FI109152B - Stabiili nestemäinen tromboplastiinireagenssi, menetelmä sen valmistamiseksi sekä reagenssin sisältävä diagnostinen välineistö - Google Patents

Description

109152

Stabiili nestemäinen tromboplastiinireagenssi, menetelmä sen valmistamiseksi sekä reagenssin sisältävä diagnostinen välineistö 5 Keksinnön tausta Tämä keksintö koskee stabiilia nestemäistä trombo-plastiinireagenssia, jolla on pitkä säilyvyysaika, ja menetelmää sen valmistamiseksi. Lisäksi keksintö koskee diagnostista välineistöä, joka sisältää mainitun reagenssin.

10 Verijärjestelmän hyytymis- ja fibrinolyysiteiden toiminnan poikkeavuuksia voidaan määrittää useissa vaiheissa. Eräs yleisimmin käytetyistä kokeista on protrombiini-aikakoe (PT). Veri- tai plasmanäyte lisätään tromboplas-tiiniin kalsiumin läsnä ollessa ja hyytymän muodostumiseen 15 tarvittava aika mitataan. Tekijä VII aktivoituu trombo-plastiinin vaikutuksesta, mikä tekijöiden V ja X kautta aiheuttaa trombiinin muodostumisen protrombiinista (tekijä I II)· Muodostunut trombiini hajottaa fibrinogeenin liukene mattomaksi fibriiniksi. Aika, joka lasketaan tromboplas-20 tiinin ja kalsiumin sekoittamisesta verinäytteen kanssa hyytymän muodostumiseen, on näytteen sisältämien hyytymistekijöiden pitoisuuden tai aktiivisuuden mitta. Tätä mää-*· ritystä käytetään suun kautta annetun antikoagulanttihoi- don seurannassa sen varmistamiseksi, että potilaalle anne- * · » · 25 taan oikea määrä antikoagulanttia. Sitä käytetään myös ··!’. hyytymisjärjestelmän toimintakyvyn määrittämiseksi.

) Tromboplastiini on yllä olevien menetelmien pri- maarireagenssi. Nykyisin sitä saadaan nisäkkäiden kudok-'·’ ’ sesta, yleensä kanin aivoista. Muita runsaasti tromboplas- 30 tiinia sisältäviä kudoksia, kuten ihmisen aivoja, ihmisen istukkaa ja naudan aivoja, voidaan käyttää, mutta on ha- I I · *>t>: vaittu, että kanin aivokudos on sopiva tromboplastiiniläh- de hintansa, toimintakykynsä ja saatavuutensa takia.

\.i Tromboplastiinireagenssin herkkyys johtuu monista 35 tekijöistä, kuten lopullisesta reagenssikoostumuksesta, 2 109152 joka saattaa sisältää puskureita, suoloja ja stabilointiaineita, menetelmästä, jolla tromboplastiinia uutetaan kudoksesta ja kudoksen alkuperäisestä lähteestä. Suurin osa tällä hetkellä markkinoilla olevista tromboplastiini-5 reagenssivalmisteista on saatavana vain kylmäkuivatussa muodossa pääasiassa reagenssin säilyvyyden takia. Liuotetulla, kylmäkuivatulla tromboplastiinireagenssilla on noin neljän päivän säilyvyysaika.

Koska reagenssi on kallista, sen säilyvyys on tär-10 keä kliinikolle tai käyttäjälle, ja mitä pitempi on sekä avatun että avaamattoman reagenssiastian säilyvyys, sitä vähemmän reagenssia täytyy heittää pois päättyneen säily-vyysajan takia.

On olemassa kylmäkuivattuun tuotteeseen erottamat-15 tomasti liittyviä ongelmia, jotka joko pienenevät tai poistuvat nestemäisen tuotteen tapauksessa. Nämä ovat (1) ennen kylmäkuivausta tapahtuvan pullojen täytön vaihtelevuus, (2) paikalliset erot kylmäkuivaussyklissä (jäädyttäminen ja lämmittäminen), (3) pipetointivirheet ja/tai vää- 20 rän tilavuuden lisäys, kun pulveri liuotetaan ja (4) liu ottamiseen käytetty vesi saattaa olla epäpuhdasta ja/tai se voi olla mikro-organismeilla kontaminoitunutta.

:*·· Kylmäkuivattu reagenssi on luontaisesti sameampaa ... kuin nestemäinen reagenssi. Reagenssin sameuden vähentä- 25 minen on myös tärkeä tekijä, kun tuotetaan parempaa rea- genssia, koska PT-kokeessa hyytymä tulee havaita heti, kun " se muodostuu.

On monia tapoja uuttaa tromboplastiini kudoksista.

* Yleisin tapa on uuttaa runsaasti tromboplastiinia sisältä- 30 vää kudosta vedessä tai fysiologisessa suolaliuoksessa * · *.’·· 25 - 50 °C:ssa. Voidaan käyttää tartraattia sisältävää fy- (i(’ siologista suolaliuosta, jonka jälkeen uute sentrifugoi- daan suurten hiukkasten poistamiseksi. Supernatantti si-sältää aktiivista tromboplastiinia sekä natriumkloridia ja j 35 natriumtartraattia (US-patentti 3 522 148) . Tätä uutetta * · s 3 109152 voidaan edelleen prosessoida. Tromboplastiiniuutteeseen voidaan lisätä esimerkiksi kalsiumlaktaattia, glysiiniä, karboksimetyyliselluloosaa ja imidatsolia. Kukin lisäaine vaikuttaa reagenssin herkkyyteen. Yleensä hyväksyttävän 5 tromboplastiinireagenssin tulee antaa 9-15 sekunnin PT normaalille verinäytteelle.

