ES2132174T5 - Reactivo liquido de tromboplastina. - Google Patents
Reactivo liquido de tromboplastina.Info
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Abstract
LA INVENCION ES UN REACTIVO TROMBOPLASTINA LIQUIDA ESTABLE USADO PARA MEDIR EL RENDIMIENTO DEL SISTEMA DE COAGULACION, CON UN ENVEJECIMIENTO EN REPOSO DE MAS DE 16 MESES, Y UN METODO PARA PRODUCIR ESTE REACTIVO.
Description
Reactivo líquido de tromboplastina.
Esta invención se refiere a un reactivo de
tromboplastina líquido estable con una larga caducidad y a un método
para producirlo.
El funcionamiento de las rutas de coagulación y
fibrinolisis del sistema sanguíneo puede ser analizado para detectar
anormalidades en muchos estadios. Uno de los análisis más comúnmente
utilizados es el análisis del tiempo de protrombina (TP). Una
muestra de sangre o de plasma es añadida a tromboplastina en
presencia de calcio, y se mide el tiempo necesario para formar un
coágulo. El Factor VII es activado por la tromboplastina, que a
través de los Factores V y X, origina la formación de trombina a
partir de protrombina (Factor II). La trombina formada corta el
fibrinógeno para dar lugar a fibrina insoluble. El tiempo medido
desde la mezcla de tromboplastina y calcio con una muestra de sangre
hasta la formación de un coágulo, es una medida de la concentración
o de la actividad de los factores de coagulación implicados. Este
análisis es utilizado para monitorizar la terapia con
anticoagulantes orales con el fin de asegurar que se está
administrando al paciente la cantidad correcta de anticoagulante. Se
utilizada también para analizar el funcionamiento del sistema de
coagulación.
La tromboplastina es el reactivo primario para
los análisis anteriores. Actualmente, se obtiene de tejido de
mamífero, normalmente de cerebros de conejo. Otro tejido rico en
tromboplastina, tal como el cerebro humano, la placenta humana y el
cerebro bovino puede ser utilizado, pero se ha encontrado que por el
coste, funcionamiento y disponibilidad, el tejido de cerebro de
conejo es una fuente adecuada de tromboplastina.
La sensibilidad de un reactivo de tromboplastina
reside en varios factores, tales como la composición del reactivo
final, que puede incluir tampones, sales y estabilizantes; el método
de extracción de la tromboplastina del tejido; y la fuente original
del tejido. Hoy día la mayoría de los reactivos de tromboplastina
preparados en el mercado están disponibles solamente como materiales
liofilizados, principalmente por razones de estabilidad del
reactivo. El reactivo de tromboplastina liofilizado reconstituido
tiene una caducidad de cuatro días aproximadamente.
La estabilidad de este reactivo es importante
para el clínico, o para el usuario, ya que es caro y cuanto más
larga sea la caducidad, del recipiente del reactivo abierto y sin
abrir, menos reactivo debe ser desechado debido al periodo de
caducidad cumplido.
Existen problemas inherentes asociados con un
producto liofilizado que son reducidos o eliminados en un producto
líquido. Éstos incluyen (1) variabilidad en el llenado de los viales
antes de la liofilización; (2) diferencias estante a estante, y
diferencias posicionales en un estante en el ciclo de liofilización
(congelación y calentamiento); (3) errores de pipeteo asociados con
la reconstitución y/o con adiciones de volumen erróneas cuando se
reconstituye el polvo; y (4) el agua utilizada para reconstituir
puede no ser pura y/o puede estar contaminada con
microorganismos.
Un reactivo liofilizado es inherentemente más
turbio que un reactivo líquido. La reducción de la turbidez del
reactivo es también un factor importante para producir un reactivo
mejor, ya que el coágulo debe ser detectado tan pronto como sea
formado en el análisis del TP.
Existen muchas maneras de extraer tromboplastina
de los tejidos. La más común es extraer el tejido rico en
tromboplastina en soluciones acuosas o salinas a
25-50ºC. Puede utilizarse una solución
salina-tartrato, después de lo cual el extracto es
centrifugado para eliminar partículas grandes. El sobrenadante
contiene la tromboplastina activa junto con cloruro de sodio y
tartrato de sodio (Patente de EE.UU. 3.522.148). Este extracto puede
ser procesado posteriormente. Por ejemplo, lactato de calcio,
glicina, carboximetilcelulosa e imidazol pueden ser añadidos al
extracto de tromboplastina. Cada aditivo tiene un efecto sobre la
sensibilidad del reactivo. En general, un reactivo de tromboplastina
aceptable debe producir un TP de 9-15 segundos con
una muestra de sangre normal.
Existen también varios procesos diferentes
utilizados para fabricar tromboplastina de cerebro de conejo más
sensible. Hawkins y col., en WO 90/05740, publicada el 31 de Mayo de
1990, describen un método de extracción de tromboplastina de tejido
utilizando sulfato de bario, agentes caotrópicos y detergentes no
iónicos. Sin embargo, el proceso produce solamente un reactivo de
tromboplastina liofilizado y no uno líquido.
Otra solicitud de patente, DE 3150594A1, describe
un proceso similar. Polvo de cerebro de conejo es mezclado con polvo
de celulosa y lavado con tampón acetato de sodio a pH
6,5-8 para eliminar los contaminantes. Es extraído
posteriormente con surfactantes en presencia de iones de calcio. De
nuevo, la tromboplastina producida es estable solamente en forma
liofilizada, con una caducidad corta una vez que ha sido
reconstituida.
Una tromboplastina líquida está disponible
actualmente en Pacific Hemostasis, Inc. Aunque podría parecer que
este reactivo ha superado algunos problemas asociados con los
reactivos liofilizados, no está disponible como reactivo en un único
vial. Dos soluciones, en viales separados, deben ser combinadas para
producir un reactivo con una estabilidad de un mes solamente.
Por tanto, en términos de comodidad, estabilidad
y fiabilidad, un reactivo de tromboplastina líquido sería de valor
para los laboratorios clínicos y de investigación.
La Patente US 3.522.148 describe un método para
producir un reactivo de tromboplastina líquido en el cual se utiliza
una solución de extracción que comprende cloruro sódico y citrato
sódico o gluconato cálcico.
La presente invención es un reactivo de
tromboplastina líquido compuesto de extracto tisular de
tromboplastina, iones de calcio, estabilizantes y antimicrobianos
como se ha reivindicado en la reivindicación 1. Este reactivo tiene
una caducidad, en el recipiente final sin abrir, de al menos 16
meses y una vez abierto, de al menos 10 días.
Se reivindica también como en la reivindicación 6
un método para producir este reactivo de tromboplastina líquido.
Este método de preparación de un reactivo de
tromboplastina es una mejora en la técnica de producción de tal
reactivo en forma líquida, y con un tiempo de caducidad maximizado,
a través del efecto combinado de varios parámetros.
La Fig. 1 es una curva típica de la evolución de
un ensayo de tromboplastina.
La Fig. 2 es una gráfica del efecto de la
concentración de tromboplastina sobre la tasa de coagulación.
La Fig. 3 es una curva de calibrado de
tromboplastina.
La Fig. 4 es un diagrama de flujo del método para
producir el reactivo de tromboplastina líquido.
La Fig. 5 es una gráfica isoterma de la
extracción del polvo de acetona de cerebro de conejo.
