JPH06508277A - 生物の組織及び体液に局在治療性熱を供給するためのガス充填リポソーム組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ガス充填リポソームを使用して生物の組織及び体液に局在化された治療上の熱の 供給方法 関連出願 本出願は、１９８９年１２月２２日付提出の米国出願第４５５．７０７号の一部 継続出願に続く、１９９０年８月２０日付提出された係属中の米国出願第５６９ ，８２８号の一部継続出願と１９９０年９月１１日付提出された係属中の米国出 願第５８１，０２７号の一部継続出願であり、それらの各記載事項は引用するこ とによりその全体が本明細書の内水発明は、生物の組織及び体液を加熱するため の超音波エネルギーの使用に、そして更に詳細には、組織及び体液の選択的加熱 を容易にするための超音波と組み合わせた過温相乗作用剤、例えば真空乾燥ガス 注入方法によって製造されたガス充填リポソーム、及び／またはその内部に液体 が実質的にないガス充填リポソームに関する。

先行技術の記述 種々の炎症性のそして関節炎の状態を処置するための熱の有用性は長く知られて きた。しかしながら、これらの並びにその他の治療の目的のための、例えば腫瘍 の処置における、このような熱を発生させるための超音波の使用は、比較的最近 開発された。

炎症及び関節炎の処置が関係する場合には、超音波で誘発された熱の使用は、冒 された部位への血液の流れを増し、結果として種々の有益な効果をもたらす役割 を果たす。更にまた、超音波エネルギーが腫瘍に供給される時には、腫瘍組織の 温度が、通常の組織におけるよりも一般的には高い速度で上昇する。この温度が 約４３℃よりも高くなると、腫瘍の細胞が死に始め、すべてがうまく行く場合に は、腫瘍は実質的に消滅する。生物の組織及び体液の超音波誘発された熱処置は 、当該技術においては適温超音波として知られている。

過温超音波技術の非侵入性は、その利点の１つである。それにもかかわらず、過 温超音波を用いる際には、ある種の注意をしなければならない。詳細には、回り の標的ではない組織に対する熱で誘発された損傷を回避する試みとして、超音波 エネルギーを処置される領域だけに焦点を当てるために注意深くなければならな い。腫瘍の処置においては、例えば、約４３℃を越える温度に到達する時には、 回りの通常の組織に対する損傷が特別な心配事となる。かくして、標的ではない 組織を過熱することのこの心配は、過温超音波の使用に関して限定を課する。こ のような治療の処置は、所望の組織及び体液を標的化する、そしてそれらの標的 化された組織中で発生される熱を最大にする方法を工夫することができる場合に は、明らかにもっと効果的にそしてもっと広く用いられるであろう。

本発明は、標的化された組織及び体の体液の選択的加熱を促進することができる 薬剤を供給することによって過温超音波の有効性及び利用性を改善することに向 けられる。

置される組織または体液に真空乾燥ガス注入方法によって製造された、ガスで満 たされたリポソームを含有−して成る治療上効果的な量の過温相乗作用剤を投与 すること、及び次にその組織または体液に超音波を付与することを含んで成る方 法に向けられる。

本発明はまた、生物の組織及び体液を熱処置するための方法であって、処置され る組織または体液にその内部に液体が実質的にない、ガス充填リポソームを含有 して成る治療上効果的な量の適温相乗作用剤を投与すること、及び次にその組織 または体液に超音波を付与することを含んで成る方法に向けられる。

本発明の相乗作用剤を使用することによって、過湿超音波は、腫瘍、炎症及び関 節炎並びにその他の種々の状態のためのより良い、より選択的なそしてより効果 的な治療の方法となる。

図面の簡単な説明 図１は、真空乾燥ガス注入方法によって製造された、真空乾燥されたガス注入さ れたリポソーム、及びその内部に液体が実質的にない、ガス充填リポソームを製 造するための本発明による装置を示す。

図２は、真空乾燥ガス注入方法によって製造された真空乾燥されたガス注入され たリポソーム及びその内部に液体が実質的にない、ガスで満たされたリポソーム のｄＢ反射率のグラフ図である。このデータは、Ａｃｏｕｓｔｉｃ　Ｉｍａｇｉ ｎｇ（商標）モデル５２００走査機（Ａｃｏｕｓｔｆｃ　Ｉｍａｇｉｎｇ、フエ ニ７クス、アリシナ）を使用して７．５メガヘルツの変換器によって走査するこ とによって得られ、そして反射率を測定するためのシステムテストソフトウェア を使用することによって作成された。このシステムは、各々の実験に先立って既 知の音響のインピーダンスによって標準化した。

発明の詳細な説明 本発明は、生物の組織及び体液を熱処置するための方法であって、処置される組 織または体液に治療上効果的な量の過温相乗作用剤を投与すること、及び次に前 記組織または体液に超音波を付与することを含んで成る方法に向けられる。

本明細書中で述べられろ過温相乗作用剤は、真空乾燥ガス注入方法によって製造 された、ガス充填リポソーム、及び／またはその内部に液体が実質的にないガス 充填リポソームを含有して成る。

真空乾燥ガス注入方法によって製造された、ガス充填リポソームと、その内部に 液体が実質的にない、ガス充填リポソームとの両方を製造するために用いること ができる真空乾燥ガス注入方法は、以下の方法を意図する。第一に、この方法に 従って、リポソームを除圧（即ち、減圧または真空状態）下に置く。次に、リポ ソームを、リポソームから実質的にすべての液体を除去し、それによって実質的 に乾燥されたリポソームを生成させるのに十分な時間、その除圧下でインキュベ ートする。実質的にすべての液体の除去とは、そして実質的に乾燥されたリポソ ームとは、これらの文言が本明細書中で使用される時には、リポソームは液体が 少なくとも約９０％ない、好ましくは液体が少なくとも約９５％ない、最も好ま しくは液体がほぼ１００％ないことを意味する。最後に、周囲圧力に到達するま でリポソームにガスを付与することによってリポソームに選ばれたガスを注入し 、かくして本発明の主題の真空乾燥されたガス注入されたリポソーム、及びその 内部に液体が実質的にない、本発明のガス充填リポソームを生成させる。本明細 書中で使用される時には、その内部中に液体が実質的にないとは、液体が少な（ とも約９０％ない、好ましくは液体が少な（とも約９５％ない、最も好ましくは 液体がほぼ１００％ないことを意味する。

