DE69327491T2

DE69327491T2 - Verfahren zum Herstellen von Microkugeln für die verzögerte Verabreichung des LHRH-Hormons und dessen Analoga, Microkugeln und so erhaltene Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69327491T2
Application number: DE69327491T
Authority: DE
Inventors: Genevieve Bernadette Billot; Marc Maurice Teichner
Original assignee: Merial SAS
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS
Priority date: 1992-07-27
Filing date: 1993-07-20
Publication date: 2000-10-12
Anticipated expiration: 2013-07-21
Also published as: EP0585151A1; ES2141756T3; CA2100925A1; FR2693905B1; AU4202293A; DE69327491D1; ATE188382T1; AU675788B2; JPH0687758A; FR2693905A1; JP3761591B2; US5540937A; NZ248207A; CA2100925C; EP0585151B1

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von injizierbaren Mikrosphären zur andauernden Freisetzung des Hormons LHRH und seiner Analoga. Die Herstellung dieser Mikrosphären beruht auf biologisch abbaubaren und biokompatiblen Polymeren oder Copolymeren, in denen das Polypeptid dispergiert ist. Die Erfindung betrifft auch Mikrosphären und Formulierungen zur andauernden Freisetzung, die sich durch dieses Verfahren erhalten lassen.
Unter Mikrosphären versteht man Partikel, in denen das Polypeptid in der Polymermatrix dispergiert ist. Diese Partikel können Tieren oder Menschen injiziert werden, nachdem sie in einer geeigneten Flüssigkeit suspendiert worden sind.
Die verwendeten biologisch abbaubaren und biokompatiblen Polymere sind gewöhnlich Poly-(D,L-lactid-glycolid), hergestellt durch Polymerisation mittels Ringöffnung, Poly-(milchsäure-glycolsäure), hergestellt durch Polykondensation von Milchsäure und Glycolsäure, Polycaprolactone und Copolymere, Polyacetale, Polyorthoester, Polyhydroxybutyrate und Copolymere.
Es sind viele Verfahren zur Mikroeinkapselung von wasserlöslichen Polypeptiden in biologisch abbaubaren Polymeren beschrieben. Diese Verfahren werden im wesentlichen in drei Gruppen eingeteilt:
- Koazervation oder Emulgierungs-Phasentrennungs-Verfahren
- Einkapselung durch Atomisierung oder Sprühtrocknen und
- Verdampfen des Lösungsmittels in der organischen oder wässrigen Phase.
Das Koazervations- oder Emulgierungs-Phasentrennungs- Verfahren (Patente US-A-4.675.189, US-a-4.835.139, Europäische Patentanmeldung EP-A-0-302-582) findet in der organischen Phase statt. Das Peptid ist in wässriger Lösung oder in pulveriger Form in einer organischen Polymerlösung disper giert. Ein Phaseninduktor, gewöhnlich ein Silikonöl, wird zur organischen Phase gegeben, um die Koazervation des Polymers in Form von Koazervattröpfchen, die das Polypeptid umschließen, zu induzieren. Diese Tröpfchen verschmelzen miteinander und bilden Keim-Mikrosphären. Diese Mikrosphären werden dann in ein Nicht-Lösungsmittel für das Polymer überführt, um ihre Härtung zu induzieren. Da die eingesetzten Polypeptide gewöhnlich in den verwendeten organischen Lösungsmitteln und Ölen unlöslich sind, ist die im Polymer eingekapselte Fraktion erhöht.
Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass erhebliche Mengen an Lösungsmitteln (Dichlormethan, Heptan oder Trichlortrifluorethan) und Öl verbraucht werden. Das führt zu erhöhten Produktionskosten und zu der Notwendigkeit, sich gegen die toxischen Wirkungen der Lösungsmittel und, im Fall von Heptan, gegen Entflammungsrisiken abzusichern. Der Koazervationsschritt ist außerdem schwierig durchzuführen: die Gewinnung einzelner Mikrosphären hängt von den Mengen an Polymer, Lösungsmittel und Phaseninduktor im Gemisch ab. Ein kleiner Überschuss an Phaseninduktor führt zur teilweisen oder vollständigen Aggregation von Mikrosphären, wodurch das erhaltene Produkt unbrauchbar wird. Andererseits ist die Freisetzungskinetik des eingekapselten Polypeptids in einem physiologischen Medium dadurch gekennzeichnet, dass eine große Menge in den ersten Stunden freigesetzt wird. Diese Eigenschaft kann in vivo zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen, wenn das Produkt zu Heilzwecken eingesetzt wird, oder kann einen Verlust an Wirkstoff bedeuten.
Das Verfahren der Einkapselung durch Atomisierung, das beispielsweise in der Patentanmeldung EP-A-0.315.875 beschrieben ist, umfasst die Herstellung einer Emulsion des Peptids in wässriger Lösung in einem Polymerengemisch in organischer Lösung, dann das Pulverisieren dieser Emulsion in einem heißen Luftstrom. Nach dem Verdampfen der Lösungsmittel während der Pulverisierung erhält man Mikrosphären.
Das grundlegende Verfahren der Lösungsmittelverdampfung umfasst das Dispergieren einer Polymerlösung, die einen Wirkstoff enthält, in einem zweiten Lösungsmittel, das mit dem des Polymers nicht mischbar ist, dann das Verdampfen des Polymer-Lösungsmittels. Ein besonders mit den obengenannten Polymeren verwendetes Verfahren ist das Verfahren, bei dem das Lösungsmittel in der wässrigen Phase verdampft wird: Eine Polymerlösung, die den Wirkstoff enthält, wird in einer wässrigen Lösung unter Rühren dispergiert. Das Lösungsmittel des Polymers wird nach und nach durch Diffusion in die wässrige Phase, dann durch Verdampfen an der Oberfläche des Gemischs entfernt. Man kann dann filtrieren und die so verfestigten Mikrosphären gewinnen. Dieses Verfahren wird insbesondere angewendet, wenn der Wirkstoff, der eingekapselt werden soll, in der wässrigen Phase unlöslich ist. Dieses Verfahren wird beispielsweise erfolgreich zum Einkapseln und zur andauernden Freisetzung von Steroiden eingesetzt (T. Tice, L. R. Beck, in: Dr. Mishell Jr., Hrsgb., Long Acting Steroid Contraception, Raven Press, New York, 1983, 175-199).