On myös monia muita menetelmiä, joita on käytetty herkemmän, kanin aivoista peräisin olevan tromboplastiinin valmistamiseksi. Hawkins et ai., WO 90/05 740, julkaistu 10 31.05.1990, kuvaavat menetelmän tromboplastiinin uuttami seksi kudoksesta käyttäen bariumsulfaattia, kaotrooppisia aineita ja nonionisia detergenttejä. Kuitenkin menetelmä tuottaa ainoastaan kylmäkuivattua eikä nestemäistä trombo-plastiinireagenssia.

15 Toinen DE-patenttihakemusjulkaisu, 3 150 594 Ai, koskee samanlaista menetelmää. Kanin aivojauhetta sekoitetaan selluloosajauheeseen ja seos pestään natriumasetaat-tipuskurilla, pH:ssa 6,5 - 8, kontaminanttien poistamiseksi. Sen jälkeen se uutetaan pinta-aktiivisilla aineilla 20 kalsiumionien läsnä ollessa. Tässäkin tapauksessa tuotettu tromboplastiini on stabiili ainoastaan kylmäkuivatussa muodossa, ja sillä on liuotettuna lyhyt säilyvyysaika.

··· Nestemäistä tromboplastiinia on nykyään saatavissa

Pacific Hemostasis, Inc. -yhtiöstä. Vaikka vaikuttaisi 25 siltä, että tässä tuotteessa olisi ratkaistu joitakin kyl-mäkuivattuihin reagensseihin liittyviä ongelmia, sitä ei » · ” ole saatavissa yhtenä reagenssina. Reagenssia varten pitää *i(;’ yhdistää kaksi eri pulloissa olevaa reagenssia, ja rea- • t · '·' genssin säilyvyys on vain yksi kuukausi.

30 Käyttökelpoisuuden, säilyvyyden ja luotettavuuden vuoksi nestemäinen tromboplastiini olisi arvokas kliini- ’ : sille ja tutkimuslaboratorioille.

Keksinnön lyhyt yhteenveto • ·

Esillä oleva keksintö on nestemäinen tromboplas-; ;· 35 tiinireagenssi, joka koostuu tromboplastiinikudosuuttees- 4 109152 ta, kalsiumioneista, stabilaattoreista ja antimikrobisista aineista. Keksinnön mukaiselle stabiilille tromboplas- tiinireagenssille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Tämän reagenssin säilyvyys lopulli-5 sessa, avaamattomassa pullossa on ainakin 16 kuukautta ja avattuna ainakin kymmenen päivää.

Patenttivaatimukset sisältävät myös menetelmän tämän nestemäisen tromboplastiinireagenssin valmistamiseksi. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mi- 10 tä patenttivaatimuksessa 6 esitetään. Menetelmän vaiheet ovat: a) tromboplastiinia sisältävä kudos, kuten kanin aivojen asetonijauhe (RBAP) puhdistetaan vieraan, pääasiassa tromboplastiinia sisältämättömän materiaalin, poista- 15 miseksi, b) tromboplastiini uutetaan puhdistetusta RBAP:stä sekoittamalla uuttoliuokseen lämpötiloissa, jotka soveltuvat tromboplastiinin uuttamiseen, c) laimennetaan tromboplastiinia sisältävä super- 20 natantti albumiinilla ja kalsiumioneilla olosuhteissa, jotka suosivat stabiilien vesikkelien ja misellien muodostusta, ;·· d) stabiloidaan vaiheen c) liuos edelleen säätä- mällä pH, 25 e) lisätään antimikrobiaalisia aineita liuokseen, f) stabiloidaan liuos vielä lisäämällä PEG:iä, > t ;; I g) määritetään liuoksen protrombiiniaika (PT) -ar- ·__·* vot, ja mikäli tarpeellista, '·’ h) säädetään PT-arvot.

30 Tämä menetelmä tromboplastiinireagenssin valmista- :.'*j miseksi on edistystä alalla tällaisen reagenssin tuottami- ‘ seksi liuosmuodossa, ei kylmäkuivatussa eikä liuotettavas- I sa muodossa, reagenssin, jonka säilyvyys on maksimoitu useiden parametrien yhteisvaikutuksen avulla.

35 Lisäksi keksinnön mukaiselle diagnostiselle vä- 5 109152 lineistölle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 11 esitetään.

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1 on tyypillinen tromboplastiinikokeen aika- 5 käyrä.

Kuvio 2 on graafinen esitys tromboplastiinin pitoisuuden vaikutuksesta hyytymisnopeuteen.

Kuvio 3 on tromboplastiinin kalibrointikäyrä.

Kuvio 4 on virtakaavio menetelmästä tuottaa neste-10 mäistä tromboplastiinireagenssia.

Kuvio 5 on isotermikuva kanin aivojen asetonijau-heuutosta.

