DE69324745T4

DE69324745T4 - Flüssiges Thromboplastin-Reagens

Info

Publication number: DE69324745T4
Application number: DE69324745T
Authority: DE
Inventors: Juan Louis Durham Torres; James Reth Chapel Hill Butler; Rajesh Cary Sharma
Original assignee: Biomerieux Inc
Current assignee: Biomerieux Inc
Priority date: 1992-08-03
Filing date: 1993-07-22
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2013-07-23
Also published as: FI933441A; DK0585987T4; DE69324745T2; US5508170A; CA2100617A1; ATE179759T1; FI109152B; EP0585987B2; CA2100617C; FI933441A0; DE69324745D1; EP0585987B1; GR3030728T3; JP3330685B2; US5358853A; KR940005288A; ZA935180B; AU4215893A; AU665432B2; ES2132174T3

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein stabiles flüssiges Thromboplastinreagens mit langer Lagerfähigkeit und einem Verfahren zu seiner Herstellung. Die Wirkung der Koagulations- und Fibrinolysepfade des Blutsystems können in vielen Stufen auf Anomalien hin untersucht werden. Einer der häufigsten angewendeten Tests ist der Prothrombin-Zeittest (PT). Einer Blut- oder Plasmaprobe wird Prothrombin in Gegenwart von Calcium zugegeben und die für die Bildung eines Gerinnsels benötigte Zeit wird gemessen. Faktor VII wird durch Thromboplastin aktiviert, welches durch die Faktoren V und X die Bildung von Thrombin aus Prothrombin (Faktor II) verursacht. Das gebildete Thrombin spaltet Fibrinogen in unlösliches Fibrin. Die gemessene Zeit vom Mischen des Thromboplastins und Calciums mit einer Blutprobe bis zur Bildung eines Gerinnsels ist ein Massstab für die Konzentration oder Aktivität der beteiligten Koagulationsfaktoren. Dieser Test wird angewendet, um eine orale Antikoagulanztherapie zu überwachen, um sicherzugehen, dass dem Patienten die richtige Menge des Antikoagulanz verabreicht wird. Er wird auch angewendet, um die Leistung des Koagulationssystem zu testen.
Thromoplastin ist das primäre Reagens für die oben genannten Tests. Zur Zeit wird es aus Säugetiergewebe, gewöhnlich Hasengehirn, erhalten. Andere Thromboplastin-reiche Gewebe, wie menschliches Gehirn, menschliche Plazenta oder Rinderhirn können verwendet werden, es wurde jedoch festgestellt, dass auf Grund von Kosten, Leistung und Verfügbarkeit Hirngewebe von Hasen die geeignete Quelle für Thromboplastin ist.
Die Empfindlichkeit von Thromboplastin-Reagenzien beruht auf einer Anzahl von Faktoren, wie beispielsweise die endgültige Reagenszusammensetzung, die Puffer, Salze und Stabilisatoren einschliesst; das Extraktionsverfahren des Thromboplastins aus dem Gewebe und die ursprüngliche Quelle des Gewebes. Die meisten heute auf dem Markt erhältlichen Thromboplastin-Reagenzien sind nur als lyophilisierte Materialien erhältlich, primär aus Gründen der Lagerfähigkeit.
Rekonstituiertes lyophilisiertes Thromboplastinreagens hat eine Lagerfähigkeit von ungefähr 4 Tagen.
Die Stabilität dieses Reagens ist für den Kliniker oder Verwender wichtig, da es teuer ist und je länger die Lagerfähigkeit sowohl vom geöffneten als auch vom ungeöffneten Reagenzbehälter ist, desto weniger Reagens muss aufgrund abgelaufener Lagerzeit vernichtet werden.
Es gibt schon an sich Probleme mit einem lyophilisierten Produkt, das in einem flüssigen Produkt entweder reduziert oder eliminiert wird. Dies schliesst (1) Variabilität beim Füllen der Behälter vor der Lyophilisierung; (2) Lager zu Lager und Lagerpositionsunterschiede im Lyophilisierungszyklus (Einfrieren und Erhitzen); (3) Pipettierfehler in Verbindung mit der Rekonstitution und/oder falsche Volumenzugaben bei der Rekonstitution des Pulvers und (4) das zur Rekonstitution verwendete Wasser ist unter Umständen nicht rein und/oder mit Mikroorganismen kontaminiert.
Ein lyophilisiertes Reagens ist schon an sich trüber als ein flüssiges Reagens. Die Trübheit zu reduzieren ist ebenfalls ein wichtiger Faktor bei der Herstellung eines besseren Reagens, da das Gerinnsel nachgewiesen werden muss, sobald es sich in dem PZ-Test bildet.
Es gibt viele Wege Thromboplastin aus Geweben zu extrahieren. Der am häufigsten angewendete Weg ist das Thromboplastin-reiche Gewebe in Wasser oder Salzlösung bei 25 bis 50°C zu extrahieren. Eine Salz-Tartrat-Lösung kann verwendet werden, wonach der Extrakt zentrifugiert wird, um grosse Partikel zu entfernen. Der Überstand enthält des aktive Thromboplastin zusammen mit Natriumchlorid und Natriumtartrat (US-Patent Nr. 3,522,148). Dieser Extrakt kann weiter verarbeitet werden. Zum Beispiel können dem Thromboplastin-Extrakt Calziumlaktat, Glycin, Carboxymethylcellulose und Imidazol zugegeben werden. Jedes Additiv hat eine Wirkung auf die Empfindlichkeit des Reagens. Im allgemeinen muss ein akzeptables Thromboplastin-Reagens mit normalen Blutproben eine PZ von 9–15 Sekunden bilden.
Es gibt auch eine ganze Reihe anderer Verfahren, die angewendet werden, um empfindlicheres Thromboplastin aus Hasengehirn zu isolieren. Hawkins et al., WO 90/05740, publiziert am 31. Mai 1990, offenbart ein Verfahren zur Extraktion von Thromboplastin aus Geweben unter Verwendung von Bariumsulfat, chaotropen Reagenzien und nichtionischer Detergenzien. Jedoch kann man mit diesem Verfahren nur ein lyophiliertes und kein flüssiges Reagens herstellen.
Eine andere Patentanmeldung, DE 31 50 594A1 , offenbart ein ähnliches Verfahren. Pulverisiertes Hasengehirn wird mit pulverisierter Cellulose gemischt und mit Natriumacetatpuffer bei einem pH von 6,5–8 gewaschen, um Kontaminanten zu entfernen. Es wird dann mit Tensiden in Gegenwart von Calciumionen extrahiert. Wie bereits gesagt, das hergestellte Thromboplastin ist nur in lyophilisierte Form mit kurzer Lagerfähigkeit nach seiner Rekonstitution stabil.
