, 1994), die die Menge an reaktiven Sauerstoff verringern.
- Freie Radikalfänger wirken sowohl in in vitro- als auch in in vivo Modellen von traumatischen oder hypoxischen/ischämischen ZNS-Verletzungen neuroprotektiv. N-Methyl-D-aspartat und AMPA/Kainat-Rezeptor-Antagonisten sind bei Sauerstoff-Glukose-Mangel Verletzungen in vitro neuroprotektiv (Neuron 1, 623-634, 1988; J. Neurosci. 13, 3510-3524, 1993) und verringern den Verlust von Hirngewebe bei Ischämie-Tiermodellen (Science 226, 850-852, 1984; Science 247, 571-574, 1990). Freie Radikalfänger wirken auch in vitro gegen den exzitotoxischen neuronalen Tod protektiv (J. Neurochem. 49, 1222-1228, 1987; Neuron 5, 12'1-126, 1990) und verringern in vivo ischämische Verletzungen (Amer. J. Physiol. 256, H589-593; Stroke 21, 1312-1317, 1990, Stroke 22, 896-901, 1991; Free Rad. Biol. Med. 12, 29-33, 1992). Transgene Tiere, die das freie Radikalfänger-Enzym, Cu, ZN-Superoxid-Dismutase (SOD) überexprimieren, sind gegen Glutamat Toxizität (Acta Neurochirurgia 51, 245-247, 1990) und ischämische Hirnschädigungen (Ann. Neurol. 29, 482-486; Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88, 11158-62, 1991) resistent.
- Der programmierte Zelltod oder Apoptose trägt auch in bestimmten neurologischen Krankheitsstadien zum Zelltod bei. Die Apoptose könnte beispielsweise einige Tage nach einer Ischämie-Reperfusion eine verzögerte neuronale Degeneration vermitteln (J. Neurochem. 61, 1973-1976, 1994; Neuroreport 5, 493-496, 1994) und könnte ein Faktor des neuronalen Zelltods bei bestimmten neurodegenerativen Erkrankungen sein (Neurosci. Lett. 170, 191-194, 1994). Oxidative Belastung infolge freier Sauerstoff-Radikale könnte eine der Verletzungen sein, die Apoptose auslösen können (Nature 356, 397-400, 1992; Neurotoxicol. 15, 81-91, 1994; J. Natl. Cancer Inst. 86, 1286-1295, 1994), so daß die freien Radikalfänger auch in der Lage sein könnten, den programmierten Zelltod einzuschränken (J. Neurochem. 62, 376-379, 1994; Neurosci. Abs. 20, 432, 1994). Bei der Vermittlung seiner cytoprotektiven Wirkungen gegen Apoptose scheint Bcl-2 als ein freier Radikalfänger zu wirken (Cell 75, 241-251, 1993).
- Der Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von carboxylierten C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)n Derivaten, worin C&sub6;&sub0; ein Buckminsterfulleren bedeutet und n eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung und Prophylaxe von auf freien Radikalen basierenden Erkrankungen, insbesondere wenn die freien Radikale als Ergebnis der Glutamat-Neurotoxizität freigesetzt werden. Die Behandlung neurotoxischer Verletzungen bedeutet entsprechend der vorliegenden Erfindung die Verringerung der Schädigung von zentralen Neuronen, welche ein zentrales Neuron umgeben, das infolge der Schädigung durch ein neurotoxisches Ereignis Glutamat freigesetzt hat. Neurotoxische Ereignisse schließen neurologische Anfälle, wie Hypoxie/Ischämie, die während eines Schlaganfalls, einer Hypoglykämie, der Epilepsie oder eines Traumas ablaufen, ein. Neurotoxische Ereignisse können auch chronische neuronale Schädigung infolge neurodegenerativer Erkrankungen, wie der Huntington-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, der Amyotrophen lateralen Sklerose ("ALS") und der neurodegenerativen Wirkungen von AIDS sein.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Buckminsterfulleren zur Herstellung eines Arzneimittels für die Hemmung neurotoxischer Verletzungen bei Patienten, bei denen die Verletzungen infolge des Stoffwechsels von Arachidonsäure, welche nach der Stimulation des NMDA Rezeptors durch Glutamat von Neuronen freigesetzt wurde, ausgelöst werden.
- Arachidonsäure ("AA") wird in Neuronen durch das Einströmen von überschüssigem Ca²&spplus; in neuronale Zellen infolge der NMDA-Rezeptor-Stimulation durch Glutamat (das Glutamat selbst wurde durch Neuronen freigesetzt, die durch das neurotoxische Ereignis geschädigt wurden) freigesetzt. Das überschüssige Ca²&spplus; aktiviert Phospholipase A&sub2;, ein Calcium abhängiges Enzym, das die AA-freisetzenden Zellmembranen zerstört. Der Stoffwechsel von AA durch endogene Lipooxygenasen und Cyclooxygenasen führt zur Entstehung der freien Sauerstoff-Radikale, welche den peroxidativen Abbau neuronaler Lipidmembranen auslösen (Acta Physiol. Scand. 492, 121-128, 1980; Proq. Brain Res. 63; 227-232, 1985) der zur neuronalen Schädigung oder Tod führt. Deshalb stellt gemäß der vorliegenden Erfindung die Verringerung der Sauerstoff-abgeleiteten freien Radikale durch die Verabreichung einer Zusammensetzung, die ein hier beschriebenes, freie Radikale fangendes Carboxyfulleren umfaßt, einen alternativen Mechanismus bereit, bei dem die Glutamat-induzierte Neurotoxizität gehemmt wird.
