JP2000514412A - 神経毒性損傷の処置のためのバックミンスターフラーレンの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、神経毒性損傷の制御または処置におけるカルボキシル化バックミンスターフラーレンの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 神経毒性損傷の処置のためのバックミンスターフラーレンの使用 本発明は、次式 Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)_n Ｉ ［式中、Ｃ₆₀はバックミンスターフラーレンであり、ｎは１〜４である］のカル ボキシル化誘導体に関する。 バックミンスターフラーレン、Ｃ₆₀は、交互に並ぶ５員環および６員環を有す る球状炭素である；３０個の炭素二重結合は、酸素ラジカルと容易に反応するた め(Science 259，1183-1185，1991)、フリーラジカル捕捉剤として作用しうる。 しかし、天然のＣ₆₀は、トルエンまたはベンゼンのような限られた数の溶媒にし か溶解しない。本発明において有用な化合物は、水溶性のカルボキシフラーレン 、すなわちマロン酸または薬学的に許容されるマロン酸の塩、エステル、および アミドで一ヶ所または数ヶ所を誘導体化されたバックミンスターフラーレンであ り、ここで、マロン酸のメチレン基が、フラーレン球の２個の炭素に結合する。 したがって、本発明において有用な化合物は、Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)_n、および対 応する塩、エステル、およびアミドであり、ｎは１〜４までの整数である。ｎ＝ ３の場合のＣ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)_nの２つの異性体の例を、図１に示す。これらの 化合物は、「Ｏ−３ａ」および「Ｒ−３ｂ」と表記され、Angew．Chem．Int．Ed．En gl．33，437-438，1994に化合物３ａおよび３ｂとして開示されているエチルエ ステルに対応する酸である。本発明において有用な好ましい化合物は、Ｃ₆₀(Ｃ( ＣＯＯＨ)₂)₃ならびに薬学的に許容されるその塩、エステル、およびアミドであ る。最も好ましい化合物は、酸そのものであるＣ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃、特にＯ− ３ａ異性体である。 驚くべきことに、それらは、生物学的なフリーラジカル捕捉剤かつ神経防御因 子であり、したがって、グルタミン酸レセプター介在性神経損傷、および血清の 欠乏により誘導されるアポトーシス性ニューロン死を阻害する。 中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸は、学習お よび記憶を含む、多くの正常な神経学的機能にとって必要である。しかし、グル タミン酸レセプターの過剰の活性化、およびその結果の興奮毒性による神経損傷 は、低酸素症／虚血(Science 226，850-852，1984;Trends Pharmacol．Sci.，11 ，379-387;Ann．Neurol．19，105-111，1986;Science 247，571-574，1990)、外 傷(Ann．Neurol．23，623-626，1988)、てんかん(Neurosci.，12，557-567，198 4)を含む、いくつかの急性発作の後に起こる中枢神経系（ＣＮＳ）におけるニュ ーロン損失、およびある種の神経変性疾患（Science 227，1496-1498，1985;Neu ron 1，623-634，1988;Trends Pharmac．Sci．11，379-387，1990;Neurol．40， 32-37，1990;Ann．Neurol．31，119-130，1992）の病原に関与している。 活性酸素(reactive oxygen)により引き起こされる酸化ストレスは、同じ急性 疾患および慢性疾患の多くに関与しているもう一つの損傷メカニズムである(Str oke 9，445-447，1978;Proq．Brain Res．63，227-235，1985;J．Neurosurq．64 ，803-807，1986;Cerebrovas．Brain Mezab．Rev．1，165-211，1989;Free．Rad ic．Biol．Med．6，289-301，1989;J．Neurochem．59，1609-1623，1992)。活性 酸素（例えば、スーパーオキシドラジカル）は、細胞膜脂質の過酸化、輸送タン パク質の不活化、およびミトコンドリアによるエネルギー産生の阻害のような、 細胞成分に対する酸化損傷を引き起こす。 これらの２つの事象、グルタミン酸興奮毒性および酸化ストレスは、相互に関 連している可能性がある。活性酸素形成は、グルタミン酸レセプターの過剰刺激 の直接的な結果として起こり(Soc．Neurosci．Abs．18，756，1992;Nature 364 ，535-537，1993)、したがってグルタミン酸神経毒性の成分を媒介する(Neuron ．1，623-634，1988;Science 262，689-694，1993)。次に、興奮毒性は、活性酸 素の量を減少させる、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼおよびカタラ ーゼ(J．Neurochem．49，1222-1228，1987;Acta Neurochirurgica 51，245-247 ，1990)、２１−アミノステロイド「ラザロイド(lazaroids)」(Neuron 5，121-1 26，1990)、ビタミン(J．Neurochem．