Das Patent US-A-4.389.330 beschreibt zum Beispiel ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln, wobei die einzukapselnde Substanz in einem Lösungsmittel gelöst oder dispergiert wird, das wenig mit Wasser mischbar ist, darin das Wandmaterial gelöst wird, die erhaltene organische Phase in einem Behandlungsmedium dispergiert wird, das die kontinuierliche Phase ausmacht und Wasser oder eine organische Flüssigkeit, wie Xylol, Toluol usw., sein kann, dann ein Teil des Lösungsmittels verdampft wird, bevor die Mikrokapseln gewonnen werden und der Rest des Lösungsmittels, das sie enthalten, extrahiert wird. Dieses Verfahren wird in dieser Anmeldung nur für in Wasser unlösliche Substanzen, Progesteron und Norgestimat, verwendet, die in Methylenchlorid als Lösungsmittel gelöst und dann in einer wässrigen Phase mit 5% PVA (Polyvinylalkohol) dispergiert werden. Es wird kein Unterschied zwischen sehr unterschiedlichen Typen der Kontinuierliche-Phase-Behandlungsmedien und zwischen den verschiedenen Lösungsmitteln, beispielsweise THF und Methylenchlorid, gemacht, die sich sehr unterschiedlich verhalten können.
Dagegen liefert die Technik, bei der das Lösungsmittel durch Dispersion einer organischen Phase in einer wässrigen Phase verdampft wird, schlechte Einkapselungsausbeuten, wenn der Wirkstoff wasserlöslich ist. In diesem Fall kann der in der organischen Lösung gelöste oder dispergierte Wirkstoff schnell diffundieren und sich in der wässrigen Phase auflösen (Bodmeier R., Mc Ginty J. W., Pharm. Res., 1987, 4, 465). Diese so hergestellten Mikrosphären enthalten nur einen kleinen Teil des anfänglichen Wirkstoffs: Der Hauptteil des Wirkstoffs geht durch Auflösen in der wässrigen Phase verloren.
Die Nachteile der klassischen Technik, bei der das Lösungsmittel verdampft wird, führte dazu, dass der Fachmann zur Einkapselung von wasserlöslichen Substanzen immer kompliziertere und teurere Techniken untersuchte und überarbeitete (Koazervation: EP-A-0.302.582, US-A-4.675.189, US-A- 4.835.139; Atomisierung; Doppelemulsion: EP-A-0.145.240, EP- A-0.442.671) oder die Lösungsmittelverdampfung an Fälle besonderer wasserlöslicher Produkte anpasste.
Wenn die Löslichkeit des Wirkstoffs vom pH-Wert abhängt, kann durch Einstellen des pH-Wertes der wässrigen Phase auf einen Wert, der einer geringen Löslichkeit des Wirkstoffs entspricht, die Verteilung des Wirkstoffs in der wässrigen Phase eingeschränkt werden. Dieses Einstellen kann aber problematisch sein, wenn der pH-Wert der wässrigen Phase auf extreme Werte eingestellt werden muss. Unter diesen Bedingungen können der Wirkstoff und das Polymer instabil sein.
Ein anderes Verfahren, das im Hinblick auf die eingeschränkte Verteilung des Wirkstoffs in der wässrigen Phase verwendet wird, umfasst, dass die wässrige Phase zuvor mit dem Wirkstoff gesättigt wird, um das Inversionsphänomen zu unterdrücken (R. Bodmeier J. W., Mc Ginty, J. Microencapsulation, 1987, Bd. 4, Nr. 4, 289-297). Diese letztere Lösung bleibt dennoch zur Einkapselung von teuren wasserlöslichen Peptiden oder Polypeptiden unbrauchbar, weil zur Sättigung der wässrigen Phase erhebliche Mengen des Wirkstoffs notwendig sind.
Eine Variante der Technik, bei der durch Lösungsmittelverdampfen eingekapselt wird, wurde zum Einkapseln von wasserlöslichen Peptiden, die Analoga von LHRH sind, in durch Polykondensation hergestellter Poly-(milchsäure-glycolsäure) (Europäische Patentanmeldung EP-A-0.145.240, Chem. Pharm. Bull. 36(3), 1095-1103, 1988), zum Einkapseln von TRH (Int. Pharm., 1991, 69, 69-75), zur Einkapselung von Somatostatin in Poly-(D,L-lactid-glycolid), gepfropft auf D-Glucose (Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 18, 1991, 597-598), zur Einkapselung von Rinderalbumin und Peroxidase von Raifort (Pharm. Research, Bd. 8. Nr. 6, 713-720, 1991) entwickelt. Diese Variante umfasst das Herstellen einer ersten Emulsion vom Wasser/Öl-Typ, in der der Wirkstoff in Lösung in Wasser im Polymer in Lösung in einem organischen Lösungsmittel, gewöhnlich Dichlormethan, emulgiert wird. Die wässrige Phase dieser ersten Emulsion kann auch ein wasserlösliches Additiv enthalten, dessen Wirkung die Verbesserung ihrer Viskosität ist. Die Verbesserung der Viskosität kann auf einer makromolekularen wasserlöslichen Verbindung, wie Gelatine (EP-A-0.145.240), oder durch ionische Wechselwirkung zwischen dem Peptid und dem Polymer beruhen (Int. J. Pharm., 1991, 69, 69-75).
Diese erste Emulsion wird dann in einer wässrigen Phase dispergiert, die einen Dispersionstabilisator enthält, so dass eine Emulsion vom Typ Wasser/Öl/Wasser erhalten wird. Das Lösungsmittel der organischen Phase wird unter Vakuum verdampft, um die Härtung der Mikrosphären einzuleiten. Die Mikrosphären werden dann durch Zentrifugation oder Filtration gewonnen.
Die Fraktion des Peptids oder Polypeptids, die durch dieses Verfahren effektiv eingekapselt wird, ist gewöhnlich erhöht.
Die Freisetzungskinetik des Wirkstoffs hängt größtenteils von den Einkapselungsbedingungen, im wesentlichen von der Menge an Wasser, Wirkstoff und Additiv in der wässrigen Phase der ersten Lösung, bezogen auf die Menge an Polymer und Lösungsmittel in der organischen Phase, ab. Die Herstellung dieser ersten Emulsion ist im Fall des LHRH-Analogons schwierig (EP-A-0.145.240), da sie die Emulgierung der wässrigen Phase in der organischen Phase bei erhöhter Temperatur und dabei das Arbeiten unter höherem Druck als Atmosphärendruck erfordert, um das Sieden und Verdampfen dieses Lösungsmittels zu verhindern. Andererseits kann die erhöhte Temperatur (69 bis 70ºC), die bei der Herstellung der ersten Emulsion verwendet wird, nicht für thermisch instabile Wirkstoffe verwendet werden.
