DE69233119T2 - Neue liposomale arzneimittelfreisetzungssysteme - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Arzneimittelfreisetzung und insbesondere gasgefüllte Liposomen, die unter Verwendung von Vakuumtrockengaseinbringungsverfahren hergestellt werden und gasgefüllte Liposomen, wobei mindestens 90% ohne Flüssigkeit in dem Inneren davon sind und die Liposomen ebenfalls darin eingekapselt ein Arzneimittel aufweisen. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung solcher Arzneimittel enthaltenden gasgefüllte Liposomen und Verfahren, zur Anwendung solcher Liposomen als Arzneimittel-Freisetzungssysteme.
  • Während hunderten von Jahren war der Mensch bestrebt, eine große Vielfalt von Arzneimitteln zu entwickeln, die zur Behandlung verschiedener Krankheiten und krankhafter Störungen nützlich sind. Die Entwicklung wirkungsvoller Mittel zur Freisetzung solcher Arzneimittel an ausgewählten Stellen im Körper blieb jedoch weit bei diesen Bemühungen zurück. Obwohl in diesem Bereich während den letzten zehn Jahren manches erreicht wurde, siehe zum Beispiel R. Baker, Controlled Release of Biologically Active Aqents, John Wiley & Sons (New York 1987), werden neue und/oder bessere Arzneimittel-Freisetzungssysteme gebraucht.
  • Gezielte Freisetzungsmittels sind besonders wichtig, wenn die Arzneimitteltoxizität von Belang ist. Spezielle Arzneimittel-Freisetzungssysteme dienen zur wirkungsvollen Minimierung toxischer Nebenwirkungen, erniedrigen die erforderlichen Dosierungsmengen und vermindern die Arzneimittelkosten für den Patienten. Die vorliegende Erfindung ist so konzipiert, dass sie sich auf diese und/oder andere wichtige Bedürfnisse in dem Bereich der Arzneimittelfreisetzung richtet.
  • US-A-4675310 beschreibt die Verwendung von Liganden und Phospholipidliposomen als Träger für den Transport verschiedener Gase. Für den Sauerstofftransport kann der Ligand zum Beispiel Hämoglobin sein, das in dem Liposom eingeschlossen ist.
  • US-A-4900540 beschreibt Phospholipidliposomen, die eine Gas- oder Gasvorläufer enthaltende Zusammensetzung umfassen. Die Liposomen sind als Kontrastmittel für die Ultraschallabbildung verwendbar.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Arzneimittel-Freisetzungssystem zur Verfügung, das gasgefüllte Liposomen umfaßt, wobei mindestens 90% ohne Flüssigkeit in ihrem Inneren davon sind und darin eingekapselt ein Arzneimittel aufweisen, wobei die Liposomen durch ein Vakuumtrockengaseinbringverfahren hergestellt werden, welches die Schritte umfaßt:
    • (i) das Anlegen von negativem Druck an ein Gefäß, das Liposomen mit dem darin eingekapselten Arzneimittel enthält;
    • (ii) das Inkubieren der Liposomen unter dem negativen Druck bei einer Temperatur von mehr als 0°C für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, mindestens 90 der Flüssigkeit von den Liposomen zu entfernen, und
    • (iii) das Einbringen von Gas in die Liposomen, bis Umgebungsdrucke erreicht werden, wodurch gasgefüllte Liposomen, die das Arzneimittel enthalten, erzeugt werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Arzneimittel-Freisetzungssystem zur Verfügung, das echogene gasgefüllte Lipsomen umfaßt, wobei mindestens 90% ohne Flüssigkeit in ihrem Inneren davon sind, und darin eingekapselt ein Gas und ein Arzneimittel aufweisen, wobei die Liposomen befähigt sind, veranlasst zu werden, nach der Anwendung von Ultraschall zu brechen oder das Arzneimittelfreizusetzen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittel-Freisetzungssystems zur Verfügung, das die folgenden Schritte umfaßt:
    • (i) das Anlegen von negativem Druck an ein Gefäß, das Liposomen mit einem darin eingekapselten Arzneimittel enthält,
    • (ii) das Inkubieren der Liposomen unter dem negativen Druck bei einer Temperatur von mehr als 0°C für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, mindestens 90 % der Flüssigkeit von den Liposomen zu entfernen, und
    • (iii) das Einbringen von Gas in die Liposomen, bis Umgebungsdrucke erreicht werden, wodurch gasgefüllte Liposomen, die das Arzneimittel enthalten, erzeugt werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von Arzneimittel-Freisetzungssystemen zur Verwendung in Verbindung mit Ultraschallabbildung zur Verfügung, das die folgenden Schritte umfaßt:
    • (i) das Abkühlenlassen der Liposomen mit einem darin eingekapselten Arzneimittel auf eine Temperatur von zwischen –10°C und –20°C,
    • (ii) das Einbringen der Liposome in ein Gefäß unter einem negativen Druck von zwischen 700 mm Hg bis 760 mm Hg,
    • (iii) das Erwärmenlassen der Liposomen auf eine Temperatur von zwischen 10°C und 20°C,
    • (iv) das Inkubieren der Liposomen unter dem negativen Druck während 24 bis 72 Stunden, um mindestens 90% der Flüssigkeit von den Liposomen zu entfernen, und
    • (v) das Einbringen von Gas in die Liposomen über eine Zeitdauer von 4 bis 8 Stunden, bis Umgebungsdrucke erreicht werden, während zugelassen wird, dass sich die Liposomen auf Umgebungstemperatur erwärmen.
    wobei zugelassen wird, das sie wirkungsvoll in vivo überwacht werden können. Die Liposomen der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls anfällig gegenüber Reißen nach Ultraschallanwendung auf der Peak-Resonanzfrequenz der Liposomen. Solche Eigenschaften erlauben, daß die betreffenden Lipsomen in neuartigen und unerwarteten Anwendungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Weiterhin sind die betreffenden Liposomen überraschend hoch stabil gegenüber Druck und/oder besitzen eine lange Lagerfähigkeit, wenn sie entweder trocken oder in einem flüssigen Medium suspendiert gelagert werden. Ebenfalls unerwartet ist die Fähigkeit der Liposomen, sich während des Vakuumtrockengaseinbringverfahrens mit Gas zu fül len und ihre ursprüngliche kreisförmige Gestalt wiedereinzunehmen, als vielmehr in eine Tassen-ähnliche Gestalt zusammenzufallen.
  • Diese und andere Merkmale der Erfindung und deren Vorteile werden in den Figuren und der nachstehenden Beschreibung genauer ausgeführt. In den Figuren:
  • 1 zeigt eine Vorrichtung zur Herstellung der Arzneimittel enthaltenden vakuumgetrockneten Liposomen mit eingebrachtem Gas und die das Arzneimittel enthaltenden gasgefüllten Liposomen, die im wesentlichen in ihrem Inneren ohne Flüssigkeit sind und die durch das Vakuumtrockengaseinbringverfahren hergestellt werden. 2 ist eine graphische Darstellung des dB Reflexionsvermögens gasgefüllter Liposomen, die im wesentlichen in ihrem Inneren ohne Flüssigkeit sind und die durch das Vakuumtrockengaseinbringverfahren hergestellt wurden, ohne dass irgendwelche Arzneimittel darin eingekapselt sind. Die Daten wurden durch Scannen mit einem 7,5 Megahertz Meßwandler unter Verwendung eines Acoustic ImagingTM Modell 5200 Scanner (Acoustic Imaging, Phoenix, Arizone) erhalten und wurden unter Verwendung der System-Testsoftware zur Messung des Reflexionsvermögens erzeugt. Vor Jedem Experiment wurde das System mit einem Phantom von bekannter akustischer Impedanz genormt.
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Ultraschall-Kontrastmittel, die gasgefüllte Lipsomen umfassen, die durch Vakuumtrockengaseinbringverfahren hergestellt wurden und darin eingekapselt ein Arzneimittel aufweisen (das heißt Arzneimittel enthaltend), wobei solche Liposomen manchmal hierin als Arzneimittel enthaltende Vakuum-getrocknete Liposomen mit eingebrachtem Gas bezeichnet werden. Die vorliegende Erfindung richtet sich weiterhin auf Kontrastmittel, die Arzneimittel mit gasgefüllten Lipopomen umfassen, die im wesentlichen in ihrem Inneren ohne Flüssigkeit sind.
  • Das Vakuumtrockengaseinbringverfahren, das zur Herstellung von sowohl den betreffenden durch das Vakuumtrockengaseinbringverfahren hergestellten gasgefüllten Liposomen als auch den gasgefüllten Liposomen angewandt wird, die im wesentlichen in ihrem Inneren ohne Flüssigkeit sind, betrifft das folgende Verfahren. Entsprechend dem Verfahren werden zuerst die Arzneimittel enthaltenden Liposomen unter negativen Druck (das heißt verringerter Druck oder Vakuumbedingungen) gesetzt. Als nächstes werden die Liposomen unter dem negativem Druck für eine Zeitdauer inkubiert, die ausreichend ist, um im wesentlichen die gesamte Flüssigkeit von den Liposomen zu entfernen, wodurch im wesentlichen getrocknete Liposomen resultieren. Mit Entfernen von im wesentlichen der gesamten Flüssigkeit und mit im wesentlich getrocknete Liposomen, wie diese Formulierungen hierein verwendet werden, ist gemeint, dass die Liposomen mindestens zu 90% ohne Flüssigkeit, vorzugsweise mindestens zu 95% ohne Flüssigkeit und besonders bevorzugt ungefähr zu 100% ohne Flüssigkeit sind. Obwohl die Flüssigkeit entfernt wird, bleibt das Arzneimittel mit seinem höheren Molekulargewicht in dem Liposom eingekapselt zurück. Schließlich wird ausgewähltes Gas in die Liposomen eingebracht, indem an die Liposomen das Gas angelegt wird, bis Umgebungsdrucke erreicht werden, wodurch die betreffenden Arzneimittel enthaltenden vakuumgetrockneten Liposomen mit eingebrachtem Gas der vorliegenden Erfindung und die Arzneimittel enthaltenden gasgefüllten Liposomen der Erfindung resultieren, die in ihrem Inneren im wesentlichen ohne Flüssigkeit sind. Der Ausdruck in ihrem Inneren im wesentlichen ohne Flüssigkeit bedeutet Liposomen mit einem Inneren, das mindestens zu 90% ohne Flüssigkeit, vorzugsweise zu 95% ohne Flüssigkeit und besonders bevorzugt zu 100% ohne Flüssigkeit ist.
  • Unerwarteterweise besitzen die entsprechend dem Vakuumtrockengaseinbringverfahren hergestellten Arzneimittel enthaltenden Liposomen und die Arzneimittel enthaltenden gasgefüllten Liposomen, die in ihrem Inneren im wesentlichen ohne Flüssigkeit sind, eine Anzahl überraschender aber äußerst vorteilhafter Merkmale. Die Liposomen der Erfindung zeigen ein intensives Echovermögen auf Ultraschall, werden bei Anwendung eines Peak-Resonanzfrequenz-Ultraschalls ( so wie andere Resonanzfrequenzen mit ausreichender Intensität und Dauer) brechen, sind hochstabil gegenüber Druck und/oder besitzen im allgemeinen eine lange Lagerfähigkeit, wenn sie entweder trocken oder in eine flüssigen Medium suspendiert gelagert werden.