Kuvio 6 on kuvaaja absoluuttisesta lämpötilasta tasapainotilassa uutetun tromboplastiinin määrään funkti-15 ona.

Kuvio 7 on kuvaaja sekoitusnopeuden vaikutuksesta kanin aivojen asetonijauheuuttoon.

Kuvio 8 on kuvaaja ionivahvuuden vaikutuksesta kanin aivojen asetonijauheuuttoon.

20 Kuvio 9 osoittaa tromboplastiinipitoisuuden vaiku tuksen eri kontrolliplasmanäytteiden hyytymisaikaan.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus ·· Esillä oleva keksintö on stabiili, nestemäinen :. tromboplastiinireagenssi, joka koostuu kudosasetonijauhe- 25 uutteesta, kalsiumioneista, stabiloivista aineista ja an-!!'!_ timikrobiaalisista reagensseista ja jonka säilyvyys avaa- ” ] mattomassa pullossa on ainakin 16 kuukautta.

> t t ‘ Vaikka tromboplastiinia voidaan uuttaa monista ku- ’ doslähteitä, kuten ihmisen aivoista ja istukasta, nykyisin 30 käytetään yleisesti kanin aivoja. Kanin aivokudosta on t · :.'*j yleisesti saatavilla asetonijauheuutteena. Jauhetta saa- ; daan mm. Continental Services Group, Inc. -yhtiöstä (P.O.

Box 420 - 950, 1 300 N.W. 36th Street, Miami, Florida, USA 33 142) ja Pel Freeze Biologicals -yhtiöstä (P.O. Box 68, * » 35 205 N. Arkansas, Rogers, Arkansas 72 556). Sitä valmiste- ; t » t 6 109152 taan yleisesti F.A. Pitlick et ai.'n menetelmällä: Methods in Enzymology, voi. XLV, osa B, toimittaja L. Lorand, s.

37, 1976.

Sen jälkeen kun kanin aivot on saatettu jauhemuo-5 toon, monet tekijät vaikuttavat tromboplastiinin uuttumi-seen siitä. Erityisesti uuton aika ja lämpötila, sekoitus-nopeus, ionivahvuus ja RBAP:n pitoisuus vaikuttavat uutetun tromboplastiinin määrään ja laatuun.

RBAP -uutteiden tromboplastiiniaktiivisuustaso 10 voidaan arvioida spektrofotometristä menetelmää käyttäen. Menetelmää voidaan käyttää arvioimaan uutteiden trombo-plastiinipitoisuutta vertailuerän pitoisuuteen verrattuna, i Ensin valmistetaan laimennussarja vertailutromboplastiini- erästä käyttäen tiettyä näytepuskuria, joka sisältää 25 mM 15 kalsiumglukonaattia, 50 mM natriumkloridia ja 25 mM Hepes-puskuria, pH 7. Normaaliplasman hyytymisnopeus määritetään näiden laimennosten avulla hyytymiskäyriltä, jotka on määritetty 405 nm:ssä (ts. maksimi-AA/min). Tuntemattoman tromboplastiiniuutteen laimennos määritetään samalla ta-20 valla ja pitoisuus määritetään suhteessa vertailutrombo-plastiinierään.

Tyypillisessä kokeessa 0,1 ml:n erä vertailunäyt- ;··· teen tai määritettävän näytteen tiettyä laimennosta lisä- tään 1 ml:aan puskuria 2,9 ml:n mikrokyvetissä. Reaktio 25 suoritetaan 37 °C:ssa ja käynnistetään lisäämällä 0,35 ml *. I ‘ 11 normaalia yhdistelmäplasmaa. Absorbanssin muutos 405 • · " ) nm:ssä ajan funktiona määritetään spektrofotometrillä.

* » · * Maksimaalinen muutosnopeus määritetään saadulta * i * ’ aikakäyrältä, ja esitetään graafisesti vastaavien laimen- 30 nosten funktiona. Kuviossa 1 on kuvattu tyypillinen aika- t t V·· käyrä. Vertailutromboplastiinille annettiin mielivaltainen ’ pitoisuus 1 yksikkö. Kuviossa 2 on kuvaaja absorbanssin 1 muutos (ΔΑ) 405 nm:ssä tromboplastiinin pitoisuuden funk- tiona, yksikköinä/ml. Arvot osoittavat saturaatiokinetiik- I » 35 kaa ja niitä voidaan kuvata seuraavalla yhtälöllä: i » 1 I » * » · 7 109152 AAmin = a[TPLN]/(L + [TPLN]) (1) missä [TPLN] on tromboplastiinin aktiivisuuspitoisuus ja a 5 ja β ovat vakioita. Yhtälö 1 voidaan muuttaa seuraavaan muotoon: 1/(ΔΑ/min) = β/α(1/[TPLN]) + 1/a (2) 10 Kuviossa 3 nähdään kuvaaja 1/[TPLN] versus 1/ (AÄ/min). Tällaisia kalibraatiokäyriä käytettiin ja voidaan käyttää määrittämään tromboplastiinin määrää mistä tahansa saadusta uutteesta.