49，1222-1228，1987)、２１−アミノステ ロイド「ラザロイド(lazaroids)」、ビタミンＥアナログ、トロロックス(trolox)( Brain Res．639，102-108，1994)、フェニルブチル−Ｎ−ニトロンのようなスピ ントラッピング剤(Brain Res．574，193-197，1992)、ならびにユビキノンアナ ログ、イデベノン（idebenone）(Neurosci．Lett．178，193-196，1994)を含む 、フリーラジカル捕捉剤により減弱させられうる。 フリーラジカル捕捉剤は、外傷または低酸素症／虚血ＣＮＳ損傷のin vitroモ デルにおいてもin vivoモデルにおいても、神経防御的である。Ｎ−メチル−Ｄ −アスパラギン酸およびＡＭＰＡ／カイニン酸レセプターアンタゴニストは、in vitroで酸素−グルコース欠乏損傷において神経防御的であり(Neuron 1，623-6 34，1988;J．Neurosci．13，3510-3524，1993)、虚血の動物モデルにおいて脳組 織の損失を減少させる(Science 226，850-852，1984;Science 247，571-574，19 90)。フリーラジカル捕捉剤も、in vitroで興奮毒性によるニューロン死を防御 し(J．Neurochem．49，1222-1228，1987;Neuron 5，121-126，1990)、in vivoで 虚血性損傷を減少させる(Amer．J．Physiol．256，H589-593;Stroke 21，1312-1 317，1990;Stroke 22，896-901，1991;Free Rad．Biol．Med．12，29-33，1992) 。フリーラジカル捕捉剤酵素、Ｃｕ，Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ（Ｓ ＯＤ）を過剰発現するトランスジェニック動物は、グルタミン酸毒性(Acta Neur ochirurgia 51，245-247，1990)および虚血性脳損傷（Ann．Neurol．29，482-48 6;Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88，11158-62，1991）に対して抵抗性である。 プログラム細胞死またはアポトーシスも、ある種の神経学的疾患状態において 細胞死の原因となる。例えば、アポトーシスは、虚血再還流の数日後の遅延型ニ ューロン変性を媒介し(J．Neurochem．61，1973-1976，1994;Neuroreport 5，49 3-496，1994)、ある種の神経変性疾患においてニューロン細胞死の要因となる(N eurosci．Lett．170，191-194，1994)。フリーラジカル酸素種による酸化ストレ スは、アポトーシスの引き金となりうる発作の一つであるため(Nature 356，397 -400，1992;Neurotoxicol．15，81-91，1994;J．Natl．Cancer Inst．86，1286- 1295，1994)、フリーラジカル捕捉剤は、プログラム細胞死をも制限することが できる(J．Neurochem．62，376-379，1994;Neurosci．Abs．20，432，1994)。Ｂ ｃｌ−２は、フリーラジカル捕捉経路に作用し、アポトーシスに対する細胞防御 効果を媒介すると考えられている(Cell．75，241-251，1993)。 本発明の主要な目的は、Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)_n（Ｃ₆₀はバックミンスターフラ ーレンであり、ｎは１〜４までの整数である）のカルボキシル化誘導体の、フリ ーラジカルにより引き起こされる疾患の処置または予防における使用、特 に、フリーラジカルがグルタミン酸神経毒性の結果として放出される場合の、対 応する薬剤の製造のためのこれらの化合物の使用、およびそれらを含む薬剤であ る。本発明の意味における神経毒性損傷の処置とは、神経毒性事象により損傷を 受けたことによりグルタミン酸を放出した中枢ニューロンの周囲の中枢ニューロ ンに対する損傷の程度を減少させることを意味する。神経毒性事象には、発作、 低血糖症、てんかん、または外傷などの間に起こる低酸素症／虚血のような急性 の神経学的傷害が含まれる。ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索 硬化症（「ＡＬＳ」)、およびＡＩＤＳの神経変性効果のような神経変性疾患によ り引き起こされる慢性ニューロン損傷も神経毒性事象である。したがって、本発 明は、該神経毒性損傷が起こる疾患を処置する方法も含む。 本発明のさらなる目的は、ニューロンのＮＭＤＡレセプターのグルタミン酸に よる刺激のためにニューロンから放出されたアラキドン酸の代謝により損傷神経 毒性が引き起こされた患者における、神経毒性損傷を阻害するためのバックミン スターフラーレンの使用、および該神経毒性損傷を阻害するのに充分な量の前記 カルボキシフラーレンおよび薬学的に許容される担体を含む医薬である。 アラキドン酸（「ＡＡ」）は、グルタミン酸（神経毒性事象そのものにより損傷 を受けたニューロンにより放出されたグルタミン酸）によるＮＭＤＡレセプター の刺激により引き起こされる、過剰のＣａ²⁺のニューロン細胞への流入によりニ ューロンに放出される。過剰のＣａ²⁺流入は、細胞膜を破壊しＡＡを遊離させる カルシウム依存性酵素、ホスフォリパーゼＡ₂を活性化する。内因性のリポギシ ゲナーゼおよびシクロオキシゲナーゼによるＡＡの代謝は、酸素フリーラジカル の生成を導き、それがニューロン脂質膜の過酸化分解のきっかけとなり(Acta Ph ysiol．Scand．492，121-128，1980;Proq．Brain Res．63，227-232，1985)、そ の結果神経の損傷または死が起こる。