Ein flüssiges Thromboplastin ist derzeit von Pacific Hemostasis Inc. erhältlich. Obwohl es den Anschein hat, dass dieses Reagens einige, mit dem lyophilisierten Reagenzien zusammenhängende Probleme gelöst hat, ist es nicht als Einzelgefässreagens erhältlich. Zwei Lösungen in getrennten Gefässen müssen vereint werden, um ein Reagens mit nur einem Monat Lagerfähigkeit zu ergeben.
Daher wäre ein flüssiges Thromboplastinreagens in Bezug auf Bequemlichkeit, Stabilität und Verlässlichkeit von grossem Wert für klinische und Forschungslabors.
Die US 3,522,148 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von flüssigem Thromboplastinreagenzien, bei denen eine Extraktionslösung eingesetzt wird, die Natriumchlorid und Natriumcitrat oder Calciumglukonat enthält.
Die vorliegende Erfindung ist ein flüssiges Thromboplastinreagens, das sich aus Thromboplastingewebeextrakt, Calciumionen, Stabilisatoren und antimikrobiellen Mitteln zusammensetzt. Dieses Reagens hat eine Lagerfähigkeit bezüglich des ungeöffneten Gefässes von mindestens 16 Monaten und einmal geöffnet, von mindestens 10 Tagen.
Ebenfalls beansprucht wird ein Verfahren zur Herstellung dieses flüssigen Thrombinplastin-Reagens nach Anspruch 6.
Dieses Verfahren zur Herstellung eines Thromboplastin-Reagens ist eine Verbesserung der Technik für die Herstellung eines solchen Reagens in flüssiger Form, und mit einer maximierten Lagerfähigkeit, durch die vereinte Wirkung einer Anzahl von Parametern.
1 ist eine typische Verlaufskurve eines Thromboplastinassays.
2 ist ein Diagramm der Wirkung der Thromboplastinkonzentration auf die Gerinnungsrate.
3 ist eine Kalibrierungskurve von Thromboplastin.
4 ist ein Flussdiagramm des Verfahrens für die Herstellung von flüssigem Thromboplastin-Reagens.
5 ist ein Diagramm einer Isotherm-Extraktion von Hasengehirnacetonpulver.
6 ist ein Diagramm der absoluten Temperatur gegen die im Gleichgewicht extrahierte Menge Thromboplastin.
7 ist ein Diagramm der Wirkung der Mischungsgeschwindigkeit auf die Extraktion von Hasengehirnacetonpulver.
8 ist ein Diagramm der Wirkung der Ionenstärke auf die Extraktion von Hasengehirnacetonpulver.
9 zeigt die Wirkung der Thromboplastin-Konzentration auf die Gerinnungszeit verschiedener Kontrollplasmen.
Die vorliegende Erfindung ist ein stabiles flüssiges Thromboplastin-Reagens nach Anspruch 1, das eine Lagerfähigkeit in einem ungeöffneten Behälter von mindestens 16 Monaten hat.
Obwohl eine Anzahl von Gewebequellen, aus denen Thromboplastin isoliert werden kann, wie beispielsweise menschliches Gehirn und Plazenta, wird allgemein Hasenhirn ausgewählt. Hasenhirngewebe ist allgemein als ein Acetonpulverextrakt erhältlich. Einige Quellen des Pulvers schliessen Continental Services Group, Inc. (P. O. Box 420-950, 1300 N. W. Street, Miami, Florida, USA 33142) und Pel Freeze Biologicals (P. O. Box 68, N. Arkansas, Rogers, Arkansas 72556) ein. Es wird im allgemeinen nach dem Verfahren von F. A. Pitlick et al., Methods in Enzymology, Bd. XLV, Teil B, Hrsg. L. Lorand, S. 37, 1976) hergestellt.
Ist das Hasenhirn einmal zu Pulverform verarbeitet worden, beeinflussen verschiedene Faktoren die Extraktion Thromboplastin aus diesem. Insbesondere die Extraktionszeit und Temperatur, die Mischungsrate, die Ionenstärke und die Konzentration des RBAP beeinflussen die Menge und die Qualität des extrahierten Thromboplastins.
Die Stärke der Thromboplastinaktivität in RBAP-Extrakten kann unter Verwendung eines photospektrometrischen Assays eingeschätzt werden. Das Assay kann verwendet werden, um die Thromboplastinkonzentration der Extrakte gegen eine Referenzcharge zu bestimmen. Eine Anzahl Verdünnungen einer Referenzthromboplastincharge wird zunächst unter Verwendung eines definierten Probenpuffers hergestellt, der 25 mM Calciumglukonat, 50 mM Natriumchlorid und 25 mM Hepes-Puffer, pH 7 enthält. Die Gerinnungsrate von normalem Plasma wurde unter Verwendung dieser Ver dünnungen bestimmt, die bei 405 nm (d.h. Maximum ΔA/Min.) erstellten Gerinnungskurven verwendend. Eine Verdünnung eines unbekannten Thromboplastinextrakts wurde auf die gleiche Weise analysiert und die Konzentration im Verhältnis zur Thromboplastinreferenz bestimmt.
In einem typischen Assay wird ein 0,1 ml Aliquot einer gegebenen Verdünnung zu 1 ml Puffer in eine 2,9 ml Küvette gegeben. Die Reaktion wird bei 37°C ausgeführt und mit der Zugabe von 0,35 ml normalem, gepooltem Plasma gestartet. Die Absorptionsänderung bei 405 nm als Funktion der Zeit wird unter Verwendung eines Photospektrometers bestimmt.
Die maximale Änderungsrate wird von der Progressionskurve bestimmt, die gegen die entsprechenden Verdünnungen erstellt und gemessen wird. 1 zeigt eine typische Progressionskurve. Dem Referenz-Thromboplastin wurde eine willkürliche Konzentration von einer Einheit gegeben.
2 zeigt ein Diagramm des Absorptionswechsels (ΔA) bei 405 nm gegen eine Thromboplastinkonzentration in Einheiten/ml. Die Daten sprechen für Sättigungskinetikett und können durch die folgende Gleichung beschrieben werden: ΔA/min = α[TPLN]/(β + [TPLN]) (1)worin [TPLN] die Thromboplastinaktivitätskonzentration und α und β Konstante sind. Gleichung 1 kann in die folgende Form umgewandelt werden: 1/(ΔA/min) = β/α(1/[TPLN]) + 1/α (2)
3 zeigt ein Diagramm von 1/[TPLN] gegen 1/(ΔA/min).
Kalibrierungskurven wie diese können und werden verwendet, um die Thromboplastinmenge in jedem erhaltenen Extrakt zu bestimmen.
Das Verfahren zur Herstellung des stabilen flüssigen Thromboplastin-Reagens wird im allgemeinen beschrieben als:

