KR20000016238A - 신경 독성 손상을 치료하기 위한 부크민스테르풀레렌의 용도 - Google Patents

신경 독성 손상을 치료하기 위한 부크민스테르풀레렌의 용도 Download PDF

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데니스 원규 최
라우라 듀간
티엔-숭 톰 린
티엔-야 루
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프리돌린 클라우스너, 롤란드 비. 보레르
에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 신경독성 손상을 조절하거나 또는 치료하는 카복실화 부크민스테르풀레렌의 용도에 관한 것이다.

Description

신경 독성 손상을 치료하기 위한 부크민스테르풀레렌의 용도
본 발명은 화학식 Ⅰ의 카복실화 유도체에 관한 것이다.
C60(C(COOH)2)n
상기식에서,
C60은 부크민스테르풀레렌(buckminsterfullerene)이고,
n은 1 내지 4이다.
부크민스테르풀레렌, C60은 변형 5- 및 6-탄소환을 갖는 탄소 구(sphere)이고, 30개의 탄소 이중결합은 산소 라디칼과 용이하게 반응하므로(참고 문헌: Science259, 1183-1185, 1991), 유리 라디칼 스캐빈저(scavenger)로서 작용할 수 있다. 그러나, 본래 C60은 제한된 수의 용매, 예를 들면 톨루엔 또는 벤젠에서만 용해된다. 본 발명에 따르는 유용한 화합물은 수용성 카복시풀레렌, 즉 말론산 또는 약제학적으로 허용되는 말론산 염, 에스테르 및 아미드와 일- 또는 다-유도체화된 부크민스테르풀레렌(여기서, 말론산의 메틸렌 그룹은 풀레렌 구의 2개의 탄소에 결합된다)이다. 따라서, 본 발명에 따르는 유용한 화합물은 C60(C(COOH)2)n(여기서 n은 1 내지 4의 정수이다) 및 상응하는 염, 에스테르 및 아미드이다. n이 3인 C60(C(COOH)2)n의 두 이성체의 예는 도 1a 및 1b에 나타내었다. 이러한 화합물은 "O-3a" 및 "R-3b"라고 칭하고, 이들은 문헌(참조: Angew. Chem. Int. Ed. Engl.33, 437-438, 1994)에서 화합물 3a 및 3b로서 기술된 에틸 에스테르에 상응하는 산이다. 본 발명에 따르는 유용한 바람직한 화합물은 C60(C(COOH)2)3및 이의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르 및 아미드이다. 가장 바람직한 화합물은 산 그 자체로 C60(C(COOH)2)n이고, 특히 O-3a 이성체이다.
놀랍게도, 이들 화합물은 생물학적 유리 라디칼 스캐빈저 및 신경 보호제이므로 글루타메이트 수용체-매개된 뉴론의 손상 및 혈청-결핍 유발된 세포소멸성(apoptotic) 뉴론의 사멸을 방지한다고 밝혀졌다.
글루타메이트, 중추 신경계에서 주된 흥분성 신경 전달 물질은 학습 및 기억을 포함하는 많은 정상적 신경계의 기능에서 필요하다. 그러나, 글루타메이트 수용체의 과활성화로 인한 독성자극성(excitotoxic) 뉴론의 손상은 중추 신경계(CNS)에서의 뉴론 손실의 병인학에서, 저산소증/허혈증(참고 문헌: Science226, 850-852, 1984; Trends Pharmacol. Sci. 11, 379-387; Ann. Neurol.19, 105-111, 1986; Science247, 571-574, 1990); 외상(참고 문헌: Ann. Neurol.23, 623-626, 1988); 간질(참고 문헌: Neurosci.,12, 557-567, 1984) 및 특정 신경퇴행성 질환(참고 문헌: Science227, 1496-1498, 1985; Neuron1, 623-634, 1988; Trends Pharmac. Sci.11, 379-387, 1990; Neurol.40, 32-37, 1990; Ann. Neurol.31, 119-130, 1992)을 포함하는 몇몇 급성 손상을 포함한다.
반응성 산소 종에 의해 유발되는 산화적 스트레스는 다수의 동일한 급성 및 만성 질병을 포함하는 또 다른 손상 메카니즘을 나타낸다(참고 문헌: Stroke9, 445-447, 1978; Proq. Brain Res.63, 227-235, 1985; J. Neurosurq.64, 803-807, 1986; Cerebrovas. Brain Mezab. Rev.1, 165-211, 1989; Free. Radic. Biol. Med.6, 289-301, 1989; J. Neurochem.59, 1609-1623, 1992). 반응성 산소 종(예: 수퍼옥사이드 라디칼)은 세포막 지질의 과산화, 수송 단백질의 불활성화, 및 미토콘드리아에 의한 에너지 생성의 억제와 같은 세포 성분에 대해 산화적 손상을 일으킨다.
이러한 두 사실, 글루타메이트 독성자극성 및 산화적 스트레스는 서로 연결될 수 있다: 반응성 산소 종의 형성은 글루타메이트 수용체의 과자극의 직접적인 결과로 발생하므로(참고 문헌: Soc. Neurosci. Abs.18, 756, 1992; Nature364, 535-537, 1993) 글루타메이트 신경 독성의 성분을 조정할 수 있다(참고 문헌: Neuron.1, 623-634, 1988; Science262, 689-694, 1993). 다시 말해, 독성자극성은 반응성 산소종의 양을 감소시키는, Cu, Zn-수퍼옥사이드 디스뮤타제 및 카탈라제(참고 문헌: J. Neurochem.49, 1222-1228, 1987; Acta Neurochirurgica51, 245-247, 1990), 21-아미노-스테로이드 "라자로이드(lazaroids)"(참고 문헌: Neuron5, 121-126, 1990), 비타민(참고 문헌: J. Neurochem.49, 1222-1228, 1987); 21-아미노-스테로이드 "라자로이드"와 비타민 E의 동족체, 트로록스(참고 문헌: Brain Res.639, 102-108, 1994)를 포함하는 유리 라디칼 스캐빈저, 페닐부틸-N-니트론과 같은 스핀-포획제(참고 문헌: Brain Res.574, 193-197, 1992) 및 우비퀴논 동족체, 이데베논(참고 문헌: Neurosci. Lett.178, 193-196, 1994)에 의해 감소될 수 있다.