したがって、本発明に従い、本明細書に開 示されたフリーラジカル捕捉カルボキシフラーレンを含む組成物を投与すること により、酸素由来のフリーラジカルを減少させることは、グルタミン酸が誘導す る神経毒性を阻害するという別のメカニズムを提供する。 本発明の好ましい目的は、発作を処置するための前記化合物の使用を含む。本 発明において、発作とは、患者の脳における、急性の神経毒性事象と定義され、 ここで、この神経毒性事象は脳のニューロンへの血流の欠乏により起きる。 本明細書中に記載されるカルボキシフラーレン化合物は、活性化合物および該 化合物と適合性の薬学的に許容される担体を含む薬剤として全身投与される。こ のような薬剤の調製においては、従来のいかなる薬学的に許容される担体も用い ることができる。薬物を経口投与する場合には、一般的に規則的な間隔をおいて 投与する。 処置のための使用において、本発明において有用な化合物は、それにより薬物 が従来投与されていた任意の経路により投与してもよい。このような経路には、 静脈内、筋肉内、皮下、髄腔内、腹腔内、局所、および経口が含まれる。好まし くは、本発明の方法は、経口または静脈内の投与により実施される。 薬剤は、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤などのような、経口投与のた めの固形型を含む、任意の従来の形態で作製することができる。薬剤は、無菌で あり、および／または保存剤、安定化剤、湿潤化剤、乳化剤、浸透圧を変化させ るための塩、および／または緩衝剤などの補助剤を含んでいてもよい。 静脈内投与用の典型的な調製物は、水／緩衝溶液を含む無菌水性溶液である。 静脈内賦形剤には、液体、栄養剤、および電解質補給剤が含まれる。抗生物質お よび抗酸化剤のような、保存剤およびその他の添加剤が含まれていてもよい。ボ ーラス静脈内投与用の薬剤は、最大１０mg/ml（１０，０００mg/リットル）の本 明細書中に記載のカルボキシフラーレンを含むことができる。点滴静脈内投与用 の薬剤は、好ましくは、約５０mg/リットル〜約５００mg/リットルの本明細書中 に記載のカルボキシフラーレンを含んでもよい。 本発明によると、本明細書中に記載のカルボキシフラーレンは、薬学的に許容 される経口形態において有用である。これらの薬剤は、適合性のある薬学的に許 容される担体物質と共に該化合物を含む。任意の従来の担体物質を用いることが できる。錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤などのような、任意の従来の経 口用剤形を用いることができる。担体物質は、経口投与に適した、有機または無 機の不活性な担体物質である。適当な担体には、水、ゼラチン、アラビアゴム、 ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアル キレン−グリコール、ペトロラタムなどが含まれる。さらに、薬剤は、他の薬学 的に活性な薬物を含んでいてもよい。芳香剤、保存剤、安定化剤、乳化剤、緩衝 剤などのような付加的な添加剤は、医薬組成物調製の許容された慣習に従い添加 することができる。 好ましい経口投与用剤形には、錠剤、硬ゼラチンまたは軟ゼラチン、メチルセ ルロース、または消化管で容易に溶解するその他の適当な物質のカプセル剤が含 まれる。本発明に従い考慮される経口投与用剤形は、処方を行う医師により決定 される、個々の患者の必要性に応じて変化する。好ましい経口投与用剤形は、本 発明において有用なカルボキシフラーレンを５０〜５００mg含むカプセル剤また は錠剤である。 本発明の方法の実施において、本発明において有用な化合物は、一般的に、一 回または数回に分割して、１日当たり約１．５mg/kg〜約１，５００mg/kgの量で 、好ましくは１日当たり約１０mg/kg〜約６０mg/kgの量で、毎日、好ましくは経 口投与または静脈内投与により成人に投与されるが、正確な投与量は患者の必要 性に応じて変化する。一般に、この処置は約３ヶ月間実施される。あるいは、本 発明の方法は、発作のような急性神経毒性事象を経験する危険が高い患者におい て、不確定の期間、予防的に実施することもできる。急性神経毒性事象の処置の ためには、患者は、急性神経毒性事象の診断後可能な限り早期に、好ましくは神 経毒性事象の開始から１２時間以内、最も好ましくは６時間以内に、本発明の方 法に従い処置されなければならない。 図１〜１１は、本発明をより詳細に示す。 図１ ヘキサカルボキシフラーレン、Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃、異性体Ｏ−３ａ およびＲ−３ｂの構造。 図２ 精製されたＣ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃マロン酸エステル（Ｏ−３ａ鏡像異性 体）のプロトンＮＭＲ分光法によるスペクトル。 図３ 精製されたＣ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃マロン酸エステル（Ｏ−３ａ鏡像異性 体）の高速分子衝撃質量分析によるスペクトル。 図４ Ｈ₂Ｏ₂（Ａ：未処理、Ｂ：Ｏ−３ａ鏡像異性体で処理）およびスーパー オキシドラジカルＯ₂ ^・-（Ｃ：未処理、Ｄ：Ｏ−３ａ鏡像異性体で処理、Ｅ：Ｒ −３ｂ鏡像異性体で処理）に対するＣ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃のフリーラ ジカル捕捉活性を示す、電子常磁性共鳴スペクトル。矢印は、ＥＰＲ空洞共振器 内の夾雑物により生じた人工的なシグナルである。 図５ 処理を行わない場合、および３種の濃度のＣ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃で処理 をした場合の、培養ニューロンのＮＭＤＡ曝露により生じた神経毒性。 