KR100467531B1 - 파클리타셀과세팔로마닌의분리와정제 - Google Patents

Abstract

수피, 탁수스 종의 침엽수, 조직 배양물 그리고 곰팡이와 같은 천연 물질로부터 탁산 특히 파클리타셀의 추출, 분리 및 정제하는 신규 공정에 대해 상술하고 있는데, 탁산은 극성과 비극성 용매사이에 분할, 비극성 용매에서 침전에 의해 원료 추출물로부터 분리하고, 혼합물은 불포화된 탁산 유도체의 할로겐화 반응에 의해 반응시키고 이어서 극성과 비극성 용매 혼합물로부터 탁산을 크로마토그래피 분리하고 결정화시키고 특히, 파클리타셀 존재 하에 불포화 측쇄 탁산 유도체 특히, 세팔로마닌의 할로겐화 반응 공정을 상술하고 이때, 브롬은 불포화된 탁산의 이중결합에 적절하게 첨가되어 파클리타셀이 변화되지 않도록 남겨두고 파클리타셀은 극성이 다소 적은 할로겐화된 탁산 유도체를 포함하는 혼합물로부터 용이하게 분리될 수 있다.

Description

파클리타셀과 세팔로마닌의 분리와 정제

본 발명은 식물 재료, 배양 물과 같은 유기 물질과 곰팡이, 특히, T. 브레비폴리아(T. brevifloia), 태평양 주목 나무의 수피 그리고 T. 바카파(T. baccata), T. 윤난넨시스(T. yunnanensis), T. 왈치니아나(Walichiana)로 부터 수득된 물질을 포함하는 파클리타셀을 함유하는 임의 재원으로부터 파클리타셀을 분리하고 정제하는 것에 관계한다. 특히, 본 발명은 다양한 농도의 파클리타셀과 세팔로마닌과 같은 불포화 측쇄를 가지는 상당히 연관된 탁산을 포함하는 다른 탁산 혼합물로부터 파클리타셀의 분리와 정제를 제공한다.

파클리타셀은 다양한 전이성 암 치료를 위한 화학적 치료요법제로 잘 알려져있다. 난소 암과 유방암 치료를 위해 FDA에 의해 승인되었고 현재 폐암과 결장 암의 치료에 임상적인 시도를 하고 있다.

화합물은 태평양 주목 나무, 탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifloia)에서 주로 추출되는 천연 산물이고, 그리고 또한 T. 바카파(T. baccata), T. 윤난넨시스(T. yunnanensis), T. 왈치니아나(Walichiana) 및 T. 히키시(T. hicksii), T. 덴시포르미스(densiformis)., T. 겜(gem), T. 바르디(wardii), T. 쿠스피아다타(T. cuspidata), T. 브론니(brownii), 및 T. 검녹색 스프레드 등을 포함하는 식물 재료로부터 다른 바이오매스 추출물질에서도 볼 수 있는데 이는 탁산-형 분자 혼합물을 포함하고 있다. 파클리타셀은 또한 배양된 식물 세포와 곰팡이로부터도 이용될 수 있다. 화합물은 분리되는 원료에 따라 등급이 정해지는 Aldrich Chemical Compnay, product Nos. T7402와 T1912, Fluka Chemie Ag, Product No.86346과 ICN Biomedicals Product No.193532 등을 상업적으로 이용할 수 있다.

다양의 천연 재료에서 파클리타셀의 농도는 태평양 주목 나무에서 0.0004-0.08%(w/w)정도가 일반적이다. 이와 같은 낮은 농도는 천연 재료로부터 임상적인 표준에 맞는 화합물의 추출과 정제에 상당한 문제가 있어, 상업적으로 이용할 수가 없다.

현재, 파클리타셀의 추출과 정제용 몇 가지 공정이 공지되어 있다. Wani et al., J. Am. Chem. Soc. 93,9:2325-2327(1971)에는 T. 브레비폴리아(brevifolia) 계통 주목을 에탄올로 추출하고 그 다음 농축시키고 클로로포름과 물로 추출하는데 이때, 파클리타셀은 클로로포름상에서 나타난다. 파클리타셀은 플로리실, 세파덱스 그리고 실리카겔 칼럼 등에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 추가 정제될 수 있다.

국립 암 센터(NCI) 방법은 메탄올을 이용하여 T. 브레비폴리아를 추출하고 이어서 염화메틸렌 추출을 하는 것에 기초한다. 염화 메틸렌 추출물은 건조시키고 아세톤에 용해시키고 n-헥산으로 불순물을 침전시킨다. 용해된 부분은 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 추가 정제한다.

그러나, Wani et al., 과 NCI 과정은 수득율이 0.02% 또는 그 이하로 매우 낮기 때문에 매우 효과가 적거나 산업상 이용할 수 없다. 이는 파클리타셀과 매우 유사한 구조를 가지고 매우 유사한 물리적인 특징을 가지는 파클리타셀의 유사 세팔로마닌과 같은 다른 탁산이 존재하기 때문이다. 파클리타셀과 세팔로마닌의 화학적인 구조를 설명하고 있는 도 1을 참조.

Potier et al., J. Nat. Prod. 47, 1:131-137(1984)에 의해 개발된 공정에 있어서, NCI 공정의 침전단계는 점진적으로 증가시킨 극성 용매로 연속적인 추출을 이용하여 용매상 추출단계를 이용하는 단계로 대체된다. 알루미나와 실리카 칼럼에서의 크로마토그래피의 추가 단계 후에, 파클리타셀은 파클리타셀과 세팔로마닌의 혼합물로써 농축된다. 그 다음 파클리타셀은 HPLC에 의해 세팔로마닌으로 부터 분리되고 Wani et al, 또는 NCI 방법에 의해 수득되는 경우보다도 상당히 많은 양의 파클리타셀을 수득 하게된다.

그러나, Wani et al, 또는 NCI 방법과 유사한 Potier et al., 방법은 정제된 파클리타셀 생성물을 수득하기 위해 통상적인 크로마토그래피 분리를 이용하여 최종 농축물에서 유사한 분리 변수를 가지는 다중 탁산을 분리해야 하는 큰 단점을 가지고 있다. 이와 같은 방법은 임상적으로 수용 가능한 순수 파클리타셀을 제공하기 위해 다중 통상적인 크로마토그래피 분리를 이용하는 파클리타셀의 대규모 상업적인 공정이 필수 적이기 때문에 이와 같은 공정은 실제 이용이 불가능한데 그 이유는 이와 같은 다중 크로마토그래피 분리와 연관된 비용이 상당하기 때문이다

파클리타셀과 세팔로마닌의 구조와 성질에 유사성 때문에 대부분에서 다중분리가 필수적이다. 도 1 에서 볼 수 있는 것과 같이, 이들 구조에서 볼 수 있는 단 한 가지 차이는 파클리타셀의 측쇄에 있는 아미노기가 벤젠산과 아실화되어 있고 세팔로마닌에서는 측쇄 아미노기가 이중 결합을 가지는 티글린산(tiglic acid)과 아실화 되어 있다는 것이다.

세팔로마닌으로 부터 파클리타셀의 크로마토그래피 분리이외에 다른 방법이 공지되어 있는데 이는 세팔로마닌에 있는 측쇄 이중 결합을 화학적으로 변형시키는 것이다. 예로써, Kingston, et al., J. Nat. Prod., 55:No.2, 259-261(1992)에서는 디올을 수득하기 위해 세팔로마닌 측쇄 이중 결합을 촉매에 의해 산화시키고 그 다음 크로마토그래피 과정과 재결정을 통하여 파클리타셀로 부터 분리해내는 것이다. 정제 안된 탁산 혼합물을 이용하는 이와 같은 방법에는 OsO₄에 의해 촉매되는 산화반응이 원추출물에 사용하기에는 용이한 공정이 아닌데 그 이유는 세팔로마닌의 측쇄 이중 결합의 선택성이 상당히 낮기 때문이고 이때 이와 같은 선택성은 추출과 정제 과정의 비용을 상당히 줄이기 위해 이용되는 경우가 있다. 또한, 약제를 만드는 공정에서 OsO₄ 를 이용하는 것은 화합물의 심각한 독성 때문에 바람직하지 못하다.