a) Waschen des Hasenhirnacetonpulverextrakts, Trennen der Lösung und Verwerfen des Überstands;
b) Erwärmen des gewaschenen Extrakts und Mischen des Extrakts mit einer Extraktionslösung, während kontinuierlichem Erhitzen der Lösung bis ungefähr 45°C;
c) Zentrifugieren der Lösung;
d) Entfernen des Überstands und Zugabe von Albumin und Calciumionen;
e) Inkubieren der Lösung;
f) Anpassen des pH und
g) Zugabe von konservierenden, stabilisierenden und antimikrobiellen Agenzien.

Das Verfahren zur Herstellung des flüssigen Thromboplastin-Reagens wird weiter unten spezifisch beschrieben und in 4 dargestellt. Das RPAB wird anfangs mit entionisiertem Wasser vorzugsweise bei ungefähr 10°C gewaschen, akzeptabel ist jedoch der Bereich von 2 bis 12°C und bei einer Konzentration von ungefähr 28 Gramm RBAP/l Wasser. Obwohl 28 g/l die bevorzugte Konzentration ist, kann die Konzentration zwischen 10 und 40 g RBAP/l Wasser variieren. Die Lösung wird mit ungefähr 150 UpM 15 Minuten lang gemischt und über Nacht bei 10°C absetzen gelassen. Der Überstand wird verworfen.
Waschen mit Wasser bei 2–8°C entfernt nur 0,2% der verfügbaren Thromboplastinaktivität des Pulvers. Es werden unter diesen Umständen jedoch signifikante Mengen löslicher Enzyme wie Lipasen und Proteasen, Salze, Chromophore, Bakterien und Kleinstpartikel entfernt.
Die Vorteile des Waschens des RBAP sind zahlreich. Zunächst werden mit dieser Waschprozedur tote und lebensfähige Bakterien zusammen mit Staub und anderen Debris entfernt. Diese Dekontamination resultiert, unter anderem, in einer verbesserten optischen Klarheit. Darüber hinaus minimiert der Waschschritt die Wirkung der unterschiedlichen Grössen der RBAP-Partikel, das das Pulver vollständig während der Absetzperiode über Nacht befeuchtet wird. Dieser Schritt normalisiert mögliche Variationen in der Konzentration löslicher Salze und Proteine in dem RBAP, weil ein Überschuss an Wasser verwendet wird. Das nasse RBAP wird auf ungefähr 25°C aufgewärmt und dann wird die auf etwa 45°C vorgewärmte Extraktionslösung zugegeben. Der Bereich der untersuchten RBAP-Konzentrationen war 25,0 bis 40,0 Gramm pro Liter Extraktionslösung. Die am meisten bevorzugte Konzentration beträgt 35 Gramm RBAP pro Liter Extraktionslösung. Diese Menge an RBAP resultiert in der maximalen Menge an in einem Schritt extrahiertem Thromboplastin. Grössere Mengen an RBAP (z.B. 40 g/l) lieferten keinen proportionalen Anstieg der Ausbeute. Geringere Mengen an RBAP (d.h. < 30 g/l) können das Reagens während den Zeiten des Jahres gefährden, in denen das verfügbare Hasengehirnpulver von schlechterer Qualität ist. Die am meisten bevorzugte Konzentration der verschiedenen Komponenten der Extraktionslösung sind in Tabelle 1 beschrieben.
Diese Extraktionsbedingungen resultierten in der maximalen Ausbeute an Thromboplastinaktivität. Darüber hinaus produzierten diese Bedingungen die niedrigsten normalen Gerinnungszeiten und eine Empfindlichkeit nahe dem erreichbaren Ziel vor der Endvolumeneinstellung der Reagenzmenge, als „bulking" bezeichnet.
Tabelle 1 Extraktionslösung
Obwohl die bevorzugte Konzentration der Komponenten der Extraktionslösung oben in Tabelle 1 angegeben ist, ist der akzeptable Bereich von Natriumchlorid von ungefähr 0,5%–1,5%; für Natriumcitrat von ungefähr 0,2% bis 0,6% und für Calciumglukonat von ungefähr 2 mM bis 6 mM.
Natriumchlorid hat eine signifikante Wirkung auf die erhaltene Thromboplastinmenge. Die Extraktionsrate steigt proportional mit steigender Ionenstärke bis zu einem Maximalpunkt an, wonach die Rate bei einer weiteren Zunahme der Ionenstärke abnimmt. Natriumchlorid, eigentlich das bevorzugte Reagens, kann mit gleicher Wirkung auch durch Chloridsalze oder andere monovalente Metallionen, wie Kalium und Lithium ersetzt werden.
Die Calciummenge spielt eine geringe Rolle bezüglich der Ausbeute, hat jedoch eine dramatische Wirkung auf den normalen Bereich und der Empfindlichkeit des resultierenden Thromboplastins. Calciumglukonat liefert das notwendige Calcium für die Koagulationskaskade, die in der Bildung eines Gerinnsels resultiert. Extraktion von RBAP in Abwesenheit von Calcium resultiert in einem Präparat mit niedrigen normalen Plasmagerinnungszeiten nach einer Recalcifizierung, jedoch sehr schlechter Empfindlichkeit gegenüber anomalen Patientenplasmen. Innerhalb bestimmter Bereiche, unter Verwendung steigender Calciumkonzentration in der Extraktionslösung, zeigt der resultierende Extrakt eine höhere Empfindlichkeit und höhere Gerinnungszeiten gegenüber anomalem Plasma.
Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass sich die Stabilität des Thromboplastins verbessert, wenn Calcium in Form des Calciumglukonatsalzes anstelle von Calciumchlorid zugegeben wird. Bivalente Kationen, wie Calcium und Magnesium binden stark an Membranen, insbesondere an solche, die saure Phospholipide enthalten.
Das Binden von Calcium und Magnesium kann eine Vesikelaggregation hervorbringen, bei der vermutlich die treibenden Kraft van der Waal'sche Kräfte sind. Die Fusionsrate steigt mit der Temperatur und der Membrandurchlässigkeit an und ist besonders schnell bei einer Phasen-Transitionstemperatur. Die beobachtete verbesserte Stabilität bei der Verwendung von Calciumsalzen der Kohlehydratsäuren, wie Glukonat, können der Bildung von Koordinationskomplexen oder der teilweisen Ausscheidung von Calciumionen zugesprochen werden. Untersuchungen zur Optimierung von Oberflächenantworten zeigten an, dass die optimale Calciumkonzentration 11,0 mM betrug.
Natriumcitrat ist ein schwacher bivalenter Ionenkomplexbildner und moduliert daher die Wirkung von Calcium. In anderen Worten sondert das Citrat einen Teil der verfügbaren Calciumionen ab und verringert deren effektive Konzentration. Mit fortschreitender Extraktion und Bindung des Calciums durch andere Komponente (z.B. Proteine und Lipide), die in die Lösung abgegeben werden, wird das Calcium-Gleichgewicht ersetzt und Citratgebundenes Calcium wird freigesetzt. Dieses Verfahren hält in der Praxis eine halbkonstante Calciumkonzentration während der Extraktion aufrecht. Obwohl Natriumcitrat und Calciumglukonat Verbindungen in dem Reagens sind, können Calciumionen zusätzlich durch beispielsweise Calciumtartrat und Calciumlactat geliefert werden.
