DE69631036T2

DE69631036T2 - Isolierung und reinigung von paclitaxel und cephalomannine

Info

Publication number: DE69631036T2
Application number: DE69631036T
Authority: DE
Inventors: C. Ramesh PANDEY; K. Luben YANKOV
Original assignee: Xechem Inc
Current assignee: Xechem Inc
Priority date: 1995-12-13
Filing date: 1996-11-01
Publication date: 2004-09-09
Anticipated expiration: 2016-11-02
Also published as: MX9706180A; DE69631036D1; ATE256116T1; KR19980702168A; HK1005375A1; KR100467531B1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Isolierung und Reinigung von Paclitaxel aus verschiedenen Quellen, die Paclitaxel enthalten, einschließlich organischen Materialien wie Pflanzenmaterialien, Kulturen und Pilzen und insbesondere aus T. brevifolia, der Rinde des Pazifischen Eibenbaums und von T. baccata, T. yunnanensis, T. walichiana. Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf die Abtrennung und Reinigung von Paclitaxel aus Mischungen von Taxanen, die verschiedene Konzentrationen an Paclitaxel und anderen Taxanan enthalten, einschließlich in naher Beziehung stehenden Taxanen, die ungesättigte Seitenketten aufweisen wie Cephalomannin.
Hintergrund der Erfindung
Paclitaxel ist ein gut bekanntes Chemotherapeutikum für die Behandlung von verschiedenen metastatischen Krebstypen. Es wurde genehmigt von der Food and Drug Administration (FDA) für die Behandlung von Eierstock- und Brustkrebs und befindet sich zum gegenwärtigen Zeitpunkt in klinischen Tests für die Behandlung von Lungen- und Dickdarmkrebs.
Die Verbindung ist ein natürliches Produkt, das primär extrahiert wird aus der Rinde des Pazifischen Eibenbaumes, Taxus brevifolia und findet sich ferner in T. baccata, T. walichiana und T. yunnanensis und anderen Biomassen-Extrakten von Pflanzenmaterialien, einschließlich T. hicksii, T. densiformis, T. gem, T. wardii, T. cuspidata, T. capitata, T. brownii und T. dark green spreader, die eine Mischung von Molekülen vom Taxan-Typ enthalten. Paclitaxel ist ferner erhältlich aus kultivierten Pflanzenzellen und Pilzen. Die Verbindung ist im Handel erhältlich in Reagenzreinheit, beispielsweise von der Firma Aldrich Chemical Co., Produkt Nr. 41,701-7, von der Firma Sigma Chemical Company, Produkt Nr. T 7402 und T 1912, in Abhängigkeit von der Quelle, aus der es stammt, von der Firma Fluka Chemie AG, Produkt Nr. 86346 und von der Firma ICN Biomedicals als Produkt Nr. 193532.
Die Konzentration von Paclitaxel in verschiedenen Rohmaterialien ist typischerweise niedrig und liegt beispielsweise in der Größenordnung zwischen 0,0004–0,08% (w/w) in der Rinde der Pazifischen Eibe. Derart niedrige Konzentrationen machen die Extraktion und Reinigung der Verbindung zu klinischen Standards, ausgehend von den Rohmaterialien, sehr aufwendig und infolgedessen unpraktisch auf kommerzieller Basis.
Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind verschiedene Verfahren zur Extraktion und Reinigung von Paclitaxel bekannt. Wani u. A. beschreiben in J. Am. Chem. Soc. 93,9: 2325–2327 (1971) die Extraktion von der Stammrinde von T. brevifolia mit Ethanol, das dann konzentriert und extrahiert wird mit Chloroform und Wasser, wobei sich das Paclitaxel in der Chloroform-Phase findet. Das Paclitaxel wird weiter gereinigt durch Kolonnenchromatographie über Florisil, Sephadex und über Silicagelkolonnen.
Eine Methode (1983) des National Cancer Institute (NCI) beruht auf der Extraktion von der Stammrinde von T. brevifolia mit Methanol, worauf sich eine Extraktion mit Methylenchlorid anschließt. Der Methylenchloridextrakt wird getrocknet und dann gelöst in Aceton, worauf sich eine Ausfällung von Verunreinigungen mit n-Hexan anschließt. Die lösliche Fraktion wird weiter durch Kolonnenchromatographie gereinigt.
Beide Verfahren, das Verfahren von Wani u. A. und das NCI-Verfahren, sind jedoch nicht sehr effizient oder kommerziell praktisch, da sie zu sehr niedrigen Ausbeuten in der Größenordnung von etwa 0,02% oder darunter führen. Dies ist zurückzuführen auf das Vorhandensein von anderen Taxanen, wie einem sehr engen Analogen des Paclitaxels, dem Cephalomannin mit sehr ähnlichen Strukturen und sehr ähnlichen physikalischen Eigenschaften gegenüber Paclitaxel. Verwiesen wird auf 1, die die chemischen Strukturen von Paclitaxel und Cephalomannin veranschaulicht.
In einem Verfahren, entwickelt von Potier u. A., beschrieben in J. Nat. Prod., 47,1: 131–137 (1984), wird die Fällungsstufe in dem NCI-Verfahren ersetzt durch eine Stufe, bei der eine Lösungsmittelpaar-Extraktionsmethode angewandt wird, d. h. eine Methode, bei der sukzessive Extraktionen durchgeführt werden mit polaren Lösungsmitteln, deren Polarität progressiv ansteigt. Nach weiteren Stufen der Chromatographie über Aluminiumoxid- und Silicakolonnen wird das Paclitaxel zu einer Mischung aus Paclitaxel und Cephalomannin konzentriert. Das Paclitaxel wird dann von dem Cephalomannin durch HPLC getrennt, mit einer Ausbeute an Paclitaxel, die beträchtlich höher ist als jene, die erhalten wird nach dem Verfahren von Wani u. A. oder nach dem NCI-Verfahren.
Das Verfahren von Potier u. A. leidet jedoch in ähnlicher Weise wie das Verfahren von Wani u. A. und das NCI-Verfahren an dem Hauptnachteil des Erfordernisses der Abtrennung von multiplen Taxanen mit ähnlichen Trennungsparametern in einem Endkonzentrat durch Verwendung von multiplen konventionellen chromatographischen Trennungen, um ein gereinigtes Paclitaxelprodukt zu erhalten. Da die kommerzielle Gewinnung von Paclitaxel im großen Maßstab unter Verwendung von mehrfachen üblichen chromatographischen Trennungen zur Erzielung eines klinisch akzeptablen reinen Paclitaxels derartiger Methoden bedarf, ist diese kommerzielle Gewinnung vom praktischen Standpunkt aus unpraktisch, aufgrund der großen Kosten, die mit derartigen multiplen chromatographischen Trennungen verbunden sind.
Mehrfache Trennungen sind für den größten Teil notwendig, aufgrund der Ähnlichkeit sowohl der Struktur als auch der Eigenschaften von Paclitaxel und Cephalomannin. Wie in 1 dargestellt, besteht die einzige Differenz in ihren Strukturen darin, dass die Aminogruppe in der Seitenkette des Paclitaxels mit Benzoesäure acyliert ist und darin, dass im Falle des Cephalomannins die Aminogruppe der Seitenkette mit Tiglinsäure acyliert ist, die eine Doppelbindung aufweist.
Es sind Methoden bekannt, die sich von einer chromatographischen Trennung von Paclitaxel von Cephalomannin unterscheiden, wie eine chemische Modifizierung der Seitenketten-Doppelbindung im Cephalomannin. Beispielsweise beschreiben Kingston u. A. in J. Nat. Prod., 55: Nr. 2, 259 261 (1992) die katalytische Oxidation der Doppelbindung in der Seitenkette des Cephalomannins in Gegenwart von OsO₄ unter Gewinnung eines Diols, das dann von Paclitaxel nach chromatographischen Verfahren abgetrennt und umkristallisiert wird. Im Falle dieses Verfahrens besteht jedoch ein Problem bei Verwendung von ungereinigten Taxanmischungen, da die Oxidation, die durch OsO₄ katalysiert wird, nicht anwendbar ist auf rohe Extrakte aufgrund einer geringen Selektivität bezüglich der Doppelbindung der Seitenkette des Cephalomannins, das, wenn es verwendet werden könnte, die Kosten der Extraktion und Reinigung beträchtlich reduzieren würde. Zusätzlich ist die Verwendung von OsO₄ bei der Herstellung von Pharmazeutika nicht wünschenswert, aufgrund der starken Toxizität der Verbindung.
In den US-A-5 334 732 und 5 336 684 im Namen von Murray u. A. wird die Oxidation der Seitenkette des Cephalomannins durch Ozon beschrieben. Diese Verfahren sind ebenfalls nicht wünschenswert, da die Verwendung von Ozon in einem Oxidationsprozess mit rohen Extrakten zu vielen unerwünschten Reaktionen mit Paclitaxel führt und weil die Oxidation durch Ozonolyse stark und nicht selektiv bezüglich Verbindungen mit vielen funktionellen Gruppen ist wie Paclitaxel und Cephalomannin und weil viele unerwünschte Oxidationen von anderen funktionellen Gruppen auftreten können, wie Aldehyden, Ketonen, Aminen usw. in dem Paclitaxelmolekül oder der Doppelbindung, die sich in der Innenseite des Taxanringes von entweder Paclitaxel oder Cephalomannin findet. Es besteht ferner das kostspielige Erfordernis eines Ozongenerators.
Infolgedessen ist die Isolierung und Reinigung von Paclitaxel aus einer rohen Biomasse, die eine komplexe Mischung von Taxanen enthält oder im anderen Extrem aus gereinigteren Mischungen, die primär Paclitaxel und Cephalomannin enthalten, zum gegenwärtigen Zeitpunkt beschränkt auf die vorerwähnten nicht-ökonomischen chromatographischen Trennmethoden und/oder die nicht-selektiven Oxidationsmethoden, weshalb ein starkes und unerfülltes Bedürfnis nach einem ökonomisch praktizierbaren Verfahren zur Trennung der wertvollen Anti-Tumor-Verbindung Paclitaxel von ihrem nahen Analogen Cephalomannin besteht wie auch von anderen nahen verwandten Taxanen.
Es ist infolgedessen ein Ziel dieser Erfindung, ein einfacheres und kostengünstigeres Verfahren bereitzustellen im Vergleich zu den zum gegenwärtigen Zeitpunkt zur Ver fügung stehenden Methoden für die ökonomische Isolierung und Reinigung der wichtigen chemotherapeutischen Verbindung Paclitaxel.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Um das im Vorstehenden beschriebene Ziel zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung ein neues und besonderes Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Paclitaxel aus rohen Biomasse-Extrakten bereit, die eine komplexe Mischung von Verbindungen vom Taxan-Typ enthalten, einschließlich Paclitaxel und insbesondere von der rohen Rinde von T. brevifolia, T. baccata, T. yunnanensis und T. walilichiana, wie auch von Pflanzenmaterial wie den Nadeln und Zweigen von verschiedenen Taxus-Spezies und wozu zur Erfindung weiterhin gehört die Downstream-Reinigung von Paclitaxel, erzeugt aus Quellen, wie Zellkulturen von Taxus-Spezies und Paclitaxel erzeugenden Pilzen.
Infolgedessen stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt ein Verfahren für die Isolierung und Reinigung von Paclitaxel aus organischem Material bereit, das unter Anderem eine Mischung von Taxanen enthält, wobei das Verfahren umfasst die Lösungsmittelextraktion des organischen Materials unter Erzeugung einer Paclitaxel enthaltenden Zusammensetzung, worauf aus der Zusammensetzung auf chromatographischem Wege Paclitaxel und andere Taxane mittels eines chromatographischen Lösungsmittels abgetrennt werden. Vorzugsweise schließt sich hieran eine Stufe einer Flash-chromatographischen Trennung von Paclitaxel und anderen Taxanen auf einer Normal-Phasen-Chromatographie-Kolonne an, die Silicagel als Absorbens enthält, unter Erzeugung einer raffinierten Mischung, die Paclitaxel, Cephalomannin und andere Taxane enthält. Die erhaltene Mischung wird dann mit einem Halogen, vorzugsweise Brom unter Bedingungen umgesetzt, die wirksam sind für die selektive Halogenierung des ungesättigten Seitenkettenrestes des Cephalomannins, unter Erzeugung einer diastereomeren Mischung von Dihalocephalomanninen. Paclitaxel wird dann leicht und einfach von der Mischung in hoher Ausbeute abgetrennt.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung kann jede Stufe in dem Verfahren der Isolierung und Reinigung von Paclitaxel aus rohem organischen Material begleitet werden durch die Stufe der selektiven Halogenierung von Cephalomannin, vor oder nach Extraktion und Reinigung durch übliche chromatographische Techniken, z. B. unabhängig davon, ob die Mischung aus einem rohen Extrakt besteht oder aus einer mehr raffinierten Mischung aus im Wesentlichen Paclitaxel, Cephalomannin und anderen Taxanen.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung wird eine hochwirksame und ökonomische Methode zur Abtrennung von Paclitaxel in praktisch quantitativer Ausbeute von dem nahen Analogen Cephalomannin durch eine neue chemische Modifizierung des Cephalomannins bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin veranschaulicht durch Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, Beispielen und Zeichnungen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht eine verallgemeinerte Darstellung der Strukturen von Paclitaxel und Cephalomannin.
