DE69431753T3

DE69431753T3 - Verfahren zur herstellung gas-gefüllter liposome

Info

Publication number: DE69431753T3
Application number: DE69431753T
Authority: DE
Inventors: Evan C Unger; Thomas A. Fritz; Terry Matsunaga; Varadarajan Ramaswami; David Yellowhair; Guanli Wu
Original assignee: ImaRx Pharmaceutical Corp
Current assignee: ImaRx Pharmaceutical Corp
Priority date: 1993-06-11
Filing date: 1994-05-19
Publication date: 2009-07-09
Anticipated expiration: 2014-05-20
Also published as: EP0711127B2; DE69431753T2; DE69431753D1; CN1215986A; US5715824A; CA2164844C; EP0711127A4; CN1119173C; PT711127E; WO1994028797A1; HK1028943A1; AU7041694A; ATE227960T1; EP0711127B1; DK0711127T4; US5935553A; ES2187524T5; EP0711127A1; US5469854A; JP2002510278A

Description

Verwandte Anmeldung
Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-part der gleichzeitig anhängigen Anmeldung mit der US-Seriennummer 717,084 und der US-Seriennummer 716,899, die beide am 18. Juni 1991 angemeldet wurden, die wiederum eine Continuation-in-part der US-Seriennummer 569,828, angemeldet am 20. August 1990, sind, die wiederum eine Continuation-in-part der Anmeldung mit der US-Seriennummer 455,707, angemeldet am 22. Dezember 1989, ist. Die gesamte Offenbarung jeder dieser Patentanmeldungen ist in diese Beschreibung einbezogen.
Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft neue Verfahren zur Herstellung Gas-gefüllter Liposomen. Liposomen, die mit diesen Verfahren hergestellt worden sind, sind z. B. besonders in Ultraschallbilderzeugungsanwendungen und in therapeutischen Abgabesystemen geeignet.
Hintergrund der Erfindung
Zum Nachweis und zur Diagnose von Erkrankungen bei Tieren und bei Menschen wurde eine Vielzahl von Bilderzeugungstechniken verwendet. Röntgenstrahlen gehören zu den ersten Techniken, die zur diagnostischen Bilderzeugung verwendet worden sind. Die mit dieser Technik erhaltenen Bilder geben die Elektronendichte des mit der Bilderzeugungstechnik untersuchten Objekts wieder. Kontrastmittel wie z. B. Barium oder Iod wurden im Laufe der Jahre verwendet, um Röntgenstrahlen derart zu schwächen oder zu blockieren, dass der Kontrast zwischen verschiedenen Strukturen erhöht wird. Es ist jedoch bekannt, dass Röntgenstrahlen relativ gefährlich sind, da die bei den Röntgenstrahlen verwendete Strahlung ionisierend ist, und dass verschiedene schädliche Effekte ionisierender Strahlung kumulativ sind.
Eine weitere wichtige Bilderzeugungstechnik ist die Magnetresonanzbilderzeugung (MRI). Diese Technik hat jedoch verschiedene Nachteile, wie z. B. die Kosten und die Tatsache, dass sie nicht mit einem tragbaren Untersuchungsgerät durchgeführt werden kann. Darüber hinaus steht MRI in vielen medizinischen Zentren nicht zur Verfügung.
In der Nuklearmedizin verwendete Radionuklide liegen einer weiteren Bilderzeugungstechnik zugrunde. Bei der Anwendung dieser Technik werden Radionuklide, wie z. B. Technetium-markierte Verbindungen in den Patienten injiziert und Bilder werden von Gamma-Kameras erhalten. Nuklearmedizintechniken leiden jedoch an einer schlechten räumlichen Auflösung und setzen das Tier oder den Patienten den schädlichen Effekten der Strahlung aus. Ferner ist die Handhabung und die Entsorgung von Radionukliden problematisch.
Ultraschall ist eine weitere diagnostische Bilderzeugungstechnik, die von der Nuklearmedizin und den Röntgenstrahlen verschieden ist, da sie den Patienten nicht den schädlichen Effekten ionisierender Strahlung aussetzt. Darüber hinaus ist Ultraschall anders als die Magnetresonanzbilderzeugung relativ kostengünstig und kann mit einem tragbaren Untersuchungsgerät durchgeführt werden. Bei der Verwendung der Ultraschalltechnik wird Schall über einen Wandler in einen Patienten oder ein Tier übertragen. Wenn sich die Schallwellen durch den Körper ausbreiten, stoßen sie auf Grenzflächen von Geweben und Fluiden. Abhängig von den akustischen Eigenschaften der Geweben und der Fluide im Körper werden die Ultraschallwellen teilweise oder vollständig reflektiert oder absorbiert. Wenn Schallwellen von einer Grenzfläche reflektiert werden, dann werden sie von dem Empfänger in dem Wandler detektiert und zur Erzeugung eines Bildes verarbeitet. Die akustischen Eigenschaften der Gewebe und der Fluide innerhalb des Körpers bestimmen den Kontrast, der in dem resultierenden Bild erscheint.
In den letzten Jahren gab es Fortschritte bei der Ultraschalltechnologie. Trotz dieser verschiedenen technologischen Verbesserungen ist Ultraschall jedoch hinsichtlich einer Anzahl von Aspekten nach wie vor ein unvollkommenes Werkzeug, insbesondere bezüglich der Bilderzeugung und der Detektion von Erkrankungen in der Leber und der Milz, den Nieren, dem Herzen und dem Gefäßsystem, einschließlich der Messung der Blutströmung. Die Fähigkeit zur Detektion und zur Messung dieser Bereiche hängt von dem Unterschied der akustischen Eigenschaften zwischen Geweben oder Fluiden und den umgebenden Geweben oder Fluiden ab. Als Folge davon wurden Kontrastmittel gesucht, welche den akustischen Unterschied zwischen Geweben oder Fluiden und den umgebenden Geweben oder Fluiden erhöhen, um die Ultraschallbilderzeugung und die Detektion von Krankheiten zu verbessern.
Die der Bilderzeugung mit Ultraschall zugrundeliegenden Prinzipien haben Forscher zur Suche nach gasförmigen Kontrastmitteln gebracht. Änderungen der akustischen Eigenschaften oder der akustischen Impedanz sind an Grenzflächen verschiedener Substanzen mit stark unterschiedlicher Dichte oder akustischer Impedanz am stärksten ausgeprägt, insbesondere an der Grenzfläche zwischen Feststoffen, Flüssigkeiten und Gasen. Wenn Ultraschallwellen auf solche Grenzflächen auftreffen, führen Änderungen der akustischen Impedanz zu einer intensiveren Reflexion von Schallwellen und einem intensiveren Signal in dem Ultraschallbild. Ein zusätzlicher Faktor, der die Effizienz der Schallreflexion beeinflusst, ist die Elastizität der reflektierenden Grenzfläche. Je größer die Elastizität dieser Grenzfläche ist, desto effizienter ist die Schallreflexion. Substanzen wie z. B. Gasblasen stellen hochelastische Grenzflächen dar. Folglich haben sich Forscher als Folge der vorstehend genannten Prinzipien auf die Entwicklung von Ultraschallkontrastmitteln auf der Basis von Gasblasen oder Gas-enthaltenden Körpern und auf die Entwicklung effizienter Verfahren zu deren Herstellung konzentriert.
Ein weiterer Bereich mit signifikantem Forschungsaufwand ist die zielgesteuerte Arzneistoffabgabe. Zielgesteuerte Abgabemittel sind besonders wichtig, wenn die Toxizität eine Rolle spielt. Spezifische therapeutische Abgabeverfahren dienen potentiell zur Minimierung toxischer Nebenwirkungen, zur Senkung der erforderlichen Dosierungsmengen und zur Senkung der Kosten für den Patienten.
Die im Stand der Technik für die Einführung genetischer Materialien, z. B. in lebende Zellen, beschriebenen Verfahren und Materialien sind beschränkt und uneffektiv.
Bisher wurden mehrere verschiedene Mechanismen zur Abgabe genetischer Materialien an lebende Zellen entwickelt. Diese Mechanismen umfassen Techniken, wie z. B. die Calciumphosphatpräzipitation und Elektroporation, und Träger, wie z. B. kationische Polymere und wässrig-gefüllte Liposomen. Diese Verfahren waren alle in vivo relativ uneffektiv und nur von eingeschränktem Nutzen für die Zellkulturtransfektion. Keines dieser Verfahren verstärkt die lokale Freisetzung, Abgabe und den Einbau von genetischem Material zur bzw. in die Zielzelle.
Es werden bessere Mittel zur Abgabe von Therapeutika, wie z. B. genetischer Materialien benötigt, um eine Vielzahl menschlicher und tierischer Krankheiten zu behandeln. Es wurden große Fortschritte bei der Charakterisierung genetischer Krankheiten und zum Verständnis der Proteintranskription gemacht. Bei der Abgabe von genetischem Material an Zellen zur Behandlung menschlicher und tierischer Krankheiten wurde jedoch nur ein relativ geringer Fortschritt erzielt.
Eine prinzipielle Schwierigkeit lag darin, das genetische Material von dem extrazellulären Raum in den intrazellulären Raum abzugeben, oder sogar genetisches Material an der Oberfläche ausgewählter Zellmembranen effektiv zu lokalisieren. Eine Vielzahl von Techniken wurde in vivo versucht, jedoch ohne großen Erfolg. Beispielsweise wurden Viren, wie z. B. Adenoviren und Retroviren, als Vektoren verwendet, um genetisches Material auf Zellen zu übertragen. Es wurde das gesamte Virus verwendet, jedoch ist die Menge an genetischem Material, die innerhalb der Virushülle platziert werden kann, beschränkt, und es bestehen Bedenken hinsichtlich möglicher gefährlicher Wechselwirkungen, die durch intakte Viren verursacht werden könnten. Die essentiellen Komponenten der Virushülle können isoliert und zum Transport von genetischem Material zu ausgewählten Zellen verwendet werden. In vivo muss das Abgabevehikel jedoch nicht nur bestimmte Zellen erkennen, sondern es muss auch zu diesen Zellen gebracht werden. Trotz ausgedehnter Arbeiten über virale Vektoren war es schwierig, einen erfolgreichen zielgesteuerten, Virus-vermittelten Vektor zur Abgabe von genetischem Material in vivo zu entwickeln.
Herkömmlich wurden Flüssigkeit-enthaltende Liposomen zur Abgabe von genetischem Material an Zellen in Zellkultur verwendet. Diese waren jedoch in vivo zur zellulären Abgabe von genetischem Material in erster Linie uneffektiv. Beispielsweise funktionierten kationische Liposomtransfektionstechniken in vivo nicht effektiv. Es werden effektivere Mittel zur Verbesserung der zellulären Abgabe von Therapeutika, wie z. B. von genetischem Material, benötigt.
WO 92/22298 beschreibt Vakuum-Trockengas-Eintröpfelungsverfahren zur Herstellung Gas-gefüllter Liposome.
US 5,123,414 beschreibt ein Eintröpfelungsverfahren von gelöstem Gas zur Herstellung Gas-gefüllter Liposome.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Lösung der vorstehend genannten Probleme gerichtet, sowie auf andere wichtige Erfordernisse auf dem Gebiet der Kontrastmittel für die Ultraschallbilderzeugung und auf Vehikel für die effektive zielgesteuerte Abgabe von Therapeutika.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung Gas-gefüllter Liposomen bereit, die zur Verwendung als Kontrastmittel für die Ultraschallbilderzeugung oder als Arzneistoffabgabemittel geeignet sind. Die erfindungsgemäßen Verfahren haben beispielsweise den Vorteil der Einfachheit und potentieller Kosteneinsparungen bei der Herstellung Gas-gefüllter Liposomen.
Erfindungsgemäß umfassen die Verfahren zur Herstellung der Gas-gefüllten Liposomen das Schütteln einer wässrigen Lösung, die ein Lipid umfasst, in Gegenwart eines Gases bei einer Temperatur unterhalb der Phasenumwandlungstemperatur vom Gel-Zustand zum flüssigkristallinen Zustand des Lipids.
In unerwarteter Weise haben die mit den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Gas-gefüllten Liposomen eine Reihe von überraschenden, jedoch sehr vorteilhaften Eigenschaften. Beispielsweise sind Gas-gefüllte Liposomen aufgrund ihrer biologischen Verträglichkeit und der Einfachheit, mit der lipophile Verbindungen zur Durchquerung von Zellmembranen gebracht werden können, nachdem die Liposomen zerrissen worden sind, vorteilhaft. Die Liposomen zeigen auch eine intensive Echogenizität auf Ultraschall, sind gegenüber Druck sehr stabil und/oder weisen allgemein eine lange Lagerfähigkeit auf, entweder wenn sie trocken oder in einem flüssigen Medium suspendiert gelagert werden. Die Echogenizität der Liposomen ist hinsichtlich der diagnostischen und therapeutischen Anwendungen und der erfindungsgemäß hergestellten Liposomen wichtig. Die Gas-gefüllten Liposomen haben z. B. auch den Vorteil einer stabilen Teilchengröße, einer niedrigen Toxizität und dehnbarer Membranen. Es wird angenommen, dass die flexiblen Membranen der Gasgefüllten Liposomen bei der Unterstützung der Ansammlung oder der Zielsteuerung dieser Liposomen in bzw. zu Geweben, wie z. B. Tumoren, nützlich sind.
Die erfindungsgemäß hergestellten Gas-gefüllten Liposomen weisen auch überlegene Eigenschaften für die Ultraschallkontrastbilderzeugung auf. Wenn sie sich im Inneren eines wässrigen Mediums oder eines Gewebemediums befinden, erzeugen die Gas-gefüllten Liposomen eine Grenzfläche für die verstärkte Schallabsorption. Die Gas-gefüllten Liposomen sind daher für die Bilderzeugung bei einem Patienten im Allgemeinen und/oder bei der Diagnose der Gegenwart von erkranktem Gewebe in Patienten geeignet, sowie für die Erwärmung von Gewebe und die Erleichterung der Arzneistofffreisetzung oder -aktivierung.
Zusätzlich zu Ultraschall können die erfindungsgemäß hergestellten Gas-gefüllten Liposomen beispielsweise zur magnetischen Bilderzeugung und als MRI-Kontrastmittel verwendet werden. Beispielsweise können die Gas-gefüllten Liposomen paramagnetische Gase, wie z. B. atmosphärische Luft, die Spuren von Sauerstoff 17 enthält, oder paramagnetische Ionen enthalten, wie z. B. Mn²⁺, Gd²⁺, Fe³⁺ und sie können folglich als Suszeptibilitätskontrastmittel für die Magnetresonanzbilderzeugung verwendet werden. Zusätzlich können die erfindungsgemäß hergestellten Gas-gefüllten Liposomen beispielsweise strahlenundurchlässige Metall-ionen, wie z. B. Iod, Barium, Brom oder Wolfram zur Verwendung als Röntgenkontrastmittel enthalten.
Die Gas-gefüllten Liposomen sind auch als Arzneistoffträger besonders geeignet. Anders als Liposomen des Standes der Technik, die ein flüssiges Inneres aufweisen, das lediglich zur Einkapselung von wasserlöslichen Arzneistoffen geeignet ist, sind die erfindungsgemäß hergestellten Gas-gefüllten Liposomen besonders zur Einkap selung lipophiler Arzneistoffe geeignet. Ferner können lipophile Derivate von Arzneistoffen leicht in die Lipidschicht eingebracht werden, wie z. B. alkylierte Derivate von Metallocendihalogeniden, vgl. Kuo et al., J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 9027–9045.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine teilweise schematische Ansicht einer bevorzugten Vorrichtung zur Herstellung der erfindungsgemäßen Gas-gefüllten Liposom-Mikrokügelchen.
2 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform zur Filtration und/oder Abgabe der erfindungsgemäßen, ein Therapeutikum enthaltenden Gas-gefüllten Liposom-Mikrokügelchen.
3 zeigt eine bevorzugte Vorrichtung zur Filtration und/oder Abgabe der erfindungsgemäßen, ein Therapeutikum enthaltenden Gas-gefüllten Liposom-Mikrokügelchen.
4 ist eine auseinandergezogene Ansicht eines Abschnitts der Vorrichtung von 3.
5 ist eine Mikrographie, welche die Größen Gas-gefüllter Liposomen vor (A) und nach (B) der Filtration zeigt.
6 zeigt graphisch die Größenverteilung Gas-gefüllter Liposomen vor (A) und nach (B) der Filtration.
7 ist eine Mikrographie einer Lipidsuspension vor (A) und nach (B) der Extrusion durch ein Filter.
8 ist eine Mikrographie Gas-gefüllter Liposomen, die nach der Filtration und der Autoklavierung einer Lipidsuspension ausgebildet worden sind, wobei die Mikrographien vor (A) und nach (B) der Klassierung der Gas-gefüllten Liposomen durch Filtration aufgenommen worden sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung Gas-gefüllter Liposomen. Anders als die Verfahren des Standes der Technik, die auf die Bildung von Liposomen gerichtet sind, bei denen eine wässrige Lösung das Innere füllt, sind die Verfahren der vorliegenden Erfindung auf die Herstellung von Liposomen gerichtet, die im Inneren Gas umfassen.
Bevorzugte Verfahren zur Herstellung der Gas-gefüllten Liposomen umfassen das Schütteln einer wässrigen Lösung, die ein Lipid umfasst, in der Gegenwart eines Gases bei einer Temperatur unterhalb der Phasenumwandlungstemperatur vom Gel-Zustand zum flüssigkristallinen Zustand des Lipids. Vorzugsweise umfassen die Verfahren ferner das Trennen der resultierenden Gas-gefüllten Liposomen zur diagnostischen oder therapeutischen Verwendung. Die mit den vorstehend genannten Verfahren hergestellten Liposomen werden hier als Gas-gefüllte Liposomen bezeichnet, die mit einem Gelzustand-Gas-Schütteleinbringverfahren hergestellt worden sind.