La Fig. 6 es una representación gráfica de la
temperatura absoluta frente a la cantidad de tromboplastina extraída
en el equilibrio.
La Fig. 7 es una gráfica del efecto de la
velocidad de mezcla sobre la extracción de polvo de acetona de
cerebro de conejo.
La Fig. 8 es una representación gráfica del
efecto de la fuerza iónica sobre la extracción de polvo de acetona
de cerebro de conejo.
La Fig. 9 muestra el efecto de la concentración
de tromboplastina sobre el tiempo de coagulación de diferentes
plasmas control.
La presente invención es un reactivo de
tromboplastina líquido estable, como se ha reivindicado en la
reivindicación 1, que tiene una caducidad en un recipiente sin abrir
de al menos 16 meses.
Aunque pueden utilizarse varias fuentes de tejido
de las que puede extraerse tromboplastina, tales como cerebro y
placenta humanos, actualmente el cerebro de conejo es la elección
común. El tejido de cerebro de conejo está disponible comúnmente
como un extracto de polvo de acetona. Algunas fuentes del polvo
incluyen Continental Services Group, Inc. (P.O. Box
420-950, 1300 N.W. 36th Street, Miami, Florida, USA
33142) y Pel Freeze Biologicals (P.O. Box 68, 205 N. Arkansas,
Rogers, Arkansas 72556). Es preparado generalmente por el método de
F.A. Pitlick y col., Methods in Enzymology, Vol. XLV, Parte B,
editado por L. Lorand, p. 37, 1976.
Una vez que el cerebro de conejo ha sido
procesado a la forma en polvo, varios factores afectan la extracción
de tromboplastina a partir de él. En particular, el tiempo y la
temperatura de extracción, la velocidad de mezcla, la fuerza iónica
y la concentración de PACC afectan todos la cantidad y la calidad de
la tromboplastina extraída.
El nivel de actividad de tromboplastina de
extractos de PACC puede ser calculado utilizando un ensayo
espectrofotométrico. El ensayo puede ser utilizado para calcular la
concentración de tromboplastina de los extractos frente a un lote de
referencia. Se prepara primeramente una serie de diluciones de un
lote de tromboplastina de referencia utilizando un tampón de muestra
definido, que contiene gluconato de calcio 25 mM, cloruro de sodio
50 mM y tampón Hepes 25 mM, pH 7. La tasa de coagulación de plasma
normal se determina utilizando estas diluciones a partir de curvas
de coagulación generadas a 405 nm (esto es, \DeltaA
máximo/minuto). Una dilución del extracto de tromboplastina
desconocido es analizada de la misma manera y se determina la
concentración con relación al lote de tromboplastina de
referencia.
En un ensayo típico, una alícuota de 0,1 ml de
una dilución dada de la muestra de referencia o de la muestra de
ensayo es añadida a 1 ml de tampón en una microcubeta de 2,9 ml. La
reacción se lleva a cabo a 37ºC y se inicia con la adición de 0,35
ml de plasma normal agrupado. Se determina el cambio de la
absorbancia a 405 nm como función del tiempo utilizando un
espectrofotómetro.
La tasa máxima de cambio es determinada a partir
de la curva de evolución generada y representada gráficamente frente
a las diluciones correspondientes. La Figura 1 muestra una curva de
evolución típica. A la tromboplastina de referencia se le dio una
concentración arbitraria de 1 Unidad. La Figura 2 muestra una
representación gráfica del cambio de la absorbancia (\DeltaA) a
405 nm frente a la concentración de tromboplastina en términos de
Unidades/ml. Los datos sugieren una cinética de saturación y puede
describirse utilizando la ecuación siguiente:
(1)\Delta
A/minuto = \alpha [TPLN]/(\beta +
[TPLN])
donde [TPLN] es la concentración de
la actividad de tromboplastina y \alpha y \beta son constantes.
La Ecuación 1 puede ser transformada en la forma
siguiente:
(2)1/(\Delta
A/minuto) = \beta /\alpha (1/[TPLN]) + 1/\alpha
La Figura 3 muestra una representación gráfica de
1/[TPLN] frente a 1/(\DeltaA/minuto). Curvas de calibrado como
ésta fueron y pueden ser utilizadas para calcular la cantidad de
tromboplastina en cualquier extracto obtenido.
El proceso para producir el reactivo de
tromboplastina líquido estable, es descrito generalmente como:
a) lavado del extracto de polvo de acetona de
cerebro de conejo, permitiendo que se separe la solución y
desechando el sobrenadante;
b) calentamiento del extracto lavado y mezcla del
extracto con una solución de extracción, mientras que se calienta
continuamente la solución a 45ºC aproximadamente;
c) centrifugación de la solución;
d) retirada del sobrenadante y adición de
albúmina e iones de calcio;
e) incubación de la solución;
f) ajuste del pH; y
g) adición de agentes conservantes,
estabilizantes y antimicrobianos.
Específicamente, el método para producir el
reactivo de tromboplastina líquido se describe a continuación y está
en forma de diagrama en la Figura 4. El PACC es lavado inicialmente
con agua desionizada, preferiblemente a 10ºC aproximadamente, pero
un rango aceptable es de 2 a 12ºC aproximadamente, y a una
concentración de 28 gramos de PACC/l de agua aproximadamente. Aunque
28 g/l es la concentración preferible, la concentración puede
oscilar entre 10 y 40 g de PACC/l de agua aproximadamente. La
solución es mezclada a aproximadamente 150 RPM durante unos 15
minutos y se deja que sedimente durante una noche a 10ºC. El
sobrenadante es desechado.
El lavado con agua a 2-8ºC
elimina solamente el 0,2% de la actividad de tromboplastina
disponible del polvo. Sin embargo, niveles significativos de enzimas
solubles tales como lipasas y proteasas, y sales, cromóforos,
bacterias y partículas son eliminados bajo estas condiciones.
Las ventajas de lavar el PACC antes de la
extracción son numerosas. Primeramente, el procedimiento de lavado
elimina parcialmente bacterias muertas y viables, junto con polvo y
otros desechos. Esta descontaminación tiene como resultado, entre
otras cosas, una claridad óptica mejorada. Además, la etapa de
lavado minimiza el efecto de las variaciones del tamaño de
partículas del PACC, ya que el polvo está completamente humedecido
durante el periodo de sedimentación de una noche. Esta etapa
normaliza también las posibles variaciones de la concentración de
sales y proteínas solubles en el PACC debido a que se utiliza un
exceso de agua.
El PACC húmedo es calentado a 25ºC
aproximadamente, y se añade posteriormente la Solución de Extracción
precalentada a 45ºC aproximadamente. El rango de las concentraciones
de PACC estudiado fue de 25,0 a 40,0 gramos por litro de Solución de
Extracción. La concentración más preferida es 35 gramos de PACC por
litro de Solución de Extracción. Esta cantidad de PACC tuvo como
resultado la máxima cantidad de tromboplastina extraída en una
etapa. Cantidades mayores de PACC (esto es, 40 g/l) no produjeron
incrementos proporcionales del rendimiento. Cantidades inferiores de
PACC (esto es, <30 g/l) podrían poner en peligro el reactivo
durante aquellos periodos del año en los que el polvo de cerebro de
conejo disponible es de peor calidad. La concentración más preferida
de los diferentes componentes de la Solución de Extracción se
describe en la Tabla 1.