  • Das Echovermögen der Liposomen und die Fähigkeit die Liposomen an der Peak-Resonanzfrequenz unter Verwendung von Ultraschall zu brechen, erlaubt die kontrollierte Freisetzung von Arzneimitteln in einem Bereich eines Patienten, indem die Überwachung der Liposomen nach der Verabreichung an einen Patienten zur Bestim mung des Vorhandenseins der Liposomen in einem gewünschten Bereich und das Brechen der Liposomen unter Verwendung von Ultraschall zur Freisetzung der Arzneimittel in dem Bereich gestattet wird. Die Liposomen der Erfindung besitzen vorzugsweise ein Reflexionsvemögen von mehr als 2 dB, vorzugsweise zwischen 4 dB und 20 dB. Innerhalb dieser Bereiche wird das höchste Reflexionsvermögen für Liposomen der Erfindung von den größeren Liposomen, höheren Liposomkonzentrationen und/oder bei Anwendung von höheren Ultraschallfrequenzen gezeigt. Die Liposomen der Erfindung weisen vorzugsweise eine Peak-Resonanzfrequenz von zwischen 0,5 mHz und 10 mHz auf. Natürlich wird die Peak-Resonanzfrequenz der gasgefüllten Liposomen der Erfindung in Abhängigkeit des Durchmessers und, in gewissem Ausmaß, der Elastizität der Liposomen variieren, wobei die größeren und elastischeren Liposomen eine niedrigere Resonanzfrequenz aufweisen, als die kleineren und elastischeren Liposomen.
  • Die Stabilität der Liposomen der Erfindung ist ebenfalls von großer praktischer Bedeutung. Die betreffenden Liposomen tendieren zu einer größeren Stabilität während der Lagerung als andere gasgefüllte Liposomen, die über bekannte Verfahren, wie zum Beispiel Druckbeaufschlagungs- oder andere Techniken hergestellt wurden. Zum Beispiel sind herkömmlich hergestellte gasenthaltende Liposomen 72 Stunden nach der Bildung oftmals im wesentlichen ohne Gas, wobei das Gas aus den Liposomen diffundiert ist und/oder die Liposomen zerbrochen und/oder verschmolzen sind, was zusammen zu einem Verlust des Reflexionsvermögens führt. Im Vergleich dazu weisen Arzneimittel enthaltende gasgefüllte Liposomen der vorliegenden Erfindung im allgemeinen eine Lagerfähigkeitsstabilität von mehr als drei Wochen, vorzugsweise eine Lagerfähigkeitsstabilität von mehr als vier Wochen, bevorzugter einer Lagerfähigkeitsstabilität von mehr als fünf Wochen und besonders bevorzugt eine Lagerfähigkeitsstabilität von mehr als drei Monaten und häufig eine Lagerfähigkeitsstabilität auf, die sogar viel länger ist, wie zum Beispiel über sechs Monate, zwölf Monate oder sogar über zwei Jahre.
  • Ebenfalls unerwartet ist die Fähigkeit der Liposomen sich während des Vakuumtrockengaseinbringverfahrens mit Gas zu füllen und ihre ursprünglichen kreisförmige Gestalt wieder einzunehmen, als vielmehr in eine tassenförmige Struktur zusammenzufallen, wie aus dem Stand der Technik zu erwarten wäre. Siehe zum Beispiel Crowe et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, Bd. 242, Seiten 240–247 (1985); Crowe et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, Bd. 220, Seiten 477-484 (1983); Fukuda et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 108, Seiten 2321–2377 (1986); Regen et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 102, Seiten 6638–6640 (1980).
  • Die dem Vakuumtrockengaseinbringverfahren der Erfindung unterzogenen Arzneimittel enthaltenden Liposomen können unter Verwendung einer beliebigen aus einer Vielfalt herkömmlicher Liposomenherstellungstechniken hergestellt werden, wie dem Fachmann offensichtlich sein wird. Diese Techniken umfassen Gefrier-Tau- sowie Techniken wie zum Beispiel Beschallung, Chelat-Dialyse, Homogenisierung, Lösungsmittelinfusion, Mikroemulgierung, Spontanbildung, Lösungsmittelverdampfung, französische Druckzellentechnik, kontrollierte Detergensdialyse und andere Techniken, wobei jede mit der Herstellung der Liposomen auf verschiedene Arten in einer Lösung, die das gewünschte Arzneimittel enthält, zu tun hat, so dass das Arzneimittel in dem resultierenden Liposom eingekapselt ist. Wie der Fachmann erkennen wird, können alternativ dazu die Arzneimittel in die Liposomen unter Verwendung von pH-Gradiententechniken eingebracht werden, die besonders auf Arzneimittel anwendbar sind, die bei einem speziellen pH-Wert entweder protinieren oder deprotinieren. Siehe, zum Beispiel Madden et al., Chemistry and Physics of Lipids, Bd. 53, Seiten 37–46 (1990). Die Größe der Arzneimittel enthaltenden Liposomen kann auf Wunsch vor dem Vakuumtrocknen und Gaseinbringen durch eine Vielzahl von Verfahren, einschließlich Extrusion, Filtration, Beschallung, Homogenisierung, wobei eine Laminarströmung eines flüssigen Kerns in eine unvermischbare flüssige Umhüllung eingeführt wird, und ähnliche Verfahren angepasst werden, um die resultierende liposomale Bioverteilung und Toleranz zu modulieren. Die Extrusion unter Druck durch Poren mit definierter Größe ist jedoch das bevorzugte Mittel zur Größenanpassung der Liposomen. Die vorstehenden Techniken sowie andere werden zum Beispiel in dem U.S Patent Nr. 4,728,578; in der U.K. Patentanmeldung GB 2193095 A; in dem U.S. Patent Nr. 4,728,575; dem U.S. Patent Nr. 4,737,323; in der internationalen Anmeldung PCT/US85/01161; Mayer et al., Biochimica et Biophysica Acta, Bd. 858, Seiten 161–168 (1986); Hope et al., Biochimica et Biophysica Acta, Bd. 812, Seiten 55–65 (1985); in dem U.S. Patent Nr. 4,533,254; Mayhew et al., Methods in Enzymology, Bd. 149, Seiten 64–77 (1987); Mayhew et al., Biochimica et Biophysica Acta, Bd. 755, Seiten 169–74 (1984); Cheng et al, Investigative Radiology, Bd. 22, Seiten 47–55 (1987); in der PCT/US89/05040, im U.S. Patent Nr. 4,162,282; U.S. Patent Nr. 4,310,505; U.S. Patent Nr. 4,921,706 und Liposome Technology, Gregoriadis, G., Hrsg., Bd. I, Seiten 29–31, 51–67 und 79–108 (CRC Rress Inc., Boca Raton, FL 1984) erörtert. Obwohl jede aus einer Anzahl variierender Techniken angewandt werden kann, werden die Arzneimittel enthaltenden Liposomen vorzugsweise über Mikroemulgierungstechniken hergestellt. Die durch die verschiedenen herkömmlichen Verfahren hergestellten Liposomen können dann in dem Vakuumtrockengaseinbringverfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung der Arzneimittel enthaltenden Liposomen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Die Materialien, die zur Herstellung der in dem Vakuumtrockengaseinbringverfahren der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Liposomen verwendet werden können, umfassen beliebige Materialien oder deren Kombinationen, von denen dem Fachmann bekannt ist, dass sie zum Liposomenaufbau geeignet sind. Die verwendeten Lipide können entweder natürlichen oder synthetischen Ursprungs sein. Solche Materialien umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Lipide, wie zum Beispiel Fettsäuren, Lysolipide, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Phosphatidylcholin, Phosphatidsäure, Sphingomyelin, Cholesterin, Cholesterinhemisuccinat, Tocopherolhemisuccinat, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylinositol, Lysolipide, Sphingomyelin, Glycosphingolipide, Glucolipide, Glycolipide, Sulfatide, Lipide mit Ether- und Estergebundenen Fettsäuren, polymerisierte Lipide, Diacetylphosphat, Stearylamin, Distearoylphosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Sphingomyelin, Cardiolipin, Phospholipide mit kurzkettigen Fettsäuren von 6–8 Kohlenstoffen in der Länge, synthetische Phospholipide mit asymmetrischen Acylketten (zum Beispiel mit einer Acylkette von 6 Kohlenstoffen und einer anderen Acylkette von 12 Kohlenstoften), 6-(5-Cholesten-3β-yloxy)-1-thio-β-D-galactopyranosid, Digalactosyldiglycerid, 6-(5-Cholesten-3β-yloxy)hexyl-6-amino-6-deoxy-1-thio-β-D-galactopyranosid, 6-(5-Cholesten-3β-yloxy)hexyl-6-amino-5-deoxyl-1-thio-α-D-mannopyranosid, Dibehenoylphosphatidylcholin, Dimyristoylphosphatidylcholin, Dilauroylphosphatidylcholin und Dioleoylphosphatidylcholin und/oder deren Kombinationen. Andere dem Fachmann offensichtliche verwendbare Lipide oder deren Kombinationen, die dem Geiste der vorliegenden Erfindung entsprechen, werden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfaßt. Zum Beispiel können Kohlenwasserstoffe enthaltende Lipide zum in vivo Abzielen angewandt werden, wie es in dem U.S. Patent Nr. 4,310,505 beschrie ben ist. Von besonderem Interesse zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind Lipide, die bei der Temperatur im Gelzustand (im Vergleich zum flüssigkristallinen Zustand) sind, bei der die Vakuumtrockengaseinbringung durchgeführt wird. Die Phasenübergangstemperaturen verschiedener Lipide sind für den Fachmann leicht offensichtlich und werden zum Beispiel in Liposome Technology, Gregoriadis, G., Hrsg., Bd. I, Seiten 1–18 (CRC Press, Inc. Boca Raton, FL 1984) beschrieben. Zusätzlich wurde festgestellt, dass die Einarbeitung von mindestens einer kleine Menge negativ geladenem Lipids in eine beliebige Liposomenmembran, obwohl es nicht erforderlich ist, vorteilhaft ist, um hochstabile Liposomen zur Verfügung zu stellen. Mit mindestens einer kleinen Menge ist ungefähr 1 Mol Prozent des gesamten Lipids gemeint. Geeignete negativ geladene Lipide sind für den Fachmann leicht offensichtlich und umfassen zum Beispiel Phosphatidylserin und Fettsäuren. Aus den kombinierten Gründen einer grundlegenden Fähigkeit zum Reißen der Liposomen bei Anwendung von Resonanzfrequenz-Ultraschall, Echovermögen und Stabilität im Anschluß an das Vakuumtrockengaseinbringverfahren werden besonders Liposomen bevorzugt, die von Dipalmitoylphosphatidylcholin hergestellt werden.