予想外にも、真空乾燥ガス注入方法に従って製造されたリポソーム、及びその内 部に液体が実質的にない、ガス充填リポソームは、多数の驚くべきしかし高度に 有益な特徴を有する。本発明のリポソームは、超音波に対する強い反響性を示し 、超音波に対する取り巻（組織及び／または体液の良好な加熱を結果としてもた らし、圧力に対して高度に安定であり、及び／または乾燥状態若しくは液体媒体 中に懸濁された状態のどちらかで貯蔵される時に長い貯蔵寿命を有する。

リポソームの反響性は、患者への投与の後で所望の部位中のリポソームの存在を 測定するリポソームの監視を可能にする。取り巻（部位の加熱を結果としてもた らすリポソームの能力は、本発明の治療用途にとって明らかに重要である。

リポソームの安定性もまた、大きな実用上の重要である。本発明のリポソームは 、既知の手順例えば加圧化またはその他の技術によって製造された、その他のガ ス充填リポソームよりも、貯蔵の間大きな安定性を有する傾向がある。例えば、 生成の７２時間後では、従来のやり方で製造されたリポソームは、しばしば本質 的にガスがなく、ガスがリポソームから拡散してしまったか及び／またはリポソ ームが破裂及び／または融解してしまって、結果として加熱潜在力の付随の損失 がもたらされる。

これと比較して、本発明のガス充填リポソームは、一般的に約３週間より長い貯 蔵寿命安定性、好ましくは約４週間より長い貯蔵寿命安定性、更に好ましくは約 ５週間より長い貯蔵寿命安定性、なお更に好ましくは約３カ月より長い貯蔵寿命 安定性、そしてしばしばもっとずっと長い、例えば６力月、１２力月、または２ 年をさえ越える貯蔵寿命安定性を有する。

また、ガスで満たされそして、先行技術から予期されるようにカップの形の構造 につぶれるよりもむしろそれらの元の円の形を取り戻す、真空乾燥ガス注入方法 の間のリポソームの能力は予想外である。例えば、Ｃｒｏｗｅら、Ａｒｃｈｉｖ ｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２４２ 巻、２４０〜２４７頁（１９８５）、Ｃｒｏｗｅら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２２０巻、４７７ 〜４８４頁（１９８３）　、Ｆｕｋｕｄａら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、 １０８巻、２３２１〜２３２７頁（１９８６）及びＲｅｇａｎら、Ｊ、　Ａｍ、 Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　、１０２巻、６６３８〜６６４０頁（１９８０）を参照さ れたし。

本発明の真空乾燥ガス注入方法にかけられるリポソームは、当業者には明らかで あろう種々の慣用のリポソーム調製技術の任意の１つを使用して製造することが できる。これらの技術は、凍結融解、並びに超音波処理、キレート透析、均質化 、溶媒注入（ｉｎｆｕｓ　１ｏｎ）　、マイクロ乳化、自発形成、溶媒蒸発、フ レンチプレス細胞技法、制御された洗浄剤透析及びその他のような技術を含む。

所望の場合には、リポソームのサイズは、真空乾燥及びガス注入に先立って、生 成するリポソームの生物分布及びクリアランスを調節するために、種々の手順例 えば押出、濾過、超音波処理、液体の非混和性シース中に導入された液体のコア の層流を用いる均質化、及び類似の方法によって調節することができる。

規定されたサイズの細孔を通しての圧力下での押出が、リポソームのサイズを調 節する好ましい手段である一上述の技術、並びにその他のものは、例えば、米国 特許第４．７２８，５７８号、英国特許出願ＧＢ２１９３０９５Ａ、米国特許第 ４，７２８，５７５号、米国特許第４，７３７．３２３号、国際出願ＰＣＴ／Ｕ Ｓ８５１０１１６１、Ｍａｙｅｒら、６５頁（１９８５Ｌ米国特許第４．５３３ ，２５４号、Ｍａｙｈｅｗら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 １４９巻、６４〜７７頁（１９８７）　、Ｍａｙｈｅｗら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃ ａ　ｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、７５５巻、１６９〜７４頁（１９８ ４）　、Ｃｈｅｎｇら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｒａｄｉｏｌ。

鉦、２２巻、４７〜５５頁（１９８７）　、ＰＣＴ／ＵＳ８９１０５０４０、米 国特許第４，１６２，２８２号、米国特許第４．　３１０．　５０５号、米国特 許第４．９２１，７０６号並びにＬｉｐｏｓｏｍｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇ ｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｇｓ編集、１巻、２９〜３７．５１〜６７及び７９〜１ ０８頁（ＣＲＣ出版社、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、１９８４）中で議論され ている。上述の特許、刊行物及び特許出願の各々の開示事項は、それらの全体が 引用によって本明細書中に組み込まれる。多数の種々の技術の任意のものを用い ることができるけれども、好ましくは、リポソームはマイクロ乳化技術によって 製造される。種々の慣用の手順によって製造されたリポソームは、次に、本発明 のリポソームを製造するために、本発明の真空乾燥ガス注入方法において用いる ことができる。

本発明の真空乾燥ガス注入方法において用いられるべきリポソームを製造する際 に利用することができる物質は、リポソーム合成のために適切であるとして当業 者に知られている任意の物質またはそれらの組み合わせを含む。使用される脂質 は、天然または合成のどちらの起源のものでも良い。このような物質は、脂質例 えば脂肪酸、リソ脂質、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジル コリン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、コレステロール、コレステロ ールヘミスクシネート、トコフェロールヘミスクシネート、ホスファチジルエタ ノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リソ脂質、スフィンゴミエリン、 グリコスフィンゴ脂質、グルコ脂質、グリコ脂質、スルファチド、エーテル及び エステル結合された脂肪酸を有する脂質、重合された脂質、リン酸ジアセチル、 ステアリルアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリ ン、スフィンゴミエリン、カルシオリピン、長さが６〜８の炭素の短鎖脂肪酸を 含むリン脂質、非対称アシル連鎖を含む（例えば、６の炭素の一つのアシル連鎖 及び１２の炭素のもう一つのアシル連鎖を含む）合成リン脂質、６−（５−コー ステン−３β−イロキシ）−１−千オーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、ジガラク トシルジグリセリド、６−　（５−コーステン−３β−イロキシ）へキシル−６ −アミノ−６−デオキシ−１−チオーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−（５− コーステン−３β−イロキシ）へキシル−６−アミノ−６−デオキシルー１−チ オーα−Ｄ−マンノピラノシド、ジベヘノイルホスファチジルコリン、シミリス トイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、並びにジオ レオイルホスファチジルコリン、並びに／またはこれらの組み合わせを含むが、 それらに限定されない。本発明の精神を保持する当業者に明らかなその他の有用 な脂質またはそれらの組み合わせもまた、本発明によって包含される。例えば、 米国特許第４．３１０，５０５号中に述べられたように、脂質を有する炭水化物 を生体内標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）のために用いて良い。本発明における使 用のために特に興味あるものは、真空乾燥ガス注入が行われる温度でゲル状態（ 液状結晶性状態と比較して）にある脂質である。種々の脂質の相転移温度は、当 業者には容易に明らかであろうし、そして、例えば、その開示が全体として引用 によって本明細書中に組み込まれる、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＳＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ。