Eine andere Variante der Technik, bei der das Lösungsmittel verdampft wird, umfasst das Herstellen der Dispersion einer organischen Phase in einer anderen nicht-mischbaren organischen Phase. Durch diese Variante kann theoretisch die Verteilung eines wasserlöslichen Wirkstoffs von der dispergierten Phase zur kontinuierlichen Phase eingeschränkt werden. Diese Technik der Dispersion-Verdampfung des Öl/Öl-Lösungsmittels umfasst das Dispergieren einer organischen Polymerlösung, die den Wirkstoff enthält, unter Rühren in einem Mineralöl oder einem zweiten organischen Lösungsmittel, das mit dem Polymerlösungsmittel nicht mischbar ist. Das Polymer ist beispielsweise in Aceton oder Acetonitril gelöst, dann wird die erhaltene Lösung in Paraffinöl dispergiert. Andere Lösungsmittelpaare sind beschrieben, wie zum Beispiel das Paar Hexafluoraceton/Tetrachlorkohlenstoff. Jedoch beschränken die Verwendung toxischer Lösungsmittel oder erheblicher Mengen an Paraffinöl das Leistungsvermögen des Verfahrens.
Außerdem sieht das Patent US-A-3.691.090 zur Herstellung von Mikrosphären, umfassend eine wasserlösliche Substanz, wie ein Enzym, dispergiert in einer Polymermatrix, das Dispergieren der Substanz in einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser mischbar oder wenig mischbar ist und in dem das Polymer gelöst ist, dann das Suspendieren dieser organischen Phase in einer wässrigen Lösung, umfassend ein anorganisches Salz, das die Solubilisierung des Lösungsmittels verhindert, um die Phasentrennung zu ermöglichen, vor.
Im Patent US-A-3.737.337 sieht das Verfahren das Dispergieren einer Substanz, die in Wasser löslich oder nicht löslich ist, in einer Lösung eines organischen Lösungsmittels, dass zu höchstens 15 Gew.-% in Wasser bei 20ºC löslich ist, dann das Dispergieren der erhaltenen organischen Phase in einer wässrigen Phase, die mit organischem Lösungsmittel oder Salzen gesättigt ist, um zunächst die Solubilisierung des Lösungsmittels zu verhindern, dann nach und nach das Einleiten der Trennung des Lösungsmittels der organischen Phase von der wässrigen Phase durch steigende Zugabe von Wasser vor.
Schließlich fasst die internationale Patentanmeldung WO 91/12882 den Kenntnisstand bei der Einkapselung von wasserlöslichen Peptiden zusammen: Vom Lösungsmittelverdampfungsverfahren ist herkömmlicherweise bekannt, dass es für diese nicht geeignet ist; das Koazervationsverfahren wird als das am besten angepasste Verfahren angesehen.
Diese internationale Anmeldung schlägt dennoch vor, die Lösungsmittelverdampfung oder Emulsion/Verdampfung anzupassen, indem ein neuer Weg gewählt wird, der das Solubilisieren des wasserlöslichen Peptids in einem dritten Lösungsmittel, dem gegebenenfalls Wasser zugesetzt wird und das gleichzeitig mit dem üblichen Lösungsmittel, wie Dichlormethan, verwendet wird, umfasst. Das dritte Lösungsmittel ist wassermischbar. Wenn die organische Phase in der wässrigen Phase dispergiert wird, wird Dichlormethan verdampft, während das dritte Lösungsmittel in die wässrige Phase übertritt. So kann die Einkapselungsausbeute im Fall bestimmter Peptidsubstanzen, wie Lachs-Calcitonin, TPA (Tissue Plasminogen Activator), Insulin, mehr als 90% betragen, wobei die für die Einkapselung des Hormons LHRH beobachteten Ausbeuten in der Größenordnung von 75% liegen. Diese Ergebnisse deuten auf eine nicht unerhebliche Verteilung des Hormons LHRH mit dem dritten Lösungsmittel.
Ein anderer wichtiger Nachteil dieses Verfahrens liegt in der Verwendung von wiederum erheblichen Lösungsmittelvolumina, die schwierig zu extrahieren sind, was zu einem Restanteil an Lösungsmittel führt, der immer noch 1,5 Gew.-% der Mikrosphäre ausmachen kann. Außerdem muss, insbesondere wenn Dichlormethan verwendet wird, ein drittes Lösungsmittel, wie Ethanol, zur wässrigen Phase in einer Menge gegeben werden, die 20 Vol.% ausmachen kann.
Die Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen Verfahrens zur Einkapselung des Hormons LHRH und seiner Analoga mit zufriedenstellenden Ausbeuten, insbesondere über 80% und ganz besonders über 90%, das kleine Volumina an Lösungsmitteln benötigt, so dass Mikrosphären mit kleinen Restanteilen erhalten werden.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens, durch das Mikrosphären für eine andau ernde Freisetzung von LHRH oder seinen Analoga für eine Dauer erhalten werden können, die von mehreren Tagen bis zu 1 Jahr reichen kann, wenn sie einem Individuum injiziert oder in vitro in einem physiologischen Puffer untergebracht werden.
So ist eine Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Mikrosphären zur andauernden Freisetzung des Hormons LHRH und seiner Analoga, wobei das Hormon in einer Polymer- oder Copolymermatrix dispergiert ist, die in Wasser unlöslich ist, wobei bei dem Verfahren das Hormon in einem organischen Lösungsmittel dispergiert und die zur Bildung der Matrix bestimmte Substanz darin gelöst wird, die so erhaltene organische Phase in einer kontinuierlichen wässrigen Phase suspendiert wird, das organische Lösungsmittel verdampft wird und die gebildeten Mikrosphären gewonnen werden, dadurch gekennzeichnet, dass das Hormon im pulverförmigen Zustand in einem Paar organischer Lösungsmittel dispergiert wird, von denen eines, das als Dispersionslösungsmittel bezeichnet wird, speziell das Erhalten einer homogenen Suspension des Hormons im pulverförmigen Zustand durch einfaches Rühren ermöglicht und von denen das andere, das als zweites Lösungsmittel bezeichnet wird, leicht mit Wasser mischbar ist, so dass es speziell die Mikrodispersion der organischen Phase in der wässrigen Phase ermöglicht. Es ist bemerkenswert, dass das leicht mit Wasser mischbare Lösungsmittel die Verteilung des Hormons verringert, was anscheinend insbesondere auf die beginnende Oberflächenhärtung der Matrix nach dem Entweichen dieses Lösungsmittels zurückzuführen ist.