- Der bevorzugte Gegenstand der Erfindung umfaßt die Verwendung der vorstehend erwähnten Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels für die Schlaganfallbehandlung. Ein Schlaganfall wird gemäß der vorliegenden Erfindung als ein akutes neurotoxisches Ereignis des Gehirns eines Patienten definiert, wobei das neurotoxische Ereignis durch den Verlust des Blutstroms zu den Neuronen des Gehirns erfolgt.
- Die hier beschriebenen Carboxyfulleren-Verbindungen werden systematisch als ein Arzneimittel verabreicht, welches die aktive Verbindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, der mit der Verbindung verträglich ist, enthält. Bei der Herstellung eines derartigen Arzneimittels kann jeder übliche pharmazeutisch annehmbare Träger verwendet werden. Wird der Arzneistoff oral verabreicht, wird er im allgemeinen in regelmäßigen Zeitabständen verabreicht.
- Bei der therapeutischen Anwendung können die erfindungsgemäßen Verbindungen auf jedem üblichen Weg, auf dem Arzneistoffe verabreicht werden, verabreicht werden. Derartige Wege schließen intravenöse, intramuskuläre, subkutane, in trathekale, intraperitoneale, oberflächliche als auch die orale Gabe ein. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren über orale oder intravenöse Verabreichungen ausgeführt.
- Das Arzneimittel kann in jeder üblichen Form hergestellt werden, einschließlich einer festen Form zur oralen Verabreichung, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver, Granulat und ähnliches. Das Arzneimittel kann sterilisiert werden und/oder Hilfsstoffe, wie Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Netzmittel, Emulgatoren, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks und/oder Puffer, enthalten.
- Typische Zubereitungen zur intravenösen Verabreichung könnten sterile wäßrige Lösungen sein, einschließlich Wasser/gepufferte Lösungen. Intravenöse Träger schließen flüssige Nähr- und Elektolytinfusionen ein. Auch Konservierungsmittel und andere Zusätze, wie Antibiotika und Antioxidantien, können anwesend sein. Arzneimittel zur i.v. Bolus-Verabreichung können bis zu 10 mg/ml (10 000 mg/Liter) eines hier beschriebenen Carboxyfullerens enthalten. Arzneimittel zur i.v.-Infusions- Verabreichung enthalten vorzugsweise von etwa 50 mg/Liter bis etwa 500 mg/Liter eines hier beschriebenen Carboxyfullerens.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die hier beschriebenen Carboxyfullerene für pharmazeutisch annehmbare orale Anwendungen geeignet. Diese Arzneimittel enthalten die Verbindung in Verbindung mit einem verträglichen pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial. Jedes übliche Trägermaterial kann verwendet werden. Jede übliche orale Dosierungsform, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver, Granulat und ähnliches, kann angewendet werden. Das Trägermaterial kann ein für die orale Verabreichung geeignetes organisches oder anorganisches inertes Trägermaterial sein. Geeignete Träger schließen Wasser, Gelatine, Gummi arabicum, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Talg, Pflanzenöle, Polyalkylenglykole, Rohvaseline und ähnliche ein. Weiterhin kann das Arzneimittel andere pharmazeutisch wirksame Mittel enthalten. Zusatzstofffe, wie Geschmacksstoffe, Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Emulgatoren, Puffe r und ähnliche, können entsprechend den gängigen pharmazeutischen Formulierungs-Praktiken zugesetzt werden.
- Eine bevorzugte orale Dosierungsform umfaßt Tabletten, Kapseln aus Hart- oder Weichgelatine, Methylzellulose oder andere geeignete Materialien, die sich im Verdauungstrakt leicht lösen. Die gemäß der vorliegenden Erfindung denkbaren oralen Dosierungen variieren entsprechend den Erfordernissen des jeweiligen Patienten, welche durch den verschreibenden Arzt festgelegt wurden. Die bevorzugte orale Dosierungsform sind Kapseln oder Tabletten, die von 50 bis 500 mg eines erfindungsgemäßen Carboxyfullerens enthalten.
- Bei der Ausführung der Erfindung wird Erwachsenen die erfindungsgemäße Verbindung im allgemeinen täglich, vorzugsweise oral oder intravenös, in einer Menge von etwa 1,5 mg/kg bis etwa 1500 mg/kg täglich, als Einzeldosis oder in Teildosierungen, vorzugsweise von etwa 10 mg/kg bis etwa 60 mg/kg täglich, wobei die genaue Dosierung den Erfordernissen des Patienten angepaßt wird, gegeben. Im allgemeinen wird diese Therapie über einen Zeitraum von etwa drei Monaten durchgeführt. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren bei den Patienten, die ein hohes Risiko besitzen, an einem akuten neurotoxischen Ereignis, wie Schlaganfall, zu erkranken, über einen nicht festgelegten Zeitraum vorbeugend ausgeführt werden. Zur Behandlung eines akuten neurotoxischen Ereignisses sollte der Patient sobald wie möglich nach der Diagnosestellung, vorzugsweise innerhalb von zwölf Stunden und besonders bevorzugt innerhalb von sechs Stunden, nach Beginn des neurotoxischen Ereignisses entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden.
- Die Fig. 1-11 veranschaulichen die Erfindung im einzelnen.
- Fig. 1 Strukturen der Hexacarboxyfulleren, C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3;, Isomere O-3a und R-3b.
- Fig. 2 Protonen-NMR-Spektrum des gereinigten C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; Malonesters (Enantiomer O-3a).