Ｇ１編集、１巻、１〜１８頁（ＣＲＣ出版社、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ。

ＦＬ　１９８４）中に述べられている。加えて、任意のリポソーム膜中への少な くとも小量の負に荷電された脂質の組み入れは、必要ではないけれども、高度に 安定なリポソームを供給するために有益である。少なくとも小量とは、全脂質の 約１モル％を意味する。適切な負に荷電された脂質は、当業者には容易に明らか であろうし、そして、例えばホスファチジルセリン及び脂肪酸を含む。真空乾燥 ガス注入方法の後の究極の高体温相乗作用、反響性及び安定性の合わせられた理 由のために最も好ましいのは、ジパルミトイルホスファチジルコリンから製造さ れたリポソームである。

一般的なガイダンスのために、ジパルミトイルホスファチジルコリンリポソーム は、ジパルミトイルホスファチジルコリン脂質をリン酸塩で緩衝された食塩水ま たは水の中に懸濁させること、及びジパルミトイルホスファチジルコリン脂質が ゲル状態から液状結晶性状態へ転移してリポソームを形成するために必要とされ る４５℃の温度より少し高い温度である約５０℃に脂質を加熱することによって 製造することができる。

約２ミクロンのむしろ不均一なサイズ分布の多重層小胞を製造するためには、リ ポソームを、次に、リポソーム溶液を約５０℃の温度で保持しながら手によって ゆっくりと混合して良い。次に、温度を室温に下げ、そしてリポソームをそのま まに留める。規定されたサイズのポリカーボネートフィルターを通してのジパル ミトイルホスファチジルコリンリポソームの押出は、所望の場合には、さらに均 一なサイズ分布のリポソームを作るために用いることができる。この技術のため の有用な装置は、押出が脂質に関するゲル状態−液状結晶性転移温度より上で好 都合に達成できるように熱バレルを備えた押出装置（Ｅｘｔｒｕｄｅｒ　Ｄｅｖ ｉｃｅ　（商標）、Ｌｉｐｅｘ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、バンク−バー、カ ナダ）である。

その代わりに、そして再び一般的なガイダンスのために、慣用の凍結融解手順を 、オリゴ層（ｏｌｉｇｏｌａｍｅｌ　１ａｒ）または単層のどちらかのジパルミ トイルホスファチジルコリンリポソームを製造するために使用して良い。凍結融 解手順の後で、次に、上で述べたような押出手順をリポソームに関して実施して 良い。

このようにして製造されたリポソームは、次に、本発明の真空乾燥されたガス注 入リポソーム、及びその内部に液体が実質的にないガス充填リポソームを製造す るために、本発明の真空乾燥ガス注入方法にかけることができる。本発明の方法 に従って、リポソームを、リポソームに陰圧（即ち、減圧または真空条件）をか けるために適切な容器中に入れる。

次に、リポソームから実質的にすべての液体を除去し、それによって実質的に乾 燥されたリポソームを生成させるのに十分な時間除圧をかける。

当業者が、一度本発明の開示を与見られると、認識するであろうように、種々の 除圧を用いることができ、そして重要なパラメーターは実質的にすべての液体が リポソームから除去されてしまったことである。一般的に、約２４〜約７２時間 かけられる、少な（とも約７００ｍｍＨｇそして好ましくは約７００ｍｍＨｇ〜 約７６０ｍｍＨｇ（ゲージ圧力）の範囲の除圧が、リポソームから実質的にすべ ての液体を除去するのに十分である。その他の適切な圧力及び時間の期間は、本 明細書中の開示に鑑みて、当業者には明らかであろう。

最後に、周囲圧力に到達するまで選ばれたガスをリポソームにかけてリポソーム にガスを注入し、それによつて本発明の真空乾燥されたガスが注入されたリポソ ームを、そしてその内部に液体が実質的にない、ガス充填リポソームを生成させ る。好ましくは、ガス注入は、ゆっくりと、即ち、少なくとも約４時間の時間の 期間にわたって、最も好ましくは約４〜約８時間の時間の期間にわたって行われ る。種々の生物適合性ガスを用いることができる。このようなガスは、空気、窒 素、二酸化炭素、酸素、アルゴン、キセノン、ネオン、ヘリウム、またはこれら の任意のそしてすべての組み合わせを含む。その他の適切なガスは当業者には明 らかであろう。選ばれるガスはリポソームの提案された用途によってのみ限定さ れる。

リポソームの製造のための上で述べた方法は、本明細書中で以後真空乾燥ガス注 入方法と呼ばれる。

所望の場合には、リポソームに除圧をかけるのに先立ってリポソームを冷却する が、このような冷却が好ましい。好ましくは、リポソームに除圧をかけるのに先 立って、リポソームを、０℃未満に、更に好ましくは約−１０℃〜約−２０℃に 、そして最も好ましくは一１０°Ｃに冷却する。所望の除圧に達すると、次にリ ポソーム温度を、実質的にすべての液体がリポソームから除去されてしまうまで 、好ましくは０℃より高（、更に好ましくは約１０’Ｃ〜約２０℃に、そして最 も好ましくは１０℃に上げ、そして除圧を打ち切り、その時点で次に温度を室温 に復帰せしめる。

