CN1221340A - 勃克明斯特富勒烯在治疗神经毒性损伤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及羧化勃克明斯特富勒烯在控制或治疗神经毒性损伤中的应用。

Description

勃克明斯特富勒烯在治疗神经毒性损伤中的应用
本发明涉及式Ⅰ的羧化衍生物
C60(C(COOH)2)n    Ⅰ
其中C60是勃克明斯特富勒烯，n是1～4。
勃克明斯特富勒烯，即C60，是一种具有交替5碳环和6碳环的碳球；30个碳双键容易与氧自由基反应(科学(Science)259,1183-1185,1991)，所以可充当自由基清除剂。然而，C60本身只能溶于有限的几种溶剂，例如甲苯或苯。本发明有用的化合物是水溶性羧基富勒烯，即用丙二酸进行过单衍生化或多衍生化的勃克明斯特富勒烯，或者药物上可接受的丙二酸盐、酯和酰胺，其中丙二酸的亚甲基与富勒烯球的两个碳连接。因此，本发明有用的化合物是C60(C(COOH)2)n以及相应的盐、酯和酰胺，其中n是1～4的整数。当n=3时,C60(C(COOH)2)n的两个异构体实例示于图1。这些化合物被称为“O-3a”和“R-3b”，它们是相应于应用化学(Angew Chem.Int.Ed.Engl.)33,437-438中作为化合物3a和3b公开的乙基酯的酸。本发明有用的优选化合物是C60(C(COOH)2)3及其药物上可接受的盐、酯和酰胺。最优选的化合物是C60(C(COOH)2)3该酸自身，尤其是O-3a异构体。
意外地发现了它们是生物自由基清除剂和神经保护剂，所以可抑制谷氨酸受体介导的神经元损伤和血清丧失诱发的编程性神经元死亡。Pop/So 8.4.97
谷氨酸，即中枢神经系统中主要的兴奋性递质，是很多正常神经功能(包括学习和记忆)所必需的。然而，谷氨酸受体的过度活化以及由它引起的兴奋毒性神经元损伤与数种急性损伤后中枢神经系统(CNS)中神经元损伤的病理相关，所述急性损伤包括缺氧/局部缺血(科学226,850-852,1984；药理科学进展(Trends Pharmacol.Sci.),11,379-387；神经病学纪事(Ann.Neurol)19,105-111,1986；科学247,571-574,1990)；外伤(神经病学纪事23,623-626,1988)；癫痫(神经科学(Neurosci.),12,557-567,1984)，以及某些神经变性病(科学277,1496-1498,1985；神经元(Neuron)1,623-634,1988；药理科学进展11,379-387,1990；神经病学(Neurol.)40,32-37,1990；神经病学记事31,119-130,1992)。
由活性氧物质引起的氧化应激反应代表很多相同的急性病和慢性病中相关的另一损伤机制(中风(Stroke)9,445-447,1978；脑研究进展(Prog.Brain Res.)63,227-235,1985；神经外科学杂志(J.Neurosurg)64,803-807,1986；Cerebrovas.Brain Mezab.Rev.1,165-211,1989；自由基生化医学(Free.Radic.Biol.Med.),6,289-301,1989；神经化学杂志(J.Neurochem)59,1609-1623,1992)。活性氧物质(例如超氧化物自由基)会引起细胞组分的氧化损坏，例如细胞膜脂质的过氧化，转运蛋白的失活，以及对线粒体产生能量的抑制。
谷氨酸兴奋毒性和氧化应激反应这两件事可能是相互连结的；活性氧物质形成可能是谷氨酸受体过度刺激的直接结果(Soc.Neurosci.Abs.18,756,1992；自然(Nature)364,535-537,1993)，于是介导谷氨酸神经毒性的组分(神经元，1,623-634,1988；科学262,689-694,1993)。反过来，兴奋毒性可通过自由基清除剂降低，这类清除剂包括Cu、Zn-超氧化物歧化酶和过氧化氢酶(神经化学杂志，49,1222-1228,1987；Acta Neurochirurgica 51,245-247,1990),21-氨基类固醇“lazaroids”(神经元，5,121-126,1990)，维生素(神经化学杂志，49,1222-1228,1987)；21-氨基类固醇“lazaroids”，维生素E类似物trolox(脑研究(Brain Res.),637,102-108,1994)，自旋捕获剂，例如苯基丁基-N-硝酮(脑研究，574,193-197,1992)，以及泛醌类似物艾地苯醌(神经科学通讯(Neurosci.Lett.),178,193-196,1994)，这些物质减少活性氧物质的量。