Herkömmlich werden wässrig-gefüllte Liposomen routinemäßig bei einer Temperatur oberhalb der Phasenumwandlungstemperatur des Lipids gebildet, da sie im flüssigkristallinen Zustand flexibler und somit in biologischen Systemen nützlicher sind, vgl. z. B. Szoka und Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. 1978, 75, 4194–4198. Im Gegensatz dazu sind die gemäß bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Liposomen Gas-gefüllt, was ihnen eine größere Flexibilität verleiht, da Gas besser komprimierbar und nachgiebiger ist als eine wässrige Lösung. Folglich können die Gas-gefüllten Liposomen in biologischen Systemen verwendet werden, wenn sie bei einer Temperatur unterhalb der Phasenumwandlungstemperatur des Lipids gebildet werden, und zwar obwohl die Gelphase steifer ist.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren wird eine wässrige Lösung, die ein Lipid enthält, in Gegenwart eines Gases geschüttelt. Der Begriff „Schütteln", wie er hier verwendet wird, ist als Bewegung definiert, bei der eine wässrige Lösung derart bewegt wird, dass ein Gas von der lokalen Umgebung in die wässrige Lösung eingebracht wird. Zum Schütteln kann jegliche Bewegung eingesetzt werden, welche die wässri ge Lösung bewegt und zum Einbringen eines Gases führt. Das Schütteln muss mit einer Stärke durchgeführt werden, die mit der Zeit eine Bildung von Schaum ermöglicht. Vorzugsweise wird das Schütteln mit einer Kraft durchgeführt, die zur Bildung eines Schaums innerhalb einer kurzen Zeit ausreichend ist, wie z. B. 30 Minuten, und vorzugsweise innerhalb von 20 Minuten und mehr bevorzugt innerhalb von 10 Minuten. Das Schütteln kann eine Verwirbelung (wie z. B. durch Vortexieren), eine Bewegung von Seite zu Seite oder eine Auf- und Abbewegung sein. Ferner können verschiedene Bewegungsarten kombiniert werden. Das Schütteln kann auch durch Schütteln des Behälters stattfinden, der die wässrige Lipidlösung enthält, oder durch Schütteln der wässrigen Lösung innerhalb des Behälters, ohne den Behälter selbst zu schütteln. Ferner kann das Schütteln manuell oder durch eine Maschine erfolgen. Mechanische Schüttler, die verwendet werden können, umfassen z. B. einen Schütteltisch wie z. B. einen VWR Scientific-Schütteltisch (Cerritos, CA) und einen mechanischen Farbmischer sowie andere bekannte Geräte. Andere Mittel zur Erzeugung des Schüttelns umfassen die Einwirkung eines Gases, das mit einer hohen Geschwindigkeit oder mit hohem Druck abgegeben wird. Es sollte auch beachtet werden, dass bei einem größeren Volumen der wässrigen Lösung die Gesamtkraft entsprechend erhöht wird. Ein heftiges Schütteln ist als mindestens etwa 60 Schüttelbewegungen pro Minute definiert und bevorzugt. Vortexieren mit mindestens 1000 Umdrehungen pro Minute als Beispiel für ein heftiges Schütteln ist mehr bevorzugt. Vortexieren bei 1800 Umdrehungen pro Minute ist ganz besonders bevorzugt.
Die Bildung Gas-gefüllter Liposomen beim Schütteln kann durch die Gegenwart eines Schaums auf der wässrigen Lösung detektiert werden. Dies ist mit einer Abnahme des Volumens der wässrigen Lösung bei der Bildung des Schaums verbunden. Vorzugsweise beträgt das Endvolumen des Schaums mindestens etwa das Zweifache des ursprünglichen Volumens der wässrigen Lipidlösung. Mehr bevorzugt beträgt das Endvolumen des Schaums mindestens etwa das Dreifache des ursprünglichen Volumens der wässrigen Lösung. Noch mehr bevorzugt beträgt das Endvolumen des Schaums mindestens etwa das Vierfache des ursprünglichen Volumens der wässrigen Lösung. Ganz besonders bevorzugt wird die gesamte wässrige Lipidlösung in Schaum umgewandelt.
Die erforderliche Schüttelzeit kann durch Detektion der Schaumbildung bestimmt werden. Beispielsweise können 10 ml Lipidlösung in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen etwa 15 bis 20 min vortexiert werden oder bis die Viskosität der Gas-gefüllten Liposomen ausreichend hoch wird, so dass sie beim Verwirbeln nicht länger an die Seitenwände schlägt. Zu diesem Zeitpunkt kann der Schaum dazu führen, dass das Volumen der Lösung, welche die Gas-gefüllten Liposomen enthält, auf 30 bis 35 ml ansteigt.
Die zur Bildung des erforderlichen Schaumvolumens erforderliche Lipidkonzentration wird abhängig von der Art des verwendeten Lipids variieren und kann vom Fachmann einfach bestimmt werden, dem die vorliegende Beschreibung zur Verfügung steht. Beispielsweise beträgt die Konzentration von 1,2-Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), das zur Bildung Gas-gefüllter Liposomen gemäß den erfindunsgemäßen Verfahren verwendet wird, in bevorzugten Ausführungsformen etwa 20 mg/ml bis etwa 30 mg/ml Kochsalzlösung. Die Konzentration von Distearoylphosphatidylcholin (DSPC), die in bevorzugten Ausführungsformen eingesetzt wird, beträgt etwa 5 mg/ml bis etwa 10 mg/ml Kochsalzlösung.
Insbesondere führt DPPC in einer Konzentration von 20 mg/ml bis 30 mg/ml beim Schütteln zu einem Gesamtvolumen der Suspension und des eingeschlossenen Gases, das viermal so groß ist wie das Suspensionvolumen allein. DSPC in einer Konzentration von 10 mg/ml führt beim Schütteln zu einem Gesamtvolumen, das kein Flüssigkeitssuspensionsvolumen aufweist und das nur Schaum enthält.
Dem Fachmann ist mit Hilfe der vorliegenden Beschreibung klar, dass die Lipide oder Liposomen vor und nach der Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren manipuliert werden können. Beispielsweise kann das Lipid hydratisiert und dann lyophilisiert, mittels Einfrier- und Auftauzyklen verarbeitet oder einfach hydratisiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Lipid hydratisiert und anschließend lyophilisiert, oder hydratisiert, und anschließend mittels Einfrier- und Auftauzyklen verarbeitet und dann lyophilisiert, und zwar vor der Bildung Gas-gefüllter Liposomen. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform wird das Lipid hydratisiert und geschüttelt, gefolgt von mindestens einem Zyklus des Einfrierens in flüssigem Stickstoff und des Auftauens, und anschließender Lyophilisierung. Die Vorteile dieser Behandlungen vor der Bildung Gas-gefüllter Liposomen umfassen die Umwandlung des Lipids in eine feste Form mit einer größeren Oberfläche, wodurch bei der Hydratisierung eine bessere Solubilisierung und anschließend eine höhere Ausbeute Gas-gefüllter Liposomen ermöglich wird.
Gemäß den Verfahren bevorzugter erfindungsgemäßer Ausführungsformen wird die Gegenwart von Gas durch die lokale Umgebungsatmosphäre bereitgestellt. Die lokale Umgebungsatmosphäre kann die Atmosphäre innerhalb eines abgeschlossenen Behälters oder kann in einem nicht verschlossenen Behälter die äußere Umgebung sein. Alternativ kann z. B. ein Gas in den Behälter injiziert oder auf andere Weise dem Behälter hinzugefügt werden, der die wässrige Lipidlösung enthält, oder in die wässrige Lipidlösung selbst, um ein von Luft verschiedenes Gas bereitzustellen. Gase, die nicht schwerer sind als Luft, können einem verschlossenen Behälter zugeführt werden, während Gase, die schwerer sind als Luft, einem verschlossenen oder nicht verschlossenen Behälter zugeführt werden können.

Die erfindungsgemäßen Verfahren werden bei einer Temperatur unterhalb der Phasenumwandlungstemperatur vom Gel-Zustand zum flüssigkristallinen Zustand des eingesetzten Lipids durchgeführt. Mit „Phasenumwandlungstemperatur vom Gel-Zustand zum flüssigkristallinen Zustand" ist die Temperatur gemeint, bei der sich eine Lipiddoppelschicht von einem Gel-Zustand in einen flüssigkristallinen Zustand umwandelt, vgl. z. B. Chapman et al., J. Biol. Chem. 1974, 249, 2512–2521. Die Phasenumwandlungstemperaturen vom Gel-Zustand zum flüssigkristallinen Zustand verschiedener Lipide stehen dem Fachmann zur Verfügung und sind z. B. in Gregoriadis, Hrsg., Liposome Technology, Band I, 1-18 (CRC Press, 1984) und Derek Marsh, CRC Handbook of Lipid Bilayers (CRC Press, Boca Raton, FL, 1990), Seite 139, beschrieben. Vgl. auch die nachstehende Tabelle I. Wenn die Phasenumwandlungstemperatur vom Gel-Zustand zum flüssigkristallinen Zustand des Lipids höher ist als Raumtemperatur, kann die Temperatur des Behälters beispielsweise durch Bereitstellen eines Kühlmechanismus zur Kühlung des Behälters, der die Lipidlösung enthält, reguliert werden. Tabelle I Hauptketten-Phasenumwandlungstemperaturen zum flüssigkristallinen Zustand gesättigter Diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine

Anzahl der Kohlenstoffatome in den Acylketten	Phasenumwandlungstemperatur zum flüssigkristallinen Zustand (°C)
1,2-(12:0)	–1,0
1,2-(13:0)	13,7
1,2-(14:0)	23,5
1,2-(15:0)	34,5
1,2-(16:0)	41,4
1,2-(17:0)	48,2
1,2-(18:0)	55,1
1,2-(19:0)	61,8
1,2-(20:0)	64,5
1,2-(21:0)	71,1
1,2-(22:0)	74,0
1,2-(23:0)	79,5
1,2-(24:0)	80,1

Herkömmlich werden wässrig-gefüllte Liposomen routinemäßig bei einer Temperatur oberhalb der Phasenumwandlungstemperatur vom Gel-Zustand zum flüssigkristallinen Zustand des Lipids gebildet, da sie im flüssigkristallinen Zustand flexibler und somit in biologischen Systemen nützlicher sind, vgl. z. B. Szoka und Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. 1978, 75, 4194–4198. Im Gegensatz dazu sind die gemäß bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Liposomen Gas-gefüllt, was ihnen eine größere Flexibilität verleiht, da Gas besser komprimierbar und nachgiebiger ist als eine wässrige Lösung. Folglich können die Gas-gefüllten Liposomen in biologischen Systemen verwendet werden, wenn sie bei einer Temperatur unterhalb der Phasenumwandlungstemperatur des Lipids gebildet werden, und zwar obwohl die Gelphase steifer ist.
Eine bevorzugte Vorrichtung zur Erzeugung der Gas-gefüllten Liposomen unter Verwendung eines Gelzustand-Gas-Schütteleinbringverfahrens ist in 1 gezeigt. Ein Gemisch aus Lipid und wässrigem Medium wird bei dem Verfahren des Gaseinbringens zur Erzeugung Gas-gefüllter Liposomen heftig bewegt, und zwar entweder chargenweise oder mittels kontinuierlicher Zuführung. Unter Bezugnahme auf 1 werden getrocknete Lipide 51 von einem Lipidversorgungsbehälter 50 über die Leitung 59 zu einem Mischbehälter 66 entweder in einem kontinuierlichen Strom oder als diskontinuierliche Boluszugaben zugesetzt. Wenn ein Chargenverfahren eingesetzt wird, kann der Mischbehälter 66 einen relativ kleinen Behälter wie z. B. eine Spritze, ein Reagenzglas, eine Flasche oder einen Rundkolben, oder einen großen Behälter umfassen. Wenn ein Verfahren mit kontinuierlicher Zuführung verwendet wird, ist das Mischgefäß vorzugsweise ein großer Behälter, wie z. B. eine Wanne.
Wenn die Gas-gefüllten Liposomen eine therapeutische Verbindung enthalten, kann die therapeutische Verbindung z. B. in einer Weise zugegeben werden, die der vorstehend beschriebenen Zugabe des Lipids vor dem Gaseinbringverfahren ähnlich ist. Alternativ kann die therapeutische Verbindung nach dem Gaseinbringverfahren zugegeben werden, wenn die Liposomen an der Außenseite mit der therapeutischen Verbindung beschichtet werden.
Zusätzlich zu den Lipiden 51, wird dem Behälter 66 über die Leitung 61 auch ein wässriges Medium 53, wie z. B. eine Kochsalzlösung, von einem Versorgungsbehälter für das flüssige Medium 52 zugesetzt. Die Lipide 51 und das wässrige Medium 53 vereinigen sich unter Bildung einer wässrigen Lipidlösung 74. Alternativ könnten die getrockneten Lipide 51 hydratisiert werden, bevor sie in den Mischbehälter 66 eingebracht werden, so dass die Lipide in eine wässrige Lösung eingebracht werden. In der bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Liposomen ist die ursprüngliche Beschickung der Lösung 74 derart, dass die Lösung nur einen Teil der Kapazität des Mischbehälters 66 einnimmt. Darüber hinaus werden in einem kontinuierlichen Verfahren die Geschwindigkeiten, mit denen die wässrige Lipidlösung 74 zugesetzt und die erzeugten Gas-gefüllten Liposomen entfernt werden, gesteuert, um sicherzustellen, dass das Volumen der Lipidlösung 74 nicht einen vorbestimmten prozentualen Anteil der Kapazität des Mischbehälters 66 überschreitet.
Das Schütteln kann durch Einführen eines Hochgeschwindigkeitsstrahls eines mit Druck beaufschlagten Gases direkt in die wässrige Lipidlösung 74 durchgeführt werden. Alternativ kann das Schütteln durch entweder manuelles oder maschinelles mechanisches Schütteln der wässrigen Lösung durchgeführt werden. Ein solches mechanisches Schütteln kann durch Schütteln des Mischbehälters 66 oder durch direktes Schütteln der wässrigen Lösung 74 ohne Schütteln des Mischbehälters selbst bewirkt werden. Wie es in 1 gezeigt ist, ist in der bevorzugten Ausführungsform ein mechanischer Schüttler 75 mit dem Mischbehälter 66 verbunden. Das Schütteln sollte eine ausreichende Intensität aufweisen, so dass nach einiger Zeit ein Schaum 73, der Gas-gefüllte Liposomen umfasst, auf der wässrigen Lösung 74 gebildet wird, wie es in 1 gezeigt ist. Die Detektion der Bildung des Schaums 73 kann als Mittel zur Steuerung der Dauer des Schüttelns eingesetzt werden, d. h. anstelle des Schüttelns für eine vorbestimmte Zeitdauer kann das Schütteln fortgesetzt werden, bis ein vorbestimmtes Schaumvolumen erzeugt worden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung zur Herstellung Gas-gefüllter Liposomen, bei der das verwendete Lipid eine Phasenumwandlungstemperatur vom Gel-Zustand zum flüssigkristallinen Zustand von unterhalb der Raumtemperatur aufweist, ist ein Mittel zur Kühlung der wässrigen Lipidlösung 74 bereitgestellt. In der in 1 gezeigten Ausführungsform wird das Kühlen mittels eines Mantels 64 erreicht, der um den Mischbehälter 66 so angeordnet ist, dass er eine ringförmige Passage bildet, die den Behälter umgibt. Wie es in 1 gezeigt ist, wird ein Kühlfluid 63 mittels Manteleinlass- und -auslassöffnungen 62 bzw. 63 zum Strömen durch diese ringförmige Passage gebracht. Durch Regulieren der Temperatur und der Strömungsgeschwindigkeit des Kühlfluids 62 kann die Temperatur der wässrigen Lipidlösung 74 bei dem gewünschten Wert gehalten werden.
Wie es in 1 gezeigt ist, wird ein Gas 55, bei dem es sich um Luft oder um ein anderes Gas wie z. B. Stickstoff oder Argon handeln kann, zusammen mit der wässrigen Lösung 74 in den Mischbehälter 66 eingebracht. Luft kann unter Verwendung eines nicht verschlossenen Mischbehälters eingebracht werden, so dass die wässrige Lösung kontinuierlich der Umgebungsluft ausgesetzt ist. Bei einem Chargenverfahren kann eine festgelegte Charge der lokalen Umgebungsluft durch Verschließen des Mischbehälters 66 eingebracht werden. Wenn ein Gas verwendet wird, das schwerer ist als Luft, muss der Behälter nicht verschlossen werden. Das Einbringen von Gasen, die nicht schwerer sind als Luft erfordert jedoch, dass der Mischbehälter verschlossen wird, z. B. unter Verwendung eines Deckels 65, wie es in 1 gezeigt ist. Gleich ob das Gas 55 Luft oder ein anderes Gas ist, kann es in dem Mischbehälter 66 z. B. durch Verbinden des Mischbehälters mit einem mit Druck beaufschlagten Gasversorgungstank 54 über eine Leitung 57 mit Druck beaufschlagt werden, wie es in 1 gezeigt ist.
Nachdem das Schütteln abgeschlossen ist, kann der Schaum 73, der die Gasgefüllten Liposomen enthält, aus dem Mischbehälter 66 entnommen bzw. extrahiert werden. Die Entnahme kann durch Einführen der Nadel 102 einer Spritze 100, die in 2 gezeigt ist, in den Schaum 73, und Ziehen einer vorbestimmten Menge Schaum in das Spritzgehäuse 104 durch Zurückziehen des Kolbens 106 durchgeführt werden. Wie es nachstehend diskutiert wird, kann die Stelle, an der das Ende der Nadel 102 in dem Schaum 73 platziert wird, zur Steuerung der Größe der entnommenen Gas-gefüllten Liposomen verwendet werden.
Alternativ kann die Entnahme durch Einführen eines Entnahmerohrs 67 in den Mischbehälter 66 durchgeführt werden, wie es in 1 gezeigt ist. Wenn der Mischbehälter 66 mit Druck beaufschlagt ist, wie es vorstehend diskutiert worden ist, kann der Druck des Gases 55 zum Drücken der Gas-gefüllten Liposomen 77 von dem Mischbehälter 66 über die Leitung 70 in einen Entnahmebehälter 76 verwendet werden. Wenn der Mischbehälter 66 nicht mit Druck beaufschlagt ist, kann der Entnahmebehälter 76 über die Leitung 78 mit einer Vakuumquelle 58, wie z. B. einer Vakuumpumpe, verbunden werden, die einen negativen Druck erzeugt, der ausreichend ist, den Schaum 73 in den Entnahmebehälter 76 zu ziehen, wie es in 1 gezeigt ist. Von dem Entnahmebehälter 76 werden die Gas-gefüllten Liposomen 77 in Gefäße 82 eingebracht, in denen sie zum Endanwender transportiert werden können. Mit dem Entnahmebehälter 76 kann eine Quelle von mit Druck beaufschlagtem Gas als Hilfe zum Ausstoßen der Gas-gefüllten Liposomen verbunden werden. Da der negative Druck zu Vergrößerung der Gas-gefüllten Liposomen führen kann, ist zur Entfernung der Gas-gefüllten Liposomen ein positiver Druck bevorzugt.