リポソームを０℃未満の温度に冷却する場合には、真空乾燥ガス注入方法を、凍 結保護剤（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ）の存在下で初めから製造されたリ ポソームか、または本発明の真空乾燥ガス注入方法を実施するのに先立って凍結 保護剤を添加されたリポソームのどちらかに関して実施することが好ましい。こ のような凍結保護剤は、必ずしも添加されはしないが、低温でリポソーム膜の実 体を維持するのを助け、そしてまた膜の究極の安定性を加える。好ましい凍結保 護剤は、トレハロース、グリセロール、ポリエチレングリコール（殊に分子量４ ００のポリエチレングリコール）、ラフィノース、スクロース及びソルビトール であり、そしてトレハロースが特に好ましい。

本発明のリポソームは圧力の変化に対して高度に安定であることもまた驚くべき ことに発見された。この特徴のために、真空乾燥及びガス注入の後の規定された 細孔サイズのフィルターを通してのリポソームの押出を、比較的均一なそして規 定された細孔サイズのリポソームを作り出すために、所望の場合には、実施する ことができる。

使用に先立つ貯蔵のために、本発明のリポソームを、水性溶液例えば食塩水溶液 （例えば、リン酸塩で緩衝された食塩水溶液）、または単に水の中に懸濁させ、 そして好ましくは約り℃〜約１０°Ｃの温度で、好ましくは約４℃で貯蔵して良 い。好ましくは、水は無菌である。最も好ましくは、リポソームを高張食塩水溶 液（例えば、約０．３〜約０．５％のＮａＣ］）中に貯蔵するが、所望の場合に は、食塩水溶液は等強性で良い。水溶液はまた、所望の場合には、ｐＨ６，８〜 ｐＨ７，４のｐＨ範囲を与えるように緩衝されていて良い。適切な緩衝剤は、酢 酸塩、クエン酸塩、リン酸塩及び重炭酸塩を含むが、これらに限定されない。デ キストロースもまた懸濁媒体中に含めて良い。好ましくは、水性溶液は、その中 にリポソームを懸濁させるのに先立って脱ガス（即ち、真空圧力下で脱ガス）さ れる。細菌発育阻止剤もまた、貯蔵に際しての細菌による劣化を防止するために リポソームと共に含まれて良い。適切な細菌発育阻止剤は、ベンザルコニウムク ロリド、ベンゼトニウムクロリド、安息香酸、ベンジルアルコール、ブチルパラ ベン、セチルピリジニウムクロリド、クロロブタノール、クロロクレゾール、メ チルパラベン、フェノール、安息香酸カリウム、カリウムソルベーｔ−（ｓｏｒ ｂａｔｅ）、安息香酸ナトリウム及びソルビン酸を含むがこれらに限定されない 。更に、１以上の酸化防止剤も、脂質の酸化を防止するためにガス充填リポソー ムと共に含まれて良い。適切な酸化防止剤は、トコフェロール、アスコルビン酸 及びパルミチン酸アスコル、ビルを含む。種々の上述のやり方で製造されたリポ ソームは、少な（とも数週または数カ月の間貯蔵することができる。その代わり に、本発明のリポソームは、所望の場合には、それらの乾燥された、懸濁されな い形で貯蔵しても良く、そしてこのようなリポソームもまた数週または数カ月よ り長い貯蔵寿命を有する。

詳細には、いずれのやり方で貯蔵されても、本発明のリポソームは、一般的に約 ３週間より長い貯蔵寿命安定性、好ましくは約４週間より長い貯蔵寿命安定性、 更に好ましくは約５週間より長い貯蔵寿命安定性、なお更に好ましくは約３カ月 より長い貯蔵寿命安定性、そしてしばしばもっとずっと長い、例えば６力月、１ ２力月または２年をさえ越える貯蔵寿命安定性を有する。

本発明のもう一つの面として、本発明の真空乾燥されたガス注入リポソーム、及 びその内部に液体が実質的にない、ガス充填リポソームを製造するために有用な 装置もまた提供される。詳細には、リポソームを真空乾燥しそして乾燥されたリ ポソーム中にガスを注入するための好ましい装置を図１中に示す。この装置はリ ポソーム１９を入れるための容器８を含む。所望の場合には、装置は容器８を取 り巻くドライアイス１７を含む氷浴５を含んで良い。氷浴５及びドライアイス１ ７はリポソームを０℃未満に冷却せしめる。真空ポンプ１が、容器に維持された （ＳＵｓｔａｉｎｅｄ）除圧をかけるために導管１５を経由して容器８に接続さ れている。好ましい態様においては、ポンプ１は、少なくとも７００ｍｍＨｇの 負圧、そして好ましくは約７００ｍｍＨｇ〜約７６０ｍｍＨｇ（ゲージ圧力）の 範囲の除圧をかけることができる。マノメーター６が、容器８にかけられた除圧 の監視を可能にするために導管１５に接続されている。

リポソームから除去された液体がポンプ１に入るのを防止するために、一連のト ラップを導管１５に接続してリポソームから引き出された液体（及び液体蒸気、 本明細書中ではすべてを集合的に液体と呼ぶ）を収集するのを助ける。好ましい 態様においては、２つのトラップを利用する。

第一のトラップは、好ましくは、ドライアイス１７を含む氷浴４中に配置された フラスコから成る。第二のトラップは、好ましくは、その回りにチューブ１６が 螺旋状に配置されているカラム３から成る。カラム３は、そのトップ端で導管１ ５にそしてその底端でチューブ１６の一端に接続されている。チューブ１６の他 端は導管１５に接続されている。図１中に示すように、ドライアイス１７を含む 氷浴２がカラム３及びチューブ１６を取り囲む。所望の場合には、ドライアイス １７を、液体窒素、液体空気またはその他の低温貯蔵用の物質で置き換えること ができる。

氷浴２及び４は、トラップ中への収集のために、リポソームから引き出された液 体を収集しそして液体蒸気を凝縮するのを助ける。本発明の好ましい実施態様に おいては、アイストラップ２及び４は、各々少なくとも約−７０℃の温度で維持 される。