自由基清除剂是体外以及体内外伤或缺氧性/局部缺血性CNS损伤模型中的神经保护剂。N-甲基-D-天冬氨酸和AMPA/红藻氨酸(kainate)受体拮抗剂是体外氧-葡萄糖丧失损伤中的神经保护剂(神经元，1,623-634,1988；神经科学杂志，13,3510-3524,1993)，并可减少局部缺血动物模型中脑组织的损失(科学，226,850-852,1984；科学，247,571-574,1990)。自由基清除剂还可保护以防体外兴奋毒性神经元死亡(神经化学杂志，49,1222-1228,187；神经元，5,121-126,1990)，并能减少体内局部缺血性损伤(美国生理学杂志(Amer.J.Physiol.),256,H589-593；中风，21,1312-1317,1990；中风，22,896-901,1991；自由基生化医学，12,29-33,1992)。超量表达自由基清除剂酶(CuZn超氧化物歧化酶(SOD))的转基因动物能抗谷氨酸毒性(Acta Neurochirurgia,51,245-247,1990)，也能抗局部缺血性脑损伤(神经病学纪事，29,482-486；美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA),88,11158-62,1991)。
编程性细胞死亡也促使某些神经疾病中细胞死亡。例如，在局部缺血再灌注数天后，编程性细胞死亡会介导延迟的神经元变性(神经化学杂志，61,1973-1976,1994；神经报告(Neuroreport),5,493-496,1994)，并且会是某些神经变性病中神经元细胞死亡的一个因素(神经科学通讯，170,191-194,1994)。由自由基氧物质引起的氧化应激反应将是能触发编程性细胞死亡的损伤之一(自然，356,397-400,1992；神经毒理学(Neurotoxicol.),15,81-91,1994；国立癌研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.),86,1286-1295,1994)，所以自由基清除剂也应能限制编程性细胞死亡(神经化学杂志，62,376-379,1994；神经科学文摘(Neurosci.Abs.),20,432,1994)。Bcl-2似乎作用于自由基清除通道以介导它的抗编程性细胞死亡的细胞保护效果(细胞(Cell.),75,241-251,1993)。
本发明的主要目的是C60(C(COOH)2)n的羧化衍生物，其中C60是勃克明斯特富勒烯，n是1～4的整数，在治疗或预防由自由基引起的疾病中的应用，尤其当该自由基是因谷氨酸神经毒性而释放时，这些化合物在制备相应药剂和包含它们的药剂中的应用。本发明意义中的治疗神经毒性损伤表示减小对一中枢神经元周围的中枢神经元损伤的程度，这一中枢神经元已经由于其受神经毒性作用的损害而释放谷氨酸。神经毒性作用包括急性神经损伤，例如在中风、低血糖、癫痫或外伤期间出现的缺氧/局部缺血。神经毒性作用也可能是由神经变性疾病引起的慢性神经元损伤，这类疾病例如亨廷顿舞蹈病、早老性疾呆、肌萎缩性侧索硬化(“ALS”)，以及艾滋病的神经变性作用。因此，本发明还包括治疗出现了所述神经毒性损伤的疾病的方法。
本发明又一目的是勃克明斯特富勒烯在抑制患者中神经毒性损伤方面的应用，其中所述损伤是由花生四烯酸的代谢而引起的，该花生四烯酸是由于谷氨酸刺激所述神经元的NMDA受体而由神经元释放的；以及药剂，它包括本文所述的羧基富勒烯和药物上可接受的载体，其量足以抑制所述神经毒性损伤。