Die Filtration wird vorzugsweise durchgeführt, um Gas-gefüllte Liposomen mit einer im Wesentlichen einheitlichen Größe zu erhalten. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen enthält die Filtrationsanordnung mehr als einen Filter und vorzugsweise grenzen die Filter nicht unmittelbar aneinander an, wie es in 4 veranschaulicht ist. Vor der Filtration weisen die Gas-gefüllten Liposomen eine Größe im Bereich von etwa 1 μm bis mehr als 60 μm auf (5A und 6A). Nach der Filtration durch einen einzelnen Filter sind die Gas-gefüllten Liposomen im Allgemeinen kleiner als 10 μm, jedoch verbleiben große Teilchen mit einer Größe von 25 μm. Nach der Filtration durch zwei Filter (10 μm Filter und dann 8 μm Filter) sind die meisten Liposomen kleiner als 10 μm und die meisten haben eine Größe von 5 bis 7 μm (5B und 6B).
Wie es in 1 gezeigt ist, kann die Filtration durch Einbeziehen eines Filterelements 72 direkt auf das Ende des Entnahmerohrs 67 durchgeführt werden, so dass nur Gas-gefüllte Liposomen unterhalb einer vorbestimmten Größe aus dem Mischbehälter 66 entnommen werden. Alternativ oder zusätzlich zu dem Entnahmerohrfilter 72 kann die Klassierung der Gas-gefüllten Liposomen mittels eines Filters 80 erreicht werden, der in die Leitung 79 eingebracht ist, die Gas-gefüllte Liposomen 77 von dem Entnahmebehälter 76 zu den Gefäßen 82 leitet, wie es in 1 gezeigt ist. Der Filter 80 kann eine Kaskadenfilteranordnung 124 enthalten, wie z. B. diejenige, die in 4 gezeigt ist. Die in 4 gezeigte Kaskadenfilteranordnung 124 umfasst zwei aufeinanderfolgende Filter 116 und 120, wobei der Filter 120 stromaufwärts von dem Filter 116 angeordnet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der stromaufwärts gelegene Filter 120 ein "NUCLEPORE" 10 μm Filter und der stromabwärts gelegene Filter 116 ein "NUCLEPORE" 8 μm Filter. Zwei 0,15 mm Metallmaschenscheiben 115 sind vorzugsweise auf jeder Seite des Filters 116 installiert. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Filter 116 und 120 mittels eines Teflon^TM O-Rings 118 um einen minimalen Abstand von 150 μm beabstandet.
Zusätzlich zur Filtration kann die Klassierung auch durch Nutzen der Abhängigkeit des Auftriebs der Gas-gefüllten Liposomen von der Größe durchgeführt werden. Die Gas-gefüllten Liposomen weisen eine beträchtlich niedrigere Dichte auf als Wasser und werden somit im Mischbehälter 66 an die Oberfläche treiben. Da die größten Liposomen die niedrigste Dichte aufweisen, werden sie am schnellsten an die Oberfläche treiben. Die kleinsten Liposomen werden im Allgemeinen als letztes die Oberfläche erreichen und der nicht mit Gas gefüllte Lipidabschnitt wird auf den Boden sinken. Dieses Phänomen kann mit Vorteil zur Klassierung der Gas-gefüllten Liposomen durch Entfernen derselben aus dem Mischbehälter 66 über ein differentielles Flotationsverfahren verwendet werden. Folglich kann das Einstellen der vertikalen Position des Entnahmerohrs 67 innerhalb des Mischbehälters 66 die Größe der entnommenen Gas-gefüllten Liposomen steuern: Je höher das Rohr ist, desto größer sind die entnommenen Gas-gefüllten Liposomen. Darüber hinaus kann durch periodisches oder kontinuierliches Einstellen der vertikalen Position des Entnahmerohrs 67 innerhalb des Mischbehälters 66 die Größe der entnommenen Gas-gefüllten Liposomen auf einer fortlaufenden Basis gesteuert werden. Eine solche Entnahme kann durch Einbeziehen einer Vorrichtung 68 erleichtert werden, bei der es sich um eine mit einem Gewinde versehene Hülse 71, die mit einem an dem Entnahmerohr 67 befestigten, mit einem Gewinde versehenen Einsatz 72 zusammenpasst, handelt, womit eine genaue Einstellung des Entnahmerohrs 67 innerhalb des Entnahmebehälters 66 ermöglicht wird.
Das Gelzustand-Gas-Schütteleinbringverfahren selbst kann auch zur Verbesserung der Klassierung der Gas-gefüllten Mikrokügelchen auf Lipidbasis verwendet werden. Im Allgemeinen sind die resultierenden Gas-gefüllten Liposomen umso kleiner, je höher die Intensität der Schüttelenergie ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch neue Verfahren zur Herstellung Arzneistoff-enthaltender Gas-gefüllter Liposomen, die an den Endanwender abgegeben werden sollen. Sobald Gas-gefüllte Liposomen gebildet worden sind, können sie nicht durch Erhitzen bei einer Temperatur sterilisiert werden, die ein Zerreißen verursachen würde. Daher ist es erwünscht, die Gas-gefüllten Liposomen aus sterilen Bestandteilen auszubilden und so wenig wie möglich nachfolgende Manipulationen durchzuführen, um die Gefahr einer Kontamination zu vermeiden. Erfindungsgemäß kann dies z. B. durch Sterilisieren des Mischbehälters, der das Lipid und die wässrige Lösung enthält, vor dem Schütteln und dem Einbringen der Gas-gefüllten Liposomen 77 aus dem Mischbehälter 66 über den Entnahmebehälter 76 direkt in das Spritzgehäuse 104 einer sterilen Spritze 100, die in 2 gezeigt ist, ohne weitere Verarbeitung oder Handhabung erreicht werden, d. h. ohne anschließende Sterilisierung. Die Spritze 100, die mit den Gas-gefüllten Liposomen 77 befüllt und geeignet verpackt ist, kann dann an den Endanwender abgegeben werden. Danach ist außer der Entnahme der Spritze aus ihrer Verpackung und Entfernen eines Schutzes (nicht gezeigt) von der Spritzennadel 102 und Einführen der Nadel in den Körper des Patienten oder in einen Katheter keine weitere Manipulation des Produkts erforderlich, um die Gasgefüllten Liposomen an den Patienten zu verabreichen. Darüber hinaus wird der Druck, der erzeugt wird, wenn der Spritzenkolben 106 in das Spritzgehäuse 104 gedrückt wird, das Zusammenfallen der größten Gas-gefüllten Liposomen verursachen, wodurch ohne Filtration ein gewisses Maß an Klassierung erreicht wird.
Wenn es erwünscht ist, die Gas-gefüllten Liposomen an dem Ort der Verwendung zu filtrieren, beispielsweise weil sie ohne Filtration aus dem Entnahmebehälter 76 entfernt werden oder weil eine weitere Filtration erwünscht ist, kann die Spritze 100 mit einem eigenem Filter 108 versehen werden, wie es in 2 gezeigt ist. Dies führt zur Klassierung der Gas-gefüllten Liposomen durch Extrudieren durch den Filter 108 aufgrund der Einwirkung des Kolbens 106, wenn die Gas-gefüllten Liposomen injiziert werden. Folglich können die Gas-gefüllten Liposomen in einem Schritt klassiert und in einen Patienten injiziert werden.
Wie es in 3 gezeigt ist, kann ein Kaskadenfiltergehäuse 110 direkt an einer Spritze 112 befestigt werden, wodurch am Ort der Verwendung eine Kaskadenfiltration ermöglicht wird. Wie es in 4 gezeigt ist, umfasst das Filtergehäuse 110 eine Kaskadenfilteranordnung 124, die vorstehend diskutiert worden ist und die zwischen einer unteren Hülse 122, die ein Außengewinde aufweist, und einer Hülse 114 eingebracht ist, die ein Innengewinde aufweist. Die untere Hülse 122 ist mit einem Luer-Verschluss ausgestattet, der es ermöglicht, die untere Hülse einfach an der Spritze 112 zu befestigen und die obere Hülse 114 ist mit einer Nadel 102 ausgestattet.
In bevorzugten Ausführungsformen wird die Lipidlösung durch einen Filter extrudiert und die Lipidlösung wird vor dem Schütteln hitzesterilisiert. Sobald sich Gas-gefüllte Liposomen gebildet haben, können sie zur Klassierung wie vorstehend beschrieben filtriert werden. Diese Schritte vor der Bildung der Gas-gefüllten Liposomen bieten z. B. den Vorteil, dass sie die Menge des nicht hydratisierten Lipids vermindern und somit eine wesentlich höhere Ausbeute an Gas-gefüllten Liposomen bereitstellen, sowie den Vorteil der Bereitstellung steriler Gas-gefüllter Liposomen, die zur die Verabreichung an einen Patienten bereit sind. Beispielsweise kann ein Mischbehälter, wie z. B. ein Gefäß oder eine Spritze, mit einer filtrierten Lipidsuspension gefüllt werden und die Lösung kann dann innerhalb des Mischbehälters z. B. durch Autoklavieren sterilisiert werden. Gas kann zur Bildung Gas-gefüllter Liposomen durch Schütteln des sterilen Behälters in die Lipidsuspension eingebracht werden. Vorzugsweise ist der sterile Behälter mit einem Filter ausgestattet, der so positioniert ist, dass die Gas-gefüllten Liposomen durch den Filter hindurchtreten, bevor sie mit einem Patienten in Kontakt kommen.
Der erste Schritt dieses bevorzugten Verfahrens, das Extrudieren der Lipidlösung durch einen Filter, verringert die Menge an nicht hydratisiertem Lipid durch Aufbrechen des getrockneten Lipids und Freilegen einer größeren Oberfläche zur Hydratisierung. Vorzugsweise hat der Filter eine Porengröße von etwa 0,1 bis etwa 5 μm, mehr bevorzugt von etwa 0,1 bis etwa 4 μm, noch mehr bevorzugt von etwa 0,1 bis etwa 2 μm und insbesondere etwa 1 μm. Wie es in der 7 gezeigt ist, wird dann, wenn eine Lipidsuspension filtriert wird (7B), die Menge an nicht hydratisiertem Lipid verglichen mit einer Lipidsuspension, die nicht vorher filtriert worden ist (7A), vermindert. Das nicht hydratisierte Lipid erscheint in Form amorpher Klumpen mit uneinheitlicher Größe und ist unerwünscht.
Der zweite Schritt, die Sterilisierung, stellt eine Zusammensetzung bereit, die einfach an einen Patienten verabreicht werden kann. Vorzugsweise wird die Sterilisierung durch Hitzesterilisierung, vorzugsweise durch Autoklavieren der Lösung bei einer Temperatur von mindestens etwa 100°C, mehr bevorzugt durch Autoklavieren bei etwa 100°C bis etwa 130°C, noch mehr bevorzugt bei etwa 110°C bis etwa 130°C, ganz besonders bevorzugt bei etwa 120°C bis etwa 130°C und insbesondere bei etwa 130°C durchgeführt. Vorzugsweise findet das Erhitzen mindestens etwa 1 min statt, mehr bevorzugt etwa 1 bis etwa 30 min, noch mehr bevorzugt etwa 10 bis etwa 20 min und insbesondere etwa 15 min.
Wenn die Sterilisation mit einem Verfahren, das von der Hitzesterilisierung verschieden ist, bei eine Temperatur durchgeführt wird, die ein Zerreißen der Gas-gefüllten Liposomen verursachen würde, kann die Sterilisierung nach der Bildung der Gasgefüllten Liposomen durchgeführt werden, was bevorzugt ist. Beispielsweise kann Gammastrahlung vor und/oder nach der Bildung Gas-gefüllter Liposomen verwendet werden.
8 veranschaulicht die Fähigkeit der Gas-gefüllten Liposomen, sich nach dem Autoklavieren, das bei 130°C 15 min durchgeführt wurde, und anschließendem Vortexieren für 10 min erfolgreich zu bilden. Ferner führt nach dem Extrusions- und Sterilisationsverfahren der Schüttelschritt zu Gas-gefüllten Liposomen mit wenig bis keiner restlichen wasserfreien Lipidphase. 8A zeigt Gas-gefüllte Liposomen, die nach dem Autoklavieren, jedoch vor der Filtration erzeugt worden sind, wodurch eine Anzahl Gas-gefüllter Liposomen mit einer Größe von mehr als 10 μm gebildet wird. 8B zeigt Gas-gefüllte Liposomen nach einer Filtration durch einen 10 μm "NUCLEPORE" Filter, was zu einer einheitlichen Größe von etwa 10 μm führt.
Die Materialien, die zur Herstellung der Gas-gefüllten Lipid-Mikrokügelchen verwendet werden können, umfassen beliebige der dem Fachmann für die Liposomherstellung als geeignet bekannten Materialien oder Kombinationen davon. Die verwendeten Lipide können entweder natürlich oder synthetisch sein. Die jeweiligen Lipide werden so ausgewählt, dass die gewünschten Eigenschaften optimiert werden, z. B. eine kurze Plasmahalbwertszeit gegenüber einer langen Plasmahalbwertszeit für eine maximale Serumstabilität. Es sollte auch beachtet werden, dass bestimmte Lipide für bestimmte Anwendungen wirksamer sind, z. B. zur Aufnahme einer therapeutischen Verbindung, die beim Zerreißen des Gas-gefüllten Lipid-Mikrokügelchens freigesetzt werden soll.
Das Lipid in den Gas-gefüllten Liposomen kann in Form einer einzelnen Doppelschicht oder einer multilamellaren Doppelschicht vorliegen. Vorzugsweise ist es mulitlamellar.
Lipide, die zur Erzeugung von Lipid-Mikrokügelchen verwendet werden können, umfassen unter anderem: Lipide wie z. B. Fettsäuren, Lysolipide, Phosphatidylcholin mit sowohl gesättigten als auch ungesättigten Lipiden, einschließlich Dioleoylphosphatidylcholin; Dimyristoylphosphatidylcholin; Dipentadecanoylphosphatidylcholin, Dilauroylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin; Distearoylphosphatidylcholin; Phosphatidylethanolamine, wie z. B. Dioleoylphosphatidylethanolamin; Phosphatidylserin; Phosphatidylglycerin; Phosphatidylinosit, Sphingolipide, wie z. B. Sphingomyelin; Glycolipide, wie z. B. Gangliosid GM1 und GM2; Glucolipide; Sulfatide; Glycosphingolipide; Phosphatidsäure; Palmitinsäure; Stearinsäure; Arachidonsäure; Ölsäure; Lipide, die Polymere aufweisen, wie z. B. Polyethylenglycol, Chitin, Hyaluronsäure oder Polyvinylpyrrolidon; Lipide, die sulfonierte Mono-, Di-, Oligo- oder Polysaccharide aufweisen; Cholesterin, Cholesterinsulfat und Cholesterinhemisuccinat; Tocopherolhemisuccinat, Lipide mit Ether- und Ester-verbrückten Fettsäuren, polymerisierte Lipide, Diacetylphosphat, Stearylamin, Cardiolipin, Phospholipide mit kurzkettigen Fettsäuren mit 6 bis 8 Kohlenstoffatomen, synthetische Phospholipide mit asymmetrischen Acylketten (z. B. mit einer Acylkette mit 6 Kohlenstoffatomen und einer anderen Acylkette mit 12 Kohlenstoffatomen), 6-(5-Cholesten-3β-yloxy)-1-thio-β-D-galactopyranosid, Digalactosyldiglycerid, 6-(5-Cholesten-3β-yloxy)hexyl-6-amino-6-desoxy-1-thio-β-D-galactopyranosid, 6-(5-Cholest-en-3β-yloxy)hexyl-6-amino-6-desoxyl-1-thio-α-D-mannopyranosid, 12-(((7'-Diethylamino-cumarin-3-yl)carbonyl)methylamino)-octadecansäure; N-[12-(((7'-Diethylaminocumarin-3-yl)carbonyl)methylamino)octadecanoyl]-2-aminopalmitinsäure; (Cholesteryl)-4'-(trimethylam-monio)butanoat; N-Succinyldioleoylphosphatidylethanolamin; 1,2-Dioleoyl-sn-glycerin; 1,2-Dipalmitoyl-sn-3-succinylglycerin; 1,3-Dipalmitoyl-2-succinylglycerin; 1-Hexa-decyl-2-palmitoylglycerophosphoethanolamin und Palmitoylhomocystein und/oder Kombinationen davon.
Falls erwünscht, können verschiedene kationische Lipide wie z. B. DOTMA, N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid; DOTAP, 1,2-Dioleoyloxy-3-(trimethyl-ammonio)propan und DOTB, 1,2-Dioleoyl-3-(4'-trimethylammonio)butanoyl-sn-glycerin verwendet werden. Im Allgemeinen kann das Molverhältnis von kationischem Lipid zu nicht-kationischem Lipid im Liposom z. B. 1:1000, 1:100, vorzugsweise zwischen 2:1 und 1:10 betragen und es kann mehr be vorzugt im Bereich zwischen 1:1 und 1:2,5 und insbesondere bei 1:1 liegen (Verhältnis der molaren Menge an kationischem Lipid zu der molaren Menge an nicht-kationischem Lipid, z. B. DPPC). Das nicht-kationische Lipid kann aus einer Vielzahl von Lipiden ausgewählt werden, wenn das kationische Lipid zum Aufbau der Mikrokügelchen verwendet wird. Vorzugsweise ist das nicht-kationische Lipid Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylethanolamin oder Dioleoylphosphatidylethanolamin. Anstelle der vorstehend beschriebenen kationischen Lipide können zum Aufbau der Mikrokügelchen und zur Bindung eines negativ geladenen Therapeutikums, wie z. B. eines genetischen Materials, an die Außenseite der Mikrokügelchen auch Lipide, die kationische Polymere wie Polylysin oder Polyarginin aufweisen, verwendet werden. Darüber hinaus können negativ geladene Lipide z. B. zur Bindung positiv geladener therapeutischer Verbindungen verwendet werden.
Andere geeignete Lipide oder Kombinationen davon, die dem Fachmann bekannt sind, sind auch von der vorliegenden Erfindung umfasst. Beispielsweise können Kohlenhydrat-aufweisende Lipide für die in vivo-Zielsteuerung verwendet werden, wie es in der US-PS 4,310,505 beschrieben ist, deren gesamte Offenbarung in diese Beschreibung einbezogen ist.
Die am meisten bevorzugten Lipide sind Phospholipide, vorzugsweise DPPC und DSPC, und insbesondere DPPC.
Gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, die zur Erzeugung Gas-gefüllter Mikrokügelchen verwendet werden können, umfassen vorzugsweise unter anderem Moleküle mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen in entweder linearer oder verzweigter Form. Beispiele für gesättigte Fettsäuren, die verwendet werden können, umfassen vorzugsweise unter anderem Laurin-, Myristin-, Palmitin- und Stearinsäure. Beispiele für ungesättigte Fettsäuren, die verwendet werden können, umfassen unter anderem Laurolein-, Physeterin-, Myristolein-, Palmitolein-, Petroselin- und Ölsäure. Beispiele für verzweigte Fettsäuren, die verwendet werden können, umfassen unter anderem Isolaurin-, Isomyristin-, Isopalmitin- und Isostearinsäure und Isoprenoide.
Kationische Polymere können an die Lipidschicht über eine oder mehrere Alkylgruppen oder Sterolgruppen gebunden werden, die zur Verankerung des kationischen Polymers in der das Gas umgebenden Lipidschicht dienen. Kationische Polymere, die auf diese Weise verwendet werden können, umfassen unter anderem Polylysin und Polyarginin und deren Analoga wie Polyhomoarginin oder Polyhomolysin. Die positiv geladenen Gruppen der kationischen Lipide und der kationischen Polymere, oder kationische Gruppen, die perfluoralkylierte Gruppen tragen, können z. B. zur Komplexierung negativ geladener Moleküle, wie z. B. von Zuckerphosphaten auf genetischem Material, verwendet werden, wodurch das Material an die Oberfläche der Gas-gefüllten Lipid-Kügelchen gebunden wird. Beispielsweise können die kationischen Analoga amphiphiler perfluoralkylierter Bipyridine verwendet werden, wie es in Garelli und Vierling, Biochim. Biophys. Acta 1992, 1127, 41–48 beschrieben ist, deren gesamte Offenbarung in diese Beschreibung einbezogen ist. Alternativ können z. B. negativ geladene Moleküle über Ester-, Amid-, Ether-, Disulfid- oder Thioesterbindungen direkt an die Kopfgruppen der Lipide gebunden werden.
Biologisch aktive Materialien, wie z. B. Peptide oder Proteine können in die Lipidschicht einbezogen werden, mit der Maßgabe, dass die Peptide ausreichend lipophil sind oder zur Bindung an die Lipidschicht mit Alkyl- oder Sterolgruppen derivatisiert werden können. Negativ geladene Peptide können z. B. unter Verwendung kationischer Lipide oder Polymere wie vorstehend beschrieben gebunden werden.
Lösungen von Lipiden oder von gasgefüllten Liposomen können z. B. durch die Zugabe einer Vielzahl von Viskositätsmodifiziermitteln, wie z. B. unter anderem Kohlenhydraten und deren phosphorylierten und sulfonierten Derivaten; Polyethern, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht im Bereich zwischen 400 und 8000; Di- und Trihydroxyalkanen und deren Polymeren, vorzugsweise mit Molekulargewichten im Bereich zwischen 800 und 8000, stabilisiert werden. Emulgierende und/oder solubilisierende Mittel können auch zusammen mit Lipiden oder Liposomen verwendet werden. Solche Mittel umfassen unter anderem auch Akaziengummi, Cholesterin, Diethanolamin, Glycerinmonostearat, Lanolinalkohole, Lecithin, Mono- und Diglyceride, Monoethanolamin, Ölsäure, Oleylalkohol, Poloxamer, Polyoxyethylen-50-stearat, Polyoxyl-35-Rizinusöl, Polyoxyl-10-oleylether, Polyoxyl-20-cetostearylether, Polyoxyl-40-stearat, Polysorbat 20, Polysorbat 40, Polysorbat 60, Polysorbat 80, Propylenglycoldiacetat, Propylenglycolmonostearat, Natriumlaurylsulfat, Natriumstearat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonooleat, Sorbitanmonopalmitat, Sorbitanmonostearat, Stearinsäure, Trolamin und emulgierendes Wachs. Suspendierende und/oder viskositätserhöhende Mittel, die mit Lipid- oder Liposomlösungen verwendet werden können, umfassen unter anderem Akaziengummi, Agar, Alginsäure, Aluminiummonostearat, Bentonit, Magma, Carbomer 934P, Carboxymethylcellulose, Calcium- und Natrium- und Natrium-12-carragheen, Cellulose, Dextrin, Gelatine, Guar Gum, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Magnesiumaluminiumsilikat, Methylcellulose, Pectin, Polyethylenoxid, Polyvinylalkohol, Povidon, Propylenglycolalginat, Siliciumdioxid, Natriumalginat, Tragantgummi und Xanthangummi.
Die Gas-gefüllten Liposomen umfassen vorzugsweise ein impermeables Material. Ein impermeables Material ist definiert als ein Material, das den Durchgang einer wesentlichen Menge der Bestandteile des Liposoms unter typischen Lagerbedingungen nicht zulässt. "Wesentlich" ist definiert als mehr als etwa 50% der Bestandteile, wobei die Bestandteile sowohl das Gas als auch beliebige andere Komponenten sind, die im Inneren des Liposoms eingekapselt sind, wie z. B. ein Therapeutikum. Vorzugsweise werden nicht mehr als etwa 25% des Gases, mehr bevorzugt nicht mehr als etwa 10% des Gases und insbesondere nicht mehr als etwa 1% des Gases während der Lagerung und vor der Verabreichung an einen Patienten freigesetzt.
Es wurde zumindest zum Teil gefunden, dass die Gasimpermeabilität der Gasgefüllten Liposomen mit der Phasenumwandlungstemperatur vom Gel-Zustand in den flüssigkristallinen Zustand zusammenhängt. Es wird angenommen, dass im Allgemeinen die Gasimpermeabilität der Liposomen bei einer gegebenen Temperatur umso größer ist, je höher die Phasenumwandlungstemperatur vom Gel-Zustand in den flüssigkristallinen Zustand ist, vgl. z. B. die vorstehende Tabelle I und Derek Marsh, CRC Handbook of Lipid Bilayers (CRC Press, Boca Raton, FL 1990), Seite 139 bezüglich der Hauptketten-Schmelzumwandlungen gesättigter Diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine. Es sollte jedoch beachtet werden, dass im Allgemeinen zur Freisetzung einer therapeutischen Verbindung aus Gas-gefüllten Liposomen, die aus Lipiden mit einer geringeren Phasenumwandlungstemperatur vom Gel-Zustand in den flüssigkristallinen Zustand zusammengesetzt sind, weniger Energie zur Freisetzung einer therapeutischen Verbindung benötigt wird.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist die Phasenumwandlungstemperatur des Lipids größer als die innere Körpertemperatur des Patienten, an den es verabreicht wird. Beispielsweise sind Lipide mit einer Phasenumwandlungstemperatur von mehr als etwa 37°C zur Verabreichung an Menschen bevorzugt. Im Allgemeinen sind Mikrokügelchen mit einer Phasenumwandlungstemperatur von mehr als etwa 20°C bevorzugt.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die mit den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Liposomen stabil, wobei die Stabilität als Widerstand gegen ein Zerreißen von der Zeit der Bildung bis zur Anwendung von Ultraschall definiert ist. Die zum Aufbau der Mikrokügelchen verwendeten Lipide können hinsichtlich der Stabilität ausgewählt werden. Beispielsweise sind Gas-gefüllte Liposomen, die aus DSPC (Distearoylphosphatidylcholin) zusammengesetzt sind, stabiler als Gas-gefüllte Liposomen, die aus DPPC (Dipalmitoylphosphatidylcholin) zusammengesetzt sind, und diese sind wiederum stabiler als Gas-gefüllte Liposomen, die aus Eiphosphatidylcholin (EPC) zusammengesetzt sind. Vorzugsweise zerreißen nicht mehr als etwa 50% der Liposomen von der Zeit der Bildung bis zur Anwendung von Ultraschall, mehr bevorzugt zerreißen nicht mehr als etwa 25% der Liposomen, ganz besonders bevorzugt zerreißen nicht mehr als etwa 10% der Liposomen und insbesondere nicht mehr als etwa 1% der Liposomen.
Die vorliegenden Liposomen neigen zu einer größeren Gasimpermeabilität und Stabilität während der Lagerung als andere Gas-gefüllte Liposomen, die mittels bekannter Verfahren, wie z. B. durch Beaufschlagen mit Druck oder anderen Techniken hergestellt worden sind. 72 Stunden nach der Bildung sind z. B. herkömmlich hergestellte Liposomen im Wesentlichen frei von Gas, wobei das Gas aus den Liposomen heraus diffundiert ist und/oder die Liposomen gerissen und/oder geschmolzen sind, was zu einem gleichzeitigen Verlust der Reflektivität führt. Im Vergleich dazu weisen erfindungsgemäße Gas-gefüllte Liposomen, die in wässriger Lösung gehalten werden, im Allgemeinen eine Lagerstabilität von mehr als etwa drei Wochen auf, vorzugsweise eine Lagerstabilität von mehr als etwa vier Wochen, mehr bevorzugt eine Lagerstabilität von mehr als etwa fünf Wochen und noch mehr bevorzugt eine Lagerstabilität von mehr als etwa drei Monaten und häufig eine Lagerstabilität, die noch viel länger ist, wie z. B. mehr als 6 Monate, 12 Monate oder sogar 2 Jahre.
Darüber hinaus wurde gefunden, dass das Einbeziehen mindestens einer kleinen Menge von negativ geladenem Lipid in eine beliebige Liposommembran, obwohl dies nicht erforderlich ist, zur Bereitstellung von Liposomen nützlich ist, die bei einer Aggregierung nicht zum Reißen neigen. Mit "mindestens eine kleine Menge" ist etwa 1 mol-% des gesamten Lipids gemeint. Geeignete negativ geladene Lipide sind dem Fachmann bekannt und umfassen z. B. Phosphatidylserin und Fettsäuren. Am meisten bevorzugt hinsichtlich des Reißens bei der Anwendung von Resonanzfrequenz-Ultraschall, der Echogenizität und der Stabilität sind Liposomen, die aus Dipalmitoylphosphatidylcholin hergestellt sind.
Ferner sind die Liposomen vorzugsweise im Gefäßsystem ausreichend stabil, so dass sie einer Rezirkulation widerstehen. Die Gas-gefüllten Liposomen können beschichtet werden, so dass die Aufnahme durch das retikuloendotheliale System minimiert wird. Geeignete Beschichtungen umfassen z. B. Ganglioside, Glucuronide, Galact-uronate, Guluronate, Polyethylenglycol, Polypropylenglycol, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Dextran, Stärke, phosphorylierte und sulfonierte Mono-, Di-, Tri-, Oligo- und Polysaccharide und Albumin. Die Liposomen können für Zwecke wie z. B. einer Vermeidung der Erkennung durch das Immunsystem beschichtet werden.
Das verwendete Lipid ist auch vorzugsweise flexibel. Flexibilität, wie sie im Zusammenhang mit Gas-gefüllten Liposomen definiert ist, ist die Fähigkeit einer Struktur, ihre Gestalt zu verändern, z. B. um durch eine Öffnung hindurchzutreten, die eine Größe aufweist, die geringer ist als die des Liposoms.
Mit der Maßgabe, dass die Zirkulationshalbwertszeit der Liposomen ausreichend lang ist, werden die Liposomen im Allgemeinen durch das Zielgewebe hindurchtreten, während sie sich im Körper befinden. Folglich wird durch Fokussieren der Schallwellen auf das ausgewählte, zu behandelnde Gewebe, das Therapeutikum lokal in das Zielgewebe freigesetzt werden. Als weiteres Hilfsmittel zur Zielsteuerung können auch Antikörper, Kohlenhydrate, Peptide, Glycopeptide, Glycolipide und Lectine in die Oberfläche der Liposomen einbezogen werden. Andere Hilfsmittel zur Zielsteuerung umfassen Polymere wie z. B. Polyethylenglycol, Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol, die auf die Oberfläche mittels Alkylierung, Acylierung, Ste rolgruppen oder derivatisierten Kopfgruppen von Phospholipiden wie z. B. Dioleoylphosphatidylethanolamin aufgebracht werden können. Auch Peptide, Antikörper, Lectine, Glycopeptide, Oligonucleotide und Glycokonjugate können auf die Oberflächen der Gas-gefüllten Lipid-Kügelchen aufgebracht werden.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können dem Lipid als Hilfsmittel für das Gaseinbringverfahren sowie zur Aufrechterhaltung der Stabilität der Gasgefüllten Liposomen z. B. Emulgatoren zugesetzt werden. Beispiele für Emulgatoren umfassen unter anderem Glycerin, Cetylalkohol, Sorbit, Polyvinylalkohol, Polypropylenglycol, Propylenglycol, Ethylalkohol, Natriumlaurylsulfat, Laureth 23, Polysorbate (alle Einheiten), alle gesättigten und ungesättigten Fettsäuren und Triethanolamin.
Für die Lagerung vor der Verwendung können die erfindungsgemäßen Liposomen in einer wässrigen Lösung, wie z. B. einer Kochsalzlösung (z. B. einer Phosphatgepufferten Kochsalzlösung), oder einfach Wasser suspendiert und vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 2°C und etwa 10°C, vorzugsweise bei etwa 4°C gelagert werden. Vorzugsweise ist das Wasser steril.
Typische Lagerbedingungen sind z. B. eine nicht-entgaste wässrige Lösung von 0,9 NaCl, die 48 Stunden bei 4°C gehalten wird. Die Lagertemperatur liegt vorzugsweise unterhalb der Phasenumwandlungstemperatur vom Gel-Zustand zum flüssigkristallinen Zustand des Materials, das die Liposomen bildet.
Insbesondere werden die Liposomen in einer isotonischen Kochsalzlösung gelagert, obwohl die Kochsalzlösung gegebenenfalls hypotonisch sein kann (z. B. etwa 0,3 bis etwa 0,5% NaCl). Die Lösung kann gegebenenfalls auch gepuffert werden, um einen pH-Wert-Bereich von etwa pH 5 bis etwa pH 7,4 bereitzustellen. Geeignete Puffer umfassen unter anderem Acetat-, Citrat-, Phosphat- und Hydrogencarbonat.
Zur Verhinderung eines bakteriellen Abbaus bei der Lagerung können auch bakteriostatische Mittel in die Liposomen einbezogen werden. Geeignete bakteriostatische Mittel umfassen unter anderem Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid, Benzoesäure, Benzylalkohol, Butylparaben, Cetylpyridiniumchlorid, Chlorbutanol, Chlorkre sol, Methylparaben, Phenol, Kaliumbenzoat, Kaliumsorbat, Natriumbenzoat und Sorbinsäure.
Der Begriff "Gas-gefüllt", wie er hier verwendet wird, steht für Liposomen mit einem Innenvolumen, das mindestens etwa 10% Gas, vorzugsweise mindestens etwa 25% Gas, mehr bevorzugt mindestens etwa 50% Gas, ganz besonders bevorzugt mindestens etwa 75% Gas und insbesondere mindestens etwa 90% Gas enthält. Dem Fachmann in Kenntnis dieser Beschreibung ist klar, dass auch ein gasförmiger Vorläufer verwendet werden kann, worauf unter Bildung eines Gases aktiviert wird.
In den erfindungsgemäßen Gas-gefüllten Liposomen können verschiedene biologisch verträgliche Gase verwendet werden. Solche Gase umfassen Luft, Stickstoff, Kohlendioxid, Sauerstoff, Argon, Fluor, Xenon, Neon, Helium oder beliebige Kombinationen davon. Andere geeignete Gase sind dem Fachmann in Kenntnis dieser Beschreibung bekannt.
Die Größe der Liposomen wird von der vorgesehenen Verwendung abhängen. Bei den kleineren Liposomen wird der Resonanzfrequenz-Ultraschall im Allgemeinen höher sein als bei den größeren Liposomen. Die Klassierung dient auch zur Modulierung der resultierenden liposomalen biologischen Verteilung und des Abbaus bzw. der Clearance. Zusätzlich zur Filtration kann die Größe der Liposomen gegebenenfalls mittels bekannter Verfahren eingestellt werden, wie z. B. durch Extrusion, Sonifizierung, Homogenisierung, die Verwendung einer laminaren Strömung eines Flüssigkeitskerns, der in eine nicht damit mischbare Flüssigkeitshülle eingebracht worden ist, vgl. z. B. die US-PS 4,728,578 , die GB-Patentanmeldung GB 2193095 A , die US-PS 4,728,575 , die US-PS 4,737,323 , die internationale Anmeldung PCT/US85/01161 , Mayer et al., Biochimica et Biophysica Acta 1986, 858, 161–168, Hope et al., Biochimica et Biophysica Acta 1985, 812, 55–65, die US-PS 4,533,254 , Mayhew et al., Methods in Enzymology 1987, 149, 64–77, Mayhew et al., Biochimica et Bio-physica Acta 1984, 755, 169–174, Cheng et al., Investigative Radiology 1987, 22, 47–55, PCT/US89/05040 , die US-PS 4,162,282 , die US-PS 4,310,505 , die US-PS 4,162,706 und Liposomes Technology, Hrsg. G. Gregoriadis, Band I, Seiten 29–37, 51–67 und 79–108 (CRC Press Inc., Boca Raton, FL, 1984). Die Offenbarungen jedes/jeder der vorstehend genannten Patente, Veröffentlichungen und Patentanmel dungen werden in ihrer Gesamtheit in diese Beschreibung einbezogen. Die Extrusion unter Druck durch Poren einer definierten Größe ist ein bevorzugtes Verfahren zur Einstellung der Größe der Liposomen.
Da die Liposomengröße die biologische Verteilung beeinflusst, können Liposomen mit verschiedener Größe für verschiedene Zwecke ausgewählt werden. Beispielsweise liegt bei einer intravaskulären Anwendung der bevorzugte Größenbereich bei einem mittleren Außendurchmesser zwischen etwa 30 nm und etwa 10 μm, wobei der bevorzugte mittlere Außendurchmesser bei etwa 5 μm liegt.
Insbesondere liegt bei einer intravaskulären Anwendung die Größe der Liposomen vorzugsweise bei einem mittleren Außendurchmesser von etwa 10 μm oder weniger, vorzugsweise bei weniger als etwa 7 μm und mehr bevorzugt bei weniger als etwa 5 μm. Vorzugsweise haben die Liposomen einen mittleren Außendurchmesser von nicht kleiner als etwa 30 nm.
Um eine therapeutische Abgabe an Organe wie z. B. der Leber bereitzustellen und eine Differenzierung von Tumorgewebe von normalem Gewebe zu ermöglichen, sind kleinere Liposomen mit einem mittleren Außendurchmesser zwischen etwa 30 nm und etwa 100 nm bevorzugt.