- Fig. 3 Massenspektrum (fast-atom bombardement) des gereinigten C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; Malonesters (Enantiomer O-3a).
- Fig. 4 Paramagnetisches Elektronenresonanzspektrum, das die Wirksamkeit von C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; als freier Radikalfänger ge gen H&sub2;O&sub2; (A: unbehandelt, B: mit dem Enantiomer O-3a behandelt) und gegen das Superoxid-Radikal O&sub2;&supmin; (C: unbehandelt, D: mit dem Enantiomer O-3a behandelt, E: mit dem Enantiomer R-3b behandelt) veranschaulicht. Die Pfeile zeigen auf ein Signal, das durch eine Verunreinigung in der EPR-Kavität erzeugt wird.
- Fig. 5 Durch die Einwirkung von NMDA auf kultivierte Neuronen entstandene Neurotoxizität, ohne Behandlung und mit drei C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; Konzentrationen.
- Fig. 6 Durch die Einwirkung von AMPA auf kultivierte Neuronen entstandene Neurotoxizität, ohne Behandlung und mit vier C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; Konzentrationen.
- Fig. 7 NMDA-stimulierte Häufung des &sup4;&sup5;Ca²&spplus;-Tracers in kultivierten Neuronen mit oder ohne zusätzliche Anwendung von C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3;.
- Fig. 8 Durch Serummangel hervorgerufener apoptotischer neuronaler Zelltod in Gliazellen-Mangel-Kulturen ohne Behandlung und mit zwei C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; Konzentrationen.
- Fig. 9 EPR-Spektren, die die Wirksamkeit von zwei C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; Isomeren als freie Radikalfänger vergleichen.
- Fig. 10 Vergleich von zwei C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; Isomeren bezüglich des Schutzes von Neuronen aus einer Verletzung, die durch die Anwendung von NMDA- (A) und durch AMPA-induzierten (B) neuronalen Tod entstanden sind. EPR-Spektren von Spinmarkierten Lipiden (5- oder 16-Doxylketostearinsäure) (C), die aus Lipiden von Maus-Hirn stammen, plus einem der beiden C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; Isomere.
- Fig. 11 Überlebenskurven von FALS-Mäusen, die mit intraperitonealen mini-osmotischen Pumpen, welche Kochsalz oder 15 mg/kg/Tag Carboxyfulleren enthalten, behandelt werden. Die hier beschriebenen Daten veranschaulichen, daß die offenbarten Carboxyfullerene eine neue Antioxidantien-Klasse mit der Fähigkeit, multiple Sauerstoff-abgeleitete freie Radikale zu fangen, darstellen und daß diese Verbindungen ungewöhnlich breite und kraftvolle neuroprotektive Fähigkeiten besitzen, den neuronalen Tod infolge der Glutamat-Exzitotoxizität und die Apoptose aufzuhalten.
- Die Medium-Stammlösung (MS) besteht aus Eagles Minimal Essential Medium mit 25 mM Glukose, ohne L-Glutamin.
- Das Plattierungsmedium besteht aus MS, ergänzt mit L- Glutamin (2 mM), 5% fötalen Kälberserum und 5% Pferdeserum. Das Wachstumsmedium enthält MS, 10% Pferdeserum und 2 mM L-Glutamin.
- Die kurzzeitige Einwirkung von NMDA wird in HEPESgepufferter physiologischer Salzlösung pH 7,40 (HBBSS) ausgeführt, die in mM ausgedrückt, 116 NaCl, 5,4 KCl, 0,8 MgSO&sub4;, 1,8 NaPO&sub4;, 12 HEPES, 25 NaHCO&sub3;, 5,5 D-Glukose mit 10 uM L-Glycin enthält.
- Die physiologische Salzlösung (BBS) bestand aus, in mM ausgedrückt, 116 NaCl, 5,4 KCl, 0,8 MgSO&sub4;, 1,8 NaPO&sub4;, 26,2 NaHCO&sub3; und 5,5 D-Glukose.
- Das ursprüngliche C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; Isomere war das Isomer O-3a, welches das Hauptprodukt der Synthese darstellt. Die Stammlösung dieser Verbindung wurde als 25 mM Lösung in Wasser hergestellt. Die Stammlösungen wurden innerhalb von 72 Stunden nach der Herstellung verwendet und wurden bei -20ºC im Dunkeln gelagert.
- Zur Herstellung einer 50 mM Stammlösung wurde unmodifiziertes C&sub6;&sub0; in Toluol gelöst.
- Neokortikale Maus-Kulturen wurden als Neuron-Astrozyten-Cokulturen (annähernd 50% Astrozyten) (Rose et al., 1992) oder als neuronale Kulturen (< 2% Astrozyten) hergestellt, Maus-Embryonen (15. Trächtigkeitstag) wurden aus den trächtigen narkotisierten Swiss-Webster-Mäusen entfernt und der Neokortex wurde von den anderen Hirnstrukturen abgeteilt. Nach kurzzeitiger Inkubation in Trypsin wurden die Zellen durch Zerreiben gespalten und die Zellsuspension wurde dann in Plattierungsmedium verdünnt und auf vorher hergestellte 24- Vertiefungen-Plastek-Kulturplatten, die entweder mit Poly-D- Lysin/Laminin (für die neuronalen Kulturen) beschichtet sind oder auf denen eine Astrozyten-Schicht (für die Cokulturen) vorhanden ist, ausplattiert. Nach 1-2 Tagen in vitro wird zur Gewinnung von "reinen" neuronalen Kulturen ein teilweiser Austausch mit Gliazellen konditionierten Medium durchgeführt und unmittelbar danach wird zur Hemmung der Gliazellproliferation Cytosin-Arabinosid (3 uM) zugesetzt. Den Mischkulturen wird, wenn sie in serumfreien MS, das 2 mM L-Glutamin enthält, gehalten werden, bis zum 11.-12. Tag zweimal wöchentlich Wachstumsmedium in vitro zugesetzt. Wenn nicht anders beschrieben, wurden die Zellen am 14.-15. Tag in vitro verwendet.