Die Dispersion der nassen RBAP-Extraktionslösung wird dann unter circa 50-minütigem Mischen bei 400 UpM auf ungefähr 45°C erhitzt. Die Extraktionsrate verändern sich nicht dramatisch, wenn die UpM von 100 auf 500 UpM ansteigen. Jedoch steigt die Grösse der extrahierten Menge mit der Zeit bei schnellerem Mischen signifikant an.
Die Dispersion wird dann mitungefähr 1800 UpM 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Dies sind die optimalen Bedingungen. Annehmbare Bedingungen schliessen Zentrifugieren von 1500 UpM bis 2200 UpM während 15 bis 30 Minuten bei ungefähr 2°C bis 10°C ein.
Der Überstand wird wieder erwärmt und ungefähr 1:1 mit einer Lösung 1%igem Rinderserumalbumin (BSA) und 0,019 M Calciumglukonat verdünnt.
Albumin hat viele Rollen in dieser Formulierung. Es wird angenommen, dass Serumalbumin dazu beiträgt, die Lipidvesikelsysteme durch Einschliessen in Lipiddoppelschichten zu stabilisieren und sie fester zu machen. Ausserdem schützt das Serumalbumin aktive Proteine durch ein Maskieren der Aktivität von degradierenden Proteasen. Für eine optimale Produktstabilität ist eine Proteasefreie BSA-Qualität erforderlich. Der verdünnte Extrakt wird 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Diese Inkubationsperiode erlaubt eine Recalcifizierung des Extrakts und zum Verschmelzen der Vesikel einen thermodynamisch vorteilhaften Zustand.
Nach der Inkubation wird der Extrakt auf ungefähr 25°C abgekühlt, der pH auf 6,6 eingestellt und die Stabilisatoren, antimikrobiellen Mittel und Konservierungsstoffe werden, falls erwünscht, zugegeben.
Obwohl Polyethylenglykol (PEG) eine Anzahl verschiedener Verwendungen in dieser Formulierung hat, ist eine der Verwendungen diejenige als Stabilisator und Konservierungsmittel. Albumin wird ebenfalls als Stabilisator und Natriumproprionat wird für beides verwendet.
Das Ausmass der Dehydrierung der Doppelschicht spielt eine wichtige Rolle bei der Induktion der vesikulären Membranfusion. Starke Hydrierungskräfte müssen überwunden werden, um den Membranen eine Annäherung zu erlauben. Aus diesem Grund können Dehydrierungsagenzien, wie PEG und Dextran eine signifikante Wirkung auf die Fusionsrate der Phospholipidvesikel haben.
Hoekstra führte Fusionsexperimente in Gegenwart von PEG durch, die darauf hinwiesen, dass das Ausmass der Doppelschichtdehydrierung und die Entstehung von „punktuellen Defekten" in der Doppelschicht dominante Faktoren bei den initialen Fusionswirkungen sind. (D. Hoekstra, J. Amer. Chem. Soc., 21, S. 2834, (1982)). PEG kann, in Abwesenheit von Calcium oder Magnesium, Vesikel ohne Fusion aggregieren, während PEG in Anwesenheit von kleinen Mengen bivalenter Kationen (z.B. > 0,5 mM) eine Fusion erleichtert.
PEG könnte dann ganz klar die Stabilität der Thromboplastin-Formulierung bewirken. PEG bewirkt jedoch einen effizienten Mechanismus um normale Gerinnungszeiten zu modulieren und bei der Einstellung von Faktor-Empfindlichkeiten. Zusätzlich verbessert PEG die Dispersionseigenschaften des Produkts. Die destabilisierende Wirkung ist bei Konzentrationen unter 2% minimal.
Untersuchungen der Wirkung von PEG-1450 zeigten, das bei Konzentrationen zwischen 0,1% bis 5% eine graduelle Abnahme der PZ in allen Referenz-Plasmen auftrat, einschliesslich Faktor VII-defiziente Plasmen und Coumadin-Plasmen. Ausserdem zeigten Untersuchungen der Partikelgrösse beträchtliche Änderungen der Vesikelgrösse, insbesondere über 2% PEG-1450. Über 2%, jedoch unter 15% wird die Grössenverteilung enger.
Oberhalb von 15% verursacht PEG die Bildung eines Präzipitats in den Referenz-Plasmen und dieses Präzipitat mimt Gerinnselbildung in Abwesenheit von Thromboplastin. Diese Beobachtung zeigt an, dass PEG vermutlich die PZ-Werte durch Fördern und Verstärken der Aggregation von Fibrinfasern während des Gerinnungsprozesses verkürzt.
Natriumpropionat wird verwendet, um die Gerinnungszeiten des Thromboplastinpräparats, falls erforderlich, mit Plasmakontrollen und Patientensereneinzustellen. Im allgemeinen wurde festgestellt, dass der endgültigen Thromboplastinformulierung bis zu 0,4% Natriumpropionat zugegeben werden können. Die Zugabe von Natriumpropionat erhöht die Gerinnungszeiten alle Plasmen. Jedoch wird die Gerinnungszeit für Plasmen mit längerer Gerinnungszeit (z.B. Coumadin-Plasma) dramatischer ansteigen, als diejenige für normale Plasmen. Natriumpropionat ist ebenfalls in dem Merck-Index als Fungizid und Schimmelverhüter aufgeführt.
Antimikrobielle Mittel können der Formulierung ebenfalls zugegeben werden. Zum Beispiel können in einer bevorzugten Kombination Natriumazid zu ungefähr 0,02% bis 0,06% und Piperazillin, Chloramphenicol und Cioprofloxacin, alle zu ungefähr 0,007%–0,015% zugegeben werden. Die antimikrobiellen Mittel werden zugegeben, um eine Kontamination durch Mikroben zu reduzieren oder zu eliminieren, einschliesslich Bakterien und Pilze, die alle die Stabilität des Thromboplastinreagens negativ beeinflussen können. Dies ist besonders wichtig, da Thromboplastin aufgrund der Vesikelnatur des Thromboplastinkomplexes nicht sterilfiltriert werden kann, um Bakterien zu entfernen.
Die Zellwände lebender Mikroorganismen erlauben nur die Passage von Molekülen mit geringem Molekulargewicht. Die in der Bakterienumgebung vorhandenen Makromoleküle müssen zuerst abgebaut werden, bevor sie internalisiert und verdaut werden. Bakterien, insbesondere die Gram-positiven, scheiden verschiedene Enzyme in ihre Umgebung ab. Diese Enzyme schliessen insbesondere Proteasen, Lipasen, Phospholipasen, Peptidasen und Nukleasen ein. Gram-negative Bakterien halten diese Enzyme zwischen der Plasma-Membran und der Zellwand zurück.
Nach dem Absterben, wird die Zellwand und Membran dieser Bakterien abgebaut und wird in der Freisetzung der gleichen abbauenden Enzyme in die Umgebung resultieren, die in beiden Bakterienarten gefunden werden.
Die Stabilität der Thromboplastinreagenzien hängt im wesentlichen von der Integrität seiner Protein- und Lipidkomponenten ab. Daher ist der Grad der Bakterienkontamination, ob Gram-positiv oder Gram-negativ, lebend oder tot, für die Lagerfähigkeit sehr wichtig. Schimmel und Pilze haben, obwohl weniger betont, die gleiche Wirkung.