Unter dem Hormon LHRH (Luteinizing Hormone Releasing Hormon, auch als GnRH für Gonadoliberin bezeichnet) wird das natürliche oder synthetische Hormon menschlichen oder tierischen Ursprungs verstanden. Unter Analoga von LHRH werden insbesondere die Fragmente, Agonisten und Antagonisten von LHRH und ihre Salze verstanden. In den Ansprüchen und ihren entsprechenden Abschnitten in der Beschreibung ist selbstverständlich, dass, wenn allgemein vom Hormon (oder Hormon LHRH) die Rede ist, das Hormon selbst, wie oben definiert, sowie seine Analoga gemeint sind.
Verglichen mit herkömmlichen Verfahren zur Einkapselung von wasserlöslichen Peptiden verwendet dieses Verfahren vorteilhafterweise kleine Mengen an Lösungsmitteln. Außerdem ermöglicht es das Erhalten einer sehr guten Dispersion des Hormons und seiner Analoga, ohne dass die gewöhnlich eingesetzten Techniken des heftigen Rührens notwendig sind. Außerdem vermeidet es die Verwendung von zusätzlichen Substanzen in Mengen, die dazu neigen, in mehr oder weniger großer Menge in den Mikrosphären zu verbleiben, wie Gelatine, Silikonöl, anorganische oder organische Salze, sowie die Verwendung organischer Lösungsmittel toxischer Natur, wie Heptan, die jeweils als unbeabsichtigte Bestandteile von Mikrosphären und als Verfahrensrückstände unerwünscht sind.
Die Viskosität der organischen Phase ist ebenfalls ein wichtiger Parameter und reicht vorzugsweise von 0,01 bis 10 Pa · s, vorzugsweise von 0,01 bis 1 Pa · s und ist insbesondere größer als etwa 0,04 Pa · s.
Nach einer ersten Ausführungsform des Verfahrens wird die zur Bildung der Matrix vorgesehene Substanz im Dispersionslösungsmittel gelöst und danach das Hormon unter Rühren darin gelöst, das Dispersionslösungsmittel wird teilweise oder vollständig, vorzugsweise vollständig, verdampft, der Rückstand wird im zweiten Lösungsmittel aufgenommen und die organische Phase wird in der wässrigen Phase suspendiert.
Nach einer zweiten Ausführungsform des Verfahrens wird zuerst das Hormon im Dispersionslösungsmittel dispergiert, während die zur Bildung der Matrix vorgesehene Substanz im zweiten Lösungsmittel gelöst wird, dann werden die beiden er haltenen Phasen gemischt, um die organische Phase zu erhalten, die dann in der wässrigen Phase suspendiert wird.
Das Dispersionslösungsmittel wird vorzugsweise unter den Lösungsmitteln Tetrahydrofuran (THF), Aceton, Dichlormethan, Chloroform, Toluol, Methylethylketon, Pyridin, Benzylalkohol, Acetonitril, Ethylacetat, Dioxan, Gemischen davon oder auch Chlorfluorkohlenstoff-Lösungsmitteln ausgewählt, während das zweite Lösungsmittel vorteilhafterweise Dichlormethan oder Chloroform ist.
Im vorteilhaften Fall kann ein einziges Lösungsmittel die angemessene Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gewährleisten. So ist es sehr einfach, das Hormon in dem Lösungsmittel zu dispergieren, in dem das Polymer zuvor gelöst worden ist. So kann die zweite Ausführungsform ein einziges Lösungsmittel, wie Dichlormethan, verwenden. Das kommerziell erhältliche Dichlormethan ist gewöhnlich mit Ethanol (beispielsweise mit 0,3% Ethanol für reines Dichlormethan zur SDS-Synthese) stabilisiert. Die Erfindung verwendet dieses Lösungsmittel im stabilisierten oder nicht stabilisierten Zustand.
Vorzugsweise verwendet die zur Bildung der Matrix vorgesehene Substanz Poly-(lactid-glycolid), Polylactide, Polymilchsäuren, Poly-(milchsäure-glycolsäure), Polycaprolactone, Polyvalerolactone, Polyhydroxybutyrate, Poly-(hydroxybutyratvalerat) sowie Gemische dieser Polymere. Die Polymere, insbesondere die ausgehend von Milchsäure und Glycolsäure oder ausgehend von cyclischen Lactid- und Glycolid-Dimeren hergestellten Polymere, bilden bei ihrem Abbau nicht-toxische Produkte, die vom Organismus metabolisiert werden. Die Geschwindigkeit des Abbaus dieser Polymere ist ein Faktor, der die Kontrolle der Freisetzungskinetik des Wirkstoffs, die man insbesondere von mehreren Tagen bis zu einem Jahr variieren kann, ermöglicht.
Das Dispersionslösungsmittel wird vorzugsweise unter Vakuum und vorteilhafterweise vollständig verdampft. Wenn die organische Phase im zweiten Lösungsmittel aufgenommen worden ist, kann sie mit konstanter Geschwindigkeit in die unter Rühren gehaltene wässrige Phase eingespritzt werden. Diese wässrige Phase enthält vorzugsweise einen Dispersionsstabilisator, wie Polyvinylalkohol (PVA), (insbesondere weniger als 5%, insbesondere von 0,5 bis 2%), Gelatine oder ein Tensid, wie "Tween 80". Das in den Mikrosphären in Suspension in der wässrigen Phase enthaltene organische Lösungsmittel wird vorzugsweise nach und nach verdampft, indem man Druckluft in der unter Rühren gehaltenen wässrigen Phase zirkulieren lässt (Hindurchperlen von Luft). Wenige Tropfen eines Antischaummittels, wie insbesondere einer Silikonemulsion, können vorteilhafterweise zur wässrigen Phase gegeben werden, um die Schaumbildung aufgrund des Hindurchperlens von Druckluft zu vermeiden.
Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels können die erhaltenen Mikrosphären durch Filtration gewonnen, mit entmineralisiertem Wasser gewaschen, dann gegebenenfalls mit einem Nicht-Lösungsmittel, wie Trichlortrifluorethan, Heptan, Petrolether, gewaschen werden. So erhält man ein leicht rieselfähiges Pulver mit einer Korngröße von insbesondere unter 250 um.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann/können das Hormon LHRH oder seine Analoga mit erhöhter Ausbeute eingebaut werden, wobei kleine Mengen an organischen Lösungsmitteln verwendet werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann die Substanz in ihrem anfänglichen pulverförmigen Zustand bis zur Bildung der Mikrosphären beibehalten werden, in denen sie homogen, ohne Aggregation, dispergiert ist, wodurch Verluste an Substanz in Zusammenhang mit der anfänglichen Verteilung des zweiten Lösungsmittels, die ansonsten durch Solubilisierung in der wässrigen Phase entstehen würden, erheblich eingeschränkt werden können.
Die Einkapselungsausbeute kann noch verbessert werden, indem die Temperatur der wässrigen Phase von 0 bis etwa 30ºC und insbesondere von 10 bis 25ºC eingestellt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist das erste Lösungsmittelverdampfungsverfahren, das das Erhalten einer guten Einkapselungsausbeute des Hormons LHRH und seiner Analoga ermöglicht. Die so erhaltenen Mikrosphären sind insbesondere dadurch bemerkenswert, dass das Hormon sehr homogen in seinem anfänglichen pulverförmigen Zustand dispergiert ist, wobei durch das Verfahren auch die Aggregation der Partikel vermieden wird. Außerdem weisen die erhaltenen Mikrosphären, wie oben erläutert, einen kleinen Anteil an unerwünschten Restsubstanzen auf. Schließlich kann durch das Verfahren ein großes Spektrum an Mikrosphären, die das Hormon LHRH oder seine Analoga enthalten, im Hinblick auf die Dauer der Freisetzung, die von mehreren Tagen bis zu etwa 1 Jahr reichen kann, sowie im Hinblick auf ihre Abmessungen, die insbesondere mehr als 50 bis 60 Mikron betragen können, Abmessungen, die durch die herkömmlicherweise zur Einkapselung wasserlöslicher Peptide in fester Form verwendeten Techniken, wie Koazervation, nicht erreicht wurden, erhalten werden.
So sind eine Aufgabe der Erfindung auch die Mikrosphären, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden können. Diese Mikrosphären können Abmessungen von 1 bis 250 Mikron, insbesondere über 50 bis 60 Mikron, haben.
So sind eine Aufgabe der Erfindung auch Mikrosphären, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden können und dadurch bemerkenswert sind, dass die Matrix, aus der sie bestehen, mindestens zwei, vorzugsweise zwei oder drei, Polymer- oder Copolymertypen umfasst, die sich insbesondere in ihrer Natur unterscheiden können oder auch von gleicher Natur sein können und sich durch eine oder mehrere Eigenschaften, wie das Verhältnis der in ihnen enthaltenen Monomereinheiten oder ihre Molekülmassen, unterscheiden können. Das ermöglicht die Veränderung der Freisetzungsgeschwindigkeiten und das Erhalten einer kontinuierlichen Freisetzung von langer Dauer von insbesondere mehr als 6 Monaten. Damit sind weitere wichtige Vorteile verbunden, wie vor allem die Polydispergierbarkeit des endgültigen Gemischs sowie die kontinuierliche Freisetzung des Wirkstoffs, der eine stark verminderte Vorinduktionsphase, insbesondere kleiner als 5 bis 10%, sogar von null, aufweist.
Vorzugsweise umfasst die Matrix ein Gemisch der zwei Polymere Poly-(D,L-lactid-glycolid) in unterschiedlichen Verhältnissen von 40-60 bis 100-0. Als Beispiel lässt sich eine Matrix nennen, die Poly-(D,L-lactid-glycolid)-75-25 und Poly- (D,L-lactid-glycolid)-50-50, beispielsweise etwa 360 mg bzw. 40 mg, für eine Dauer der kontinuierlichen Freisetzung von T20 bis etwa T180 umfasst. Die jeweiligen Mengen jedes der Polymer- oder Copolymertypen sind selbstverständlich ein Faktor, der ebenfalls variiert werden kann.
Eine Aufgabe der Erfindung sind auch Formulierungen, die mindestens zwei Typen erfindungsgemäßer Mikrosphären umfassen, die sich in der Zusammensetzung ihrer Matrices unterscheiden, um eine kontinuierliche lang andauernde Freisetzung, insbesondere in der Größenordnung von 8 Monaten oder mehr, und/oder mit kleiner oder ohne Latenzzeit zu erhalten. Die Matrices können sich insbesondere in ihrer Natur unterscheiden oder von gleicher Natur sein, aber sich in den Verhältnissen an in ihnen enthaltenen Monomereinheiten und/oder ihren Molekülmassen unterscheiden. Es ist bemerkenswert, dass sich mittels nur zwei Arten von Mikrosphären eine Freisetzung von LHRH in vitro wie in vivo von gleich oder mehr als 8 Mo naten erzielen lässt. Man kann insbesondere, ausgehend von zwei Typen von Mikrosphären, eine andauernde Freisetzung von gleich oder mehr als 8 Monaten vom Tag der Verabreichung an mit dem Profil einer eindeutig verlängerten Freisetzung und nahezu nullter Ordnung erzielen.
Die Erfindung wird jetzt eingehender anhand der Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Mikrosphären, die ein Peptid [D.Trp&sup6;]-LHRH enthalten, und unter Veranschaulichung der Freisetzungskinetik dieses Peptids mit der beigefügten Zeichnung beschrieben. Es zeigt/zeigen:
- die Fig. 1 und 2 Graphen, die die Freisetzungskinetik von [D.Trp&sup6;]-LHRH in Poly-(D,L-lactid-glycolid)- (= PGLA-) 75-25-Mikrosphären in ug/Tag bzw. in kumulativen Prozentzahlen zeigen;
- die Fig. 3 und 4 Graphen, die denjenigen der Fig. 1 und 2 entsprechen, für ein Gemisch, umfassend 30% PGLA-63-35- Mikrosphären und 70% PGLA-75-25-Mikrosphären;
- die Fig. 5 einen Graph, der die Freisetzungskinetik in ug/Tag für Mikrosphären zeigt, deren Matrix ein Gemisch aus PGLA-75-25 und PGLA-50-50 ist.