Murray, et al.,의 미국 특허 5,334,732와 5,336,684에서는 오존에 의한 세팔로마닌 측쇄의 산화작용에 대해 상술하고 있다. 이와 같은 방법은 원 추출물로 산화과정에서 오존을 사용하는 것이 파클리타셀과 불필요한 반응을 유발하고; 가오존 분해에 의한 산화반응이 너무 강하고, 파클리타셀과 세팔로마닌과 같은 많은 기능 기가 있는 화합물에서는 선택성이 없고 그리고 파클리타셀 또는 세팔로마닌의 탁산 고기의 내측에서 볼 수 있는 이중결합 또는 파클리타셀 분자에 있는 알데히드, 케톤, 아민 등과 같은 다른 기능기의 원치 않는 산화반응을 유도한다. 또한, 오존 발생기가 필요한데 상당한 비용이 요구된다.

따라서, 주로 파클리타셀과 세팔로마닌을 포함하는 다소 정제된 혼합물로부터 또는 탁산 또는 다른 혼합물로 된 원료 바이오매스를 포함하고 있는 복합체 혼합물로부터 파클리타셀의 분리와 정제는 전술한 비-경제적 크로마토그래피 분리 기술 그리고/또는 비-선택적 산화 반응에 현재 제한되기 때문에 파클리타셀과 상당히 유사한 세팔로마닌 뿐만 아니라 다른 상당히 근접한 관련 탁산으로 부터 가치 있는 항-종양 화합물 파클리타셀을 분리해내는 경제적이고 실용적인 방법이 절실히 요구된다.

따라서, 본 발명의 목적은 중요한 화학요법적 화합물인 파클리타셀의 경제적인 분리와 정제에 대한 현재 이용할 수 있는 방법보다 더 간단하고 더 비용 면에서 효과적인 방법을 제공한다.

발명의 요약

전술한 목적을 실행하기 위해 본 발명은 T. 브레비폴리아(T. brevifloia), T. 바카파(T. baccata), T. 윤난넨시스(T. yunnanensis), T. 왈치니아나(Walichiana)의 태평양 주목 나무의 수피 뿐만 아니라 침엽수 작은 가지와 같은 식물 재료로부터 파클리타셀을 포함하는 탁산형 화합물을 포함한 원료 바이오매스 추출물로부터 분리와 정제를 위한 신규하고 독특한 과정을 제공하고, 탁수스(Taxus) 종의 세포 배양과 파클리타셀을 생산하는 곰팡이로부터 생산된 파클리타셀의 하류정제를 포함하는 공정을 추가로 제공한다.

따라서, 한편으로는, 본 발명은 무엇보다도 탁산 혼합물을 포함하는 유기 물질로 부터 파클리타셀의 분리와 정제 공정을 제공하는데, 이 공정은 파클리타셀로 구성된 조성물을 만들기 위해 유기 물질의 용매 추출과 크로마토그래피 용매로 조성물로 부터 파클리타셀과 다른 탁산을 크로마토그래피 분리하는 것으로 구성된다. 이는 파클리타셀, 세팔로마닌 그리고 다른 탁산으로 구성된 정제된 혼합물을 만들기 위해 흡수제로써 실리카겔과 같은 정상 크로마토그래피 칼럼에서 파클리타셀과 다른 탁산의 섬광 크로마토그래피 분리 단계가 이어진다. 생성된 혼합물은 디할로 세팔로마닌의 부분 입체 이성질체를 생산하기 위해 세팔로마닌의 불포화된 측쇄의 선택적인 할로겐화 반응에 효과적인 조건하에서 할로겐 적절하게는 브롬과 반응하고; 그 다음 파클리타셀은 혼합물로부터 용이하고 편리하게 다량 분리할 수 있다.

본 발명의 다른 한편에서는 원료 유기 물질로부터 파클리타셀의 분리와 정에를 위한 공정에서 임의 단계는 통상적인 크로마토그래피 기술에 의한 추출과 정제이전 또는 그 이후에 세팔로마닌의 선택적인 할로겐화 반응에 의해 이루어 질 수 있는데 이는 혼합물이 원료 추출물이거나 또는 파클리타셀, 세팔로마닌 그리고 다른 탁산의 다소 정제된 혼합물인지에 무관하게 이루어진다.

본 발명의 다른 한편에서는, 세팔로마닌의 신규한 화학적 수정에 의해 상당히 근접한 유사체 세팔로마닌으로 부터 상당한 수득률로 파클리타셀을 분리하는 매우 효과적이고 경제적인 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 적절한 구체예, 실시예 그리고 도면의 상세한 설명에 의해 분명하게 이해할 수 있을 것이다.

도 1 은 파클리타셀과 세팔로마닌의 일반적인 구조를 나타낸다.

도 2 는 본 발명에 따라 할로겐화 될 수 있는 다양한 불포화된 측쇄를 내포하는 몇 개의 불포화된 탁산과 기능기의 구조를 나타낸 것이다.

도 3 은 T. 브레비폴라로부터 파클리타셀의 분리와 정제에서 본 발명의 한 측면의 적절한 구체예를 순서도로 나타낸 것이다.

도 4 는 세팔로마닌의 선택적인 브롬화 반응을 위한 적절한 반응 과정을 설명하는 것이다.

도 5 는 본 발명으로 부터 수득된 파클리타셀의 UV 스펙트럼이다.

도 6 는 본 발명으로 부터 수득된 파클리타셀의 IR 스펙트럼이다.

도 7 는 본 발명으로 부터 수득된 파클리타셀의 프로톤 NMR 스펙트럼이다.

도 7b 는 본 발명으로 부터 수득된 파클리타셀의 탄소-13 NMR 스펙트럼이다.

도 8a와 8b 는 본 발명으로 부터 수득된 파클리타셀의 El-MS 스펙트럼이다.

도 9 는 본 발명으로 부터 수득된 파클리타셀의 DCI-MS 스펙트럼이다.

도 10 은 본 발명으로 부터 수득된 파클리타셀의 FAB-MS(양 이온 모드) 스펙트럼이다.

도 11 은 본 발명으로 부터 수득된 파클리타셀의 FAB-MS(음 이온 모드) 스펙트럼이다.

도 12 는 본 발명으로 부터 수득된 파클리타셀의 HPLC 분석이다.

도 13 은 본 발명으로 부터 수득된 TGA의 스펙트럼이다.

도 14 는 본 발명으로 부터 수득된 파클리타셀의 USC 스펙트럼이다.

본 발명의 공정에 있어서, 본 발명은 T. 브레비폴리아(T. brevifloia), T, 바카파(T. baccata), T. 윤난넨시스(T. yunnanensis), T. 왈치니아나(Walichiana)의 태평양 주목 나무의 수피 뿐만 아니라 침엽수 작은 가지와 같은 식물 재료로부터 파클리타셀을 포함하는 탁산형 화합물을 포함한 다양한 원료 바이오매스 추출물과 탁수스(Taxus) 종의 세포 배양과 파클리타셀을 생산하는 곰팡이로부터 정제된 파클리타셀을 추출하는 간단하고 경제적인 공정을 제공한다.

공정은 파클리타셀의 파괴 없이 선택적으로 특정 탁산을 변형시키기 위해 불포화된 측쇄를 포함하는 파클리타셀, 세팔로마닌 그리고 다른 탁산 유도체의 정제안된, 정제된 부분적으로 정제된 혼합물의 선택적인 할로겐화반응 적절하게는 브롬화반응으로 구성된다.