図６ 処理を行わない場合、および４種の濃度のＣ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃で処理 をした場合の、培養ニューロンのＡＭＰＡ曝露により生じた神経毒性。 図７ Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃を同時適用した場合およびしない場合の、培養ニ ューロンにおけるＮＭＤＡにより刺激されたトレーサー⁴⁵Ｃａ²⁺蓄積。 図８ 処理を行わない場合および２種の濃度のＣ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃で処理を した場合の、血清欠乏によりグリア欠損培養物において生じたアポトーシス性ニ ューロン細胞死。 図９ ２つのＣ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃異性体のフリーラジカル捕捉活性を比較し たＥＰＲスペクトル。 図１０ ＮＭＤＡの適用により生じる損傷（Ａ）およびＡＭＰＡにより誘導さ れるニューロン死（Ｂ）に対するニューロンの防御における、２つのＣ₆₀(Ｃ(Ｃ ＯＯＨ)₂)₃異性体の比較。マウス脳由来の脂質へ、２つのＣ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃ 異性体のいずれかと共に取り込まれたスピン標識脂質（５−または１６−ドキシ ルケトステアリン酸）のＥＰＲスペクトル(Ｃ)。 図１１ 生理食塩水または１５mg/kg/日のカルボキシフラーレンを含む腹腔内 ミニ浸透圧ポンプで処理されたＦＡＬＳマウスに関する生存曲線。 本明細書中のデータは、開示されたカルボキシフラーレンが、多数の酸素由来 フリーラジカルを捕捉する能力を有する新規なクラスの抗酸化剤であること、そ してこれらの化合物が、極めて広域の強力な神経防御能を有し、グルタミン酸興 奮毒性によるニューロン死およびアポトーシスを軽減させることを示している。 実施例 溶液 培地ストック（ＭＳ）は、２５mMグルコースを含み、Ｌ−グルタミンを含まな いイーグル最少必須培地からなる。 プレーティング用培地は、Ｌ−グルタミン(２mM)、５％ウシ胎児血清、およ び５％ウマ血清を補充したＭＳからなる。 増殖培地は、ＭＳ、１０％ウマ血清、および２mM Ｌ−グルタミンを含む。 ＮＭＤＡへの短時間曝露は、１１６mM ＮａＣｌ、５．４mM ＫＣｌ、０．８mM ＭｇＳＯ₄、１．８mM ＮａＰＯ₄、１２mM ＨＥＰＥＳ、２５mM ＮａＨＣＯ₃、 ５．５mM Ｄ−グルコース、１０M Ｌ−グリシンを含む、ＨＥＰＥＳ緩衝平衡塩 溶液、pH７．４０（ＨＢＢＳＳ）で行った。 平衡塩溶液（ＢＳＳ）は、１１６mM ＮａＣｌ、５．４mM ＫＣｌ、０．８mM ＭｇＳＯ₄、１．８mM ＮａＰＯ₄、２６．２mM ＮａＨＣＯ₃、および５．５mM Ｄ −グルコースであった。 もとの異性体であるＣ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃は、合成の主要生成物である、Ｏ− ３ａ異性体であった。この化合物のストックは、２５mM水溶液として調製された 。ストックは、調製から７２時間以内に使用され、暗所に−２０℃で保存された 。 未修飾Ｃ₆₀はトルエンに溶解し、５０mMストックを調製した。皮質細胞培養物 マウス新皮質培養物は、ニューロンと星状膠細胞の共培養物（約５０％星状膠 細胞）(Rose et al.，1992)として、またはニューロン培養物（＜２％星状膠細 胞）として調製した。麻酔をかけられた妊娠スイスウェブスター(Swiss-Webster )マウスから、マウス胎児（妊娠１５日目）を取り出し、新皮質を他の脳組織か ら切り取る。トリプシン中で短時間インキュベートした後、摩砕により細胞を解 離させ、細胞懸濁液をプレーティング用培地で希釈し、予め調製されたポリ−Ｄ −リジン／ラミニンでコーティングされた２４穴プラステック（Plastek）培養 プレート（ニューロン培養物用）または既に存在する星状膠細胞層へと播く(共 培養用)。in vitroで１〜２日の後、「純粋な」ニューロン培養物のために、グ リア馴化培地を部分的に交換し、グリアの増殖を阻害するため、培地交換後直ち にシトシンアラビノシド（３μＭ）を添加する。混合培養物には、in vitroで１ １〜１２日目まで週２回増殖培地を与え、次いで、２mM Ｌ−グルタミンを含む 無血清ＭＳを与える。特に別記しない限り、細胞はin vitroで１４〜１６日目の ものを使用した。実施例１ カルボキシフラーレン（２，２−フラーロマロン酸）の合成および性質 ジエチル２，２−フラ−ロマロン酸エステル 新しく蒸留したトルエン（１， ０００ml）に、Ｃ₆₀（１ｇ、１．３９mmol）を添加し、透明で紫色の溶液が得ら れるまで数分間撹拌した。ジエチル臭化マロン酸（０．４７４ml、２．７８mmol ）を、撹拌中の溶液に滴下した。０．５２６ml（３．４７５mmol）のＤＢＵ（１ ，８−ジアゾビシクロ［５，４，０］−ウンデカ−７−エン）をフラーレン溶液 に添加すると、色が紫色から暗赤色に変化した。室温で曝気しながら一晩撹拌し た後、アンモニウム塩を除去するため溶液を濾過し、溶媒を真空蒸発させた。残 渣を少量のクロロホルムに溶解し、シリカゲルカラム（充填物質は、メルク（Me rck）の７０−２３０メッシュまたは２３０−４００メッシュのフラッシュクロ マトグラフィーゲルであった）の最上部に添加した。トルエン／ヘキサン（１： １）からトルエン（１００％）までの勾配を用いて、フラーレン生成物を溶出さ せた。最初の溶出で、未反応のフラーレン、一価付加物、二価付加物、三価付加 物、多価付加物という５つの画分が得られた。各画分の溶媒を真空除去し、固体 の残渣を、純粋になるまで繰り返しクロマトグラフィーにかけた。