ES2132174T5 - Reactivo liquido de tromboplastina. - Google Patents

Reactivo liquido de tromboplastina.

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ES2132174T5 ES93202175T ES93202175T ES2132174T5 ES 2132174 T5 ES2132174 T5 ES 2132174T5 ES 93202175 T ES93202175 T ES 93202175T ES 93202175 T ES93202175 T ES 93202175T ES 2132174 T5 ES2132174 T5 ES 2132174T5
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Abstract

LA INVENCION ES UN REACTIVO TROMBOPLASTINA LIQUIDA ESTABLE USADO PARA MEDIR EL RENDIMIENTO DEL SISTEMA DE COAGULACION, CON UN ENVEJECIMIENTO EN REPOSO DE MAS DE 16 MESES, Y UN METODO PARA PRODUCIR ESTE REACTIVO.

Description

Reactivo líquido de tromboplastina.
Antecedentes de la invención
Esta invención se refiere a un reactivo de tromboplastina líquido estable con una larga caducidad y a un método para producirlo.
El funcionamiento de las rutas de coagulación y fibrinolisis del sistema sanguíneo puede ser analizado para detectar anormalidades en muchos estadios. Uno de los análisis más comúnmente utilizados es el análisis del tiempo de protrombina (TP). Una muestra de sangre o de plasma es añadida a tromboplastina en presencia de calcio, y se mide el tiempo necesario para formar un coágulo. El Factor VII es activado por la tromboplastina, que a través de los Factores V y X, origina la formación de trombina a partir de protrombina (Factor II). La trombina formada corta el fibrinógeno para dar lugar a fibrina insoluble. El tiempo medido desde la mezcla de tromboplastina y calcio con una muestra de sangre hasta la formación de un coágulo, es una medida de la concentración o de la actividad de los factores de coagulación implicados. Este análisis es utilizado para monitorizar la terapia con anticoagulantes orales con el fin de asegurar que se está administrando al paciente la cantidad correcta de anticoagulante. Se utilizada también para analizar el funcionamiento del sistema de coagulación.
La tromboplastina es el reactivo primario para los análisis anteriores. Actualmente, se obtiene de tejido de mamífero, normalmente de cerebros de conejo. Otro tejido rico en tromboplastina, tal como el cerebro humano, la placenta humana y el cerebro bovino puede ser utilizado, pero se ha encontrado que por el coste, funcionamiento y disponibilidad, el tejido de cerebro de conejo es una fuente adecuada de tromboplastina.
La sensibilidad de un reactivo de tromboplastina reside en varios factores, tales como la composición del reactivo final, que puede incluir tampones, sales y estabilizantes; el método de extracción de la tromboplastina del tejido; y la fuente original del tejido. Hoy día la mayoría de los reactivos de tromboplastina preparados en el mercado están disponibles solamente como materiales liofilizados, principalmente por razones de estabilidad del reactivo. El reactivo de tromboplastina liofilizado reconstituido tiene una caducidad de cuatro días aproximadamente.
La estabilidad de este reactivo es importante para el clínico, o para el usuario, ya que es caro y cuanto más larga sea la caducidad, del recipiente del reactivo abierto y sin abrir, menos reactivo debe ser desechado debido al periodo de caducidad cumplido.
Existen problemas inherentes asociados con un producto liofilizado que son reducidos o eliminados en un producto líquido. Éstos incluyen (1) variabilidad en el llenado de los viales antes de la liofilización; (2) diferencias estante a estante, y diferencias posicionales en un estante en el ciclo de liofilización (congelación y calentamiento); (3) errores de pipeteo asociados con la reconstitución y/o con adiciones de volumen erróneas cuando se reconstituye el polvo; y (4) el agua utilizada para reconstituir puede no ser pura y/o puede estar contaminada con microorganismos.
Un reactivo liofilizado es inherentemente más turbio que un reactivo líquido. La reducción de la turbidez del reactivo es también un factor importante para producir un reactivo mejor, ya que el coágulo debe ser detectado tan pronto como sea formado en el análisis del TP.
Existen muchas maneras de extraer tromboplastina de los tejidos. La más común es extraer el tejido rico en tromboplastina en soluciones acuosas o salinas a 25-50ºC. Puede utilizarse una solución salina-tartrato, después de lo cual el extracto es centrifugado para eliminar partículas grandes. El sobrenadante contiene la tromboplastina activa junto con cloruro de sodio y tartrato de sodio (Patente de EE.UU. 3.522.148). Este extracto puede ser procesado posteriormente. Por ejemplo, lactato de calcio, glicina, carboximetilcelulosa e imidazol pueden ser añadidos al extracto de tromboplastina. Cada aditivo tiene un efecto sobre la sensibilidad del reactivo. En general, un reactivo de tromboplastina aceptable debe producir un TP de 9-15 segundos con una muestra de sangre normal.
Existen también varios procesos diferentes utilizados para fabricar tromboplastina de cerebro de conejo más sensible. Hawkins y col., en WO 90/05740, publicada el 31 de Mayo de 1990, describen un método de extracción de tromboplastina de tejido utilizando sulfato de bario, agentes caotrópicos y detergentes no iónicos. Sin embargo, el proceso produce solamente un reactivo de tromboplastina liofilizado y no uno líquido.
Otra solicitud de patente, DE 3150594A1, describe un proceso similar. Polvo de cerebro de conejo es mezclado con polvo de celulosa y lavado con tampón acetato de sodio a pH 6,5-8 para eliminar los contaminantes. Es extraído posteriormente con surfactantes en presencia de iones de calcio. De nuevo, la tromboplastina producida es estable solamente en forma liofilizada, con una caducidad corta una vez que ha sido reconstituida.
Una tromboplastina líquida está disponible actualmente en Pacific Hemostasis, Inc. Aunque podría parecer que este reactivo ha superado algunos problemas asociados con los reactivos liofilizados, no está disponible como reactivo en un único vial. Dos soluciones, en viales separados, deben ser combinadas para producir un reactivo con una estabilidad de un mes solamente.
Por tanto, en términos de comodidad, estabilidad y fiabilidad, un reactivo de tromboplastina líquido sería de valor para los laboratorios clínicos y de investigación.
La Patente US 3.522.148 describe un método para producir un reactivo de tromboplastina líquido en el cual se utiliza una solución de extracción que comprende cloruro sódico y citrato sódico o gluconato cálcico.