유리 라디칼 스캐빈저는 외상성 또는 저산소성/허혈성 CNS 손상의 생체내 모델뿐 아니라 시험관내 모델에서 신경 보호적이다. N-메틸-D-아스파테이트 및 AMPA/카이네이트 수용체 길항제는 산소-글루코즈 결핍 손상에 대해 시험관 내에서 신경 보호적이고(참고 문헌: Neuron1, 623-634, 1988; J. Neurosci.13, 3510-3524, 1993), 허혈증의 동물 모델에서 뇌 조직의 손실을 감소시킨다(참고 문헌: Science226, 850-852, 1984; Science247, 571-574, 1990). 유리 라디칼 스캐빈저는 또한 시험관 내에서 독성자극성 뉴론의 사멸에 대해 보호하고(참고 문헌: J. Neurochem. 49, 1222-1228, 187; Neuron 5. 121-126, 1990), 생체 내에서 허혈성 손상을 감소시킨다(참고 문헌: Amer. J. Physiol.256, H589-593; Stroke21, 1312-1317, 1990; Stroke22, 896-901, 1991; Free Rad. Biol. Med.12, 29-33, 1992). 유리 라디칼 스캐빈저 효소, Cu, Zn 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD)를 과발현시킨 유전자전이(transgenic) 동물은 글루타메이트 독성(참고 문헌: Acta Neurochirurgia51, 245-247, 1990) 및 허혈성 뇌 손상(참고 문헌: Ann. Neurol.29, 482-486; Proc. Natl. Acad. Sci., USA88, 11158-62, 1991)에 대한 내성을 갖는다.
계획된 세포사멸(cell death) 또는 세포소멸(apoptosis)은 또한 특정 신경성 질병 상태에서의 세포사멸에 기인한다. 예를 들면 세포소멸은 허혈증-재관류 후 지연된 뉴론의 퇴행 일을 조절하고(참고 문헌: J. Neurochem.61, 1973-1976, 1994; Neuroreport5, 493-496, 1994), 특정 신경퇴행성 질병에서 뉴론 세포사멸의 인자일 것이다(참고 문헌: Neurosci. Lett.170, 191-194, 1994). 유리 라디칼 산소 종에 의한 산화적 스트레스는 세포소멸을 일으킬 수 있는 손상 중 하나일 것이고(참고 문헌: Nature356, 397-400, 1992; Neurotoxicol.15, 81-91, 1994; J. Natl. Cancer Inst.86, 1286-1295, 1994), 그러므로 유리 라디칼 스캐빈저는 또한 계획된 세포사멸을 제한할 수 있다(참고 문헌: J. Neurochem.62, 376-379, 1994; Neurosci. Abs.20, 432, 1994). Bcl-2는 세포소멸에 대해 세포 보호적 효과를 조정하는 유리 라디칼 스캐빈지 경로에서 작용한다고 나타난다(참고 문헌: Cell.75, 241-251, 1993).
본 발명의 주 목적은 유리 라디칼에 의해 야기되는, 특히 유리 라디칼이 글루타메이트 신경 독성의 결과로서 방출되는 질병의 치료 또는 예방에서, C60(C(COOH)2)n의 카복실화 유도체(여기서 C60은 부크민스테르풀레렌이고, n이 1 내지 4의 정수이다)의 용도, 상응하는 약제를 제조하기 위한 이러한 화합물의 용도 및 이를 함유하는 약제에 관한 것이다. 본 발명의 의미 내에 신경 독성 손상을 치료한다는 것은 신경 독성 사실에 의한 손상으로 인해 글루타메이트가 방출되는 중추 뉴론 주변에서, 중추 뉴론에 대한 손상의 정도를 감소시킴을 의미한다. 신경 독성 사실은, 예를 들면 발작 동안 발생하는 저산소증/허혈증, 저혈당증, 간질 또는 외상과 같은 급성 신경성 손상을 포함한다. 신경 독성 사실은 또한 신경퇴행성 질환, 예를 들면 헌팅톤 질병, 알츠하이머 질병, 근위축성 측색경화증("ALS") 및 AIDS의 신경퇴행성 효과에 의해 유발되는 만성 신경성 손상일 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 신경 독성 손상이 발생하는 질병을 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명의 추가의 목적은, 신경 독성 손상이 뉴론의 NMDA 수용체의 글루타메이트에 의한 자극으로 뉴런에 의해 방출되는 아라키돈산의 대사에 의해 유발되는 환자에서 신경 독성 손상을 억제하기 위한 부크민스테르풀레렌의 용도, 및 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 상기 기술한 카복시풀레렌을 상기 신경 독성 손상을 억제하기에 충분한 양으로 포함하는 약제에 관한 것이다.
아라키돈산("AA")은, 글루타메이트(세포 독성 사실 자체에 의해 손상된 뉴론에 의해 방출된 글루타메이트)에 의한 NMDA 수용체의 자극으로 인해 발생한 과량의 Ca2+가 뉴론 세포로 유입되어 뉴론으로부터 방출된다. 과량의 Ca2+의 유입은 AA를 유리시켜 세포막을 붕괴하는 포스포리파제 A2, 칼슘-의존성 효소를 활성화시킨다. 내인성 리폭시게나제 및 사이클로옥시게나제에 의한 AA의 대사는 뉴론 지질막의 과산화적 변성을 수행하는 산소 유리 라디칼의 생성을 유도하고(참고 문헌: Acta Physiol. Scand.492, 121-128, 1980; Proq. Brain. Res.63, 227-232, 1985), 그 결과 뉴론이 손상 또는 사멸하게 된다. 그러므로 본 발명에 따라서, 본원에서 기술한 유리 라디칼 스캐빈지하는 카복시풀레렌을 포함하는 조성물을 투여하여 산소-유도된 유리 라디칼을 감소시킴으로써 글루타메이트-유발된 신경 독성을 억제하는 또 다른 메카니즘을 제공한다.