再分離により 、二価付加物および三価付加物を含有する画分から、２つの主要生成物が得られ た。 ２，２−フラーロマロン酸 単一のエステル付加物異性体（１００mg）を含む 試料を、窒素下、トルエン（５０ml）に溶解した。次に、２０：１モル過剰のＮ ａＨを添加した。１００℃で２〜３時間撹拌した後、熱い溶液に１mlのメタノー ルを滴下し、気体を激しく発生させた。同時に、ナトリウム塩の定量的な沈殿が 起こった。遠心分離により塩を収集し、真空下で乾燥させた。乾燥した化合物を ２M Ｈ₂ＳＯ₄で洗浄し、次に水で洗浄した。対応するエステルのマロン酸誘導体 である生成物を、一晩真空下で乾燥させ、微細な茶色の粉末を得た。 三価付加フラーレンエステルのＯ−３ａ鏡像異性体を含む試料について、質量 分析を行った。次に、このエステルを加水分解し、酸性化し、最終的にカルボキ シフラーレン化合物、Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃を形成した。精製されたＣ₆₀エステ ルのプロトンＮＭＲおよび質量スペクトル（それぞれ、図２および３）は、 試料が、２，２−フラーロマロン酸エステルの単一の異性体（質量＝１１９４／ １１９５のＯ−鏡像異性体）を、付加物の分解により生じた少量のＣ₆₀（質量＝ ７２０）と共に含むことを示している。本明細書には、Ｏ−３ａ鏡像異性体であ るもとの化合物の結果を記載した。他の鏡像異性体Ｒ−３ｂを用いたより最近の 研究で、それも有効な神経防御剤であることが示されている。 カルボキシフラーレンの溶液は、半透明の茶色であった。しかし、０．４５（ ｍナイロンフィルターで濾過した濃縮溶液（５０mM）は、フィルター上に全く残 渣が残らず、真の溶液であることが示された。対照実験で、化合物は比色ＬＤＨ アッセイを妨害しないことが確認された。２５mMまでのカルボキシフラーレン溶 液は、実験溶液のpHを変化させなかった。 実施例２ 興奮性アミノ酸の毒性およびフラーレノールの適用 電子常磁性共鳴分光法により、Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)_n化合物が、ヒドロキシル ラジカルもスーパーオキシドラジカルもどちらも除去することができる、強力な フリーラジカル捕捉剤であることが証明された。図４は、Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃ のフリーラジカル捕捉活性を示す、ＥＰＲスペクトルＡ〜Ｅを示す。スペクトル ＡおよびＢは、それぞれ、１５分間にＨ₂Ｏ₂により生じたヒドロキシルラジカル (スピンアダクト：ＤＭＰＯ−ＯＨ⁽)、およびＨ₂Ｏ₂と共に１５０（ＭのＯ−３ ａ異性体が含まれている場合の、このＯＨシグナルの除去を示す。スーパーオキ シドラジカル（Ｏ₂ ^(-）も、Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)_n化合物により効率的に捕捉さ れた。ＤＭＰＯ−ＯＯＨというスピンアダクトを形成するＯ₂ ^(-は、キサンチン オキシダーゼをキサンチンと共にインキュベーションすることにより生成させた (スペクトルＣ)。４０(ＭのＯ−３ａ異性体または４０（ＭのＲ−３ｂ異性体の いずれかと共にインキュベーションすることにより、スーパーオキシドラジカル が除去された(それぞれ、スペクトルＤおよびＥ)。ｎ＝１または２のその他の水 溶性Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)_n化合物のＥＰＲ解析で、それらもまた効率的なフリー ラジカル捕捉剤であることが確認された(データは示していない)。 少なくとも５０mMまで水に溶解するヘキサカルボキシル化された化合物 Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃は、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）および （−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸 （ＡＭＰＡ）への曝露により生じた興奮毒性損傷から、皮質ニューロンを防御し た。ジカルボキシフラーレン誘導体およびテトラカルボキシフラーレン誘導体は 、水溶液への溶解性が低く、神経防御活性を有してはいたが、ヘキサカルボキシ 誘導体よりは神経防御剤としての有効性が低かった。 神経防御の評価のため、カルボキシフラーレン（３〜３００（Ｍ）を、上記の ニューロンと星状膠細胞との共培養物へＮＭＤＡと共に適用した。カルボキシフ ラーレンの存在下での、ＮＭＤＡへの短時間曝露は、培地をＨＢＢＳＳで３回交 換し、その後５０μＭ〜５００μＭ ＮＭＤＡおよびカルボキシフラーレンを１ ０分間添加することにより行った。培地をＭＳで４回交換することにより、ＮＭ ＤＡおよびカルボキシフラーレンを除去し、培養物を湿度の高いＣＯ₂(５％)、 ３７℃のインキュベーターに２４時間放置し、その後傷害の程度を調べた。 皮質ニューロン損傷を生じさせるために、通常、５〜１００（Ｍ ＡＭＰＡへ の長時間（２４時間）の曝露を用いる。他の実験系列で、神経防御の評価のため 、カルボキシフラーレン（３−３００（Ｍ）を、上記のニューロンと星状膠細胞 との共培養物へＡＭＰＡと共に適用した。培地をＭＳで２回交換した後、ＡＭＰ Ａおよびカルボキシフラーレンを添加し、培養物を３７℃のインキュベーターに 戻した。内因性のグルタミン酸放出によるＮＭＤＡレセプターの二次的な活性化 を防ぐため、ＡＭＰＡおよびカルボキシフラーレンと共に、ＮＭＤＡレセプター アンタゴニスト、ＭＫ−８０１ （１０（Ｍ）を含ませた。 ＮＭＤＡまたはＡＭＰＡの投与から２４時間後に、２００〜４００ｘの位相差 顕微鏡、および染色細胞から培養培地への乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）流出 の測定により、ニューロン死を調べた(Koh and Choi,1987)。