Breve resumen de la invención
La presente invención es un reactivo de tromboplastina líquido compuesto de extracto tisular de tromboplastina, iones de calcio, estabilizantes y antimicrobianos como se ha reivindicado en la reivindicación 1. Este reactivo tiene una caducidad, en el recipiente final sin abrir, de al menos 16 meses y una vez abierto, de al menos 10 días.
Se reivindica también como en la reivindicación 6 un método para producir este reactivo de tromboplastina líquido.
Este método de preparación de un reactivo de tromboplastina es una mejora en la técnica de producción de tal reactivo en forma líquida, y con un tiempo de caducidad maximizado, a través del efecto combinado de varios parámetros.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 es una curva típica de la evolución de un ensayo de tromboplastina.
La Fig. 2 es una gráfica del efecto de la concentración de tromboplastina sobre la tasa de coagulación.
La Fig. 3 es una curva de calibrado de tromboplastina.
La Fig. 4 es un diagrama de flujo del método para producir el reactivo de tromboplastina líquido.
La Fig. 5 es una gráfica isoterma de la extracción del polvo de acetona de cerebro de conejo.
La Fig. 6 es una representación gráfica de la temperatura absoluta frente a la cantidad de tromboplastina extraída en el equilibrio.
La Fig. 7 es una gráfica del efecto de la velocidad de mezcla sobre la extracción de polvo de acetona de cerebro de conejo.
La Fig. 8 es una representación gráfica del efecto de la fuerza iónica sobre la extracción de polvo de acetona de cerebro de conejo.
La Fig. 9 muestra el efecto de la concentración de tromboplastina sobre el tiempo de coagulación de diferentes plasmas control.
Descripción detallada de la invención
La presente invención es un reactivo de tromboplastina líquido estable, como se ha reivindicado en la reivindicación 1, que tiene una caducidad en un recipiente sin abrir de al menos 16 meses.
Aunque pueden utilizarse varias fuentes de tejido de las que puede extraerse tromboplastina, tales como cerebro y placenta humanos, actualmente el cerebro de conejo es la elección común. El tejido de cerebro de conejo está disponible comúnmente como un extracto de polvo de acetona. Algunas fuentes del polvo incluyen Continental Services Group, Inc. (P.O. Box 420-950, 1300 N.W. 36th Street, Miami, Florida, USA 33142) y Pel Freeze Biologicals (P.O. Box 68, 205 N. Arkansas, Rogers, Arkansas 72556). Es preparado generalmente por el método de F.A. Pitlick y col., Methods in Enzymology, Vol. XLV, Parte B, editado por L. Lorand, p. 37, 1976.
Una vez que el cerebro de conejo ha sido procesado a la forma en polvo, varios factores afectan la extracción de tromboplastina a partir de él. En particular, el tiempo y la temperatura de extracción, la velocidad de mezcla, la fuerza iónica y la concentración de PACC afectan todos la cantidad y la calidad de la tromboplastina extraída.
El nivel de actividad de tromboplastina de extractos de PACC puede ser calculado utilizando un ensayo espectrofotométrico. El ensayo puede ser utilizado para calcular la concentración de tromboplastina de los extractos frente a un lote de referencia. Se prepara primeramente una serie de diluciones de un lote de tromboplastina de referencia utilizando un tampón de muestra definido, que contiene gluconato de calcio 25 mM, cloruro de sodio 50 mM y tampón Hepes 25 mM, pH 7. La tasa de coagulación de plasma normal se determina utilizando estas diluciones a partir de curvas de coagulación generadas a 405 nm (esto es, \DeltaA máximo/minuto). Una dilución del extracto de tromboplastina desconocido es analizada de la misma manera y se determina la concentración con relación al lote de tromboplastina de referencia.
En un ensayo típico, una alícuota de 0,1 ml de una dilución dada de la muestra de referencia o de la muestra de ensayo es añadida a 1 ml de tampón en una microcubeta de 2,9 ml. La reacción se lleva a cabo a 37ºC y se inicia con la adición de 0,35 ml de plasma normal agrupado. Se determina el cambio de la absorbancia a 405 nm como función del tiempo utilizando un espectrofotómetro.
La tasa máxima de cambio es determinada a partir de la curva de evolución generada y representada gráficamente frente a las diluciones correspondientes. La Figura 1 muestra una curva de evolución típica. A la tromboplastina de referencia se le dio una concentración arbitraria de 1 Unidad. La Figura 2 muestra una representación gráfica del cambio de la absorbancia (\DeltaA) a 405 nm frente a la concentración de tromboplastina en términos de Unidades/ml. Los datos sugieren una cinética de saturación y puede describirse utilizando la ecuación siguiente:
(1)\Delta A/minuto = \alpha [TPLN]/(\beta + [TPLN])
donde [TPLN] es la concentración de la actividad de tromboplastina y \alpha y \beta son constantes. La Ecuación 1 puede ser transformada en la forma siguiente:
(2)1/(\Delta A/minuto) = \beta /\alpha (1/[TPLN]) + 1/\alpha
La Figura 3 muestra una representación gráfica de 1/[TPLN] frente a 1/(\DeltaA/minuto). Curvas de calibrado como ésta fueron y pueden ser utilizadas para calcular la cantidad de tromboplastina en cualquier extracto obtenido.
El proceso para producir el reactivo de tromboplastina líquido estable, es descrito generalmente como:
a) lavado del extracto de polvo de acetona de cerebro de conejo, permitiendo que se separe la solución y desechando el sobrenadante;
b) calentamiento del extracto lavado y mezcla del extracto con una solución de extracción, mientras que se calienta continuamente la solución a 45ºC aproximadamente;
c) centrifugación de la solución;
d) retirada del sobrenadante y adición de albúmina e iones de calcio;
e) incubación de la solución;
f) ajuste del pH; y
g) adición de agentes conservantes, estabilizantes y antimicrobianos.
Específicamente, el método para producir el reactivo de tromboplastina líquido se describe a continuación y está en forma de diagrama en la Figura 4. El PACC es lavado inicialmente con agua desionizada, preferiblemente a 10ºC aproximadamente, pero un rango aceptable es de 2 a 12ºC aproximadamente, y a una concentración de 28 gramos de PACC/l de agua aproximadamente. Aunque 28 g/l es la concentración preferible, la concentración puede oscilar entre 10 y 40 g de PACC/l de agua aproximadamente. La solución es mezclada a aproximadamente 150 RPM durante unos 15 minutos y se deja que sedimente durante una noche a 10ºC. El sobrenadante es desechado.