BEISPIEL 1

HERSTELLUNGSVERFAHREN, EINKAPSELUNGSAUSBEUTE

Als Einkapselungsausbeute wird das Verhältnis der Menge an Wirkstoff, die wirklich eingekapselt worden ist, zu der zu Beginn des Verfahrens verwendeten Gesamtmenge an Wirkstoff bezeichnet.

1. Herstellung von Mikrosphären

Die organische Phase, die das Polymer und den Wirkstoff enthält, wird zuvor folgendermaßen hergestellt:
Es werden 400 mg Poly-(D,L-lactid-glycolid)-75-25 mit einer inhärenten Viskosität von 0,59 dl/g, in 3,5 g Tetrahydrofuran gelöst. Nach und nach werden zu dieser organischen Lösung 39,6 mg eines Lyophilisats des Hormons [D.Trp&sup6;]-LHRH (Trifluoracetat) unter Rühren zugegeben. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum vollständig verdampft, dann wird die Masse unter Rühren in 2,4 g Dichlormethan gelöst. Diese Dispersion des Hormons [D.Trp&sup6;]-LHRH wird in 500 ml entmineralisiertes Wasser, das 1% Polyvinylalkohol (PVA 8/88) enthält, bei 19ºC unter Rühren eingespritzt. Gegen Ende des Einspritzens werden 3 Tropfen Antischaummittel (Silikonemulsion) zugegeben. Dann wird unter Rühren das Dichlormethan mittels Hindurchperlen von Druckluft durch das Gemisch verdampft. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels werden die Mikrosphären durch Filtration unter Vakuum gewonnen, dann mit entmineralisiertem Wasser gewaschen, um restliches PVA und einen Teil des Silikon- Antischaummittels zu entfernen. Die gewonnenen Mikrosphären werden auf einem Filter wasserfrei getrocknet, dann mit Trichlor-1,1,2-trofluor-1,2,2-ethan gewaschen, um restliches Anitschaummittel zu entfernen. Die Mikrosphären werden dann gewonnen und bei 4ºC aufbewahrt. Die so erhaltenen Mikrosphären enthalten 8,1% [D.Trp&sup6;]-LHRH (theoretisch 9%).

2. Einkapselungsausbeute

Das oben beschriebene Beispiel bezieht sich auf ein Salz eines Peptidhormons mit 10 Aminosäuren und einer Löslichkeit von etwa 45 mg/ml in der kontinuierlichen Phase. Obwohl die Löslichkeit dieses Peptids in Wasser erhöht ist, erhält man gute Einkapselungsergebnisse.
Ein wichtiger Parameter ist die Viskosität der organischen Phase, die das Polymer enthält, die Dispersion des Peptids und des oder der Lösungsmittel. Man misst die Viskosität der Polymer/Dichlormethan-Lösung bei 19ºC mit einem Viskosi meter vom Oswald-Typ, dann werden Einkapselungsversuche, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, indem das Dichlormethanvolumen und somit die Viskosität der organischen Phase variiert wird. Dann besteht eine direkte Beziehung zwischen der Viskosität und der Einkapselungsausbeute:

Viskosität Einkapselungsausbeute (%)

(Pa · s)
0,014 81
0,018 84
0,030 86
0,040 90
Die Einkapselungsausbeute wird ausgehend von der Extraktion des Hormons aus den hergestellten Mikrosphären und HPLC- Bestimmung bestimmt.
Eine Ausbeute von 90% kann auch mit erhöhten Beladungen an Peptid (15%) erhalten werden, wobei die Beladung als Verhältnis der Peptidmenge zur Gesamtmenge Polymer + Peptid definiert ist.
Die unter den Bedingungen einer optimalen Ausbeute hergestellten Mikrosphären (Viskosität > 0,04 Pa · s) haben eine Größe < 250 um und können nach dem Suspendieren in einem geeigneten wässrigen Vehikel injiziert werden.
Durch eine Temperatursenkung der kontinuierlichen wässrigen Phase kann die Einkapselungsausbeute noch verbessert werden: Wenn das im Beispiel 1 verwendete Gemisch mit einer Viskosität von 0,04 Pa · s in eine wässrige Phase bei 13ºC eingespritzt wird, übersteigt die Ausbeute 90 bis 94%.
Um eine Peptiddispersion mit kleiner Korngröße herzustellen, sind andere Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische anwendbar, so dass das Hormon im dispergierten Zustand verbleibt, ohne zu solvatisieren, beispielsweise Chloroform, Aceton, Ethylacetat usw. Diese Lösungsmittel, die rein oder im Gemisch verwendet werden, sind dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid in ihnen unter mäßigem Rühren dispergierbar ist, so das eine Korngröße von wenigen Mikron erhalten wird, und dadurch, dass das Polymer in ihnen löslich ist.

BEISPIEL 2

Eine Vereinfachung des Verfahrens kann erzielt werden, wenn die organische Phase/wässrige Phase-Dispersion direkt ohne vorherige Verdampfung durchgeführt wird:
Es wird 1 g des im Beispiel 1 beschriebenen Poly-(D,L- lactid-glycolids)-75-25 in 5,2 g Dichlormethan (kommerzielles SDS-Produkt mit 0,3% Ethanol) gelöst. 98,9 mg eines [D.Trp&sup6;]- LHRH-Lyophilisats werden in 0,53 g Dichlormethan (0,3% Ethanol) dispergiert. Die Peptiddispersion wird mit der Polymerlösung unter Rühren gemischt, und dann wird das Gemisch in 500 ml entmineralisiertes Wasser bei 19ºC, das 1% PVA 8/88 enthält, unter Rühren eingespritzt. Der Rest des Verfahrens verläuft identisch zum Beispiel 1.
Die Einkapselungsausbeute beträgt 86%.
Ersatzweise wird das Peptid direkt in der Polymer- Dichlormethan-Lösung unter mäßigem Rühren dispergiert: Dann wird wie bei Beispiel 2 vorgegangen.
Wiederum ersatzweise wird ein Lyophilisat von [D.Trp&sup6;, desGly 10, NH&sub2;]-LHRH-Ethylamid in der Lösung aus Polymer und Dichlormethan unter mäßigem Rühren dispergiert. Ebenfalls bleibt die Verteilung des Peptids in der wässrigen Phase gering. Es werden eindeutig äquivalente Ausbeuten erhalten.
Bestimmte Paare von Dispersionslösungsmitteln für das Peptid können als solche in der späteren Dispersionsphase der organischen Phase in der wässrigen Phase (Dichlormethan/Chloroform-Gemisch) verwendet werden. Dadurch kann auf die im Beispiel 1 beschriebene Phase des Verdampfens des Disper sionslösungsmittels verzichtet werden, da dieses nicht oder wenig mit Wasser mischbar ist (Chloroform, ...).
Die Größenordnung der Zugabe des Peptids oder des Polymers zum Dispersionslösungsmittel kann in Übereinstimmung mit der Erfindung geändert werden.