본 공정의 한 구체예에서, 다양한 탁산 복합 혼합물을 포함하는 바이오매스는 초기 추출상, 적절하게는 저가 알코올 예로써 메탄올, 에탄올 등과 같은 초기 추출상 동안에 파클리타셀의 양 전달을 증가시키기 위해 매체의 체적 비에 표면적의 비가 높게 처리하는 것이 적절하다. 예로써, 파클리타셀의 농도가 일반적으로 0.1% w/w이하인 원으로 부터 T. 브레비포라의 수피를 이용하면, 수피는 미세한 혼합물로 갈고 그 다음 샘플에 있는 모든 파클리타셀이 추출되기에 충분한 시간동안에 메탄올로 추출한다. 그 다음 메탄올 추출물을 로터리 증발기로 추출하고 그 다음 원 추출물보다는 약 20배 용적이 작게 추출한다.

추가 추출은 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 또는 에틸렌 디클로라이드와 같은 적절한 용매와 물 사이에 1:1 v/v 비율로 메탄올 농축물을 분할하여 실행할 수 있는데 이때, 수용성 성분은 수용 상으로 추출된다. 이와 같은 성분은 예로써, 파클리타셀의 수용성 글리코시드와 잠재적으로 가치 있는 추가 처리를 진행하기 위해 저장될 수 있는 혼합물에서 다른 극성 화합물이 될 수 있다. 이와 같은 구체예에서, 파클리타셀로 구성된 유기 용매상은 파클리타셀로 구성된 잔기로 기화되고 그리고 불순물을 침전시킴으로써 추가 정제될 수 있다. 예로써, 아세톤에 잔류물을 용해시킴으로써, 타르 비극성 불순물은 동량의 추가 헥산을 첨가하여 침전시키고 그 다음 여과해낼 수 있다. 수득된 침전물은 40℃에서 고진공(1mm 내지 2 mm)하에서 건조시킬 수 있다.

본 구체예에서, 본 잔기는 메틸렌 클로라이드 또는 에틸렌 클로라이드와 같은 크로마토그래피 용매 최소량에 용해시키고 그 다음 실리카겔 칼럼에서 섬광 크로마토그래피한다. 예로써 이동상은 1:9 내지 3:7 v/v 비율의 아세톤, 메틸렌 클로라이드 또는 에틸렌 클로라이드의 혼합물일 수 있다. 칼럼의 제 1 소수 부분은 극성이 낮은 혼합물을 포함하고 이어서 파클리타셀과 세팔로마닌이 다양한 농도로 포함된 부분이 이어진다. 부분을 칼럼으로부터 용출시킨 뒤에 실리카겔은 아세톤과 메탄올로 세척하고 용출물은 버린다.

파클리타셀과 세팔로마닌을 포함하는 부분은 그 다음 복합시키고 다시 파클리타셀로 구성된 잔기를 형성하기 위해 기화시킨다. 이 잔기는 탄화 테트라클로라이드, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 또는 에틸렌 클로라이드와 같은 염소계 용매에 용해시켜 용액을 만들고 이때, 다양하게 불포화된 탁산은 세팔로마닌(그리고 다른 탁산을 포함하는 측쇄 불포화된)에서 불포화된 측쇄 이중결합의 선택적인 할호겐화반응을 위한 효과적인 조건하에서 할로겐화시켜 파클리타셀과 다른 측쇄 할로겐화된 탁산 화합물과 함께 용액에서 디할로세팔로마닌의 부분 입체이성질체를 만든다. 비록 모든 할로겐이 본 발명에서 고려될 수 있지만 브롬이 가장 적절한데 그이유는 높은 효과와 저렴한 비용 때문이다. 적절하게는 모든 존재하는 세팔로마닌은 실제 혼합물로부터 파클리타셀의 용이한 분리를 제공하기 위해 디할로세팔로마닌 부분 입체 이성질체로 안전하게 전이된다.

염소계 용매에서 탁산은 또한 0℃에 가까운 온도에서 강하게 혼합하면서 암상태로 적절하게는 브롬화시킨다. 반응 속도는 바람직하게는 하이드로브롬산의 생산 속도가 제한되고 파클리타셀의 잔기의 가수분해가 거의 없도록 서서히 이루어진다. 존재하는 모든 세팔로마닌의 반응이 완료되었는지를 결정하기 위해 크로마토그래피 분석한 후에 브롬의 첨가를 종료하고 파클리타셀과 디브롬세팔로마닌 이성질체를 포함하는 브롬화된 용액을 희석된 황화나트륨으로 우선 세척하고 그 다음 중탄산나트륨으로 세척하여 반응하는 동안에 임의 브롬 또는 하이드로브롬산을 제거하고 중화시킨다.

유기층은 물과 무수 황화나트륨으로 추가 세척하고 그 다음 메틸렌 클로라이드와 같은 소량의 용매에 용해된 고형 잔기를 건조시키기 위해 기화시키고 디브롬세팔로마닌을 포함하는 부분은 파클리타셀을 포함하는 부분으로부터 아세톤과 에틸렌 디클로라이드 1:9 v/v를 이용하여 실리카겔 칼럼을 통하여 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. TLC 와 HPLC 분석에 기초한 파클리타셀을 포함하는 용출된 부분을 복합시키고 그 다음 고형 잔기를 건조시키기 위해 기화시키고 여기에서부터 정제된 파클리타셀은 아세톤에 고체를 용해시켜 회수할 수 있고 핵산으로 파클리타셀을 결정화시킨다. 결정은 여과시키고 세척하고 건조시켜 최종 생성물을 만든다.

공정은 실행하는데 간단하고 용이하다. 적절하게는 파클리타셀과 세팔로마닌의 생산과 부산물의 분석은 HPLC 와 TLC로 실행하는 것이 적절하고 이는 생성물의 임의 손실을 피할 수 있다. 나타낸 바와 같이, 세팔로마닌의 할로겐화반응 적절하게는 브롬화반응은 파클리타셀과 세팔로마닌을 모두 포함하는 혼합물의 크로마토그래피 분리 동안에 파클리타셀의 선택성을 증가시키는 신규하고 편리한 방법이고, 공지의 다양한 탁산 변형과는 달리 브롬화 반응의 조건은 조절이 가능하여 공정동안에 파클리타셀의 손실이 없게 할 수 있다. 도 3에서는 T. 브레비폴리아로부터 파클리타셀의 분리와 정제를 위한 적절한 공정에 대해 나타내고 도 4에서는 세팔로마닌의 선택적인 브롬화반응을 위한 적절한 반응 과정을 설명하고 있다.

본 발명에 따르면, 분리 공정은 존재하는 파클리타셀의 농도에 관계하지는 않으며, 파클리타셀의 분리와 정제를 위한 시작점에서 복합 혼합물의 조성에도 무관하다. 따라서, 본 과정은 파클리타셀의 분리와 정제를 실행하기 위한 공정의 임의 단계에서 이용할 수 있는 선택성 할로겐화반응 단계와 함께 배양된 식물 세포와 파클리타셀을 생산하는 곰팡이와 같은 파클리타셀의 다른 원료로부터 파클리타셀의 분리와 정제 하류 과정에도 이용될 수 있다.

약 1% 내지 99.9% 파클리타셀의 양과 세팔로마닌을 포함하는 혼합물에서 할로겐화 반응은 전술한 과정과 유사하다. 혼합물은 적절하게는 CCl₄ 또는 CHCl₃와 같은 다량의 염소화 용매에서 적절하게 용해시키고 그 다음 0℃ 가까운 냉각 상태에서 교반하면서 냉각시킨 후에 CCl₄ 또는 CHCl₃로 희석된 화학량적인 동량(세팔로마닌에 대해 1.2 몰라 동량)을 세팔로마닌이 완전하게 브롬화될 때 까지 첨가한다. 전체 반응은 20℃, 적절하게는 5℃를 초과하지 않는 온도에서 암상태로 HPLC 분석과 같은 분석에 의해 모니터할 수 있다. 브롬화 반응을 종료한 후에 반응 혼합물은 과량의 브롬을 제거하기 위해 세척한다.