花生四烯酸(“AA”)是由于过量Ca2+流入神经元细胞而在神经元中释放的，这种过量流入是由谷氨酸刺激NMDA受体而引起的(谷氨酸已由因神经毒性作用本身损坏的神经元释放)。过量的Ca2+流入激活磷脂酶A2(它是一种钙依赖性酶)，它分裂细胞膜释放AA。由内源性脂肪氧合酶和环加氧酶引起的AA代谢导致产生氧自由基，后者触发神经元脂质膜的过氧化降解(斯堪的纳维亚生理学学报(Acta Physiol.Scand.),492,121-128,1980；脑研究进展(Proq.Brain Res.),63,227-232,1985)，这就导致神经元损坏或死亡。因此，按本发明，通过施用包括本文所述的自由基清除性羧基富勒烯的组合物而减少氧衍生的自由基就提供了另一机制，通过它可使谷氨酸诱导的神经毒性得到抑制。
本发明的优选目的包括上述化合物在治疗中风方面的应用。按本发明，中风被定义为患者脑中的急性神经毒性作用，其中该神经毒性作用是因血液流向脑神经元的丧失而发生的。
本文中描述的羧基富勒烯化合物是作为药剂而全身施用的，该药剂包含该活性化合物以及与所述化合物相容的药物上可接受的载体。在这类药剂的制备中，可应用任意常规的药物上可接受的载体。当该药物经口施用时，一般以一定间隔施用它。
在治疗应用中，本发明的有用化合物可通过任意常规的施药途径施用。这类途径包括：静脉内、肌内、皮下、鞘内、腹膜内、局部以及经口途径。优选地，本发明的方法通过经口的或静脉内的施药途径实施。
该药剂可制备成任何常规形式，包括经口施用的固体形式例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、粒剂等。该药剂可被灭菌和/或可包含辅剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于改变渗透压的盐和/或缓冲剂。
静脉内施用的典型制剂可以是无菌水溶液，包括水/缓冲溶液。静脉内载体包括流体、营养物和电解质补足物。还可存在防腐剂和其它添加剂，例如抗生素和抗氧化剂。用于静脉内施用集合药团的药剂可包含高达10mg/ml(10,000mg/升)本文所述的羧基富勒烯。静脉内滴注施药的药剂优选包含约50mg/升至约500mg/升本文所述的羧基富勒烯。
按本发明，本文所述的羧基富勒烯适用于药物上可接受的经口方式。这些药剂包含所述化合物以及相容性药物上可接受的载体物质。可应用任意常规的载体物质。任何常规经口剂量形式，例如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、粒剂等都可以用。该载体物质可以是适合经口施用的有机或无机惰性载体物质。合适的载体包括水、明胶、阿拉伯树胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、聚亚烷基二醇、矿脂等。此外，该药剂可包含其它药物活性剂。可按公认的药物调和实践加入其它添加剂，例如调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂等。
优选的经口剂量形式包括片剂，硬的或软的明胶、甲基纤维素或容易溶于消化道的其它合适物质的胶囊。本发明考虑的经口剂量将根据开处方的医师确定的各患者的需要而改变。优选的经口剂量形式是胶囊或片剂，其中包含50～500mg适用于本发明的羧基富勒烯。
在实施本发明的方法时，适用于本发明的化合物通常每天给成人施用，优选经口或静脉内施用，日剂量约1.5mg/kg～约1500mg/kg，呈单次的或分开的剂量，优选每天约10mg/kg～约60mg/kg，准确剂量应根据患者的需要而改变。通常，该疗法进行约3个月的一段时间。或者，对于具有患急性神经毒性病(例如中风)的高度危险性的那些患者，可预防性地实施本发明的方法达不确定的一段时间。用于治疗急性神经毒性病时，在诊断为急性神经毒性病之后应尽可能快地用本发明的方法治疗患者，优选在神经毒性病开始发作的12小时内，最优选在6小时内。