ストップコック１４が、選ばれたガスがガスボトル１８から容器８中にそしてリ ポソーム１９中に導入せしめられるように容器８の上流で導管１５中に配置され ている。

本発明の装置はリポソーム１９を容器８中に入れることによって利用される。好 ましい実施態様においては、ドライアイス１７を含む氷浴５が、リポソームの温 度を０℃未満に、更に好ましくは約−１０℃〜約−２０℃に、そして最も好まし くは一１０℃に低下させるために使用される。ストップコック１４及び９を閉じ ておいて、真空ポンプ１を機動する。次に、ストップコック１０．１１．１２及 び１３を注意深く開いて、真空ポンプ１によって容器８中に真空を作り出す。少 な（とも約７００ｍｍＨｇのそして好ましくは約７００ｍｍＨｇ〜約７６０ｍｍ Ｈｇの負圧が達成されるまでマノメーター６によって圧力を測定する。本発明の 好ましい実施態様においては、ドライアイス１７を含む氷浴４によって冷却され た容器７、並びにドライアイス１７を含む氷浴２によって冷却されたカラム３及 びコイル１６が、−緒にまたは別々にリポソームから引き出された液体蒸気を凝 縮しそして液体をトラップして、その結果このような液体及び液体蒸気が真空ポ ンプ１に入るのを防止する。本発明の好ましい態様においては、アイストラップ ２及び４の温度は、各々、少なくとも約−７０°Ｃの温度で維持される。所望の 除圧は一般的に少な（とも２４時間維持され、その結果液体及び液体蒸気は容器 ８中のリポソーム１９から除去されそして容器３及び７中で凍結される。システ ム内の圧力を、マノメータ−６を使用して監視しそして一般的に約２４〜約７２ 時間維持するが、この時間には実質的にすべての脂質がリポソームから除去され てしまっている。この時点で、ストップコック１０をゆっくりと閉じそして真空 ポンプ１を停止する。次に、ストップコック１４を徐々に開き、そしてガスをガ スボトル１８からストップコック１４を通して導管１５を経由してゆっくりとシ ステム中に導入し、容器８中のリポソーム１９中にガスを注入する。好ましくは 、このガス注入は、システムが周囲圧力に到達するまで、少なくとも約４時間の 時間の期間にわたって、最も好ましくは約４〜約８時間の時間の期間にわたって ゆっ（りと行われる。

本発明の真空乾燥されたガス注入されたリポソーム、及びその内部に液体が実質 的にない、ガスで満たされたリポソームは、高体温相乗剤としての使用のための 優れた特徴を有する。本発明のリポソームは、超音波での取り巻く組織及び／若 しくは体液に良好な加熱を与え、圧力に対して高度に安定であり、並びに／また は乾燥して若しくは液体媒体中に懸濁させてのどちらかで貯蔵される時に一般的 に長い貯蔵寿命を有する。

使用においては、本発明の高体温相乗剤が生物の組織にまたは生物の体液に投与 され、次にこの生物の物体に超音波が付与される。本発明の方法は、腫瘍組織、 筋肉組織または血液体液のような生物の物体に関して用いる時に特に有用である 。

用いられるリポソームは種々のサイズのもので良いが、好ましくは、それらが約 ３０ナノメートル〜約１０ミクロンの平均外径を有するサイズ範囲のものであり 、そして好ましい平均外径は約２ミクロンである。

当業者には知られているように、リポソームのサイズは生物分布に影響を与え、 そしてそれ故種々の目的のために異なるサイズのリポソームが選ばれる。例えば 、脈管内の使用のためには、リポソームのサイズは、平均外径で、一般的に約５ ミクロンより大きくはな（、そして約３０ナノメートルより小さくはない。脈管 以外の使用のためには、所望の場合には、もっと大きいリポソーム、例えば約２ 〜約１０ミクロン平均外径を用いて良い。

用いられる脂質は、特定の治療の使用を最適化し、毒性を最小にしそして生成物 の貯蔵寿命を最大にするために選ぶことができる。ステロール例えばコレステロ ールを含むまたは含まない飽和または不飽和のどちらかのフォスファチジルコリ ンから成る中性リポソームは、ガスをトラップする胆管内過温相乗作用剤として 極めて良（機能する。網内系（ＲＥＳ）のような細胞による取り込みを改善する ために、負に帯電した脂質例えばフォスファチジルグリセロール、フォスファチ ジルセリンまたは類似の物質を添加する。更により大きなリポソーム安定性のた めには、リポソームを重合可能な脂質を使用して重合させることができ、または リポソームの表面をポリマー例えばポリエチレングリコールによってコートして その結果小胞の表面を血清蛋白質がら保護することができ、またはガングリオシ ド例えばＧＭＩを脂質マトリックス内に組み入れることができる。リポソームは また、結合されたレセプターまたは抗体と共に製造して特定の細胞のタイプ例え ば腫瘍に対するそれらの標的化を容品にして良い。それらの高体温相乗作用及び 安定性の理由のに最も好ましいのは、ジパルミトイルホスファチジルコリンから 製造されたリポソームである。

用法が生体内である場合には、投与は、種々のやり方で、例えば脈管内に、リン パ管内に、非経口的に、皮下に、筋肉内に、腹膜内に、間質的に、高圧的に（ｈ ｙｐｅｒｂａｒｉｃａｌｌｙ）、経口的にまたは腫瘍内に種々の投薬形を使用し て実施して良く、使用される投与の特別なルート及び投薬形はめられる治療の使 用のタイプ、及び用いられる特定の相乗剤に依存する。例えば、主要で主な動脈 の供給（ｓｕｐｐｌｙ）例えば腎臓に関する腫瘍においては、これらの過温相乗 作用剤は動脈内に投与して良い。典型的には、投薬量を比較的低いレベルで始め そして所望の温度増加効果が達成されるまで増す。一般的には、本発明の造影剤 は、水または食塩水溶液（例えば、リン酸塩で緩衝された食塩水）中のような水 性懸濁液の形で投与される。好ましくは、水は無菌である。

また好ましくは食塩水溶液は高張性食塩水溶液（例えば、約０．３〜約０、　５ ％のＮａＣＩ）であるが、所望の場合には、食塩水溶液は等強性で良い。また所 望の場合には、溶液を緩衝してｐＨ６，８〜ｐＨ７，４の範囲のｐＨを与えても 良い。加えて、デキストロースを好ましくは媒体中に含めて良い。好ましくは、 水性溶液を、その中にリポソームを懸濁させるのに先立って脱ガス（即ち、真空 圧力下で脱ガス）する。

生体内用法に関しては、患者は任意のタイプの哺乳動物で良いが、最も好ましく はヒトである。本発明ｄ方法は、腫瘍、種々の炎症の状態及び関節炎の処置にお いて、殊に腫瘍の処置において特に有用である。真空乾燥ガス注入方法によって 製造された、ガスで満たされたリポソーム及びその内部中に液体が実質的にない 、ガスで満たされたリポソームは、漏れやすい（ｌｅａｋｙ）毛細血管及び病気 の組織からの遅延された流出のために、腫瘍中に、特に脳中に集積する。同様に 、腫瘍管が漏れやすい体のその他の部位においても、過温相乗作用剤は集積する であろう。