Menetelmä stabiilin, nestemäisen tromboplastiini-15 reagenssin tuottamiseksi kuvataan yleensä seuraavalla tavalla : a) pestään kanin aivojen asetonijauheuutetta, annetaan liuoksen erottua ja heitetään supernatantti pois, b) lämmitetään pestyä uutetta ja sekoitetaan uute j 20 uuttoliuokseen samalla liuosta lämmittäen noin 45 °C:een, j c) sentrifugoidaan liuos, d) poistetaan supernatantti ja lisätään albumiini '·· ja kalsiumionit, e) inkuboidaan liuosta, 25 f) säädetään pH ja g) lisätään säilöntäaineet, stabilointiaineet ja • · antimikrobiaaliset aineet.

« · ·

Menetelmä nestemäisen tromboplastiinireagenssin '·' ’ tuottamiseksi kuvataan alla yksityiskohtaisesti ja se ku- 30 vataan kaaviomaisesti kuviossa 4. RBAP pestään ensin de-·,'·· ionisoidulla vedellä, edullisesti noin 10 °C:ssa, mutta ' : hyväksyttävä lämpötila-alue on noin 2-12 °C, ja pitoi- suudessa, joka on noin 28 g RBAP/1 vettä. Vaikka 28 g/1 on haluttu pitoisuus, pitoisuus voi olla välillä 10 - 40 g > · 35 RBAP/1 vettä. Liuosta sekoitetaan noin 150 RPM:n nopeu- » 8 109152 della noin 15 minuuttia ja sen annetaan seisoa yön yli 10 °C:ssa. Supernatantti heitetään pois.

Pesu vedellä 2-8 °C:ssa poistaa vain 0,2 % jauheessa saatavilla olevasta tromboplastiiniaktiivisuudesta.

5 Kuitenkin huomattava osa liukenevista entsyymeistä, kuten lipaaseista ja proteaaseista, suoloista, kromoforeista, bakteereista ja hiukkasista poistuu näissä olosuhteissa.

RBAP:n pesusta ennen uuttoa on lukuisia etuja. Ensinnäkin pesumenettely poistaa osittain kuolleet ja elin-10 kykyiset bakteerit samoin kuin pölyn ja muun hiukkasjät-teen. Tästä kontaminanttien poistosta seuraa mm. parantunut optinen kirkkaus. Lisäksi pesuvaihe minimoi RBAP:n hiukkaskoon vaihtelevuuden vaikutuksen, koska jauhe vettyy täydellisesti yli yön tapahtuvan seisottamisvaiheen aika-15 na. Tämä vaihe normalisoi myös mahdolliset RBAP:n liukoisten suolojen ja proteiinien konsentraatioiden vaihtelut, koska vettä käytetään ylimäärin.

i Märkä RBAP lämmitetään noin 25 °C:een ja sen jäl keen lisätään noin 45 °C:een esilämmitetty uuttoliuos.

20 Tutkitut RBAP-pitoisuudet liikkuivat alueella 25,0 40,0 g/1 uuttoliuosta. Edullisin pitoisuus on 35 g RBAP/1 uuttoliuosta. Tästä määrästä RBAP:tä saatiin maksimimäärä ;·* uutettua tromboplastiinia yhdellä kertaa. Suuremmat RBAP- määrät (ts. 40 g/1) eivät lisänneet saantoa suoraan ver-25 rannollisesti. Pienemmät RBAP-määrät (ts. < 30 g/1) saat-toivat huonontaa reagenssia vuodenaikoina, jolloin saata- I · vissa oleva kanin aivo jauhe on huonompilaatuista. Uutto-liuoksen eri komponenttien edullisimmat pitoisuudet kuva-‘ taan taulukossa 1.

30 Näillä uutto-olosuhteilla saatiin tromboplastiini- aktiivisuuden maksimaalinen saanto. Lisäksi nämä olosuh-1 > teet tuottivat alhaisimman normaalin hyytymisajan ja herk- kyyden, joka on lähellä saavutettavaa kohdetta ennen lo-pullista reagenssierän tilavuudensäätöä, mitä kutsutaan '!* 35 "bulking" ' iksi.

I » I

| 9 109152 } 3

Taulukko 1

Uuttoliuos

Komponentti Pitoisuus (paino/tilavuus) 5 Natriumkloridi 0,85 %

Natriumsitraatti 0,40 %

Kalsiumglukonaatti 3,0 mM

Vaikka uuttoliuoksen kunkin komponentin haluttu pitoisuus on annettu edellä olevassa taulukossa 1, natriumkloridin 10 hyväksyttävä alue on noin 0,5 - 1,5 %, natriumsitraatin noin 0,2 - 0,6 % ja kalsiumglukonaatin noin 2-6 mM.

Natriumkloridilla on huomattava vaikutus trombo-plastiinin saantoon. Uuttonopeus kasvaa suorassa suhteessa kasvavaan ionivahvuuteen maksimipisteeseen saakka, jonka 15 jälkeen nopeus pienenee ionivahvuuden edelleen kasvaessa. Hyväksi reagenssiksi havaittu natriumkloridi voidaan myös korvata muiden monovalenttien metalli-ionien, kuten kaliumin ja litiumin, kloridisuoloilla samanlaisin vaikutuksin .