图1～11更详细地阐述本发明。图1六羧基富勒烯C60(C(COOH)2)3的结构，异构体O-3a和R-3b。图2纯化了的C60(C(COOH)2)3丙二酸酯(O-3a对映体)质子NMR谱法的谱图。图3纯化了的C60(C(COOH)2)3丙二酸酯(O-3a对映体)快速原子轰击质谱分析的谱图。图4电子顺磁共振谱图，它阐明了C60(C(COOH)2)3对H2O2(A：未处理的，B：用O-3a对映体处理了的)和超氧化物自由基O2 -(C：未处理的，D：用O-3a对映体处理了的，E：用R-3b对映体处理了的)的自由基清除活性。箭头指向EPR腔中污染物产生的人为信号。图5培养的神经元接触NMDA后产生的神经毒性，未处理和用3种浓度的C60(C(COOH)2)3处理。图6培养的神经元接触AMPA后产生的神经毒性，未处理和用4种浓度的C60(C(COOH)2)3处理。图7 NMDA刺激的痕量45Ca2+在培养的神经元中的积累，同时应用和未同时应用C60(C(COOH)2)3。图8在缺乏神经胶质的培养物中因血清丧失而产生的编程性神经元细胞死亡，未处理和用2种浓度的C60(C(COOH)2)3处理。图9比较两种C60(C(COOH)2)3异构体的自由基清除活性的EPR谱。图10比较了两种C60(C(COOH)2)3异构体在保护神经元以防因应用NMDA而产生的损伤(A)和AMPA-诱导的神经元死亡(B)。掺入小鼠脑的脂质的自旋标记脂质(5-或16-doxyl ketostearic acid(酮硬脂酸))的EPR谱(C)，加有两种C60(C(COOH)2)3异构体的任一种。图11用包含盐水或15mg/kg/天羧基富勒烯的腹膜内微型渗透泵处理的FALS小鼠的存活曲线。
本文的数据表明，公开的羧基富勒烯是一类新型抗氧化剂，具有清除多种氧衍生的自由基的能力，而且这些化合物具有不寻常的宽范围和有效的神经保护能力，可减少因谷氨酸兴奋毒性引起的神经元死亡，以及编程性细胞死亡。
                       实施例
溶液
培养基储备液(MS)，由伊格尔基本必需培养基构成，含25mM葡萄糖，无L-谷氨酰胺。
平板培养基，由MS构成，补加L-谷氨酰胺(2mM)，5％胎牛血清以及5％马血清。
生长培养基，含MS,10％马血清以及2mML-谷氨酰胺。
与NMDA短暂接触是在HEPES缓冲的平衡盐溶液中进行的，该溶液pH为7.40(HBBSS)，包含以mM为单位的116NaCl,5.4KCl,0.8MgSO4,1.8NaPO4,12HEPES,25NaHCO3,5.5D-葡萄糖，以及10(ML-甘氨酸。
平衡盐溶液(BSS)包含以mM为单位的116NaCl,5.4KCl,0.8MgSO4,1.8NaPO4,26.2NaHCO3以及5.5D-葡萄糖。
C60(C(COOH)2)3的起始异构体是O-3a异构体，它代表合成的主产物。该化合物储备液是作为25mM水溶液制备的。储备液应在制备后72小时内应用，在-20℃下暗处贮存。
将未改性的C60溶于甲苯以配制50mM储备液。
皮质细胞培养物
小鼠新皮质培养物是以神经元-星形细胞共培养物(大约50％星形细胞)制备的(Rose等，1992)或者以神经元培养物(＜2％星形细胞)制备的。从麻醉了的怀孕Swiss-Webster小鼠取出小鼠胚胎(怀孕第15天)，将新大脑皮质与其它脑结构解剖分离。在胰蛋白酶中短暂培养后，将细胞研磨分裂，然后将该细胞悬浮液稀释入平板培养基，铺在预先制备的、用聚(D-赖氨酸)/层粘连蛋白涂覆的24孔Plastek培养板上(用于神经元培养物)或者铺在现有的星形细胞床上(用于共培养物)。体外1～2天后，用神经胶质条件培养基部分更换“纯”神经元培养物，在加液抑制神经胶质增殖后立即添加胞嘧啶阿拉伯糖苷(3μM)。向混合培养物中一周2次加入生长培养基直至在体外11～12天，此时加入含2mML-谷氨酰胺的无血清MS。除非另有说明，在体外14～16天后应用细胞。
                        实施例1
羧基富勒烯(2,2-富勒烯丙二酸(2,2-fulleromalonic acids))的合成和性能
2,2-富勒烯丙二酸二乙酯将C60(1g,1.39mmol)加入新蒸馏的甲苯(1000ml)并搅拌数分钟而得清亮的紫色溶液。在搅拌下往该溶液中滴加溴代丙二酸二乙酯(0.474ml,2.78mmol)。在该富勒烯溶液中加入0.526ml(3.475mmol)DBU(1,8-重氮基二环[5.4.0]-十一碳-7-烯)使颜色从紫色变成暗红色。在室温下的空气中搅拌一夜后，过滤该溶液以除去铵盐，真空(varus)蒸发溶剂。将残余物溶于少量氯仿，然后加到硅胶柱顶上(填料是得自Merck的70～230目或230～400目的急骤色谱凝胶)。用从甲苯/己烷(1∶1)至甲苯(100％)的梯度洗脱富勒烯产物。初始洗脱得到5个级分，即未反应的富勒烯、一加合物、二加合物、三加合物、多加合物。在真空中除去各级分的溶剂，将固体残余物重复进行色谱处理直至纯净。含二加合物和三加合物的级分各在再分离后给出两种主要产物。