모든 경우에서, 세팔로마닌과 다른 불포화된 탁산은 파클리타셀의 높은 회수율과 함께 브롬화 된다. 파클리타셀과 브롬화된 화합물을 포함하는 생성된 혼합물은 크로마토그래피와 결정화 반응과 같은 다양한 방법을 이용하여 분리시키고 정제한다. 극성이 다소 적은 디브롬 유도체로의 세팔로마닌의 전이는 혼합물로부터 파클리타셀의 좀더 용이한 분리 가능성을 제공한다.

혼합물에 첨가되는 브롬의 몰수는 주로 세팔로마닌과 다른 불포화된 화합물의 농도에 의존한다. 일반적으로, 다소 순도가 떨어지는 혼합물(세팔로마닌과 연관하여 다량의 불포화 탁산을 포함하는)은 순도가 더 높은 혼합물보다도 불포화된 탁산을 완전하게 브롬화시키기 위해 더 많은 양의 브롬 몰량을 요구한다. 도 2 에서는 탁시신, 탁시신-I, 탁시닌 그리고/또는 브레비폴리아와 같은 불포화된 화합물을 다량 혼합물에 포함하는 경우에 이들은 브롬 1 몰라(Molar)양 이상으로 흡수하기 때문에 더 많은 몰라 양이 요구된다.

할로겐화 반응의 공정에 이용될 수 있는 용매는 이용되는 할로겐, 적절하게는 브롬에 비활성이어야 한다. 본 발명에 따른 유용하고 적절한 용매는 CCl₄, CHCl₃, CH₂Cl₂, C₂H₄Cl₂ 와 같은 염소계 용매가 적절하고 그 중에서도 CCL₄가 가정 적절하다. 할로겐화 공정은 -20℃ 내지 +20℃ 사이의 온도 범위에서 가장 효과적인데 적절하게는 -5℃ 내지 5℃ 에서 브롬과 함께 하는 것이다. 상기 반응에서 적절한 시약은 상업적으로 이용할 수 있는 탄화 테트라클로라이드 또는 클로로포름에서 0.01M 내지 0.1M 브롬이 된다. 브롬 또는 다른 할로겐에 감응성이 있는 몇가지 반응기를 포함하는 탁산 화합물을 브롬화시키기 위해 브롬과 같은 할로겐을 이용하는데 있어, 도 2 에 나열된 파클리타셀 또는 다른 화합물과의 다양한 원치 않는 반응이 일어날 수 있다는 것을 제시할 것이다. 그러나, 대신에 세팔로마닌의 측쇄 이중 결합에 대한 선택성은 기대이상으로 높고 뿐만 아니라 엑소사이클 이중결합을 포함하는 다른 탁산의 선택적인 브롬화 반응에 대해서도 선택성이 있다는 것을 발견하였다. 본 발명의 공정에 있어서, 파클리타셀은 반응동안에 상당히 분해되거나 또는 브롬화되지 않는 것을 알 수 있다. 그러나, 파클리타셀은 반응이 상당한 빛에 노출되는 경우에 몇 가지 확인 안된 화합물로 분해된다. 할로겐화 반응(브롬화반응)동안에 파클리타셀의 임의 분해는 HPLC 에 의한 반응을 주기적으로 모니터함으로써 용이하게 피할 수 있다.

다음의 실시예는 본 발명의 적절한 공정에 의해 파클리타셀의 정제에 관계한다. 모든 화학물질은 제조업자/공급업자로 부터 제공을 받는다. 모든 생성물과 부산물로부터 발생하는 파클리타셀과 세팔로마닌은 Merck #5554, F254 실리카 겔 플레이트를 이용한 TLC와 HPLC에 의해 모니터 하였다. HPLC 시스템은 Water 510 펌프, 660E 시스템 컨트롤러, 712 WISP 또는 710E WISP 오토인젝터, Waters 490 프로그램 다중 파장 감지기, Waters 990 포토다이오드 배열 감지기 그리고 NEC APCIV 컴퓨터와 Waters LambdaMax 모델 481 스펙트로포토메터와 데이터 모듈로 구성된다. 사용된 HPLC 칼럼은 3.9mm×300mm 페닐 역상 Waters μbondapak 칼럼과 페닐 가드칼럼을 포함한다. 섬광 크로마토그래피를 위한 실리카겔은 ICN 바이오메디칼에 의해 공급되는 32-63mm 메쉬 크기이다.

그러나, 다음의 실시예는 설명을 목적으로 한 것이며 본 발명을 이에 한정하고자 함은 아님을 인지할 것이다.

실시예 1

천연 바이오매스로부터 파클리타셀의 정제

단계 1

태평양 주목 탁수스 브레비폴리아의 수피로부터 크기가 2 내지 4mm 조각으로 만든다. 수피에 파클리타셀의 농도는 수피의 0.03-0.1% w/w이고, 45kg의 수피를 스테인레스 스틸 탱크내로 공급한다. 이는 150L 메탄올로 3 회 추출한다. 각 추출물은 혼합을 촉진시키기 위해 추출물을 빈번히 회전하면서 5 일 주기로 실행한다. 추출물은 용적을 10-15L 사이로 농축시키기 위해 로터리 증발기로 농축시킨다. 추출물의 온도는 40℃를 초과하지 않는다. 파클리타셀의 거의 99%가 이와 같은 방법에 의해 메탄올 상으로 추출된다.

단계 2

1 단계로부터 메탄올 추출물은 메틸렌 클로라이드 또는 에틸렌 클로라이드 그리고 그 유사체와 물사이에 분할한다. 15L 메탄올 추출물에 동량의 메틸렌 클로라이드와 물을 첨가한다. 혼합물은 15분간 서서히 교반하고 2 시간동안 방치한다. 두 개의 상을 분리하였다. 메틸렌 클로라이드 상은 파클리타셀의 분리를 위해 추가 공정에 들어간다. 분석 시에, 파클리타셀은 수용상에 남아있고 그 다음 메틸렌 클로라이드로 제 추출하고 메틸렌 클로라이드 추출부분은 제 1 추출부로 부터 동일 부분으로 모은다. 혼합하는 동안에 유제가 형성되면 이를 부수기 위해 메탄올(0.5-1L)을 첨가한다. 메틸렌 클로라이드 추출물은 건조하기 위해 회전 기화시킨다. 고형 잔유물은 1.8-2.2% 파클리타셀을 포함하는 0.9-1.1kg사이에 있다. 공정동안에 생성물의 온도는 40℃를 초과하지 않는다.

단계 3

단계 2 로부터 수용성 부분에는 파클리타셀, 10-데아세틸 바카틴 III, 바카틴 III 그리고 다른 극성 화합물을 포함하고 있다. 수용성 부분 35L에는 51 브라인(brine) 용액을 첨가한다. 두 개의 상이 분리된다. 위층인 에틸 아세틸 층은 파클리타셀, 10-데아세틸 바카틴 III, 바카틴 III 그리고 다른 극성 화합물을 포함하고 있다. 아래층 수용성 상은 에틸 아세테이트로 재 추출하고 에틸 아세테이트 부분은 초기 추출 부분으로부터 동일 부분으로 모은다. 모아진 에틸 아세테이트 부분은 30-35L로써 회전 기화기에 의해 농축시키고 2.8 내지 3.2 L로 점성 암갈색 용액으로 만든다. 이는 글리코시드를 분리하기 위한 추가 공정을 위해 저장한다.