Estas condiciones de extracción tuvieron como
resultado el rendimiento máximo de actividad de tromboplastina.
Además, estas condiciones produjeron el tiempo de coagulación normal
más bajo y una sensibilidad próxima a la diana alcanzable antes del
ajuste del volumen final del lote de reactivo, llamado "aumento de
volumen".
Componente | Concentración (peso/vol) |
Cloruro de sodio | 0,85% |
Citrato de sodio | 0,40% |
Gluconato de calcio | 3,0 mM |
Aunque la concentración preferida de cada uno de
los componentes de la Solución de Extracción se da en la Tabla 1
anterior, un rango aceptable para el cloruro de sodio es del 0,5% al
1,5% aproximadamente; para el citrato de sodio, del 0,2% a 0,6%
aproximadamente y para el gluconato de calcio, de 2 mM a 6 mM
aproximadamente.
El cloruro de sodio tiene un efecto significativo
sobre el rendimiento de la tromboplastina obtenida. La tasa de
extracción incrementa proporcionalmente con una fuerza iónica
creciente hasta un punto máximo, después del cual la tasa disminuye
con un incremento posterior de la fuerza iónica. El cloruro de
sodio, aunque se encontró que era el reactivo preferido, puede ser
también sustituido por sales cloruro de otros iones metálicos
monovalentes, tales como potasio y litio, con un efecto similar.
El nivel de calcio tiene un papel menor en el
rendimiento obtenido pero tiene un efecto dramático sobre el rango
normal y la sensibilidad de la tromboplastina resultante. El
gluconato de calcio proporciona el calcio necesario para la cascada
de coagulación que tiene como resultado la formación de un coágulo.
La extracción del PACC en ausencia de calcio tiene como resultado
una preparación con tiempos de coagulación de plasma normal bajos
después de la recalcificación, pero una sensibilidad muy pobre a los
plasmas de pacientes anormales. Dentro de ciertos rangos, utilizando
concentraciones crecientes de calcio en la Solución de Extracción,
el extracto resultante tiene una sensibilidad mayor a plasmas
anormales y tiempos de coagulación normales mayores.
Estudios previos han mostrado que la estabilidad
de la tromboplastina se incrementa cuando se añade calcio en forma
de la sal gluconato de calcio en lugar de cloruro de calcio.
Cationes divalentes, tales como calcio y magnesio, pueden unirse
potentemente a membranas, particularmente a las que contienen
fosfolípidos ácidos.
La unión por calcio y magnesio puede producir
agregación de vesículas, cuya fuerza directriz son presumiblemente
interacciones de van der Waals. La velocidad de fusión incrementa
con la temperatura y con la fluidez de las membranas, y es
especialmente rápida a la temperatura de la transición de fases. La
estabilidad mejorada observada con la utilización de sales de calcio
de ácidos carbohidratados, tales como gluconato, puede ser atribuida
a la formación de complejos de coordinación o a través de un
secuestro parcial de iones de calcio. Estudios de optimización de la
respuesta de superficies indicaban que la concentración óptima de
calcio era de 11,0 mM.
El citrato de sodio es un quelante débil de iones
divalentes y, de este modo, modula el efecto del calcio. En otras
palabras, el citrato secuestra parte del calcio disponible y reduce
su concentración eficaz. A medida que procede la extracción y el
calcio es unido por otros componentes que están siendo liberados a
la solución (esto es, proteínas y lípidos), el equilibrio del calcio
es desplazado y se libera el calcio unido al citrato. Este proceso,
en la práctica, mantiene una concentración semiconstante de calcio
durante la extracción. Aunque el citrato de sodio y el gluconato de
calcio son los compuestos en el reactivo, los iones de calcio pueden
ser además suministrados por, por ejemplo, tartrato de calcio y
lactato de calcio.
La dispersión PACC
húmedo-Solución de Extracción es calentada
posteriormente a 45ºC aproximadamente mientras que se mezcla a unas
400 RPM durante 50 minutos aproximadamente. La velocidad de
extracción no cambia dramáticamente cuando se incrementan las RPM
desde 100 a 500 RPM. Sin embargo, la magnitud de la cantidad
extraída con el tiempo aumenta significativamente con una mezcla más
rápida.
La dispersión es luego centrifugada a 1800 RPM
aproximadamente durante 20 minutos a 4ºC. Éstas son las condiciones
óptimas. Condiciones aceptables incluyen una centrifugación de 1500
RPM a 2200 RPM durante 15 a 30 minutos aproximadamente y de 2ºC
aproximadamente a 10ºC aproximadamente.
El sobrenadante es vuelto a calentar y es diluido
1:1 aproximadamente con una solución de seroalbúmina bovina (BSA) al
1% y gluconato de calcio 0,019 M.
La albúmina tiene múltiples funciones en esta
formulación. Se cree que la seroalbúmina ayuda a estabilizar los
sistemas de vesículas lipídicas intercalándose en las bicapas
lipídicas y haciéndolas más rígidas. Además, la albúmina protege a
las proteínas activas enmascarando la acción de las proteasas
degradantes. Se requiere una calidad de BSA sin proteasas para una
estabilidad óptima del producto. El extracto diluido es incubado
durante 1 hora aproximadamente a 37ºC. Este periodo de incubación
permite la recalcificación del extracto y la fusión de las vesículas
para un estado termodinámicamente favorable.
Después de la incubación, el extracto es enfriado
hasta 25ºC aproximadamente, se ajusta el pH a alrededor de 6,6 y se
añaden, si se desea, los estabilizantes, antimicrobianos y
conservantes.
Aunque el polietilén glicol (PEG) tiene una
variedad de utilizaciones en esta formulación, uno de los usos es
como estabilizante y conservante. Se utiliza también albúmina como
estabilizante, y se utiliza propionato de sodio como ambos.
El grado de deshidratación de las bicapas juega
un importante papel en la inducción de la fusión de las membranas
vesiculares. Potentes fuerzas de hidratación tienen que ser
superadas para permitir que las membranas lleguen a una estrecha
proximidad. Por esta razón, agentes de deshidratación, tales como
PEG y dextrano, pueden tener un efecto significativo sobre la
velocidad de fusión de las vesículas de fosfolípidos.
Hoekstra realizó experimentos de fusión en
presencia de PEG que sugieren que el grado de deshidratación de la
bicapa y la creación de "defectos puntuales" en la bicapa son
factores dominantes en los efectos iniciales de la fusión. (D.
Hoekstra, J. Amer. Chem. Soc., 21, p. 2834, (1982)). El PEG, en
ausencia de calcio o de magnesio, puede agregar las vesículas sin
fusión, mientras que el PEG en presencia de pequeñas cantidades de
cationes divalentes (esto es, >0,5 mM) facilita la fusión.
Claramente por tanto, el PEG podría afectar a la
estabilidad de la formulación de tromboplastina. Sin embargo, el PEG
proporciona un mecanismo eficaz para modular los tiempos de
coagulación normales y para el ajuste de las sensibilidades a los
Factores. Además, el PEG mejora las características de dispersión
del producto. El efecto desestabilizante es mínimo a concentraciones
por debajo del 2%.