2,2-富勒烯丙二酸将含该酯加合物的单一异构体的各样品(100ml)在氮气下溶于甲苯(50ml)。然后加入20∶1摩尔比过量的NaH。在100℃下搅拌2～3h后，向该热溶液中滴加1ml甲醇，猛烈放出气体。同时定量沉淀出钠盐。通过离心收集该盐，真空下干燥。先用2M H2SO4再用水洗涤干燥后的化合物。在真空下将代表相应酯的丙二酸衍生物的该产物干燥一夜而得细棕色粉末。
对包含三加合富勒烯酯的O-3a对映体的样品进行质谱分析；然后将该酯水解再酸化而生成最终的羧基富勒烯化合物，即C60(C(COOH)2)3。纯化的C60酯的质子NMR和质谱(分别为图2和3)指示该样品包含2,2-富勒烯丙二酸酯的单一异构体(O-对映体，质量=1194/1195)和少量C60(质量=720)，它可能是由该加合物裂解而生成的。本文描述了初始化合物(即O-3a对映体)的结果。最近对另一对映体(即R-3b)的研究指示它也是一种有效的神经保护剂。
羧基富勒烯的溶液呈棕色半透明。然而，过滤通过0.45(m尼龙滤膜的浓(50mM)溶液未在滤膜上留下任何残余物，表明它是真溶液。对比试验证实，该化合物不干扰比色LDH分析。浓度高达25mM羧基富勒烯的溶液不能改变试验溶液的pH。
                      实施例2
兴奋性氨基酸毒性以及富勒烯醇(fullerenols)的应用
通过电子顺磁共振谱，证实C60(C(COOH)2)n化合物是有效的自由基清除剂，能清除羟基自由基和超氧化物自由基。图4显示的EPR谱图A～E阐明了C60(C(COOH)2)3的自由基清除活性。谱图A和B分别示出在15分钟期间由H2O2产生的羟基自由基(自旋加合物：DMPO-OH()，以及当150(MO-3a异构体被包括于H2O2中时该OH信号的消除。超氧化物自由基(O2 (-)也被C60(C(COOH)2)n化合物有效地消除了。构成自旋加合物DMPO-OOH的O2 (-，是通过黄嘌呤氧化酶与黄嘌呤保温而生成的(谱图C)。与40(M O-3a异构体或40(M R-3b一起保温消除了超氧化物自由基信号(分别为谱图D和E)。n=1或2的其它水溶性C60(C(COOH)2)n化合物的EPR分析证实它们也是有效的自由基清除剂(未给出数据)。
六羧基化化合物C60(C(COOH)2)3可溶于水到至少50mM浓度，它保护皮质神经元以抗通过与N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)和(-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(AMPA)接触而产生的兴奋毒性损伤。二羧基和四羧基富勒烯衍生物较少地溶于水溶液，虽然具有神经保护活性，但比六羧基衍生物的神经保护效果更小。
将羧基富勒烯(3-300(M)与NMDA一起应用于前述的神经元-星形细胞共培养物以估测神经保护作用。在羧基富勒烯存在下与NMDA的短暂接触是这样进行的，即用HBBSS更换培养基3次，接着添加50μM～500μM NMDA与羧基富勒烯达10分钟。通过用MS更换培养基4次而除去NMDA和羧基富勒烯，将培养物置于加湿的含CO2(5％)的37℃培养箱中达24小时，估测损伤程度。
例行地长时间地(24小时)接触5～100(M AMPA以产生皮质神经元损伤。在另一系列试验中，将羧基富勒烯(3～300(M)与AMPA一起应用于前述神经元-星形细胞共培养物以估测神经保护作用。用MS更换培养基2次后，添加AMPA和羧基富勒烯，再将培养物返回37℃的培养箱中。NMDA受体拮抗剂MK-801(10(M)被包括于AMPA和羧基富勒烯中以消除通过内源性谷氨酸释放而再次活化NMDA受体。
施用NMDA或AMPA 24小时后通过相差显微术(200～400x)，并通过测定从死细胞流入培养基浴液的乳酸脱氢酶(LDH)(Koh和Choi,1987)而估测神经元死亡。细胞死亡的定量估测在某些试验中通过锥虫蓝或碘化丙锭染色和细胞计数而得到了确证。