El lavado con agua a 2-8ºC elimina solamente el 0,2% de la actividad de tromboplastina disponible del polvo. Sin embargo, niveles significativos de enzimas solubles tales como lipasas y proteasas, y sales, cromóforos, bacterias y partículas son eliminados bajo estas condiciones.
Las ventajas de lavar el PACC antes de la extracción son numerosas. Primeramente, el procedimiento de lavado elimina parcialmente bacterias muertas y viables, junto con polvo y otros desechos. Esta descontaminación tiene como resultado, entre otras cosas, una claridad óptica mejorada. Además, la etapa de lavado minimiza el efecto de las variaciones del tamaño de partículas del PACC, ya que el polvo está completamente humedecido durante el periodo de sedimentación de una noche. Esta etapa normaliza también las posibles variaciones de la concentración de sales y proteínas solubles en el PACC debido a que se utiliza un exceso de agua.
El PACC húmedo es calentado a 25ºC aproximadamente, y se añade posteriormente la Solución de Extracción precalentada a 45ºC aproximadamente. El rango de las concentraciones de PACC estudiado fue de 25,0 a 40,0 gramos por litro de Solución de Extracción. La concentración más preferida es 35 gramos de PACC por litro de Solución de Extracción. Esta cantidad de PACC tuvo como resultado la máxima cantidad de tromboplastina extraída en una etapa. Cantidades mayores de PACC (esto es, 40 g/l) no produjeron incrementos proporcionales del rendimiento. Cantidades inferiores de PACC (esto es, <30 g/l) podrían poner en peligro el reactivo durante aquellos periodos del año en los que el polvo de cerebro de conejo disponible es de peor calidad. La concentración más preferida de los diferentes componentes de la Solución de Extracción se describe en la Tabla 1.
Estas condiciones de extracción tuvieron como resultado el rendimiento máximo de actividad de tromboplastina. Además, estas condiciones produjeron el tiempo de coagulación normal más bajo y una sensibilidad próxima a la diana alcanzable antes del ajuste del volumen final del lote de reactivo, llamado "aumento de volumen".
TABLA 1 Solución de extracción
Componente Concentración (peso/vol)
Cloruro de sodio 0,85%
Citrato de sodio 0,40%
Gluconato de calcio 3,0 mM
Aunque la concentración preferida de cada uno de los componentes de la Solución de Extracción se da en la Tabla 1 anterior, un rango aceptable para el cloruro de sodio es del 0,5% al 1,5% aproximadamente; para el citrato de sodio, del 0,2% a 0,6% aproximadamente y para el gluconato de calcio, de 2 mM a 6 mM aproximadamente.
El cloruro de sodio tiene un efecto significativo sobre el rendimiento de la tromboplastina obtenida. La tasa de extracción incrementa proporcionalmente con una fuerza iónica creciente hasta un punto máximo, después del cual la tasa disminuye con un incremento posterior de la fuerza iónica. El cloruro de sodio, aunque se encontró que era el reactivo preferido, puede ser también sustituido por sales cloruro de otros iones metálicos monovalentes, tales como potasio y litio, con un efecto similar.
El nivel de calcio tiene un papel menor en el rendimiento obtenido pero tiene un efecto dramático sobre el rango normal y la sensibilidad de la tromboplastina resultante. El gluconato de calcio proporciona el calcio necesario para la cascada de coagulación que tiene como resultado la formación de un coágulo. La extracción del PACC en ausencia de calcio tiene como resultado una preparación con tiempos de coagulación de plasma normal bajos después de la recalcificación, pero una sensibilidad muy pobre a los plasmas de pacientes anormales. Dentro de ciertos rangos, utilizando concentraciones crecientes de calcio en la Solución de Extracción, el extracto resultante tiene una sensibilidad mayor a plasmas anormales y tiempos de coagulación normales mayores.
Estudios previos han mostrado que la estabilidad de la tromboplastina se incrementa cuando se añade calcio en forma de la sal gluconato de calcio en lugar de cloruro de calcio. Cationes divalentes, tales como calcio y magnesio, pueden unirse potentemente a membranas, particularmente a las que contienen fosfolípidos ácidos.
La unión por calcio y magnesio puede producir agregación de vesículas, cuya fuerza directriz son presumiblemente interacciones de van der Waals. La velocidad de fusión incrementa con la temperatura y con la fluidez de las membranas, y es especialmente rápida a la temperatura de la transición de fases. La estabilidad mejorada observada con la utilización de sales de calcio de ácidos carbohidratados, tales como gluconato, puede ser atribuida a la formación de complejos de coordinación o a través de un secuestro parcial de iones de calcio. Estudios de optimización de la respuesta de superficies indicaban que la concentración óptima de calcio era de 11,0 mM.
El citrato de sodio es un quelante débil de iones divalentes y, de este modo, modula el efecto del calcio. En otras palabras, el citrato secuestra parte del calcio disponible y reduce su concentración eficaz. A medida que procede la extracción y el calcio es unido por otros componentes que están siendo liberados a la solución (esto es, proteínas y lípidos), el equilibrio del calcio es desplazado y se libera el calcio unido al citrato. Este proceso, en la práctica, mantiene una concentración semiconstante de calcio durante la extracción. Aunque el citrato de sodio y el gluconato de calcio son los compuestos en el reactivo, los iones de calcio pueden ser además suministrados por, por ejemplo, tartrato de calcio y lactato de calcio.
La dispersión PACC húmedo-Solución de Extracción es calentada posteriormente a 45ºC aproximadamente mientras que se mezcla a unas 400 RPM durante 50 minutos aproximadamente. La velocidad de extracción no cambia dramáticamente cuando se incrementan las RPM desde 100 a 500 RPM. Sin embargo, la magnitud de la cantidad extraída con el tiempo aumenta significativamente con una mezcla más rápida.
La dispersión es luego centrifugada a 1800 RPM aproximadamente durante 20 minutos a 4ºC. Éstas son las condiciones óptimas. Condiciones aceptables incluyen una centrifugación de 1500 RPM a 2200 RPM durante 15 a 30 minutos aproximadamente y de 2ºC aproximadamente a 10ºC aproximadamente.
El sobrenadante es vuelto a calentar y es diluido 1:1 aproximadamente con una solución de seroalbúmina bovina (BSA) al 1% y gluconato de calcio 0,019 M.