Estudios del efecto de PEG-1450
mostraron que a concentraciones entre el 0,1% y el 5% había una
disminución gradual del TP de todos los plasmas de referencia,
incluyendo plasma deficiente en Factor VII y plasma cumadínico.
Además, estudios del tamaño de las partículas mostraron cambios
considerables del tamaño de las vesículas, particularmente por
encima del 2% de PEG-1450. Por encima del 2,0% de
PEG-1450 pero por debajo del 15%, la distribución de
tamaños es más estrecha.
Por encima del 15%, PEG-1450 hace
que se forme un precipitado en los plasmas de referencia y este
precipitado imita la formación de coágulos en ausencia de
tromboplastina. Esta observación indica que el PEG acorta
probablemente los valores de TP estimulando e incrementando la
agregación de las hebras de fibrina durante el proceso de
coagulación.
Se utiliza propionato de sodio para ajustar el
tiempo de coagulación de la preparación de tromboplastina con
controles de plasma y con muestras de pacientes, si es necesario. Se
ha encontrado de manera general que puede añadirse hasta un 0,4% de
propionato de sodio a la formulación final del reactivo de
tromboplastina. La adición de propionato de sodio incrementa el
tiempo de coagulación de todos los plasmas. Sin embargo, el tiempo
de coagulación aumentará más dramáticamente para los plasmas con un
tiempo de coagulación más largo (esto es, plasmas cumadínicos) que
para los plasmas normales. El propionato de sodio está también
enumerado en el Index Merck como fungicida y preventivo de
mohos.
A la formulación pueden añadirse también
antimicrobianos. Por ejemplo, en una combinación preferida se añade
azida de sodio de un 0,02% a un 0,06% aproximadamente y
piperacilina, cloramfenicol y ciprofloxacino, todos del 0,007% al
0,015% aproximadamente. Los antimicrobianos son añadidos para
reducir o eliminar la contaminación microbiológica, incluyendo
bacterias y hongos, todos los cuales podrían afectar de manera
adversa la estabilidad del reactivo de tromboplastina. Esto es
particularmente importante ya que la tromboplastina no puede ser
esterilizada por filtración para eliminar bacterias debido a la
naturaleza vesicular del complejo de tromboplastina.
Las paredes celulares de los microorganismos
vivos permitirán el paso solamente de moléculas de peso molecular
pequeño. Las macromoléculas presentes en el entorno de las bacterias
deben ser degradadas antes de que puedan ser internalizadas y
digeridas. Las bacterias, particularmente las que son gram
positivas, secretan diferentes enzimas al medio que las rodea. Estos
enzimas incluyen en particular, proteasas, lipasas, fosfolipasas,
peptidasas y nucleasas. Las bacterias gram negativas retienen estos
enzimas entre la membrana plasmática y la pared celular.
Después de la muerte, la pared celular y la
membrana de estas bacterias se degradarán teniendo como resultado la
liberación al entorno del mismo tipo de enzimas degradantes
encontrados en ambos tipos de bacterias.
La estabilidad de los reactivos de tromboplastina
depende sustancialmente del mantenimiento de la integridad de sus
componentes proteicos y lipídicos. Por tanto, el nivel de
contaminación bacteriana, ya sean gram positivas o gram negativas,
viables o muertas, es muy significativo para la caducidad. Además,
aunque menos pronunciado, los mohos y hongos tienen un efecto
similar.
Hay numerosas fuentes de contaminación
bacteriana. Éstas pueden ser introducidas en las materias primas
(por ejemplo, PACC, gluconato de calcio, BSA), en el proceso de
fabricación, en el entorno de utilización (esto es, en el vial
abierto) y en los mecanismos de transferencia tales como válvulas,
tubos y sondas. Debido a la variedad de fuentes bacterianas, los
agentes antimicrobianos utilizados en esta formulación tienen un
doble fin. Primeramente, deben eliminar las bacterias y los hongos
durante las etapas de fabricación y, segundo, deben impedir la
contaminación mientras el producto está en uso durante un periodo de
tiempo especificado.
Las características de una combinación óptima son
una amplia acción bacteriostática y bactericida con interacciones
despreciables con el producto en términos de funcionamiento y
aspecto. Cualquier antimicrobiano que proporcione tal protección
puede ser útil en esta formulación.
Los compuestos antimicrobianos analizados podrían
ser clasificados como a) productos químicos reactivos tales como
azida de sodio, b) inhibidores reversibles, tal como ditiotreitol,
c) antibióticos, tal como Espiromicina y d) destructores de
membranas, tal como fenol. Parece que, en general, las bacterias
gram negativas son más nocivas para el reactivo que las bacterias
gram positivas. Por tanto, es crítico eliminar estos tipos de
bacterias al principio del procedimiento de procesado. Además, los
compuestos reactivos químicamente, aunque eficaces para eliminar
bacterias, son nocivos para la estabilidad a largo plazo del
reactivo de tromboplastina líquido según se dedujo de estudios de
estabilidad acelerada. Finalmente, eliminando las células viables y
muertas, el lavado del PACC mejora la acción antimicrobiana de los
agentes analizados.
Pseudomonas maltophilia es una cepa
persistente y extremadamente nociva para la tromboplastina líquida.
La combinación antimicrobiana preferida es muy eficaz para eliminar
esta clase particular de microbio. Esta combinación consta de azida
de sodio, piperacilina, cloramfenicol y ciprofloxacino. El modo de
acción de cada uno de estos compuestos es bastante diferente. La
piperacilina inhibe la síntesis de la pared celular. El
cloramfenicol inhibe la síntesis de proteínas, mientras que el
ciprofloxacino inhibe la replicación del ADN. La azida de sodio
interfiere con el sistema de citocromos y tiene también algunas
propiedades antifúngicas.
Se sometieron a selección varios agentes
antibacterianos y antifúngicos para encontrar las combinaciones más
eficaces. Algunas alternativas disponibles incluyen las
siguientes.
La familia de antibióticos de la penicilina
incluye también las acilaminopenicilinas, que incluyen la
piperacilina, azlocilina y mezlocilina. Estos antibióticos tienen
una actividad incrementada contra muchos organismos gram negativos
presentes en el PACC y en el entorno de la fabricación. Son también
capaces de inhibir las beta-lactamasas de
Klebsiella pneumoniae, un microorganismo común. La
piperacilina puede ser sustituida también por Espiromicina.
La azida de sodio es un agente antifúngico eficaz
y barato. Clotrimazol, 5-fluorocitosina y nistatina
son también eficaces como fungicidas.
Las quinolonas, tales como ciprofloxacino y
norfloxacino son también antimicrobianos de amplio espectro.
Gentamicina, estreptomicina y amikacina pueden servir también como
sustitutos de las quinolonas.
El cloramfenicol es un inhibidor de la síntesis
de proteínas. La tetraciclina podría ser utilizada como una
alternativa, aunque hemos encontrado que esto requeriría
concentraciones más elevadas de los tres antibióticos restantes.
El extracto que contiene los antimicrobianos se
ajusta a un pH de 6,6 aproximadamente y se mantiene a
2-8ºC aproximadamente durante una noche. Esta
incubación es utilizada para disminuir rápidamente la carga
microbiana.