- 2,2-Fulleromalonsäurediethylester C&sub6;&sub0; (1 g, 1,39 mMol) wurde in frisch destilliertes Toluol (1000 ml) gegeben und einige Minuten gerührt, wodurch eine klare, violette Lösung erhalten wird. Der gerührten Lösung wurde tropfenweise Brommalonsäurediethylester (0,474 ml, 2,78 mmol) zugesetzt. Infolge der Zugabe von 0,526 ml (3,475 mmol) DBU (1,8-Diazobicyclo[5,4,0]-undec-7-en) zu der Fulleren-Lösung wechselt die Farbe von violett nach dunkelrot. Nachdem die Lösung über Nacht an der Luft bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurde sie filtriert, um die Ammoniumsalze zu entfernen und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Der Rückstand wurde in einem kleinen Volumen Chloroform gelöst und auf eine Kieselgel-Säule aufgetragen (das Packungsmaterial war 70-230 oder 230-400 Chromatographiegel von Merck). Die Fulleren-Produkte wurden durch Verwendung eines Gradienten von Toluol/Hexan (1 : 1) bis Toluol (100%) eluiert. Die ursprüngliche Elution ergab 5 Fraktionen, nicht-reagiertes Fulleren, Monoaddukte, Bisaddukte, Trisaddukte, Multiaddukte. Die Lösungsmittel jeder Fraktion wurden im Vakuum entfernt und der feste Rückstand wurde wiederholt bis zur Reinheit chromatographiert. Die Fraktionen, welche die Bisaddukte und Trisaddukte enthielten, ergaben durch die wiederholte Trennung zwei Hauptprodukte.
- 2,2-Fulleromalonsäure(n) Die Proben, welche die einzelnen Isomere der Ester Addukte (100 Ing) enthielten, wurden unter Stickstoff in Toluol (50 ml) gelöst. Anschließend wurde ein 20 : 1 molarer Überschuß an NaH zugesetzt. Nach 2-3 stündigem Rühren bei 100ºC wurde der heißen Lösung tropfenweise 1 ml Methanol zugesetzt, wodurch eine lebhafte Gasentwicklung entstand. Gleichzeitig lief die quantitative Ausfällung des Natriumsalzes ab. Das Salz wurde durch Zentrifugation isoliert und unter Vakuum getrocknet. Die getrocknete Verbindung wurde mit 2 M H&sub2;SO&sub4; und anschließend mit Wasser gewaschen. Das Produkt, welches das Malonsäurederivat des entsprechenden Esters darstellt, wurde über Nacht unter Vakuum getrocknet, wodurch ein feines braunes Pulver entstand.
- Die Massenspektrometrie wurde an einer Probe ausgeführt, die das Enantiomer O-3a des Fullerenester-Trisaddukts enthielt; dieser Ester wurde dann zur Bildung des Carboxyfulleren-Endprodukts, C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3;, hydrolysiert und angesäuert. Die Protonen-NMR- und Massenspektren (Fig. 2 bzw. 3) des gereinigten C&sub6;&sub0; Esters weisen darauf hin, daß die Probe ein einzelnes Isomer des 2,2-Fulleromalonesters (O-Enantomer mit einer Masse = 1194/1195) enthält, mit einer geringen Menge an Cso (Masse = 720), welches durch die Fragmentierung des Addukts entstanden sein kann. Die Ergebnisse der Ursprungsverbindung, das Enatiomer O-3a, werden hier beschrieben. Frühere Studien mit dem anderen Enantiomer R-3b weisen darauf hin, daß es ebenfalls ein wirksames Neuroprotektivum ist.
- Die Carboxyfulleren-Lösungen waren durchscheinend braun. Die Filtration einer konzentrierten (50 mM) Lösung durch 0,45 um Nylonfilter hinterließ jedoch keinerlei Rückstand auf den Filtern, was auf eine echte Lösung hinweist. Die Kontrollversuche bestätigten, daß die Verbindungen das kolorimetrische LDH-Assay nicht stören. Lösungen mit einer Konzentration bis zu 25 mM Carboxyfulleren veränderten den pH-Wert der Versuchslösungen nicht.
- Durch paramagnetische Elektronenresosonanz-Spektroskopie wurde nachgewiesen, daß die C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)n Verbindungen wirksame freie Radikalfänger sind, die sowohl Hydroxyl- als auch Superoxid-Radikale entfernen können. Die Fig. 4 zeigt die EPR-Spektren A-E, die die Wirksamkeit von C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; als Fänger freier Radikale veranschaulichen. Die Spektren A bzw. B zeigen das durch H&sub2;O&sub2; über einen Zeitraum von 15 Minuten erzeugte Hydroxyl-Radikal (Spin-Addukt: DMPO-OH·) und die Entfernung dieses OH-Signals, wenn das H&sub2;O&sub2; 150 uM Isomer O-3a enthält. Das Superoxid-Radikal (O&sub2;&supmin;) wurde ebenfalls wirkungsvoll von den C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)n Verbindungen abgefangen. O&sub2;&supmin; welches das DMPO-OOH Spin-Addukt bildet, wurde durch Inkubation von Xanthin-Oxidase mit Xanthin erzeugt (Spektrum C). Durch die Coinkubation mit entweder 40 uM Isomer O-3a oder 40 uM R-3b wurde das Superoxid-Radikal-Signal entfernt (Spektren D bzw. E). Die EPR-Analyse von anderen wasserlöslichen C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)n Verbindungen mit n = 1 oder 2 bestätigte, daß sie ebenfalls wirksame freie Radikalfänger sind (Daten sind nicht dargestellt).