본 발명의 바람직한 목적은 발작을 치료하기 위한 상기 언급한 화합물의 용도를 포함한다. 본 발명에 따라서, 발작은 신경 독성 사실이 뇌의 뉴론으로의 혈액량 감소로 인해 발생한 환자의 뇌에서 급성 신경 독성 사실로서 기술된다.
본원에서 기술한 카복시풀레렌 화합물은 활성 화합물 및 상기 화합물과 혼화성인 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제로서 전신적으로 투여된다. 이러한 약제를 제조하는데, 통상의 약제학적으로 허용되는 담체가 사용될 수 있다. 약물이 경구로 투여될 경우, 일반적으로 규칙적인 간격으로 투여된다.
치료적 용도에서, 본 발명에 따른 유용한 화합물은 약물이 통상적으로 투여되는 경로에 따라 투여될 수 있다. 이러한 경로는 경구뿐 아니라 정맥내, 근육내, 피하, 주사, 복막내, 국부 경로를 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 방법은 경구 또는 정맥 경로로 투여될 수 있다.
약제는 경구 투여용 고체 형태, 예를 들면 정제, 캡슐, 환제, 산제, 과립제 등을 포함하는 통상의 형태로 제조될 수 있다. 약제는 살균될 수 있고/거나 보조제, 예를 들면 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 다양한 삼투압에 대한 염 및/또는 완충제를 함유할 수 있다.
정맥내 투여용 통상의 제제는 물/완충 용액을 포함하는 살균 수용액일 것이다. 정맥내 비히클은 액제, 영양 및 전기분해적 재공급을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제는 또한 항생제 및 항산화제일 수 있다. 볼러스 정맥 투여용 약제는 본원에서 기술한 카복시풀레렌 10㎎/㎖(10,000㎎/ℓ) 이하를 함유할 수 있다. 점적 정맥 투여용 약제는 바람직하게는 본원에서 기술한 카복시풀레렌 약 50㎎/ℓ 내지 약 500㎎/ℓ를 함유한다.
본 발명에 따른, 본원에서 기술한 카복시풀레렌은 약제학적으로 허용되는 경구 형태로 유용하다. 이 약제는 약제학적으로 허용되는 혼화성 담체 물질과 함께 상기 화합물을 함유한다. 통상의 담체 물질이 사용될 수 있다. 정제, 캡슐제, 환제, 산제, 과립제 등과 같은 통상의 경구 복용형이 사용될 수 있다. 담체 물질은 경구 투여용으로 적합한 유기 또는 무기 불활성 담체 물질일 수 있다. 적합한 담체는 물, 젤라틴, 아라비아검, 락토오즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트 , 활석, 식물성유, 폴리알킬렌-글리콜, 석유 젤리 등을 포함한다. 또한, 약제는 기타 약제학적 활성제를 함유할 수 있다. 추가의 첨가제, 예를 들면 향미제, 보존제, 안정화제, 유화제, 완충제 등은 약제학적 화합물의 허용되는 방법에 따라서 가해질 수 있다.
바람직한 경구 복용형은 정제, 경질 또는 연질 젤라틴, 메틸셀룰로즈 또는 소화 기관에서 용이하게 용해된 또 다른 적합한 물질의 캡슐제를 포함한다. 본 발명에 따르는 경구 복용형은 처방 주치의가 결정하는 각 환자의 필요에 따라 다양할 것이다. 바람직한 경구 복용형은 본 발명에 따르는 유용한 카복시풀레렌의 50 내지 500㎎을 함유하는 캡슐제 또는 정제이다.
본 발명의 방법을 수행하는데 있어서, 본 발명에 따른 유용한 화합물은 일반적으로 성인 1일, 바람직하게는 경구 또는 정맥내로, 1일 단독 또는 분할 용량으로 약 1.5㎎/kg 내지 약 1500㎎/kg, 바람직하게는 1일 약 10㎎/kg 내지 약 60㎎/kg 투여되고, 정확한 복용량은 환자의 필요에 따라 다양할 것이다. 일반적으로 이 치료법은 약 3 개월 동안 수행된다. 또는 본 발명의 방법은 예방학적으로 매우 위험한 급성 신경 독성 사실, 예를 들면 발작을 겪고 있는 환자에게 무제한적 시간 동안 수행한다. 급성 신경 독성 사실의 치료를 위해, 환자는 급성 신경 독성 사실의 진단 후 가능한 한 빨리, 바람직하게는 신경 독성 사실 발병의 12시간 내에, 가장 바람직하게는 6시간 내에 본 발명의 방법에 따라서 치료되어야 한다.
도 1 내지 11은 본 발명을 더욱 상세히 나타낸다.
도 1a 및 1b는 헥사카복시풀레렌, C60(C(COOH)2)3, 이성체 O-3a 및 R-3b의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 양성자 NMR 분광기에 의한 정제된 C60(C(COOH)2)3말론산 에스테르(O-3a 에난티오머)의 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 3은 신속-전자 충격 질량 분광기에 의한 정제된 C60(C(COOH)2)3말론산 에스테르(O-3a 에난티오머)의 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 4는 H2O2(A: 비처리, B: O-3a 에난티오머로 처리) 및 수퍼옥사이드 라디칼 O2(C: 비처리, D: O-3a 에난티오머로 처리, E: R-3b 에난티오머로 처리)에 대한, C60(C(COOH)2)3의 유리 라디칼 스캐빈징 활성을 나타내는 전자 상자성(paramagnetic) 공명 스렉트럼이고, 화살표는 EPR 공동에서 오염에 의해 형성된 인공 생성물의 시그날을 표시한 것이다.
도 5는 배양 뉴론을 비처리 및 3가지 농도의 C60(C(COOH)2)3로 처리한 NMDA에 노출시켜 생성된 신경 독성을 도시한 것이다.
도 6은 배양 뉴론을 비처리 및 4가지 농도의 C60(C(COOH)2)3로 처리한 AMPA에 노출시켜 생성된 신경 독성을 도시한 것이다.