BEISPIEL 3

HERSTELLUNG VON MIKROSPHÄREN AUSGEHEND VON POLY(D,L-LACTID-GLYCOLID)-65-35

Es werden 2 g Poly-(D,L-lactid-glycolid)-65-35 mit einer inhärenten Viskosität von 0,69 dl/g in 8,9 g THF gelöst. Zu dieser Lösung werden 198 mg eines [D.Trp&sup6;]-LHRH-Lyophilisats unter Rühren zugegeben. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum und Rühren verdampft, und der trockene Rückstand wird dann in 11,8 g Dichlormethan unter Rühren gelöst. Die erhaltene Lösung wird in 500 ml entmineralisiertes Wasser bei 19ºC, das 1% Polyvinylalkohol 8/88 enthält, unter mechanischem Rühren (700 U/min) eingespritzt. Der Rest des Verfahrens ist identisch zu Beispiel 1. Es werden Mikrosphären mit einer Größe < 250 um erhalten, die ein rieselfähiges Pulver bilden. Die Einkapselungsausbeute beträgt 86%.

BEISPIEL 4

HERSTELLUNG VON MIKROSPHÄREN AUSGEHEND VON POLY(D,L-LACTID-GLYCOLID)-75-25: FREISETZUNG DES [D.Trp&sup6;]-LHRH-AGONISTEN VON 80 BIS 240 TAGEN

Es werden wie im Beispiel 1 hergestellte Mikrosphären verwendet, die 8,1% [D.Trp&sup6;]-LHRH enthalten.
50 mg Mikrosphären werden in 5 ml Phosphatpuffer, pH- Wert 7,2, bei 37ºC getaucht. Der Überstand wird genau abgenommen und durch 5 ml Puffer bei 37ºC ersetzt. Jede der Entnahmen wird dann mittels HPLC analysiert, um die Menge an [D.Trp&sup6;]-LHRH-Hormon zu bestimmen, die als Funktion der Zeit freigesetzt wird.
Die Kinetik der Freisetzung in vitro, verglichen mit der in vivo-Kinetik, ermöglichte das Aufzeigen ihrer Übereinstimmung. Insbesondere sind die Dauer und die Profile der Freisetzung in vitro und in vivo identisch.
Für mit 8,1% [D.Trp&sup6;]-LHRH beladene Mikrosphären, die ausgehend von Poly(D,L-lactid-glycolid)-75-25 hergestellt wurden, wird für 50 mg Mikrosphären die folgende Freisetzungskinetik erhalten (vgl. Fig. 1 und 2).
Fig. 1: Nach einem schwachen anfänglichen Hormonfreisetzungspeak, der etwa 2% der Gesamtmenge an Hormon darstellt, ist die Freisetzung in vitro bis etwa T80 schwach, was einer Induktionsphase entspricht, dann steigt die Freisetzung fortwährend und stabilisiert sich bei etwa 20 mg/T am 220. Tag. Dann sinkt die Freisetzung und versiegt am 260. Tag.
Fig. 2: Die kumulative Fraktion des in vitro freigesetzten Hormons zeigt, dass die Freisetzung von T80 bis T240 nahezu nullter Ordnung ist.

BEISPIEL 5

KONTINUIERLICHE FREISETZUNG DES HORMONS [D.Trp&sup6;]-LHRH FÜR 8 MONATE AUSGEHEND VON EINEM GEMISCH MEHRERER FORMULIERUNGEN

Wenn die Formulierungen gemischt werden, die im Beispiel 1 und im Beispiel 3 hergestellt wurden, kann man ein kontinuierliches Freisetzungssystem für das Hormon [D.Trp&sup6;]-LHRH für 8 Monate erhalten.
Die in vitro-Freisetzungsversuche, die durch Mischen von 30% (bezogen auf die Menge des in den jeweiligen Formulierungen eingekapselten Peptids) der Poly-(D,L-lactid-glycolid)- 65-35-Formulierung und 70% der Poly-(D,L-lactid-glycolid)-75- 25-Formulierung unter den gleichen Bedingungen, wie im Bei spiel 4, durchgeführt wurden, zeigen, dass tatsächlich eine Additivität und folglich Komplementarität der beiden Formulierungen besteht: Die PGLA-65-35-Formulierung setzt dass Hormon von 0 bis 85 Tagen frei und die PGLA-75-25-Formulierung setzt das Hormon von 80 bis 240 Tagen frei (Fig. 3). Die Hormonfreisetzung folgt einer Kinetik nahe der Ordnung 0 bis zum Tag 240 (Fig. 4).

BEISPIEL 5

KONTINUIERLICHE FREISETZUNG DES HORMONS [D.Trp&sup6;]-LHRH FÜR 6 MONATE AUSGEHEND VON EINEM GEMISCH VON 2 POLYMEREN IN EINER EINZIGEN FORMULIERUNG

Um eine kontinuierliche Freisetzung des Hormons für längere Zeitspannen (6 Monate oder mehr) zu erhalten, besteht ein weiteres Verfahren aus dem Mischen von zwei, sogar drei, Polymeren mit verschiedenen Eigenschaften in einer einzigen Formulierung:
- entweder von zwei Polymeren mit dem gleichen D,L-Lactid-glycolid-Verhältnis, aber verschiedenen Molekülmassen, so dass die Polydispergierbarkeit des endgültigen Gemischs erhöht ist und beispielsweise von 3,5 bis 30 reicht;
- oder von mit zwei Polymeren mit unterschiedlichem D,L- Lactid-glycolid-Verhältnis, so dass die Geschwindigkeit des Abbaus des einen oder des anderen dieser Polymere unterschiedlich ist und die kontinuierliche Freisetzung des Wirkstoffs ohne vorherige Induktionsphase ermöglicht.
Dieser Typs des Gemischs wurde im folgenden Beispiel hergestellt:
360 mg Poly-(D,L-lactid-glycolid)-75-25 (inhärente Viskosität von 0,59 dl/g) und 40 mg Poly-(D,L-lactid-glycolid)- 50-50 (inhärente Viskosität von 0,44 dl/g) werden in 3,5 g THF gelöst. Zu dieser Lösung werden 16,7 mg eines [D.Trp&sup6;]- LHRH-Lyophilisats (Trifluoracetat) unter Rühren zugegeben.
Dieses Lösungsmittel wird unter Rühren verdampft, und der trockene Rückstand wird dann in 2,4 g Dichlormethan gelöst. Die erhaltene Lösung wird in 500 ml entmineralisiertes Wasser, das 1% Polyvinylalkohol 8/88 enthält, bei 20ºC unter mechanischem Rühren (700 U/min) eingespritzt. Der Rest des Verfahrens ist identisch zum Beispiel 1. Es werden Mikrosphären mit einer Größe 250 um erhalten, die ein rieselfähiges Pulver bilden. Die Einkapselungsausbeute beträgt 93%.