Zur Embolisation eines Gewebes wie z. B. der Niere oder der Lunge haben die Liposomen vorzugsweise einen mittleren Außendurchmesser von weniger als etwa 200 μm.
Für die intranasale, intrarektale oder lokale Verabreichung haben die Mikrokügelchen einen mittleren Außendurchmesser von vorzugsweise weniger als etwa 100 μm.
Große Liposomen, z. B. mit einer Größe zwischen 1 und 10 μm werden im Allgemeinen in den intravaskulären Raum eingeschlossen, bis sie durch phagocytische Elemente abgebaut werden, welche die Gefäße auskleiden, wie z. B. Makrophagen und Kuppferzellen, die Sinusoidgefäße auskleiden. Für den Durchgang zu den Zeilen über die Sinusoidgefäße hinaus können kleinere Liposomen, z. B. mit einem mittleren Außendurchmesser von weniger als etwa 1 μm, z. B. weniger als etwa 300 nm, verwendet werden.
Der Verabreichungsweg der Liposomen wird abhängig von dem beabsichtigten Gebrauch variieren. Dem Fachmann ist klar, dass die Verabreichung der erfindungsgemäßen therapeutischen Abgabesysteme auf verschiedene Weisen durchgeführt werden kann, wie z. B. intravaskulär, intralymphatisch, parenteral, subkutan, intramuskulär, intranasal, intrarektal, intraperitoneal, interstitiell, in die Luftwege mittels einer Vernebelungseinrichtung, hyperbar, oral, lokal oder in Tumore unter Verwendung verschiedener Dosierungsformen. Ein bevorzugter Verabreichungsweg ist intravaskulär. Für den intravaskulären Gebrauch wird das therapeutische Abgabesystem im Allgemeinen intravenös injiziert. Es kann jedoch auch intraarteriell injiziert werden. Die erfindungsgemäßen Liposomen können auch interstitiell oder in einen beliebigen Körperhohlraum injiziert werden.
Die Abgabe von Therapeutika von den Liposomen unter Verwendung von Ultraschall wird am Besten für Gewebe erreicht, die ein gutes akustisches Fenster für die Übertragung von Ultraschallenergie aufweisen. Dies ist bei den meisten Geweben im Körper wie z. B. den Muskeln, dem Herz, der Leber und der meisten anderen vitalen Strukturen der Fall. Im Gehirn kann zum Richten der Ultraschallenergie durch den Schädel kann ein chirurgisches Fenster erforderlich sein.
Darüber hinaus ist die Erfindung besonders bei der Abgabe von Therapeutika an die Lungen eines Patienten geeignet. Die Gas-gefüllten Liposomen sind leichter als beispielsweise herkömmliche flüssigkeitsgefüllte Liposomen, die sich im Allgemeinen im zentralen proximalen Luftweg ablagern, anstatt dass sie die Peripherie der Lungen erreichen. Es wird daher angenommen, dass die Gas-gefüllten Liposomen die Abgabe einer therapeutischen Verbindung an die Peripherie der Lungen verbessern kann, einschließlich die Endluftwege und die Alveolen. Für die Verabreichung an die Lungen können die Gas-gefüllten Liposomen z. B. durch Vernebelung angewandt werden.
Bei Anwendungen wie z. B. der gezielten Ansteuerung der Lungen, die mit Lipiden ausgekleidet sind, kann das Therapeutikum bei der Aggregation der Gas-gefüllten Liposomen mit den Lipiden freigesetzt werden, die das angesteuerte Gewebe auskleiden. Darüber hinaus können die Gas-gefüllten Liposomen nach der Verabreichung ohne die Verwendung von Ultraschall platzen. Folglich muss zur Freisetzung des Arzneistoffs bei der vorstehend genannten Art der Verabreichung kein Ultraschall angewandt werden.
Ferner sind die Gas-gefüllten Liposomen besonders für Therapeutika geeignet, die in wässrigen Medien oder beim Aussetzen gegenüber Sauerstoff und/oder atmosphärischer Luft abgebaut werden können. Beispielsweise können die Liposomen zur Verwendung mit labilen therapeutischen Verbindungen mit einem Inertgas wie z. B. Stickstoff oder Argon gefüllt werden. Zusätzlich können die Gas-gefüllten Liposomen mit einem Inertgas gefüllt und zur Einkapselung eines labilen Therapeutikums zur Verwendung in einem Bereich eines Patienten verwendet werden, der normalerweise zum Aussetzen des Therapeutikums gegenüber der atmosphärischen Luft führen wurde, wie z. B. bei kutanen oder ophthalmischen Anwendungen.
Die Gas-gefüllten Liposomen sind auch zur transkutanen Abgabe besonders gut geeignet, wie z. B. einem Pflasterabgabesystem. Die Verwendung des zerreißend wirkenden Ultraschalls kann die transdermale Abgabe therapeutischer Verbindungen verstärken. Ferner kann ein Mechanismus zur Überwachung und Modulierung der Arzneistoffabgabe verwendet werden. Beispielsweise kann diagnostischer Ultraschall zur visuellen Überwachung des Platzens der Gas-gefüllten Liposomen und zur Modulierung der Arzneistoffabgabe verwendet werden und/oder ein Hydrophon kann zur Detektion des Schalls des Platzens der Gas-gefüllten Liposomen und zur Modulierung der Arzneistoffabgabe verwendet werden.
In bevorzugten Ausführungsformen werden die Liposomen individuell verabreicht, anstatt dass sie z. B. in einer Matrix eingebettet sind.
Für die in vitro-Verwendung, wie z. B. für Zellkulturanwendungen können die Gasgefüllten Liposomen den Zellen in Kultur zugesetzt und anschließend inkubiert werden. Anschließend kann Schallenergie auf das Kulturmedium angewandt werden, das die Zellen und die Liposomen enthält.
Im Allgemeinen werden die therapeutischen Abgabesysteme in Form einer wässrigen Suspension, wie z. B. in Wasser oder einer Kochsalzlösung (z. B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung), verabreicht. Vorzugsweise ist das Wasser steril. Ebenso bevorzugt ist die Kochsalzlösung eine isotonische Kochsalzlösung, obwohl die Kochsalzlösung gegebenenfalls hypotonisch sein kann (z. B. etwa 0,3 bis etwa 0,5% NaCl). Die Lösung kann zur Bereitstellung eines pH-Wert-Bereichs von etwa pH 5 bis etwa pH 7,4 gegebenenfalls auch gepuffert werden. Ferner kann in die Medien vorzugsweise Dextrose einbezogen werden. Weitere Lösungen, die zur Verabreichung Gas-gefüllter Liposomen verwendet werden können, umfassen unter anderem Mandelöl, Maisöl, Baumwollsaatöl, Ethyloleat, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, Mineralöl, Myristylalkohol, Octyldodecanol, Olivenöl, Erdnussöl, Pfirsichkernöl, Sesamöl, Sojabohnenöl und Squalen.
Die geeignete Dosierung von zu verabreichenden Gas-gefüllten Mikrokügelchen und die Art der Verabreichung werden abhängig vom Alter, dem Gewicht und dem zu behandelnden Säuger und der beabsichtigten speziellen Anwendung (therapeutisch/diagnostisch) variieren. Typischerweise wird die Dosierung bei niedrigeren Konzentrationen begonnen und solange erhöht, bis der gewünschte therapeutische Effekt erreicht ist.
Zur Verwendung bei der Ultraschall-Bilderzeugung weisen die Liposomen vorzugsweise eine Reflektivität von mehr als 2 dB, mehr bevorzugt zwischen etwa 4 dB und etwa 20 dB auf. Innerhalb dieser Bereiche zeigt sich bei den Liposomen die höchste Reflektivität bei den größeren Liposomen, bei höheren Konzentrationen der Liposomen und/oder dann, wenn höhere Ultraschallfrequenzen eingesetzt werden.
Für die therapeutische Arzneistoffabgabe wird das Zerreißen der Liposomen, die ein Therapeutikum erhalten, überraschenderweise einfach durch Anwenden von Ultraschall mit einer bestimmten Frequenz auf den Bereich des Patienten durchgeführt, an dem eine Therapie erwünscht ist, nachdem die Liposomen an diesen Bereich verabreicht oder auf eine andere Weise diesen Bereich erreicht haben. Insbesondere wurde in unerwarteter Weise gefunden, dass dann, wenn Ultraschall mit einer Frequenz angewandt wird, die der Peak-Resonanzfrequenz der Therapeutikum- enthaltenden Gas-gefüllten Liposomen entspricht, die Liposomen zerreißen und ihren Inhalt freigeben.
Peak-Resonanzfrequenz kann entweder in vivo oder in vitro bestimmt werden, jedoch vorzugsweise in vivo, und zwar durch Aussetzen der Liposomen gegenüber Ultraschall, empfangen der reflektierten Resonanzfrequenzsignale und Analysieren des Spektrums der empfangenen Signale zur Bestimmung des Peaks unter Verwendung von herkömmlichen Mitteln. Der so bestimmte. Peak entspricht der Peak-Resonanzfrequenz (oder der zweiten Harmonischen, wie sie manchmal bezeichnet wird).
Vorzugsweise haben die Liposomen eine Peak-Resonanzfrequenz zwischen etwa 0,5 MHz und etwa 10 MHz. Natürlich wird die Peak-Resonanzfrequenz der Gasgefüllten Liposomen abhängig vom Außendurchmesser und in gewissem Maß von der Elastizität oder Flexibilität der Liposomen variieren, wobei die größeren oder elastischeren oder flexibleren Liposomen eine niedrigere Resonanzfrequenz aufweisen als die kleineren und weniger elastischen oder flexiblen Liposomen.
Die Therapeutikum-enthaltenden Gas-gefüllten Liposomen werden auch zerreißen, wenn sie einer nicht-Peak-Resonanzfrequenzultraschall in Kombination mit einer höheren Intensität (abgegebene Leistung) und Dauer (Zeit) ausgesetzt werden. Diese höhere Energie führt jedoch zu einer stark erhöhten Erwärmung, die gegebenenfalls nicht erwünscht ist. Durch Einstellen der Frequenz der Energie, so dass sie mit der Peak-Resonanzfrequenz übereinstimmt, wird die Effizienz des Zerreißens und der Freisetzung des Therapeutikums verbessert, eine nennenswerte Gewebeerwärmung tritt im Allgemeinen nicht auf (häufig keine Erhöhung der Temperatur um mehr als etwa 2°C) und es wird weniger Gesamtenergie benötigt. Folglich ist die Anwendung von Ultraschall bei der Peak-Resonanzfrequenz am meisten bevorzugt, obwohl dies nicht erforderlich ist.
Für diagnostischen oder therapeutischen Ultraschall kann bei der Durchführung der Erfindung ein beliebiger der verschiedenen Typen von diagnostischen Ultraschallbilderzeugungsvorrichtungen verwendet werden, wobei die spezielle Art oder das spezielle Modell der Vorrichtung für das erfindungsgemäße Verfahren nicht kritisch ist.
Es sind auch Vorrichtungen geeignet, die für die Anwendung von Ultraschallhyperthermie gestaltet sind, wobei solche Vorrichtungen in den US-PSen 4,620,546 , 4,658,828 und 4,586,512 beschrieben sind, deren gesamte Offenbarung in diese Beschreibung einbezogen ist. Vorzugsweise wird in der Vorrichtung eine Resonanzfrequenz-Spektralanalyseeinrichtung (RF-Spektralanalyseein-richtung) verwendet. Die Wandlersonden können extern angewandt oder implantiert werden. Der Ultraschall wird am Anfang gewöhnlich mit einer niedrigeren Intensität und Dauer eingesetzt und dann wird die Intensität, die Zeit und/oder die Resonanzfrequenz erhöht, bis die Liposomen im Ultraschall sichtbar wird (für diagnostische Ultraschallanwendungen) oder bis die Liposomen zerreißen (für therapeutische Ultraschallanwendungen).
Obwohl die Anwendung der verschiedenen Prinzipien dem Fachmann klar ist, dem diese Beschreibung zur Verfügung steht, liegt die Resonanzfrequenz für Gas-gefüllte Liposomen mit einem mittleren Außendurchmesser von 1,5 bis etwa 10 μm im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis etwa 10 MHz. Durch Einstellen der Brennpunktzone auf das Zentrum des Zielgewebes (z. B. den Tumor) können die Gas-gefüllten Liposomen unter Echtzeitultraschall visualisiert werden, da sie sich im Zielgewebe ansammeln. Unter Verwendung des 7,5 MHz-Curved-Array-Wandlers als Beispiel, Einstellung der an den Wandler abgegebenen Leistung auf das Maximum und Einstellen der Brennpunktzone innerhalb des Zielgewebes wird die zeitgemittelte räumliche Spitzenleistung (SPTA-Leistung) in Wasser maximal etwa 5,31 mW/cm² betragen. Diese Leistung wird eine gewisse Freisetzung des Therapeutikums von den Gas-gefüllten Liposomen verursachen. Eine viel größere Freisetzung kann jedoch durch die Verwendung einer höheren Leistung erreicht werden.
Durch Umschalten des Wandlers auf den Doppler-Modus steht eine höhere Ausgangsleistung von bis zu 2,5 W/cm² von dem gleichen Wandler zur Verfügung. Wenn das Gerät im Doppler-Modus arbeitet, kann die Leistung an eine ausgewählte Brennpunktzone innerhalb des Zielgewebes abgegeben werden und die Gasgefüllten Liposomen können dazu gebracht werden, ihre Therapeutika freizusetzen. Dadurch, dass der Wandler so ausgewählt wird, dass er mit der Resonanzfrequenz der Gas-gefüllten Liposomen übereinstimmt, macht dieses Verfahren der Freisetzung des Therapeutikums noch effizienter.
Für Gas-gefüllte Liposomen mit größerem Durchmesser, z. B. mit einem mittleren Außendurchmesser von mehr als 3 μm kann zur Freisetzung des Therapeutikums ein Wandler mit niedrigerer Frequenz effektiver sein. Beispielsweise kann ein Wandler mit niedrigerer Frequenz mit 3,5 MHz (20 mm Curved-Array-Modell) so ausgewählt werden, dass er der Resonanzfrequenz der Gas-gefüllten Liposomen entspricht. Unter Verwendung dieses Wandlers können an den Brennpunkt 101,6 mW/cm² abgegeben werden und das Umschalten auf den Doppler-Modus wird die Ausgangsleistung (SPTA) auf 1,02 W/cm² erhöhen.
Die Verwendung des Phänomens der Kavitation zur Freisetzung und/oder Aktivierung der Arzneistoffe/Prodrugs innerhalb der Gas-gefüllten Liposomen können Energien bei niedrigerer Frequenz eingesetzt werden, da die Kavitation bei niedrigeren Frequenzen effektiver stattfindet. Unter Verwendung eines 0,757 MHz-Wandlers, der mit höheren Spannungen betrieben wird (in Höhe von 300 V) wird die Kavitation von Lösungen Gas-gefüllter Liposomen bei Schwellen von etwa 5,2 atm stattfinden.

Tabelle II zeigt die Energiebereiche, die auf Gewebe von diagnostischem Ultraschall mit gewöhnlich verwendeten Geräten übertragen werden, wie z. B. von dem Portascan Allzweckscanner mit dem Empfänger-Pulsen 1966 Modell 661 von Piconics Inc. (Tyngsboro, MA), dem Echoview 81 Scanner einschließlich des 80C-Systems von Picker (Cleveland, OH) oder dem Modell D-9 Versatone Bidirectional Doppler von Medisonics (Montain View, CA). Im Allgemeinen sind diese bei der Pulswiederholung verwendeten Energiebereiche zur Diagnose und zur Überwachung der Gas-gefüllten Liposomen geeignet. Sie reichen jedoch nicht zum Zerreißen der erfindungsgemäßen Gas-gefüllten Liposomen aus. Tabelle II Leistung und Intensitäten, die von diagnostischen Geräten erzeugt werden*

Pulswiederholungsrate (Hz)	Gesamte Ultraschallleistungs-abgabe P (mW)	Durchschnittliche Intensität an der Wandlerfläche I_TD (W/m²)
520	4,2	32
676	9,4	71
806	6,8	24
1000	14,4	51
1538	2,4	8,5

* Werte aus Carson et al., Ultrasound in Med. & Biol. 1978, 3, 341–350, dessen gesamte Offenbarung in diese Beschreibung einbezogen ist.

Ultraschall mit höherer Energie, wie er z. B. in therapeutischen Ultraschallgeräten gebräuchlich verwendet wird, ist zur Aktivierung der Therapeutikum-enthaltenden Gasgefüllten Liposomen bevorzugt. Im Allgemeinen wird bei therapeutischen Ultraschallgeräten eine relative Einschaltdauer von 50% bis 100% abhängig von der Fläche des Gewebes eingesetzt, die mit Ultraschall erwärmt werden soll. Flächen mit großen Mengen an Muskelmasse (d. h. Rücken, Oberschenkel) und stark vaskularisiertes Gewebe wie z. B. das Herz können eine größere relative Einschaltdauer erfordern, z. B. 100%.
Bei diagnostischem Ultraschall wird ein Schallpuls oder mehrere Schallpulse verwendet und das Gerät macht zwischen den Pulsen zum Empfangen der reflektierten Schallsignale eine Pause. Die begrenzte Anzahl von Pulsen, die bei diagnostischem Ultraschall verwendet wird, begrenzt die effektive Energie, die an das Gewebe abgegeben wird, von dem Bilder erzeugt werden.
Bei therapeutischem Ultraschall wird Dauerultraschall zur Abgabe höherer Energien verwendet. Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Liposomen kann die Schallenergie gepulst werden, wobei Dauerultraschall jedoch bevorzugt ist. Wenn die Pulserzeugung eingesetzt wird, dann wird der Schall vorzugsweise in Echoserienlängen von mindestens etwa 8 und vorzugsweise mindestens etwa 20 Pulsen zu einem Zeitpunkt gepulst.
Es kann Ultraschall mit entweder fester oder modulierter Frequenz eingesetzt werden. Eine feste Frequenz ist dadurch definiert, dass die Schallfrequenz über die Zeit konstant ist. Eine modulierte Frequenz ist eine Frequenz, bei der sich die Wellenfrequenz mit der Zeit ändert, z. B. von hoch nach niedrig (PRICH) oder von niedrig nach hoch (CHIRP). Beispielsweise wird ein PRICH-Puls mit einer ursprünglichen Frequenz von 10 MHz Schallenergie mit zunehmender Leistung von 1 bis 5 W auf 1 MHz durchlaufen. Ein fokussierter frequenzmodulierter Hochenergieultraschall kann die Rate der lokalen Gasausdehnung innerhalb der Liposomen und die Rate des Zerreißens erhöhen, so dass die Therapeutika lokal abgegeben werden.