단계 4

단계 2 로부터 메틸렌 클로라이드 고형 잔기는 2L 아세톤에 용해시킨다. 동량의 헥산을 강력한 교반 환경 아래에서 첨가한다. 극성 불순물은 이와 같은 조건아래에서 침전시킨다. 이들은 가라앉고 상층액은 추가 처리를 위해 버린다. 침전물은 아세톤/헥산(1/1 v/v)으로 세척하고 여과물은 기존 상층액과 함께 모은다. 상층액은 회전 기화기를 이용하여 ⅓ 용적으로 기화시킨다. 점성 잔유물은 1.5L-3.0L사이가 되고 황갈색을 띄게 된다.

단계 5

단계 4 의 아세톤/헥산 잔유물은 왕성하게 교반하면서 10 내지 15L 헥산에 적하시킨다. 얇은 노란색 물질이 침전되기 시작한다. 약 8 시간 뒤에 이 물질을 여과시키고 진공(1mm 내지 2mm), 40℃에서 건조시켜 약 0.5 내지 0.6kg 물질을 수득한다.

단계 6

단계 5 로부터의 고형 잔기는 0.5L 아세톤-메틸렌 클로라이드에 그 다음 용해시키고 이동상으로 동일 용매를 이용하여 실리카 겔 칼럼을 통하여 섬광 크로마토그래피한다. 사용된 겔의 량은 3.5 내지 4kg이 된다. 각 샘플은 TLC 와 HPLC를 통하여 분석한다. 파클리타셀과 세팔로마닌을 포함하는 부분은 함께 모으고 건조하기 위해 로터리 기화시킨다. 고형 잔기는 45-55% w/w 파클리타셀 또는 36 내지 40g 파클리타셀을 포함하는 55 내지 70mg의 파클리타셀과 세팔로마닌의 혼합물이다.

단계 7

단계 6 으로부터 수득된 파클리타셀과 세팔로마닌의 원료 혼합물은 분석 후에 28.8% w/w 세팔로마닌과 51.2% w/w 파클리타셀을 포함하는 것으로 밝혀졌고 이는 세팔로마닌으로 부터 파클리타셀을 분리하기 위해 화학적으로 변형된다. 10g 원료 혼합물은 카본 테트라클로라이드, 클로로포름, 메틸렌 클로라이드 또는 에틸렌 클로라이드와 같은 염소계 용매 1 L에 용해시킨다. 이와 같은 적절한 구체예에서, 0.01M 카본 테트라클로라이드 브롬 용액은 암상태에서 왕성하게 혼합하면서 0℃ 온도 조건하에 원액 용액과 매우 서서히 반응한다. 반응 공정은 HPLC에 의해 모니터된다. 세팔로마닌이 완전하게 반응하면 브롬화 반응은 종료된다. 잔류 브롬은 황산나트륨 수용액으로 세척함으로써 제거될 수 있다. 반응하는 동안에 형성된 하이드로브롬산은 희석된 중탄산나트륨 용액(0.5% w/w)으로 세척해 낸다. 그 다음 생성된 유기 추출물은 무수 황산나트륨으로 건조시키고 로터리 기화기에서 농축하여 13.2g중량의 고형 잔류물이 된다.

단계 8

단계 7의 브롬화 잔기는 아세톤/메틸렌 클로라이드 혼합물 1:9 v/v에 용해시키고 실리칼 칼럼에서 크로마토그래피 분리한다. 수득된 부분은 TLC와 HPLC에 의해 분석한다. 파클리타셀을 포함하는 부분은 함께 모으고 로터리 기화기에 의해 기화 건조시킨다. 고형 잔유물은 흰색이고 6.1g 이다.

단계 9

단계 8 의 고형 잔유물은 아세톤에 용해시키고 동량의 n-헥산 또는 헥산으로 결정화한다. 결정은 냉각 아세톤/헥산, 1/1 v/v 용액으로 세척하고 40℃으로 진공하에 건조시킨다. 고형 결정은 4.84g이고 HPLC로 측정하였을 때 파클리타셀이 >97% w/w를 포함하고 있다.

실시예 2

부분적으로 정제된 세팔로마닌의 브롬화 반응

150mℓ 카본 테트라클로라이드에 용해된 6-7% 파클리타셀를 포함하는 0.63g 91.5% 세팔로마닌(0.0007 moles)를 250㎖ 분리 펀넬이 고정된 500㎖ 세 가지 밑 둥근 플라스크에 첨가한다. 플라스크는 냉각-염 베스에 담근다, 온도가 -5℃에 달하면, 카본 테트라클로라이드(76.31㎖, 0.01M) 브롬 용액(0.1221g)을 서서히 교반시키면서 첨가하는데 이때 교반 속도는 반응 온도가 5℃를 초과하지 않도록 한다. 세팔로마닌과 브롬의 비율은 1:1.1 mole이다. 첨가는 세시간 동안 이루어지고 생성된 용액은 탁한 옅은 갈색이다.

브롬화 반응은 HPLC로 매 시간마다 모니터 한다. 존재하는 모든 세팔로마닌이 2", 3"-디브로모-유도체로 전이될 때 반응이 완료되고 이는 HPLC에 기초할 때, 액 8시간 소요된다. 반응 혼합물은 브롬의 소모로 인하여 얇은 노란 색 내지 무색으로 된다.

반응 혼합물은 1L 분리 펀넬을 통하여 이동되고 우선 0.5% 수용성 황산나트륨(300㎖)로 세척하고 그 다음 0.5% 수용성 중탄산나트륨으로 세척하고 그 다음 탈이온수(200㎖)로 2회 세척하여 최종 pH가 6.5가 된다. 복합된 수용성 층은 CH₂Cl로 일단 추출하고 그 다음 CH₂Cl₂층은 기존 유기 추출물과 혼합한다. 그 다음 Na₂SO₄ 위에서 건조하고 여과하고 기화시킨다. 수득률은 0.76g으로 옅은 크림색 고형이 되고 시작 물질에 기초하면 거의 100% 수득률이 된다.

크림 색 고형 물질은 용출액으로써 아세톤/CH₂Cl₂(10:90)을 이용하여 실리카겔(50g, ICN Silitech, 32-63 D, 60A)에서 크로마토그래피한다. 50㎖ 부분을 수득하고 TCL(Silicagel 60 F₂₅₄, Merck #5554)에 의해 점검하고, 아세톤/CH₂Cl₂ (20/80)으로 발생시키고 비닐린-설퓨린산/메탄올 분무제를 이용하여 감지한다. R_f=0.64에서 단일 점을 가지는 부분은 혼합하고 농축시켜 건조하면 0.485g 밝은 크림색이 흰색 결정 고형이 된다; mp:158℃, 2", 3"-디브로모세팔로마닌으로 확인되었다. 수득률은 시작 세팔로마닌을 기초할 때 약 70%가 되었다.

실시예 3

세팔로마닌, 파클리타셀 그리고 다른 탁산계 화합물을 포함하는 정제 안된 혼합물의 브롬화반응

실시예 2에 이용된 것과 같은 유사한 기구를 이용하며, HPLC에 기초하면 51.2% 파클리타셀, 28.8% 세팔로마닌 그리고 약 20% 다른 탁산 또는 비-탁산 불순물의 혼합물로 구성된 정제 안된 파클리타셀(2.0g) 샘플은 150㎖ 카본 테트라클로라이드와 150㎖ CH₂Cl₂에 용해시켜 맑은 밝은 황색 용액을 만든다. 플라스크는 냉염 바스에 담구고 교반한다. 온도가 -5℃에 달하면, 0.1332g 100% 브롬/83.13㎖(0.01M) 카본 테트라클로라이드(1 M tp:1.2M 브롬)를 용액에 첨가하는데 이때, 첨가 속도는 반응 혼합물의 온도가 5℃를 초과하지 않도록 한다. 참가에 요구되는 시간은 약 세시간이고 흐린, 황갈색 용액을 만든다. 브롬의 첨가가 완료되면, 반응은 추가 8 시간동안 동일한 조건에서 지속하고 매 1 시간마다 파클리타셀과 세팔로마닌의 HPLC 분석을 실행한다. 용액이 무색 또는 옅은 황색이 되면 반응이 종료되고 모든 세팔로마닌은 디브로모 유도체로 전이된다. 추가 8시간 후에 용액에 여전히 1-2＆ 이상 세팔로마닌을 포함하고 있는 경우에 초기 조건을 유지하고 10㎖ 0.01M 브롬/카본 테트라클로이드를 적하시켜 첨가하고 HPLC 분석하기 전에 1 시간동안 반응을 허용한다.