細胞死の定量は、 トリパンブルーまたはプロピジウムイオダイド染色、および細胞計数により、い くつかの実験で確認した。 Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃についての結果を図５および６に示す。Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯ Ｈ)₂)₃は、ＮＭＤＡ（図５）およびＡＭＰＡ（図６）により誘導された興奮毒性 ニューロン損傷に対する強力な神経防御を示した。 Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃（３００（Ｍ）は、現在までに行われた全ての実験で少な くとも６０％、ＮＭＤＡによるニューロン死を減少させ、いくつかの実験ではほ ぼ完全に防御した。洗浄された対照に存在するＬＤＨの量を差し引き、ＮＭＤＡ 毒性に特異的なシグナルを得た。ＮＭＤＡのみの場合に生じた細胞死の百分率と してデータをグラフにした。この曝露により、各培養で全ニューロンの５１（９ 、４４（６、および８８（１４％が死亡した。平均値（Ｓ．Ｄ.。^*＝ＮＭＤＡに 対してｐ＜０．０５(多重比較のため、ＡＮＯＶＡの後、スチューデントニュー マンクールズ検定を行うことにより決定)。３回の実験からのプールされたデー タ（図５）は、ニューロン細胞死が７５％減少したことを示している。 Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃は、１００（Ｍで、ＡＭＰＡによるニューロン細胞死を ＞８０％減少させた(図６)。放出された内因性のグルタミン酸によるＮＭＤＡレ セプターの二次的活性化を防ぐため、ＡＭＰＡと共に、ＭＫ−８０１（１０（Ｍ ）を含ませた。値は、平均値（ＳＥＭである。１回の実験当たりｎ＝３〜４）で あり、４回の実験からのデータをプールした。全ニューロン／培養物の４０〜７ ０％であった、ＡＭＰＡ／ＭＫ−８０１のみの場合に生じた細胞死に対する百分 率としてデータをグラフにした。^*＝ＡＭＰＡに対してｐ＜０．０５(多重比較の ため、ＡＮＯＶＡの後、スチューデントニューマンクールズ検定を行うことによ り決定)。 本明細書に記載の実験は、本発明者らの知る限り、細胞防御剤または抗酸化剤 としての、これらの化合物の最初の使用である。 実施例３ ⁴⁵ Ｃａ²⁺トレーサー実験 ＮＭＤＡにより誘導されるニューロン細胞損傷に対する防御が、ＮＭＤＡによ り誘導されるカルシウム流入の減少によるのではないことを確認するため、⁴⁵Ｃ ａ²⁺トレーサー実験を実施した。培養物をＨＢＢＳＳで２回洗浄し、その後、⁴⁵ Ｃａ²⁺トレーサー（０．５Ｃｉ／培養ウェル；NEN，Boston，MA）を含むＨＢＢ ＳＳ中、単独で、またはＣ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃と共に、ＮＭＤＡ（３００（Ｍ） に曝露した。１０分後に、培地を未標識ＨＢＢＳＳで４回交換す ることにより曝露を中止した後、０．２％硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）の 添加により細胞を溶解させた。細胞を２時間ＳＤＳ中に放置した後、溶解物をシ ンチレーションバイアルに移した。各培養ウェルをさらにＳＤＳで洗浄し、その 洗浄液をバイアルに添加し、（−計数を行った。 図７の結果は、カルボキシフラーレンがＮＭＤＡレセプターアンタゴニストで はないことを示している。ＮＭＤＡと共に最大３００（ＭのＣ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂ )₃を同時適用しても、⁴⁵Ｃａ²⁺の蓄積は影響を受けなかった。基底⁴⁵Ｃａ²⁺を全 ての条件から差し引き、ＮＭＤＡレセプター活性化に特異的な⁴⁵Ｃａ²⁺増加を得 た。平均値（ＳＥＭ，ｎ＝４） 実施例４ 血清欠乏によるアポトーシス性ニューロン死 グリア欠損培養物中の皮質ニューロンは、血清を除去してから２４〜４８時間 後にアポトーシス性細胞死を受けるが、これは、細胞体萎縮、ニューロン突起の 断片化、およびヘキスト（Hoechst）３３２５８染色によるクロマチン縮合のよ うな形態学的な変化により特徴付けられる(Dugan et al，1995)。血清欠乏によ るアポトーシス性ニューロン死も、ヘキサカルボキシフラーレンの同時適用によ り軽減された。この損傷は、ＤＮＡのラダー形成、クロマチンの凝縮、細胞の萎 縮、アポトーシス小体の形成、および巨大分子合成阻害剤による防御を含む、ア ポトーシスの典型的な特徴を有することが示されている。血清含有増殖培地をア ミノ酸（グルタミンを除く）を添加した平衡塩溶液で交換することにより、１％ 未満の星状膠細胞を含む培養物中の皮質ニューロンから血清を除去した。洗浄さ れた対照を、ＢＳＳ中に２％ウシ胎児血清、２％ウマ血清を含む培地に戻した。 ２４および４８時間後、ニコン（Nikon）倒位顕微鏡を用いて、１００〜４００ ｘで位相差光学を用いて細胞の写真を撮影した。 さらに、血清除去の４８時間後、もはやトリパンブルーを排除することができ ない細胞を計数することにより、ニューロン細胞死を決定した。図８に示されて いるように、血清除去の開始から４８時間後に、もはやトリパンブルーを排除す ることができない細胞を計数することにより決定されたニューロン細胞死は、ニ ューロン死の著しい減少を示した。１０（Ｍ Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃で処理 された細胞は、ニューロン死の５０％の減少を示した。血清含有培地で維持され た洗浄された対照培養物には、ほとんど死亡が見られなかった。値は平均値（Ｓ ＥＭ。