- Die hexacarboxylierte Verbindung, C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3;, die bis zu einer Konzentration von wenigstens 50 mM in Wasser löslich war, schützt kortikale Neuronen vor exzitotoxischen Verletzungen, die durch die Einwirkung von N-Methyl-D-aspartat (NMDA) und (Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol)propionsäure (AMPA) erzeugt werden. Die Dicarboxy- und Tetracarboxyfulleren-Derivate waren in wäßriger Lösung wenig löslich und obwohl sie neuroprotektive Wirksamkeit besitzen, waren sie weniger wirksame Neuroprotektantien als die Hexacarboxy-Derivate.
- Zum Nachweis der Neuroprotektion wurde Carboxyfulleren (3-300 uM) gemeinsam mit NMDA auf die vorstehend beschriebenen Neuronen-Astrozyten-Cokulturen angewendet. Die kurzzeitige Einwirkung von NMDA in Anwesenheit von Carboxyfülleren wurde ausgeführt, indem das Medium dreimal mit HBBSS gewechselt wur de und anschließend für 10 Minuten 50 uM-500 uM NMDA plus Carboxyfulleren zugesetzt wurde. Um das Ausmaß der Verletzung zu bestimmen, wurden NMDA und Carboxyfulleren entfernt, indem das Medium viermal mit MS gewechselt wurde und die Kulturen wurden 24 Stunden im Inkubator bei feuchter Atmosphäre, 5% CO&sub2; und bei 37ºC gehalten.
- Die verlängerte Einwirkung (24 Stunden) von 5-100 uM AMPA wird routinemäßig zur Herstellung kortikaler neuronaler Verletzungen angewendet. Zum Nachweis der Neuroprotektion wurde in anderen Versuchsreihen Carboxyfulleren (3-300 mM) gemeinsam mit AMPA auf die vorstehend beschriebenen Neuronen- Astrozyten-Cokulturen angewendet. Nachdem das Medium zweimal mit MS gewechselt wurde, wurden AMPA und Carboxyfulleren zugesetzt und die Kulturen wieder in den 37ºC Inkubator gestellt. Um die sekundäre Aktivierung von NMDA durch die endogene Glutamat-Freisetzung auszuschließen, war der NMDA-Rezeptor- Antagonist MK-801 (10 uM) in AMPA und Carboxyfulleren zugegen.
- Der neuronale Tod wurde 24 Stunden nach der NMDA- oder AMPA-Verabreichung durch Phasenkontrast-Mikroskopie bei 200- 400x und durch Messung der aus den gefärbten Zellen freigesetzten Laktatdehydrogenase (LDH) (Koh und Choi, 1987) nachgewiesen. Die Quantifizierung des Zelltods erfolgte in einigen Versuchen durch Trypanblau- oder Propidiumjodid-Färbung sowie durch Zellzahlmessungen.
- Die Ergebnisse für C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; sind in den Fig. 5 und 6 dargestellt. C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; zeigte eine starke Neuroprotektion gegen NMDA (Fig. 5) und AMPA induzierte exzitotoxische neuronale Verletzungen (Fig. 6). C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; (300 uM) verringert den neuronalen Tod durch NMDA in allen derzeit durchgeführten Versuchen um wenigstens 60% und gewährleistet in einigen Versuchen einen nahezu vollständigen Schutz. Die in den gewaschenen Kontrollen vorhandene LDH-Menge wurde abgezogen, um das für die NMDA-Toxizität spezifische Signal zu erhalten. Die Daten werden grafisch als prozentualer Anteil im Vergleich zu dem durch NMDA hervorgerufenen Zelltod dargestellt: durch diese Einwirkung wurden 51(9,44(6 und 88 (14% der Gesamtheit an Neuronen pro Kultur) abgetötet. Mittelwert (S. D.* = p < 0,05) gegenüber NMDA gemäß dem ANOVA-Test mit nachfolgenden Student-Newman-Keuls-Test für den multiplen Vergleich. Die aus drei Versuchen gesammelten Daten (Fig. 5) veranschaulichen eine Verringerung von 75% des neuronalen Zelltods.
- C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; verringert den neuronalen Zelltod von AMPA bei 100 uM um > 80% (Fig. 6). Um die sekundäre Aktivierung des NMDA-Rezeptors durch die endogene Glutamat-Freisetzung auszuschließen, war MK-801 (10 uM) in AMPA zugegen. Die Werte sind Mittelwerte (SEM, n = 3-4/Versuch), die Daten aus 4 Versuchen wurden zusammengefaßt. Die Daten werden grafisch als prozentualer Anteil im Vergleich zu dem durch AMPA/MK-801 hervorgerufenen Zelltod dargestellt und entsprechen 40-70% der Gesamtheit an Neuronen/Kultur. * = p < 0,05 gegenüber AMPA gemäß dem ANOVA-Test mit nachfolgendem Student-Newman-Keuls-Test für den multiplen Vergleich.