반응 혼합물로부터 초과량의 브롬은 0.5% 수용성 Na₂SO₃(300㎖), 0.5% 수용성 NaHCO₃(200㎖) 그리고 탈이온수(2X 200㎖)으로 세척하여 제거한다. 반응 혼합물은 무수 Na₂SO₄를 이용하여 건조시키고 진공 하에서 건조시켜 2.35g의 건조한 밝은 크림색이 흰색 결정 잔류물이 된다. 건조된 물질은 실시예 2 에 예시한 조건하에서 실리카겔 칼럼 위에서 정제한다. 분리될 혼합물과 실리카겔의 비율은 1:60이고 따라서 120g 실리카겔이 이용된다. 각 부분은 TLC 의해 점검하고 HPLC에 의해 매 1 부분을 점검한다. TLC에서 동일한 R_f를 가지는 부분과 HPLC에서 동일한 보유 시간을 가지는 부분을 두 개의 복합된 부분을 만들기 위해 혼합한다. R_f가 0.64인 단일 TLC 점을 가지는 부분(#25-#39)은 디브로모세팔로마닌이고 R_f가 0.49인 단일 TLC점을 가지는 부분(#41-#81)은 파클리타셀을 나타낸다.

진공하에 40℃에서 건조 농축 시에 부분#25-#39는 흰색에서 밝은 황색 고형(0.460g, 66.6% 이론적인 수득량)을 생산한다.

수득된 디브로모세팔로마닌의 분석 결과는 다음과 같다;

m.p.158-160℃(크로마토그래피 순도 96.19%)

R_f=실리카 겔 60 F₂₅₄ 플레이트(Merck, #5554)에서0.64(단일 점)

용매 시스템; 아세톤; CH₂Cl₂(20:80)

분무 용매;바닐린/황산/메탄올

질량 스텍트럼[FAB]⁺

[M + H]⁺=990, 992, 994

[M + Na]⁺=1014

[M + K]⁺=1030

제 2 복합 부분(#41-#81)의 농축으로 1.16g(>100% 이론량) 파클리타셀을 생산하고 이는 50:50 아세톤/헥산을 이용하여 재결정하고 여과하고 동일 비율의 냉각된 용매로 세척하고 24 시간동안 40℃에서 건조시킨다. 수득량은 흰색 결정 0.902g(시작 물질에 기초하면 45.11% 이론 또는 시작 물질에서 파클리타셀의 HPLC분석에 기초하면 88.1%)이다. 분리 정제된 파클리타셀의 분석은 다음과 같다;

m.p.214-216℃

R_f=실리카 겔 60 F₂₅₄ 플레이트에서 확실한 샘플 존재 하에 (Merck, #5554)에서 0.49

용매 시스템; 아세톤; CH₂Cl₂(20:80)

분무 용매;바닐린/황산/메탄올

UV 스펙트럼/CH₃OH: 228.4(297146.8)

(λ_MAX in nm, (ε)) 206.6(26540.1)

IR 스펙트럼 in KBr(cm^-1) 3500, 1105, 1070( tert ＆ sec. OH)

3430, 1650, 1580(-CONH-)

3070, 1610, 1520, 780, 710(monosub, 방향족 고리)

2950, 2910, 1480, 1450, 1370(CH₃, CH₂, CH)

3020, 1315, 980(이중결합)

1730, 1270(방향족 에스테르)

1715, 1240(>C=0)

850(에폭시 고리)

UV와 IR 스펙트럼은 순수 파클리타셀의 것과 일치하였다.

실시예 4

탁산 정제 안된 혼합물로부터 파클리타셀의 분리 정제와 이의 분석

10.00g 원료 파클리타셀 용액( HPLC분석에 기초하여 내용물은 28.8% 세팔로마닌, 51.2% 파클리타셀 그리고 약 20%의 다른 탁산 또는 비-탁산 불순물이 된다)을 500㎖ 분리 펀낼, 재환류 응축기, 온도계 그리고 자석 교반기를 갖추고 있는 2.0L 세 가지 플라스크내의 1.5L 카본 테트라클로라이드에 용해시키고, 플라스크는 냉각-염 베스에 담군다, 반응 혼합물은 온도가 -5℃에 달할 때까지 교반시키고, 그 다음 41.2㎖ 0.1M 브롬(0.665g 브롬) 카본 테트라클로라이드 용액(0.1221g)을 약 3 시간 동안 적하시킨다. 세팔로마닌과 브롬의 비율은 1:1.2이다. 반은 온도는 5℃을 넘지 않도록 한다. 브롬 첨가가 완료되면, 온도를 -1 내지 5℃ 사이로 유지하면서 교반을 계속한다. 존재하는 모든 세팔로마닌이 디브로모-유도체로 전이될 때까지 반응은 HPLC로 매 시간마다 모니터한다(약 8시간). 1500-1600㎖ 용액의 최종 색깔은 시작 물질의 색깔에 따라 밝은 황색 또는 크림색이 되고 소량의 과량 브롬이 존재할 수도 있다.

잔류 브롬을 제거하기 위해 반응 혼합물은 우선 0.5% 수용성 황산나트륨(500㎖)로 세척하고 그 다음 0.5% 수용성 중탄산나트륨(500㎖)으로 세척하고 그 다음 탈이온수(2X500㎖)로 세척한다. 그 다음 반응 혼합물은 무수 Na₂SO₄위에서 건조하고 진공 하에서 농축하여 수득률은 13.20g으로 옅은 크림색 내지 흰색 결정 고형이 된다.

이 물질은 실시예 2 와 3 에서 언급한 조건하에서 실리카 겔 칼럼에서 크로마토그래피 분리한다. 100×5cm 유리 칼럼은 600g 실리카 겔(비율 10:90)로 슬러리 방법에 의해 준비한다. 1L 아세톤/CH₂Cl₂(25:75)는 최종 칼럼 세척제로 이용한다. 각 부분은 TLC에의해 분석하고 HPLC에 의해 매 세 번째 부분을 분석한다. 부분(#11-#22)는 R_f=0.64에서 단일 점을 가지고 복합 후에 Buchi votavapor(40℃ 진공) 에서 농축, 건조하여 휜색 내지 밝은 황색 고형인 2", 3"-디브로모세팔로마닌3.25g(95%)을 수득한다.