１回の実験当たりｎ＝３〜４）である。この実験は、３回の実験のうちの 代表的なものである。^*＝血清欠乏に対してｐ＜０．０５(多重比較のため、ＡＮ ＯＶＡの後、スチューデントニューマンクールズ検定を行うことにより決定)。 実施例５ Ｃ₆₀上のカルボキシル基の極性位置が神経防御効力を改善する Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃の２つの位置異性体、Ｏ−３ａおよびＲ−３ｂを、ラン パースおよびヒルシュの方法（Lamparth and Hirsch(1990)）に従い、合成し、 精製した。これらの化合物の純度をＮＭＲおよびＵＶ／可視スペクトル分析によ り確認した。Ｏ−３ａ化合物においては、全てのメタノ架橋（methano bridge） がお互いに関してｅ（エクアトリアル）位にあり（ｅ，ｅ，ｅ）、分子はＣ₃対 称を有することが、¹Ｈおよび¹³ＣＮＭＲ分光法で示された。化合物Ｒ−３ｂは 、Ｃ₆₀骨格の３回軸に関してエクアトル方向の帯上にトランス３位で存在するメ タノ架橋を有しており(トランス−３，トランス−３，トランス−３)、Ｄ₃対称 を有する。図１に示された３Ｄ構造は、Ｏ−３ａ上のカルボキシル基の極性分布 、およびＲ−３ｂ上のカルボキシル基のエクアトリアル分布を図示している。 図９は、スピントラップ／ＥＰＲスペクトルから判断されるように、これら２ つの異性体が化学的には同様の^・ＯＨフリーラジカルおよびＯ₂ ^・-フリーラジカル の捕捉能を示すことを示している。図９は、スピントラッピング剤として１００ mM ５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド（ＤＭＰＯ）を用いた、^・Ｏ Ｈラジカル（フェントン（Fenton）反応によりＦｅ²⁺存在下１００μＭＨ₂Ｏ₂か ら合成）およびＯ₂ ^・-ラジカル（キサンチン＋キサンチンオキシダーゼから合成 ）のＥＰＲスペクトルを示している。ヒドロキシルラジカル（左のスペクトル） ：ＤＭＰＯのみ(上)、４μＭ Ｏ−３ａ（中央）、４μＭＲ−３ｂ（下）の存在 下の^・ＯＨ。スーパーオキシドラジカル（右）：ＤＭＰＯのみ(上)、４００μＭ Ｏ−３ａ(中央)、４００μＭ Ｒ−３ｂ（下）の存在下のＯ₂ ^・-。矢 印は、空洞共振器内の未知のラジカルによる偽シグナルである。試料は、ブルー カー（Bruker）２００、Ｘ−バンドＥＰＲスペクトロメーターで、石英フラット セル（６０×１０×０．２５mM）で分析した。設定は、電力＝１．６mW、モジュ レーション（modulation）＝１G、フィールドモジュレーション（field modulat ion）＝１００Hz、Ｒ．Ｇ．＝３．２×１０⁵。 ＥＰＲの結果は、Ｏ−３ａ異性体およびＲ−３ｂ異性体両方が、ほとんどの他 のフリーラジカル捕捉剤に関して報告されている濃度よりも１００から１０００ 倍低い濃度で、^・ＯＨの極めて強力な捕捉剤であることを示している。^・ＯＨに対 するカルボキシフラーレンの捕捉能は、Ｏ₂ ^・-ラジカルに対する効力よりも１０ 倍強い。 Ｏ−３ａ異性体およびＲ−３ｂ異性体は、ＥＰＲ解析では同等の抗酸化剤であ るが、Ｏ−３ａ化合物は、生物学的には、Ｒ−３ｂよりも、ＮＭＤＡレセプター およびＡＭＰＡレセプターにより媒介される損傷に対する効果が高い。これらの 結果は、図１０に示されている。図１０は、Ｏ−３ａは、ＮＭＤＡの適用により 生じる損傷からのわずかに良好な防御を与えるが(Ａ)、ＡＭＰＡにより誘導され るニューロン死に対して実質的により良好な防御を与える（Ｂ）ことを示してい る。値は、平均値±ＳＥＭ。各条件でｎ＝８〜１２。^*＝未処理損傷条件に対し てｐ＜０．０５(多重比較のため、ＡＮＯＶＡの後、スチューデントニューマン クールズ検定を行うことにより決定)。^**＝ｐ＜０．０５で、Ｏ−３ａとＲ−３ ｂに有為差あり。図１０は、マウス脳由来の脂質へＯ−３ａまたはＲ−３ｂのい ずれかと共に取り込まれたスピン標識脂質（５−または１６−ドキシルケトステ アリン酸）のＥＰＲスペクトル（Ｃ）も示している。スピン標識は、成体マウス 脳から抽出された脂質へ、１：１００の割合で添加した。ＥＰＲの設定は、図９ に関する説明に記載したものと同一である。いずれの異性体も、５−ドキシル基 のオーダーパラメーター（Ｓ）にシフトを生じたが、Ｏ−３ａはより大きなＳの 変化を生じた(表１)。Ｏ−３ａはまた、１６−ドキシルケトステアリン酸からの 脂質状態シグナルも、Ｒ−３ｂより大きく変化させ、このことから、Ｏ−３ａが 、脂質の不規則度または流動性を増大させることが示された(表１)。いずれの結 果も、Ｏ−３ａがＲ−３ｂよりも大幅に脂質二重層に侵入しやすいこ とを示唆している。 ＮＭＤＡレセプターおよびＡＭＰＡレセプターにより媒介される損傷からニュ ーロンを防御する活性が高いのに加え、Ｏ−３ａは、内皮細胞培養物および肝細 胞におけるこのような損傷から、Ｒ−３ｂより強化された防御を提供した。この 違いは、明らかに、Ｏ−３ａ異性体の方が、Ｒ−３ｂよりも膜に侵入する能力が 高いためである。Ｏ−３ａの極性が、細胞膜への侵入を容易にしている。このよ うな膜へ侵入する能力は、Ｏ−３ａが、Ｒ−３ｂよりも良好な脂質過酸化からの 細胞膜の防御を与えることを示唆している。したがって、Ｃ₆₀誘導体の防御効率 にとって、官能基の位置（極性vs周囲性(circumferential)）は重要である。 実施例６ 筋萎縮性側索硬化症のトランスジェニックモデルにおける生存に対するカルボキ シフラーレンの効果 運動ニューロン疾患による死亡の最も一般的な死因である、ＡＬＳは、１０， ０００人に１人という割合で発症する。家族性型の疾患（ＦＡＬＳ）は、通常、 常染色体優性であって、症例の１０〜１５％を占めている。１９９３年に、重要 な進展があり、ＦＡＬＳを有するいくつかの家族で、Ｃｕ，Ｚｎ−ＳＯＤ（ｓｏ ｄｌ）遺伝子の変異が同定され(Rosen et al.