2 veranschaulicht eine verallgemeinerte Darstellung der Strukturen von verschiedenen ungesättigten Taxanen und funktionellen Gruppen, die hierin enthalten sind, mit verschiedenen ungesättigten Seitenketten, die gemäß dieser Erfindung halogeniert werden können.
3 ist ein Arbeitsablaufprogramm einer bevorzugten Ausführungsform eines Aspektes der Erfindung bezüglich der Isolierung und Reinigung von Paclitaxel von T. brevifolia.
4 veranschaulicht ein bevorzugtes Reaktionsschema für die selektive Bromierung von Cephalomannin.
5 ist ein UV-Spektrum von Paclitaxel, das gemäß dieser Erfindung erhalten wurde.
6 ist ein IR-Spektrum von Paclitaxel, das gemäß dieser Erfindung erhalten wurde.
7a ist ein Protonen-NMR-Spektrum von Paclitaxel, das gemäß dieser Erfindung erhalten wurde.
7b ist ein Kohlenstoff-13-NMR-Spektrum von Paclitaxel, das gemäß dieser Erfindung erhalten wurde.
8a und 8b sind EI-MS von Paclitaxel, das gemäß dieser Erfindung erhalten wurde.
9 ist ein DCI-MS von Paclitaxel, das gemäß dieser Erfindung erhalten wurde.
10 ist ein FAB-MS (positive Ionenart) von Paclitaxel, das gemäß dieser Erfindung erhalten wurde.
11 ist ein FAB-MS (negative Ionenart) von Paclitaxel, das gemäß dieser Erfindung erhalten wurde.
12 ist eine HPLC-Analyse von Paclitaxel, das gemäß dieser Erfindung erhalten wurde.
13 ist ein TGA-Spektrum von Paclitaxel, das gemäß dieser Erfindung erhalten wurde.
14 ist ein DSC-Spektrum von Paclitaxel, das gemäß dieser Erfindung erhalten wurde.
DETAILLIERTE DISKUSSION VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
In dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren wird ein einfaches und ökonomisches Verfahren für die Extraktion von gereinigtem Paclitaxel aus Biomassen von verschiedenem Ursprung bereitgestellt, wie aus Pflanzenmaterial, das eine Mischung von Taxanen enthält, z. B. aus der Rinde von T. brevifolia (Pazifische Eibe), T. yunnanensis, aus Nadeln und Zweigen von anderen Taxus-Spezies und von anderen Quellen von Paclitaxel wie jenen, die erzeugt werden aus Zellkulturen der Taxus-Spezies und von Paclitaxel erzeugenden Pilzen.
Das Verfahren umfasst die selektive Halogenierung, vorzugsweise Bromierung, von ungereinigten, teilweise gereinigten oder gereinigten Mischungen aus Paclitaxel, Cephalomannin und anderen Taxan-Derivaten, die ungesättigte Seitenketten aufweisen, um bestimmte Taxane zu transformieren, ohne Paclitaxel zu zerstören.
Gemäß einer Ausführungsform dieses Verfahrens wird eine Biomasse, die eine komplexe Mischung von verschiedenen Taxanen enthält, falls dies der Fall ist, vorzugsweise verarbeitet zu einem Medium von einem hohen Verhältnis von Oberflächenbereich zu Volumen, um die Massenübertragung von Paclitaxel während einer anfänglichen Extraktionsphase zu erhöhen, vorzugsweise mit einem kurzkettigen Alkohol, wie Methanol, Ethanol usw.. Beispielsweise wird bei Verwendung der Rinde von T. brevifolia als Lieferant, in der die Konzentration an Paclitaxel in typischer Weise geringer als 0,1% w/w ist, die Rinde zu einer feinen Mischung vermahlen, worauf sie mit Methanol extrahiert wird über einen Zeitraum, der als ausreichend angesehen wird, dass praktisch sämtliches Paclitaxel in der Probe extrahiert wird. Der Methanolextrakt wird dann konzentriert, beispielsweise mittels eines Rotationsverdampfers, zu einem Konzentrat, das vorzugsweise ein etwa 20-fach geringeres Volumen hat als der Originalextrakt.
Eine weitere Extraktion kann durchgeführt werden beispielsweise durch Aufteilung des Methanolkonzentrates zwischen einem geeigneten Lösungsmittel wie Methylenchlorid, Chloroform oder Ethylendichlorid und Wasser, vorzugsweise in einem Verhältnis von 1 : 1 v/v, wobei die in Wasser löslichen Komponenten in die wässrige Phase extrahiert werden. Derartige Komponenten können beispielsweise bestehen aus in Wasser löslichen Glycosiden von Paclitaxel und anderen mehr polaren Verbindungen der Mischung, die für eine zusätzliche Aufarbeitung von potentiell wertvollen Komponenten aufbewahrt werden kann. Im Falle dieser Ausführungsform wird die Paclitaxel enthaltende organische Lösungsmittelphase eingedampft zu einem Paclitaxel enthaltenden Rückstand und kann weiter gereinigt werden durch Sedimentation der Verunreinigungen. Beispielsweise werden durch Auflösen des Rückstandes in Aceton teerige, nicht-polare Verunreinigungen ausgefällt bei Zugabe eines gleichen Volumens von Hexanen, worauf sie abfiltriert werden können. Das Aceton-Hexanlösliche Filtrat wird dann konzentriert und der Rückstand wird aus frischen Hexanen ausgefällt. Der erhaltene Niederschlag wird dann unter hohem Vakuum getrocknet (1 mm bis 2 mm) bei 40°C.
Im Falle dieser Ausführungsform hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn der Rückstand als nächstes gelöst wird in einer minimalen Menge eines chromatographischen Lösungsmittels, wie Methylenchlorid oder Ethylendichlorid, worauf er einer Flash-Chromatographie über einer Silicagelkolonne unterworfen wird. Die mobile Phase kann z. B. eine Mischung aus Aceton und Methylenchlorid oder Ethylendichlorid in einem Volumenverhältnis von 1 : 9 bis 3 : 7 v/v sein. Die ersten wenigen Fraktionen der Kolonne enthalten niedrig-polare Verbindungen, worauf Fraktionen folgen, die verschiedene Konzentrationen an Paclitaxel und Cephalomannin enthalten. Nachdem die Fraktionen aus der Kolonne eluiert wurden, wird das Silicagel gewaschen, beispielsweise mit Aceton und Methanol und das Eluierungsprodukt wird verworfen.
Fraktionen, die Paclitaxel und Cephalomannin enthalten, werden darauf miteinander vereinigt und eingedampft, um wiederum einen Paclitaxel enthaltenden Rückstand zu erzeugen. Dieser Rückstand wird danach vorzugsweise in einem chlorierten Lösungsmittel gelöst, wie Tetrachlorkohlenstoff, Methylenchlorid, Chloroform oder Ethylendichlorid, unter Erzeugung einer Lösung, in der verschiedene ungesättigte Taxane halogeniert werden unter Bedingungen, die wirksam sind für die selektive Halogenierung der ungesättigten Seitenketten-Doppelbindung im Cephalomannin (und anderen Taxanen, die eine ungesättigte Seitenkette aufweisen) unter Erzeugung einer diastereomeren Mischung von Dihalocephalomanninen in Lösung mit Paclitaxel und anderen in der Seitenkette halogenierten Taxanverbindungen. Obgleich sämtliche Halogene für die Verwendung im Rahmen dieser Erfindung empfohlen werden, wird Brom bevorzugt verwendet aufgrund seiner hohen Wirksamkeit und niedrigen Kosten. Vorzugsweise wird sämtliches Cephalomannin, das vorhanden ist, praktisch vollständig in die diastereomere Mischung von Dihalocephalomanninen überführt, um eine leichte Abtrennung von Paclitaxel aus der Mischung zu erzielen.
Die Taxane in dem chlorierten Lösungsmittel werden ebenfalls vorzugsweise unter Bedingungen der Dunkelheit bromiert unter kräftigem Rühren und bei einer Temperatur nahe 0°C. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist wünschenswert niedrig derart, dass die Geschwindigkeit der Erzeugung von Bromwasserstoffsäure beschränkt ist und derart, dass eine geringe oder keine Hydrolyse von Resten des Paclitaxels stattfindet. Nach der chromatographischen Analyse, beispielsweise durch HPLC, um zu bestimmen, ob sämtliches oder praktisch sämtliches des vorhandenen Cephalomannins vollständig umgesetzt wurde, wird die Zugabe von Brom beendet und die bromierte Lösungsmittellösung, enthaltend unter Anderem Paclitaxel und Dibromocephalomannin-Isomere wird vorzugsweise gewaschen, beispielsweise zunächst mit einer verdünnten Lösung von Natriumsulfat, worauf sich eine Wäsche mit Natriumbicarbonat anschließt, um jegliches Brom oder Bromwasserstoffsäure, die während der Reaktion gebildet wurde, zu entfernen oder zu neutralisieren.
Die organische Schicht wird ferner gewaschen mit Wasser und getrocknet mit wassertreiem Natriumsulfat und danach zur Trockene eingedampft und der feste Rückstand wird in einer kleinen Menge eines Lösungsmittels gelöst, z. B. Methylenchlorid, und Fraktionen, die Dibromocephalomannin-Isomere enthalten, können auf chromatographischem Wege abgetrennt werden von Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, beispielsweise durch Kolonnenchromatographie über einer Silicagelkolonne, vorzugsweise mit einer Aceton- und Ethylendichloridmischung im Verhältnis von 1 : 9 v/v. Eluierte Fraktionen, die Paclitaxel enthalten, aufgrund einer TLC- und HPLC-Analyse werden miteinander vereinigt und dann zu einem trockenen festen Rückstand eingedampft, aus dem gereinigtes Paclitaxel gewonnen werden kann durch Auflösen der festen Masse in Aceton und Auskristallisation von Paclitaxel mit Hexanen. Die Kristalle werden abfiltriert, gewaschen und zu dem Endprodukt getrocknet.
Das Verfahren ist einfach und leicht durchzuführen. Vorzugsweise werden Analysen des Produktstromes und von Nebenproduktströmen bezüglich Paclitaxel und Cephalomannin durchgeführt durch HPLC und TLC derart, dass jeglicher Verlust an Produkt vermieden werden kann. Wie gezeigt, ist die Halogenierung, vorzugsweise Bromierung von Cephalomannin ein neuer und zweckmäßiger Weg zur Erhöhung der Selektivität von Paclitaxel während der chromatographischen Trennung von Mischungen, die sowohl Paclitaxel als auch Cephalomannin enthalten, und ungleich verschiedenen berichteten chemischen Modifizierungen von Taxanen können die Bedingungen der Bromierung gesteuert werden derart, dass kein beträchtlicher Verlust an Paclitaxel während des Prozesses auftritt. 3 veranschaulicht ein bevorzugtes Verfahrensschema für die Isolierung und Reinigung von Paclitaxel von T. brevifolia und 4 veranschaulicht ein bevorzugtes Reaktionsschema für die selektive Bromierung von Cephalomannin.