Die Frequenz des verwendeten Schalls kann von etwa 0,025 bis etwa 100 MHz variieren. Frequenzbereiche zwischen etwa 0,75 und etwa 3 MHz sind bevorzugt und Frequenzen zwischen etwa 1 und etwa 2 MHz sind am meisten bevorzugt. Es können gewöhnlich verwendete therapeutische Frequenzen von etwa 0,75 bis etwa 1,5 MHz eingesetzt werden. Es können auch gewöhnlich verwendete diagnostische Frequenzen von etwa 3 bis etwa 7,5 MHz eingesetzt werden. Für sehr kleine Liposomen, z. B. mit einem mittleren Außendurchmesser von unter 0,5 μm, können höhere Schallfrequenzen bevorzugt sein, da diese kleineren Liposomen Schallenergie bei höheren Schallfrequenzen effektiver absorbieren. Wenn sehr hohe Frequenzen verwendet werden, z. B. über 10 MHz, wird die Schallenergie im Allgemeinen eine begrenzte Eindringtiefe in Fluide und Gewebe aufweisen. Eine externe Anwendung kann für die Haut und andere Oberflächengewebe bevorzugt sein. Für tiefe Strukturen kann jedoch die Anwendung von Ultraschall über interstitielle Sonden oder intravaskuläre Ultraschallkatheter bevorzugt sein.
Wenn die Gas-gefüllten Liposomen für die Arzneistoffabgabe verwendet werden, kann die abzugebende therapeutische Arzneistoffverbindung je nach dem innerhalb der Wand des Liposoms eingebettet sein, in dem Liposom eingekapselt und/oder an dem Liposom gebunden sein. Der Ausdruck "gebunden sein an" oder dessen Variationen, wie er hier in Verbindung mit dem Ort der therapeutischen Verbindung ver wendet wird, bedeutet, dass die therapeutische Verbindung in irgendeiner Weise mit der inneren und/oder der äußeren Wand des Mikrokügelchens verbunden ist, wie z. B. über eine kovalente oder ionische Bindung oder über eine andere chemische oder elektrochemische Bindung oder Wechselwirkung. Der Ausdruck "eingekapselt" oder dessen Variationen, wie er in Verbindung mit dem Ort der therapeutischen Verbindung verwendet wird, bedeutet, dass sich die therapeutische Verbindung in dem inneren Hohlraum des Mikrokügelchens befindet. Der Ausdruck "eingebettet in" oder dessen Variationen, wie er in Verbindung mit dem Ort der therapeutischen Verbindung verwendet wird, bezeichnet die Positionierung der therapeutischen Verbindung innerhalb der Wand des Mikrokügelchens. Der Ausdruck "umfassend ein Therapeutikum" bezeichnet alle verschiedenen Arten der Positionierung des Therapeutikums im Zusammenhang mit dem Mikrokügelchen. Demgemäß kann das Therapeutikum Variabel positioniert werden, wie z. B. eingeschlossen im inneren Hohlraum des Gasgefüllten Mikrokügelchens, angeordnet zwischen dem Gas und der inneren Wand des Gas-gefüllten Mikrokügelchens, einbezogen auf die externe Oberfläche des Gasgefüllten Mikrokügelchens und/oder innerhalb des Mikrokügelchenstruktur selbst integriert.
In den Liposomen kann ein beliebiges Therapeutikum eingekapselt werden. Mit Therapeutikum ist hier ein Mittel gemeint, dass auf den Patienten einen günstigen Effekt ausübt. Der Begriff "Therapeutikum", wie er hier verwendet wird, ist mit dem Begriff "Arzneistoff" synonym.
Beispiele für Arzneistoffe, die mit Gas-gefüllten Liposomen für die Zwecke der Arzneistoffabgabe abgegeben werden können, umfassen unter anderem: Hormonprodukte, wie z. B. Vasopressin und Oxytocin und deren Derivate, Glucagon und Thyroidmittel, wie z. B. Jodprodukte und Anti-Thyroidmittel; kardiovaskuläre Produkte, wie z. B. Chelatisierungsmittel und Quecksilber-Diuretika und Herzglycoside; Atmungsprodukte, wie z. B. Xanthinderivate (Theophyllin und Aminophyllin); Antiinfektiosa wie z. B. Aminoglycoside, Antimykotika (Amphotericin), Penicillin und Cephalosporin-Antibiotika, antivirale Mittel, wie z. B. Zidovudin, Ribavirin, Amantadin, Vidarabin und Acyclovir, Antihelminthika, Antimalariamittel und Antituberkulosearzneistoffe; biologische Mittel, wie z. B. Immunseren, Antitoxine und Antivenena, Tollwutprophylaxeprodukte, bakterielle Impfstoffe, virale Impfstoffe, Toxoide; antineoplastische Mittel, wie z. B. Nitrosoharnstoffe, Stickstoff-Senfgase, Antimetaboliten (Fluoruracil, Hormone, wie z. B. Progestine und Östrogene und Antiöstrogene; Antibiotika, wie z. B. Dactinomycin; Mitosehemmstoffe, wie z. B. Etoposid und die Vinca-Rosea-Alkaloide, Radiopharmazeutika wie z. B. radioaktive Iod- und Phosphorprodukte; sowie Interferon, Hydroxyharnstoff, Procarbazin, Dacarbazin, Mitotan, Asparaginase und Cyclosporine.
Genetische und biologisch aktive Materialien können in den inneren Gas-gefüllten Raum dieser Liposomen während des Gaseinbringverfahrens oder in oder auf die Lipidmembranen dieser Teilchen ein- bzw. aufgebracht werden. Das Aufbringen auf die Oberfläche dieser Partikel ist bevorzugt. Genetische Materialien und biologisch aktive Produkte mit einem hohen Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten können direkt in die das Gas umgebende Lipidschicht eingebracht werden. Das Aufbringen auf die Oberfläche der Gas-gefüllten Lipidkügelchen ist jedoch mehr bevorzugt. Um dies zu erreichen werden im Allgemeinen Gruppen, die genetische Materialien oder biologisch aktive Materialien binden können, in die Lipidschichten eingebracht, die dann diese Materialien binden. Im Fall von genetischen Materialien (DNA, RNA, sowohl einzelsträngig als auch doppelsträngig, und Antisense- und Sense-Oligonucleotide) wird dies einfach durch die Verwendung kationischer Lipide oder kationischer Polymere erreicht, die in die getrockneten Lipid-Ausgangsmaterialien einbezogen werden können.
Andere geeignete Therapeutika umfassen unter anderem: Antineoplastische Mittel, wie z. B. Platinverbindungen (z. B. Spiroplatin, Cisplatin und Carboplatin), Methotrexat, Adriamycin, Taxol, Mitomycin, Ansamitocin, Bleomycin, Cytosinarabinosid, Arabinosyladenin, Mercaptopolylysin, Vincristin, Busulfan, Chlorambucil, Melphalan (z. B. PAM, L-PAM oder Phenylalaninsenfgas), Mercaptopurin, Mitotan, Procarbazinhydrochlorid, Dactinomycin (Actinomycin D), Daunorubicinhydrochlorid, Doxorubicinhydrochlorid, Mitomycin, Plicamycin (Mithramycin), Aminoglutethimid, Estramustinphosphat-Natrium, Flutamid, Leuprolidacetat, Megestrolacetat, Tamoxifencitrat, Testolacton, Trilostan, Amsacrin (m-AMSA), Asparaginase (L-Asparaginase), Erwina Asparaginase, Etoposid (VP-16), Interferon α-2a, Interferon α-2b, Teniposid (VM-26), Vinblastinsulfat (VLB), Vincristinsulfat, Bleomycin, Bleomycinsulfat, Methotrexat, Adriamycin und Arabinosyl; Blutprodukte, wie z. B. parenterales Eisen, Hämin, Hämatoporphyrine und deren Derivate; Modifikatoren der biologischen Antwort (biological response modifiers), wie z. B. Muramyldipeptid, Muramyltripeptid, Mikroben-Zellwandkomponenten, Lymphokine (z. B. Bakterienendotoxin, wie z. B. Lipopolysaccharid, Makrophagenaktivierungsfaktor), Untereinheiten von Bakterien (wie z. B. von Mycobakterien, Corynebakterien), das synthetische Dipeptid N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin; Antimykotika, wie z. B. Ketoconazol, Nystatin, Griseofulvin, Flucytosin (5-fc), Miconazol, Amphotericin B, Ricin und β-Lactamantibiotika (z. B. Sulfazecin); Hormone, wie z. B. Wachstumshormon, Melanocyten-stimulierendes Hormon, Östradiol, Beclomethasondipropionat, Betamethason, Betamethasonacetat und Betamethason natriumphosphat, Vetamethasondinatriumphosphat, Vetamethasonnatriumphosphat, Cortisonacetat, Dexamethason, Dexamethasonacetat, Dexamethasonnatriumphosphat, Flunsolid, Hydrocortison, Hydrocortisonacetat, Hydrocortisoncypionat, Hydrocortisonnatriumphosphat, Hydrocortisonnatriumsuccinat, Methylprednisolon, Methylprednisolonacetat, Methylprednisolonnatriumsuccinat, Paramethasonacetat, Prednisolon, Prednisolonacetat, Prednisolonnatriumphosphat, Prednisolontebutat, Prednison, Triamcinolon, Triamcinolonacetonid, Triamcinolondiacetat, Triamcinolonhexacetonid und Fludrocortisonacetat; Vitamine, wie z. B. Cyanocobalamin, Neinoic-Säure (neinoic acid), Retinoide und Derivate, wie z. B. Retinolpalmitat und α-Tocopherol; Peptide, wie z. B. Mangansuperoxiddismutase; Enzyme, wie z. B. alkalische Phosphatase; Antiallergische Mittel, wie z. B. Amelexanox; Antigerinnungsmittel, wie z. B. Phenprocoumon und Heparin; Kreislaufarzneistoffe, wie z. B. Propranolol; Stoffwechselverstärker, wie z. B. Glutathion; Antituberkulotika, wie z. B. para-Aminosalicylsäure, Isoniazid, Capreomycinsulfat, Cycloserin, Ethambutolhydrochlorid, Ethionamid, Pyrazinamid, Rifampin und Streptomycinsulfat; antivirale Mittel, wie z. B. Acyclovir, Amantadine, Azidothymidin (AZT oder Zidovudin), Ribavirin und Vidarabinmonohydrat (Adeninearabinosid, ara-A); Antianginamittel, wie z. B. Diltiazem, Nifedipin, Verapamil, Erythrityltetranitrat, Isosorbiddinitrat, Nitroglycerin (Glyceryltrinitrate) und Pentaerythrittetranitrat; Antigerinnungsmittel, wie z. B. Phenprocoumon, Heparin; Antibiotika, wie z. B. Dapson, Chloramphenicol, Neomycin, Cefaclor, Cefadroxil, Cephalexin, Cephradin, Erythromycin, Clindamycin, Lincomycin, Amoxicillin, Ampicillin, Bacampicillin, Carbenicillin, Dicloxacillin, Cyclacillin, Picloxacillin, Hetacillin, Methicillin, Nafcillin, Oxacillin, Penicillin G, Penicillin V, Ticarcillin, Rifampin und Tetracyclin; entzündungshemmende Mittel, wie z. B. Difunisal, Ibuprofen, Indomethacin, Meclofenamat, Mefenaminsäure, Naproxen, Oxyphenbutazon, Phe nylbutazon, Piroxicam, Sulindac, Tolmetin, Aspirin und Salicylate; Antiprotozoika, wie z. B. Chloroquin, Hydroxychloroquin, Metronidazol, Chinin and Megluminantimonat; Antirheumatika, wie z. B. Penicillamin; Narkotika, wie z. B. Paregoric; Opiate, wie z. B. Kodein, Heroin, Methadon, Morphin und Opium; Herzglycoside, wie z. B. Deslanosid, Digitoxin, Digoxin, Digitalin und Digitalis; neuromuskuläre Blocker, wie z. B. Atracuriumbesylat, Gallamintriethiodid, Hexafluoreniumbromid, Metocuriniodid, Pancuroniumbromid, Succinylcholinchlorid (Suxamethoniumchlorid), Tubocurarinchlorid und Vecuroniumbromid; Sedativa (Hypnotika), wie z. B. Amobarbital, Amobarbital-Natrium, Aprobarbital, Butabarbital-Natrium, Chloralhydrat, Ethchlorvynol, Ethinamat, Flurazepamhydrochlorid, Glutethimid, Methotrimeprazinhydrochlorid, Methyprylon, Midazolamhydrochlorid, Paraldehyd, Pentobarbital, Pentobarbital-Natrium, Phenobarbital-Natrium, Secobarbital-Natrium, Talbutal, Temazepam und Triazolam; Lokalanästhetika, wie z. B. Bupivacainhydrochlorid, Chlorprocainhydrochlorid, Etidocainhydrochlorid, Lidocainhydrochlorid, Mepivacainhydrochlorid, Procainhydrochlorid und Tetracainhydrochlorid; Allgemeinanästhetika, wie z. B. Droperidol, Etomidat, Fentanylcitrat mit Droperidol, Ketaminhydrochlorid, Methohexital-Natrium und Thiopental-Natrium; und radioaktive Teilchen oder Ionen, wie z. B. Strontium, Iodid, Rhenium und Yttrium.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Therapeutikum ein monoklonaler Antikörper, wie z. B. ein monoklonaler Antikörper, der an ein Melanom-Antigen binden kann.
Andere bevorzugte Therapeutika umfassen genetisches Material, wie z. B. entweder natürliche oder synthetische Nucleinsäuren, RNA und DNA, einschließlich rekombinanter RNA und DNA und Antisense-RNA und -DNA. Arten von genetischem Material, die verwendet werden können, umfassen z. B. Gene, die sich auf Expressionsvektoren wie z. B. Plasmiden, Phagemiden, Cosmiden, künstlichen Hefechromosomen (YAC's) und defekten oder "Helfer"-Viren befinden, Antigennucleinsäuren, sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige RNA und DNA und Analoga davon, wie z. B. Phosphorothioat- und Phosphorodithioat-Oligodesoxynucleotide. Darüber hinaus kann das genetische Material z. B. mit Proteinen oder anderen Polymeren kombiniert werden.
Beispiele für genetische Therapeutika, die unter Verwendung der Liposomen angewandt werden können, umfassen DNA, die mindestens einen Abschnitt eines HLA-Gens kodiert, DNA, die mindestens einen Abschnitt von Dystrophin kodiert, DNA, die mindestens einen Abschnitt von CFTR kodiert, DNA, die mindestens einen Abschnitt von IL-2 kodiert, DNA, die mindestens einen Abschnitt von TNF kodiert, ein Antisense-Oligonucleotid, das die DNA binden kann, die mindestens einen Abschnitt von Ras kodiert.
DNA, die bestimmte Proteine kodiert, kann bei der Behandlung vieler verschiedener Arten von Krankheiten verwendet werden. Beispielsweise kann Adenosindeaminase zur Behandlung von ADA-Mangel bereitgestellt werden; Tumornekrosefaktor und/oder Interleukin-2 kann zur Behandlung von fortgeschrittenem Krebs bereitgestellt werden; der HDL-Rezeptor kann zur Behandlung von Lebererkrankungen bereitgestellt werden; Thymidinkinase kann zur Behandlung von Eierstockkrebs, Gehirntumoren oder HIV-Infektion bereitgestellt werden; HLA-B7 kann zur Behandlung von malignem Melanom bereitgestellt werden; Interleukin-2 kann zur Behandlung von Neuroblastom, malignem Melanom oder Nierenkrebs bereitgestellt werden; Interleukin-4 kann zur Behandlung von Krebs bereitgestellt werden; HIV env kann zur Behandlung von HIV-Infektionen bereitgestellt werden; Antisense ras/p53 kann zur Behandlung von Lungenkrebs bereitgestellt werden und Faktor VIII kann zur Behandlung von Hämophilie B bereitgestellt werden, vgl. z. B. Science 258, 744–746.
Gegebenenfalls kann mehr als ein Therapeutikum unter Verwendung der Liposomen angewandt werden. Beispielsweise kann ein einzelnes Liposom mehr als ein Therapeutikum enthalten oder Liposomen, die verschiedene Therapeutika enthalten, können zusammen verabreicht werden. Beispielsweise können ein monoklonaler Antikörper, der an ein Melanom-Antigen binden kann, und ein Oligonucleotid, das mindestens einen Abschnitt von IL-2 kodiert, gleichzeitig verabreicht werden. Der Ausdruck "mindestens ein Abschnitt von", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass nicht das gesamte Gen von dem Oligonucleotid repräsentiert werden muss, solange der repräsentierte Abschnitt des Gens einen effektiven Block für die Genexpression bereitstellt.
Entsprechend können Prodrugs in den Liposomen eingekapselt werden und diese werden von dem Umfang des Begriffs "Therapeutikum", wie er hier verwendet wird, umfasst. Prodrugs sind bekannt und umfassen inaktive Arzneistoffvorläufer, die, wenn sie einer hohen Temperatur, metabolisierenden Enzymen, einer Kavitation und/oder Druck ausgesetzt werden, in Gegenwart von Sauerstoff oder auf andere Weise, oder wenn sie von den Liposomen freigesetzt werden, aktive Arzneistoffe ausbilden. Solche Prodrugs können in dem erfindungsgemäßen Verfahren bei der Anwendung von Ultraschall auf die Prodrug-enthaltenden Liposomen mit der/dem resultierenden Kavitation, Erwärmung, Druck und/oder Freisetzung von den Liposomen aktiviert werden. Geeignete Prodrugs sind dem Fachmann bekannt und sind z. B. in Sinkula et al., J. Pharm. Sci. 1975, 64, 181–210 beschrieben, dessen gesamte Offenbarung in diese Beschreibung einbezogen ist.