  • Jedes aus einer Vielzahl von Arzneimitteln kann in die Liposomen eingekapselt werden. Mit Arzneimitteln, wie hierin verwendet wird, sind Wirkstoffe gemeint, die eine vorteilhafte und/oder therapeutische Wirkung auf den Patienten aufweisen. Geeignete Arzneimittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: antineoplastische Mittel, wie zum Beispiel Platinverbindungen (zum Beispiel Spiroplatin, Cisplatin und Carboplatin), Methotrexat, Adriamycin, Mitomycin, Ansamitocin, Blemoycin, Cytosin-Arabinosin, Arabinosyl, Anenin, Mercaptopolylysin, Vincristin, Busulfan, Chlorambucil, Melphasan (zum Beispiel PAM, L-PAM oder Phenylalaninsenf), Mercaptopurin, Mitotan, Procarbazinhydrochloriddacinomycin (Actinomycin D), Daunorubicinhydrochlorid, Doxorubicinhydrochlorid, Mitomycin, Plicamycin (Mithramycin), Aminoglutethimid, Estramustinphosphatnatrium, Flutamid, Leuprolidacetat, Megestrolacetat, Tamoxifencitrat, Testolacton, Trilostan, Amsacrin (m-AMSA), Asparaginase (L-Asparaginase) Erwina asparaginase, Etoposid (VP-16), Interferon α-2a, Interferon α-2b, Teniposid (VM-26), Vinblastinsulfat (VLB), Vincristinsulfat, Bleomycin, Bleomycinsulfat, Methotrexat, Adriamycin, Cytosin-Arabinosin und Arabinosyl; biologische Reaktionsmodifikatoren, wie zum Beispiel Muramyldipeptid, Muramyltripeptid, mikrobielle Zellwandkomponenten, Lymphokine (zum Beispiel bakterielles Endotoxin, wie zum Beispiel Lipopolysaccharid, Makrophagen-Aktivierungsfaktor), Untereinheiten von Bakterien (wie zum Beispiel Mycobakterien, Corynebakterien), das synthetische Dipeptid N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin; genetisches Material, wie zum Beispiel Nukleinsäuren, RNA und DNA entweder natürlichen oder synthetischen Ursprungs, einschließlich rekombinante RNA und DNA; Antimykotika, wie zum Beispiel Ketoconazol, Nystatin, Griseofulvin, Flucytoson (5-fc), Miconazol, Amphotericin-β, Ricin und β-Lactum Antibiotika (zum Beispiel Sulfazecin); Hormone, wie zum Beispiel Wachstumshormone, Melanocyt stimulierendes Hormon, Estradiol, Beclomethasondipropionat, Bethamethason, Bethamethasonacetat und Betamethason-Natriumphosphat, Vetamethason-Dinatriumphosphat, Vetamethason-Natriumphosphat, Cortinsonacetat, Dexamethason, Dexamethasonacetat, Dexamethason-Natriumphosphat, Fluinsolid, Hydrocortison, Hydrocortisonacetat, Hydrocortisoncypionat, Hydrocortison-Natriumphosphat, Hydrocortison-Natriumsuccinat, Methylprednisolon, Methylprednisolonacetat, Methylprednisolon-Natriumsuccinat, Paramethasonacetat, Prednisolon, Prednisolonacetat, Prednisolon-Natriumphosphat, Prednisolontebutat, Prednison, Triamcinolon, Triamcinolonacetonid, Triamcinolondiacetat, Triamcinolonhexacetonid und Fludrocortisonacetat; Vitamine, wie zum Beispiel Cyanocobalamin und α-Tocopherol; Peptide, wie zum Beispiel Mangansuperoxiddimutase; Enzyme, wie zum Beispiel alkalische Phosphatase; antiallergische Mittel, wie zum Beispiel Amelexanox; Antikoagulantien, wie zum Beispiel Phenprocoumon und Heparin; Kreislaufmittel, wie zum Beispiel Propranolol; metabolische Wirkstoffe, wie zum Beispiel Glutathion; antituberkulöse Mittel, wie zum Beispiel para-Aminosalicylsäure, Isoniazid-Capreomycinsulfat-Cycloserin, Ethambutolhydrochlorid-Ethionamid, Pyrazinamid, Rifampin und Streptomycinsulfat; antivirale Mittel, wie zum Beispiel Acyclovir, Amantadinazidothymidin (AZT oder Zidovudin), Ribavirin und Vidarabinmonohydrat (Adeninarabinosid, Ara-A); antianginale Mittel, wie zum Beispiel Diltiazem, Nifedipin, Verapamil, Erythrityltetranitrat, Isosorbiddinitrat, Nitroglycerin (Glyceryltrinitrat und Pentaerythritoltetranitat; Antikoagulantien, wie zum Beispiel Phenprocoumon, Heparin; Antibiotika, wie zum Beispiel Dapson, Chloramphenicol, Neomycin, Cefaclor, Cefadroxil, Cephalexin, Cephradin Erythromycin, Clindamycin Lincomycin, Amoxicillin, Ampicillin, Bacampicillin, Carbenicillin, Cloxacillin, Cyclacillin, Picloxacillin, Hetacillin, Methicillin, Nafcillin, Oxacillin, Penicillin G, Penicillin V, Ticarcillin-Fifampin und Tetracyclin; entzündungshemmende Mittel, wie zum Beispiel Difunisal, Ibuprofen, Indomethacin, Meclofenamat, Mefenaminsäure, Naproxen, O xyphenbutazon, Phenylbutazon, Piroxicam, Culindac, Tolmetin, Aspirin und Salicylate; Antiprotozoantien, wie zum Beispiel Chloroquin, Hydroxycloroquin, Metronidazol, Chinin und Megleminantimonat; antirheumatische Mittel, wie zum Beispiel Penicillamin; Narkotika, wie zum Beispiel Paregoric; Opiate, wie zum Beispiel Codein, Heroin, Methadon, Morphin und Opium; kardiale Glycoside, wie zum Beispiel Deslanosid, Digitoxin, Digoxin, Digitalin und Digitalis; neuromuskuläre Hemmstoffe, wie zum Beispiel Atracuriumbesylat, Gallamintriethiodid, Hexafluoreniumbromid, Metocuriniodid, Pancuroniumbromid, Succinylcholinchlorid (Suxamethoniumchlorid), Tubocurarinchlorid und Vecuroniumbromid; Sedativa (Hypnosemittel), wie zum Beispiel Amobarbital, Amobarbitalnatrium, Aprobarbital, Butabarbitalnatrium, Chloralhydrat, Ethchlorvynol, Ethinamat, Flurazepamhydrochlorid, Glutethimid, Methotrimeprazinhydrochlorid, Methyprylon, Midazolamhydrochlorid, Paraldehyd, Pentobarbital, Pentobarbitalnatrium, Phenobarbitalnatrium, Secobarbitalnatrium, Talbutal, Temazepam und Triazolam; lokale Betäubungsmittel, wie zum Beispiel Bupivacainhydrochlorid, Chlorprocainhydrochlorid, Etidocainhydrochlorid, Lidocainhydrochlorid, Mepivacainhydrochlorid, Procainhydrochlorid und Tetracainhydrochlorid; allgemeine Betäubungsmittel, wie zum Beispiel Droperidol, Etomidat, Fentanylcitrat mit Droperidol, Ketaminhydrochlorid, Methohexitalnatrium und Thiopentalnatrium, und radioaktive Teilchen oder Ionen, wie zum Beispiel Strontium, Rheniumiodid und Yttrium.
  • Ähnlich können Pro-Arzneimittel in die Liposomen eingekapselt werden und sind im Umfang der Begriffe ein Arzneimittel oder mehrere Arzneimittel, wie sie hierin verwendet werden, enthalten. Pro-Arzneimittel sind in dem Fachgebiet gut bekannt und umfassen inaktive Arzneimittelvorläufer, die wirksame Arzneimittel bilden, wenn sie hoher Temperatur, Kavitation und/oder Druck in Gegenwart von Sauerstoff oder anderem ausgesetzt werden oder wenn sie von den Liposomen freigesetzt werden. Solche Pro-Arzneimittel können in dem Verfahren der Erfindung bei Anwendung von Ultraschall auf die Pro-Arzneimittel enthaltenden Liposomen mit der resultierenden Kavitation, Erwärmung Druck und/oder Freisetzung von den Liposomen aktiviert werden. Geeignete Pro-Arzneimittel sind für den Fachmann offensichtlich und sind zum Beispiel in Sinkula et al., J. Pharm. Sci., Bd. 64, Seiten 181–210 (1975) beschrieben. Pro-Arzneimittel können zum Beispiel inaktive Formen der aktiven Arzneimittel umfassen, wobei auf dem Pro-Arzneimittel eine chemische Gruppe vorhanden ist, die es inaktiv macht und/oder dem Arzneimittel Löslichkeit oder irgendeine andere Eigenschaft verleiht. In dieser Form sind die Pro-Arzneimittel im allgemeinen inaktiv, sobald die chemische Gruppe jedoch von dem Pro-Arzneimittel durch Wärme, Kavitation, Druck und/oder durch Enzyme in dem umgebenden Milieu oder anderweitig abgespalten ist, wird das aktive Arzneimittel erzeugt. Solche Pro-Arzneimittel sind sehr gut in dem Fachgebiet beschrieben und umfassen eine große Vielfalt von Arzneimittel, die an chemische Gruppen durch Bindungen gebunden sind, wie zum Beispiel Ester an kurz-, mittel- oder langkettige aliphatische Carbonate, Hemiester oder organische Phosphate, Pyrophosphate, Sulfate, Amide, Aminosäuren, Azobindungen, Carbamate, Phosphamid, Glucosiduronat, N-Acetylglucosaminid und β-Glucosid. Beispiele von Arzneimitteln mit dem Muttermolekül und der reversiblen Modifikation oder Bindung sind folgende: Convallatoxin mit Ketalen, Hydantoin mit Alkylestern, Chlorphenesin mit Glycin oder Alaninestern, Acetaminophen mit Koffeinkomplex, Acetylsalicylsäure mit THAM-Salz, Acetylsalicylsäure mit Acetamidophenylester, Naloxon mit Sulfatester, 15-Methylprostaglandin F2α mit Methylester, Procain mit Polyethylenglycol, Erythromycin mit Alkylestern, Clindamycin mit Alkylestern oder Phosphatestern, Tetracyclin mit Betainsalzen, 7-Acylaminocephalosporine mit Ring-substituierten Acyloxybenzylestern, Nandrolon mit Pheylproprionat-Decanoatestern, Estradiol mit Enoletheracetal, Methylprednisolon mit Acetatestern, Testosteron mit n-Acetylglucosaminidglucosiduronat-(Trimethylsilyl)ether, Cortisol oder Prednisolon oder Dexamethason mit 21-Phosphatestern. Pro-Arzneimittel können ebenfalls als reversible Arzneimittelderivate entworfen werden und als Modifikatoren zur Erhöhung des Arzneimitteltransports an ortsspezifische Gewebe verwendet werden. Beispiele von Muttermolekülen mit reversiblen Modifikationen oder Bindungen zur Beeinflussung des Transports an ortsspezifische Gewebe und für eine erhöhte therapeutische Wirkung umfassen Isocyanat mit Haloalkylnitroharnstoff, Testosteron mit Propionatester, Methotrexat (3-5'-Dichlormethotrexat) mit Dialkylestern, Cytosin-Arabinosid mit 5'-Acylat, Stickstoffsenf (2,2'-Dichlor-N-methyldiethylamin), Stickstoffsenf mit Aminomethyltetracyclin, Stickstoffsenf mit Cholesterin oder