Gemäß dieser Erfindung ist das Trennungsverfahren weder abhängig von der Konzentration des vorhandenen Paclitaxels noch von der Zusammensetzung der komplexen Mischungen, die die Ausgangspunkte für die Isolierung und Reinigung des Paclitaxels darstellen. Infolgedessen kann das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren in geeigneter Weise angewandt werden auf die Downstream-Isolierung und Reinigung von Paclitaxel von anderen Quellen von Paclitaxel wie kultivierten Pflanzenzellen und Paclitaxel erzeugenden Pilzen, mit der Stufe der selektiven Halogenierung, die empfohlen wird zur Anwendung in jeder Stufe des Verfahrens zur Erleichterung der Isolierung und Reinigung von Paclitaxel.
Im Falle von Mischungen, die Cephalomanin enthalten sowie Mengen von etwa 1 bis etwa 99,9% Paclitaxel ist das Halogenierungsverfahren ähnlich dem oben beschriebenen Verfahren. Die Mischung wird vorzugsweise in einer großen Menge an chloriertem Lösungsmittel, beispielsweise CCl₄ oder CHCl₃ gelöst, und nach Abkühlung auf nahe 0°C unter Rühren wird eine stoichiometrische Menge an Brom (1,2 molare Äquivalente relativ zu Cephalomannin), verdünnt mit CCl₄ oder CHCl₃ zugegeben, bis das Cephalomannin vollständig bromiert ist. Die vollständige Reaktion sollte im Dunkeln durchgeführt werden bei Temperaturen, die nicht über 20°C an steigen sollten, vorzugsweise 5°C, und das Verfahren sollte überwacht werden, z. B. durch HPLC-Analyse. Nachdem die Bromierung beendet ist, wird die Reaktionsmischung gewaschen, um überschüssiges Brom zu entfernen.
In sämtlichen Fällen werden das Cephalomannin und andere ungesättigte Taxane bromiert, bei einer hohen Wiedergewinnung des Paclitaxels. Die erhaltenen Mischungen, die Paclitaxel und bromierte Verbindungen enthalten, werden getrennt und gereinigt, unter Anwendung von unterschiedlichen Methoden wie einer Chromatographie und Umkristallisation. Die Transformation des Cephalomannins in das weniger polare Dibromoderivat führt zu Möglichkeiten einer leichteren Abtrennung von Paclitaxel aus der Mischung.
Die Anzahl an molaren Äquivalenten von Brom, die der Mischung zugegeben wird, hängt hauptsächlich ab von der Konzentration an dem Cephalomannin und den anderen ungesättigten Verbindungen. Im Allgemeinen erfordert eine weniger reine Mischung (die eine hohe Menge an ungesättigten Taxanen relativ zu Cephalomannin enthält) mehr molare Äquivalente von Brom, um die ungesättigten Taxane vollständig zu bromieren als eine reinere Mischung. 2 veranschaulicht die Struktur von verschiedenen ungesättigten Taxanen. Enthält die Mischung einen hohen Gehalt an ungesättigten Verbindungen wie Taxicin, Taxicin-1, Taxinin und/oder Brevifoliol, so sind die molaren Äquivalente höher, da sie mehr als 1 molares Äquivalent an Brom absorbieren.
Lösungsmittel, die im Rahmen des Verfahrens der Halogenierung verwendet werden können, müssen inert gegenüber dem Halogen sein, das verwendet wird, insbesondere gegenüber dem bevorzugten Brom. Geeignete und bevorzugt verwendete Lösungsmittel gemäß dieser Erfindung sind chlorierte Lösungsmittel wie CCl₄, CHCl₃, CH₂Cl₂, C₂H₄Cl₂, wobei CCl₄ das am meisten bevorzugte Lösungsmittel ist. Das Halogenierungsverfahren ist am meisten effektiv innerhalb eines Temperaturbereiches von etwa –20°C bis etwa +20°C, vorzugsweise von etwa –5°C bis etwa 5°C bei Verwendung von Brom. Ein bevorzugtes Reagenz für die obigen Reaktionen ist 0,01 M bis 0,1 M Brom in Tetrachlorkohlenstoft oder Chloroform, die im Handel erhältlich sind.
Ein üblicher Erfahrungsschatz würde lehren, dass bei Verwendung eines Halogens, wie Brom zur Bromierung von Taxan-Verbindungen, die verschiedene funktionelle Gruppen aufweisen, die empfindlich sind gegenüber Brom oder anderen Halogenen, verschiedene unerwünschte Reaktionen des Paclitaxels stattfinden würden oder im Falle der anderen Verbindungen, die in 2 aufgelistet sind. Im Gegensatz hierzu wurde jedoch gefunden, dass die Selektivität der Seitenketten-Doppelbindung des Cephalomannins in unerwarteter Weise sehr hoch ist, wie auch im Falle der selektiven Bromierung von anderen Taxanen, die exocyclische Doppelbindungen enthalten. Im Falle des Verfahrens dieser Erfindung wird Paclitaxel weder in ins Gewicht fallender Weise abgebaut noch während der Reaktion bromiert. Paclitaxel kann jedoch zu verschiedenen nicht identifizierten Verbindungen abgebaut werden, wenn die Reaktion einer großen Lichtmenge ausgesetzt wird oder falls ein großer Überschuss an Halogen verwendet wird. Jeglicher Abbau von Paclitaxel während der Halogenierungs-(Bromierungs-)reaktion kann jedoch leicht vermieden werden durch periodische Überwachung der Reaktion durch HPLC.
Beispiele
Die folgenden Beispiele beziehen sich auf die Reinigung von Paclitaxel nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Prozesses. Sämtliche Chemikalien wurden verwendet, wie sie vom Hersteller/Lieferanten erhalten wurden. Das Paclitaxel und das Cephalomannin, die erhalten wurden von sämtlichen Produkt- und Nebenproduktströmen wurden überwacht durch Dünnschicht-Chromatographie unter Verwendung von Merck #5554, F₂₅₄Silicagelplatten und durch HPLC. Das HPLC-System bestand aus einer Waters 510-Pumpe, einem 660E-System-Kontroller, einem 712 WISP- oder 710E WISP-Autoinjektor, einem Waters 490-Programm-Multiwellenlängen-Detektor, einem Waters 990-Photodioden-Array-Detektor und einem NEC APCIV-Computer sowie einem Waters LambdaMax Model 481-Spektrophotometer und Datamodul. Die verwendeten HPLC-Kolonnen umfassten eine 3,9 mm × 300 mm Phenyl-Umkehr-Phasen Waters μbondapak Kolonne sowie eine Phenyl-Guard-Kolonne. Das Silicagel für die Flash-Chromatographie bestand aus einem Silicagel mit einer Maschengröße von 32–63 mm, erhalten von ICN Biomedicals.
BEISPIEL 1
Reinigung von Paclitaxel aus einer rohen Biomasse
Stufe 1
Rinde von der Pazifischen Eibe, Taxus brevifolia, wurde zerschreddert auf eine Größe zwischen 2 bis 4 mm. Die Konzentration von Paclitaxel in der Rinde lag zwischen 0,03–0,1% w/w. 45 kg der Rinde wurden in einen Tank aus rostfreiem Stahl eingeführt. Die Rinde wurde dreimal mit 150 l Methanol extrahiert. Jede Extraktion erfolgte während eines Zeitraumes von 5 Tagen unter häufiger Rezirkulation des Extraktes, um die Vermischung zu fördern. Der Extrakt wurde konzentriert durch Rotationsverdampfung auf ein Konzentrat eines Volumens zwischen 10–15 l. Die Temperatur des Extraktes überschritt nicht 40°C. Nahezu 99% des Paclitaxels wurden in die Methanolphase nach dieser Methode extrahiert.
Stufe 2
Das Methanolkonzentrat aus der Stufe 1 wurde aufgeteilt, beispielsweise zwischen Methylenchlorid oder Ethylendichlorid und dergleichen sowie Wasser. Zu 15 l des Methanolextraktes wurden gleiche Volumina an Methylenchlorid und Wasser zugegeben. Die Mischung wurde langsam 15 Minuten lang gerührt und danach 2 Stunden lang stehen gelassen. Die zwei Phasen trennten sich. Die Methylenchloridphase wurde weiter zur Isolierung des Paclitaxels verarbeitet. Wenn nach einer Analyse Paclitaxel in der wässrigen Phase zurückgeblieben war, wurde diese mit Methylenchlorid reextrahiert und die Methylenchloridfraktion wurde mit der Fraktion von der ersten Extraktion vereinigt. Methanol (0,5–1 l) wurde zu der Mischung zugegeben, wenn sich Emulsionen während des Vermischens bildeten, um sie aufzubrechen. Der Methylenchlorid-Extrakt wurde durch Rotationsverdampfung zur Trockene eingedampft. Der feste Rückstand lag zwischen 0,9–1,1 kg, enthaltend 1,8–2,2% w/w Paclitaxel. Die Temperatur des Produktes während der Verarbeitung wurde nicht auf über 40°C ansteigen gelassen.
Stufe 3
Die wässrige Fraktion von der Stufe 2 enthielt Glycoside des Paclitaxels, 10-Deacetylbaccatin III, Baccatin III und andere polare Verbindungen. Zu 35 l der wässrigen Fraktion wurden 5 l Salzlösung zugegeben. Diese Fraktion wurde dann mit 20 l Ethylacetat extrahiert. Die zwei Phasen wurden voneinander getrennt. Die obere, die Ethylacetatschicht, enthielt Glycoside und Paclitaxel, 10-Deacetylbaccatin III, Baccatin III und andere polare Verbindungen. Die untere Phase, die wässrige Phase, wurde mit Ethylacetat reextrahiert und die Ethylacetatfraktion wurde mit der gleichen Fraktion von der früheren Extraktion vereinigt. Die vereinigte Ethylacetatfraktion, die zwischen 30–35 l lag, wurde dann durch Rotationsverdampfung konzentriert auf eine viskose dunkelbraune Lösung eines Volumens von 2,8–3,2 l. Dieses Produkt wurde für eine weitere Verarbeitung zur Isolierung von Glycosiden aufbewahrt.
Stufe 4
Der feste Methylenchloridrückstand der Stufe 2 wurde in 2 l Aceton gelöst. Ein gleiches Volumen von Hexanen wurde unter Bedingungen einer intensiven Bewegung zugesetzt. Polare Verunreinigungen wurden unter diesen Bedingungen ausgefällt. Sie wurden absitzen gelassen und die überstehende Flüssigkeit wurde für eine weitere Verarbeitung abdekantiert. Der Niederschlag wurde gewaschen mit Aceton/Hexanen (1/1 v/v) und das Filtrat wurde mit der vorerwähnten überstehenden Flüssigkeit vereinigt. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf ein Drittel (1/3) des Volumens durch Rotationsverdampfung eingedampft. Der viskose Rückstand lag bei 1,5 l–3,0 l und hatte eine gelblich-braune Farbe.
Stufe 5
Der Aceton/Hexan-Rückstand aus der Stufe 4 wurde tropfenweise zu 10 ~ 15 l Hexanen zugegeben unter kräftigem Rühren. Ein hellgelbes Material begann sich auszuscheiden. Nach ungefähr 8 Stunden wurde dieses Material abfiltriert und unter hohem Vakuum getrocknet (1 mm bis 2 mm) bei 40°C unter Gewinnung von etwa 0,5– 0,6 kg Material.
Stufe 6
Der feste Rückstand von der Stufe 5 wurde danach in 0,5 l einer Mischung aus Aceton-Methylenchlorid, 1 : 9 v/v gelöst und einer Flash-Chromatographie unterworfen unter Verwendung einer Silicagelkolonne unter Verwendung des gleichen Lösungsmittels wie in der mobilen Phase. Die Menge an verwendetem Silicagel lag zwischen 3,5–4 kg. Die Fraktionen wurden in Volumen von 1 l aufgefangen. Jede Probe wurde durch TLC und HPLC analysiert. Cephalomannin wurde mit Paclitaxel co-eluiert. Die Fraktionen, die Paclitaxel und Cephalomannin enthielten, wurden miteinander vereinigt und durch Rotationsverdampfung zur Trockene eingedampft. Der feste Rückstand bestand aus einer rohen Mischung von Paclitaxel und Cephalomannin zwischen 55 g bis 70 g mit 45–55% w/w Paclitaxel oder etwa 36 g–40 g Paclitaxel.
Stufe 7
Eine rohe Mischung aus Paclitaxel und Cephalomannin aus Stufe 6, von der gefunden wurde, dass sie nach Analyse 28,8% w/w Cephalomannin und 51,1% w/w Paclitaxel enthielt, wurde daraufhin chemisch modifiziert, um das Paclitaxel von dem Cephalomannin zu trennen. 10 g der rohen Mischung wurden in 1 l eines chlorierten Lösungsmittels gelöst, wie beispielsweise Tetrachlorkohlenstoff, Chloroform, Methylenchlorid oder Ethylendichlorid. Im Falle dieser bevorzugten Ausführungsform wird eine 0,01 M Lösung von Brom in Tetrachlorkohlenstoff sehr langsam mit der rohen Lösung unter Bedingungen der Dunkelheit und bei einer Temperatur von 0°C unter kräftigem Mischen umgesetzt. Der Reaktionsverlauf wurde durch HPLC überwacht. Die Bromierungsreaktion wurde beendet, wenn das Cephalomannin vollständig umgesetzt war. Spurenmengen von Brom wurden durch Waschen mit einer wässrigen Lösung von Natriumsulfit entfernt. Bromwasserstoffsäure, die sich während der Reaktion bildete, wurde mit einer verdünnten Lösung von Natriumbicarbonat (0,5%, w/w) ausgewaschen. Der erhaltene organische Extrakt wurde dann mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und auf einem Rotationsverdampfer zu einem festen Rückstand konzentriert, der 13,2 g wog.