La albúmina tiene múltiples funciones en esta formulación. Se cree que la seroalbúmina ayuda a estabilizar los sistemas de vesículas lipídicas intercalándose en las bicapas lipídicas y haciéndolas más rígidas. Además, la albúmina protege a las proteínas activas enmascarando la acción de las proteasas degradantes. Se requiere una calidad de BSA sin proteasas para una estabilidad óptima del producto. El extracto diluido es incubado durante 1 hora aproximadamente a 37ºC. Este periodo de incubación permite la recalcificación del extracto y la fusión de las vesículas para un estado termodinámicamente favorable.
Después de la incubación, el extracto es enfriado hasta 25ºC aproximadamente, se ajusta el pH a alrededor de 6,6 y se añaden, si se desea, los estabilizantes, antimicrobianos y conservantes.
Aunque el polietilén glicol (PEG) tiene una variedad de utilizaciones en esta formulación, uno de los usos es como estabilizante y conservante. Se utiliza también albúmina como estabilizante, y se utiliza propionato de sodio como ambos.
El grado de deshidratación de las bicapas juega un importante papel en la inducción de la fusión de las membranas vesiculares. Potentes fuerzas de hidratación tienen que ser superadas para permitir que las membranas lleguen a una estrecha proximidad. Por esta razón, agentes de deshidratación, tales como PEG y dextrano, pueden tener un efecto significativo sobre la velocidad de fusión de las vesículas de fosfolípidos.
Hoekstra realizó experimentos de fusión en presencia de PEG que sugieren que el grado de deshidratación de la bicapa y la creación de "defectos puntuales" en la bicapa son factores dominantes en los efectos iniciales de la fusión. (D. Hoekstra, J. Amer. Chem. Soc., 21, p. 2834, (1982)). El PEG, en ausencia de calcio o de magnesio, puede agregar las vesículas sin fusión, mientras que el PEG en presencia de pequeñas cantidades de cationes divalentes (esto es, >0,5 mM) facilita la fusión.
Claramente por tanto, el PEG podría afectar a la estabilidad de la formulación de tromboplastina. Sin embargo, el PEG proporciona un mecanismo eficaz para modular los tiempos de coagulación normales y para el ajuste de las sensibilidades a los Factores. Además, el PEG mejora las características de dispersión del producto. El efecto desestabilizante es mínimo a concentraciones por debajo del 2%.
Estudios del efecto de PEG-1450 mostraron que a concentraciones entre el 0,1% y el 5% había una disminución gradual del TP de todos los plasmas de referencia, incluyendo plasma deficiente en Factor VII y plasma cumadínico. Además, estudios del tamaño de las partículas mostraron cambios considerables del tamaño de las vesículas, particularmente por encima del 2% de PEG-1450. Por encima del 2,0% de PEG-1450 pero por debajo del 15%, la distribución de tamaños es más estrecha.
Por encima del 15%, PEG-1450 hace que se forme un precipitado en los plasmas de referencia y este precipitado imita la formación de coágulos en ausencia de tromboplastina. Esta observación indica que el PEG acorta probablemente los valores de TP estimulando e incrementando la agregación de las hebras de fibrina durante el proceso de coagulación.
Se utiliza propionato de sodio para ajustar el tiempo de coagulación de la preparación de tromboplastina con controles de plasma y con muestras de pacientes, si es necesario. Se ha encontrado de manera general que puede añadirse hasta un 0,4% de propionato de sodio a la formulación final del reactivo de tromboplastina. La adición de propionato de sodio incrementa el tiempo de coagulación de todos los plasmas. Sin embargo, el tiempo de coagulación aumentará más dramáticamente para los plasmas con un tiempo de coagulación más largo (esto es, plasmas cumadínicos) que para los plasmas normales. El propionato de sodio está también enumerado en el Index Merck como fungicida y preventivo de mohos.
A la formulación pueden añadirse también antimicrobianos. Por ejemplo, en una combinación preferida se añade azida de sodio de un 0,02% a un 0,06% aproximadamente y piperacilina, cloramfenicol y ciprofloxacino, todos del 0,007% al 0,015% aproximadamente. Los antimicrobianos son añadidos para reducir o eliminar la contaminación microbiológica, incluyendo bacterias y hongos, todos los cuales podrían afectar de manera adversa la estabilidad del reactivo de tromboplastina. Esto es particularmente importante ya que la tromboplastina no puede ser esterilizada por filtración para eliminar bacterias debido a la naturaleza vesicular del complejo de tromboplastina.
Las paredes celulares de los microorganismos vivos permitirán el paso solamente de moléculas de peso molecular pequeño. Las macromoléculas presentes en el entorno de las bacterias deben ser degradadas antes de que puedan ser internalizadas y digeridas. Las bacterias, particularmente las que son gram positivas, secretan diferentes enzimas al medio que las rodea. Estos enzimas incluyen en particular, proteasas, lipasas, fosfolipasas, peptidasas y nucleasas. Las bacterias gram negativas retienen estos enzimas entre la membrana plasmática y la pared celular.
Después de la muerte, la pared celular y la membrana de estas bacterias se degradarán teniendo como resultado la liberación al entorno del mismo tipo de enzimas degradantes encontrados en ambos tipos de bacterias.
La estabilidad de los reactivos de tromboplastina depende sustancialmente del mantenimiento de la integridad de sus componentes proteicos y lipídicos. Por tanto, el nivel de contaminación bacteriana, ya sean gram positivas o gram negativas, viables o muertas, es muy significativo para la caducidad. Además, aunque menos pronunciado, los mohos y hongos tienen un efecto similar.
Hay numerosas fuentes de contaminación bacteriana. Éstas pueden ser introducidas en las materias primas (por ejemplo, PACC, gluconato de calcio, BSA), en el proceso de fabricación, en el entorno de utilización (esto es, en el vial abierto) y en los mecanismos de transferencia tales como válvulas, tubos y sondas. Debido a la variedad de fuentes bacterianas, los agentes antimicrobianos utilizados en esta formulación tienen un doble fin. Primeramente, deben eliminar las bacterias y los hongos durante las etapas de fabricación y, segundo, deben impedir la contaminación mientras el producto está en uso durante un periodo de tiempo especificado.
Las características de una combinación óptima son una amplia acción bacteriostática y bactericida con interacciones despreciables con el producto en términos de funcionamiento y aspecto. Cualquier antimicrobiano que proporcione tal protección puede ser útil en esta formulación.