20 Kalsiumin pitoisuudella on vähäisempi vaikutus saantoon, mutta sillä on valtava vaikutus saadun trombo-plastiinin normaalialueeseen ja herkkyyteen. Kalsiumgluko-;··· naatista saadaan tarpeellinen kalsium hyytymiskaskadia • varten, joka johtaa hyytymän muodostumiseen. RBAP:n uutto 25 ilman kalsiumia saa aikaan valmisteen, jolla on alhainen normaaliplasman hyytymisnopeus kalsiumin lisäyksen jäi- * · I'. '. keen, mutta joka on erittäin epäherkkä epänormaaleille po- tilasplasmoille. Tiettyjen rajojen sisällä, kun käytetään '·’' kasvavaa kalsiumpitoisuutta uuttoliuoksessa, saatu uute on 30 herkempi epänormaaleille plasmoille ja sillä on suurempi ·.’·! normaali hyytymisnopeus.

i « i ‘ ^ Edeltävät tutkimukset ovat osoittaneet, että trom- boplastiinin säilyvyys kasvaa, kun kalsium lisätään kal-siumin glukonaattisuolan muodossa, eikä kalsiumkloridina.

; 35 Divalentit suolat, kuten kalsium ja magnesium, voivat si- 10 109152 toutua voimakkaasti membraaneihin, erityisesti happamia fosfolipidejä sisältäviin membraaneihin.

Kalsiumin ja magnesiumin sitoutuminen voi aiheuttaa vesikkelien aggregaatiota, jonka aiheuttavana voimana 5 on ilmeisesti van der Waals -vuorovaikutus. Fuusion nopeus lisääntyy lämpötilan myötä ja membraanin juoksevuus on erittäin nopea faasitransitiolämpötilassa. Hiilihydraatti-happojen, kuten glukonaatin ja tartraatin, kalsiumsuolojen käytön johdosta havaittu parantunut säilyvyys saattaa 10 liittyä koordinaatiokompleksien muodostumiseen tai kalsi- umionien paikalliseen eristämiseen. Pintavasteen optimoin-tikokeet osoittivat, että kalsiumin optimipitoisuus oli 11,0 mM.

Natriumsitraatti on heikko divalentti ionikelaat-15 tori ja moduloi siten kalsiumin vaikutusta. Toisin sanoen sitraatti eristää osan saatavilla olevasta kalsiumista ja alentaa sen vaikuttavaa pitoisuutta. Kun uutto etenee ja muut liuokseen vapautuvat komponentit (ts. proteiinit ja lipidit) sitovat kalsiumia, kalsiumin tasapaino korvautuu 20 ja sitraattiin sitoutunut kalsiumin vapautuu. Tämä tapahtuma käytännössä pitää kalsiumpitoisuuden osittain vakiona j uuton aikana. Vaikka natriumsitraattia ja kalsiumgluko-;·· naattia pidetään edullisina yhdisteinä reagenssissa, muita • j. heikkoja metalli-ionikelaattoreita, kuten oksalaattia voi- 25 daan käyttää natriumsitraatin sijasta, ja kalsiumioneja voi myös saada kalsiumtartraatista ja kalsiumlaktaatista.

• · *,! Märkä RBAP-uuttoliuosdispersio lämmitetään sen jälkeen noin 45 °C:een samalla sekoittaen noin 400 RPM:n '·’ ’ nopeudella noin 50 minuuttia. Uuttonopeus ei muutu paljon, 30 kun RPM kasvaa 100:sta 500:aan. Kuitenkin aikavälillä uu- ·.*·: tettu määrä kasvaa huomattavasti nopeamman sekoituksen myötä.

Sen jälkeen dispersio sentrifugoidaan noin 1 800 » » RPM:n nopeudella 20 minuuttia 4 °C:ssa. Nämä ovat optimi-35 olosuhteet. Hyväksyttäviä olosuhteita ovat sentrifugointi 11 109152 1 500 - 1 200 RPM:n nopeudella noin 15 - 30 minuuttia, noin 2-10 °C:ssa.

Supernatantti lämmitetään uudelleen ja laimennetaan noin 1:1 liuoksella, joka koostuu 1 % naudan seerumin 5 albumiinista(BSA) ja 0,019 M kalsiumglukonaatista.

Albumiinilla on tässä formulaatiossa useita rooleja. Uskotaan, että seerumin albumiini auttaa stabiloimaan lipidivesikkelisysteemeitä työntymällä lipidikaksoisker-rosten väliin ja tekemällä niistä jäykempiä. Lisäksi albu-10 miini suojaa aktiivisia proteiineja peittämällä hajottavien proteaasien vaikutusta. Optimaalisen tuotteen säilyvyyden takia tarvitaan proteaaseista vapaata BSA-laatua. Laimennettua uutetta inkuboidaan noin yksi tunti 37 °C:ssa.

Tämä inkubointivaihe sallii uutteen kalkkiutumisen uudel-15 leen ja vesikkelien kiinnittymisen termodynaamisesti suotuisaan asemaan.

Inkuboinnin jälkeen uute jäähdytetään noin 25 °C:een, pH säädetään noin 6,6:een ja mahdollisesti tarvittavat stabilointiaineet, antimikrobiaaliset aineet ja 20 säilöntäaineet lisätään.