Es gibt viele Quellen bakterieller Kontamination. Diese können durch das ungereinigte Material, z.B. RBAP, Calciumglukonat, BSA) eingeführt werden, das Herstellungsverfahren, die „in-Gebrauch"-Umgebung (d.h. ein offenes Gefäss) und durch Transfer-Mechanismen wie Ventile, Leitungen und Sonden. Aufgrund der Ver schiedenheit der bakteriellen Quellen, erfüllen die antimikrobiellen Agenzien, die in dieser Formulierung verwendet werden, eine doppelten Zweck. Zunächst müssen sie Bakterien und Pilze während der Herstellungsschritte eliminieren und, zweitens, müssen sie eine Kontamination ausschliessen, während das Produkt während einer bestimmten Zeitspanne in Gebrauch ist.
Die Eigenschaften einer optimalen Kombination sind eine breite bakteriostatische und bakterizide Aktion mit vernachlässigbaren Interaktionen mit dem Produkt bezüglich seiner Leistung und Erscheinung. Jedes antimikrobielle Mittel, das einen solchen Schutz bietet, kann in dieser Formulierung verwendet werden.
Die getesteten antimikrobiellen Mittel können als a) reaktive Chemikalien wie Natriumazid, b) reversible Inhibitoren wie Dithiothreitol, c) Antibiotika wie Spiromycin und d) Membranzerstörer wie Phenol sein. Es scheint, dass im allgemeinen Gramnegative Bakterien schädlicher für das Reagens sind, als Grampositive Reagenzien. Es ist daher wichtig, diese Bakterienarten früh im Herstellungsverfahren zu eliminieren. Auch chemische reaktionsfähige Verbindungen, obwohl sie bei der Eliminierung von Bakterien wirksam sind, sind für die Langzeit-Stabilität des flüssigen Thromboplastinreagens schädlich, wie von ausgedehnten Stabilitätsuntersuchungen beurteilt werden kann. Schliesslich verbessert das Waschen des RBAP durch Entfernen lebender und toter Zellen die antimikrobielle Wirkung der getesteten Agenzien.
Pseudomonas maltophilia ist ein persistenter und extrem schädlicher Stamm für flüssiges Thromboplastin. Die bevorzugte antimikrobielle Kombination ist wirksam bezüglich der Entfernung dieser besonderen Mikrobenklasse. Diese Kombination besteht aus Natriumazid, Piperacillin, Chloramphenicol und Ciprofloxacin. Die Wirkweise jeder dieser Komponente ist ziemlich unterschiedlich. Piperazin inhibiert die Zellwandsynthese. Chloramphenicol inhibiert die Proteinsynthese, während Ciprofloxacin die DNA- Replikation inhibiert. Natriumazid interferiert mit dem Cytochromsystem und hat auch einige anti-Fungus-Eigenschaften.
Eine Anzahl antibakterieller und antifungaler Agenzien wurden untersucht, um die wirksamsten Kombinationen zu finden. Einige verfügbare Alternativen schliessen das folgende ein:
Die Penicillin-Familie der Antibiotika schliesst auch Acylaminopenizilline ein, welche Piperacillin, Azlocillin und Mezlocillin einschliessen. Diese Antibiotika haben eine erhöhte Aktivität gegenüber Gram-negativen Organismen, die in dem RBAP und der Herstellungsumgebung vorhanden sind. Sie sind auch in der Lage, die beta-Lactamasen von Klebsiella pneumonia, einem verbreiteten Mikroorganismus, zu inhibieren. Spiromycin kann auch durch Piperacillin ersetzt werden.
Natriumazid ist ein wirksames und günstiges antifungales Agens. Clotrimazol, 5-Fluorcytosin und Nystatin sind ebenfalls wirksame Fungizide.
Quinolone, wie Cyprofloxacin und Norfloxacin sind ebenfalls breit angelegte antimikrobielle Mittel. Gentamycin, Streptomycin und Amikacin können ebenfalls als Ersatz für Quinolone dienen. Chloramphenicol ist ein Inhibitor der Proteinsynthese. Tetracylin könnte als Alternative verwendet werden, obwohl wir festgestellt haben, dass dies höhere Konzentrationen der übrigen drei Antibiotika erfordern würde.
Der pH-Wert des das antimikrobielle Mittel enthaltenden Extrakts wird auf ungefähr 6,6 eingestellt und wird bei ungefähr 2–8°C über Nacht inkubiert. Diese Inkubation wird durchgeführt, um die mikrobiellen Belastung schnell zu reduzieren.
Ist der Extrakt einmal vollständig hergestellt, muss die Variabilität des RBAP kontrolliert werden. Die Gründe für diese Variabilität sind zahlreich und schliessen zum Beispiel hormonelle Veränderungen der Hasen während des Jahres ein. Diese Situation resultiert in einigen Extrakten, die „reicher" an Thromboplastin als andere sind und was sich unter Umständen in den Leistungseigenschaften des endgültigen Reagens spiegelt.
Wir haben ein Thromboplastin-Assay verwendet, um die Thromboplastin-Konzentrationen zu bestimmen. Zunächst wurden Verdünnungsserien eines Referenzthromboplastins unter Verwendung eines definierten Probenpuffers hergestellt, der Calciumglukonat, Natriumchlorid und HEPES-Puffer, pH 7 enthielt. Die Gerinnungsrate von normalem Plasma wurde unter Verwendung dieser Verdünnungen mit Gerinnungskurven bestimmt, die bei 405 nm (d.h. Maximum ΔA/min) erstellt wurden. Eine Verdünnung eines unbekannten Thromboplastins wird auf die gleiche Weise analysiert und die Konzentration wird im Verhältnis zur Referenz von der Kalibrierungskurve bestimmt. Dieses Verfahren normalisiert die Thromboplastinkonzentration auf wirksame Weise, um die Variationen des RBAP zu beseitigen.
Die bevorzugten Endkonzentrationen aller Komponenten des Thromboplastinreagens sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2 Flüssiges Thromboplastinreagens, endgültige Formulierung
Wie in Tabelle 2 gezeigt, sind die Komponenten der endgültigen Formulierung Calciumglukonat, Natriumcitrat, Natriumchlorid, PEG-1450, Rinderserumalbumin, Natriumpropionat und RBAP-Extrakt. Die Formulierung schliesst auch eine Kombination von vier antimikrobiellen Verbindungen ein.
Die Toleranz dieser Formulierung bezüglich der Variabilität der Konzentrationen der Komponenten ist ±5% für jeden Bestandteil. Die Komponenten, deren Konzentration die Leistung des flüssigen Thromboplastins am meisten beeinflussen, sind Natriumcitrat, Natriumpropionat und Natriumchlorid.
Der pH des flüssigen Thromboplastins wird vorzugsweise auf 6,6 ± 0,19 eingestellt.
Die erhaltene Endkonzentration ergibt die Formulierung mit guter Empfindlichkeit gegenüber Patientenplasmen mit Coumadin.
Andere Faktoren in der Formulierung, wie die Konzentrationen von Natriumpropionat, PEG-1450, Calciumglukonat und Thromboplastin tragen alle zu der endgültigen Empfindlichkeit des Reagens bei.
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um die Erfindung weiter zu erklären und sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken.
Beispiele
Die folgenden Reagenzien wurden in allen Beispielen verwendet:
1. Hasenhirnacetonpulver