- Diese hier beschriebenen Versuche sind unserer Kenntnis nach die erste Verwendung dieser Verbindungen als cytoprotektive Mittel und Antioxidantien.
- Um zu bestätigen, daß der Schutz gegen die NMDAinduzierten neuronalen Verletzungen nicht auf eine Verringerung des NMDA induzierten Calciumstroms zurückzuführen sind, wurden Ca²&spplus;-Tracer-Versuche durchgeführt. Die Kulturen wurden zweimal mit HBBSS gewaschen und dann der Einwirkung von entweder nur NMDA (300 uM) oder mit C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; in HBBSS, das den &sup4;&sup5;Ca²&spplus; Tracer (0,5 Cl/Kulturplattenvertiefungen; NEN, Boston, MA) enthält, ausgesetzt. Die Einwirkung wurde nach 10 Minuten durch den viermaligen Mediumwechsel mit unmarkierten HBBSS beendet, gefolgt durch die Lyse der Zellen durch Zugabe von 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS). Die Zellen wurden 2 Stunden in SDS belassen und das Lysat wurde danach in Szintillationsampullen überführt. Den Ampullen wurde eine zusätzliche Menge an Wasch lösung aus jeder Kulturvertiefung zugegeben, wonach die γ- Zählung erfolgte.
- Die Ergebnisse in Fig. 7 veranschaulichen, daß die Carboxyfullerene keine NMDA-Rezeptor-Antagonisten sind. Die &sup4;&sup5;Ca²&spplus;-Häufung wurde nicht durch die gemeinsame Anwendung von NMDA mit C60(C(COOH)2)3 bis zu einer Konzentration von 300 uM beeinflußt. Um den für die NMDA-Rezeptor-Aktivierung spezifischen &sup4;&sup5;Ca²&spplus;-Anstieg zu erhalten, wurde das basale 452+ unter allen Bedingungen abgezogen. Mittelwert (SEM, n = 4).
- Kortikale Neuronen in Gliazellen-Mangel-Kulturen unterlagen 24-48 Stunden nach der Entfernung des Serums dem apoptotischen Zelltod, der durch morphologische Veränderungen, wie Schrumpfung der Zellen, Fragmentierung des neuronalen Ablaufs und Chromatin-Kondensation, gemäß der Hoechst-33258-Färbung (Dugan et al., 1995) gekennzeichnet ist. Der apoptotische neuronale Tod infolge Serummangel erfolgte auch bei der gleichzeitigen Anwendung von Hexacarboxyfulleren. Es erwies sich, daß diese Verletzungen die für die Apoptose typischen Merkmale aufweisen, einschließlich der DNA-Faltung, der Chromatin- Verklumpung, der Zell-Schrumpfung, der Bildung apoptotischer Körper und dem Schutz durch makromolekulare Synthese-Inhibitoren. Den kortikalen Neuronen-Kulturen, die weniger als 1% Astrozyten enthalten, wurde das Serum entzogen, indem das Serum-enthaltende Wachstumsmedium gegen eine mit Aminosäuren ergänzte (ausgenommen Glutamin) physiologische Salzlösung ausgetauscht wurde. Die gewaschenen Kontrollen erhielten Medium, das 2% fötales Kalbsserum, 2% Pferdeserum in BBS enthält. Nach 24 und 48 Stunden wurden die Zellen unter Nutzung der Phasenkontrastoptik eines Nikon Umkehrmikroskops bei 10D-400x photographiert.
- Zusätzlich wurde der neuronale Zelltod 48 Stunden nach der Entfernung des Serums bestimmt, indem die Zellen gezählt wurden, die kein Trypanblau mehr annehmen. Wie in Fig. 8 dar gestellt, war der 48 Stunden nach Beginn des Serummangels mittels Trypanblau-Färbung bestimmte neuronale Zelltod signifikant verringert. Die mit 10 uM C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; behandelten Zellen wiesen eine 50% Verringerung des neuronalen Tods auf. Bei den in serumhaltigen Medium gehaltenen Zellen stellte sich in sehr viel geringerem Maße Tod ein. Die Werte sind Mittelwerte (SEM, n = 3-4 / Versuch). Dieser Versuch ist repräsentativ für 3 Versuche. * = p < 0,05 gegenüber Serummangel gemäß dem ANOVA-Test mit nachfolgenden Student-Newman-Keuls-Test für den multiplen Vergleich.
- Zwei C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; Regioisomere, O-3a und R-3b, wurden gemäß dem Verfahren nach Lamparth und Hirsch (Lamparth und Hirsch (1990)) synthetisiert und gereinigt. Die Reinheit dieser Verbindungen wurde durch NMR- und UV/sichtbare Spektralanalysen bestätigt. In der Verbindung O-3a befinden sich alle Methan-Brücken in äquatorialen Positionen zueinander (e,e,e) und das Molekül weist C&sub3;-Symmetrie auf, wie durch ¹H- und ¹³C- NMR-Spektroskopie gezeigt wurde. Die Verbindung R-3b besitzt Methan-Brücken, (trans-3, trans-3, trans-3) liegen und weist D&sub3;-Symmetrie auf. Die in Fig. 1 dargestellten 3-D-Strukturen veranschaulichen die polare Verteilung der Carboxylgruppen am O-3a und die äquatoriale Verteilung der Carboxylgruppen am R- 3b.