C60(C(COOH)2)3的结果示于图5和6。C60(C(COOH)2)3显示了增强的抗NMDA(图5)和AMPA诱导的(图6)兴奋毒性神经元损伤的神经保护作用。在迄今为止进行的所有试验中，C60(C(COOH)2)3(300(M)减少NMDA引起的神经元死亡至少60％，并在一些试验中几乎提供完全保护作用。减去洗涤后的对比物中存在的LDH量以给出NMDA毒性的特定信号。将数据以只由NMDA引起的细胞死亡百分数作图，每次培养物该接触杀死总神经元的51(9,44(6，以及88(14％。由ANOVA接着由Student-Newman-Keuls检验对多个对比试验取平均值(S.D.*=p＜0.05对NMDA。从3个试验汇集的数据(图5)阐明神经元细胞死亡减少75％。
在100(M时C60(C(COOH)2)3减少由AMPA引起的神经元细胞死亡＞80％(图6)。MK-801(10(M)被包括于AMPA中以消除由释放的内源性谷氨酸引起的NMDA受体的再次活化。这些值是平均值(SEM,n=3～4/试验，汇集4个试验的数据。将数据以只由AMPA/MK-801引起的细胞死亡百分数作图，表示40～70％的总神经元/培养物。*=p＜0.05对AMPA，是由ANOVA接着由Student-Newman-Keuls检验对多个对比试验进行的。
就我们所知，上述试验是首次将这些化合物用作细胞保护剂或抗氧化剂。
                        实施例3
45Ca2+示踪试验
为了证实抗NMDA诱导的神经元细胞损伤的保护作用不是由于NMDA诱导的钙流入量减少的缘故，进行了45Ca2+示踪研究。用HBBSS洗涤培养物2次，然后将培养物与NMDA(300(M)接触，该NMDA单独地或者与C60(C(COOH)2)3一起溶于含示踪物45Ca2+(0.5(Ci/培养孔；NEN,Boston,MA)的HBBSS中。10分钟后通过用未标记的HBBSS更换培养基4次而终止该接触，接着添加0.2％十二烷基硫酸钠(SDS)裂解细胞。将细胞置于SDS中达2小时，再将裂解液转至闪烁小瓶。另将用SDS洗涤各培养孔的洗液加入小瓶，然后进行(-计数。
图7的结果阐明了羧基富勒烯不是NMDA受体拮抗剂。同NMDA一起应用多达300(M的C60(C(COOH)2)3也未影响45Ca2+积累。从所有条件扣除基本的45Ca2+而得对NMDA受体活化呈特异性的45Ca2+增量。平均(SEM,n=4。
                         实施例4
丧失血清的编程性神经元死亡
缺少神经胶质的培养物中的皮质神经元在除去血清后24～48小时经历编程性细胞死亡，特征表现为形态变化(例如细胞体收缩)，神经元过程的裂解，以及由Hoechst 33258染色引起的染色质凝聚(Dugan等，1995)。因丧失血清而引起的编程性神经元死亡也可通过一起应用六羧基富勒烯而减少。已证实该损伤具有典型编程性细胞死亡的特征，包括DNA序列梯，染色质凝集，细胞收缩，编程性细胞死亡体的形成，以及通过大分子合成抑制剂的保护。通过用补加了氨基酸(谷氨酰胺除外)的平衡盐溶液更换含血清的生长培养基而使包含＜1％星形细胞的培养物中的皮质神经元丧失血清。将洗涤后的对照物返回培养基中，该培养基于BSS中包含2％胎牛血清、2％马血清。24小时和48小时之后，应用相差光学系统在100～400X下用Nikon倒置显微镜对细胞照相。
此外，在除去血清48小时后通过计数不再能排斥锥虫蓝的细胞而测定神经元细胞死亡。如图8中所示，从开始除去血清的48小时后通过计数不再能排斥锥虫蓝的细胞而测定的神经元细胞死亡，阐明神经元死亡的明显减少。用10M(C60(C(COOH)2)3处理的细胞表明减少了神经元死亡的50％。保持在含血清培养基中的洗涤了的对比培养物死亡很少。这些值是平均值(SEM,n=3～4/试验。该试验表示3次试验。*=p＜0.05对丧失血清的，通过ANOVA接着通过Student-Newman-Keuls检验对多个对比样进行的。
                      实施例5
羧基在C60上的极性位置改善了神经保护效率