Vaikka polyetyleeniglykolilla (PEG) on tässä formulaatiossa useita käyttöjä, yksi niistä on käyttö stabi-·· lointi- ja säilöntäaineena. Albumiinia käytetään myös sta- .j. bilointiaineena ja natriumpropionaattia käytetään molem- 25 missä tarkoituksissa. Kaksoiskerroksen dehydraatioasteella on tärkeä merkitys vesikkelin membraanifuusion induktiol- • · I h ] le. Voimakkaat hydraatiovoimat tulee voittaa, jotta memb- ' ; raanit voivat tulla aivan lähekkäin. Tästä syystä dehyd- '·’ ' raatioaineilla, kuten PEG:illä ja dekstraanilla, voi olla 30 huomattava vaikutus fosfolipidivesikkelien fuusionopeu- teen.

·’ Hoekstra suoritti sellaisia fuusiokokeita PEG:in I t t läsnä ollessa, jotka osoittavat, että kaksoiskerroksen de-

t I

hydraatioaste ja "pistevirheiden" syntyminen kaksoisker-; 35 rokseen, ovat vallitsevia tekijöitä alkuperäisissä fuusio- I 12 i 109152 vaikutuksissa. (D. Hoekstra, J. Amer. Chem. Soc. 21 (1982) 2 843). PEG voi kalsiumin tai magnesiumin puuttuessa agg-regoida vesikkelejä ilman, että ne fuusioituvat, kun taas PEG helpottaa fuusiota pienten divalenttien kationimäärien 5 läsnäollessa (ts. > 0,5 mM).

Silloin PEG voi selvästi vaikuttaa tromboplas-tiiniformulaation stabiilisuuteen. Kuitenkin PEG antaa tehokkaan mekanismin moduloida normaalihyytymisaikoja ja säätää tekijöiden herkkyyksiä. Lisäksi PEG parantaa tuot-10 teen dispersio-ominaisuuksia. Destabiloiva vaikutus on minimaalinen alle 2-%:isissa pitoisuuksissa.

Tutkimukset PEG-1450:n vaikutuksesta osoittivat, että 0,1 - 5 %:n pitoisuuksilla kaikkien vertailuplasmo-jen, mukaan lukien tekijä VII -puutosplasman ja Coumadin-15 plasman, PT-arvoissa havaittiin asteittainen pieneneminen. Lisäksi hiukkaskokotutkimukset osoittivat huomattavia muutoksia vesikkelin koossa erityisesti yli 2-%:isillä PEG-1 450-pitoisuuksilla. Yli 2,0-%:isillä mutta alle 15-%lisillä PEG-1450-pitoisuuksilla kokojakautuma tulee 20 kapeammaksi.

15-%:isen pitoisuuden yläpuolella PEG-1450 saa aikaan vertailuplasmoihin saostuman muodostumista ja tämä ;··· muistuttaa hyytymän muodostusta ilman tromboplastiinia.

h Tämä havainto merkitsee sitä, että PEG todennäköisesti ly- 25 hentää PT-arvoja aiheuttamalla ja edistämällä fibriini- säikeiden aggregoitumista hyytymi s tapahtuman aikana.

Natriumpropionaattia käytetään, mikäli tarpeen, tromboplastiinivalmisteen hyytymisajan säätämiseen plasma-’·’' kontrolleille ja potilasnäytteille. Yleisesti on havaittu, 30 että natriumpropionaattia voidaan lisätä lopulliseen trom- boplastiinireagenssiformulaatioon aina 0,4 %:iin asti.

'iti· Natriumpropionaatin lisäys lisää kaikkien plasmojen hyyty- misaikaa. Hyytymisaika lisääntyy kuitenkin huomattavammin i » pitkän hyytymisajan plasmoilla (ts. Coumadin-plasmoilla) 35 kuin normaaliplasmoilla. Natriumpropionaatti on Merckin » » · 13 109152

Indeksissä luokiteltu myös fungisidiksi ja homeenesto-aineeksi.

Formulaatioon voidaan lisätä myös antimikrobiaali-sia aineita. Esimerkiksi edullisessa yhdistelmässä lisä-5 tään natriumatsidia noin 0, 02 - 0,06 % ja piperasillii-nia, kloramfenikolia ja kiprofloksasiinia kaikkia noin 0,007 - 0,015 %. Antimikrobiaalisia aineita lisätään mikrobiologisen kontaminaation, esim. bakteeri- ja sienikon-taminaation, vähentämiseksi tai poistamiseksi, mitkä kaik-10 ki kontaminaatiot voivat vaikuttaa epäedullisesti trombo-plastiinireagenssin säilyvyyteen. Tämä on erityisen tärkeätä, koska tromboplastiinia ei voida steriilisuodattaa bakteerien poistamiseksi tromboplastiinikompleksin vesik-keliluonteen vuoksi.

15 Elävien mikro-organismien soluseinämät sallivat vain molekyylipainoltaan pienten molekyylien kulkeutumisen. Bakteerin ympäristössä olevien makromolekyylien täytyy hajota, ennen kuin ne voivat mennä sisään ja pilkkoutua. Bakteerit, erityisesti gram-positiiviset bakteerit, 20 erittävät erilaisia entsyymejä ympäröivään väliaineeseen. Näihin entsyymeihin kuuluvat erityisesti proteaasit, li-paasit, fosfolipaasit, peptidaasit ja nukleaasit. Gram-:··· negatiivisilla bakteereilla nämä entsyymit ovat plasmamem- \< braanin ja soluseinämän välissä, j 25 Kun nämä bakteerit kuolevat, niiden soluseinämä ja | membraani hajoaa, jolloin samantyyppisiä hajottavia ents- ’! ! yymejä, joita löytyy kummankintyyppisistä bakteereista, vapautuu ympäristöön.