Una vez que el extracto ha sido preparado
totalmente, debe controlarse la variabilidad del PACC. Las razones
de esta variabilidad son numerosas e incluyen, por ejemplo, los
cambios hormonales de los conejos durante el año. Esta situación
tiene como resultado que algunos extractos son "más ricos" en
tromboplastina que otros y, finalmente, se refleja en las
características de funcionamiento del reactivo final.
Hemos utilizado un ensayo de tromboplastina para
determinar las concentraciones de tromboplastina. Se preparan
primeramente una serie de diluciones de un lote de tromboplastina de
referencia utilizando un tampón de muestra definido, que contiene
gluconato de calcio, cloruro de sodio y tampón HEPES, pH 7. Se
determina la tasa de coagulación de plasma normal utilizando estas
diluciones a partir de curvas de coagulación producidas a 405 nm
(esto es, \DeltaA máximo/minuto). Se analiza de la misma manera
una dilución de una tromboplastina desconocida y se determina la
concentración en relación con el lote de referencia a partir de la
curva de calibrado. Este procedimiento normaliza eficazmente la
concentración de tromboplastina para compensar la variación
encontrada en el PACC.
Las concentraciones finales preferidas de todos
los componentes del reactivo de tromboplastina se muestran en la
Tabla 2.
Según se muestra en la Tabla 2, los componentes
de la formulación final son gluconato de calcio, citrato de sodio,
cloruro de sodio, PEG-1450, seroalbúmina bovina,
propionato de sodio y extracto de PACC. La formulación incluye
también una combinación de cuatro compuestos antimicrobianos.
La tolerancia de la formulación a la variabilidad
de la concentración de los componentes es aproximadamente \pm 5%
para cada constituyente. Los componentes cuya concentración afecta
más al funcionamiento de la tromboplastina líquida son el citrato de
sodio, el propionato de sodio y el cloruro de sodio.
El pH del reactivo de tromboplastina líquido es
ajustado preferiblemente a 6,6 \pm 0,19.
La concentración final obtenida proporciona a la
formulación una buena sensibilidad hacia los plasmas de pacientes
cumadinizados. Otros factores de la formulación, tales como el
propionato de sodio, PEG-1450, gluconato de calcio y
la concentración de tromboplastina, contribuyen todos a la
sensibilidad final del reactivo.
Los ejemplos siguientes se dan para explicar
adicionalmente la invención, y no tienen la intención de limitar de
ninguna manera la invención.
Se utilizaron los reactivos siguientes a lo largo
de los ejemplos:
- Polvo de acetona de cerebro de conejo
- Ácido D-glucónico/sal de
hemicalcio - solución madre de 0,05 M (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO, EE.UU.)
- Cloruro de sodio, USP Granular
- Citrato de sodio, dihidrato - solución madre al
10%
- Polietilén glicol-1450 -
solución madre al 20% (J.T. Baker Chemical Co., Buffalo Grove, IL,
EE.UU.)
- Seroalbúmina bovina (BSA)
- Ácido propiónico, sal sódica - solución madre
al 10%
- Azida de sodio
- Cloramfenicol
- Ciprofloxacino
- Piperacilina
- Plasma agrupado normal (NPP)
- Plasma control con Citrato Normal Verify®-VNC
(Verify es una marca registrada de Organon Teknika Corporation,
Durham, N.C., EE.UU.).
- Nivel de Citrato I Anormal Verify® (VACI) –
plasma anormal
- Nivel de Citrato II Anormal Verify® (VACII) –
plasma anormal
- Verify® 1 - control de plasma normal
- Verify® 2 y 3 (controles de plasma
anormales)
Polvo de acetona de cerebro de conejo fue lavado
con agua desionizada a 10ºC a una concentración de 28 g de PACC/l de
H_{2}O. El PACC fue lavado mezclando a 150 RPM durante 15 minutos.
El PACC húmedo sedimentó durante una noche a 10ºC. El sobrenadante
fue retirado por succión y desechado. El PACC húmedo fue calentado a
25ºC y se añadió una solución de extracción precalentada a 45ºC. La
solución de extracción consistía en una solución acuosa de cloruro
de sodio al 0,85%, citrato de sodio al 0,40% y gluconato de calcio
3,0 mM. La dispersión fue calentada a 45ºC mientras se mezclaba a
400 RPM durante 50 minutos. El extracto fue centrifugado
posteriormente a 1800 RPM durante 20 minutos a 4ºC, y se retiró el
sobrenadante.
El sobrenadante fue diluido 1 a 1 con una
solución de BSA 1% y gluconato de calcio 0,019 M e incubado durante
1 hora a 37ºC. El extracto diluido fue luego enfriado hasta 25ºC y
se añadió azida de sodio 0,05%, piperacilina 0,01%, cloramfenicol
0,01% y ciprofloxacino 0,01%. Se ajustó el pH del extracto diluido a
6,65 y se refrigeró durante una noche a 2-8ºC.
Con de fin de minimizar los efectos de la
variabilidad de lotes diferentes de PACC, la concentración de la
tromboplastina en el extracto diluido fue determinada típicamente
utilizando un procedimiento simplificado denominado Factor de
Dilución Volumétrico (BDF). Para obtener el BDF, se preparan una
serie de diluciones a pequeña escala del extracto diluido. Por
ejemplo, la concentración final de cada uno de los componentes de
carga, según se ve en la Tabla 2, se mantiene constante en seis
matraces, mientras que se añaden cantidades variables de la Solución
de Extracción de tromboplastina, y posteriormente se diluye cada
matraz con agua hasta un volumen constante. Las concentraciones
finales preferidas de tromboplastina oscilan de 1,4 a 1,9 veces.
Efectivamente, sólo la concentración de tromboplastina cambia de
solución a solución. Las soluciones son posteriormente analizadas
para determinar los valores del TP utilizando plasma agrupado
normal, plasmas control, plasma deficiente en Factor VII y varios
plasmas de pacientes tratados con cumadina. El BDF óptimo (esto es,
la concentración óptima de tromboplastina) es elegido a partir de
los resultados obtenidos.
Si no pueden obtenerse valores de funcionamiento
óptimos, se prepara un segundo grupo de soluciones de ensayo
utilizando el mejor BDF obtenido previamente y diferentes
concentraciones de propionato de sodio. El tener la flexibilidad de
ajustar el extracto diluido con el BDF y con propionato de sodio
minimiza el impacto de la variabilidad del PACC.
La composición final del reactivo de
tromboplastina líquido preparado fue gluconato de calcio 11,0 mM,
PEG-1450 1,5%, cloruro de sodio 0,25%, citrato de
sodio 0,2%, BSA 0,3%, propionato de sodio 0-0,5%
(variable), azida de sodio 0,03%, piperacilina 0,008%, cloramfenicol
0,006% y ciprofloxacino 0,006%.
Los estudios sobre el efecto del tiempo y la
temperatura sobre la eficacia de la extracción se realizaron a 37ºC,
42ºC, 45ºC, 47ºC y 50ºC.
A cada una de las cinco temperaturas estudiadas,
se utilizó un recipiente de 600 ml con camisa exterior para preparar
el baño de agua. Se utilizaron tubos de centrífuga de 200 ml como
recipientes de reacción. Se utilizó un baño de agua circulante para
el control de la temperatura. La Solución de Extracción fue mezclada
continuamente con un agitador superior graduado a 500 RPM.