本発明の適温相乗作用剤は、単独で、お互いに組み合わせて、または他の治療及 び／若しくは診断剤と組み合わせ使用して良い。腫瘍治療の応用においては、例 えば、過温相乗作用剤は、種々の化学療法剤と組み合わせて投与して良い。

超音波イメージング装置の種々のタイプの任意のものを本発明の実施において用 いることができ、そして装置の特別なタイプまたはモデルは本発明の方法にとっ て重要ではない。しかしながら、好ましくは、超音波過温剤（ｈｙｐｅｒｔｈｅ ｒｍｉａ）を投与するために特別に設計された装置が好ましい。このような装置 は、それらの各々の開示事項がそれらの全体において引用によって本明細書中に 組み込まれる米国特許第４．６２０，５４６号、第４，６５８．８２８号及び第 ４．　５８６．　５１２号中に述べられている。超音波過温剤を投与しそして共 鳴周波数（ＲＦ）スペクトル分析機を組み入れるために設計された装置の使用が 特に好ましい。

出願人は何ら特別な働きの理論に限定されることを意図しないけれども、本発明 の方法において用いられる過温相乗作用剤は、以下の科学的仮定のためにそれら の優れた結果を有すると信じられる。

超音波エネルギーは、組織を通って伝えられても、反射されても、または吸収さ れてもいずれでも良い。本発明の相乗作用剤は、その中に相乗作用剤が存在する 生物の組織または体液内の音のエネルギーの吸収を増す役割を果たし、これは増 加した加熱、それによって超音波過温剤の治療の有効性を増すことを結果として もたらす。

音の吸収は、高い程度の超音波不均一性を有する音響の部位において増加される と信じられる。より高い程度の不均一性を有する柔らかな組織及び体液は、音響 的により均一である組織または体液よりも高い率で音を吸収するであろう。音が 、取り巻く媒体とは異なる音響インピーダンスを有する界面に遭遇する時には、 音の反響の増加及び音の吸収の増加の両方が存在すると信じられる。音の吸収の 程度は、界面を構成する２つの物質の間の音響インピーダンスの間の差が増加す るにつれて上昇すると信じられる。本発明の相乗作用剤は、相乗作用剤と何らか の取り巻く液体及び組織との間の高い音響インピーダンスの差を与える。

強い音のエネルギーはまたキャビテーションを引き起こすと信じられそして、キ ャビテーションが起きる時には、今度はこれが強い局部的な加熱を引き起こすと 考えられる。ガスの泡はキャビテーション閾値を低下させる、即ち、超音波処理 の間のキャビテーションの方法を加速すると信じられる。

本発明の相乗作用剤は、相乗作用剤と取り巻く液体及び組織との間の高い音響イ ンピーダンスの差を与え、そしてキャビテーション閾値を減らすので、主題の相 乗作用剤は、取り巻く組織及び体液中への超音波エネルギーの吸収の速度を増し そしてそのエネルギーの局部の熱への転化を行う作用をすることができる。付加 的に、ガスの低い熱伝導度が局部の熱放散を減らす役割を果たすことができ、そ の結果加熱の速度の増加と最後の平衡温度の増加との両方が存在する。

本発明の相乗作用剤は、音響の不均一性を増しそして腫瘍及び組織中のキャビテ ーション核を発生させ、それによって超音波過温における加熱の相乗作用剤とし て作用する役割を果たすことができる。ガスは隣の組織及び隣の体液との音響イ ンピーダンスのミスマツチを創り出すので、ガスは取り巻く組織及び体液中の熱 の中への音の吸収及びエネルギーの転化を増す作用をする。

本発明のリポソームは、物理的及び機能的特徴の両方における多数の態様におい て先行技術のリポソームとは異なると信じられる。例えば、本発明のリポソーム は、その内部中に液体が実質的にない。定義によって、先行技術におけるリポソ ームは、水性媒体の存在によって特徴付けられてきた。例えば、Ｄｏｒｌａｎｄ ’ｓ　ＩｌｌｕｓｔｒａｔｅｄＭｅｄｉｃａｌ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、９４６ 頁、第２７版（Ｗ、　Ｂ。

５ａｕｎｄｅｒｓ社、フィラデルフィア　１９８８）を参照されたし。

更にまた、本発明のリポソームは、驚くべきことに、超音波での取り巻く組織及 び／または体液の良好な加熱を結果としてもたらし、そして本発明の高体温相乗 剤応用にとって明らかに重要な特徴である、長い貯蔵寿命を有する。

本明細書中で詳細に述べられた用途を越える、本発明のリポソームのための種々 のその他の用途が存在する。このような付加的な用途は、例えば、薬配達ビヒク ルのようなそして超音波イメージングのための造影剤のような応用を含む。この ような付加的な用途及びその他の関連する主題は、“新規なリポソームドラッグ デリバリ−システム”及び“ガス充填リポソーム及び超音波造影剤としてのそれ らの使用”という標題の本発明と同時に出願された出願人の特許出願中に述べら れそして特許請求されている。なおこれらの特許出願の各々の開示事項は、その 全体が引用によって本明細書中に組み込まれる。

以下の実施例は、単に本発明の例示でありそして何ら本発明の範囲を限定すると 考えられてはならない。これらの実施例及びそれらの等個物は、これまでの開示 及び添付する請求の範囲の光の下で当業者には一層明らかになるであろう。

実施例１〜８は、本発明の、真空乾燥されたガス注入リポソームの製造及びテス トを述べている事実上の実施例であり、ガスで満たされたリポソームはその内部 に液体が実質的にない。実施例９〜１３は、特定の条件下で本発明がどのように 働くかの例示であることを意味する予言的な実施例である。

実施例１ ジパルミトイルホスファチジルコリン（１グラム）をｌＱｍｌのリン酸塩で緩衝 された食塩水中に懸濁させ、この懸濁液を約５０℃に加熱し、そして次に約３０ 分問丸底フラスコ中で手によって渦を巻かせた。熱源を除去し、そして懸濁液を 室温に冷却せしめながら更に２時間渦を巻かせて、リポソームを生成させた。