Stufe 8
Der bromierte Rückstand von Stufe 7 wurde in einer Aceton/Methylenchloridmischung gelöst, 1 : 9 v/v, und chromatographisch über einer Silicakolonne getrennt. Die Fraktionen wurden aufgefangen und durch TLC und HPLC analysiert. Die Paclitaxel enthaltenden Fraktionen wurden zusammengegeben und zur Trockene durch Rotationsverdampfung eingedampft. Der feste Rückstand war weiß und wog 6,1 g.
Stufe 9
Der feste Rückstand von Stufe 8 wurde danach in Aceton gelöst und mit einem gleichen Volumen von n-Hexan oder Hexanen zur Kristallisation gebracht. Die Kristalle wurden mit kalter Aceton/Hexanlösung, 1/1 v/v, gewaschen und dann unter Vakuum bei 40°C getrocknet. Die festen Kristalle wogen 4,84 g und enthielten > 97% w/w Paclitaxel, wie durch HPLC gemessen wurde.
BEISPIEL 2
Bromierung von teilweise gereinigtem Cephalomannin
Eine Lösung von 0,63 g 91,5%igem Cephalomannin (0,0007 Mole), enthaltend etwa 6–7% Paclitaxel, gelöst in 150 ml Tetrachlorkohlenstoff, wurde in einen 500 ml fassenden Dreihals-Rundkolben gegeben, der ausgerüstet war mit einem 250 ml fassenden Trenntrichter. Der Kolben wurde in ein Eis-Salzbad getaucht. Erreichte die Temperatur –5°C, so wurde ein Lösung von Brom (0,1221 g) in Tetrachlorkohlenstoff (76,31 ml, 0,01 M) langsam unter Rühren mit einer solchen Geschwindigkeit zugegeben, dass die Reaktionstemperatur nicht über 5°C anstieg. Das Verhältnis von Cephalomannin zu Brom lag bei 1 : 1,1 Molen. Für die Zugabe wurden etwa 3 Stunden benötigt und die erhaltene Lösung war hellbraun und wolkig.
Die Bromierung wurde durch HPLC-Analyse jede Stunde überwacht. Die Reaktion war vollständig, wenn sämtliches vorhandenes Cephalomannin in das 2'',3''-Dibromoderivat überführt worden war, wozu, bezogen auf HPLC ungefähr 8 Stunden erfor derlich waren. Die Reaktionsmischung war hellgelb bis farblos, aufgrund des Verbrauches des Broms.
Die Reaktionsmischung wurde dann in einen 1 l fassenden Trenntrichter überführt und zunächst mit einer 0,5%igen wässrigen Natriumsulfitlösung (300 ml), einer 0,5%igen wässrigen Natriumbicarbonatlösung (300 ml) und danach zweimal mit deionisiertem Wasser (jeweils 200 ml) bis zu einem End-pH-Wert von 6,5 gewaschen. Die vereinigte wässrige Schicht wurde einmal mit GH₂Cl₂ extrahiert und die CH₂Cl₂-Schicht wurde mit dem zuvor gewonnenen organischen Extrakt vermischt. Die Mischung wurde dann über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und zur Trockene eingedampft. Die Ausbeute lag bei 0,76 g einer leicht cremig gefärbten festen Masse, was ungefähr einer 100% Ausbeute, bezogen auf das Ausgangsmaterial entsprach.
Das cremefarbene feste Material wurde auf einer Kolonne aus Silicagel (50 g, ICN Silitech, 32–63 D, 60 A) chromatographiert, unter Verwendung von Aceton/CH₂Cl₂ (10 : 90) als Eluierungsmittel. 50 ml-Fraktionen wurden aufgefangen und untersucht durch TLC (Silicagel 60 F₂₅₄, Merck #5554, entwickelt mit Aceton/CH₂Cl₂ (20/80) und ermittelt unter Verwendung von Vanillin-Schwefelsäure in Methanol-Sprühreagens). Die Fraktionen mit einem einzelnen Spot bei R_f = 0,64 (Fraküonen #26–#38) wurden vermischt, zur Trockene konzentriert unter Gewinnung von 0,485 g einer hell cremefarbenen bis weißen kristallinen festen Masse, Fp.: 158°C, identifiziert als 2'',3''-Dibromocephalomannin. Die Ausbeute wurde bestimmt zu 70% auf Basis des Ausgangs-Cephalomannins.
BEISPIEL 3
Bromierung einer rohen Mischung, enthaltend Cephalomannin, Paclitaxel und andere Verbindungen vom Taxan-Typ
Unter Verwendung einer ähnlichen Vorrichtung wie im Falle des Beispiels 2 wurde eine Probe von rohem Paclitaxel (2,0 g) von einer Mischung von 51,2% Paclitaxel, 28,8% Cephalomannin und etwa 20% anderer Taxane oder von Nicht-Taxan-Verunreinigungen, bezogen auf HPLC in 150 ml Tetrachlorkohlenstoff und 150 ml CH₂Cl₂ gelöst, unter Gewinnung einer klaren, hellgelben Lösung. Der Kolben wurde in ein Eis-Salzbad getaucht und der Inhalt wurde gerührt. Erreichte die Temperatur –5°C, wurde eine Lösung von 0,1332 g von 100% Brom in 83,13 ml (0,01 M) Tetrachlorkohlenstoff (1 M Cephalomannin : 1,2 M Brom) zu der Lösung mit einer solchen Geschwindigkeit zugegeben, dass die Temperatur der Reaktionsmischung nicht auf über 5°C anstieg. Die Zugabe erforderte etwa 3 Stunden und führte zu einer wolkigen, bräunlich-gelben Lösung. Nachdem die Zugabe des Broms beendet war, wurde die Reaktion weiter ablaufen gelassen unter den gleichen Bedingungen für weitere 8 Stunden, wobei jede Stunde HPLC-Analysen auf Paclitaxel und Cephalomannin durchgeführt wurden. Die Reaktion war beendet, wenn die Lösung farblos war oder hellgelb und wenn sämtliches Cephalomannin in das Dibromo-Derivat überführt worden war. Wenn nach den zusätzlichen 8 Stunden die Lösung immer noch mehr als 1–2% Cephalomannin enthielt, so wurden unter Beibehaltung der Ausgangsbedingungen 10 ml von 0,01 M Brom in Tetrachlorkohlenstoft tropfenweise zugegeben und 1 Stunde lang reagieren gelassen, bevor eine neue Analyse mit HPLC durchgeführt wurde.
Überschüssiges Brom von der Reaktionsmischung wurde entfernt durch Waschen mit 0,5%iger wässriger Na₂SO₃ (300 ml), 0,5%iger wässriger NaHCO₃ (200 ml) und deionisiertem Wasser (2 × 200 ml). Die Reaktionsmischung wurde getrocknet unter Verwendung von wasserfreiem Na₂SO₄ und zur Trockene konzentriert unter hohem Vakuum, unter Gewinnung von 2,35 g eines trockenen, leicht cremefarbigen bis weißen kristallinen Rückstandes. Das trockene Material wurde dann gereinigt unter Verwendung einer Silicagelkolonne unter den Bedingungen, die in Beispiel 2 angegeben sind. Das Verhältnis zwischen der Mischung, die getrennt werden sollte und dem Silicagel lag bei 1 : 60, so dass 120 g Silicagel verwendet wurden. Jede Fraktion wurde durch TLC überprüft und jede dritte Fraktion durch HPLC. Fraktionen mit dem gleichen R_f-Wert bei der TLC-Analyse und der gleichen Retentionszeit in HPLC wurden miteinander vermischt unter Gewinnung von zwei kombinierten Fraktionen. Die Fraktionen (#41–#39), die einen einzelnen TLC-Spot mit einem R_f-Wert von 0,64 zeigten, stellten Dibromocephalomannin dar und die Fraktionen (#41–#81 ), die einen einzelnen TLC-Spot bei R_f0,49 zeigten, stellten Paclitaxel dar.
Die Fraktionen #25–#39 führten bei der Konzentration bis zur Trockene bei ca. 40°C unter hohem Vakuum zu einer weißen bis hellgelben festen Masse (0,460 g, 66,6% theoretische Ausbeute).
Die Analyse des erhaltenen Dibromocephalomannins ergab:
Fp. 158–160°C (chromatographische Reinheit 96,19%)
R_f = 0,64 (einzelner Spot) auf Silicagel 60 F₂₅₄ Platte (Merck, #5554)
Lösungsmittelsystem: Aceton : CH₂Cl₂ (20 : 80)
Sprüh-Reagens: Vanillin/Schwefelsäure in Methanol
Massen-Spektrum [FAB]⁺: [M + H]⁺ = 990, 992, 994
[M + Na]⁺ = 1014
[M + K]⁺ = 1030
Eine Konzentration der zweiten vereinigten Fraktionen (#41 – #81) ergab 1,16 g (> 100% der theoretischen Ausbeute) an Paclitaxel, das umkristallisiert wurde unter Verwendung einer Mischung von Aceton/Hexan im Verhältnis 50 : 50, worauf gefiltert, mit dem gleichen Verhältnis von gekühltem Lösungsmittel gewaschen und dann unter hohem Vakuum bei 40°C 24 Stunden lang getrocknet wurde. Die Ausbeute lag bei 0,902 g (45,11% der theoretischen Ausbeute, bezogen auf das Gewicht des Ausgangsmaterials oder bei 88,1%, bezogen auf die HPLC-Analyse von Paclitaxel in dem Ausgangsmaterial) an weißem kristallinem Material.
Die Analyse des abgetrennten und gereinigten Paclitaxels war wie folgt:
Fp. 214–216°C
R_f = 0,49 in Gegenwart einer authentischen Probe auf Silicagel 60 F₂₅₄ Platte (Merck, #5554)
Lösungsmittelsystem: Aceton : CH₂Cl₂ (20 : 80)
Sprüh-Reagens: Vanillin/Schwefelsäure in Methanol
UV-Spektrum in CH₃OH(λ_max in nm, (ε)): 228,4 (297146,8) 206,6 (26540,1)
IR-Spektrum in KBr (cm^–1) 3500, 1105, 1070 (tert. & sek. OH) 3430, 1650, 1580 (-CONH-) 3070, 1610, 1520, 780, 710 (monosub. aromatische Ringe) 3920, 2910, 1480, 1450, 1370 (CH₃ CH₂, CH) 2950, 1315, 980 (Doppelbindung) 1730, 1270 (aromatische Ester) 1715, 1240 (>C=O) 1730, 1180 (Acetate) 850 (Epoxyring) Sowohl das UV-Spektrum wie auch das IR-Spektrum entsprachen reinem Paclitaxel.
BEISPIEL 4
Trennung und Reinigung von Paclitaxel aus einer rohen Mischung von Taxanen und Analyse hiervon
Eine Lösung von 10,00 g rohem Paclitaxel (auf Basis der HPLC-Analyse lag der Gehalt bei 28,8% Cephalomannin, 51,2% Paclitaxel und ungefähr 20% anderen Taxanen oder Nicht-Taxan Verunreinigungen) wurde in 1,5 l Tetrachlorkohlenstoff in einem 2,0 l fassenden Dreihals-Rundkolben gelöst, der ausgerüstet war mit einem 500 ml fassenden Trenntrichter, einem Rückfluss-Kondensor, einem Thermometer und einem Magnetrührer und der in ein Eis-Salzbad getaucht war. Die Reaktionsmischung wurde gerührt, bis die Temperatur 5°C erreicht hatte, worauf 41,2 ml von 0,1 M Brom (0,665 g Brom) in Tetrachlorkohlenstoff tropfenweise während etwa 3 Stunden zugegeben wurden. Das molare Verhältnis zwischen Cephalomannin und Brom lag bei 1 : 1,2. Die Reaktionstemperatur stieg nicht über 5°C an. Nachdem die Bromzugabe beendet war, wurde weiter gerührt, wobei die Temperatur bei –1 bis 5°C gehalten wurde. Die Reaktion wurde durch HPLC jede Stunde überwacht, bis sämtliches Cephalomannin in die Dibromoderivate überführt worden war (ungefähr 8 Stunden). Die endgültige Farbe der 1500–1600 ml Lösung war hellgelb bis cremefarbig, je nach der Farbe der Ausgangsmischung und dem möglichen Vorhandensein eines geringen Überschusses an Brom.
Um Bromspuren zu entfernen, wurde die Reaktionsmischung mit einer 0,5%igen wässrigen Na₂SO₃-Lösung (500 ml), einer 0,5%igen wässrigen NaHCO₃-Lösung (500 ml) und deionisiertem Wasser (2 500 ml) gewaschen. Die Reaktionsmischung wurde mit wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter Vakuum zur Trockene konzentriert, unter Gewinnung von 13,20 g eines hell-cremefarbigen bis weißen kristallinen Materials.
Dieses Material wurde chromatographisch getrennt auf einer Silicagelkolonne unter den Bedingungen, die oben in den Beispielen 2 und 3 angegeben wurden. Eine 100 × 5 cm große Glaskolonne wurde hergestellt nach der Aufschlämmungs-Methode mit 600 g Silicagel (Verhältnis 1 : 50). Die Kolonne wurde eluiert mit Aceton/CH₂Cl₂ (10 : 90). Eine Menge von 1 l Aceton/CH₂Cl₂ (25 : 75) wurde als abschließende Kolonnenwäsche verwendet. Jede Fraktion wurde analysiert durch TLC und jede dritte Fraktion durch HPLC. Die Fraktionen #11–#22 zeigten einen einzelnen Spot bei Rf = 0,64, und nach der Vereinigung, Konzentration und Trocknung auf einem Buchi-Rotationsverdampfer (40°C, hohes Vakuum), wurden 3,25 g (95%)von 2'',3''-Dibromocephalomannin als weiße bis hellgelbe feste Masse erhalten.
Die Analyse des Produktes war wie folgt:
Fp.: 158–160°C
R_f = 0,64 (einzelner Spot) auf Silicagel 60 F₂₅₄ Platte (Merck, #5554)
Lösungsmittelsystem: Aceton : CH₂Cl₂ (20 : 80)
Sprüh-Reagens: Vanillin/Schwefelsäure in Methanol
Elementar-Zusammensetzung und Molekulargewicht (auf Basis von HR FAB⁺)