– Hasenhirnacetonpulver

2. Komponente der Extraktionslösung

– D-Gluconsäure/Hemicalciumsalz – Vorratslösung von 0,05 M (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)
– Natriumchlorid, USP Granular
– Natriumcitrat, Dihydrat – Vorratslösung von 10%

3. Komponente der Volumen-Lösung

– Polyethylenglykol-1450 – Vorratslösung von 20% (J. T. Baker Chemical Co., Buffalo Grove, IL, USA)
– Rinderserumalbumin (BSA)
– Propionsäure, Natriumsalz, – Vorratslösung von 10%
– Natriumazid
– Chloramphenicol
– Ciprofloxacin
Piperacillin

4. Kontrollen

– Normales „Pool"-Plasma (NPP)
– Verify^® Normal Citrate Plasma Control-VNC (Verify ist ein Handelsname der Organon Teknika Corporation, Durham, N. C., USA)
– Verify^® Abnormal Citrate Level I (VACI) – anomales Plasma
– Verify^® Abnormal Citrate Level II (VACII) – anomales Plasma
– Verify^® 1 – normale Plasmakontrolle
– Verify^® 2 und 3 (anomale Plasmakontrollen)

Beispiel 1: Herstellung eines flüssigen Thromboplastinreagens
Hasengehirnacetonpulver wurde mit entionisiertem Wasser bei 10°C und einer Konzentration von 28 g RBAP/l H₂O gewaschen. Das RBAP wurde durch Mischen bei 150 UpM 15 Minuten gewaschen. Das nasse RBAP setzte sich über Nacht bei 10°C ab. Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt und verworfen. Das nasse RBAP wurde auf 25°C erwärmt und eine auf 45°C vorgewärmte Extraktionslösung wurde zugegeben. Die Extraktionslösung bestand aus einer wässrigen Lösung aus 0,85% Natriumchlorid, 0,40% Natriumcitrat und 3,0 mM Calciumglukonat. Die Dispersion wurde unter Mischen bei 400 UpM 50 Minuten auf 45°C erhitzt. Der Extrakt wurde dann 20 Minuten bei 4°C mit 1800 UpM zentrifugiert und der Überstand entfernt.
Der Überstand wurde 1 zu 1 mit einer Lösung auf 1% BSA und 0,19 M Calciumglukonat verdünnt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Der verdünnte Extrakt wurde dann auf 25°C abgekühlt und 0,05% Natriumacid, 0,01% Piperacillin, 0,01% Chloramphenicol und 0,01% Ciprofloxacin wurden zugegeben. Der pH des verdünnten Extrakts wurde auf 6,65 eingestellt und über Nacht bei 2–8°C gekühlt.
Um die Wirkungen der Verschiedenheit der unterschiedlichen Anteile des RBAP zu minimieren, wurde typischerweise die Thromboplastinkonzentration in dem verdünnten Extrakt unter Verwendung eines vereinfachten, als Bulk-Verdünnungs-Faktor (BVF) bezeichneten Verfahrens bestimmt. Um den BVF zu erhalten, wird von dem verdünnten Extrakt eine Serie von Verdünnungen in kleinem Umfang hergestellt. Zum Beispiel wird, wie in Tabelle 2 gezeigt, die Endkonzentration jeder der „Bulking"-Komponenten in sechs Flaschen konstant gehalten, während unterschiedliche Mengen an Thromboplastinextraktionslösung zugegeben werden, wonach jede Flasche mit Wasser bis zu einem konstanten Volumen verdünnt wird. Die bevorzugten Endkonzentrationen des Thromboplastin bewegen sich vom 1,4 bis zum 1,9-fachen. Nur die Thromboplastinkonzentration ändert sich tatsächlich von Lösung zu Lösung. Die Lösungen werden dann auf PZ-Werte unter Verwendung von normalem „Pool"-Plasma, Kontrollplasmen, Faktor VII-defizientes Plasma, und Plasmen verschiedener mit Coumadin behandelter Patienten analysiert. Das optimale BVF (d.h. das die optimale Thromboplastinkonzentration) wurde aus den erhaltenen Ergebnissen ausgewählt.
Wenn optimale Leistungswerte nicht erhalten werden können, wird ein zweites Set an Testlösungen unter Verwendung des besten zuvor erhaltenen BVF- und verschiedenen Natriumpropionat-Konzentrationen hergestellt. Mit der Flexibilität den verdünnten Extrakt sowohl mit dem BVF als auch mit dem Natriumpropionat anzupassen, minimiert den Einfluss der Verschiedenheit des RBAP. Die endgültige Zusammensetzung des hergestellten flüssigen Thromboplastinreagens war 11,0 mM Calciumglukonat, 1,5% PEG-1450, 0,25% Natriumchlorid, 0,2% Natriumcitrat, 0,3% BSA, 0,0% Natriumpropionat (variabel), 0,03% Natriumazid, 0,008% Piperacillin, 0,006% Chloramphenicol und 0,006% Ciprofloxacin.
Beispiel 2. Extraktionstemperatur und -zeit
Untersuchungen der Wirkung von Zeit und Temperatur auf die Extraktionseffizienz wurden bei 37°C, 42°C, 45°C, 47°C und 50°C durchführt.
Für jede der fünf untersuchten Temperaturen wurde ein ummanteltes Gefäss verwendet, um das Wasserbad vorzubereiten. 200 ml-Zentrifugenröhrchen wurden als Reaktionsgefässe verwendet. Ein zirkulierendes Wasserbad wurde zur Temperaturkontrolle verwendet. Die Extraktionslösung wurde kontinuierlich mit einem Überkopf-Rührgerät mit 500 UpM gerührt.
Die Extraktionslösung wurde in das Reaktionsgefäss überführt und während einer halben Stunde unter Rühren wurde die Temperatur ausgeglichen. Anschliessend wurden 20 g RBAP in die Lösung gestreut. Die Lösung wurde kontinuierlich mit 750 UpM gerührt. Aliquots von 10 ml wurden in Zeitintervallen (10, 20, 30, 60, 90, 120 Minuten usw. bis 24 Stunden) entnommen.
Die Aliquots wurden bei 5°C und 1800 Upm 20 Minuten zentrifugiert. Der Überstand von jeder Probe wurde in 10 ml-Glasgefässe überführt und auf Thromboplastinaktivität analysiert.
5 zeigt die Menge an Thromboplastin (Einheiten pro ml), die als eine Funktion von Zeit und Temperatur extrahiert wurden. 5 zeigt, dass nach einer initialen Periode von 25–50 Minuten die extrahierte Thromboplastinmenge eine lineare Funktion der Zeit bei allen Temperaturen ist. Der initiale nicht-lineare Teil der Extraktionskurve korrespondiert vermutlich mit dem Befeuchten des RBAP.
Es wurde eine Oberflächen-Antwortkurve erstellt, mit der eine mathematische Beziehung zwischen der Menge an extrahiertem Thromboplastin (TPLN) bezüglich Zeit und Temperatur hergestellt wurde. Die Daten passten gut in ein kubische Modell, wie von der Standardabweichung und den erhaltenen Einflussparametern beurteilt werden konnte. Die Gleichung lautet wie folgt: 2,1T2t + 2,5Tt + 0,70T2 – 0,60t2 + 3,5T + 1,6t + 2,0 (3)wobei T der Temperatur und t der Zeit entspricht. 5 zeigt auch, dass die Menge an extrahiertem TPLN mit der Extraktionstemperatur ansteigt.
Ein einfaches mathematisches Modell wurde abgeleitet, das die Extraktionstemperatur in Bezug zu der extrahierten TPLN-Menge setzt. Das Modell beruht auf der Tatsache, dass das chemische Potential, μ, des TPLN im Gleichgewicht in beiden Phasen konstant sein sollte: μ(RBAP) = μ(B) (4) μ0(RBAP) + RTlny = μ0(B) + RTlnx (5),wobei die μ⁰ chemische Potentiale in Standard-Referenz-Stadien sind, B der Extraktionspuffer, x die TPLN-Konzentration in dem Extraktionspuffer, y die TLPN-Konzentration in dem RBAP und R die universelle Gaskonstante ist. Das Modell setzt voraus, dass sich das System nach 4 Stunden Extraktion dem Gleichgewicht annähert. 5 zeigt, dass dies eine akzeptable Annahme ist, ausser vielleicht bei 50°C, wo die Extraktionsrate hoch ist und wo ausserdem sekundäre Mechanismen wirken könnten.
Die Gleichung 5 kann in die folgende Form überführt werden: lnK = σ/R(1/T) (6),worin K der Teilungskoeffizient (x/y) und σ eine Kombination von Konstanten ist. 6 zeigt ein Diagramm von 1/T versus dem Logarithmus des extrahierten Thromboplastins in Einheiten. Mit der Ausnahme des Punktes, der 50°C entspricht, passen die Punkte in eine lineare Beziehung, wie von dem Modell vorausgesagt.
Die Abweichung von dem Modell bei 50°C betont die beträchtlich unterschiedliche Menge an extrahiertem Thromboplastins bei dieser Temperatur. Tabelle 3 zeigt einen Vergleich der Extraktionsrate bei verschiedenen Temperaturen.