도 7은 C60(C(COOH)2)3의 공동-적용 존재 및 부재하에 배양된 뉴론에서 추적자45Ca2+의 NMDA-자극된 축적을 도시한 것이다.
도 8은 비처리 및 2가지 농도의 C60(C(COOH)2)3로 처리한 혈청 결핍에 의한 글리아-결핍 배양에서 생성된 세포소멸성 뉴론의 세포사멸을 도시한 것이다.
도 9는 두 종의 C60(C(COOH)2)3이성체의 유리 라디칼 스캐빈징 활성을 비교한 EPR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 10a, 10b 및 10c는 NMDA(도 10a) 및 AMPA-유발된 뉴론의 사멸(도 10b)의 적용에 의해 생성된 손상으로부터 뉴론을 보호하는데 있어서 두 종의 C60(C(COOH)2)3이성체의 비교이고, 마우스 뇌로부터의 지질내로 혼입된 스핀-표지된 지질(5- 또는 16-독실 케토스테아르산)(도 10c)+ 두 종의 C60(C(COOH)2)3이성체의 EPR 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 11은 식염수 또는 카복시풀레렌 15㎎/kg/일을 함유하는 복막내 미니-삼투압 펌프를 사용하여 처리된 FALS 마우스의 생존 곡선을 도시한 것이다.
본원의 데이터는 상술한 카복시풀레렌이 다중 산소-유도 유리 라디칼이 스캐빈저로서의 능력을 갖는 신규한 항산화제 부류이고, 이 화합물이 특히 광범위하고 강력한 신경 보호력을 갖고, 글루타메이트 독성자극성으로 인한 뉴론 사멸 및 세포소멸을 약화시킨다고 나타낸다.
용액
배지 스톡(MS)은 글루코즈 25mM을 갖고, L-글루타민이 없는 이글스 필수 최소 배지(Eagle's Minimal Essential Media)로 이루어져 있다.
평판 배지는 L-글루타민(2mM), 송아지 혈청 5% 및 말 혈청 5%가 공급된 MS 로 이루어져 있다.
성장 배지는 MS, 말 혈청 10% 2mM L-글루타민으로 이루어져 있다.
NMDA에 대한 간단한 노출은 NaCl 116mM, KCl 5.4mM, MgSO40.8mM, NaPO41.8mM, HEPES 12mM, NaHCO325mM, D-글루코즈 5.5mM, 10M L-글리신을 함유하는, HEPES-완충 발란스 염 용액, pH 7.40(HBBSS)에서 수행한다.
발란스 염 용액(BSS)는 NaCl 116mM, KCl 5.4mM, MgSO40.8mM, NaPO41.8mM, NaHCO326.2mM 및 D-글루코즈 5.5mM로 이루어져 있다.
C60(C(COOH)2)3의 본래 이성체는 합성의 주 생성물인 O-3a 이성체이다. 이 화합물의 스톡은 물중 25mM 용액으로 제조된다. 스톡을 제조하여 72시간 내에 사용하고, -20℃의 암소에서 저장한다.
미개질 C60을 톨루엔에 용해시키고 50mM 스톡을 제조한다.
피질 세포의 배양
마우스 신피질 배양물은 뉴론-성상세포 공동-배양물로서(약 50% 성상세포)(참고 문헌: Rose et al., 1992) 또는 뉴론 배양물(〈2% 성상세포)로서 제조된다. 마우스 태아(수임된지 15일)를 마취 상태의 임신한 스위스-웹스터 마우스로부터 제거하고, 신피질을 다른 뇌 구조물로부터 절단 제거한다. 트립신에서 짧게 배양한 후, 세포를 연마하여 분리하고, 이어서 세포 현탁액을 평판 배지에서 희석하고 미리 준비된, 폴리-D-라이신/라미닌으로 코팅한 24-웰 플라스텍 배양 플레이트 위로(뉴론 배양용) 또는 성상세포의 존재 베드 위로(공동-배양용) 도말한다. 시험관 내에서 1 내지 2일 후, 글리아 조건화된 배지와 부분적으로 교환되어 "순수" 뉴론 배양물을 제조하고, 사이토신 아라비노사이드(3μM)을 공급 후 즉시 가하고 글리아 증식을 억제한다. 혼합 배양물은, 2mM L-글루타민을 함유하는 혈청-유리 MS와 함께 공급할 경우 시험관 내에서 11 내지 12일까지 성장 배지와 함께 공급된다. 다른 언급이 없는 한, 세포는 시험관 내에서 14 내지 16일 사용된다.
실시예 1
카복시풀레렌(2,2-풀레로말론산)의 합성 및 성질
디에틸 2,2-풀레로말론산 에스테르.C60(1g, 1.39mmol)을 신선하게 증류된 톨루엔(1000㎖)에 가하고, 수분 동안 교반하여 투명한 보라색 용액을 수득한다. 디에틸 브로모말로네이트(0.474㎖, 2.78mmol)을 교반 용액에 적가한다. DBU(1,8-디아조비사이클로[5,4,0]-운덱-7-엔) 0.526㎖(3.475mmol)을 풀레렌 용액에 가하면 색이 보라색에서 암적색으로 변한다. 실온, 공기에서 밤새 교반한 후 용액을 여과하여 암모늄염을 제거하고, 용매를 바러스(varus)에서 증발시킨다. 잔사를 소량의 클로로포름에 용해시키고 실리카겔 칼럼(충전 물질은 70-230 메시 또는 230-240 메시 플래시 크로마토그래피 겔, 제조원: 머크)의 상부로 가한다. 풀루렌 생성물을 톨루엔/헥산(1:1)으로부터 톨루엔(100%)의 구배를 사용하여 용출시킨다. 초기 용출에서는 미반응 풀루렌, 모노부가물, 바이부가물, 트리부가물, 멀티부가물 5분획을 수득한다. 각 분획의 용매를 진공에서 제거하고 순수해질 때까지 고체 잔사를 반복적으로 크로마토그래피한다. 바이부가물 및 트리부가물 각각을 함유하는 분획을 재분리하여 두 종의 주요 생성물을 수득한다.