C₄₅H₅₄NO₁₄ ⁷⁹Br₂[M + H]⁺: Berechnet: 990,191000 Gefunden: 990,191103 (Δm = 0,1 ppm)
C₄₅H₅₄NO₁₄ ⁷⁹Br⁸¹[M + H]⁺: Berechnet: 992,181000 Gefunden: 992,189057 (Δm = 8,1 ppm)
C₄₅H₅₄NO₁₄ ⁸¹Br₂[M + H]⁺: Berechnet: 994,175000 Gefunden: 994,187011 (Δm = 12,1 ppm)
C₄₅H₅₃NO₁₄ ⁷⁹Br⁸¹[M + H]⁺: Berechnet: 1014,161000 Gefunden: 1014,171002 (Δm = 9,9 ppm)
C₄₅H₅₃NO₁₄ ⁷⁹Br⁸¹Br[M + H]⁺: Berechnet: 1030,097000 Gefunden: 1030,144940 (Δm = 46,5 ppm) UV-Spektrum in CH₃OH: [λ_max nm, (ε)] 274,2 (1550,8); 227,1 (18610,4); 221,8 (18325,1) IR-Spektrum in KBr (cm^–1) 3500, 1105, 1070 (tert. & sek. OH) 3420, 1670, 1580 (-CONH-) 3310, 3060, 1605, 1505, 770, 710 (monosub. aromatische Verbindungen) 3060, 2960, 2915, 2870, 1465, 1370 (-CH₃-CH₂, =CH-) 3020, 1670, 1310, 980 (Doppelbindung) 1730, 1270 (aromatische Ester) 1715, 1240 (>C=O) 1730, 1180 (Acetate) 855 (Epoxyringe) 520 (Bromoverbindungen)
¹H-NMR in CDCl₃ (300 MHz): 1,94 (d, 3H, -COC(Br) CH₃ -5") (ppm; Seitenketten nur Protonen) 1,98 (d, 3H, -HC(Br) CH₃ -4") 4,63 (qt, 1H, ¹CH(Br) –3'')
¹³C-NMR (300 MHz) (in ppm; Seitenkette nur C): 170,21 und 170,25 (C-1') 172,26 und 172,32 (C-1'') 72,76 und 72,90 (C-2') 69,71 und 69,88 (C-2'') 54,34 und 54,52 (C-3) 55,13 und 55,35 (C-3'') 30,39 und 30,77 (C-4'') 27,21 und 27,62 (C-5'')
EIMS; [M]⁺ (m/z) 568, 551, 509, 491, 449, 431, 405, 391, 386, 329, (die Hauptfragmente) 326, 308, 278, 264, 245, 217, 200, 188, 159, 149, 122, 105, 91, 83, 77, 55, 43.
DCIMS; [M + H]⁺ (m/z) 569, 552, 510, 492, 474, 450, 432, 424, 392, 387, (die Hauptfragmente) 370, 329, 327, 309, 279, 265, 264, 246, 218, 200, 188, 167, 149, 125, 124, 106, 101, 100, 91, 83, 69.
FAB⁺ -MS: (m/z) 1030 [M + K]⁺; 1014 [M + Na]⁺; 992 [M + H]⁺ (siehe Elem. Anal.); 974 [M-H₂O]⁺; 932 [M-AcOH]⁺; 914 [M-AcOH-H₂O]⁺; 912 [M-HBr]⁺; 870 [M-BzOH]⁺; 854 [870-H₂O-2H]; 832 [M-2HBr]⁺; 705 [M-243-Ac]⁺; 569 [T]⁺; 551 [T-H₂O]; 509 [T-AcOH]⁺; 491 [T-AcOH-H₂O]⁺; 448 [T-BzOH]⁺; 429, 424 [SH₂]⁺; 413; 405 [S-H₂O]⁺; 391 [S-O-H₂O]⁺; 387 [T-AcOH-BzOH]⁺; 376; 347 [S-O-CO-HCHO]⁺; 338; 327 [387-AcOH]⁺; 315; 284 [327-Ac]⁺; 279; 264 [832-T]⁺ oder [424-2HBr]⁺; 246 [264-H₂O]⁺; 231; 218 [264-HCOOH]⁺; 188; 167 [S-C₅H₈ONBr₂]⁺; 149 [167-H₂O]⁺; 133; 122 [BzOH]⁺; 113; 105 [Bz]⁺; 91 [C₇H₇]⁺; 83; 77 [C₆H₆]⁺; 76; 57; 55; (T = Taxanring in der Verbindung; S – Säure (Seiten)kette in der Verbindung).
HPLC: Bedingung 1: Kolonne CN 10 μ (250 × 4,6 mm) Lösungsmittelsystem: CH₃CN : H₂O (40 : 60) Strömungsgeschwindigkeit 1 ml/Min. Detektor-Wässer 490 bei 227 nm Injektionsvolumen 20 μl RT_{2'',3''-Dibromocephalomannin} 26,06 Min. Bedingung 2: Kolonne: Curosil G 6 μ (250 × 3,2 mm) Lösungsmittelsystem: CH₃CN : H₂O (45 : 55) Strömungsgeschwindigkeit 0,75 ml/Min. Detektor-Wässer 490 bei 227 nm Injektionsvolumen 20 μl RT_{2'',3''-Dibromocephalomannin} 2 Diastereomere Formen: RT_I = 23,53 RT_II = 24,50
Thermogravimetrische Analyse (TGA): Temperatur (Stabilität%): 28,04°C (100,0%), 100,00°C (99,64%), 150,00°C (98,88%), 175,00°C (95,35%), 180,00°C (86,74%), 200,00°C (60,38%), 250,00°C (45,03%)
Differential-Abtast-Kalorimetrie (DSC): 173,76°C, 187,73°C.