La Solución de Extracción fue colocada en el
recipiente de reacción y se dejó equilibrar a la temperatura durante
0,5 horas con agitación. Posteriormente se espolvorearon 20 gramos
de PACC en la solución. La solución fue agitada continuamente a 750
RPM. Se extrajeron alícuotas de 10 ml a intervalos de tiempo (10,
20, 30, 60, 90, 120 minutos, etc. hasta 24 horas).
Las alícuotas fueron centrifugadas a 5ºC, 1800
RPM, durante 20 minutos. El sobrenadante de cada muestra fue
transferido a viales de vidrio de 10 ml y analizado para determinar
la actividad de tromboplastina.
La Figura 5 muestra la cantidad de tromboplastina
(Unidades por ml) extraída como función del tiempo y de la
temperatura. La Figura 5 muestra que después de un periodo inicial
de 25-50 minutos, la cantidad de tromboplastina
extraída es una función lineal del tiempo a todas las temperaturas.
La porción inicial no lineal de las curvas de extracción corresponde
probablemente al humedecimiento del PACC.
Se generó una curva
superficie-respuesta obteniendo una relación
matemática entre la cantidad de tromboplastina extraída (TPLN) con
respecto al tiempo y a la temperatura. Los datos daban un buen
ajuste a un modelo cúbico según se estimó por la desviación estándar
y los parámetros de influencia obtenidos. La ecuación es según
sigue:
(3)2,1T^{2}t +
2,5Tt + 0,70T^{2} - 0,60t^{2} + 3,5T + 1,6t +
2,0
en la que T es la temperatura y t
corresponde al tiempo. La Figura 5 muestra también que la cantidad
de TPLN extraída incrementa con la temperatura de
extracción.
Se derivó un modelo matemático sencillo que
relacionaba la temperatura de extracción con la cantidad de TPLN
extraída. El modelo está basado en el hecho de que el potencial
químico, \mu, de la TPLN en el equilibrio debe ser constante en
ambas fases:
(4)\mu (PACC)
= \mu
(B)
(5)\mu
^{0}(PACC) + RT \ ln \ y = \mu ^{0}(B) + RT \ ln \
x
donde los \mu^{0}s son los
potenciales químicos en los estados de referencia estándar, B es el
tampón de extracción, x es la concentración de TPLN en el tampón de
extracción, y es la concentración de TPLN en el PACC, y R es la
constante gaseosa universal. El modelo asume que después de 4 horas
de extracción, el sistema se aproxima al equilibrio. La Figura 5
muestra que ésta es una hipótesis aceptable, excepto quizás a 50ºC
donde la tasa de extracción es elevada y, también, donde puede estar
actuando un mecanismo
secundario.
La Ecuación 5 puede ser transformada en la forma
siguiente:
(6)ln\ K =
\sigma /R \
(1/T)
donde K es el coeficiente de
reparto (x/y) y \sigma es una combinación de constantes. La Figura
6 muestra una representación gráfica de 1/T frente al logaritmo de
la tromboplastina extraída en unidades. Con la excepción del punto
correspondiente a 50ºC, los puntos se ajustan a una relación lineal
como se pronosticó a partir del
modelo.
La desviación del modelo a 50ºC enfatiza la
cantidad considerablemente diferente de tromboplastina extraída a
esta temperatura. La Tabla 3 muestra una comparación de la tasa de
extracción a diferentes temperaturas.
Temperatura | Tasa de extracción |
(mUnidades/minuto) | |
37,0 | 2,67 |
42,0 | 5,40 |
45,0 | 5,14 |
47,0 | 11,3 |
50,0 | 25,6 |
La extracción incrementada entre 47ºC y 50ºC
puede indicar que ésta es la región de temperatura correspondiente a
la Temperatura Crítica (Tc) de los lípidos de la suspensión. Por
encima de la Tc las vesículas lipídicas son más fluidas y, por lo
tanto, se dispersan más eficazmente. Por debajo de la Tc, las
vesículas son más rígidas y disminuye la extracción. La Tabla 3
muestra que la tasa de extracción cambia muy poco en la región de
42ºC a 45ºC. En esta región de temperatura la variabilidad lote a
lote estaría minimizada.
Se realizaron estudios sobre el efecto de la
velocidad de mezcla en la tasa de extracción del PACC.
Los experimentos fueron realizados a 100, 175,
250, 350 y 500 RPM según sigue:
Se colocaron 1000 ml de la Solución de
Extracción, según se describió en el Ejemplo 1, en un matraz Dewar
de acero inoxidable de 2 litros (10,5 cm de diámetro x 31 cm de
altura) y se dejaron calentar hasta la temperatura de extracción de
45ºC. La temperatura en el tanque fue monitorizada. Se espolvorearon
20 gramos de PACC sobre la parte superior de la solución de
extracción sin agitación. El tiempo cero fue definido como la
activación del agitador a cada una de las graduaciones de RPM
anteriores. Se retiraron muestras cada diez minutos y se
centrifugaron a 1200 RPM durante 3 minutos. El sobrenadante fue
diluido con tampón y refrigerado. Las muestras diluidas fueron
analizadas para determinar la concentración de tromboplastina
utilizando el ensayo de tromboplastina descrito anteriormente.
Los resultados obtenidos indicaban que la tasa de
extracción no cambiaba dramáticamente con velocidades de mezcla
crecientes. Por otra parte, la magnitud de la cantidad extraída con
el tiempo incrementaba significativamente con una mezcla más
rápida.
La mezcla más rápida desplaza la cantidad total
extraída hacia valores más elevados sin afectar considerablemente a
las pendientes de las curvas. La Figura 7 muestra la cantidad de
tromboplastina extraída a 45ºC después de 60 minutos a diferentes
velocidades de mezcla. La Figura 7 muestra que existe una relación
lineal entre la cantidad de tromboplastina extraída y la velocidad
de mezcla.
Se colocó PACC (0,15 g) en tubos de ensayo de
plástico de 8-5 ml. Se preparó una solución madre de
NaCl 1 M y se añadieron a cada tubo 3 ml de solución de NaCl
(correspondiendo a una molaridad de 0 a 1 M). Los tubos fueron
agitados en vórtex durante 5 segundos cada uno y situados en un baño
de agua a 45ºC. Después de una incubación de 10 minutos, los tubos
fueron agitados en vórtex durante 5 segundos y se volvieron a
colocar en el baño de agua durante 5 minutos adicionales. Al final
del periodo de 15 minutos, los tubos fueron centrifugados a 1800 RPM
durante 20 minutos a 4ºC. El sobrenadante fue diluido posteriormente
30 veces en tampón y analizado para determinar la concentración de
tromboplastina. La concentración de NaCl fue convertida en fuerza
iónica.
La Figura 8 muestra una representación gráfica
del valor de la actividad de tromboplastina obtenida como función de
la fuerza iónica del tampón de extracción. La Figura 8 muestra que
la tasa de extracción aumenta con una fuerza iónica creciente hasta
un punto máximo, después del cual la tasa disminuye con el
incremento posterior de la fuerza iónica.
Una posibilidad para la existencia de un punto
máximo es que la fuerza iónica acelera también la tasa de
sedimentación durante la centrifugación. Por tanto, la tasa de
sedimentación aumentada tendrá como resultado una reducción aparente
de la tasa de extracción, ya que las muestras son analizadas para
determinar la concentración de TPLN utilizando el sobrenadante
después de la centrifugación del extracto.