2,2-풀레로말론산(들).에스테르 부가물(100㎎)의 단일 이성체를 함유하는 샘플을 질소하에서 톨루엔(50㎖)에 용해시킨다. 이어서, NaH의 20:1몰과량을 가한다. 100℃에서 2 내지 3시간 교반한 후, 메탄올 1㎖을 고온 용액에 적가하면 기체가 생성된다. 동시에 정량적으로 나트륨 염의 침전이 발생한다. 염을 원심분리하여 회수하고 진공하에 건조시킨다. 건조 화합물을 2M H2SO4, 이어서 물로 세척한다. 상응하는 유도체의 말론산 유도체인 생성물을 밤새 진공에서 건조시켜 미세 갈색 분말을 수득한다.
트리부가물 풀레렌 에스테르의 O-3a 에난티오머를 함유하는 샘플을 질량 분광기로 분석하고, 이어서 이 에스테르를 가수분해하고 산성화시켜 최종 카복시풀레렌 화합물, C60(C(COOH)2)3을 수득한다. 정제 C60에스테르의 양성자 NMR 및 질량 스펙트럼(도 2 및 3, 각각)에서는 샘플이 부가물의 분열로부터 발생할 수 있는 소량의 C60(질량=720)을 갖는 2,2-풀레렌말론산 에스테르의 단일 이성체(질량=1194/1195를 갖는 O-에난티오머)를 함유한다고 나타난다. 그 결과 본래의 화합물, O-3a 에난티오머를 본원에 기술한다. 또한 최근의 연구에서는 다른 에난티오머, R-3b도 효과적인 신경 보호제라고 나타낸다.
카복시풀레렌의 용액은 투명한 갈색이다.
그러나, 진한 용액(50mM) 나일론 필터 0.45mm를 통해 여과한 후 필터상에 어떠한 잔사도 남아있지 않아 순수 용액임을 나타낸다. 대조군 실험에서는 화합물이 색도 측정 LDH 검정과 간섭하지 않음을 증명한다. 카복시풀레렌 25mM 이하의 용액은 실험 용액의 pH를 변화시키지 않는다.
실시예 2
자극성 아미노산 독성 및 풀레레놀의 적용
전자 상자성 공명 분광기에 의해 C60(C(COOH)2)n화합물은 하이드록실 및 수퍼옥사이드 라디칼 둘 다를 제거할 수 있는, 효능있는 유리 라디칼 스캐빈저임이 증명되었다. 도 4는 C60(C(COOH)2)3의 유리 라디칼 스캐빈징 활성을 나타내는 EPR 스펙트럼 A 내지 E를 나타낸다. 스펙트럼 A 및 B 각각은 15분 이상 동안 H2O2에 의해 형성된 하이드록실 라디칼(스핀 부가물: DMPO-OH) 및 O-3a 이성체 15OM가 H2O2와 함께 포함되는 경우, 이 OH 시그날의 제거를 나타낸다. 수퍼옥사이드 라디칼(O2 -)는 또한 C60(C(COOH)2)n화합물에 의해 효과적으로 스캐빈지된다. 스핀 부가물 DMPO-OOH을 형성하는 O2 -는 크잔틴 옥시다제를 크잔틴(스펙트럼 C)과 함께 항온처리함으로서 생성된다. 40 M O-3a 이성체 또는 40 M R-3b 이성체와의 공동-항온처리는 수퍼옥사이드 라디칼 시그날을 제거한다(각각 스펙트럼 D 및 E). 기타 수-가용성 n이 1 또는 2인 C60(C(COOH)2)n화합물의 EPR 분석으로 이 화합물이 또한 효과적인 유리 라디칼 스캐빈저임을 확인한다(데이타 미제시).
헥사카복실화 화합물, C60(C(COOH)2)3은 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 및 아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸 프로피온산(AMPA)에 노출되어 생성된 독성 자극성 손상에 대해 보호된 피질 뉴론 50mM 이상에서 수용성이다. 디카복시 및 테트라카복시 풀루렌 유도체는 수용액에서 덜 용해되나, 반면 함유하는 신경 보호적 활성은 헥사카복시 유도체보다 덜 효과적인 신경 보호제이다.
카복시풀레렌 (3-300 (M))은 신경 보호의 평가를 위해 NMDA와 함께 상기 언급한 뉴론-성상 세포 공동-배양액에 공동-적용시킨다. 카복시풀레렌의 존재하에 NMDA에 신속한 노출은 배지를 HBBSS로 3회 교환한 후 10분 동안 NMDA 50μM 내지 500μM + 카복시풀레렌을 가함으로써 수행된다. NMDA 및 카복시풀레렌은 배지를 MS로 4회 교환하여 제거하고 배양액을 습윤된 CO2(5%), 37℃ 배양기에 24시간 동안 넣고, 손상의 정도를 평가한다.
AMPA 5-100 (M)에 지연된(24시간) 노출은 일반적으로 피질 뉴론의 손상을 생성시키는데 사용된다. 또 다른 일련의 실험에서, 카복시풀레렌(3300 (M))을 신경 보호의 평가를 위해 AMPA와 함께 상기 언급한 뉴론-성상 세포 공동-배양액에 적용시킨다. 배지를 MS, AMPA로 2회 교환하고, 카복시풀레렌을 가한 후, 배양액을 37℃ 배양기에 다시 넣는다. NMDA 수용체 길항제, MK-801(10 (M))이 AMPA 및 카복시풀레렌을 포함하여 내인성 글루타메이트 방출에 의한 NMDA 수용체의 2차 활성을 제거한다.
뉴론의 사멸은 NMDA 또는 AMPA를 투여한 후 24시간에 위상차 현미경 200-400×에 의해 사멸 세포로부터 배양 배질로의 락테이트 디하이드로게나제(LDH)의 유출을 측정함으로써 평가한다(참고 문헌: Koh and Choi, 1987). 세포사의 정량적인 양은 트립판 블루 또는 프로피듐 이오디드 염색 및 세포 계수에 의해 일부 실험에서 확인된다.