Prodrugs können z. B. inaktive Formen der aktiven Arzneistoffe umfassen, bei denen eine chemische Gruppe an dem Arzneistoff vorliegt, die ihn inaktiv macht und/oder ihm eine Löslichkeit oder andere Eigenschaften verleiht. In dieser Form sind die Prodrugs im Allgemeinen relativ inaktiv, sobald jedoch die chemische Gruppe von der Prodrug durch Wärme, Kavitation, Druck und/oder Enzyme in der Umgebung oder auf andere Weise abgespalten worden ist, wird der aktive Arzneistoff erzeugt. Solche Prodrugs sind im Stand der Technik gut beschrieben und umfassen viele verschiedene Arzneistoffe, die an chemische Gruppen über Bindungen wie Ester an kurze, mittlere oder langkettige aliphatische Carbonate, an Halbester organischer Phosphate, Pyrophosphate, Sulfate, Amide, Aminosäuren, Azobindungen, Carbamate, Phosphamide, Glucosiduronate, N-Acetylglucosamin und β-Glucosid gebunden sind.
Nachstehend sind Beispiele von Arzneistoffen mit den Stammmolekülen und der reversiblen Modifikation oder Bindung angegeben: Convallatoxin mit Ketalen, Hydantoin mit Alkylestern, Chlorphenesin mit Glycin- oder Alaninestern, Acetaminophen mit Koffeinkomplex, Acetylsalicylsäure mit THAM-Salz, Acetylsalicylsäure mit Acetamidophenylester, Naloxon mit Sulfatester, 15-Methylprostaglandin F_2α mit Methylester, Procain mit Polyethylenglycol, Erythromycin mit Alkylestern, Clindamycin mit Alkylestern oder Phosphatestern, Tetracyclin mit Betainsalzen, 7-Acylaminocephalosporine mit Ring-substitutierten Acyloxybenzylestern, Nandrolon mit Phenylpropionatdecanoatestern, Östradiol mit Enoletheracetal, Methylprednisolon mit Acetatestern, Testosteron mit N-Acetylglucosaminid, Glucosiduronat(trimethylsilyl)ether, Cortisol oder Prednisolon oder Dexamethason mit 21-Phosphatestern.
Prodrugs können auch als reversible Arzneistoffderivate gestaltet und als Modifizierungsmittel zur Verstärkung des Arzneistofftransports zu ortsspezifischen Geweben verwendet werden. Beispiele für Stammmoleküle mit reversiblen Modifikationen oder Bindungen zur Beeinflussung des Transports an ein ortsspezifisches Gewebe und für einen verstärkten therapeutischen Effekt umfassen Isocyanat mit Halogenalkylnitrosoharnstoff, Testosteron mit Propionatester, Methothrexat (3,5'-Dichlormethothrexat) mit Dialkylestern, Cytosinarabinosid mit 5'-Acylat, Stickstoff-Senfgas (2,2'-Dichlor-N-methyldiethylamin), Stickstoff-Senfgas mit Aminomethyltetracyclin, Stickstoff-Senfgas mit Cholesterin- oder Östradiol- oder Dehydroepiandrosteronestern und Stickstoff-Senfgas mit Azobenzol.
Dem Fachmann ist klar, dass eine spezielle chemische Gruppe zur Modifizierung eines gegebenen Arzneistoffs zur Beeinflussung der Verteilung des Arzneistoffs entweder in der Membran oder in den Innenraum der Liposomen ausgewählt werden kann. Die Bindung, die zur Verbindung der chemischen Gruppe mit dem Arzneistoff ausgewählt wird, kann so ausgewählt werden, dass sie die gewünschte Metabolismusgeschwindigkeit aufweist, z. B. bei der Hydrolyse in Fall von Esterbindungen in Gegenwart von Serumesterasen nach der Freisetzung von den Gas-gefüllten Liposomen. Zusätzlich kann die spezielle chemische Gruppe zur Beeinflussung der biologischen Verteilung des in dem erfindungsgemäßen Gas-gefüllten, Arzneistoffaufweisenden Liposom verwendeten Arzneistoffs ausgewählt werden, z. B. N,N-Bis(2-chlorethyl)-phosphordiamidsäure mit cyclischem Phosphoramid für ein Eierstockadenokarzinom.
Zusätzlich können die innerhalb der Gas-gefüllten Liposomen eingesetzten Prodrugs so gestaltet werden, dass sie reversible Derivate enthalten, die als Modifiziermittel der bereitzustellenden Aktivitätsdauer verwendet werden, um längere Wirkungseffekte oder Depotwirkungseffekte bereitzustellen. Beispielsweise kann Nikotinsäure mit Dextran und Carboxymethyldextranestern, Streptomycin mit einem Alginsäuresalz, Dihydrostreptomycin mit einem Pamoatsalz, Cytarabin (Arabin-C) mit 5'-Adamantoatester, ara-Adenosin (ara-A) mit 5-Palmitat- und 5'-Benzoatestern, Amphotericin B mit Methylestern, Testosteron mit 17-β-Alkylestern, Östradiol mit Formiatester, Prostaglandin mit 2-(4-Imidazolyl)ethylaminsalz, Dopamin mit Aminosäureamiden, Chloramphenicol mit Mono- und Bis(trimethylsilyl)ethern und Cycloguanil mit Pamoatsalzen modifiziert werden. In dieser Form kann ein Depot oder ein Vorrat eines langwirkenden Arzneistoffs in vivo von den Gas-gefüllten, Prodrugaufweisenden Liposomen freigesetzt werden.
Darüber hinaus können zur Erzeugung toxischer freier Radikalverbindungen Verbindungen verwendet werden, die im Allgemeinen thermisch labil sind. Verbindungen mit Azobindungen, Peroxid- und Disulfidbindungen, die sich bei hoher Temperatur zersetzen, sind bevorzugt. Bei dieser Form der Prodrug werden Azo-, Peroxid- oder Disulfidbindungen-enthaltende Verbindungen durch Kavitation und/oder verstärkte Erwärmung, die durch die Wechselwirkung von Hochenergieschall mit den Gasgefüllten Liposomen erzeugt wird/werden, zur Erzeugung von Kaskaden freier Radikale von diesen Prodrugs, die darin eingeschlossen sind, aktiviert. Viele verschiedene Arzneistoffe oder Chemikalien können diese Prodrugs aufbauen, wie z. B. Azoverbindungen mit der allgemeinen Struktur R-N=N-R, wobei R eine Kohlenwasserstoffkette ist und die Doppelbindung zwischen den beiden Stickstoffatomen in vivo zur Erzeugung freier Radikalprodukte reagieren kann.
Beispiele für Arzneistoffe oder Verbindungen, die zur Erzeugung freier Radikalprodukte verwendet werden können, umfassen Azo-enthaltende Verbindungen, wie z. B. Azobenzol, 2,2'-Azobisisobutyronitril, Azodicarbonamid, Azolitmin, Azomycin, Azosemid, Azosulfamid, Azoxybenzol, Aztreonam, Sudan III, Sulfachrysoidin, Sulfamidochrysoidin und Sulfasalazin, Verbindungen mit Disulfidbindungen, wie z. B. Sulbentin, Thiamindisulfid, Thiolutin, Thiram, Verbindungen, die Peroxide enthalten, wie z. B. Wasserstoffperoxid und Benzoylperoxid, 2,2'-Azobisisobutyronitril, 2,2'-Azobis(2-amidopropan)dihydrochlorid und 2,2'-Azobis(2,4-dimethylvaleronitril).
Ein Gas-gefülltes Liposom, das mit Sauerstoffgas gefüllt ist, sollte bei der Kavitation viele freie Radikale erzeugen. Auch Metallionen aus den Übergangsreihen, insbesondere Mangan, Eisen und Kupfer können die Bildungsrate von reaktiven Sauer stoffzwischenprodukten aus Sauerstoff erhöhen. Durch Einkapseln von Metallionen innerhalb der Liposomen kann die Bildung von freien Radikalen in vivo verstärkt werden. Diese Metallionen können in die Liposomen als freie Salze, als Komplexe, z. B. mit EDTA, DTPA, DOTA oder Deferoxamin, oder als Oxide der Metallionen einbezogen werden. Darüber hinaus können derivatisierte Komplexe der Metallionen an Lipidkopfgruppen gebunden werden oder lipophile Komplexe der Ionen können z. B. in eine Lipiddoppelschicht einbezogen werden. Wenn sie einer thermischen Stimulation, z. B. einer Kavitation, ausgesetzt werden, werden diese Metallionen dann die Bildungsgeschwindigkeit der reaktiven Sauerstoffzwischenprodukte erhöhen. Ferner können Strahlensensibilisatoren wie z. B. Metronidazol und Misonidazol zur Erzeugung freier Radikale bei der thermischen Stimulation in die Gas-gefüllten Liposomen einbezogen werden.
Als Beispiel für die Verwendung der Prodrugs kann eine acylierte chemische Gruppe über eine Esterbindung an einen Arzneistoff gebunden werden, die in vivo durch die enzymatische Einwirkung im Serum leicht gespalten wird. Das acylierte Prodrug wird in die Gas-gefüllten Liposomen einbezogen. Wenn das Gas-gefüllte Liposom durch den Schallpuls des Ultraschalls zum Platzen gebracht wird, wird das von dem Liposom eingekapselte Prodrug dem Serum ausgesetzt. Die Esterbindung wird dann durch Esterasen im Serum gespalten, wodurch der Arzneistoff erzeugt wird.
Entsprechend kann Ultraschall nicht nur für das Zerreißen der Gas-gefüllten Liposomen verwendet werden, sondern auch zur Erzeugung thermischer Effekte, welche die Geschwindigkeit der chemischen Spaltung und der Freisetzung des aktiven Arzneistoffs von dem Prodrug erhöhen können.
Die Liposomen können auch so gestaltet werden, dass sowohl innerhalb als auch außerhalb des Liposoms eine symmetrische oder asymmetrische Verteilung des Arzneistoffs vorliegt.
Die spezielle chemische Struktur der Therapeutika kann so ausgewählt oder modifiziert werden, dass eine gewünschte Löslichkeit erreicht wird, so dass das Therapeutikum entweder innerhalb des Gas-gefüllten Raums des Liposoms eingekapselt, an das Liposom gebunden oder in dem Liposom integriert ist. Das oberflächengebunde ne Therapeutikum kann eine oder mehrere Acylketten aufweisen, so dass dann, wenn die Blase zum Platzen gebracht wird oder erwärmt oder durch Kavitation zum Zerreißen gebracht wird, das acylierte Therapeutikum dann die Oberfläche verlassen kann und/oder das Therapeutikum von der chemischen Gruppe mit den Acylketten abgespalten werden kann. Entsprechend können andere Therapeutika mit einer hydrophoben Gruppe, die eine aromatische Struktur oder eine Sterolstruktur aufweist, zum Einbau in die Oberfläche des Liposoms formuliert werden Die vorliegende Erfindung wird weiter in den nachstehenden Beispielen beschrieben, welche die Herstellung und das Testen der Gas-gefüllten Liposomen veranschaulichen. Die nachstehenden Beispiele sind nicht beschränkend aufzufassen.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung Gas-gefüllter Liposomen
50 mg 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (Molekulargewicht: 734,05, Pulver, Chargennummer 160pc-183) (Avanti-Polar Lipids, Alabaster, AL) wurden abgewogen und mit 5,0 ml Kochsalzlösung (0,9% NaCl) oder Phosphat-gepufferter Saline (0,8% Natriumchlorid, 0,02% Kaliumchlorid, 0,115% zweibasiges Natriumphosphat und 0,02% einbasiges Kaliumphosphat, pH-Wert auf 7,4 eingestellt) in einem Zentrifugenröhrchen hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde dann auf einem Vortex-Gerät (Scientific Industries, Bohemia, NY) 10 min bei einer Geräteeinstellung von 6,5 geschüttelt. Es wurde ein Gesamtvolumen von 12 ml festgestellt. Die Kochsalzlösung nahm von 5,0 ml auf etwa 4 ml ab.
Die mit diesem neuen Verfahren hergestellten Gas-gefüllten Liposomen wurden dann mittels optischer Mikroskopie klassiert. Es wurde festgestellt, dass die größten Liposomen eine Größe von etwa 50 bis etwa 60 μm aufwiesen und dass die geringste detektierte Größe etwa 8 μm betrug. Die durchschnittliche Größe lag in einem Bereich von etwa 15 bis etwa 20 μm.
Die Gas-gefüllten Liposomen wurden dann durch eine 10 oder 12 μm "NUCLEPORE"-Membran unter Verwendung eines Swin-Lok-Filterhalters (Nuclepore Filtration Products, Costar Corp., Cambridge, MA) und einer 20 cm³-Spritze (Becton-Dickinson & Co., Rutherford, NJ) filtriert. Die Membran war eine 10 oder 12 μm "NUCLEPORE"-Membran (Nuclepore Filtration Products, Costar Corp., Cambridge, MA). Der 10,0 μm-Filter wurde in dem Swin-Lok-Filterhalter platziert und die Kappe wurde fest aufgesetzt. Die Liposomenlösung wurde aufgeschüttelt und über eine Nadel der Größe 18 in eine 20 cm³-Spritze überführt. Etwa 12 ml der Liposomenlösung wurden in die Spritze eingebracht und die Spritze wurde auf den Swin-Lok-Filterhalter aufgeschraubt. Die Spritzen- und Filterhalteranordnung wurde umgedreht, so dass die größeren der Gas-gefüllten Liposomenvesikel nach oben steigen konnten. Anschließend wurde die Spritze sanft nach oben geschoben und die Gasgefüllten Liposomen wurden auf diese Weise filtriert.
Die Überlebensrate (die Menge der Gas-gefüllten Liposomen, die nach dem Extrusionsvorgang zurückgehalten wurden) der Gas-gefüllten Liposomen nach der Extrusion durch den 10,0 μm Filter betrug etwa 83–92%. Vor der Extrusion betrug das Schaumvolumen etwa 12 ml und das Volumen der wässrigen Lösung betrug etwa 4 ml. Nach der Extrusion betrug das Schaumvolumen etwa 10 bis 11 ml und das Volumen der wässrigen Lösung betrug etwa 4 ml.
Das optische Mikroskop wurde erneut zur Bestimmung der Größenverteilung der extrudierten Gas-gefüllten Liposomen verwendet. Es wurde festgestellt, dass die größten Liposomen eine Größe von etwa 25 bis etwa 30 μm aufwiesen und dass die geringste detektierte Größe etwa 5 μm betrug. Die durchschnittliche Größe lag in einem Bereich von etwa 8 bis etwa 15 μm.
Es wurde gefunden, dass nach der Filtration mehr als 90% der Gas-gefüllten Liposomen kleiner als 15 μm waren.
Beispiel 2: Herstellung von Gas-gefüllten Liposomen, einschließlich einer Lyophilisierung
50 mg 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (Molekulargewicht: 734,05, Pulver) (Avanti-Polar Lipids, Alabaster, AL) wurden abgewogen und in ein Zentrifugenröhrchen eingebracht. Das Lipid wurde dann mit 5,0 ml Kochsalzlösung (0,9% NaCl) hydratisiert. Das Lipid wurde dann 10 min bei einer Geräteeinstellung von 6,5 vortexiert. Nach dem Vortexieren wurde die gesamte Lösung in flüssigem Stickstoff eingefroren. Anschließend wurde die Probe zum Gefriertrocknen auf das Lyophilisiergerät aufgebracht. Die Probe wurde 18 Stunden auf dem Lyophilisiergerät belassen. Das getrocknete Lipid wurde von dem Lyophilisiergerät abgenommen, in 5 ml Kochsalzlösung rehydratisiert und 10 min bei eine Einstellung von 6,5 vortexiert. Eine kleine Probe dieser Lösung wurde auf einen Objektträger pipettiert und die Lösung wurde unter einem Mikroskop betrachtet. Dann wurde die Größe der Gas-gefüllten Liposomen bestimmt. Es wurde festgestellt, dass die größten Liposomen eine Größe von etwa 60 μm aufwiesen und dass die geringste detektierte Größe etwa 20 μm betrug. Die durchschnittliche Größe lag in einem Bereich von etwa 30 bis etwa 40 μm.
Beispiel 3 (Referenzbeispiel): Beispiel für die Herstellung von Gas-gefüllten Liposomen oberhalb der Phasenumwandlungstemperatur des Lipids
50 mg 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (Molekulargewicht: 734,05, Pulver) (Avanti-Polar Lipids, Alabaster, AL) wurden abgewogen und in ein Zentrifugenröhrchen eingebracht. Etwa 61 cm (2 Fuß) eines Latexschlauchs (Innendurchmesser 0,64 cm (0,25 Inch)) wurde in der Art einer Spule um ein konisches Zentrifugenröhrchen gewickelt. Der Latexschlauch wurde dann mit einem Isolierband an dem Zentrifugenröhrchen befestigt. Der Latexschlauch wurde dann mit einem Umwälzbad mit konstanter Temperatur (VWR Scientific Modell 1131) verbunden. Die Temperatur des Bads wurde auf 60°C eingestellt und die Wasserumwälzung wurde so eingestellt, dass das Wasser mit hoher Geschwindigkeit durch den Schlauch zirkulierte. Ein Thermometer wurde in die Lipidlösung eingebracht. Die Temperatur lag zwischen 42°C und 50°C.
Die Lipidlösung wurde 10 min bei einer Vortexgeräteeinstellung von 6,5 vortexiert. Es wurde festgestellt, dass ein sehr geringes Schäumen des Lipids (Phasenumwandlungstemperatur = 41°C) zu keiner nennenswerten Bildung von Gas-gefüllten Liposomen führte. Eine optische Mikroskopie zeigte große Lipidteilchen in der Lösung.
Die Anzahl der Gas-gefüllten Liposomen, die sich bei dieser Temperatur gebildet hatten, lag bei weniger als 3% der Anzahl, die sich bei eine Temperatur unterhalb der Phasenumwandlungstemperatur gebildet hatte. Die Lösung wurde 15 min absetzen gelassen, bis die Temperatur der Lösung auf Raumtemperatur (25°C) äquilibriert war. Die Lösung wurde dann 10 min vortexiert. Nach 10 min wurde festgestellt, dass sich Gas-gefüllte Liposomen gebildet hatten.
Beispiel 4: Herstellung von Gas-gefüllten Liposomen, einschließlich eines Einfrier-Auftau-Verfahrens
50 mg 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (Molekulargewicht: 734,05, Pulver) (Avanti-Polar Lipids, Alabaster, AL) wurden abgewogen und in ein Zentrifugenröhrchen eingebracht. Das Lipid wurde dann mit 5,0 ml einer 0,9%igen NaCl-Lösung hydratisiert. Die wässrige Lipidlösung wurde dann 10 min bei einer Geräteeinstellung von 6,5 vortexiert. Nach dem Vortexieren wurde die gesamte Lösung in flüssigem Stickstoff eingefroren. Anschließend wurde die gesamte Lösung in einem Wasserbad bei Raumtemperatur (25°C) aufgetaut. Der Einfrier-Auftau-Vorgang wurde dann achtmal wiederholt. Die hydratisierte Suspension wurde dann 10 min bei einer Geräteeinstellung von 6,5 vortexiert. Die Gas-gefüllten Liposomen wurden dann nachgewiesen, wie es in Beispiel 1 beschrieben worden ist.