Tabelle 3 Extraktionsrate von RBAP bei unterschiedlichen Temperaturen
Die verstärkte Extraktion zwischen 47°C und 50°C könnte anzeigen, dass dies der Temperaturbereich ist, der der kritischen Temperatur T_c der in Suspension empfindlichen Lipide entspricht. Oberhalb der Tc sind Lipidvesikel flüssiger und dispergieren daher effizienter. Unterhalb der Tc sind die Vesikel stabilisiert und die Extraktion nimmt ab. Tabelle 3 zeigt, dass sich die Extraktionsrate in dem 42°C bis 45°C-Bereich wenig verändert. In diesem Temperaturbereich würde die Verschiedenheit von Charge zu Charge minimiert.
Beispiel 3. Mischungsbedingungen
Untersuchungen bezüglich der Mischgeschwindigkeit und der Extraktionsrate von RBAP wurden durchgeführt.
Experimente wurden bei 100, 175, 250, 350 und 500 UpM wie folgt durchgeführt:
1000 ml der Extraktionslösung wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, in eine 21 Dewar-Flasche aus rostfreiem Stahl (10,5 cm Durchmesser × 31 cm Höhe) gegeben und auf die Extraktionstemperatur von 45°C erwärmt. Die Temperatur in dem Tank wurde überwacht. 20 g RBAP wurden auf die Oberfläche der Extraktionslösung ohne Rühren gestreut. Die Zeit Null wurde als die Aktivierung des Rührers bei jeder der genannten UpM-Einstellungen definiert. Alle zehn Minuten wurden Proben entnommen und 3 Minuten mit 1200 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde mit Puffer verdünnt und gekühlt. Die verdünnten Proben wurden auf ihre Thromboplastinkonzentration unter Verwendung des oben beschriebenen Thromboplastin-Assays analysiert.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass sich die Extraktionsrate mit steigender Mischgeschwindigkeit nicht dramatisch änderte. Auf der anderen Seite erhöhte sich die Grösse der extrahierten Menge mit der Zeit signifikant, wenn schneller gemischt wurde.
Schnelleres Mischen hebt die extrahierte Gesamtmenge auf höhere Werte, ohne den Verlauf der Kurve beträchtlich zu beeinflussen. 7 zeigt die Thromboplastinmenge, die bei 45°C nach 60 Minuten bei unterschiedlichen Mischgeschwindigkeiten extrahiert wurde. 7 zeigt, dass es eine lineare Beziehung zwischen den extrahierten Thromboplastinmenge und de Mischgeschwindigkeit gibt.
Beispiel 4. Wirkung der Ionenstärke auf die Thromboplastinextraktion aus RBAP
RBAP (0,15 g) wurde in 8 5 ml-Plastikreagenzgläser gegeben. Eine 1 M NaCL-Vorratslösung wurde hergestellt und 3 ml der NaCl-Lösung (einer Molarität von 0 bis 1 M entsprechend) wurden jeden Reagenzglas zugegeben. Die Reagenzgläser wurden jeweils 5 Sekunden auf dem Vortexgerät gemischt und in ein 45°C warmes Wasserbad gestellt. Nach 10-minütiger Inkubation wurden die Reagenzgläser 5 Sekunden auf dem Vortexgerät gemischt und weitere 5 Minuten in ein Wasserbad gegeben. Am Ende einer 15-minütigen Periode wurden die Reagenzgläser 20 Minuten mit 1800 UpM bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dann 30-fach in Puffer verdünnt und auf seine Thromboplastinkonzentration analysiert. Die NaCl-Konzentration wurde in Ionenstärke überführt.
8 zeigt ein Diagramm der Thromboplastinaktivität, die als Funktion der Ionenstärke in dem Extraktionspuffer erhalten wurde. 8 zeigt, dass die Extraktionsrate mit ansteigender Ionenstärke bis zu einem maximalen Punkt ansteigt, wonach die Rate mit einem weiteren Anstieg der Ionenstärke abnimmt.
Eine Möglichkeit für die Existenz eines Maximalpunkts ist, dass die Ionenstärke die Sedimentationsrate während der Zentrifugierung beschleunigt. Die vermehrte Sedimentationsrate wird daher in einer offensichtlichen Reduktion der Extraktionsrate resultieren, da die Proben unter Verwendung des Überstands nach der Zentrifugierung des Extrakts auf ihre TPLN-Konzentration untersucht werden.
Beispiel 5. Erhalten einer optimalen Thromboplastin-Konzentration als Reagens
Ein Gefäss mit extrahiertem Thromboplastin wurde mit Puffer bis zum 32-fachen verdünnt und die verschieden Verdünnungen wurden unter Verwendung von normalem Pool-Plasma (NPP) und den Plasma-Kontrollen Verify^® Normal Citrate (VNC) und Verify^® Abnormal Level I und II (VCAI und VCAII) analysiert. Die Thromboplastin-Konzentrationen wurden mit den Verdünnungen bestimmt.
9 zeigt ein Diagramm der Wirkung der TPLN-Konzentration auf Gerinnungszeiten unter Verwendung von NPP, Verify^® Normal Citrate (VNC) und Verify^® Abnormal Level I und II (VCAI und VCAII). 9 zeigt typische Sättigungskurven im Fall von NPP und VNC, mit einem leichten Anstieg der Werte bei hohen TPLN-Konzentrationen. Im Fall der anomalen Plasmen steigen die Werte jedoch beträchtlich mit ansteigender TPLN-Konzentration. Diese Wirkung wird ebenfalls mit Faktor-VII-defizientem Plasma und coumadinisiertem Patientenplasma beobachtet.
Diese Daten zeigen, dass kleine Abweichungen von dem Ziel beträchtliche Veränderungen in den Leistungseigenschaften verursachen, wenn die Extraktionsbedingungen in einem TPLN von ungefähr 1,5 Einheiten resultieren. Ausserdem würden während einer Langzeitlagerung geringe Abnahmen der TPLN-Konzentration sich bezüglich der Gerinnungszeiten sehr bemerkbar machen. Auf der anderen Seite begleiten TPLN-Werte im Bereich von 0,5 bis 1,0 Einheiten die TPLN-Variabilität viel besser und sollten in Präparaten mit höherer Lagerzeitstabilität resultieren.
Beispiel 6. Leistungseigenschaften des flüssigen Thromboplastinreagens
Wie in Tabelle 4 beobachtet, ergeben die vier in Beispiel 1 hergestellten Forschungschargen gleiche Ergebnisse in verschiedenen Tests im Vergleich zu einem industriellen Standardthromboplastinreagens, Simplastin Excel und zeigen im allgemeinen ein gute Reproduzierbarkeit von Charge zu Charge.
Tabelle 4 Zusammenfassung der Ergebnisse der Forschungschargen
Tabelle 5 fasst ausserdem gleiche Ergebnisse von weiteren 5 Chargen flüssigen Thromboplastinreagens zusammen, die ebenfalls gemäss Beispiel 1 hergestellt wurden (Verify^® 1, 2 und 3 wurden als Kontrollplasmen verwendet).
Diese 5 Entwicklungschargen wurden gemäss Beispiel 1 hergestellt. Die beobachtete Chargen-zu-Chargen-Reproduzierbarkeit ist ein Ergebnis des in dieser Spezifikation gelehrten Verfahrens zusammen mit Stabilisatoren und antimikrobiellen Agenzien.
Tabelle 5 Leistungsergebnisse des Thromboplastinreagens in Entwicklungschargen
Beispiel 7. Optimierte ISI-Werte für flüssiges Thromboplastinreagens
Der internationale Sensibilitätsindex (ISI) ist ein empirisch bestimmter Kalibrierungswert, der die orale Antikoagulans-Empfindlichkeit eines Thromboplastin-Reagens im Vergleich zu dem internationalen Referenz-Präparat der Weltgesundheitsorganisation reflektiert. ISI-Werte des wie in Beispiel 1 hergestellten flüssigen Reagens wurden unter Verwendung der Referenzcharge bestimmt, die gegen die internationale Referenz der Weltgesundheitsorganisation kalibriert wurde.
Eine Serie coumadinisierte Patientenplasmen und normale Plasmen wurden mit dem Test-Thromboplastin-Reagens auf PZ-Werte analysiert. Die orthogonale Regression des log-log einer Messkurve der Referenz-PZs gegen den Test wurde erhalten. Die Neigung der Regressionslinie, wenn mit dem ISI des Referenz-Reagens multipliziert, ergibt den ISI des Testreagens. Die knapp erhaltenen Ergebnisse der fünf flüssigen Entwicklungschargen der Thromboplastinreagenzien sind in Tabelle 5 gezeigt und die vier Forschungschargen des flüssigen Thromboplastinreagens in Tabelle 4.
Beispiel 8. Stabilität des flüssigen Thromboplastinreagens