C60(C(COOH)2)3의 결과는 도 5 및 6에 나타낸다. C60(C(COOH)2)3은 NMDA(도 5) 및 AMPA-유발된(도 6) 독성 자극성 뉴론의 손상에 대한 확실한 신경 보호를 나타내었다. 여지껏 수행된 모든 실험에서 C60(C(COOH)2)3300(M)은 NMDA로부터 뉴론의 사멸을 60% 이상으로 감소시키고 일부 실험에서는 거의 완전한 보호를 수득하였다. 세척된 대조군에 존재하는 LDH의 양을 공제하여 NMDA 독성에 대한 신호 특성을 수득한다. 데이터는 NMDA단독으로 제조된 세포사의 %를 그래프로 나타낸다: 이 노출로 배양액 당 총 뉴론의 51(9,44(6, 및 88(14%)를 사멸시켰다. 평균(S.D.)이고, *=p〈0.05 vs. NMDA를 ANOVA에 의해, 이어서 다중 비교에 대한 스튜던트-뉴맨 케울스 시험(Student-Newman-Keuls test)에 의해 수행한다. 세 실험으로부터의 모든 데이터(도 5)는 뉴론 세포사에서 75% 감소를 나타낸다.
C60(C(COOH)2)3은 100(M)에서 AMPA로부터 〉80% 까지 뉴론 세포사를 감소시킨다(도 6). MK-801(10 (M))을 AMPA와 배양하여 방출된 내인성 글루타메이트에 의해 NMDA 수용체의 2차 활성을 제거한다. 값은 네 가지 실험으로부터의 모든 데이터의 평균(SEM, n이 3-4/실험)이다. 데이터는 AMPA/MK-801 단독에 의해 생성된 세포사의 %로서 그래프로 나타내고, 총 뉴론/배양의 40 내지 70%를 나타낸다. *=p〈0.05 vs. NMDA를 ANOVA에 의해, 이어서 다중 비교에 대한 스튜던트-뉴맨 케울스 시험에 의해 수행한다.
본원에 기술한 실험은 세포 보호제 또는 항산화제로서 이러한 화합물의 제1 용도는 본 발명자들의 지식내에 있다.
실시예 3
45 Ca 2+ 추적자 실험
NMDA-유발된 뉴론의 세포 손상에 대한 보호는 NMDA-유발된 칼슘 유입의 감소에 의한 것이 아님을 밝히기 위해45Ca2+추적자 연구를 수행한다. 배양액을 HBBSS로 2회 세척한 후, 추적자45Ca2+를 함유하는 HBBSS내에서(0.5Ci/배양 웰; NEN, Boston, MA) 단독 또는 C60(C(COOH)2)3와 함께에 NMDA(300(M))에 노출시킨다. 노출은 10분 후 배지를을 비표지 HBBSS로 4회 교환한 후, 0.2% 나트륨 도데실 설페이트(SDS)를 가하여 세포 용해시켜 종결시킨다. 세포를 2시간 동안 SDS에서 방치하고, 이어서 용융물을 섬광 바이알에 옮긴다. SDS로 각각의 배양액을 추가로 잘 세척하고 바이알에 가하고 이어서 계수한다.
도 7의 결과는 카복시풀레렌이 NMDA 수용체 길항제가 아님을 나타낸다.45Ca2+의 축적은 C60(C(COOH)2)3300(M) 이하의 공동-적용에 의해 NMDA에 영향을 주지 않는다. 모든 조건으로부터 기본45Ca2+을 공제하여 NMDA 수용체 활성에 대한45Ca2+증가 특성을 수득한다. 평균(SEM, n=4).
실시예 4
혈청 결핍 세포소멸성 뉴론의 사멸
글리아-결핍 배양액의 세포체 수축, 뉴론 조작의 단편 및 훽스트 33258 염색에 의한 염색질 축합과 같은 형태 변화가 특징인 피질 뉴론은 혈청의 제거 후 24 내지 48시간 동안 세포소멸성 세포사를 일으킨다(참고 문헌: Dugan et al., 1995). 혈청 결핍에 의한 세포소멸성 뉴론 사멸은 또한 헥사카복시풀레렌의 공동-적용에 의해 약화된다. 이 손상은 DNA 레더링, 염색질 클럼핑, 세포 수축, 세포소멸체의 형성 및 거대분자 합성 억제제에 의한 보호를 포함하는 통상의 세포소멸의 특징을 갖는 다고 나타난다. 1% 미만의 성상 세포를 함유하는 배양액 중의 피질 뉴론은 혈청-함유 성장 배지을 아미노산(글루타민 제외)을 첨가한 발란스 염 용액으로 교환함으로써 혈청을 제거한다. 세척한 대조군을 BBS내에 2% 송아지 혈청, 2% 말 혈청을 함유하는 배지로 다시 넣는다. 24 및 48 시간 후, 세포를 위상차 현미경 100-400X를 사용하고, 니콘 역 현미경을 사용하여 사진찍는다.
또한, 뉴론 세포의 사멸은 혈청을 제거한 지 48시간에 트립판 블루를 더 이상 제외할 수 없는 세포를 계수함으로써 측정한다. 도 8에 나타낸 바대로, 뉴론 세포의 사멸은 혈청 결핍 발생한 지 48시간에 트립판 블루를 더 이상 제외할 수 없는 세포를 계수함으로써 측정하고, 뉴론의 사멸에서 유의적 감소를 나타낸다. C60(C(COOH)2)310(M)로 처리한 세포는 뉴론의 사멸에서 50% 감소를 나타낸다. 혈청-함유 배지에서 유지되는 세척한 대조군 배양액에서는 거의 사멸하지 않는다. 값은 평균(SEM, n=3-4/실험)이다. 이 실험은 3회 실험의 대표적인 것이다. *=p〈0.05 vs. 혈청-결핍이고, ANOVA에 의해 이어서 다중 비교에 대한 스튜던트-뉴맨 케울스 시험에 의해 수행된다.