Beispiel 5: Herstellung von Gas-gefüllten Liposomen mit einem Emulgator (Natriumlaurylsulfat)
Es wurden zwei Zentrifugenröhrchen vorbereitet, die jeweils 50 mg DPPC enthielten. 1 mol-% (etwa 0,2 mg Duponol C, Chargennummer 2832) Natriumlaurylsulfat wurde einem der Zentrifugenröhrchen zugesetzt und dem anderen Röhrchen wurden 10 mol-% (2,0 mg Duponol C, Chargennummer 2832) zugesetzt. Beiden Zentrifugenröhrchen wurden 5 ml 0,9%ige NaCl-Lösung zugesetzt. Beide Röhrchen wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und etwa 16 Stunden lyophilisiert. Beide Röhrchen wurden von dem Lyophilisiergerät entfernt und beiden Röhrchen wurden 5 ml Kochsalzlösung zugesetzt. Beide Röhrchen wurden in der Position 6,5 10 min vortexiert.
Es wurde festgestellt, dass die größten Gas-gefüllten Liposomen mit 1 mol-% Natriumlaurylsulfat eine Größe von etwa 75 μm aufwiesen und dass die geringste detektierte Größe etwa 6 μm betrug. Die durchschnittliche Größe lag in einem Bereich von etwa 15 bis etwa 40 μm. Es wurde festgestellt, dass die größten Gas-gefüllten Liposomen mit 10 mol-% Natriumlaurylsulfat eine Größe von etwa 90 μm aufwiesen und dass die geringste detektierte Größe etwa 6 μm betrug. Die durchschnittliche Größe lag in einem Bereich von etwa 15 bis etwa 35 μm.
Das Schaumvolumen in der Lösung, welche die Gas-gefüllten Liposomen mit 1 mol-% Natriumlaurylsulfat enthielt, betrug etwa 15 ml und das Volumen der wässrigen Lösung betrug etwa 3 bis 4 ml. Das Schaumvolumen in der Lösung, welche die Gasgefüllten Liposomen mit 10 mol-% Natriumlaurylsulfat enthielt, betrug etwa 15 ml und das Volumen der wässrigen Lösung betrug etwa 3 bis 4 ml.
Beispiel 6 (Referenzbeispiel): Bestimmung, ob Gas-gefüllte Liposomen durch Sonifizierung erzeugt werden können
50 mg Lipid, 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (Avanti-Polar Lipids, Alabaster, AL) wurden abgewogen und mit 5 ml 0,9% NaCl-Lösung hydratisiert. Anstelle des Vortexierens wurde die wässrige Lösung unter Verwendung eines Sonicator Ultraschallprozessors XL von Heat Systems, Modell XL 2020 (Heat Systems, Inc., Farmingdale, NY), sonifiziert. Der Sonicator wurde bei einer Frequenz von 20 kHz bei einer Position 4 des Knopfes auf dem Sonicator auf Dauerschall eingestellt. Für die 10 min dauernde Sonifizierung wurde eine Mikrospitze verwendet. Nach der Sonifizierung wurde die Lösung unter einem optischen Mikroskop betrachtet. Es gab keine Hinweise auf die Erzeugung Gas-gefüllter Liposomen.
Anschließend wurde die Mikrospitze des Sonicators entfernt und durch die Endkappe ersetzt, die mit dem Sonicator mitgeliefert worden ist. Eine weitere Lösung (50 mg Lipid pro 5 ml Kochsalzlösung) wurde hergestellt und mit dieser Spitze sonifiziert. Nach 10 min wurde die Lösung unter dem Mikroskop betrachtet. Auch hier zeigten sich keine Hinweise auf Gas-gefüllte Liposomen.
Beispiel 7: Bestimmung von Konzentrationseffekten auf die Erzeugung Gas-gefüllter Liposomen
In diesem Beispiel wird bestimmt, ob eine niedrigere Konzentrationsgrenze des Lipids die Erzeugung von Gas-gefüllten Liposomen stoppt. 10 mg 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (Avanti-Polar Lipids, Alabaster, AL) wurden zu 10 ml Kochsalzlösung zugesetzt. Die Lipid/Kochsalzlösung wurde in der Position 6,5 10 min vortexiert. Die Lösung wurde zur Klassierung unter einem optischen Mikroskop betrachtet. Es wurde festgestellt, dass die größten Liposomen eine Größe von etwa 30 bis etwa 45 μm aufwiesen und dass die geringste detektierte Größe etwa 7 μm betrug. Die durchschnittliche Größe lag in einem Bereich von etwa 30 bis etwa 45 μm.
Es zeigte sich, dass die Gas-gefüllten Liposomen zerbrechlicher waren, da sie schneller zerplatzten, als dies vorher gezeigt wurde. Somit erscheint es, dass die Konzentration des Lipids ein Faktor bei der Erzeugung und Stabilität Gas-gefüllter Liposomen ist.
Beispiel 8: Kaskadenfiltration
Unfiltrierte Gas-gefüllte Liposomen können in eine 50 ml Spritze aufgezogen und durch eine Kaskade aus einem "NUCLEPORE" 10 μm Filter und einem 8 μm Filter hindurchgeschickt werden, die minimal 150 μm voneinander entfernt sind (3 und 4). Alternativ kann z. B. die Probe durch einen Stapel aus 10 μm und 8 μm Filtern filtriert werden, die unmittelbar aneinander angrenzen. Gas-gefüllte Liposomen wurden durch die Filter mit einem Druck hindurchgeschickt, der eine Strömungsgeschwindigkeit von 2,0 ml/min erzeugte. Die so filtrierten Gas-gefüllten Liposomen wurden dann hinsichtlich der Ausbeute an Gas-gefüllten Liposomen gemessen, was ein Volumen von 80 bis 90% des unfiltrierten Volumens ergab.
Die resultierenden Gas-gefüllten Liposomen wurden zur Bestimmung ihrer Größe und der Größenverteilung mit vier verschiedenen Verfahren klassiert. Die Klassierung wurde mit einer optischen Klassierungseinheit Modell 770 von Particle Sizing Systems, einem optischen Zeiss Axioplan-Mikroskop, das über eine Schnittstelle mit einer von Universal Imaging hergestellten Bildverarbeitungssoftware verbunden war und einem Coulter-Zähler (Coulter Electronics Limited, Luton, Beds., England) durchgeführt. Wie es aus den 5 und 6 ersichtlich ist, war die Größe der Gasgefüllten Liposomen einheitlicher um 8 bis 10 μm verteilt als die unfiltrierten Gasgefüllten Liposomen. Somit ist ersichtlich, dass die filtrierten Gas-gefüllten Liposomen eine sehr viel einheitlichere Größe aufweisen.
Beispiel 9: Herstellung einer filtrierten DPPC-Suspension
250 mg DPPC (Dipalmitoylphosphatidylcholin) und 10 ml einer 0,9%igen NaCl-Lösung wurden einem 50 ml Falcon-Zentrifugenröhrchen (Becton-Dickinson, Lincoln Park, NJ) zugesetzt und bei Raumtemperatur gehalten (etwa 20°C). Die Suspension wurde dann unter Stickstoffdruck durch eine 1 μm Nuclepore-Polycarbonatmembran (Costar, Pleasanton, CA) filtriert. Die resultierende Suspension wurde dann auf einem Modell 370 Laserlichtstreuungsklassierungsgerät von Particle Sizing Systems (Santa Barbara, CA) klassiert. Alle Lipidteilchen hatten einen mittleren Außendurchmesser von 1 μm oder weniger.
Darüber hinaus wurde die gleiche Menge an DPPC-Suspension bei 124 MPa (18000 psi) fünfmal durch einen Microfluidizer von Microfluidics^TM (Microfluidics Corporation, Newton, MA) geschickt. Die Suspension, die weniger trüb war, wurde mit einem Submikrometer-Teilchenklassierungsgerät Modell 370 mit Laserlichtstreuung von Particle Sizing Systems (Santa Barbara, CA) klassiert. Dabei wurde gefunden, dass die Größe einheitlich weniger als 1 μm betrug. Es ist bekannt, dass die Teilchengröße mikrofluidisierter Suspensionen bis zu 6 Monate stabil bleibt.
Beispiel 10: Herstellung einer filtrierten DSPC-Suspension
100 mg DSPC (Distearoylphosphatidylcholin) und 10 ml einer 0,9%igen NaCl-Lösung wurden einem 50 ml Falcon-Zentrifugenröhrchen (Becton-Dickinson, Lincoln Park, NJ) zugesetzt. Die Suspension wurde dann unter einem Stickstoffdruck von 2,07 bis 55,2 MPa (300 bis 800 psi) durch eine 1 μm "NUCLEPORE"-Polycarbonatmembran (Costar, Pleasanton, CA) extrudiert. Die resultierende Sus pension wurde auf einem Submikrometer-Teilchenklassierungsgerät Modell 370 mit Laserlichtstreuung von Particle Sizing Systems (Santa Barbara, CA) klassiert. Es wurde gefunden, dass alle Teilchen eine Größe von 1 μm oder weniger aufwiesen.
Darüber hinaus wurde die gleiche Menge an DSPC-Suspension bei 124 MPa (18000 psi) fünfmal durch einen Microfluidizer von Microfluidics^TM (Microfluidics Corporation, Newton, MA) geschickt. Die Suspension, die weniger trüb war, wurde mit einem Submikrometer-Teilchenklassierungsgerät Modell 370 mit Laserlichtstreuung von Particle Sizing Systems (Santa Barbara, CA) klassiert. Dabei wurde gefunden, dass die Größe einheitlich weniger als 1 μm betrug.
Beispiel 11: Sterilisation filtrierter Lipidsuspensionen durch Autoklavierung
Die bereits klassierten Suspensionen von DPPC und DSPC der Beispiele 9 und 10 wurden 20 min in einem Autoklaven Modell 057835 von Barnstead (Barnstead/Thermolyne, Dubuque, IA) autoklaviert. Nach der Äquilibrierung auf Raumtemperatur (etwa 20°C) wurde die sterile Suspension für die Gaseinbringung verwendet.
Beispiel 12: Gaseinbringung filtrierter autoklavierter Lipide mittels Vortexieren
10 ml einer Lösung aus 1,2-Dipalmitoylphosphatidylcholin mit einer Konzentration von 25 mg/ml in 0,9%iger NaCl-Lösung, die vorher durch einen 1 μm Filter extrudiert und 20 min autoklaviert worden ist, wurden einem 50 ml Falcon-Zentrifugenröhrchen (Becton-Dickinson, Lincoln Park, New Jersey) zugesetzt. Nach der Äquilibrierung der Lipidsuspension auf Raumtemperatur (etwa 20°C) wurde die Flüssigkeit auf einem VWR Genie-2 (120 V, 0,5 A, 60 Hz) (Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY) 10 min oder für einen Zeitraum vortexiert, nach dem das Gesamtvolumen der Gas-gefüllten Liposomen mindestens zweimal oder dreimal so groß war wie das Volumen der ursprünglichen wässrigen Lipidlösung. Die Lösung am Boden des Röhrchens war nahezu völlig frei von wasserfreiem teilchenförmigen Lipid und ein großes Schaumvolumen, das Gas-gefüllte Liposomen enthielt, resultierte. Folglich beeinflußt ein vorhergehendes Autoklavieren die Vermögen der Lipidsuspension nicht, Gas-gefüllte Liposomen zu bilden. Das Autoklavieren verändert die Größe der Liposomen nicht und es vermindert nicht das Vermögen der Lipidsuspensionen, Gas-gefüllte Liposomen zu bilden.
Beispiel 13: Gaseinbringung filtrierter autoklavierter Lipide mittels Schütteln auf einem Schütteltisch
10 ml einer Lösung aus 1,2-Dipalmitoylphosphatidylcholin mit einer Konzentration von 25 mg/ml in 0,9%iger NaCl-Lösung, die vorher durch einen 1 μm Filter extrudiert und 20 min autoklaviert worden ist, wurden einem 50 ml Falcon-Zentrifugenröhrchen (Becton-Dickinson, Lincoln Park, NJ) zugesetzt. Nach der Äquilibrierung der Lipidsuspension auf Raumtemperatur (etwa 20°C) wurde das Röhrchen dann aufrecht auf einen Umlaufschüttler von VWR Scientific (VWR Scientific, Cerritos, CA) platziert und 30 min bei 300 U/min geschüttelt. Die resultierende Bewegung auf dem Schütteltisch führte zur Erzeugung Gas-gefüllter Liposomen.
Beispiel 14: Gaseinbringung filtrierter autoklavierter Lipide mittels Schütteln mit einem Farbmischer
10 ml einer Lösung aus 1,2-Dipalmitoylphosphatidylcholin mit einer Konzentration von 25 mg/ml in 0,9%iger NaCl-Lösung, die vorher durch einen 1 μm Filter extrudiert und 20 min autoklaviert worden ist, wurden einem 50 ml Falcon-Zentrifugenröhrchen (Becton-Dickinson, Lincoln Park, NJ) zugesetzt. Nach der Äquilibrierung der Lipidsuspension auf Raumtemperatur (etwa 20°C) wurde das Röhrchen innerhalb eines 3,79 Liter (1 Gallone) Haushaltsfarbbehälters immobilisiert und anschließend in einem mechanischen Farbmischer einer fünfzehnminütigen Drehbewegung unterworfen. Nach heftigem Mischen wurde das Zentrifugenröhrchen entfernt und die Bildung Gas-gefüllter Liposomen wurde festgestellt.
Beispiel 15: Gaseinbringung filtrierter autoklavierter Lipide mittels Schütteln per Hand
10 ml einer Lösung aus 1,2-Dipalmitoylphosphatidylcholin mit einer Konzentration von 25 mg/ml in 0,9%iger NaCl-Lösung, die vorher durch einen 1 μm Nuclepore- Filter extrudiert und 20 min autoklaviert worden ist, wurden einem 50 ml Falcon-Zentrifugenröhrchen (Becton-Dickinson, Lincoln Park, NJ) zugesetzt. Nach der Äquilibrierung der Lipidsuspension auf Raumtemperatur (etwa 20°C) wurde das Röhrchen 10 min kräftig mit der Hand geschüttelt. Nachdem Ende der Bewegung hatten sich Gas-gefüllte Liposomen gebildet.
Beispiel 16: Klassierungsfiltration autoklavierter Gas-gefüllter Liposomen über Kaskadenfilter oder gestapelte Filter
Gas-gefüllte Liposomen wurden gemäß Beispiel 12 aus DPPC hergestellt. Die resultierenden unfiltrierten Liposomen wurden in eine 50 ml Spritze aufgezogen und durch ein Kaskadenfiltersystem hindurchgeschickt, das aus einem "NUCLEPORE" (Costar, Pleasanton, CA) 10 μm Filter, gefolgt von einem 8 μm Filter bestand, die minimal 150 μm voneinander entfernt sind. Darüber hinaus wurde bei einer separaten Probe eine gestapelte 10 μm und 8 μm Filtrationsanordnung verwendet, bei der die beiden Filter aneinander angrenzten. Gas-gefüllte Liposomen wurden durch die Filter mit einem Druck hindurchgeschickt, der eine Filtrationsgeschwindigkeit von 2,0 ml/min erzeugte. Die filtrierten Gas-gefüllten Liposomen ergaben ein Volumen von 80 bis 90% des unfiltrierten Volumens.
Die resultierenden Gas-gefüllten Liposomen wurden zur Bestimmung ihrer Größenverteilung mit vier verschiedenen Verfahren klassiert. Die Klassierung wurde mit einer optischen Klassierungseinheit Modell 770 von Particle Sizing Systems (Santa Barbara, CA), einem optischen Axioplan-Mikroskop von Zeiss (Oberkochen, Deutschland), das über eine Schnittstelle mit einer Bildverarbeitungssoftware verbunden war (Universal Imaging, West Chester, PA) und einem Coulter-Zähler (Coulter Electronics Limited, Luton, Beds., England) durchgeführt. Wie es in 8 veranschaulicht ist, war die Größe der Gas-gefüllten Liposomen um 8 bis 10 μm einheitlicher verteilt als bei den unfiltrierten Gas-gefüllten Liposomen.
Der Fachmann erkennt mit Hilfe der vorstehenden Beschreibung zusätzlich zu den gezeigten Modifikationen der Erfindung weitere verschiedene Modifikationen. Solche Modifikationen sollen auch in den Schutzbereich der beigefügten Patentansprüche fallen.

Claims

Verfahren zur Herstellung Gas-gefüllter Lipid-Mikrokügelchen, welches das Schütteln einer wäßrigen Lösung, die ein Lipid umfaßt, in der Gegenwart eines Gases bei einer Temperatur unterhalb der Phasenumwandlungstemperatur vom Gel-Zustand zum flüssigkristallinen Zustand des Lipids umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, ausgeführt bei einem Druck oberhalb des Umgebungsdrucks.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, welches weiter das Trennen der resultierenden Gas-gefüllten Lipid-Mikrokügelchen zur diagnostischen oder therapeutischen Verwendung umfaßt.
Verfahren zur Herstellung Gas-gefüllter Liposom-Mikrokügelchen, umfassend die Schritte: (a) das Einleiten einer wäßrigen Lösung, die ein Lipid umfaßt, in ein Gefäß; (b) das Einleiten eines Gases in das Gefäß; (c) das Schütteln der wäßrigen Lipidlösung in Gegenwart des Gases, um mindestens einen Teil des Gases in die wäßrige Lösung einzubringen, wobei das Schütteln bei einer Temperatur unterhalb der Phasenumwandlungstemperatur vom Gel-Zustand zum flüssigkristallinen Zustand des Lipids mit ausreichender Intensität und Dauer durchgeführt wird, um einen Schaum, enthaltend Gas-gefülltes Liposom, über der wäßrigen Lösung herzustellen; und (d) das Extrahieren mindestens eines Teils des Schaums, enthaltend Gasgefülltes Liposom, aus dem Gefäß.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Schritt des Schüttelns der wäßrigen Lösung den Schritt des Schüttelns des Gefäßes umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, weiter umfassend den Schritt des Unterdrucksetzens des Gefäßes.
Verfahren zur Herstellung von Gas-gefüllten Liposom-Mikrokügelchen nach Anspruch 4, wobei das Gefäß ein Spritzgehäuse einer Spritze ist.