Die Fraktionen von #26 bis #68, die einen einzelnen Spot in TLC (Rf = 0,49, gleich der authentischen Probe von Paclitaxel) sowie eine einzelne Spitze im Falle der HPLC-Analyse hatten, wurden miteinander vereinigt, konzentriert und auf einem Buchi-Rotationsverdampfer getrocknet (40°C, hohes Vakuum), unter Gewinnung von 6,10 g einer weißen festen Masse. Dieses Material wurde aus 60 ml einer Mischung aus Aceton/Hexan (50 : 50) auskristallisiert, filtriert, gewaschen mit dem gleichen Verhältnis von gekühlten Lösungsmitteln und getrocknet unter hohem Vakuum bei 40°C (24 Stunden), unter Gewinnung von 4,84 g (92%) einer weißen festen kristallinen Masse, die identifiziert wurde durch Vergleich mit einer authentischen Probe von Paclitaxel.
Analyse des gereinigten Paclitaxels wie folgt:
Fp.: 214°C–216°C
TLC: Rf = 0,49 (in Gegenwart der authentischen Probe)
Silicagel 60 F₂₅₄ Platte (Merck, #5554)
Lösungsmittelsystem: Aceton/CH₂Cl₂ (20 : 80)
Sprüh-Reagens: Vanillin/Schwefelsäure in Methanol
Elementaranalyse:
5