* Tromboplastiinireagenssien stabiilisuus riippuu 30 oleellisesti siitä, että sen proteiini- ja lipidisisältö *.’· säilyy koskemattomana. Siksi bakteerikontaminaation taso, ’ : joko gram-negatiivisen tai -positiivisen, elävän tai kuol- ;··, leen, on hyvin oleellinen säilyvyyden kannalta. Lisäksi, vaikka sitä vähemmän painotetaan, homeilla ja sienillä on I 35 samanlainen vaikutus.

109152 I 14

Bakteerikontaminaation lähteitä on lukuisia. Niitä voi tulla raaka-aineiden mukana (esim. RBAP, kalsiumglu-konaatti, BSA), valmistusprosessissa, käytössä ympäristöstä (esim. avoin pullo) ja kuljetusmekanismeista, kuten 5 venttileistä, putkista ja antureista. Lukuisten bakteeri-lähteiden takia antimikrobiaalisilla aineilla on tässä formulaatiossa kahtainen tarkoitus. Ensinnä niiden tulee poistaa bakteerit ja sienet valmistusvaiheiden aikana ja toiseksi niiden tulee estää kontaminaatio, kun tuote on 10 käytössä tietyn ajanjakson.

Optimaalisen yhdistelmän piirteitä ovat laaja bak-teriostaattinen ja bakterisidinen vaikutus ilman, että se vaikuttaa juuri lainkaan tuotteen toimintaan tai ulkonäköön. Mikä tahansa antimikrobiaalinen aine, jolla on täl-15 lainen suojavaikutus, on käyttökelpoinen tässä formulaatiossa .

Testatut antimikrobiaaliset yhdisteet voitaisiin luokitella a) reaktiivisiin kemikaaleihin, kuten natrium-atsidi, b) reversiibeleihin inhibiittoreihin, kuten ditio-20 treitoli, c) antibiootteihin, kuten spiromysiini ja d) membraanin tuhoajiin, kuten fenoli. Yleensä on ilmeistä, että gram-negatiiviset bakteerit ovat reagenssille haital- ;·· lisempia kuin gram-positiiviset bakteerit. Siksi on kriit- tistä poistaa tämän tyyppiset bakteerit valmistusprosessin , 25 varhaisessa vaiheessa. Kemiallisesti toimivat yhdisteet, vaikka ovatkin tehokkaita bakteerien tuhoajia, ovat myös ? · !! ! haitallisia nestemäisen tromboplastiinireagenssin pitkän •it; ajan säilyvyydelle, mikä on havaittu kiihdytetyissä säily- • * · “·’ * vyyskokeissa. Lopuksi RBAP -pesu lisää testattujen ainei- 30 den antimikrobiaalista toimintaa poistamalla elinkykyisiä

• I

*.‘: ja kuolleita soluja.

* : Pseudomonas maltophilia on nestemäisessä trombo- plastiinissa itsepintainen ja erittäin haitallinen kanta. Edullinen antimikrobiaalinen yhdistelmä on erittäin teho-35 kas tuhoamaan erityisesti tämän luokan mikrobeja. Tämä yh- < » i » »

I I

15 109152 distelmä koostuu natriumatsidista, piperasilliinista, klo-ramfenikolista ja kiprofloksasiinista. Näiden kaikkien komponenttien toimintatapa on melko erilainen. Piperasil-liini inhiboi soluseinämän synteesiä. Kloramfenikoli inhi-5 boi proteiinisynteesiä, kun taas kiprofloksasiini inhiboi DNA:n replikaatiota. Natriumatsidi vaikuttaa sytokromijär-jestelmään, ja sillä on myös joitakin sienten kasvua estäviä ominaisuuksia.

Tehokkaimman yhdistelmän löytämiseksi käytiin läpi 10 useita bakteerien ja sienten kasvua estäviä aineita. Jotkut saatavilla olevat vaihtoehdot sisältyvät seuraavaan.

Antibioottien penisilliiniperheeseen kuuluvat myös asyyliaminopenisilliinit, joita ovat piperasilliini, ats-losilliini ja metslosilliini. Näillä antibiooteilla on 15 huomattava aktiivisuus useita RBAPrssä ja teollisessa ympäristössä läsnä olevia gram-negatiivisia organismeja kohtaan. Ne kykenevät myös inhiboimaan Klebsiella pneumoniae: n, yleisen mikro-organismin, β-laktamaaseja. Piperasilliini voidaan myös korvata spiromysiinillä.

20 Natriumatsidi on tehokas ja halpa sienten kasvua estävä aine. Klotrimatsoli, 5-fluorosytosiini ja nystatii-ni ovat myös tehokkaita fungisideja.