- Fig. 9 veranschaulicht, daß die zwei Isomere aus chemischer Sicht entsprechend der Beurteilung der Spin- Auflösung/EPR-Spektren, ähnliche Fähigkeiten, freie ·OH und O&sub2;&supmin; Radikale abzufangen aufweisen. Fig. 9 zeigt die EPR-Spektren von ·OH- (aus 100 uM H&sub2;O&sub2; in Fe²&spplus; durch die Fenton-Reaktion) und O&sub2;&supmin; (aus Xanthin + Xanthin-Oxidase) Radikalen mit 100 mM 5,5- Dimethyl-1-pyrollin-N-oxid (DMPO) als Spin-auflösendes Mittel. Hydroxyl-Radikal (linke Spektren): ·OH in Gegenwart von DMPO (oben), in Gegenwart von 4 uM O-3a (Mitte) oder in Gegenwart von 4 uM R-3b (unten). Superoxid-Radikal (rechts): O&sub2;&supmin; nur in DMPO (oben), in Gegenwart von 400 uM O-3a (Mitte) oder in Gegenwart von 400 uM R-3b (unten). Der Pfeil kennzeichnet ein Spurensignal infolge eines unbekannten Radikals in der Kavität. Die Probe wurde in einer Quarz-Flachzelle (60 · 10 · 0,25 mm) in einem Bruker 200, X-Band-EPR-Spekrometer analysiert. Die Einstellungen waren wie folgt: Leistung = 1,6 mW, Modulation = 1 G, Feldmodulation = 100 Hz, R. G. = 3,2 · 10&sup5;.
- Die EPR-Ergebnisse veranschaulichen, daß sowohl das Isomere O-3a als auch das R-3b außerordentlich wirksame ·OH Fänger sind, bei Konzentrationen, die 100 bis 1000fach geringer sind, als es von den meisten freien Radikalfängern mitgeteilt worden ist. Die Fähigkeit von Carboxyfulleren ·OH abzufangen, ist 10fach größer als seine Wirksamkeit gegenüber O&sub2;·- Radikalen.
- Obwohl die Isomere O-3a und R-3b gemäß der EPR-Analyse gleichwertig wirksame Antioxidantien sind, war die Verbindung O-3a sowohl gegen NMDA- als auch gegen AMPA-Rezeptor-vermittelte Verletzungen biologisch wirksamer als R-3b. Diese Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt. Fig. 10 veranschaulicht, daß O-3a einen geringfügig besseren Schutz gegen durch Anwendung von NMDA (A) entstandene Verletzungen, aber einen wesentlich besseren Schutz gegen AMPA-induzierten neuronalen Tod (B) liefert. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM, n = 8-12 pro Bedingung. * - p < 0,05 gegenüber unbehandelten Verletzungsbedingungen gemäß dem ANOVA-Test mit nachfolgendem Student- Newman-Keuls-Test für den multiplen Vergleich. ** = p < 0,05 R- 3b ist von O-3a verschieden. Fig. 10 zeigt auch die EPR- Spektren der Spin-markierten Lipide (C) (5- oder 16-Doxyl- Ketostearinsäure), die in den Lipiden aus Maus-Hirn enthalten sind, plus entweder O-3a oder R-3b. Die Spin Markierungen wurden den aus adulten Maus-Hirnen extrahierten Lipiden im Verhältnis von 1 : 100 zugesetzt. Die EPR-Einstellungen waren die gleichen, wie die in der Legende für Fig. 9 aufgeführten.
- Beide Isomere erzeugen eine Verschiebung im (S) der 5- Doxylgruppe, O-3a erzeugte jedoch eine größere Veränderung in S (Tabelle 1). O-3a veränderte das Signal von 16-Doxyl- Ketostearinsäure im flüssigen Zustand auch in größerem Ausmaß als R-3b, was darauf hinweist, daß O-3a die Zerstörung oder die Fließfähigkeit der Lipide erhöht (Tabelle 1). Beide Ergebnisse lassen vermuten, daß O-3a in größerem Ausmaß als R-3b in die Lipidschicht eindringt.
- Zusätzlich zu der größeren Wirksamkeit beim Schutz von Neuronen gegen NMDA- und AMPA-Rezeptor-vermittelte Verletzungen liefert O-3a einen besseren Schutz als R-3b gegen Verletzungen in Endothel-Zellkulturen und in Hepatozyten. Dieser Unterschied entstand offensichtlich infolge der Fähigkeit des Isomers O-3a in einem größeren Ausmaß in die Membranen einzudringen als R-3b. Die Polarität von O-3a ermöglicht, daß es besser in die Zellmembran eindringt. Diese Fähigkeit, in Membranen zu interkalieren, läßt vermuten, daß O-3a den Zellmembranen einen besseren Schutz gegen Lipid-Peroxidation bietet als R-3b. Die Lokalisation der funktionellen Gruppen (polar gegenüber Umfang) ist daher für die schützende Wirkung der C&sub6;&sub0; Derivate von Bedeutung. Tabelle 1. Membran Parameter aus den Spin-markierten / EPR- Versuchen
- a Ordnungsparameter, 5 = a (T/'-T ')/(T/-T ), worin T/' die gemessene hyperfeine Aufspaltung für die parallele Orientierung in den 5-Doxystearinsäure Spin-Markierung/Phospholipiden und T ' die senkrechte dazu Orientierung bedeutet. Wir setzen a = 1 und T/'-T ' = 25 G.