Los compuestos antimicrobianos analizados podrían ser clasificados como a) productos químicos reactivos tales como azida de sodio, b) inhibidores reversibles, tal como ditiotreitol, c) antibióticos, tal como Espiromicina y d) destructores de membranas, tal como fenol. Parece que, en general, las bacterias gram negativas son más nocivas para el reactivo que las bacterias gram positivas. Por tanto, es crítico eliminar estos tipos de bacterias al principio del procedimiento de procesado. Además, los compuestos reactivos químicamente, aunque eficaces para eliminar bacterias, son nocivos para la estabilidad a largo plazo del reactivo de tromboplastina líquido según se dedujo de estudios de estabilidad acelerada. Finalmente, eliminando las células viables y muertas, el lavado del PACC mejora la acción antimicrobiana de los agentes analizados.
Pseudomonas maltophilia es una cepa persistente y extremadamente nociva para la tromboplastina líquida. La combinación antimicrobiana preferida es muy eficaz para eliminar esta clase particular de microbio. Esta combinación consta de azida de sodio, piperacilina, cloramfenicol y ciprofloxacino. El modo de acción de cada uno de estos compuestos es bastante diferente. La piperacilina inhibe la síntesis de la pared celular. El cloramfenicol inhibe la síntesis de proteínas, mientras que el ciprofloxacino inhibe la replicación del ADN. La azida de sodio interfiere con el sistema de citocromos y tiene también algunas propiedades antifúngicas.
Se sometieron a selección varios agentes antibacterianos y antifúngicos para encontrar las combinaciones más eficaces. Algunas alternativas disponibles incluyen las siguientes.
La familia de antibióticos de la penicilina incluye también las acilaminopenicilinas, que incluyen la piperacilina, azlocilina y mezlocilina. Estos antibióticos tienen una actividad incrementada contra muchos organismos gram negativos presentes en el PACC y en el entorno de la fabricación. Son también capaces de inhibir las beta-lactamasas de Klebsiella pneumoniae, un microorganismo común. La piperacilina puede ser sustituida también por Espiromicina.
La azida de sodio es un agente antifúngico eficaz y barato. Clotrimazol, 5-fluorocitosina y nistatina son también eficaces como fungicidas.
Las quinolonas, tales como ciprofloxacino y norfloxacino son también antimicrobianos de amplio espectro. Gentamicina, estreptomicina y amikacina pueden servir también como sustitutos de las quinolonas.
El cloramfenicol es un inhibidor de la síntesis de proteínas. La tetraciclina podría ser utilizada como una alternativa, aunque hemos encontrado que esto requeriría concentraciones más elevadas de los tres antibióticos restantes.
El extracto que contiene los antimicrobianos se ajusta a un pH de 6,6 aproximadamente y se mantiene a 2-8ºC aproximadamente durante una noche. Esta incubación es utilizada para disminuir rápidamente la carga microbiana.
Una vez que el extracto ha sido preparado totalmente, debe controlarse la variabilidad del PACC. Las razones de esta variabilidad son numerosas e incluyen, por ejemplo, los cambios hormonales de los conejos durante el año. Esta situación tiene como resultado que algunos extractos son "más ricos" en tromboplastina que otros y, finalmente, se refleja en las características de funcionamiento del reactivo final.
Hemos utilizado un ensayo de tromboplastina para determinar las concentraciones de tromboplastina. Se preparan primeramente una serie de diluciones de un lote de tromboplastina de referencia utilizando un tampón de muestra definido, que contiene gluconato de calcio, cloruro de sodio y tampón HEPES, pH 7. Se determina la tasa de coagulación de plasma normal utilizando estas diluciones a partir de curvas de coagulación producidas a 405 nm (esto es, \DeltaA máximo/minuto). Se analiza de la misma manera una dilución de una tromboplastina desconocida y se determina la concentración en relación con el lote de referencia a partir de la curva de calibrado. Este procedimiento normaliza eficazmente la concentración de tromboplastina para compensar la variación encontrada en el PACC.
Las concentraciones finales preferidas de todos los componentes del reactivo de tromboplastina se muestran en la Tabla 2.
TABLA 2 Reactivo de tromboplastina líquido; formulación final
1
Según se muestra en la Tabla 2, los componentes de la formulación final son gluconato de calcio, citrato de sodio, cloruro de sodio, PEG-1450, seroalbúmina bovina, propionato de sodio y extracto de PACC. La formulación incluye también una combinación de cuatro compuestos antimicrobianos.
La tolerancia de la formulación a la variabilidad de la concentración de los componentes es aproximadamente \pm 5% para cada constituyente. Los componentes cuya concentración afecta más al funcionamiento de la tromboplastina líquida son el citrato de sodio, el propionato de sodio y el cloruro de sodio.
El pH del reactivo de tromboplastina líquido es ajustado preferiblemente a 6,6 \pm 0,19.
La concentración final obtenida proporciona a la formulación una buena sensibilidad hacia los plasmas de pacientes cumadinizados. Otros factores de la formulación, tales como el propionato de sodio, PEG-1450, gluconato de calcio y la concentración de tromboplastina, contribuyen todos a la sensibilidad final del reactivo.
Los ejemplos siguientes se dan para explicar adicionalmente la invención, y no tienen la intención de limitar de ninguna manera la invención.
Ejemplos
Se utilizaron los reactivos siguientes a lo largo de los ejemplos:
1. Polvo de acetona de cerebro de conejo
- Polvo de acetona de cerebro de conejo
2. Componentes de la solución de extracción
- Ácido D-glucónico/sal de hemicalcio - solución madre de 0,05 M (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.)
- Cloruro de sodio, USP Granular
- Citrato de sodio, dihidrato - solución madre al 10%
3. Componentes de la solución de carga final
- Polietilén glicol-1450 - solución madre al 20% (J.T. Baker Chemical Co., Buffalo Grove, IL, EE.UU.)
- Seroalbúmina bovina (BSA)
- Ácido propiónico, sal sódica - solución madre al 10%
- Azida de sodio
- Cloramfenicol
- Ciprofloxacino
- Piperacilina
4. Controles
- Plasma agrupado normal (NPP)
- Plasma control con Citrato Normal Verify®-VNC (Verify es una marca registrada de Organon Teknika Corporation, Durham, N.C., EE.UU.).