UV-Spektrum in CH₃OH(λ_max in nm, (ε)): 227,2 (29824,1) 208,0 (26256,3)

6

IR-Spektrum (KBr) (cm^–1) 3500, 1105, 1070 (tert. & sek. OH) 3430, 1650, 1580 (-CONH-) 1610, 1520, 780, 710 (monosub. aromatische Ringe) 2950, 2910, 1480, 1450, 1370 (-CH₃-, -CH₂-, >CH-Gruppen) 3020, 1315, 980 (Doppelbindung) 1725, 1270 (aromatische Ester) 1710, 1240 (>C=O) 850 (Epoxyringe)

7a

¹H-NMR-Spektrum 1,88 (S, 1 OH, C-1 ); 5,66 (d, 1H, C-2); 3,82 (dd, (300 MHz; CDCl³) (ppm) 1H, C-3); 2,38 (S, 3H, Ch₃COO bei C-4); 4,94 (dd, 1H, C-5); 1,88 (ddd, 1H, C-6); 2,48 (ddd, 1H, C-6); 2,53 (d,1OH, C-7); 4,38 (dd, 1H, C-7); 6,27 (S, 1H, C-10); 2,23 (S, 3H, CH₃COO bei C-10); 6,20 (qt, 1H, C-13); 2,27 (ddd, 1H, C-14); 2,33 (dd, 1H, C-14); 1,13 (S, 3H, C-17); 1,23 (S, 3H, C-18); 1,78 (S, 3H, C-18); 1,68 (S, 3H, C-19); 4,20 (dd, 1H, C-20); 4,30 (S, 1H, C-20); 3,77 (S, 1H, C-2'); 4,78 (ddd, 1H, C-2'); 5,20 (ddd, 1H, C-3); 7,10 (d, 1H, N-1); 7,30 + 7,53 (m, 10H, p- & m-Protonen bei aromatischen Ringen A₁, B₁ & C₁); 7,64 (t, 1H, A₁-p); 7,72 (dd, 2H, C₁-o); 8,11 (dd, 2H, A₁-o).

7b

¹³C-NMR-Spektrum (300 MHz, CDCl₃) 79,1 (C-1); 75,1 (C-2); 45,8 (C-3); 81,2 (C-4); (ppm) 84,4 (C-5); 35,6 (C-6); 72,1 (C-7); 56,7 (C-8); 203,6 (C-9); 75,6 (C-10); 133,3 (C-11); 141,9 (C-12); 72,3 (C-13); 35,7 (C-14); 43,2 (C-15); 21,8 (C-16); 26,9 (C-17); 14,7 (C-18); 9,5 (C-19); 76,5 (C-20); 73,3 (C-2'); 55,1 (C-3'); 20,7 (CH₃CO) bei C-10); 22,6 (CH₃CO) bei C-4); 170,3 (CH₃CO bei C-10); 171,1 (CH₃CO bei C-4); 167,0 (ArCO-A₁); 167,0 (ArCO-C₁); 172,7 (PhlSCO-); 129,3 (aC-C₁); 133,8 (aC-B₁ ); 138,1 (aC-C₁ ); 130,3 (o-C, A₁); 127,0 (o-C, B₁); 127,0 (o-C, C₁); 128,7 (m-C, A₁); 128,6 (m-C, B₁); 129,0 (m-C, C₁); 133,6 (p-C, A₁); 131,9 (p-C, B₁); 128,3 (p-C, C₁).