このようにして製造されたリポソームを、図１中に示したものと類似の装置中の 容器に入れ、約−１０℃に冷却し、そして次に高い負の真空圧力をかけた。次に 、リポソームの温度を約１０°Ｃに上げた。高い負の真空圧力を約４８時間維持 した。約４８時間後に、約４時間の期間にわたって室の中に窒素を徐々に注入し 、この時間の後で圧力を周囲圧力に戻した。生成した真空乾燥されたガス注入さ れたリポソーム（ガスで満　。

たされたリポソームはその内部中に何ら液体が実質的にない）を、次に、１０Ｃ Ｃのリン酸塩で緩衝された食塩水中に懸濁させ、そして約４℃で約３カ月貯蔵し た。

実施例２ 実施例１のリポソームを超音波検査的にテストするために、これらのリポソーム の２５０ｍｇのサンプルを、３００ｃｃの脱ガスされた（即ち、真空圧力下で脱 ガスされた）リン酸塩で緩衝された食塩水中に懸濁させた。次に、これらのリポ ソームを、Ａｃｏｕｓｔｉｃ　Ｉｍａｇｉｎｇ　モデル　５２００　走査機（Ａ ｃｏｕｓｔｉｃ　Ｉｍａｇｉｎｇ。

フェニックス、ＡＺ）を使用しモしてｄＢ反射率を測定するためのシステムソフ トウェアを用いる７、５ｍＨｚの変換器によって種々の時間間隔で走査した。こ のシステムはリポソームをテストするのに先立って既知の音響インピーダンスの 陰影によって標準化した。ｄＢ反射率を示すグラフを図２中に与える。

実施例３ ジパルミトイルホスファチジルコリン（１グラム）及び凍結予防保護剤トレハロ ース（１グラム）を１０ｍ１のリン酸塩で緩衝された食塩水中に懸濁させ、この 懸濁液を約５０℃に加熱し、そして次に約３０分問丸底フラスコ中で手によって 渦を巻かせた。熱源を除去し、そして懸濁液を室温に冷却せしめながら更に約２ 時間渦を巻かせて、リポソームを生成させた。

次に、このようにして製造されたリポソームを、実施例１中で示した手順に実質 的に従って真空乾燥しそしてガスを注入して、真空乾燥されたガス注入リポソー ムを生成させたが、ガス充填リポソームはその内部に何らの液体も実質的に存在 しなかった。次にこれらのリポソームを１０ｃｃのリン酸塩で緩衝された食塩水 中に懸濁させ、そして次に約４°Ｃで数週間貯蔵した。

実施例４ 実施例３のリポソームを超音波検査的にテストするために、実施例２の手順に実 質的に従った。これらのリポソームのｄＢ反射率は、実施例２中で報告したｄＢ 反射率と類似であった。

実施例５ ジパルミトイルホスファチジルコリン（１グラム）をｌＱｍｌのリン酸塩で緩衝 された食塩水中に懸濁させ、この懸濁液を約５０℃に加熱し、そして次に約３０ 分問丸底フラスコ中で手によって渦を巻かせた。次に、この懸濁液を、約５０℃ で温度を維持しながら、押出に先立って慣用のの凍結融解処理をしてそしてしな いでの両方で、熱バレルによって覆われた押出装置（Ｅｘｔｒｕｄｅｒ　Ｄｅｖ ｉｃｅ　（商標）、ＬｉｐｅｘＢｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、バンク−バー、カナ ダ）による５サイクルの押出を施した。熱源を除去し、そして懸濁液を室温に冷 却せしめながら更に約２時間渦を巻かせて、リポソームを生成させた。

次に、このようにして製造されたリポソームを、実施例１中で示した手順に実質 的に従って真空乾燥しそしてガス注入して、真空乾燥されたガス注入されたリポ ソームを生成させたが、ガスで満たされたリポソームはその内部中に何ら液体が 実質的になかった。次にこれらのリポソームを１０ＣＣのリン酸塩で緩衝された 食塩水中に懸濁させ、そして次に約４℃で数週間貯蔵した。

実施例６ 実施例５のリポソームを超音波検査的にテストするために、実施例２の手順に実 質的に従った。これらのリポソームのｄＢ反射率は、実施例２中で報告したｄＢ 反射率と類似であった。

実施例７ 本発明のリポソームの安定性をテストするために、実施例１のリポソーム懸濁液 を、約６００ｐｓ　ｉの圧力で５回、押出装置（Ｅｘｔｒｕｄｅｒ　Ｄｅｖｉｃ ｅ　（商標）、Ｌｉｐｅｘ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ。

バンク−バー、カナダ）中の２ミクロンのポリカーボネートフィルターを通過さ せた。押出処理の後で、実施例２中で述べたようにして、リポソームを超音波検 査的に検討した。驚くべきことに、高い圧力下での押出の後でさえ、本発明のリ ポソームはそれらの反響性を実質的に保留した。実施例８ 実施例１のリポソームを、３〜７．５ｍＨｚで変わる変換器周波数を使用する超 音波によって走査した。結果は、超音波の周波数が高ければ高いほど、反響性は それだけ急速に衰え、これは比較的高い共鳴周波数及びより高い周波数に伴うよ り高いエネルギーを反映することを示した。

以下の実施例、実施例９〜１３は、予言的実施例である。

実施例９ 癌を有する患者に、真空乾燥ガス注入方法によって製造された、ガスで満たされ たリポソームのある投薬量を投与する。これらのリポソームは、その内部中に液 体が実質的にない。腫瘍中のリポソームの集積は、超音波検査的に証明される。

次に、集中させた（Ｆｏｃｕｓｅｄ）超音波高体温剤を腫瘍及びその中のリポソ ームに投与する。腫瘍は、リポソ−ムなしで超音波過温作用剤を使用する処置と 比較して増加した加熱の速度を有する。

実施例１０ 超音波過温作用剤を投与しそしてＲＦスペクトル分析計を組み入れるために設計 された超音波装置を用いた。真空乾燥ガス注入方法によって製造された、ガスで 満たされたリポソーム（これらのリポソームはその内部中に液体が実質的にない ）を静脈内に供給した後で、患者の病巣中のＲＦ倍信号超音波過温作用剤ＲＦス ペクトル分析計によって監視する。