- Nivel de Citrato I Anormal Verify® (VACI) – plasma anormal
- Nivel de Citrato II Anormal Verify® (VACII) – plasma anormal
- Verify® 1 - control de plasma normal
- Verify® 2 y 3 (controles de plasma anormales)
Ejemplo 1 Preparación del reactivo de tromboplastina líquido
Polvo de acetona de cerebro de conejo fue lavado con agua desionizada a 10ºC a una concentración de 28 g de PACC/l de H_{2}O. El PACC fue lavado mezclando a 150 RPM durante 15 minutos. El PACC húmedo sedimentó durante una noche a 10ºC. El sobrenadante fue retirado por succión y desechado. El PACC húmedo fue calentado a 25ºC y se añadió una solución de extracción precalentada a 45ºC. La solución de extracción consistía en una solución acuosa de cloruro de sodio al 0,85%, citrato de sodio al 0,40% y gluconato de calcio 3,0 mM. La dispersión fue calentada a 45ºC mientras se mezclaba a 400 RPM durante 50 minutos. El extracto fue centrifugado posteriormente a 1800 RPM durante 20 minutos a 4ºC, y se retiró el sobrenadante.
El sobrenadante fue diluido 1 a 1 con una solución de BSA 1% y gluconato de calcio 0,019 M e incubado durante 1 hora a 37ºC. El extracto diluido fue luego enfriado hasta 25ºC y se añadió azida de sodio 0,05%, piperacilina 0,01%, cloramfenicol 0,01% y ciprofloxacino 0,01%. Se ajustó el pH del extracto diluido a 6,65 y se refrigeró durante una noche a 2-8ºC.
Con de fin de minimizar los efectos de la variabilidad de lotes diferentes de PACC, la concentración de la tromboplastina en el extracto diluido fue determinada típicamente utilizando un procedimiento simplificado denominado Factor de Dilución Volumétrico (BDF). Para obtener el BDF, se preparan una serie de diluciones a pequeña escala del extracto diluido. Por ejemplo, la concentración final de cada uno de los componentes de carga, según se ve en la Tabla 2, se mantiene constante en seis matraces, mientras que se añaden cantidades variables de la Solución de Extracción de tromboplastina, y posteriormente se diluye cada matraz con agua hasta un volumen constante. Las concentraciones finales preferidas de tromboplastina oscilan de 1,4 a 1,9 veces. Efectivamente, sólo la concentración de tromboplastina cambia de solución a solución. Las soluciones son posteriormente analizadas para determinar los valores del TP utilizando plasma agrupado normal, plasmas control, plasma deficiente en Factor VII y varios plasmas de pacientes tratados con cumadina. El BDF óptimo (esto es, la concentración óptima de tromboplastina) es elegido a partir de los resultados obtenidos.
Si no pueden obtenerse valores de funcionamiento óptimos, se prepara un segundo grupo de soluciones de ensayo utilizando el mejor BDF obtenido previamente y diferentes concentraciones de propionato de sodio. El tener la flexibilidad de ajustar el extracto diluido con el BDF y con propionato de sodio minimiza el impacto de la variabilidad del PACC.
La composición final del reactivo de tromboplastina líquido preparado fue gluconato de calcio 11,0 mM, PEG-1450 1,5%, cloruro de sodio 0,25%, citrato de sodio 0,2%, BSA 0,3%, propionato de sodio 0-0,5% (variable), azida de sodio 0,03%, piperacilina 0,008%, cloramfenicol 0,006% y ciprofloxacino 0,006%.
Ejemplo 2 Temperatura y tiempo de extracción
Los estudios sobre el efecto del tiempo y la temperatura sobre la eficacia de la extracción se realizaron a 37ºC, 42ºC, 45ºC, 47ºC y 50ºC.
A cada una de las cinco temperaturas estudiadas, se utilizó un recipiente de 600 ml con camisa exterior para preparar el baño de agua. Se utilizaron tubos de centrífuga de 200 ml como recipientes de reacción. Se utilizó un baño de agua circulante para el control de la temperatura. La Solución de Extracción fue mezclada continuamente con un agitador superior graduado a 500 RPM.
La Solución de Extracción fue colocada en el recipiente de reacción y se dejó equilibrar a la temperatura durante 0,5 horas con agitación. Posteriormente se espolvorearon 20 gramos de PACC en la solución. La solución fue agitada continuamente a 750 RPM. Se extrajeron alícuotas de 10 ml a intervalos de tiempo (10, 20, 30, 60, 90, 120 minutos, etc. hasta 24 horas).
Las alícuotas fueron centrifugadas a 5ºC, 1800 RPM, durante 20 minutos. El sobrenadante de cada muestra fue transferido a viales de vidrio de 10 ml y analizado para determinar la actividad de tromboplastina.
La Figura 5 muestra la cantidad de tromboplastina (Unidades por ml) extraída como función del tiempo y de la temperatura. La Figura 5 muestra que después de un periodo inicial de 25-50 minutos, la cantidad de tromboplastina extraída es una función lineal del tiempo a todas las temperaturas. La porción inicial no lineal de las curvas de extracción corresponde probablemente al humedecimiento del PACC.
Se generó una curva superficie-respuesta obteniendo una relación matemática entre la cantidad de tromboplastina extraída (TPLN) con respecto al tiempo y a la temperatura. Los datos daban un buen ajuste a un modelo cúbico según se estimó por la desviación estándar y los parámetros de influencia obtenidos. La ecuación es según sigue:
(3)2,1T^{2}t + 2,5Tt + 0,70T^{2} - 0,60t^{2} + 3,5T + 1,6t + 2,0
en la que T es la temperatura y t corresponde al tiempo. La Figura 5 muestra también que la cantidad de TPLN extraída incrementa con la temperatura de extracción.
Se derivó un modelo matemático sencillo que relacionaba la temperatura de extracción con la cantidad de TPLN extraída. El modelo está basado en el hecho de que el potencial químico, \mu, de la TPLN en el equilibrio debe ser constante en ambas fases:
(4)\mu (PACC) = \mu (B)
(5)\mu ^{0}(PACC) + RT \ ln \ y = \mu ^{0}(B) + RT \ ln \ x
donde los \mu^{0}s son los potenciales químicos en los estados de referencia estándar, B es el tampón de extracción, x es la concentración de TPLN en el tampón de extracción, y es la concentración de TPLN en el PACC, y R es la constante gaseosa universal. El modelo asume que después de 4 horas de extracción, el sistema se aproxima al equilibrio. La Figura 5 muestra que ésta es una hipótesis aceptable, excepto quizás a 50ºC donde la tasa de extracción es elevada y, también, donde puede estar actuando un mecanismo secundario.
La Ecuación 5 puede ser transformada en la forma siguiente:
(6)ln\ K = \sigma /R \ (1/T)
donde K es el coeficiente de reparto (x/y) y \sigma es una combinación de constantes. La Figura 6 muestra una representación gráfica de 1/T frente al logaritmo de la tromboplastina extraída en unidades. Con la excepción del punto correspondiente a 50ºC, los puntos se ajustan a una relación lineal como se pronosticó a partir del modelo.