- b Korrelationszeit τc = 6, 5 · 10&supmin;¹&sup0; [(h&sub0;/h&submin;&sub1;)-1], worin w&sub0; die Breite der Mittelfeldlinie in Gauss bedeutet und h&submin;&sub1; und h&sub0; die Peakhöhe der Mittel- und Hochfeld-Kurven auf der Absorptionskurve erster Ableitung für 5-Doxylstearinsäure sind.
- Lipid/wäßriger Verteilungsfaktor, f = hL/hA, worin hL und hA die für 16-Doxylstearinsäure gemessene Peakhöhe der Lipid- und der wäßrigen Phase bedeutet. Wir verwendeten ¹/&sub2; der hA- Gesamthöhe als gültigen Vergleich.
- Ein Induviduum von 10 000 entwickelt ALS, die häufigste Todesursache infolge einer motorischen neuronalen Erkrankung. Die familiale Form der Erkrankung (FALS), die üblicherweise autosomal dominant ist, trifft auf 10-15% der Fälle zu. 1993 wurde ein kritischer Durchbruch bei bestimmten Familien mit FALS-Mutationen im Cu, Zn-SOD (sodl)-Gen (Rosen et al., 1993) verzeichnet und die nachfolgende Forschung führte zu der Hypothese, daß die Entstehung von ALS auf eine gesteigerte Bildung von reaktivem Sauerstoff (ROS) durch mutagen verändertes SOD1 in einigen FALS-Formen zurückzuführen ist.
- Gurney und Mitarbeiter haben eine Maus gezüchtet, welche die in FALS-Familien gefundene G&sup9;³A-Punktmutation trägt (Gurney et al., 1994) und die G1-Linie der G&sup9;³A transgenen Mäuse zeigt viele Merkmale der humanen FALS. Die G1-Linie, mit 18 Kopien und vierfacher SOD-Aktivität im Vergleich zu Wildtieren, entwickelt den motorischen neuronalen Tod mit Schwächung der Hinterläufe, verschlechtertem Grooming und Abmagerung entlang ihrer Schenkel im 3.-4. Lebensmonat. Die betroffenen Mäuse starben vor dem 5. Lebensmonat (Gurney et al., 1994). Um die Fähigkeit von C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; zur Behandlung von FALS zu bestimmen, wurde es bei der Behandlung von FALS-Mäusen eingesetzt (Gurney-GI-Stamm). In der 10. Lebenswoche wurden mini-osmotische Alzet-Pumpen (28 Tage, 6 ug/Tag, 15 mg/kg/Tag), die C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; (die gemischten Isomere, die aus > 90% O-3a bestehen) oder Salzlösung enthalten, intraperitoneal implantiert. Die Pumpen wurden in der 14. Lebenswoche erneuert. Die freie Beweglichkeit wurde mittels Video-Überwachung kontrolliert und unter Verwendung der Bresnahan-Skala für Rückenmark Erkrankungen ausgewertet (Basso et al., 1995). Wie durch Gurney und Mitarbeiter mitgeteilt, entwickeln diese Tiere nach 90 Lebenstagen motorische Symptome und waren zwischen 125 und 145 Lebenstagen moribund.
- Fig. 11 stellt die Überlebenskurven für FALS-Mäuse dar, die mit Salzlösung oder 15 mg/kg/Tag Carboxyfulleren enthaltenden intraperitonealen mini-osmotischen Pumpen behandelt wurden. Diese Ergebnisse veranschaulichen, daß die mit C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; behandelte Gruppe einen um 8±2, 2 Tage verzögerten Tod zeigten, p = 0,041 gemäß dem T-Test. Die mit C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)&sub3; behandelten FALS-Mäuse zeigten auch eine Verzögerung im Einsetzen der Symptome. Der 8-tägige Überlebensanstieg war gemäß dem T-Test statistisch signifikant (p = 0,041). Es gab keine Unterschiede im Überleben von FALS-Mäusen, die keine Pumpen erhielten (123 Tage, n = 4) oder denen, die mit Salzlösung gefüllten Pumpen behandelt wurden (125 Tage, n = 6). Zudem zeigten die Wildtyp-Tiere (n = 6), die zwei Monate mit Carboxyfulleren behandelt wurden (15 mg/kg/Tag) keine nachteiligen Wirkungen bezüglich der Gesundheit und des Verhaltens - sie waren ebenso aktiv wie die unbehandelten Nachkommen und ihr Gewicht war gleich (innerhalb der Geschlechter).
Claims (3)
1. Verwendung von carboxylierten Derivaten der Formel
C&sub6;&sub0;(C(COOH)&sub2;)n
worin C&sub6;&sub0; ein Buckminsterfulleren bedeutet und n 1-4 ist,
sowie pharmazeutisch annehmbare Salze, Ester und Amide davon zur Herstellung von
Medikamenten für die Kontrolle oder Behandlung von Krankheiten basierend auf
freien Sauerstoff-Radikalen, die ausgesendet werden durch Neuronen, welche durch
den Glutamat NMDA Rezeptor stimuliert werden.
2. Die Verwendung von Verbindungen der Formel I entsprechend
Anspruch 1, wobei Krankheiten zu neurotoxischen Schäden umfasst werden wie
neurologische Anfälle, zum Beispiel Hypoxie/Ischämie, wie sie während eines
Schlaganfalls, Hypoglykämie, Epilepsie oder neurodegenerativen Schäden wie der
Huntington'schen Krankheit, der Alzheimer'schen Krankheit der Amyotrophen
lateralen Sklerose (ALS) and neurodegenerativen Wirkungen von AIDS, auftreten.
3. Die Verwendung ensprechend Ansprüchen 1-2, worin in Formel I n 3
ist.
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