Un vial de tromboplastina extraída fue diluido
con tampón hasta 32 veces y las diferentes diluciones fueron
ensayadas utilizando plasma agrupado normal (NPP) y controles de
plasma con Citrato Normal Verify® (VNC), y con Niveles de Citrato
Anormales I y II Verify® (VACI y VACII). Las concentraciones de
tromboplastina fueron determinadas en las diluciones.
La Figura 9 muestra una representación gráfica
del efecto de la concentración de TPLN sobre el tiempo de
coagulación utilizando NPP, Citrato Normal Verify® y Niveles
Anormales I y II Verify®. La Figura 9 muestra curvas de saturación
típicas en el caso de NPP y VNC, con un ligero incremento de los
valores a concentraciones elevadas de TPLN. En el caso de los
plasmas anormales, sin embargo, los valores aumentan
considerablemente con concentraciones crecientes de TPLN. Este
efecto es observado también con plasma deficiente en Factor VII y
con plasma de pacientes cumadinizados.
Estos datos indican que cuando las condiciones de
extracción tienen como resultado una TPLN de 1,5 Unidades
aproximadamente, pequeñas desviaciones de la diana producirían
cambios considerables de las características de funcionamiento.
Además, durante el almacenamiento de larga duración, pequeñas
disminuciones de la concentración de TPLN serían muy perceptibles en
términos de tiempos de coagulación. Por otra parte, valores de TPLN
en el rango de 0,5 a 1,0 Unidades ajustan mucho mejor la
variabilidad de la TPLN y tendrían como resultado preparaciones con
una estabilidad a largo plazo más elevada.
Según se observa en la Tabla 4, los cuatro lotes
de investigación (RL1 - RL4), preparados como en el Ejemplo 1, dan
resultados similares en varios ensayos en comparación con un
reactivo de tromboplastina estándar industrial, Simplastin Excel, y
exhiben generalmente muy buena reproducibilidad de lote a lote.
Adicionalmente, la Tabla 5 resume resultados
similares para otros cinco lotes de reactivo de tromboplastina
líquido preparados también como en el Ejemplo 1 (Verify® 1, 2 y 3
son utilizados como plasmas control). Estos cinco lotes de
desarrollo fueron preparados como en el Ejemplo 1. La
reproducibilidad lote a lote vista es el resultado del proceso según
se describe en esta especificación junto con estabilizantes y
agentes antimicrobianos.
El Índice de Sensibilidad Internacional (ISI) es
un valor de calibrado determinado empíricamente que refleja la
sensibilidad a los anticoagulantes orales de un reactivo de
tromboplastina cuando se compara con la Preparación de Referencia
Internacional de la Organización Mundial de la Salud. Los valores
del ISI del reactivo líquido preparado como en el Ejemplo 1 fueron
determinados utilizando un lote de referencia calibrado frente a la
Referencia Internacional de la Organización Mundial de la Salud.
Una serie de plasmas de pacientes cumadinizados y
plasmas normales fueron analizados con el reactivo de tromboplastina
de ensayo y con el reactivo de tromboplastina de referencia para
determinar los valores del TP. Se obtuvo la regresión ortogonal
log-log de una representación gráfica de los TPs de
referencia frente a los de ensayo. La pendiente de la línea de
regresión, cuando se multiplica por el ISI del reactivo de
referencia, da el ISI del reactivo de ensayo. Los resultados
compactos obtenidos para cinco lotes de desarrollo del reactivo de
tromboplastina líquido se muestran en la Tabla 5, y para cuatro
lotes de investigación del reactivo de tromboplastina líquido en la
Tabla 4.
Se preparó un lote de reactivo de tromboplastina
líquido de manera similar a la descrita en el Experimento 1, y
contenía PACC, PEG-1450, BSA, citrato de sodio,
cloruro de sodio, gluconato de calcio, azida de sodio y timerosal.
Muestras de este lote habían sido almacenadas a
2-8ºC durante 24 meses. Se llevaron a cabo análisis
del TP en duplicados de este lote y se muestran en la Tabla 6. Los
resultados muestran que los resultados del TP a los 20 meses son
comparables entre el estándar industrial, Simplastin Excel, y este
lote, y que el lote daba resultados similares a los 0 meses y a los
20 meses.
Adicionalmente, los lotes de investigación según
se describieron en el Ejemplo 6 han sido analizados para determinar
la estabilidad real a 2-8ºC hasta 12 meses. Los
resultados se dan a continuación en la Tabla 7, mostrando que el
reactivo funciona dentro de límites aceptables según está definido
por los plasmas control, VNC, VACI y VACII.
Seis viales abiertos de los lotes del reactivo de
tromboplastina líquido según se describió en el Ejemplo 6, los Lotes
de Investigación RL 1-3 y los Lotes de Desarrollo DL
1-3, muestran una estabilidad de al menos 14 días en
la Tabla 8 siguiente, cuando se midió su funcionamiento en un ensayo
de TP.
Claims (9)
1. Un reactivo de tromboplastina líquido que
contiene extracto tisular de tromboplastina, iones de calcio, un
cloruro metálico del citrato de sodio, gluconato de calcio,
estabilizantes uno de los cuales es BSA y antimicrobianos, obtenible
mediante (a) extracción de un tejido rico en tromboplastina con una
solución que contiene un cloruro de metal y un quelante de iones
metálicos débil que comprende citrato sódico y gluconato de calcio,
a una concentración en el rango de 25 a 40 g de tejido/l de solución
de extracción, (b) dilución 1:1 aproximadamente con una solución que
contiene iones de calcio y BSA, y (c) incubación.
2. Un reactivo de tromboplastina líquido de
acuerdo con la reivindicación 1, en el que el tejido rico en
tromboplastina es polvo de acetona de cerebro de conejo.
3. Un reactivo de tromboplastina líquido de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que al
menos un estabilizante es seleccionado del grupo que consta de
albúmina, propionato de sodio, polietilén glicol e iones de
gluconato.
4. Un reactivo de tromboplastina líquido de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3,
en el que dichos antimicrobianos son seleccionados de azida de
sodio, piperacilina, cloramfenicol, ciprofloxacino.
5. Un reactivo de tromboplastina líquido de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4,
que contiene adicionalmente propionato de sodio como agente para el
ajuste del tiempo de protrombina.
6. Un método para producir un reactivo de
tromboplastina líquido que comprende:
(a) lavado del extracto de polvo de acetona de
cerebro de conejo (PACC) con agua a una concentración de 10 a 40 g
de PACC/l aproximadamente;
(b) calentamiento del extracto de PACC lavado
hasta 25ºC aproximadamente;
(c) mezcla del extracto de PACC calentado con una
solución de extracción que contiene un cloruro de metal y un
quelante de iones metálicos débil que comprende citrato de sodio y
gluconato de calcio a una concentración en el rango de 25 a 40 g de
PACC/l de solución de extracción, mientras se calienta continuamente
a 45ºC aproximadamente;
(d) centrifugación de la solución a una
temperatura de 2ºC aproximadamente a 10ºC aproximadamente;
(e) dilución del sobrenadante 1:1 aproximadamente
con una solución que contiene albúmina e iones de calcio;
(f) incubación del sobrenadante diluido;
(g) ajuste del pH hasta pH neutro aproximadamente
y adición de antimicrobianos;
(h) adición de polietilén glicol desde un 0,1% a
un 5% aproximadamente;
(i) análisis de la solución para determinar los
valores del tiempo de protrombina, y, si se necesita,
(j) adición de propionato de sodio.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6,
en el que adicionalmente antes de añadir el propionato de sodio, la
solución es ajustada mediante un Factor de Dilución Volumétrico.