Estradiol oder Dehydroepiandrosteronestern und Stickstoffsenf mit Azobenzol. Wie der Fachmann erkennen würde, kann eine spezielle chemische Gruppe zur Modifikation eines gegebenen Arzneimittels so ausgewählt werden, dass sie die Aufteilung des Arzneimittels entweder in die Membran oder in den Innenraum des Liposoms beeinflusst. Die zur Bindung der chemischen Gruppe an das Arzneimittel gewählte Bindung kann so ausgewählt werden, dass sie die ge wünschte Metabolismusrate aufweist, zum Beispiel Hydrolyse im Fall von Esterbindungen in Gegenwart von Serumesterasen nach Freisetzung von den gasgefüllten Liposomen. Zusätzlich kann die spezielle chemische Gruppe so ausgewählt werden, dass sie die Bioverteilung des Arzneimittels beeinflusst, das in dem gasgefüllten Arzneimittel tragenden Lipsom der Erfindung verwendet wird, zum Beispiel N,N-Bis(2-chlorethyl)-phosphordiamidsäure mit cyclischem Phosphoramid für Eierstock-Adenocarzinome. Zusätzlich können die innerhalb der gasgefüllten Lipsome verwendeten Pro-Arzneimittel so entworfen werden, dass sie reversible Derivate enthalten, die als Modifikatoren verwendet werden, um für eine andauernde Wirksamkeit, für eine Verlängerung der Wirksamkeit oder Funktionswirkungen bei Lagerung sorgen. Zum Beispiel kann Nicotinsäure mit Dextran und Carboxymethyldextranestern, Streptomycin mit Alginsäuresalz, Dihydrostreptomycin mit Pamoatsalz, Cytarabin (Ara-C) mit 5'-Adamantoatester, Ara-Adenosin (Ara-A) mit 5-Palmitat und 5'-Benzoatestern, Amphotericin-β mit Methylestern, Testosteron mit 17-β-Alkylestern, Estradiol mit Formatester, Prostaglandin mit 2-(4-Imidazolyl)ethylaminsalz, Dopamin mit Aminosäureamiden, Chloramphenicol mit Mono- und Bis(trimethylsilyl)ethern, und Cycloguanil mit Pamoatsalz modifiziert werden. In dieser Form kann ein Depot oder Reservoir eines lang anhaltend wirkenden Arzneimittels in vivo von den gasgefüllten Pro-Arzneimittel enthaltenden Liposomen freigesetzt werden. Außerdem können Verbindungen, die allgemein thermisch labil sind, zur Erzeugung nicht toxischer radikalischer Verbindungen verwendet werden. Bevorzugt werden Verbindungen mit Azobindungen, Peroxiden und Disulfidbindungen, die bei hoher Temperatur spalten. Mit dieser Pro-Arzneimittelform werden Verbindungen mit einer Azo-, Peroxid oder Disulfidbindung durch Kavitation und/oder erhöhte Erwärmung aktiviert, was durch die Wechselwirkung der Hochenergie-Schalls mit den gasgefüllten Lipsomen verursacht wird, wobei Kaskaden freier Radikale aus diesen darin eingeschlossenen Pro-Arzneimitteln erzeugt werden. Diese Pro-Arzneimittel können aus einer grossen Vielfalt von Arzneimitteln oder Chemikalien aufgebaut sein, wie zum Beispiel Azoverbindungen, wobei die allgemeine Struktur solcher Verbindungen R-N=N-R ist, wobei R eine Kohlenwasserstoffkette ist und die Doppelbindung zwischen den zwei Stickstoffatomen unter Erzeugung freier in vivo Radikalprodukte reagieren kann. Beispielhafte Arzneimittel oder Verbindungen, die zur Erzeugung freier Radikalprodukte verwendet werden können, umfassen Azo enthaltende Verbindungen, wie zum Beispiel Azobenzol, 2,2'-Azobisisobutyronitril, Azocarbonamid, Azolitmin, Azomycin, Azose mid, Azosulfamid, Azoxybenzol, Aztreonam, Sudan III, Sulfachrysoidin, Sulfamidochrsoidin und Sulfasalazin, Disulfidbindungen enthaltenden Verbindungen, wie zum Beispiel Sulbentin, Thiamindisulfid, Thiolutin, Thiram, Peroxide enthaltende Verbindungen, wie zum Beispiel Wasserstoffperoxid und Benzoylperoxid, 2,2'-Azobis(2-amidopropan)dihydrochlorid und 2,2'-Azobis(2,4-Dimethylvaleronitril). Ein gasgefülltes Lipsome, das mit Sauerstoff gefüllt ist, sollte bei Kavitation in hohem Umfang freie Radikale erzeugen. Ebenfalls können Metallionen aus der Übergangsreihe, besonders Mangan, Eisen und Kupfer die Bildungsgeschwindigkeit reaktiver Sauerstoffzwischenprodukte aus Sauerstoff erhöhen. Durch Einkapseln von Metallionen innerhalb der Liposomen kann die in vivo Bildung freier Radikale erhöht werden. Diese Metallionen können in die Lipsomen als freie Salze, als Komplexe, zum Beispiel mit EDTA, DTPA, DOTA oder Desferrioxamin oder als Oxide der Metallionen eingebaut werden. Zusätzlich können derivatisierte Komplexe der Metallionen an die Lipidkopfgruppen gebunden werden, oder lipophile Komplexe der Ionen können in die Lipiddoppelschicht eingebaut werden. Bei Aussetzung gegenüber thermischer Stimulierung, zum Beispiel Kavitation, werden diese Metallionen dann die Bildungsgeschwindigkeit reaktiver Sauerstoffzwischenprodukte erhöhen. Weiterhin können Strahlungssensibilisatoren, wie zum Beispiel Metronidazol und Misonidazol in die gasgefüllten Liposomen zur Erzeugung freier Radikale auf thermische Stimulation hin eingebaut werden.
  • Als beispielhafte Verwendung von Pro-Arzneimitteln kann eine acylierte chemische Gruppe an ein Arzneimittel über eine Esterbindung gebunden werden, die sich in vivo leicht durch Enzymwirkung im Serum spalten würde. Das acylierte Pro-Arzneimittel wird in das gasgefüllte Liposom der Erfindung eingebaut. Die Liposomen können auch so entworfen werden, dass es eine symmetrische oder eine asymmetrische Verteilung des Arzneimittels sowohl innerhalb als auch außerhalb des Liposoms gibt. Wenn das gasgefüllte Liposom durch den Schallpuls des Ultraschalls aufplatzt, wird das von dem Liposom eingekapselte Pro-Arzneimittel dann dem Serum ausgesetzt. Dann wird die Esterbindung durch Esterasen im Serum unter Erzeugung des Arzneimittels gespalten.
  • Ähnlich kann der Ultraschall nicht nur zum Aufsprengen der gasgefüllten Liposomen verwendet werden, sondern auch zur Bewirkung thermischer Effekte, die die Ge schwindigkeit der chemischen Bindungsspaltung und die Freisetzung des Wirkungsmittels aus dem Pro-Arzneimittel erhöht.
  • Wie der Fachmann erkennen kann, kann die spezielle chemische Struktur der Arzneimittel so ausgewählt oder modifiziert werden, dass eine gewünschte Löslichkeit erreicht wird, so dass das Arzneimittel entweder im wässrigen Innenraum des Liposoms oder in der Lipidmembran eingekapselt wird. Das Membran-gebundene Arzneimittel kann eine oder mehrere Acylketten enthalten, so dass beim Sprengen der Blase oder Erhitzen oder durch Kavitation dann das acylierte Arzneimittel die Membran verlassen kann und/oder das Arzneimittel von der chemischen Acylkettengruppe abgespalten werden kann. Ähnlich können andere Arzneimittel mit einer hydrophoben Gruppe, die aromatisch ist oder von Sterolstruktur ist, zum Einbau in die Membran formuliert werden.
  • Zur Herstellung der Arzneimittel enthaltenden Liposomen und mittels einer allgemeinen Anweisung, können zum Beispiel Dipalmitoylphosphatidylcholin-Liposome hergestellt werden, indem Dipalmitoylphosphatidylcholinlipide in Phosphat-gepufferter Salzlösung oder in das einzukapselnde Arzneimittel enthaltendem Wasser suspendiert wird und die Lipide auf ungefähr 50°C, einer Temperatur, die geringfügig über 45°C, der für den Übergang der Dipalmitoylphosphatidylcholinlipide aus einem Gelzustand zu einem flüssigkristallinen Zustand erforderlichen Temperatur liegt, erhitzt werden, zur Bildung von Arzneimittel enthaltenden Liposomen. Zur Herstellung multilamellarer Vesikel mit einer ziemlich heterogenen Größenverteilung um 2 Mikrometer herum, können die Liposomen dann sanft von Hand gemischt werden, während die Liposomenlösung auf einer Temperatur von ungefähr 50°C gehalten wird. Die Temperatur wird dann auf Raumtemperatur abgesenkt und die Liposomen bleiben unversehrt. Auf Wunsch kann die Extrusion von Dipalmitoylphosphatidylcholin-Liposomen durch Polycarbonat-Filter von definierter Größe angewandt werden, um Liposomen mit einer homogeneren Größenverteilung herzustellen. Eine für diese Technik verwendbare Vorrichtung ist eine Extrudervorrichtung (Extruder DeviceTM, Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada), die mit einer Thermotrommel ausgestattet ist, so dass die Extrusion bequem oberhalb der Übergangstemperatur von Gelzustand-Flüssigkristallzustand für Lipide ausgeführt werden kann.
  • Für lipophile Arzneimittel, die in wässrigen Medien schwerlöslich sind, können solche Arzneimittel mit den Lipiden selbst, vor der Bildung der Liposomen gemischt werden. Zum Beispiel kann Amphotericin mit den getrockneten Lipiden suspendiert werden (zum Beispiel Ei-Phosphatidylcholin und Cholesterin mit einem Molverhältnis von 8 : 2 in Chloroform und Mischung mit den Lipiden). Dann wird das Chloroform verdampft (beachte, dass auch andere geeignete organische Lösungsmittel, wie zum Beispiel Ethanol oder Ether verwendet werden können) und die eine Mischung des lipophilen Arzneimittels enthaltenden getrockneten Lipide werden dann in wässrigen Medien, zum Beispiel steriles Wasser oder physiologische Salzlösung, wieder suspendiert. Dieses Verfahren kann für eine Vielfalt von lipophilen Arzneimitteln, wie zum Beispiel Corticosteroide zum Einbau lipophiler Arzneimittel in die Liposomenmembranen, verwendet werden. Die resultierenden Liposomen werden dann getrocknet, und dem Vakuumtrockengaseinbringverfahren unterzogen, wie vorstehend beschrieben ist.