A. Geschlossene Gefässe.
B. Eine Charge an flüssigem Thromboplastinreagens wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und enthielt RBAP, PEG 1450, BSA, Natriumcitrat, Natriumchlorid, Calciumglukonat, Natriumazid und Thimerosal. Proben dieser Chargen wurden bei 2–8°C 24 Monate aufbewahrt. PZ-Tests dieser Charge wurden im Doppel durchgeführt und sind in Tabelle 6 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die PZ-Ergebnisse dieser Charge nach 20 Monaten mit dem industriellen Standard, Simplastin Excel, vergleichbar waren und dass die Charge die gleichen Ergebnisse nach 0 und 20 Monaten lieferte.

Tabelle 6 Stabilität bei geschlossenem Gefäss PZ-Ergebnisse (Sekunden)
Die Forschungschargen wurden ausserdem, wie in Beispiel 6 beschrieben, auf ihre tatsächliche Stabilität bei 2–8°C bis zu 12 Monaten untersucht. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 7 beschrieben und zeigen wie das Reagens innerhalb akzeptabler Grenzen, die durch die Kontrollplasmen, VNC, VACI und VACII definiert werden, wirkt.
Tabelle 7 Stabilität der Forschungschargen bei geschlossenem Gefäss PZ-Ergebnisse (Sekunden)
C. Geöffnete Gefässe
Sechs geöffnete Gefässe der in Beispiel 6 beschriebenen flüssigen Thromboplastinreagenzien, Forschungschargen 1–3 und Entwicklungschargen DL 1–3 zeigen eine Stabilität von mindestens 14 Ta gen in Tabelle 8 unten, wenn ihre Leistung in einem PZ-Test gemessen wurde.
Tabelle 8 PZ-Ergebnisse der Stabilität bei geöffnetem Gefäss (Sekunden)

Claims

Flüssiges Thromboplastinreagens, welches Thromboplastingewebeextrakt, Calciumionen, ein Metallchlorid, Natriumcitrat, Calciumglukonat, Stabilisatoren, von denen einer BSA ist, und antimikrobielle Mittel umfasst, erhältlich durch (a) Extraktion eines Thrombiplastin-reichen Gewebes mit einer Lösung, die ein Metallchlorid und einen schwachen Metallionenkomplexbildner umfasst, der Natriumcitrat und Calciumglukonat enthält, in einer Konzentration in dem Bereich von 25 bis 40 9 Gewebe/l Extraktionslösung, (b) Verdünnung ungefähr 1:1 mit einer Lösung, die Calciumionen und BSA umfasst und (c) Inkubation.
Flüssiges Thromboplastinreagens gemäss Anspruch 1, worin das Thromboplastin-reiche Gewebe Hasengehimacetonpulver ist.
Flüssiges Thromboplastinreagens gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, worin mindestens ein Stabilisator aus der Gruppe bestehend aus Natriumpropionat, Polyethylenglykol und Glukonationen ausgewählt wird.
Flüssiges Thromboplastinreagens gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die genannten antimikrobiellen Mittel aus der Gruppe bestehend aus Natriumazid, Piperacillin, Chloramphenicol und Ciprofloxacin ausgewählt werden.
Flüssiges Thromboplastinreagens gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, das zusätzlich Natriumpropionat als ein die Prothrombinzeit einstellendes Agenz umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines flussigen Thromboplastinreagens, welches umfasst: (a) Waschen des Hasengehimacetonpulvers (RBAP) Extrakts mit Wasser in einer Konzentration von ungefähr 10 bis 40 g RBAP/l; (b) Erwärmen des gewaschenen RBAP-Extrakts bis auf ungefähr 25°C; (c) Mischen des erwärmten RBAP-Extrakts mit einer Extraktionslösung, die ein Metallchlorid und einen schwachen Metallionenkomplexbildner, der Natriumcitrat und Calciumglukonat enthält, in einer Konzentration in dem Bereich von 25 bis 40 g RBAP/l Extraktionslösung umfasst, unter kontinuierlichem Erhitzen auf ungefähr 45°C; (d) Zentrifugieren der Lösung bei einer Temperatur von ungefähr 2°C bis 10°C; (e) Verdünnen des Überstands ungefähr 1:1 mit einer Lösung, die Albumin und Calciumionen umfasst; (f) Inkubieren des verdünnten Überstands; (g) Einstellen des pH auf ungefähre Neutralität und Zugabe der antimikrobiellen Mittel; (h) Zugabe von Polyethylenglykol van ungefähr 0,1% bis 5%; (i) Testen der Lösung auf Prothrombin-Werte; und, falls erforderlich; (j) Zugabe von Natriumpropionat.
Verfahren gemäss Anspruch 6, worin zusätzlich vor der Zugabe von Natriumpropionat, die Lösung mit dem Volumen-Verdünnungsfaktor eingestellt wird.
Flüssiges Thromboplastinreagens gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung in einem diagnostischen Verfahren.
Verwendung des flüssigen Thromboplastinreagens gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Diagnose-Sets.