たとえガスで満たされたリポソームの濃度が超音波検査的に像の上で可視化する には薄すぎる場合でも、ＲＦスペクトル分析計はＲＦスペクトルのピークにおけ る変化を検出する。ＲＦスペクトル中のピークは、ガスで満たされたリポソーム の調和振動の周波数を反映する。このデータは、超音波過温装置のオペレーター が、超音波エネルギーの付与をガスで満たされたリポソームの最大の病巣的濃度 と一致するように調節し、そして過温か進行するにつれてガス充填リポソームの 消失を評価することを可能にする。共鳴周波数の評価はまた、オペレーターが周 波数、振幅、期間及びパルス反復率を泡の増大効果を通して腫瘍を加熱するのに 最大に効果的であるように調節することを可能にする。更に、病巣内のガス充填 リポソームの存在は、オペレーターが病気の組織を通る血液流れ、即ち腫瘍から の熱の流出の速度を決定する際の大きな価値ある情報を評価することを可能にす る。血液流れに関する情報は、リアルタイムの超音波の下での像の単純な主観的 な評価からか、またはガスで満たされたリポソームの共鳴周波数を反映するＲＦ スペクトルにおけるピークの積分による定量的評価によってのどちらかで得るこ とができる。

実施例１１ 真空乾燥ガス注入方法によって製造された、ガス充填リポソーム（これらのリポ ソームはその内部に液体が実質的になくそして酸素ガスを包み込んでいる）を癌 を有する患者に静脈内投与する。超音波過温を高エネルギー超音波のパルスによ って実施すると、キャビテーションが泡の場所で起きる。酸素は、腫瘍組織を破 壊するのを助けるフリーラジカルの生成の速度を増す。

実施例１２ 癌を有する患者中に、真空乾燥ガス注入方法によって製造された、ガス充填リポ ソーム（これらのリポソームはその内部に液体が実質的にな（そして酸素を包み 込んでいる）を静脈内投与し、そして次に超音波によって患者を走査する。リポ ソームのピーク濃度が腫瘍中にある時に、腫瘍を過温及び放射線治療によって同 時に処置する。リポソーム及び過温の効果が、酸素を放出してイオン化放射線に よって発生されそしてまたキャビテーションによって生成されたフリーラジカル を生成させて、合わせられた放射線及び過温に対する腫瘍の応答を改善すること によって放射線治療の効果を拡大する。

本明細書中で示されそして説明されたものに加えて、種々の改変が、上述の説明 から当業者には明らかであろう。このような改変もまた、添付された請求の範囲 の範囲内に入ると意図される。

実施例１３ 真空乾燥ガス注入方法によって製造された、ガス充填リポソーム（これらのリポ ソームはその内部に液体が実質的にな（そしてアルゴンガスを包み込んでいる） を癌を有する患者に静脈内投与する。超音波過温を高エネルギー超音波のパルス によって実施すると、キャビテーションが泡の場所で起きる。アルゴンは、腫瘍 組織を破壊するのを助けるフリーラジカルの生成の速度を増す。

ｄＢ　反射率 補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成５年１２月１５ 日

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．生物の組織及び体液を熱処置するための方法であって、（ｉ）処置される組 織または体液に真空乾燥ガス注入方法によって製造された、ガス充填リポソーム を含有して成る治療上効果的な量の過温相乗作用剤を投与すること、及び （ｉｉ）該組織または体液に超音波を付与することを含んで成る方法。
2. ２．該リポソームが、脂肪酸、リソ脂質、ジパルミトイルホスファチジルコリン 、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、コレステロ ール、コレステロールヘミスクシネート、トコフェロールヘミスクシネート、ホ スファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リソ脂質、スフ ィンゴミエリン、グリコスフィンゴ脂質、グルコ脂質、グリコ脂質、スルファチ ド、エーテル及びエステル結合された脂肪酸を有する脂質、並びに重合された脂 質から成る群から選ばれた脂質材料を含んで成る、請求の範囲１記載の方法。
3. ３．該リポソームがジパルミトイルホスファチジルコリンを含んで成る、請求の 範囲２記載の方法。
4. ４．該リポソームが、空気、窒素、二酸化炭素、酸素、アルゴン、キセノン、ヘ リウム及びネオンから成る群から選ばれたガスによって満たされている、請求の 範囲１記載の方法。
5. ５．該リポソームが窒素ガスによって満たされている、請求の範囲４記載の方法 。
6. ６．該リポソームが水性媒体中に懸濁されている、請求の範囲１記載の方法。
7. ７．該水性媒体がリン酸塩で緩衝された食塩水である、請求の範囲６記載の方法 。
8. ８．該リポソームを、腫瘍組織、筋肉組織及び血液体液から成る群から選ばれた 組織または体液に投与する、請求の範囲１記載の方法。
9. ９．生物の組織及び体液を熱処置するための方法であって、（ｉ）処置される組 織または体液にその内部に液体が実質的にない、ガス充填リポソームを含有して 成る治療上効果的な量の過温相乗作用剤を投与すること、及び （ｉｉ）該組織または体液に超音波を付与することを含んで成る方法。
10. １０．該リポソームが、脂肪酸、リソ脂質、ジパルミトイルホスファチジルコリ ン、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン、コレステ ロール、コレステロールヘミスクシネート、トコフェロールヘミスクシネート、 ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、リソ脂質、ス フィンゴミエリン、グリコスフィンゴ脂質、グルコ脂質、グリコ脂質、スルファ チド、エーテル及びエステル結合された脂肪酸を有する脂質、並びに重合された 脂質から成る群から選ばれた脂質材料を含んで成る、請求の範囲９記載の方法。
11. １１．該リポソームがジパルミトイルホスファチジルコリンを含んで成る、請求 の範囲１０記載の方法。
12. １２．該リポソームが、空気、窒素、二酸化炭素、酸素、アルゴン、キセノン、 ヘリウム及びネオンから成る群から選ばれたガスによって満たされている、請求 の範囲９記載の方法。
13. １３．該リポソームが窒素ガスによって満たされている、請求の範囲１２記載の 方法。
14. １４．該リポソームが水性媒体中に懸濁されている、請求の範囲９記載の方法。
15. １５．該水性媒体がリン酸塩で緩衝された食塩水である、請求の範囲１４記載の 方法。
16. １６．該リポソームを、腫瘍組織、筋肉組織及び血液体液から成る群から選ばれ た組織または体液に投与する、請求の範囲９記載の方法。