8a und 8b

EIMS: [M]⁺ = 853 (m/z, die Hauptfragmente) 568 [T]⁺; 550 [T-H₂O]⁺; 508 [T-AcOH]⁺; 490 [T-AcOH-H₂O]⁺; 448 [T-2AcOH]⁺ oder (T-BzOH)⁺; 386 [T-AcOH-BzOH]⁺; 326 [T-BzOH-2AcOH]⁺; 308 [326-H₂O]⁺; 286 [M-T]⁺; oder [S]⁺; 280; 268 [S-O]⁺; 240 [S-O-CO]⁺; 210 [S-O-CO-HCOH]⁺; 122 [BzOH]⁺; 105 [Bz]⁺; 91 [C₇H₇]⁺; 77 [C₆H₆]⁺; 51; 43 [Ac]⁺.

9

DC/MS: [M + H]⁺ = 854 (m/z, die Hauptfragmente) 569; 551; 509; 492; 449; 387; 327; 311; 287; 269; 240; 224; 222; 210; 165; 149; 123; 105; 92; 71.

10

FAB⁺ MS (m/z, die Hauptfragmente) 892 [M + K]⁺; 876 [M + Na]⁺; 854 [M + H]⁺; 569; 551; 523; 509; 495; 369; 327; 286; 240; 210; 277; 155; 149; 119; 105; 85; 69.

11

FAB^– MS 852 [M-H]^–

12

HPLC Kolonne: μBondapak Phenyl Lösungsmittelsystem: CH₃CN : CH₃OH : H₂O-32 : 20 : 48 Strömungsgeschwindigkeit: 1 ml/Min. Detektor-Wässer: 490 bei 227 nm Injektionsvolumen: 20 μl

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TGA: Temperatur (Stabilität): 50,00°C (100,0%), 205,00°C (99,86%), 215,00°C (99,10%), 220,00°C (92,19%), 250,00°C (56,66%), 275,00°C (45,92%).

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DSC: 210,85°C
Wassergehalt (% H₂O): 0,90% (Karl Fischer)

Claims

Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Paclitaxel aus organischem Material, das eine Mischung von Taxanen enthält; wobei das Verfahren umfasst: (1) die Extraktion einer eine Taxus-Verbindung enthaltenden Zusammensetzung aus dem organischen Material; (2) die chromatographische Abtrennung einer Mischung mit Paclitaxel, Cephalomannin und anderen Taxanen aus der Zusammensetzung; daraufhin (3) die Umsetzung der Mischung mit einem Halogen unter Bedingungen, die wirksam für die selektive Umwandung von Cephalomannin in eine Diastereomeren-Mischung von Dihalocephalomanninen sind; daraufhin (4) die Abtrennung des Paclitaxels aus der Mischung.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das organische Material mit einem ersten Extraktions-Lösungsmittel extrahiert wird, das dann verdampft wird unter Bildung eines ersten Paclitaxel enthaltenden Rückstandes, worauf der erste Rückstand mit einem zweiten Extraktions-Lösungsmittel extrahiert wird, das dann verdampft wird unter Erzeugung eines zweiten Paclitaxel enthaltenden Rückstandes, worauf der zweite Rückstand weiter durch Kristallisation gereinigt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das erste Extraktions-Lösungsmittel Methanol ist und bei dem der erste Paclitaxel enthaltende Rückstand verteilt wird in Wasser und einem Lösungsmittel, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methylenchlorid, Ethylendichlorid und Chloroform, und bei dem der Rückstand in dem Lösungsmittel extrahiert und getrocknet wird unter Bildung des zweiten Rückstandes und bei dem der zweite Paclitaxel enthaltende Rückstand in Aceton gelöst wird und nicht-polare Verunreinigungen mit Hexanen ausgefällt werden, wobei die Aceton-Hexanlösung dann verdampft wird auf etwa ein Drittel (1/3) des Volumens unter Erzeugung eines dritten Paclitaxel enthaltenden, viskosen Rückstandes.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das Lösungsmittel und Wasser in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 auf v/v-Basis vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 3, bei dem der dritte viskose Rückstand ausgefällt wird durch Zugabe von etwa dem 10-fachen Volumen an Hexanen unter Erzeugung eines hellgelben Niederschlages unter Erzeugung eines vierten Paclitaxel enthaltenden, festen Rückstandes.
Verfahren nach Anspruch 4, das weiterhin umfasst das Auflösen des vierten festen Rückstandes in Aceton mit Methylenchlorid und/oder Ethylendichlorid, worauf die Lösung einer Blitz-Chromatographie über einer Silicagel-Kolonne in einem chromatographischen Lösungsmittel unterworfen wird, um Extraktionsmittel-Fraktionen zu gewinnen, die Mischungen von Paclitaxel und Cephalomannin enthaften, die kombiniert und getrocknet werden unter Erzeugung eines fünften Paclitaxel enthaltenden Rückstandes.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das chromatographische Lösungsmittel aus einer Mischung von Aceton und Methylenchlorid oder Ethylendichlorid in einem Verhältnis von etwa 1 : 9 bis etwa 3 : 7 auf v/v-Basis besteht.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem der fünfte Rückstand in einem chlorierten Lösungsmittel gelöst wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CCl₄, CHCl₃, C₂H₄Cl₂ und CH₂Cl₂ und mit einem Halogen umgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das Halogen aus Brom besteht.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das Brom in einer Konzentration entsprechend einer 0,01 M bis etwa 0,1 M Lösung in halogenierten Lösungsmitteln vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die Umsetzung mit Brom bei einer Temperatur von etwa –20°C bis etwa 20°C im Dunkeln durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 11, bei dem praktisch sämtliches in der Lösung von chlorierten Lösungsmitteln vorliegenden Cephalomannin in eine Diastereomeren-Mischung von Dibromocephalomanninen umgewandelt wird und bei dem das Paclitaxel dann aus der Reaktionsmischung abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das Paclitaxel enthaltende, organische Material ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Rinde von Taxus brexifolia, einem Pflanzenmaterial der Taxus-Spezies, einer Zellkultur aus der Taxus-Spezies und einem Paclitaxel erzeugenden Pilz.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das Paclitaxel von der Reaktionsmischung durch Silicagel-Chromatographie mit einem chromatographischen Lösungsmittel abgetrennt wird, das eine Mischung von Aceton und Methylenchiorid oder Ethylendichlorid umfasst, die in einem Verhältnis von etwa 1 : 9 bis etwa 3 : 7 auf Volumenbasis vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das abgetrennte Paclitaxel mit Aceton und Hexanmischungen auskristallisiert wird.
Verfahren zur Abtrennung von Paclitaxel aus einer Mischung enthaltend Paclitaxel und Cephalomannin, das die Stufen umfasst: a) Umsetzung der Mischung mit einem Halogen bei einer Temperatur sowie während einer Zeitspanne, die ausreichen, um praktisch sämtliches Cephalomannin zu halogenieren, und b) Abtrennung des Paclitaxels von dem halogenierten Cephalomannin.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem das Halogen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fluor, Chlor, Brom und Iod.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das Halogen Brom ist.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Brom in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,01 M bis etwa 0,1 M vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Reaktion von a) bei einer Temperatur im Bereich von etwa –20°C bis etwa 20°C durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, bei dem das Brom in einem chlorierten Lösungsmittel vorliegt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CCl₄, CHCl₃ und CH₂Cl₂.
Verfahren nach Anspruch 21, bei dem das chlorierte Lösungsmittel CCl₄ oder CHCl₃ ist.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Reaktion a) im Dunkeln durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Trennung b) durch Silicagel-Chromatographie in einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, bei dem das Lösungsmittel eine Mischung aus Aceton und Methylenchlorid oder 1,2-Dichloroethan in einem Volumenverhältnis von etwa 1 : 9 bis etwa 3 : 7 ist.
Verfahren nach Anspruch 25, bei dem die Paclitaxel enthaltenden Fraktionen zu einem festen Rückstand eingedampft werden.
Verfahren nach Anspruch 26, das weiterhin umfasst die Reinigung des Paclitaxels durch Kristallisation.
Verfahren nach Anspruch 27, bei dem der feste Rückstand in Aceton gelöst wird.
Verfahren nach Anspruch 28, bei dem das Paclitaxel mit Hexanen auskristallisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 25, bei dem das Paclitaxel von einer Diastereomeren-Mischung von 2''-,3''-Dibromocephalomanninen abgetrennt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Umsetzung a) durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie überwacht wird.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem die Mischung von einem Paclitaxel enthaltenden Lieferanten stammt.
Verfahren nach Anspruch 32, bei dem der Paclitaxel enthaltende Lieferant ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Rinde von Taxus brevifolia, Pflanzenmaterial von einer Taxus-Spezies, einer Zellkultur einer Taxus-Spezies und einem Paclitaxel produzierenden Pilz.
Verfahren zur Abtrennung von Paclitaxel aus einer Mischung von Paclitaxel und Cephalomannin mit den Stufen von a) Umsetzung der Mischung mit Brom bei einer Temperatur und während einer Zeitspanne, die ausreichen, um praktisch sämtliches Cephalomannin zu bromieren, und b) Abtrennung des Paclitaxels von dem bromierten Cephalomannin.