8. El reactivo de tromboplastina líquido de
cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para ser
utilizado en un método de diagnóstico.
9. Utilización del reactivo de tromboplastina
líquido de cualquiera de las reivindicaciones 1-5
para la fabricación de un kit de diagnóstico.
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DE69832628T2 (de) * | 1997-04-23 | 2006-09-07 | Instrumentation Laboratory S.P.A. | Rekombinant-kaninchengewebefaktor basiertes prothrombinzeitreagenz |
DE19720853A1 (de) * | 1997-05-17 | 1998-11-19 | Dade Behring Marburg Gmbh | Erhöhung der FVII Empfindlichkeit eines Thromboplastinreagenzes |
DE19811016A1 (de) * | 1998-03-13 | 1999-09-16 | Dade Behring Marburg Gmbh | Gebrauchsfertiges Prothrombinzeitreagenz auf der Basis von rekombinantem Gewebsfaktor |
JP2002526557A (ja) | 1998-10-07 | 2002-08-20 | シグマ−アルドリッチ・カンパニー | トロンボプラスチン試薬ならびにそのような試薬の製造および使用方法 |
US6207661B1 (en) * | 1999-02-22 | 2001-03-27 | Baxter International Inc. | Premixed formulation of piperacillin sodium and tazobactam sodium injection |
US6733985B1 (en) * | 1999-05-19 | 2004-05-11 | International Technidyne Corporation | Preparation of stable liquid and dried synthetic prothrombin time reagents |
US6248353B1 (en) | 1999-12-10 | 2001-06-19 | Dade Behring Inc. | Reconstitution of purified membrane proteins into preformed liposomes |
US6855509B2 (en) | 2000-12-19 | 2005-02-15 | Instrumentation Laboratory Company | Protein S functional assay and kit therefor |
US7148067B2 (en) * | 2004-08-31 | 2006-12-12 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Thromboplastin reagents |
WO2006088741A2 (en) * | 2005-02-16 | 2006-08-24 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Procoagulants based on metal-chelating lipids |
WO2006096345A2 (en) * | 2005-03-04 | 2006-09-14 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Coagulation and fibrinolytic cascades modulator |
CA2649538C (en) * | 2006-04-21 | 2014-06-03 | Yatin Gokarn | Buffering agents for biopharmaceutical formulations |
JP4999613B2 (ja) * | 2007-08-31 | 2012-08-15 | シスメックス株式会社 | 血液凝固測定用試薬及び血液凝固時間測定方法 |
US8821861B2 (en) * | 2007-10-05 | 2014-09-02 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Fibrin sealant |
WO2009061697A1 (en) | 2007-11-09 | 2009-05-14 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Anticoagulant antagonist and hemophilia procoagulant |
DE102007062323A1 (de) | 2007-12-21 | 2009-06-25 | Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh | Langzeitstabiles Thromboplastin-Reagenz |
JPWO2010134345A1 (ja) | 2009-05-20 | 2012-11-08 | 積水メディカル株式会社 | 血液凝固時間延長剤 |
JP5589103B2 (ja) * | 2013-01-23 | 2014-09-10 | 株式会社Lsiメディエンス | 二価金属イオン含有の体外診断用試薬組成物および二価金属イオン由来金属化合物の沈殿防止方法 |
JP6250306B2 (ja) * | 2013-05-28 | 2017-12-20 | 株式会社Lsiメディエンス | リポ化トロンボプラスチン含有血液凝固能測定試薬及び測定方法 |
JP2014197019A (ja) * | 2014-06-30 | 2014-10-16 | 積水メディカル株式会社 | 血液凝固反応における血液凝固時間延長剤 |
JP6709286B2 (ja) | 2016-02-12 | 2020-06-10 | インストゥルメンテーション ラボラトリー カンパニー | 2成分「混合および使用」の液体トロンボプラスチン試薬、その作製方法および使用方法 |
EP3489692A1 (de) | 2017-11-28 | 2019-05-29 | Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH | Prothrombinzeit-reagenz enthaltend einen eisenchelator |
EP3859327A4 (en) * | 2018-09-25 | 2022-09-07 | Sekisui Medical Co., Ltd. | METHOD OF MEASUREMENT OF BLOOD COAGING TIME |
CN113005176A (zh) * | 2019-12-20 | 2021-06-22 | 深圳市帝迈生物技术有限公司 | 稳定剂、凝血酶原时间检测试剂及其制备方法、试剂盒 |
CN111638374B (zh) * | 2020-06-08 | 2022-10-18 | 深圳市国赛生物技术有限公司 | 一种用于测定凝血酶原时间的体外诊断试剂盒 |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2516216A (en) * | 1947-06-24 | 1950-07-25 | Sharp & Dohme Inc | Thromboplastin as testing agent |
US2842480A (en) * | 1954-05-27 | 1958-07-08 | Ortho Pharma Corp | Preparation of thromboplastin |
US2847350A (en) * | 1954-05-27 | 1958-08-12 | Ortho Pharma Corp | Preparation of highly active thromboplastin |
US2847347A (en) * | 1954-05-27 | 1958-08-12 | Ortho Pharmacentical Corp | Preparation of improved thromboplastin |
US2921000A (en) * | 1956-05-22 | 1960-01-12 | Ortho Pharma Corp | Thromboplastin |
US3522148A (en) * | 1965-08-13 | 1970-07-28 | Dade Reagents Inc | Stabilized thromboplastin preparation |
DE3113350A1 (de) * | 1981-04-02 | 1982-10-21 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Reagens zur optischen bestimmung des blutgerinnungsverhaltens |
DE3150596A1 (de) * | 1981-12-21 | 1983-06-30 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur herstellung von gewebsthromboplastin |
US4755461A (en) * | 1986-04-17 | 1988-07-05 | Bio/Data Corporation | Tableted blood plasma microconcentrated thromboplastin coagulation reagent |
US5270451A (en) * | 1988-11-23 | 1993-12-14 | Baxter Diagnostics Inc. | Extraction method for preparing thromboplastin reagents |
EP0396733B1 (en) * | 1988-11-23 | 1994-01-05 | Baxter Diagnostics Inc. | Improved extraction methods for preparing thromboplastin reagents |
US5091304A (en) * | 1989-08-21 | 1992-02-25 | International Technidyne Corporation | Whole blood activated partial thromboplastin time test and associated apparatus |
DE3929329A1 (de) * | 1989-09-04 | 1991-03-07 | Behringwerke Ag | Stabilisierungsmittel zur verbesserung der wiederfindung von gerinnungsfaktoren in blutproben |
US5281528A (en) * | 1989-12-18 | 1994-01-25 | Warner-Lambert Company | Process for purified thromboplastin for ultra-pure thrombin preparation |
FR2679251B1 (fr) * | 1991-07-18 | 1993-11-12 | Nord Assoc Essor Transfusion San | Procede de preparation d'un concentre de thrombine humaine destine a un usage therapeutique. |
-
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