실시예 5
C 60 의 카복실 그룹의 극성 위치는 신경 보호적 효능을 개선시킨다
C60(C(COOH)2)3의 두 종의 레지오이성체, O-3a 및 R-3b는 합성한 후 람파르트 및 히르스크 방법으로 정제한다(참고 문헌: Lamparth and Hirsch(1990)). 이러한 화합물의 순도는 NMR 및 자외선/가시광선 스펙트럼 분석에 의해 증명된다. O-3a 화합물에서, 모든 메타노 결합은 서로에 대해 e(quatorial, 적도)위치이고(e,e,e), 분자는1H 및13C 분광 분석에 나타낸 바대로 C3대칭이다. 화합물 R-3b는 트랜스-3 위치에서 C60구조의 3배 축에 대한 적도를 따르는 벨트에서 메타노 결합을 갖고(트랜스-3, 트랜스-3, 트랜스-3), D3대칭이다. 도 1에 나타낸 3-D 구조는 O-3a의 카복시 그룹의 극성 분포와 R-3b의 카복시 그룹의 적도 분포를 예시한다.
도 9에서는 스핀-포획/EPR 스펙트럼에서 정의한 바대로 이러한 두종의 이성체가 화학적으로 ˙OH 및 O2˙-유리 라디칼을 스캐빈지하는 유사한 능력이 있음을 나타낸다. 도 9는 스핀-포획제로서 100mM 5,5-디메틸-1-피롤린-N-옥사이드(DMPO)을 사용하여 ˙OH(펜톤 반응에 의한 Fe2+에서 100μM H2O2로부터)및 O2˙-(크잔틴+크잔틴 옥시다제로부터)의 EPR 스펙트럼을 나타낸다. 하이드록실 라디칼(왼쪽 스펙트럼)은: DMPO 단독(위), 4μM O-3a(중간) 또는 4μM R-3b(밑) 존재하의˙OH이다. 수퍼옥사이드 라디칼(오른쪽 스펙트럼)은: DMPO 단독(위), 4μM O-3a(중간) 또는 4μM R-3b(밑) 존재하의 O2˙-이다. 화살표는 공동에서 미지의 라디칼에 의한 위조 시그날이다. 샘플은 Bruker 200, X-밴드 EPR 분광기내의 석영 플랫 셀(60×10×0.025mm)에서 분석한다. 세팅은 전력=1.6mW, 변조=1G, 장변조=100Hz, R.G.=3.2×105이다.
EPR이 결과 O-3a 및 R-3b 이성체 둘 다는 대부분의 기타 유리 라디칼 스캐빈저에 대해 보고된 바보다 낮은 100 내지 1000배 농도의˙OH의 매우 강력한 스캐빈저임을 나타낸다. ˙OH에 대한 카복시풀레렌의 스캐빈지 능력은 O2˙-라디칼에 대한 효능보다 10배 더 높다.
O-3a 및 R-3b 이성체는 EPR 분석에 의해 동등한 항산화제이지만, O-3a 화합물이 NMDA 및 AMPA 수용체-매개된 둘다의 손상 대해 R-3b 보다 더 생물학적으로 효과적이다. 이러한 결과는 도 10에 나타낸다. 도 10은 O-3a가 NMDA의 적용에 의해 생성된 손상으로부터 약간 더 나은 보호를 제공하나(A) 실질적으로 AMPA-유발된 뉴론의 사멸에 대한 더 나은 보호를 제공한다(B). 값은 평균 ±SEM이고, n은 조건당 8 내지 12이다. *=p〈0.05 vs. 비처리 손상 조건이고, ANOVA에 의해 이어서 다중 비교에 대한 스튜던트-뉴맨 케울스 시험에 의해 수행된다. **=p〈0.05 R-3b는 O-3a와 상이하다. 도 10은 또한 마우스 뇌로부터의 지질에 혼입된 스핀-표지된 지질(C)(5- 또는 16-독실 케토스테아르산) + O-3a 또는 R-3b의 EPR 스펙트럼을 나타낸다. 스핀 표지를 성체 마우스 뇌로부터 추출한 지질에 1:100의 비율로 가한다. EPR 세팅은 도 9의 레전드에 나타낸 세팅과 동일하다. 이성체 둘 다는 5-독실 그룹의 순차 파라미터(S)에서의 이동을 형성하나 O-3a는 S에서 더 큰 변화를 형성시킨다(표 1). 또한 O-3a는 R-3보다 큰 정도로 16-독실 케토스테아르산으로부터 지질 상태 시그날을 변형시키고, O-3a가 지질의 불규칙성 또는 유동성을 증가시킨다고 나타낸다(표 1). 두 결과로, O-3a가 R-3b보다 더 큰 정도로 지질 이중층으로 도입된다는 것을 알 수 있다.
NMDA 및 AMPA 수용체-매개된 손상으로부터의 뉴론 보호에 대한 큰 활성 이외에, O-3a는 내피질 세포 배양 및 간세포에서의 이러한 손상으로부터 R-3b보다 증진된 보호를 제공한다. 이 차이점은 R-3b보다 O-3a가 명백하게 막에 더 잘 도입되는 O-3a 이성체의 능력에 기인한다. O-3a의 극성도는 이를 더 용이하게 세포막에 도입시킬 수 있다. 막 사이에 끼워넣는 능력은 O-3a가 R-3b 보다 지질 과산화로부터 세포막의 더 나은 보호를 제공한다고 제안한다. 따라서 작용 그룹의 위치(극성 vs. 원주)는 C60유도체의 보호 효율에서 중요하다.
스핀-표지/EPR 실험으로부터의 막 파라미터
화합물 순차 파라미터a 상관 시간b 지질/수성 분배 인자c
O-3a 0.84±0.01 5.7±0.5ns 1.0±0.2
R-3b 0.86 4.5 0.6
대조군 0.88 5.1 0.8
a 순차 파라미터, S=a(TI'-TL')/(TI-TL), 여기서 TI'은 5-독실스테아르산 스피 표지/인지질에서 수평 방향에 대해 측정된 미세한 분열이고, TL'은 수직 방향이다. 본 발명자들은 a=1이고, TI-TL=25G라고 가정한다.
b 상관 시간, τC는 6.5×10-10 wo[(ho/h-1)-1], 여기서 wo는 가우스의 미드-필드 라인의 폭이고, ho및 h-1는 5-독실스테아르산에서 측정된 1차 유도체 흡수에 대한 미드- 및 하이-필드 라인의 피크 높이이다.
c는 지질/수성 분배 인자, f=hL/hA이고, hL및 hA가 16-독실-스테아르산에 대해 측정된 지질 및 수성상의 피크 높이이다. 본 발명자들은 유효한 비교에 대해 hA의 총 높이의 1/2이다.