按Lamparth和Hirsch的方法(Lamparth和Hirsch(1990))合成并纯化了C60(C(COOH)2)3的两种区域异构体，即O-3a和R-3b。这些化合物的纯度通过NMR和紫外/可见光谱分析进行检验。就O-3a化合物来说，所有亚甲基桥都位于相互之间的e(平伏)位置(e,e,e)，由1H和13C NMR谱分析证实该分子具有C3对称现象。化合物R-3b的亚甲基桥位于沿约为C60骨架的三重轴的大国环的带上呈反式-3位置(反-3，反-3，反-3)，并具有D3对称现象。示于图1中的3-D结构阐明了O-3a上羧基的极性分布以及R-3b上羧基的平伏分布。
图9通过化学法显示，由自旋捕获/EPR谱鉴定的这两种异构体表现出相似的清除OH和O2 -自由基的能力。图9示出了用100mM 5，5-二甲基-1-吡啶(pyrolline)-N-氧化物(DMPO)为自旋捕获剂OH自由基(通过Fenton反应从100μM H2O2于Fe2+中而得)和O2 -自由基(得自黄嘌呤+黄嘌呤氧化酶获得)的EPR谱。羟基自由基(左边的谱图)：OH只存在DMPO时(上图)，存在4μM O-3a时(中图)，或者存在4μM R-3b时(下图)。超氧化物自由基(右边)：O2 -只存在DMPO时(上图)，存在400μM O-3a时(中图)，存在400μM R-3b时(下图)。箭头指示由于腔内存在未知自由基而出现的仿真信号。样品是在Bruker 200,X-带EPR光谱仪中石英平板池(60×10×0.25mm)中分析的。设定值为：功率=1.6mW，调制=1G，场调制=100Hz,R.G.=3.2×105。
EPR结果表明，在比报道的大多数其它自由基清除剂小100～1000倍的浓度下，O-3a和R-3b异构体都是极有效的OH清除剂。羧基富勒烯对OH的清除能力比对O2 -自由基的清除能力大10倍。
虽然由EPR分析证实O-3a和R-3b异构体是等效的抗氧化剂，但就生物上抗NMDA和AMPA受体介导的损伤来说，O-3a化合物比R-3b更有效。这些结果示于图10。图10阐明了，O-3a对应用NMDA引起的损伤(A)提供稍佳的保护作用，但提供好得多的对AMPA诱导的神经元死亡(B)的保护作用。这些值是n=8～12各条件下的平均值±SEM。*=p＜0.05对未处理的损伤条件，应用ANOVA接着通过Student-Newman-Keuls检验对多个对照样进行。**=p＜0.05R-3b不同于O-3a。图10还示出掺入得自小鼠脑的脂质、加有O-3a或R-3b的自旋标记脂质的EPR谱(C)(5-或16-doxyl酮硬脂酸)。以1∶100的比率将自旋标记物加入从成熟小鼠脑提取的脂质。EPR设定值与图9的图例中列出的那些相同。两种异构体都使5-doxyl基的序参数(S)产生漂移，但O-3a使S产生更大的变动(表1)。O-3a还比R-3b更大程度地改变16-doxyl酮硬脂酸的液态信号，表明O-3a增大了脂质的无序性或流动性(表1)。两组结果表示O-3a比R-3b更大程度地进入脂质双层。
除了在保护神经元以抗NMDA和AMPA受体介导的损伤中显示更大的活性外，O-3a还比R-3b提供更强的保护作用以抗内皮细胞培养物以及肝细胞中的损伤。该差异明显是由于O-3a异构体比R-3b进入膜的能力更强。O-3a的极性使它能更轻易地进入细胞膜。嵌入这些细胞膜的该能力启示，O-3a将比R-3b提供更好的细胞膜保护作用以防脂质过氧化。因此，功能基的位置(极性比圆周)对C60衍生物的保护效率来说很重要。
表1：自旋标记物/EPR试验的膜参数
化合物       序参数a     相关时间b    脂质/水的分配因子c
 O-3a        0.84±0.01   5.7±0.5ns    1.0±0.2
 R-3b        0.86         4.5           0.6
 对比物      0.88         5.1           0.8a序参数，S=a(Tl′-T′)/(Tl-T)，其中Tl′是测定的5-doxyl硬脂酸自旋标记物/磷脂中平行取向的超精细分裂，T′则是垂直取向。我们假定a=1，且Tl-T=25G，b相关时间，τc=6.5×10-10 W0[(h0/h-1)-1]，其中W0是以高斯表示的中场线宽度，h0和h-1是对5-doxyl硬脂酸测定的一阶导数吸收的中场线和高场线的峰高。c脂质/水的分配因子，f=hL/hA，其中hL和hA是对16-doxyl硬脂酸测定的脂质相和水相的峰高。为了有效的比较，我们应用了hA整个峰高的1/2。