  • Alternativ dazu und wiederum über eine allgemeine Anleitung können herkömmliche Gefrier-Tau-Verfahren zur Herstellung von entweder oligolamellaren oder unilamellaren Dipalmitoylphosphatidylcholin-Liposomen verwendet werden. Nach den Gefrier-Tau-Verfahren können dann Extrusionsverfahren, wie vorstehend beschrieben, mit den Liposomen durchgeführt werden.
  • Die somit hergestellten Arzneimittel enthaltenden Liposomen können dann dem Vakuumtrockengaseinbringverfahren der vorliegenden Erfindung unterzogen werden, um die Arzneimittel enthaltenden Vakuum-getrockneten Liposomen mit eingebrachtem Gas und die Arzneimittel enthaltenden gasgefüllten Liposomen der Erfindung, wobei mindestens 90% ohne Flüssigkeit in ihrem Inneren sind, herzustellen. Entsprechend dem Verfahren der Erfindung werden die Arzneimittel enthaltenden Liposomen in ein Gefäß gegeben, das für das Aussetzen der Liposomen gegenüber negativem Druck (das heißt, verringerter Druck oder Vakuumbedingungen) geeignet ist. Negativer Druck wird dann während einer Zeitdauer angewandt, die ausreichend ist, um im wesentlichen die gesamte Flüssigkeit von den Liposomen zu entfernen, wodurch im wesentlichen getrocknete Liposomen resultieren. Wie der Fachmann erkennen würde, sobald er mit der vorliegenden Offenbarung ausgestattet ist, können verschiedene negative Drucke angewandt werden, wobei der wichtige Parameter derjenige ist, dass im wesentlichen die gesamte Flüssigkeit von den Liposomen ent fernt worden ist. Im allgemeinen ist ein negativer Druck von mindestens 700 mm Hg und vorzugsweise im Bereich von 700 mm Hg und 760 mm Hg (Manometerdruck), angewandt während 24 bis 72 Stunden ausreichend, um mindestens 90% der Flüssigkeit von den Liposomen zu entfernen. Andere geeignete Drucke und Zeitdauern sind für den Fachmann im Hinblick auf die vorliegenden Offenbarungen offensichtlich.
  • Schließlich wird ein ausgewähltes Gas auf die Liposomen angewandt, um in die Liposomen Gas einzubringen, bis Umgebungsdrucke erreicht werden, wodurch die Arzneimittel enthaltenden Vakuum-getrockneten Liposomen der Erfindung mit eingebrachtem Gas und die Arzneimittel enthaltenden gasgefüllten Liposomen, die im wesentlichen ohne Flüssigkeit in ihrem Inneren sind, resultieren. Die Gaseinbringung findet vorzugsweise langsam statt, das heißt über eine Zeitdauer von mindestens 4 Stunden, besonders bevorzugt über eine Zeitdauer von zwischen 4 und 8 Stunden. Es können verschiedene bioverträgliche Gase angewandt werden. Solche Gase umfassen Luft, Stickstoff, Kohlenstoffdioxid, Sauerstoff, Argon, Xenon; Neon, Helium oder ein beliebiges und alle Kombination davon. Andere geeignete Gase werden dem Fachmann offensichtlich sein, wobei das gewählte Gas nur durch die beabsichtigte Anwendung der Liposomen eingeschränkt wird.
  • Das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung von Liposomen wird nachfolgend als das Vakuumtrockengaseinbringverfahren bezeichnet.
  • Auf Wunsch können die Liposomen gekühlt werden, bevor die Liposomen negativem Druck ausgesetzt werden, und eine solche Kühlung wird bevorzugt. Die Liposomen werden vorzugsweise auf weniger als 0°C, bevorzugter auf zwischen –10°C und –20 °C und besonders bevorzugt auf –10°C abgekühlt, bevor die Liposomen negativem Druck ausgesetzt werden. Nach dem Erreichen des gewünschten negativen Drucks, wird die Temperatur der Liposomen dann vorzugsweise auf mehr auf 0°C, bevorzugter auf zwischen 10°C und 20°C und besonders bevorzugt auf 10°C erhöht, bis im wesentlichen die gesamte Flüssigkeit von den Liposomen entfernt worden ist und der negative Druck wird zu der Zeit ausgesetzt, bei welcher eine Rückkehr der Temperatur auf Raumtemperatur gestattet wird.
  • Bei einer Abkühlung der Liposomen auf eine Temperatur unterhalb 0°C wird bevorzugt, dass das Vakuumtrockengaseinbringverfahren entweder mit Liposomen ausgeführt wird, die anfänglich in Gegenwart von Kryoschutzmitteln hergestellt worden sind, oder mit Liposomen zu denen vor der Ausführung des Vakuumtrockengaseinbringverfahrens der Erfindung Kryoschutzmittel zugegeben worden sind. Solche Kryoschutzmittel helfen, obwohl sie nicht obligatorisch zugegeben werden, die Unversehrtheit der Liposomenmembranen bei niedrigen Temperaturen zu bewahren und tragen ebenfalls zur grundlegenden Stabilität der Membranen bei. Bevorzugte Kryoschutzmittel sind Trehalose, Glycerol, Polyethylenglycol (besonders Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 400), Raffinose, Sucrose und Sorbitol, wobei Trehalose besonders bevorzugt wird.
  • Überraschenderweise wurde ebenfalls entdeckt, dass die Liposomen der Erfindung gegenüber Druckänderungen hoch stabil sind. Aufgrund dieses Merkmals kann auf Wunsch die Extrusion der Liposomen durch Filter von definierter Porengröße nach Vakuum-Trockung und Gaseinbringung durchgeführt werden, um Liposomen mit relativ homogener und definierter Porengröße zu erzeugen.
  • Zur Lagerung vor der Verwendung können die Arzneimittel enthaltenden Liposomen der vorliegenden Erfindung in einer wässrigen Lösung, wie zum Beispiel eine Salzlösung (zum Beispiel eine Phosphat-gepufterte Salzlösung), oder einfach in Wasser suspendiert werden und vorzugsweise bei einer Temperatur von zwischen 2°C und 10°C, vorzugsweise von 4°C gelagert werden. Das Wasser ist vorzugsweise steril. Besonders bevorzugt werden die Liposomen in einer hypertonischen Salzlösung (zum Beispiel 0,3 bis 0,5% NaCl) gelagert, obwohl die Salzlösung auf Wunsch isotonisch sein kann. Auf Wunsch kann die Lösung ebenfalls gepuffert sein, um für einen pH-Wert Bereich von pH-Wert 6,8 bis pH-Wert 7,4 zu sorgen. Geeignete Puffer umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Acetat, Citrat, Phosphat und Bicarbonat. In den Suspensionsmedien kann ebenfalls Dextrose enthalten sein. Die wässrige Lösung wird vorzugsweise entgast (das heißt, Entgasung unter Vakuumdruck), bevor die Liposomen darin suspendiert werden. Bakteriostatische Mittel können ebenfalls mit den Liposomen aufgenommen werden, um eine bakterielle Zersetzung bei Lagerung zu verhindern. Geeignete bakteriostatische Mittel umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Benzalkoniumchlorid, Benzethoniumchlorid, Benzoesäure, Benzylal kohol, Butylparaben, Ketylpyridiniumchlorid, Chlorobutanol, Chlorocresol, Methylparaben, Phenol, Kaliumbenzoat, Kaliumsorbat, Natriumbenzoat und Sorbinsäure. Weiterhin können ein oder mehrere Oxidatien mit den gasgefüllten Liposomen aufgenommen werden, um eine Oxidation des Lipids zu verhindern. Geeignete Antioxidatien umfassen Tocopherol, Ascorbinsäure und Ascorbylpalmitat. Liposomen, die auf die verschiedenen vorstehenden Arten hergestellt worden sind, können mindestens für mehrere Woche oder Monate gelagert werden. Alternativ dazu können die Liposomen der vorliegenden Erfindung auf Wunsch in ihrer getrockneten, nicht suspendierten Form gelagert werden und solche Liposomen haben ebenfalls eine Lagerfähigkeit, die größer ist als mehrere Wochen oder Monate. Besonders die auf die beiden Arten gelagerten Liposomen der vorliegenden Erfindung weisen im allgemeinen eine Lagerfähigkeitsstabilität von mehr als drei Wochen, vorzugsweise eine Lagerfähigkeitsstabilität von mehr als vier Wochen, bevorzugter eine Lagerfähigkeitsstabilität von mehr als fünf Wochen und besonders bevorzugt eine Lagerfähigkeitsstabilität von mehr als drei Monaten und häufig eine Lagerfähigkeitsstabilität auf, die sogar noch länger ist, wie zum Beispiel über sechs Monate, zwölf Monate oder sogar zwei Jahre.
  • In 1 ist eine bevorzugte Vorrichtung zur Vakuum-Trocknung von Liposomen und Einbringung eines Gases in die getrockneten Liposomen gezeigt. Die Vorrichtung umfaßt ein Gefäß 8 zum Aufnehmen der Arzneimittelenthaltenden Liposomen 19. Auf Wunsch kann die Vorrichtung ein Eisbad 5 umfassen, das Trockeneis 17 enthält, das das Gefäß 8 umgibt. Das Eisbad 5 und das Trockeneis 17 gestatten die Abkühlung der Liposomen auf weniger als 0°C. Eine Vakuumpumpe 1 ist mit dem Gefäß 8 über ein Rohr 15 verbunden, um einen anhaltenden negativen Druck auf das Gefäß auszuüben. In der bevorzugten Ausführungsform ist die Pumpe 1 in der Lage einen negativen Druck von mindestens 700 mm Hg und vorzugsweise einen negativen Druck im Bereich von 700 mm Hg bis 760 mm Hg (Manometerdruck) auszuüben. Ein Manometer 6 ist mit dem Rohr 15 verbunden, um eine Überwachung des auf das Gefäß 8 ausgeübten negativen Drucks zu gestatten.
  • Zur Vermeidung eines Eindringens der von den Liposomen entfernten Flüssigkeit in die Pumpe 1 ist eine Reihe von Fallen mit dem Rohr 15 verbunden, um bei der Sammlung der Flüssigkeit (und Flüssigkeitsdampf, die alle zusammengefasst hierin als Flüssigkeit bezeichnet werden), die den Liposomen entzogen wurde, zu helfen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zwei Fallen verwendet. Die erste Falle umfaßt vorzugsweise einen Kolben 7, der sich in einem Eisbad 4 mit Trockeneis 17 befindet. Die zweite Falle umfaßt vorzugsweise eine Säule 3, um die eine Rohrleitung 16 spiralförmig angeordnet ist. Die Säule 3 ist mit ihrem oberen Ende mit dem Rohr 15 und ihrem unteren Ende mit einem Ende der Rohrleitung 16 verbunden. Das andere Ende der Rohrleitung ist mit dem Rohr 15 verbunden. Wie in 1 gezeigt wird, umgibt ein Eisbad 2 mit Trockeneis 17 die Säule 3 und die Rohrleitung 16. Auf Wunsch kann Trockeneis 17 gegen flüssigen Stickstoff, flüssige Luft oder andere kryogene Materialien ersetzt werden. Die Eisbäder 2 und 4 helfen jegliche Flüssigkeit zu sammeln und jeglichen Flüssigkeitsdampf zu kondensieren, der den Liposomen entzogen wurde, um diese zur Sammlung in den Fallen aufzufangen. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden die Eisfallen 2 und 4 jeweils auf einer Temperatur von mindestens –70°C gehalten.