IN VITRO-FREISETZUNGSKINETIK

50 mg der im Beispiel 5 hergestellten Mikrosphären werden in 5 ml Phosphatpuffer, pH-Wert 7,2, bei 37ºC getaucht, und dann wird der Überstand auf identische Weise zu Beispiel 4 genau abgenommen.
Es wird eine Netto-Verkürzung der Induktionsphase von 80 Tagen auf 20 Tage erzielt (vgl. Beispiel 4). Auf diese Phase folgt ein Zeitraum der kontinuierlichen Freisetzung des Hormons von T20 bis T180.
Durch das Polymerengemisch mit unterschiedlichen Eigenschaften lässt sich im vorliegenden Beispiel die Dauer der Induktionsphase reduzieren, und es ermöglicht die kontinuierliche Freisetzung des Wirkstoffs für etwa 160 Tage.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Mikrosphären zur andauernden Freisetzung des Hormons LHRH und seiner Analoga, wobei die Mikrosphären aus einer in Wasser unlöslichen polymeren oder copolymeren Matrix hergestellt werden, die das Hormon oder das Analogon umfasst, wobei bei dem Verfahren eine organische Phase hergestellt wird, die das Hormon LHRH oder das Analogon und die zur Bildung der Matrix bestimmte Substanz umfasst, diese organische Phase in einer kontinuierlichen wässrigen Phase suspendiert wird, das organische Lösungsmittel verdampft wird und die gebildeten Mikrosphären gewonnen werden, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Phase gebildet wird, indem man in einem leicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, das die Dispersion des Hormons im pulverförmigen Zustand erlaubt, das Hormon LHRH oder das Analogon im pulverförmigen Zustand dispergiert und das Polymer oder Copolymer darin löst.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Dichlormethan, Chloroform und einem Gemisch davon.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Hormon LHRH in pulverförmigem Zustand in einem Paar organischer Lösungsmittel dispergiert wird, das außer dem leicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel ein als Dispersionsmittel bezeichnetes Lösungsmittel umfasst, das speziell das Erhalten einer homogenen Suspension des Hormons oder des Analogons im pulverförmigen Zustand durch einfaches Rühren ermöglicht.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Dispersionsmittel ausgewählt ist aus den Lösungsmitteln Tetrahydrofuran (THF), Dioxan, Aceton, Acetonitril, Ethylacetat, Dichlormethan, Chloroform, Toluol, Pyridin, Benzylalkohol, Methylethylketon, Gemischen von diesem und Chlorfluorkohlenstoff-Lösungsmitteln.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, das die zur Bildung der Matrix vorgesehene Substanz im Dispersionsmittel gelöst wird, und dann darin das Hormon dispergiert wird, das gesamte Dispersionsmittel oder ein Teil davon verdampft wird, der Rückstand im leicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel aufgenommen wird und die organische Phase in der wässrigen Phase suspendiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst das Hormon im Dispersionsmittel dispergiert wird, während der zur Bildung der Matrix vorgesehene Stoff im leicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gelöst wird, dann die beiden erhaltenen Phasen gemischt werden, um die organische Phase zu erhalten, die man in der wässrigen Phase suspendiert.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Hormon in Dichlormethan dispergiert wird, bevor oder nachdem das Polymer im gleichen Lösungsmittel gelöst wird, und dann die so erhaltene organische Phase in der wässrigen Phase suspendiert wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Bildung der Matrix vorgesehene Substanz ausgewählt ist aus Poly(lactid-glycolid), Polylactiden, Polymilchsäuren, Poly(milchsäure-glycolsäure), Polycaprolactonen, Polyvalerolacetonen, Polyhydroxybutyraten, Poly(hydroxybutyraten-valerat) sowie den Gemischen dieser Polymere.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die organische Phase, die die im zweiten Lösungsmittel dispergierte Substanz umfasst, eine Viskosität von etwa 0,01 bis 10 Pa · s, vorzugsweise von 0,01 bis 1 Pa · s, insbesondere von mehr als oder gleich 0,04 Pa · s hat.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur der wässrigen Phase auf 0 bis 30ºC, insbesondere auf 10 bis 25ºC eingestellt ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel verdampft wird, indem man Druckluft unter Rühren in der wässrigen Phase zirkulieren lässt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Phase einen Dispersionsstabilisator umfasst.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass zur wässrigen Phase einige Tropfen eines Antischaummittels, wie einer Silikonemulsion, gegeben werden.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Verdampfen des Lösungsmit tels die erhaltenen Mikrosphären durch Filtration gewonnen, mit entmineralisiertem Wasser gewaschen und dann gegebenenfalls mit einem Nicht-Lösungsmittel, wie Trichlortrifluorethan, Heptan, Petrolether, gewaschen werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Ausgangs-Hormon LHRH oder -Analogon die Form eines Lyophilisates hat.

16. Mikrosphären zur andauernden Freisetzung des Hormons LHRH und seiner Analoga, die durch die Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15 erhalten werden können.

17. Mikrosphären nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix mindestens zwei, insbesondere zwei oder drei, Typen von Polymeren oder Copolymeren umfasst.

18. Mikrosphären nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymere oder Copolymere von gleicher Art sind, sich aber untereinander durch das Verhältnis der in ihnen enthaltenen Monomereinheiten und/oder durch ihre Molekülmassen unterscheiden.

19. Mikrosphären nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix ein Gemisch der zwei Polymere Poly(D,L- lactid-glycolid) in verschiedenen Verhältnissen von 40- 60 bis 100-0 umfasst.

20. Mikrosphären nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ihre Abmessungen von etwa 1 bis 250 Mikron reichen und sie insbesondere größer als 50 bis 60 Mikron sind.

21. Formulierung zur andauernden Freisetzung und/oder zur Freisetzung mit kleiner oder ohne Latenzzeit des Hormons LHRH und seiner Analoga, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zwei Arten von Mikrosphären nach einem der Ansprüche 16 bis 20 umfasst, die sich in der Zusammensetzung der Matrices unterscheiden.

22. Formulierung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Matrices durch ihre Art unterscheiden oder von gleicher Art sind, sich aber durch das Verhältnis der ihnen enthaltenen Monomereinheiten und/oder durch ihre Molekülmassen unterscheiden.

23. Formulierung nach den Ansprüchen 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie zwei Arten von Mikrosphären zur andauernden Freisetzung für 6 Monate oder länger umfasst.