，1993)、その後の研究で、いくつ かの型のＦＡＬＳでは、変異ＳＯＤ１により活性酸素（ＲＯＳ）生成が増加する ことが、ＡＬＳの原因であるという仮説が立てられた。 ガーニー（Gurney）とその共同研究者らは、ＦＡＬＳ家族に見出されるＧ⁹³Ａ 点突然変異を有するマウスを開発し(Gurney et al，1994)、Ｇ⁹³Ａトランスジェ ニックマウスのＧＩ系統は、ヒトＦＡＬＳの特徴の多くを示す。１８コピーを有 し、野生型動物の４倍のＳＯＤ活性を有するＧＩ系統は、３〜４ヶ月齢で、後肢 の虚弱、グルーミング損傷、および側腹に沿った痩せと共に、運動ニューロン死 を発症する。罹患したマウスは、５ヶ月齢までに死亡した(Gurney et al，1994) 。 ＦＡＬＳを処置する能力を決定するため、ＦＡＬＳマウス（Gurney GI系統） の処置にＣ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃を使用した。１０週齢で、Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃ （＞９０％Ｏ−３ａからなる異性体の混合物）または生理食塩水を含有するアル ゼット（Alzet）ミニ浸透圧ポンプ（２８日、６（ｌ／日、１５mg/kg/日）を腹 腔内に埋め込んだ。１４週齢の時点で、ポンプを交換した。広い場所での歩行の ビデオテープによる評価を行い、ブレスナハン（Bresnahan）スケールを用いて 脊髄損傷スコアを決定した(Basso et al.,1995)。ガーニーとその共同研究者ら により報告されたように、これらの動物は、約９０日齢までに運動に関係した症 状を表し、１２５日齢〜１４５日齢の間に瀕死の状態となる。 図１１は、生理食塩水または１５mg/kg/日のカルボキシフラーレンを含む腹腔 内ミニ浸透圧ポンプで処置されたＦＡＬＳマウスの生存曲線である。これらの結 果は、Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃で処置された群では、死亡が８±２．２日遅延され たことを示している(ｔ検定によりｐ＝０．０４１)。Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)₃処置 されたＦＡＬＳマウスでは、症状の出現も遅く なった。８日という生存の延長は、ｔ検定で統計的有意に達していた(ｐ＝０． ０４１)。ポンプを埋め込まれなかったＦＡＬＳマウス（１２３日、ｎ＝４）ま たは生理食塩水を含むポンプで処置されたＦＡＬＳマウス(１２５日、ｎ＝６)に ついては、生存に違いはなかった。さらに、カルボキシフラーレン(１５mg/kg/ 日)で２ヶ月間処置を受けた野生型動物（ｎ＝６）には、健康または行動に関す る有害な効果は見られず、未処置の同腹子と同程度に活発で、体重も類似してい た(同性内)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｃ 61/125 Ｃ０７Ｃ 61/125 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ， ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ Ｖ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ (72)発明者 リン，ティエン―サン・トム アメリカ合衆国、ミズーリ 63017、チェ スターフィールド、セイルズヴィル・ドラ イブ 180 (72)発明者 ルー，ティエン―ヤー 台湾 117、タイペイ、セクション ４、 シン・ハイ・ロード、レーン 101 143

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．グルタミン酸ＮＭＤＡレセプターによる刺激によりニューロンから放出され るフリーラジカル酸素種により引き起こされる疾患の制御または処置のための医 薬を製造するための、次式 Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)_n Ｉ ［式中、Ｃ₆₀はバックミンスターフラーレンであり、ｎは１〜４である］のカル ボキシル化誘導体および薬学的に許容されるその塩、エステル、およびアミドの 使用。 ２．疾患が、発作、低血糖症、てんかんの間に起こるような低酸素症／虚血など の急性神経学的発作、またはハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索 硬化症（ＡＬＳ）およびＡＩＤＳの神経変性効果などの神経変性疾患のような神 経毒性損傷を含む、請求項１に記載の式Ｉの化合物の使用。 ３．式Ｉにおいてｎが３である、請求項１または２に記載の使用。 ４．一つまたは複数の請求項１で定義した式Ｉの化合物または薬学的に許容され るその塩、エステル、およびアミドと、処置に不活性な担体物質とを含む医薬。 ５．発作、低血糖症、てんかん、もしくは外傷の間に起こるような低酸素症／虚 血などの急性神経学的発作、またはハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮 性側索硬化症（ＡＬＳ）およびＡＩＤＳの神経変性効果のような神経変性疾患に より引き起こされる慢性ニューロン損傷の制御または処置のための、請求項４に 記載の医薬。 ６．式Ｃ₆₀(Ｃ(ＣＯＯＨ)₂)_n［式中ｎは１〜４の整数である］の化合物、薬学的 に許容されるその塩、および薬学的に許容されるそのエステルと、薬学的に許容 される担体とを含む組成物を患者に投与することにより、神経毒性損傷に罹患し た患者において、神経毒性損傷を処置する方法であって、該組成物中に該化合物 が該神経毒性損傷を処置するのに有効な量で含まれている、方法。