  • Im Rohr 15 ist stromaufwärts von dem Gefäß 8 ein Sperrhahn angebracht, um zu gestatten, dass ein ausgewähltes Gas in das Gefäß 8 und in die Liposomen 19 aus der Gasflasche 18 eingeführt werden kann.
  • Die Vorrichtung wird durch Einbringen der Arzneimittel enthaltenden Liposomen 19 in das Gefäß 8 verwendet. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Eisbad 5 mit Trockeneis 17 zur Erniedrigung der Temperatur der Liposomen auf weniger als 0°C, bevorzugter auf zwischen –10°C und –20°C und besonders bevorzugt auf –10°C verwendet. Bei geschlossenen Sperrhähnen 14 und 9 wird die Vakuumpumpe angeschaltet. Dann werden vorsichtig die Sperrhähne 10, 11, 12 und 13 geöffnet, um mittels Vakuumpumpe 1 im Gefäß 8 ein Vakuum zu erzeugen. Der Druck wird mittels eines Manometers 6 gemessen, bis ein negativer Druck von mindestens 700 mm Hg und bevorzugt im Bereich von zwischen 700 mm Hg und 760 mm Hg (Manometerdruck) erreicht wird. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kondensieren das durch das Eisbad 4 mit Trockeneis 17 gekühlte Gefäß 7 und die durch das Eisbad 2 mit Trockeneis 17 gekühlte Säule 3 und Spule 16 zusammen oder einzeln Flüssigkeitsdampf und fangen Flüssigkeit auf, die den Liposomen entzogen wurde, um zu verhindern, daß solche Flüssigkeiten und Flüssigkeitsdampf in die Vakuumpumpe 1 eindringen. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegen den Erfindung wird die Temperatur der Eisfallen 2 und 4 jeweils bei einer Temperatur von mindestens –70°C gehalten. Der gewünschte negative Druck wird im allgemeinen während mindestens 24 Stunden aufrechterhalten, während Flüssigkeit und Flüssigkeitsdampf von den Liposomen 19 im Gefäß 8 entfernt und in den Gefäßen 3 und 7 eingefroren wird. Der Druck im System wird unter Verwendung des Manometers 6 überwacht und wird im allgemeinen während 24 bis 72 Stunden aufrechterhalten, wobei zu dieser Zeit mindestens 90% der Flüssigkeit von den Liposomen entfernt worden ist. Zu diesem Zeitpunkt wird der Sperrhahn 10 langsam geschlossen und die Vakuumpumpe 1 ausgeschaltet. Dann wird der Sperrhahn 14 allmählich geöffnet und das Gas wird langsam in das System von der Gasflasche 18 durch den Sperrhahn 14 über das Rohr 15 eingeleitet, um Gas in die Arzneimittel enthaltenden Liposomen 19 im Gefäß 8 einzubringen. Die Gaseinbringung findet vorzugsweise langsam über eine Zeitdauer von mindestens 4 Stunden, besonders bevorzugt über eine Zeitdauer von zwischen 4 und 8 Stunden statt, bis das System Umgebungsdruck erreicht.
  • Die Arzneimittel enthaltenden Vakuum-getrockneten Liposomen mit eingebrachtem Gas und die Arzneimittel enthaltenden gasgefüllten Liposomen der vorliegenden Erfindung, wobei mindestens 90% ohne Flüssigkeit in ihrem Inneren sind, weisen bessere Merkmale als Arzneimittel-Freisetzungsvehikel auf. Die vorliegende Erfindung kann besonders für die kontrollierte Freisetzung von Arzneimitteln in einen Bereich eines Patienten angewandt werden, wobei dem Patienten die Arzneimittel enthaltenden Liposomen der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, die Liposomen unter Verwendung von Ultraschall zur Bestimmung des Vorhandensein der Liposomen in dem Bereich überwacht werden und die Liposomen dann unter Verwendung von Ultraschall zur Freisetzung der Arzneimittel in dem Bereich reißen. Der Patient kann jede Art von Säugetier sein, besonders bevorzugt ist er jedoch menschlich. Mit dem Ausdruck Bereich eines Patienten ist der gesamte Patient gemeint oder ein besonderes Gebiet oder Teil des Patienten. Unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung kann zum Beispiel die Arzneimittelfreisetzung im Herz eines Patienten und dem Gefäßsystem eines Patienten (das heißt, venöse oder arterielle Systeme) bewirkt werden. Die Erfindung ist ebenfalls besonders nützlich zur Freisetzung von Arzneimitteln in das Linksherz eines Patienten, ein Bereich, der vorher nicht einfach mit Arzneimittelfreisetzung erreicht wurde. Arzneimittel können ebenfalls leicht an die Leber-, Milz- und Nierenbereiche eines Patienten, sowie an andere Bereiche unter Verwendung der vorliegenden Verfahren abgegeben werden.
  • Das Brechen der Arzneimittel enthaltenden Lipsomen der Erfindung wird überraschend einfach durch Anwendung von Ultraschall einer bestimmten Frequenz auf den Bereich des Patienten, in dem die Therapie erwünscht wird, ausgeführt, nachdem die Liposomen in diesen Bereich verabreicht wurden oder auf andere Art diesen Bereich erreicht haben. Besonders wurde unerwartet festgestellt, dass bei Anwendung von Ultraschall bei einer Frequenz, die der Peak-Resonanzfrequenz der Arzneimittel enthaltenden gasgefüllten Liposomen entspricht, die Liposomen brechen und ihre Inhalte freisetzen. Die Peak-Resonanzfrequenz kann entweder in vivo oder in vitro bestimmt werden, vorzugsweise jedoch in vivo, indem die Liposomen gegenüber Ultraschall ausgesetzt werden, wobei die reflektierten Resonanzfrequenzsignale erhalten werden und das Spektrum der erhaltenen Signale zur Bestimmung des Peaks unter Verwendung herkömmlicher Mittel analysiert wird. Der so bestimmte Peak entspricht der Peak-Resonanzfrequenz (oder zweiten Harmonischen, wie er manchmal bezeichnet wird). Die gasgefüllten Liposomen werden ebenfalls brechen, wenn sie Ultraschall, der nicht der Peak-Resonanzfrequenz entspricht, ausgesetzt werden, jedoch muß die Intensität (Wattleistung) und Dauer (Zeit) höher sein, um ein Brechen der Liposomen zu verursachen. Diese höhere Energie führt zu einer stark erhöhten Aufheizung, die nicht wünschenswert sein kann. Durch Anpassung der Frequenz der Energie, so dass sie mit der Peak-Resonanzfrequenz übereinstimmt, wird der Wirkungsgrad des Brechens und Freisetzens des Arzneimittels verbessert, während eine merkliche Aufwärmung des Gewebes im allgemeinen nicht stattfindet (häufig keine Temperaturzunahme um mehr als ungefähr 2°C) und es ist insgesamt weniger Energie erforderlich. Somit ist die Anwendung von Ultraschall bei der Peak-Resonanzfrequenz, obwohl sie nicht erforderlich ist, besonders bevorzugt.
  • In der Praxis der vorliegenden Erfindung kann jede der verschiedenen Arten diagnostischer Ultraschallabbildungsvorrichtungen angewandt werden, wobei der spezielle Typ oder das Modell der Vorrichtung für das Verfahren der Erfindung nicht entscheidend ist. Geeignet sind ebenfalls Vorrichtungen, die zur Verabreichung von Ultraschall-Hyperthermie ausgelegt sind, wobei solche Vorrichtungen in den U.S. Patenten mit den Nummern 4,620,546, 4,658,828 und 4,586,512 beschrieben sind. Die Vorrichtung verwendet vorzugsweise einen Resonanzfrequenz (RF)-Spektralanalysator. Der Ultraschall wird im allgemeinen mit einer niedrigeren Intensität und Dauer, vorzugsweise bei der Peak-Resonanzfrequenz, eingeleitet, dann wird die Intensität, Zeit und/oder Resonanzfrequenz erhöht, bis das Brechen der Liposomen stattfindet.
  • Obwohl die Anwendung der verschiedenen Prinzipien für den Fachmann ohne weiteres offensichtlich ist, sobald er mit der vorliegenden Offenbarung versehen ist, wird entsprechend einer allgemeinen Anweisung, die Resonanzfrequenz für gasgefüllte Liposomen mit einem Durchmesser von 1,5 bis 2,0 Mikrometern im Bereich von ungefähr 7,5 Megahertz liegen. Durch Anpassung des Fokusbereichs an das Zentrum des Zielgewebes (zum Beispiel der Tumor) können unter Realzeit-Ultraschall die gasgefüllten Liposomen sichtbar gemacht werden und wie sie sich innerhalb des Zielgewebes ansammeln. Beispielsweise wird unter Verwendung des 7,5 Megahertz gekrümmten Flächen-Meßwandlers und Anpassung der an den Messwertwandler abgegeben Leistung auf ein Maximum und Anpassung des Fokusbereichs innerhalb des Zielgewebes, der räumliche und zeitliche Durchschnitt der Peakleistung (SPTA) mit näherungsweise 5,31 mW/cm2 in Wasser maximal sein. Diese Leistung wird etwas Freisetzung des Arzneimittels von den gasgefüllten Liposomen verursachen, jedoch kann eine viel größere Freisetzung durch Verwendung höherer Leistung ausgeführt werden. Durch Schalten des Messwandlers in den Dopplermodus sind höhere Leistungsabgaben von bis zu 2,5 Watt pro cm2 von demselben Messwandler erhältlich. Mit der im Dopplermodus arbeitenden Vorrichtung kann die Leistung an einen ausgewählten Fokusbereich innerhalb des Zielgewebes abgegeben werden und die gasgefüllten Liposomen können dazu veranlasst werden, ihre Arzneimittel freizusetzen. Wird der Messwandler so gewählt, dass er mit der Resonanzfrequenz der gasgefüllten Liposomen übereinstimmt, so wird dieses Verfahren der Arzneimittelfreisetzung sogar noch leistungsfähiger gemacht werden. Bei gasgefüllten Liposomen mit größerem Durchmesser, zum Beispiel mit einer Größe von mehr als 3 Mikrometern, kann ein Meßwandler mit niedrigerer Frequenz wirksamer für die Ausführung der Arzneimittelfreisetzung sein. Zum Beispiel kann ein Meßwandler mit einer niedrigeren Frequenz von 3,5 Megahertz (20 mm gekrümmtes Flächenmodell) ausgewählt werden, um der Resonanzfrequenz der gasgefüllten Liposomen zu entsprechen. Unter Verwendung dieses Messwandlers können 101,6 Milliwatt pro cm2 an den Fokus abgegeben werden und Umschalten in den Dopplermodus wird die Leistungsabgabe (SPTA) auf 1,02 Watt pro cm2 erhöhen. Zur Verwendung des Kavitationsphänomens für die Freisetzung und/oder Aktivierung der Arzneimittel/Pro-Arzneimittel innerhalb der gasgefüllten Liposomen können niedrigere Frequenzenergien verwendet werden, da die Kavitation wirksamer bei niedrigeren Frequenzen stattfindet. Unter Verwendung eines 0,757 Megahertz Messwandlers, der mit höheren Spannungen betrieben wird (in der Höhe von 300 Volt) wird die Kavitation von Lösungen mit gasgefüllten Liposomen bei Schwellen von ungefähr 5,2 Atmosphären stattfinden.