                     实施例6
羧基富勒烯对肌萎缩性侧索硬化的转基因模型中存活量的作用
在10,000个人中有一个患有ALS,ALS是由于运动神经元疾病而导致死亡的最常见起因。该疾病的家族形式(FALS)通常是常染色体显性的，构成这类病例的10～15％。在1993年，一个关键性突破鉴定了具有FALS的某些家族中Cu,Zn-SOD(sodl)基因中的突变(Rosen等，1993)，于是后续的工作导致这种假设，即ALS可能是由于某些FALS形式中由突变体SOD1更多地产生活性氧物质(ROS)。
Gurney及其同事们已培育了携带见于FALS家族中的G93A点突变的小鼠(Gurney等，1994),G93A转基因小鼠的G1系阐明了人FALS的很多特征。该G1系，具有18个拷贝数和4倍于野生型动物的SOD活性，在3～4个月大小逐步呈现运动神经元死亡，变得下肢弱化，损伤的梳理，以及沿它们的胁腹变瘦。感染的小鼠在5个月大小之前死亡(Gurney等，1994)。
将C60(C(COOH)2)3用于治疗FALS小鼠(Gurney GI品系)以测定其治疗FALS的能力。在10周大小，在腹膜内植入包含C60(C(COOH)2)3(混合异构体，其中包括＞90％ O-3a)或者盐水的Alzet微型渗透泵(28天，6(1/天,15mg/kg/天)。在14周大小，置换这些泵。用录像带录下露天场地行走情况并进行评价，应用Bresnahan标准记录脊髓损伤(Basso等，1995)。如Gurney及其同事们报道的那样，这些动物在大约90天大小出现运动原症状，并在125～145天大小濒临死亡。
图11示出用包含盐水或15mg/kg/天羧基富勒烯的腹膜内微型渗透泵处理后FALS小鼠的存活曲线。这些结果表明，用C60(C(COOH)2)3处理过的组表现为延迟8±2.2天死亡，t-检验得p=0.041。用C60(C(COOH)2)3处理过的FALS小鼠还表明症状的开始被延迟了。由t-检验得知，8天存活率增大达到统计学显著性(p=0.041)。对于未接受泵处理(123天，n=4)或者用装有盐水的泵处理(125天，n=6)的FALS小鼠来说，它们的存活率没有差别。此外，用羧基富勒烯(15mg/kg/天)处理两个月的野生型动物(n=6)未表现健康不良或行为不良的效果-它们与未处理的同窝出生者同样活泼，体重也类似(同性别间比较)。

Claims (6)

1．式Ⅰ的羧化衍生物
C60(C(COOH)2)n    Ⅰ
其中C60是勃克明斯特富勒烯，n=1～4，及其药物上可接受的盐、酯和酰胺在制备用于控制或治疗由于谷氨酸NMDA受体刺激神经元而释放自由基氧物质引起的疾病的药剂方面的应用。
2．权利要求1的式Ⅰ化合物的应用，其中的疾病包括：神经毒性损伤，例如急性神经损伤如中风、低血糖、癫痫期间出现的缺氧/局部缺血；或者神经变性病，例如亨廷顿舞蹈病、早老性痴呆、肌萎缩性侧索硬化(ALS)，以及艾滋病的神经变性作用。
3．权利要求1～2的应用，其中式Ⅰ中的n是3。
4．一种药剂，它包含一种或多种权利要求1中定义的式Ⅰ化合物或其药物上可接受的盐、酯和酰胺以及治疗上惰性的载体物质。
5．用于控制或治疗下列疾病的权利要求4的药剂：急性神经损伤，例如在中风、低血糖、癫痫或外伤期间出现的缺氧/局部缺血；或者由神经变性病如亨廷顿舞蹈病、早老性痴呆、肌萎缩性侧索硬化(ALS)和艾滋病的神经变性作用引起的慢性神经元损伤。
6．通过给患有神经毒性损伤的患者施用一种组合物而治疗所述损伤的方法，其中该组合物包括式C60(C(COOH)2)n的化合物，其中n是1～4的整数，其药物上可接受的盐和药物上可接受的酯，以及药物上可接受的载体，其中所述化合物在所述组合物中的存在量是治疗所述神经毒性损伤的有效量。
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