생성물의 분석은 다음과 같다;

m.p.158-160℃

R_f=실리카 겔 60 F₂₅₄ 플레이트(Merck, #5554)에서0.64(단일 점)

용매 시스템; 아세톤; CH₂Cl₂(20:80)

분무 용매;바닐린/황산/메탄올

원소 조성과 분자량(HR FAB⁺에 기초하여)

C₄₅H₅₄NO₁₄ ⁷⁹Br₂[M +H]⁺

계산치: 990.191000

실재치: 990.191103(Δm=0.1ppm)

C₄₅H₅₄NO₁₄ ⁷⁹Br^8IBr[M +H]⁺

계산치: 992.181000

실재치: 992.189057(Δm=8.1ppm)

C₄₅H₅₄NO₁₄ ^8IBr₂[M +H]⁺

계산치: 994.175000

실재치: 994.187011(Δm=12.1ppm)

C₄₅H₅₃NO₁₄Na⁷⁹Br⁸¹Br[M +Na]⁺

계산치: 1014.161000

실재치: 1014.171002(Δm=9.9ppm)

C₄₅H₅₃Na₁₄K⁷⁹Br⁸¹Br[M +K]⁺

계산치: 1030.097000

실재치: 1030.144940(Δm=0.1ppm)

UV 스펙트럼/CH₃OH: (λ_MAX in nm, (ε)) 274.2(1550.8); 227.1(18610.4); 221.8(18325.1)

IR 스펙트럼 in KBr(cm^-1) 3500, 1105, 1070( tert ＆ sec. OH)

3420, 1670, 1580(-CONH-)

3110, 3060, 1605, 1505, 707, 710(monosub, 방향족 고리)

3060, 2960, 2915, 2870, 1465, 1370(-CH₃, CH₂-, =CH-)

3020, 1670, 1310, 980(이중결합)

1730, 1270(방향족 에스테르)

1715, 1240(>C=0)

855(에폭시 고리)

520(브롬 화합물)

¹H NMR in CDCl₃ (300 MHz) : 1.94 (d, 3H, -COC(Br) CH₃-5")

(ppm; 측쇄 프로톤만) 1.98 (d, 3H, -HC(Br) CH₃-4")

4.63 (qt, 1H, -¹CH (Br) -3")

13C NMR (300 MHz) 170.21 그리고 170.25 (C-1')

(in ppm; 측쇄) 172.26 그리고 172.32 (C-1")

72.76 그리고 72.90 (C-2')

69.71 그리고 69.88 (C-2")

54.34 그리고 54.52 (C-3")

30.39 그리고 30.77 (C-4")

27.21 그리고 27.62 (C-5")

EIMS : [M]⁺ 568, 551, 509, 491, 431, 405,

(m/z)(주요단편) 391, 386, 329, 326, 308, 278,

264, 245, 217, 200, 188, 159, 149,

122, 105, 91, 83, 77, 55, 43.

DCIMS : [M+H]⁺ 569, 552, 510, 474, 450, 432,

(m/z)(주요단편) 424, 392, 387, 370, 329, 327,

309, 279, 265, 264, 246, 218, 200,

FAB + -MS: 1030 [M+K]⁺; 1014 [M+Na]⁺; 992

(m/z) [M+H]⁺ (See Elem, Anal.);

974 [M - H₂O]⁺ ; 932 [M-AcOH]+ ; 914

[M-AcOH-H₂O]⁺ ; 912 [M-HBr]⁺ ; 870

[M - BzOH]⁺ ; 854 [870 - H₂O - 2H];

832 [M-2HBr]+ ; 705 [M-243-AC]+

569 [T]⁺ ; 551 [T-H₂O];

509 [T-AcOH]⁺; 491 [T-AcOH-H₂O]+ 448 [T-BzOH]⁺;

391 [S - 0 - H₂O]⁺ ;

378 [T - AcOH - BzOH]⁺ ; 376 ; 347

[S - 0 - CO - HCHO]⁺ ; 338:

327 [387 - AcOH]⁺ ; 315; 284

[327 - Ac]⁺ ; 279; 264 [832 - T]⁺ or

[424 - 2HBr]⁺ ; 246 [264 - H₂O]⁺ ; 231;

218 [264 - HCOOH]⁺ ; 188;

167 [S - C₅H₈ONBr₂]⁺ ; 149 [167 - H₂O]⁺ ;

133; 122 [BzOH]⁺ ; 113:

105[Bz]⁺; 91[C₇H₇]⁺; 83; 77[C₆H₆]⁺; 76; 57; 55;

(T=화합물에서 탁산고리 ; S-산 화합물에서 측쇄)

HPLC:

조건 1 : 칼럼 CN 10μ (250×4.6mm)

용매계 CH₃CH : H₂O (40 : 60)

유속 1 mL/min

감지수 490 (at 227 nm)

주입용량 20 μL

RT _2″,3″ - 디브로모세팔로마닌 26.06 분

조건 2 : 칼럼 : 쿠로실 G 6μ (250×3.2mm)

용매계 CH₃CN : H₂O (45 : 55)

유속 0.75 mL/min

감지수 490 (at 227 nm)

주입용량 20μL

RT _{2″, 3″}- 디브로모세팔로마닌 2부분입체 이성질

체형

RT_I = 23.53

RT_II = 24.50

열무게 분석 (TGA):

온도 (안전도 %) : 28.04℃

(100.0%), 100.00℃ (99.64%),

150.00℃ (98.88%), 175.00℃ (95.35%),

180.00℃ (86.75%), 200.00℃

(60.38%), 250.00℃ (45.03%).

분별 스케닝 열량계 (DSC):

173.76℃, 187.73℃

TLC에서 단일 점을 가지고(Rf 0.49, 파클리타셀의 진짜 샘플과 동일함) 그리고 HPLC에서 단일 피크를 가지는 #26 내지 #68의 부분을 복합시키고 봉축시키고 Buchi Rotavapor(40℃ 진공)에서 건조시켜 흰색 고형 6.10g을 수득하였다. 이 물질은 60㎖ 아세톤/헥산 혼합물(50:50)으로부터 결정화시키고 여과시키고 동 비율의 냉각 용매로 세척하고 40℃(24시간) 진공에서 건조시켜 흰색 결정 4.84g(92%)을 수득하는데 이는 파클리타셀의 진짜 샘플과 비교할 때 동일하였다.

m.p. : 214℃ - 216℃

TLC :

Rf : 0.49 (진짜 샘플 존재시에 ) 실리카겔 60 F₂₅₄ 플레이트(merck # 5554)

용매계 : 아세톤/CH₂Cl₂ (20 : 80)

분무제 : 바닐린/설폰산/메탄올

원소분석 :

C₄₇H_5IO_l4N: %C %H %N

계산치 66.11 6.02 1.64

실제치 65.97 5.89 1.63

도 5

UV 스펙트럼 CH3OH :

(λ_max IN mm, (ε)) 227.2 (29824.1)

208.0 (26256.3)

도 6

IR 스펙트럼 (KBr) (cm^-1)

3500, 1105, 1070 (tert. ＆ sec. OH)

3430, 1650, 1580 (-CONH-)

1610, 1520, 780, 710 (방향족고리)

2950, 2910, 1480, 1450, 1370 (-CH₃,

- CH₂-, >CH- 기)

3020, 1315, 980 (이중결합)

1725, 1270 (방향족 에스테르)

1710, 1240 (>C=0)

850 (에톡시 고리)

도 7a

¹H NMR 스팩트럼 1.88 (S, 1 OH, C-1); 5.66(D, 1H, C-2);

(300 MHz; CDCl³) 3.82(dd, 1H, C-3); 2.38(S, 3H, Ch₃COO

(ppm) at C-4); 4.94 (dd, 1H, C-5): 1.88(ddd,

1H, C-6); 2.48 (ddd, 1H, C-6): 2.53

(d, 1 OH, C-7); 4.38 (dd, 1H, C-7);

6.27 (S, 1H, C-10); 2.23 (S, 3H, CH3COO at

C-10); 6.20 (qt, 1h, C-13);

2.27 (ddd, 1H, C-14); 2.33

(dd, 1H, C-14); 1.13 (S, 3H, C-17);

1.23 (S, 3H, C-18); 1.78 (S, 3H, C-18);

1.68 (S, 3H, C-19); 4.20 (dd, 1H, C-20);

4.30(S, 1H, C-20); 3.77 (S, 1H, C-2');

4.78(ddd, 1H, C-2'), 5.20(ddd, 1H, C-3),

7.10(ddd, 1H, C-3),

p - ＆ m - 방향족 고리에 서프로톤 A₁, B₁, ＆

C₁); 7.64 (t, 1H, A₁-P); 7.72

(dd, 2H, C₁-0), 8.11 (dd, 2H, A₁-0).