  • Die Liposomen der vorliegenden Erfindung können variierende Größen aufweisen, sie sind jedoch vorzugsweise in einem Größenbereich, in dem sie einen durchschnittlichen äußeren Durchmesser zwischen 30 Nanometern und 10 Mikrometern aufweisen, mit einem bevorzugten durchschnittlichen äußeren Durchmesser von ungefähr 2 Mikrometern. Wie dem Fachmann bekannt ist, beeinflusst die Liposomengröße die Bioverteilung und daher können Liposomen mit verschiedenen Größen für verschiedene Zwecke ausgewählt werden. Zum Beispiel ist für die intravaskuläre Verwendung die Liposomengröße mit dem durchschnittlichen äußeren Durchmesser im allgemeinen nicht größer als 5 Mikrometer und im allgemeinen nicht kleiner als 20 Nanometer. Um für eine Arzneimittelfreisetzung an Organe, wie zum Beispiel Leber zu sorgen und eine Differenzierung des Tumors von normalem Gewebe zu gestatten, sind kleinere Liposomen mit einem durchschnittlichen äußeren Durchmesser zwischen 30 Nanometern und 100 Nanometern nützlich. Bei den kleineren Liposomen wird der Resonanzfrequenz-Ultraschall im allgemeinen höher sein als für die größeren Liposomen.
  • Die gasgefüllten Arzneimittel enthaltenden Liposomen der vorliegenden Erfindung können mit jeder der verschiedenen Arten von Ultraschallabbildungsvorrichtungen verwendet werden, die für die Verabreichung von Ultraschall-Hyperthermien ausgelegt sind. Solche Vorrichtungen sind gut bekannt und sind in den U.S. Patenten mit den Nummern 4,620,546, 4,658,828 und 4,586,512 beschrieben und werden allgemein in der Physiotherapie und der Sportmedizin angewandt. Es wird bevorzugt, einen direkten Zugriff auf die Resonanzfrequenzdaten von den Ultraschalldaten unter Verwendung einer handelsüblichen Software zur Bestimmung der Peak- Resonanzfrequenz zu haben, als vielmehr diese Daten (zum Beispiel über Fourrier-Transformation) in zweidimensionale oder dreidimensionale Bilder umzuformatieren. Die Messwandlersonden können ebenfalls auf Wunsch extern oder implantiert sein.
  • Wie der Fachmann erkennen würde, kann die Verabreichung der Arzneimittel-Freisetzungssysteme der vorliegenden Erfindung auf verschiedene Arten ausgeführt werden, wie zum Beispiel intravaskulär, intralymphatisch, parenteral, subcutan, intramuskulär, intraperitoneal, interstitiell, hyperbar, oral oder innerhalb des Tumors, unter Verwendung einer Vielfalt von Dosierungsformen. Ein bevorzugter Weg zur Verabreichung ist intravaskulär. Zur intravaskulären Verwendung wird das Arzneimittel-Freisetzungssystem im allgemeinen intravenös injiziert, es kann jedoch ebenfalls intraarteriös injiziert werden. Die zu verabreichende verwendbare Dosierung und die Art der Verabreichung werden in Abhängigkeit vom Alter, Gewicht und des zu behandelnden Säugetiers und der beabsichtigten besonderen therapeutischen Anwendung variieren. Typischerweise wird die Dosierung mit niedrigeren Gehalten begonnen und erhöht, bis die gewünschte therapeutische Wirkung erreicht wird. Im allgemeinen werden die Arzneimittel-Freisetzungssysteme der Erfindung in Form einer wässrigen Suspension, wie zum Beispiel in Wasser oder einer Salzlösung (zum Beispiel Phosphat-gepufferte Salzlösung) verabreicht. Das Wasser ist vorzugsweise steril. Ebenfalls ist die Salzlösung vorzugsweise eine hypertonische Salzlösung (zum Beispiel 0,3 bis 0,5% NaCl), obwohl die Salzlösung auf Wunsch isotonisch sein kann. Auf Wunsch kann die Lösung ebenfalls gepuffert sein, um für einen pH-Wertbereich von pH-Wert 6,8 bis 7,4 zu sorgen. Zusätzlich kann vorzugsweise Dextrose in die Medien eingefügt werden. Die wässrige Lösung ist vorzugsweise entgast (das heißt, Entgasung unter Vakuumdruck), bevor die Liposomen darin suspendiert werden.
  • Es wird angenommen, dass die Liposomen der vorliegenden Erfindung von den Liposomen aus dem Stand der Technik in vieler Hinsicht, sich sowohl in physikalischen als auch in funktionellen Merkmalen unterscheiden. Die Liposomen der vorliegenden Erfindung sind im wesentlichen ohne Flüssigkeit in ihrem dem Inneren. Ihrer Definition nach sind Liposomen aus dem Stand der Technik durch das Vorhandensein eines wässrigen Mediums charakterisiert worden. Siehe zum Beispiel Dorland's Illustrated Medical Dictionary, S. 946, 27. Ausgabe (W. B. Saunders Company, Philadelphia 1988). Überdies zeigen die vorliegenden Liposomen ein überraschend intensives Echovermögen gegenüber Ultraschall, sie sind reißanfällig gegenüber Ultraschallanwendung auf der Peak-Resonanzfrequenz der Liposomen und besitzen eine lange Lagerbeständigkeit, was Merkmale von großem Vorteil bei der Verwendung von Liposomen als Arzneimittel-Freisetzungssysteme sind.
  • Für die Liposomen der Erfindung gibt es verschiedene andere Anwendungen jenseits von denjenigen, die hierin genau beschrieben sind. Solche zusätzlichen Verwendungen umfassen zum Beispiel Anwendungen als Hyperthermiepotentiatoren für Ultraschall und als Kontrastmittel zur Ultraschallabbildung.
  • Die vorliegende Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Beispiele 1–10 sind prophetische Beispiele, die die Herstellung, den Test und die Verwendung der Arzneimittel enthaltenden Vakuum-getrockneten Liposomen mit eingebrachtem Gas beschreiben, wobei die gasgefüllten Liposomen zu mindestens 90% ohne Flüssigkeit im Inneren davon sind. Die folgenden Beispiele sollten nicht so gestaltet sein, dass sie den Umfang der beigefügten Ansprüche einschränken.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Dipalmitoylphosphatidylcholin (1 Gramm) wird in 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung, die das Arzneimittel Adriamycin enthält, suspendiert, die Suspension wird auf ungefähr 50°C erwärmt und dann von Hand in einem Rundkolben während ungefähr 30 Minuten verwirbelt. Die Wärmequelle wird entfernt und die Suspension wird für zwei weitere Stunden verwirbelt, während man die Suspension auf Raumtemperatur unter Bildung der Arzneimittel enthaltenden Liposomen abkühlen lässt.
  • Die somit hergestellten Liposomen werden in ein Gefäß in einer Vorrichtung eingebracht, die ähnlich zu der in 1 gezeigten ist, auf ungefähr –10°C abgekühlt und dann werden sie einem hohen negativen Druck ausgesetzt. Die Temperatur der Liposomen wird dann auf ungefähr 10°C erhöht. Der hohe negative Vakuumdruck wird während ungefähr 48 Stunden aufrechterhalten. Nach 48 Stunden wird allmählich Stickstoffgas in die Kammer über eine Zeitdauer von ungefähr 4 Stunden eingebracht und nach dieser Zeitdauer geht der Druck auf Umgebungsdruck zurück. Die resultierenden Arzneimittel enthaltenden Vakuum-getrockneten Liposomen mit eingebrachtem Gas, wobei die gasgefüllten Liposomen im wesentlichen ohne Flüssigkeit in dem Inneren davon sind, werden dann in 10 cm3 Phosphat-gepufferter Salzlösung suspendiert und bei ungefähr 4°C ungefähr drei Monate lang gelagert.
  • Beispiel 2
  • Für den ultrasonographischen Test der Liposomen von Beispiel 1 wird eine Probe dieser Liposomen von 250 mg in 300 cm3 entgaster Phosphat-gepufferter Salzlösung (das heißt, Entgasung unter Vakuumdruck) suspendiert. Die Liposomen werden dann in vitro in variierenden Zeitabschnitten mit einem 7,5 mHz Messwandler unter Verwendung eines Acoustic Imaging Model 5200 Scanners gescannt (Acoustic Imaging, Phoenix, AZ) und unter Anwendung der System-Testsoftware wird das dB Reflexionsvermögens gemessen. Das System wird vor dem Testen der. Liposomen mit einem Phantom von bekannter akustischer Impedanz kalibriert. Das gute dB Reflexionsvermögen der Liposomen wird gezeigt.
  • Beispiel 3
  • Dipalmitoylphosphatidylcholin (1 Gramm) und die kryoschützende Trehalose (1 Gramm) werden in 10 ml Phosphat-gepufterter Salzlösung, die das Arzneimittel Amphotericin-B enthält, suspendiert, die Suspension wird auf ungefähr 50°C erwärmt und dann von Hand in einem Rundkolben während ungefähr 30 Minuten verwirbelt. Die Wärmequelle wird entfernt und die Suspension wird für weitere zwei Stunden verwirbelt, während man die Suspension auf Raumtemperatur unter Bildung von Liposomen abkühlen lässt. Die somit hergestellten Liposomen werden dann Vakuumgetrocknet und Gas wird eingebracht, wobei im wesentlichen die in Beispiel 1 gezeigten Arbeitsgänge befolgt werden, woraus die Arzneimittel enthaltenden Vakuumgetrockneten Liposomen mit eingebrachtem Gas resultieren, wobei die gasgefüllten Liosomen im wesentlichen ohne Flüssigkeit in dem inneren davon sind. Die Liposomen werden dann in 10 cm3 Phosphat-gepufferter Salzlösung suspendiert und dann bei ungefähr 4°C mehrere Wochen lang gelagert.
  • Beispiel 4
  • Für den ultrasonographischen Test der Liposomen von Beispiel 3 werden im wesentlichen die Arbeitsgänge von Beispiel 2 befolgt. Das gute dB Reflexionsvermögen der Liposomen wird gezeigt.