La desviación del modelo a 50ºC enfatiza la cantidad considerablemente diferente de tromboplastina extraída a esta temperatura. La Tabla 3 muestra una comparación de la tasa de extracción a diferentes temperaturas.
TABLA 3 Tasa de extracción del PACC a diferentes temperaturas
Temperatura Tasa de extracción
(mUnidades/minuto)
37,0 2,67
42,0 5,40
45,0 5,14
47,0 11,3
50,0 25,6
La extracción incrementada entre 47ºC y 50ºC puede indicar que ésta es la región de temperatura correspondiente a la Temperatura Crítica (Tc) de los lípidos de la suspensión. Por encima de la Tc las vesículas lipídicas son más fluidas y, por lo tanto, se dispersan más eficazmente. Por debajo de la Tc, las vesículas son más rígidas y disminuye la extracción. La Tabla 3 muestra que la tasa de extracción cambia muy poco en la región de 42ºC a 45ºC. En esta región de temperatura la variabilidad lote a lote estaría minimizada.
Ejemplo 3 Condiciones de mezcla
Se realizaron estudios sobre el efecto de la velocidad de mezcla en la tasa de extracción del PACC.
Los experimentos fueron realizados a 100, 175, 250, 350 y 500 RPM según sigue:
Se colocaron 1000 ml de la Solución de Extracción, según se describió en el Ejemplo 1, en un matraz Dewar de acero inoxidable de 2 litros (10,5 cm de diámetro x 31 cm de altura) y se dejaron calentar hasta la temperatura de extracción de 45ºC. La temperatura en el tanque fue monitorizada. Se espolvorearon 20 gramos de PACC sobre la parte superior de la solución de extracción sin agitación. El tiempo cero fue definido como la activación del agitador a cada una de las graduaciones de RPM anteriores. Se retiraron muestras cada diez minutos y se centrifugaron a 1200 RPM durante 3 minutos. El sobrenadante fue diluido con tampón y refrigerado. Las muestras diluidas fueron analizadas para determinar la concentración de tromboplastina utilizando el ensayo de tromboplastina descrito anteriormente.
Los resultados obtenidos indicaban que la tasa de extracción no cambiaba dramáticamente con velocidades de mezcla crecientes. Por otra parte, la magnitud de la cantidad extraída con el tiempo incrementaba significativamente con una mezcla más rápida.
La mezcla más rápida desplaza la cantidad total extraída hacia valores más elevados sin afectar considerablemente a las pendientes de las curvas. La Figura 7 muestra la cantidad de tromboplastina extraída a 45ºC después de 60 minutos a diferentes velocidades de mezcla. La Figura 7 muestra que existe una relación lineal entre la cantidad de tromboplastina extraída y la velocidad de mezcla.
Ejemplo 4 Efecto de la fuerza iónica sobre la extracción de tromboplastina de PACC
Se colocó PACC (0,15 g) en tubos de ensayo de plástico de 8-5 ml. Se preparó una solución madre de NaCl 1 M y se añadieron a cada tubo 3 ml de solución de NaCl (correspondiendo a una molaridad de 0 a 1 M). Los tubos fueron agitados en vórtex durante 5 segundos cada uno y situados en un baño de agua a 45ºC. Después de una incubación de 10 minutos, los tubos fueron agitados en vórtex durante 5 segundos y se volvieron a colocar en el baño de agua durante 5 minutos adicionales. Al final del periodo de 15 minutos, los tubos fueron centrifugados a 1800 RPM durante 20 minutos a 4ºC. El sobrenadante fue diluido posteriormente 30 veces en tampón y analizado para determinar la concentración de tromboplastina. La concentración de NaCl fue convertida en fuerza iónica.
La Figura 8 muestra una representación gráfica del valor de la actividad de tromboplastina obtenida como función de la fuerza iónica del tampón de extracción. La Figura 8 muestra que la tasa de extracción aumenta con una fuerza iónica creciente hasta un punto máximo, después del cual la tasa disminuye con el incremento posterior de la fuerza iónica.
Una posibilidad para la existencia de un punto máximo es que la fuerza iónica acelera también la tasa de sedimentación durante la centrifugación. Por tanto, la tasa de sedimentación aumentada tendrá como resultado una reducción aparente de la tasa de extracción, ya que las muestras son analizadas para determinar la concentración de TPLN utilizando el sobrenadante después de la centrifugación del extracto.
Ejemplo 5 Obtención de la concentración de tromboplastina óptima para el reactivo
Un vial de tromboplastina extraída fue diluido con tampón hasta 32 veces y las diferentes diluciones fueron ensayadas utilizando plasma agrupado normal (NPP) y controles de plasma con Citrato Normal Verify® (VNC), y con Niveles de Citrato Anormales I y II Verify® (VACI y VACII). Las concentraciones de tromboplastina fueron determinadas en las diluciones.
La Figura 9 muestra una representación gráfica del efecto de la concentración de TPLN sobre el tiempo de coagulación utilizando NPP, Citrato Normal Verify® y Niveles Anormales I y II Verify®. La Figura 9 muestra curvas de saturación típicas en el caso de NPP y VNC, con un ligero incremento de los valores a concentraciones elevadas de TPLN. En el caso de los plasmas anormales, sin embargo, los valores aumentan considerablemente con concentraciones crecientes de TPLN. Este efecto es observado también con plasma deficiente en Factor VII y con plasma de pacientes cumadinizados.
Estos datos indican que cuando las condiciones de extracción tienen como resultado una TPLN de 1,5 Unidades aproximadamente, pequeñas desviaciones de la diana producirían cambios considerables de las características de funcionamiento. Además, durante el almacenamiento de larga duración, pequeñas disminuciones de la concentración de TPLN serían muy perceptibles en términos de tiempos de coagulación. Por otra parte, valores de TPLN en el rango de 0,5 a 1,0 Unidades ajustan mucho mejor la variabilidad de la TPLN y tendrían como resultado preparaciones con una estabilidad a largo plazo más elevada.
Ejemplo 6 Características de funcionamiento del reactivo de tromboplastina líquido
Según se observa en la Tabla 4, los cuatro lotes de investigación (RL1 - RL4), preparados como en el Ejemplo 1, dan resultados similares en varios ensayos en comparación con un reactivo de tromboplastina estándar industrial, Simplastin Excel, y exhiben generalmente muy buena reproducibilidad de lote a lote.