도 7b

13C NMR 스펙트럼 79.1(C-1); 75.1(C-2); 45.8(CO3); 81.2

(300 MHz, CDCl3) (C-4); 84.4(C-5); 35.6(C-6); 72.1(C-7);

(ppm) 56.7(C-8); 203.6(C-9); 75.6(C-10);

133.3(C-11); 141.9(C-12); 72.3(C-13);

35.7(C-14); 43.2(C-15); 21.8(C-16);

26.9(C-17); 14.7(C-18); 9.5(C-19);

(56.66%), 275.00℃(45.92%).

도 14

DSC : 210.85℃.

물함량 (％H₂O) : 0.90% (Karl Fischer)

Claims (34)

1. 탁산 혼합물을 함유하는 유기 물질로부터 파클리타셀을 분리하고 정제하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:

   1) 상기 유기 물질로부터 탁수스(taxus) 화합물-포함 조성물을 추출하고;

   2) 실리카겔 칼럼에서 메틸렌 클로라이드 또는 에틸렌 클로라이드에서 선택되는 크로마토그래피 용매를 이용한 섬광 크로마토그래피로 상기 조성물로부터 파클리타셀, 세팔로마닌, 다른 탁산을 함유하는 혼합물을 분리하고;

   3) 세팔로마닌을 디할로세팔로마닌의 부분입체이성질성 혼합물로 전이시키는 세팔로마닌 불포화 측쇄의 선택적인 할로겐화 반응에 효과적인 조건하에서 상기 혼합물을 할로겐과 반응시키고;

   4) 실리카겔 칼럼에서 아세톤과 메틸렌 클로라이드 또는 에틸렌 클로라이드로 구성되는 크로마토그래피 용매를 이용한 크로마토그래피로 상기 혼합물로부터 파클리타셀을 분리한다.
2. 제 1 항에 있어서, 유기 물질은 제1 추출용매로 추출하고, 상기 제1 추출용매는 기화시켜 제1 파클리타셀-포함 잔류물을 만들고, 이후 제2 추출용매로 제1 잔류물을 추출하고, 상기 제2 추출용매는 기화시켜 제2 파클리타셀-포함 잔류물을 만들고, 이후 결정화 반응으로 제2 잔류물을 정제하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 제1 추출용매는 메탄올이고, 제1 파클리타셀-포함 잔류물은 메틸렌 클로라이드, 에틸렌 클로라이드, 클로로포름에서 선택되는 용매와 물 사이에 분할하고, 상기 잔류물은 상기 용매에서 추출하고 제2 잔류물로 건조시키며, 상기 제2 파클리타셀-포함 잔류물은 아세톤에 용해시키고 비-극성 불순물을 헥산으로 침전시키며, 여기서 아세톤-헥산 용액은 1/3 용적으로 기화시켜 제3 파클리타셀-포함 점성 잔류물을 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 용매와 물은 1:1 v/v 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 3 항에 있어서, 제3 점성 잔류물은 10배 용적의 헥산 첨가로 침전시켜 밝은 황색 침전물을 얻고, 이로부터 제4 파클리타셀-포함 고형 잔류물을 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 4 항에 있어서, 제4 고형 잔류물은 메틸렌 클로라이드 또는 에틸렌 클로라이드와 함께 아세톤에 용해시키고, 이후 크로마토그래피 용매하에 실리카겔 칼럼에서 섬광 크로마토그래피하여 파클리타셀과 세팔로마닌의 혼합물을 포함하는 용출액 부분을 수득하고, 이는 합치고 건조시켜 제5 파클리타셀-포함 잔류물을 만드는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 크로마토그래피 용매는 1:9 내지 3:7 v/v 비율의 아세톤과 메틸렌 클로라이드 또는 에틸렌 클로라이드의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 6 항에 있어서, 제5 잔류물은 CCl₄, CHCl₃, C₂H₄Cl₂, CH₂Cl₂에서 선택되는 염소계 용매에 용해시키고 할로겐과 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 할로겐은 브롬인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 브롬은 할로겐화된 용매에서 0.01M 내지 0.1M 용액의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, 브롬과의 반응은 암(dark) 상태에서 -20℃ 내지 20℃ 범위의 온도에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 염소계 용매에 존재하는 모든 세팔로마닌이 디브로모세팔로마닌의 부분입체이성질성 혼합물로 전이되고, 파클리타셀이 반응 혼합물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 파클리타셀을 포함하는 유기 물질은 탁수스 브레비폴리아(T. brevifloia)의 수피(bark), 탁수스 종의 식물재료, 탁수스 종의 세포 배양물및 파클리타셀을 생산하는 곰팡이에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 12 항에 있어서, 파클리타셀은 1:9 내지 3:7 v/v 비율의 아세톤과 메틸렌클로라이드 또는 에틸렌 클로라이드 혼합물로 구성되는 크로마토그래피 용매를 이용한 실리카겔 크로마토그래피에 의해 반응 혼합물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 12 항에 있어서, 분리된 파클리타셀은 아세톤과 헥산 혼합물로 결정화되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 파클리타셀과 세팔로마닌을 함유하는 혼합물로부터 파클리타셀을 분리하는 방법에 있어서,

    a) 모든 세팔로마닌을 할로겐화할 수 있는 온도와 시간에서 할로겐과 혼합물을 반응시키고,

    b) 할로겐화된 세팔로마닌으로부터 파클리타셀을 분리하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 할로겐은 플루오르, 염소, 브롬, 요오드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 할로겐은 브롬인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 18 항에 있어서, 브롬은 0.01M 내지 0.1M 농도 범위로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 16 항에 있어서, a)의 반응은 -20℃ 내지 20℃ 범위의 온도에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 19 항에 있어서, 브롬은 CCl₄, CHCl₃, CH₂Cl₂에서 선택되는 염소계 용매에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 21 항에 있어서, 염소계 용매는 CCl₄ 또는 CHCl₃인 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 16 항에 있어서, a)의 반응은 암(dark) 상태에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 16 항에 있어서, b)의 분리는 적절한 용매에서 실리카겔 크로마토그래피에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 24 항에 있어서, 용매는 아세톤과 메틸렌 클로라이드 또는 1,2-디클로로에탄이 1:9 내지 3:7인 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 25 항에 있어서, 파클리타셀을 포함하는 부분은 고형 잔류물로 기화되는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 26 항에 있어서, 결정화반응으로 파클리타셀을 정제하는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 27 항에 있어서, 고형 잔류물은 아세톤에 용해되는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 28 항에 있어서, 파클리타셀은 헥산으로 결정화되는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 25 항에 있어서, 파클리타셀은 2",3"-디브로모세팔로마닌의 부분입체이성 질성 혼합물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 16 항에 있어서, a)의 반응은 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)에 의해 모니터되는 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 16 항에 있어서, 혼합물은 파클리타셀을 포함하는 원료로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 32 항에 있어서, 파클리타셀을 포함하는 원료는 탁수스 브레비폴리아(T. brevifloia)의 수피, 탁수스 종의 식물재료, 탁수스 종의 세포 배양물 및 파클리타셀을 생산하는 곰팡이에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 파클리타셀과 세팔로마닌을 포함하는 혼합물로부터 파클리타셀을 분리하는 방법에 있어서,

    a) 모든 세팔로마닌을 브롬화할 수 있는 온도와 시간에서 브롬과 혼합물을 반응시키고,

    b) 브롬화된 세팔로마닌으로부터 파클리타셀을 분리하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.

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