실시예 6
근위축성 측색경화증의 유전자전이 모델에서 생존에 대한 카복시풀레렌의 효과
10,000 개체중 하나는 대부분의 운동성 뉴론 질병으로 인한 사망의 일반적인 대부분의 원인인 ALS를 포함한다. 질병의 공지 형태(FALS)는 일반적으로 각 경우의 10 내지 15%로 이루어진 상염색체성 우성이다. 1993년에, FALS를 갖는 특정 계의 Cu, Zn-SOD(sod1) 유전자에서의 돌연변이체를 분리하는 중요한 발전을 이루었고(참고 문헌: Rosen et al., 1993), 이어서 이 업적은 ALS가 FALS의 일부 형태에서 돌연변이 SOD1에 의해 반응성 산소 종(ROS)의 증진된 생성으로 인한다는 가설을 유도할 수 있다.
거니 등(Gurney)은 FALS 계에서 발견된 G93A 지점 돌연변이를 갖는 마우스를 개발하였고(참고 문헌: Gurney et al., 1994), G93A 트랜스제닉 마우스의 G1 라인은 사람 FALS의 특징을 다수 나타낸다. 야생형 동물의 SOD 18복사 및 4배를 갖는 G1 라인은 3-4개월생 마우스의 운동성 뉴론 사멸이 후사지(hindlimb)의 약화, 손상된 그루밍(grooming) 및 측복부의 수척으로 진행된다. 감염된 마우스는 5개월 이전에 죽는다(참고 문헌: Gurney et al., 1994).
C60(C(COOH)2)3은 FALS 마우스(Gurney G1 주)를 치료하여 FALS를 치료하는 이 화합물의 능력을 측정하는데 사용한다. 10주에 C60(C(COOH)2)3(O-3a 〉90%로 이루어진 혼합 이성체) 또는 식염수를 함유하는 Alzet 미노-삼투압 펌프(28일, 6(1/일, 15㎎/kg/일))를 복막내에 이식한다. 펌프를 14주에 교체한다. 개방 장 워킹의 비디오테입 평가를 수행하고, 척수 손상에 대한 브레스나한(Bresnahan) 단위를 사용하여 채점한다(참고 문헌: Basso et al., 1995). 거니 등이 보고한 바대로, 이 동물은 약 90일에 운동성 증후를 나타내고, 125 내지 145일에 사망한다.
도 11은 복강내 식염수 또는 카복시풀레렌 15㎎/kg/일을 함유하는 복강내 미니-삼투압 펌프를 사용하여 처리한 FALS 마우스에 대한 생존 커브를 나타낸다. 이 결과는 C60(C(COOH)2)3로 처리한 그룹이 사망에서 8±2.2일 지연되고, t-시험에 의한 p=0.041이라고 나타낸다. C60(C(COOH)2)3로 처리한 FALS 마우스는 증후의 초기에 지연을 나타낸다. 생존에서 8일 동안의 증가는 t-시험에 의해 통계적 유의성(p=0.041)에 도달한다. 펌프로 처리하지 않은 FALS 마우스(123일, n=4) 또는 식염수-충전 펌프로 처리한 FALS 마우스(125일, n=6)은 생존에서 차이가 거의 없다. 또한, 2개월 동안 카복시풀레렌(15㎎/kg/일)으로 처리한 야생형 동물(n=6)은 어떠한 부작용 또는 행동 효과도 나타내지 않는다-이들은 비처리한 한배 새끼(littermates)만큼 활동적이고, 무게도 유사하다(동일 성별내에).

Claims (6)

  1. 글루타메이트 NMDA 수용체에 의해 자극된 뉴론이 방출하는 유리 라디칼 산소 종에 의해 유발된 질병의 조절 또는 치료용 약제를 제조하기 위한, 화학식 Ⅰ의 카복실화 유도체 및 이의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르 및 아미드의 용도.
    화학식 Ⅰ
    C60(C(COOH)2)n
    상기식에서,
    C60은 부크민스테르풀레렌이고,
    n은 1 내지 4이다.
  2. 제1항에 있어서, 질병이 급성 신경성 손상, 예를 들면 발작 동안 발생하는 저산소증/허혈증, 저혈당증, 간질 또는 신경퇴행성 질환, 예를 들면 헌팅톤 질병, 알츠하이머 질병, 근위축성 측색경화증(ALS) 및 AIDS의 신경퇴행성 효과와 같은 신경 독성 손상을 포함하는 화학식 Ⅰ의 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 화학식 Ⅰ에서 n이 3인 용도.
  4. 제1항에서 정의한 바와 같은 하나 이상의 화학식 Ⅰ의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 에스테르 및 아미드, 및 치료학적으로 불활성인 담체 물질을 함유하는 약제.
  5. 제4항에 있어서, 급성 신경성 손상, 예를 들면 발작 동안 발생하는 저산소증/허혈증, 저혈당증, 간질 또는 외상, 또는 신경퇴행성 질환, 예를 들면 헌팅톤 질병, 알츠하이머 질병, 근위축성 측색경화증(ALS) 및 AIDS의 신경퇴행성 효과에 의해 유발된 만성 뉴론의 손상을 조절하거나 치료하기 위한 약제.
  6. 신경 독성 손상을 겪고 있는 환자에게 신경 독성 손상 치료 유효량의 화학식 C60(C(COOH)2)n의 화합물(여기서, C60은 부크민스테르풀레렌이고, n은 1 내지 4이다), 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 약제학적으로 허용되는 에스테르, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 투여하여 신경 독성 손상을 치료하는 방법.
KR1019980709809A 1996-06-03 1997-05-26 신경 독성 손상을 치료하기 위한 부크민스테르풀레렌의 용도 KR20000016238A (ko)

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