TABLA 4 Resumen de los resultados de los lotes de investigación
2
3
Adicionalmente, la Tabla 5 resume resultados similares para otros cinco lotes de reactivo de tromboplastina líquido preparados también como en el Ejemplo 1 (Verify® 1, 2 y 3 son utilizados como plasmas control). Estos cinco lotes de desarrollo fueron preparados como en el Ejemplo 1. La reproducibilidad lote a lote vista es el resultado del proceso según se describe en esta especificación junto con estabilizantes y agentes antimicrobianos.
TABLA 5 Resultados de funcionamiento de lotes de desarrollo del reactivo de tromboplastina
4
Ejemplo 7 Valor del ISI optimizado para el reactivo de tromboplastina líquido
El Índice de Sensibilidad Internacional (ISI) es un valor de calibrado determinado empíricamente que refleja la sensibilidad a los anticoagulantes orales de un reactivo de tromboplastina cuando se compara con la Preparación de Referencia Internacional de la Organización Mundial de la Salud. Los valores del ISI del reactivo líquido preparado como en el Ejemplo 1 fueron determinados utilizando un lote de referencia calibrado frente a la Referencia Internacional de la Organización Mundial de la Salud.
Una serie de plasmas de pacientes cumadinizados y plasmas normales fueron analizados con el reactivo de tromboplastina de ensayo y con el reactivo de tromboplastina de referencia para determinar los valores del TP. Se obtuvo la regresión ortogonal log-log de una representación gráfica de los TPs de referencia frente a los de ensayo. La pendiente de la línea de regresión, cuando se multiplica por el ISI del reactivo de referencia, da el ISI del reactivo de ensayo. Los resultados compactos obtenidos para cinco lotes de desarrollo del reactivo de tromboplastina líquido se muestran en la Tabla 5, y para cuatro lotes de investigación del reactivo de tromboplastina líquido en la Tabla 4.
Ejemplo 8 Estabilidad del reactivo de tromboplastina líquido A. Viales cerrados
Se preparó un lote de reactivo de tromboplastina líquido de manera similar a la descrita en el Experimento 1, y contenía PACC, PEG-1450, BSA, citrato de sodio, cloruro de sodio, gluconato de calcio, azida de sodio y timerosal. Muestras de este lote habían sido almacenadas a 2-8ºC durante 24 meses. Se llevaron a cabo análisis del TP en duplicados de este lote y se muestran en la Tabla 6. Los resultados muestran que los resultados del TP a los 20 meses son comparables entre el estándar industrial, Simplastin Excel, y este lote, y que el lote daba resultados similares a los 0 meses y a los 20 meses.
TABLA 6 Estabilidad de los viales cerrados resultados del TP (segundos)
5
Adicionalmente, los lotes de investigación según se describieron en el Ejemplo 6 han sido analizados para determinar la estabilidad real a 2-8ºC hasta 12 meses. Los resultados se dan a continuación en la Tabla 7, mostrando que el reactivo funciona dentro de límites aceptables según está definido por los plasmas control, VNC, VACI y VACII.
TABLA 7 Estabilidad de viales cerrados de lotes de investigación resultados de TP (segundos)
6
7
B. Viales abiertos
Seis viales abiertos de los lotes del reactivo de tromboplastina líquido según se describió en el Ejemplo 6, los Lotes de Investigación RL 1-3 y los Lotes de Desarrollo DL 1-3, muestran una estabilidad de al menos 14 días en la Tabla 8 siguiente, cuando se midió su funcionamiento en un ensayo de TP.
TABLA 8 Estabilidad de viales abiertos - Resultados de TP (segundos)
8
9

Claims (9)

1. Un reactivo de tromboplastina líquido que contiene extracto tisular de tromboplastina, iones de calcio, un cloruro metálico del citrato de sodio, gluconato de calcio, estabilizantes uno de los cuales es BSA y antimicrobianos, obtenible mediante (a) extracción de un tejido rico en tromboplastina con una solución que contiene un cloruro de metal y un quelante de iones metálicos débil que comprende citrato sódico y gluconato de calcio, a una concentración en el rango de 25 a 40 g de tejido/l de solución de extracción, (b) dilución 1:1 aproximadamente con una solución que contiene iones de calcio y BSA, y (c) incubación.
2. Un reactivo de tromboplastina líquido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tejido rico en tromboplastina es polvo de acetona de cerebro de conejo.
3. Un reactivo de tromboplastina líquido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que al menos un estabilizante es seleccionado del grupo que consta de albúmina, propionato de sodio, polietilén glicol e iones de gluconato.
4. Un reactivo de tromboplastina líquido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dichos antimicrobianos son seleccionados de azida de sodio, piperacilina, cloramfenicol, ciprofloxacino.
5. Un reactivo de tromboplastina líquido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que contiene adicionalmente propionato de sodio como agente para el ajuste del tiempo de protrombina.
6. Un método para producir un reactivo de tromboplastina líquido que comprende:
(a) lavado del extracto de polvo de acetona de cerebro de conejo (PACC) con agua a una concentración de 10 a 40 g de PACC/l aproximadamente;
(b) calentamiento del extracto de PACC lavado hasta 25ºC aproximadamente;
(c) mezcla del extracto de PACC calentado con una solución de extracción que contiene un cloruro de metal y un quelante de iones metálicos débil que comprende citrato de sodio y gluconato de calcio a una concentración en el rango de 25 a 40 g de PACC/l de solución de extracción, mientras se calienta continuamente a 45ºC aproximadamente;
(d) centrifugación de la solución a una temperatura de 2ºC aproximadamente a 10ºC aproximadamente;
(e) dilución del sobrenadante 1:1 aproximadamente con una solución que contiene albúmina e iones de calcio;
(f) incubación del sobrenadante diluido;
(g) ajuste del pH hasta pH neutro aproximadamente y adición de antimicrobianos;
(h) adición de polietilén glicol desde un 0,1% a un 5% aproximadamente;
(i) análisis de la solución para determinar los valores del tiempo de protrombina, y, si se necesita,
(j) adición de propionato de sodio.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que adicionalmente antes de añadir el propionato de sodio, la solución es ajustada mediante un Factor de Dilución Volumétrico.
8. El reactivo de tromboplastina líquido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para ser utilizado en un método de diagnóstico.
9. Utilización del reactivo de tromboplastina líquido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para la fabricación de un kit de diagnóstico.
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