  • Beispiel 5
  • Dipalmitoylphosphatidylcholin (1 Gramm) wird in 10 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung suspendiert, die das Arzneimittel Cytosin-Arabinosin enthält, die Suspension wird auf ungefähr 50°C erwärmt und dann von Hand in einem Rundkolben während ungefähr 30 Minuten verwirbelt. Die Suspension wird dann 5 Extrusionszyklen durch eine Extrusionsvorrichtung unterzogen, die mit einer Thermotrommel ummantelt ist (Extruder DeviceTM, Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada), sowohl mit als auch ohne herkömmlicher Gefrier-Tau-Behandlung vor der Extrusion, während die Temperatur auf ungefähr 50°C gehalten wird. Die Wärmequelle wird entfernt und die Suspension wird für weitere zwei Stunden verwirbelt, während man die Suspension auf Raumtemperatur unter Bildung von Liposomen abkühlen lässt.
  • Die somit hergestellten Liposomen werden dann Vakuum-getrocknet und Gas wird eingebracht, wobei im wesentlichen die in Beispiel 1 gezeigten Arbeitsgänge befolgt werden, woraus die Arzneimittel enthaltenden Vakuum-getrockneten Liposomen mit eingebrachtem Gas resultieren, wobei die gasgefüllten Liposomen im wesentlichen ohne Flüssigkeit in dem inneren davon sind. Die Liposomen werden dann in 10 cm3 Phosphat-gepufferter Salzlösung suspendiert und dann bei ungefähr 4°C mehrere Wochen lang gelagert.
  • Beispiel 6
  • Für den ultrasonographischen Test der Liposomen von Beispiel 5 werden im wesentlichen die Arbeitsgänge von Beispiel 2 befolgt. Das gute dB Reflexionsvermögen der Liposomen wird gezeigt.
  • Beispiel 7
  • Zum Testen der Stabilität der Arzneimittel enthaltenden Liposomen der Erfindung wird die Liposomensuspension von Beispiel 1 fünfmal mit einem Druck von ungefähr 600 psi durch 2 Mikrometer Polycarbonat-Filter in einer Extrudervorrichtung (Extruder DeviceTM, Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada) gegeben. Nach der Extrusionsbehandlung werden die Liposomen ultrasonsographisch untersucht, wie in Beispiel 2 beschrieben ist. Überraschenderweise bewahren die Liposomen sogar nach Extrusion unter hohem Druck im wesentlichen ihr Echovermögen.
  • Beispiel 8
  • Die Liposomen von Beispiel 1 werden durch Ultraschall unter Verwendung von Messwandlerfrequenzen gescannt, die von 3 bis 7,5 mHz variieren. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass bei höherer Ultraschallfrequenz das Echovermögen schneller abnimmt, was eine mit den höheren Frequenzen verbundene relativ hohe Resonanzfrequenz und höhere Energie widerspiegelt.
  • Beispiel 9
  • Einem Krebspatienten werden intravenös Arzneimittel enthaltende Vakuumgetrocknete Liposomen mit eingebrachtem Gas verabreicht, wobei die gasgefüllten Liposomen im wesentlichen ohne Flüssigkeit in dem Inneren davon sind. Das in den Liposomen enthaltende Arzneimittel ist Adriamycin. Bei der Verabreichung der intravenösen Injektion wird der Tumor ultrasonographisch und über ein automatisiertes Softwareprogramm gescannt und die Resonanzfrequenz der Liposomen wird bestimmt. Dann wird die Ultraschallenergie bei der Peak-Resonanzfrequenz der Liposomen in den Tumor fokussiert. Die Ultraschallenergiemenge ist ungenügend, um irgendeine merkliche Aufwärmung des Gewebes zu verursachen (das heißt, keine Temperaturveränderung um mehr als 2°C), jedoch reicht die Energie zum Aufplatzen der Liposomen und zum Freisetzen des Adriamycins an der Tumorstelle aus. Bei diesem Vorgehen wird eine lokale Arzneimittelfreisetzung unter Verwendung der Liposomen mit Ultraschall ausgeführt.
  • Beispiel 10
  • In einen Patienten mit schwerer örtlich begrenzter Pilzinfektion werden Arzneimittel enthaltende Vakuum-getrocknete Liposomen mit eingebrachtem Gas intravenös injiziert, wobei die gasgefüllten Liposomen im wesentlichen ohne Flüssigkeit in dem Inneren davon sind, und Ultraschall wird auf eine Art verwendet, die im wesentlichen ähnlich zu derjenigen in Beispiel 9 beschriebenen ist, um die lokale Arzneimittelfreisetzung auszuführen. Das Arzneimittel Amphotericin-B, das die Liposomen enthalten, wird wirksam an die Stelle der Infektion abgegeben.
  • Verschiedene Modifikationen der Erfindung innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche zusätzlich zu denjenigen Modifikationen, die hier gezeigt und beschrieben sind, sind für den Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung offensichtlich.

Claims (20)

  1. Arzneimittel-Freisetzungssystem, welches gasgefüllte Liposomen umfaßt, wobei mindestens 90% ohne Flüssigkeit in dem Inneren davon sind und darin eingekapselt ein Arzneimittel aufweisen, wobei die Liposomen durch ein Vakuumtrockengaseinbringverfahren hergestellt werden, welches die Schritte umfaßt (i) das Anlegen von negativem Druck an ein Gefäß, welches Liposomen mit dem darin eingekapselten Arzneimittel enthält, (ii) das Inkubieren der Liposomen unter dem negativen Druck bei einer Temperatur von oberhalb 0°C für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, mindestens 90% der Flüssigkeit von den Liposomen zu entfernen, und (iii) das Einbringen von Gas in die Liposomen, bis Umgebungsdrücke erreicht werden, wodurch gasgefüllte Liposomen, die das Arzneimittel enthalten, erzeugt werden.
  2. Arzneimittel-Freisetzungssystem, welches echogene, gasgefüllte Liposomen umfasst, wobei mindestens 90% ohne Flüssigkeit in dem Inneren davon ein Gas und ein Arzneimittel darin eingekapselt aufweisen, wobei die Liposomen befähigt sind, veranlaßt zu werden, nach der Anwendung von Ultraschall zu brechen oder das Arzneimittel freizusetzen.
  3. Arzneimittelfreisetzungssystem nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die gasgefüllten Liposomen Lipidmaterialien, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fettsäuren, Lysolipiden, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Phosphatidylcholin, Phosphatidsäure, Sphingomyelin, Cholesterin, Cholesterinhemisuc cinat, Tocopherolhemisuccinat, Phosphatidyl-Ethanolamin, Phosphatidylinositol, Lysolipiden, Glycosphingolipiden, Glucolipiden, Glycolipiden, Sulfatiden, Lipiden mit Ether- und Ester-gebundenen Fettsäuren und polymerisierten Lipiden, umfassen.
  4. Arzneimittel-Freisetzungssystem nach Anspruch 2, wobei die gasgefüllten Liposomen Dipalmitoylphosphatidylcholin umfassen.
  5. Arzneimittel-Freisetzungssystem nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die gasgefüllten Liposomen mit einem Gas, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Luft, Stickstoff, Kohlendioxid, Sauerstoff, Argon, Xenon, Helium und Neon, gefüllt sind.
  6. Arzneimittel-Freisetzungssystem nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die gasgefüllten Liposomen in einem wässrigen Medium suspendiert gelagert werden.
  7. Arzneimittel-Freisetzungssystem nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei die gasgefüllten Liposomen trocken gelagert werden.
  8. Arzneimittel-Freisetzungssystem nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die gasgefüllten Liposomen eine Stabilität von mehr als drei Wochen aufweisen.
  9. Arzneimittel-Freisetzungssystem nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die gasgefüllten Liposomen ein Reflexionsvermögen von größer als etwa 2 dB haben.
  10. Arzneimittel-Freisetzungssystem nach Anspruch 9, wobei die gasgefüllten Liposomen ein Reflexionsvermögen zwischen 2 dB und 20 dB aufweisen.
  11. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittel-Freisetzungssystems, welches die folgenden Schritte umfaßt (i) das Anlegen von negativem Druck an ein Gefäß, welches Liposomen mit einem Arzneimittel darin eingekapselt enthält, (ii) das Inkubieren der Liposomen unter dem negativen Druck bei einer Temperatur von oberhalb 0°C für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, mindestens 90% der Flüssigkeit von den Liposomen zu entfernen, und (iii) das Einbringen von Gas in die Liposomen, bis Umgebungsdrücke erreicht werden, wodurch gasgefüllte Liposomen, die das Arzneimittel enthalten, erzeugt werden.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, welches weiter das Abkühlenlassen der Liposomen vor und während Schritt (i) auf eine Temperatur von zwischen –10°C und –20°C, das Erwärmenlassen der Liposomen während Schritt (ii) auf eine Temperatur von zwischen 10°C und 20°C und das Erwärmenlassen der Liposomen während Schritt (iii) auf Umgebungstemperaturen umfaßt.
  13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei der negative Druck zwischen 700 mm Hg bis 760 mm Hg beträgt und für 24 bis 72 Stunden angelegt wird.
  14. Verfahren nach Anspruch 11, 12 oder 13, wobei das Gas in die Liposomen über eine Zeitdauer von 4 bis 8 Stunden eingebracht wird.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, welches weiter nach Schritt (iii) das Extrudieren der Liposomen durch mindestens einen Filter einer ausgewählten Porengröße umfaßt.
  16. Verfahren zur Herstellung von Arzneimittel-Freisetzungssystemen zur Verwendung in Verbindung mit Ultraschallabbildung, welches die folgenden Schritte umfaßt (i) das Abkühlenlassen der Liposomen mit einem Arzneimittel darin eingekapselt auf eine Temperatur von zwischen –10°C und –20°C, (ii) das Anordnen der Liposome in ein Gefäß unter einem negativen Druck von zwischen 93,3 kPa (700 mm Hg) bis 101,3 kPa (760 mm Hg), (iii) das Erwärmenlassen der Liposomen auf eine Temperatur von zwischen 10°C und 20°C, (iv) das Inkubieren der Liposomen unter dem negativen Druck für 24 bis 72 Stunden, um mindestens 90% der Flüssigkeit aus den Liposomen zu entfernen, und (v) das Einbringen von Gas in die Liposomen über eine Zeitdauer von 4 bis 8 Stunden, bis Umgebungsdrücke erreicht werden, während zugelassen wird, daß sich die Liposomen auf Umgebungstemperatur erwärmen.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 16, wobei das Gas aus der Gruppe, bestehend aus Luft, Stickstoff, Kohlendioxid, Sauerstoff, Argon, Xenon, Neon und Helium, ausgewählt ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 16, welches weiter nach Schritt (iv) das Extrudieren der Liposomen durch mindestens einen Filter einer ausgewählten Porengröße umfaßt.
  19. Verwendung eines Arzneimittel-Freisetzungssystems nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung bei der Verabreichung eines Arzneimittels einem inneren Körperbereich eines Patienten, wobei die Gegenwart der Liposomen in dem Bereich unter Verwendung von Ultraschall überwacht wird, und das Arzneimittel aus den Liposomen in dem Bereich durch Reißen der Liposomen unter Verwendung von Ultraschall freigesetzt wird.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei das Arzneimittel dem Linksherz eines Patienten verabreicht wird.
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