, * Kinolonit, kuten kiprofloksasiini ja norfloksasii- ni, ovat myös laaja-alaisia antimikrobisia aineita. Genta-25 mysiini, streptomysiini ja amikasiini voivat myös korvata ·_·, kinolonit.

! Kloramfenikoli on proteiinisynteesin inhibiittori.

; Tetrasykliiniä voitaisiin käyttää vaihtoehtona, vaikka me ·* * olemmekin huomanneet, että tämä vaatisi jäljellä olevaa 30 kolmea antibioottia suurempina pitoisuuksina.

Antimikrobisia aineita sisältävän uutteen pH on säädetty noin 6,6:ksi ja sitä on pidetty 2-8 °C:ssa yli yön. Tätä inkubaatiota käytetään alentamaan mikrobien mää-rää nopeasti.

;* 35 Kun uute on täysin valmis, RBAP:n vaihtelevuus pi- 16 109152 tää kontrolloida. Tähän vaihtelevuuteen on lukuisia syitä ja niitä ovat esim. kaneissa vuoden aikana tapahtuvat hormonaaliset muutokset. Tästä johtuen joissakin uutteissa on enemmän tromboplastiinia kuin toisissa, mikä lopulta hei-5 jastuu lopullisen reagenssin käyttäytymiseen.

Olemme käyttäneet tromboplastiinikoetta trombo-plastiinikonsentraatioiden määrittämiseen. Vertailutrombo-plastiinierästä valmistetaan ensin laimennossarja käyttäen tiettyä näytepuskuria, joka sisältää kalsiumglukonaattia, 10 natriumkloridia ja HEPES -puskuria, pH 7. Normaaliplasman hyytymisnopeus määritetään näiden laimennosten avulla hyy-tymiskäyriltä, jotka on mitattu 405 nm:ssä (ts. maksimi Δ A/min). Tuntemattoman tromboplastiinin laimennos analysoidaan samalla tavalla ja pitoisuus määritetään suhteessa 15 vertailuerään kalibraatiokäyrältä. Tämä menetelmä normalisoi tehokkaasti tromboplastiinipitoisuuden RBAP:ssa olevan muuntelun peittämiseksi.

Kaikkien tromboplastiinireagenssin komponenttien lopulliset, hyväksi havaitut pitoisuudet on esitetty tau-20 lukossa 2.

Taulukko 2 ·· Nestemäinen tromboplastiinireagenssi, lopullinen .:. formulaatio » • · t * , 25 Komponentti Pitoisuus (paino/tilavuus) # · · t · *, RBAP Uuttesta

'tt* Kalsiumglukonaatti 11,0 mM

: PEG-1450 1,50 % 30 Natriumkloridi 0,25 % ·,’*· Natriumsitraatti 0,20 % • * · ' i Naudan seerumin albumiini 0,30 %

Natriumpropionaatti 0 - 0,5 % • i *..! Natriumatsidi 0,03 % » · 35 Piperasillini 0,008 % » f 109152 I 17

Kloramfenikoli 0,006 %

Kiprofloksasiini 0,006 %

Kuten taulukosta 2 nähdään, lopullisen formulaati-5 on komponentit ovat kalsiumglukonaatti, natriumsitraatti, natriumkloridi, PEG-1450, naudan seerumin albumiini, nat-riumpropionaatti ja RBAP -uute. Formulaatio sisältää myös neljän antimikrobiaalisen yhdisteen yhdistelmän.

Formulaatio sietää kunkin ainesosan pitoisuudessa 10 noin + 5 %:n muuntelun. Komponentit, joiden konsentraati-ot vaikuttavat eniten nestemäisen tromboplastiinin käyttäytymiseen, ovat natriumsitraatti, natriumpropionaatti ja natriumkloridi.

Nestemäisen tromboplastiinireagenssin pH on edul-I 15 lisesti 6,6 ± 0,19.

Lopullinen pitoisuus tarjoaa formulaation, joka on hyvin herkkä Coumadin-käsitellyille potilasnäytteille.

Muut tekijät formulaatiossa, kuten natriumpropionaatti-, PEG-1450-, kalsiumglukonaatti- ja tromboplastiinipitoi-20 suus, myötävaikuttavat reagenssin lopulliseen herkkyyteen.

Seuraavat esimerkit on annettu selvittämään edelleen keksintöä, eikä niitä ole tarkoitettu kaventamaan ·· keksintöä millään tavoin.

.. Esimerkit 25 Seuraavia reagensseja käytetään esimerkeissä: 1. Kanin ai voase töni jauhe t * ;! ; - Kanin aivoista tehty asetoni jauhe > * · 2. Uuttoliuoskomponentit - D-glukonihappo/hemikalsiumsuola - 0,05 M kanta-30 liuos (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) - Natriumkloridi, USP Granular ‘ : - Natriumsitraatti, dihydraatti - 10-%:inen kanta- liuos ,. I 3. Bulkkiliuoskomponentit ;* 35 - Polyetyleeniglykoli-1450 - 20-%:inen kantaliuos

* I

t 18 109152 - Polyetyleeniglykoli-1450 - 20-%:inen kantaliuos (J.T. Baker Chemical Co., Buffalo Grove, IL, USA) - Naudan seerumin albumiini (BSA) - Propionihappo, natriumsuola - 10-%:inen kantaliuos 5 - Natriumatsidi - Kloramfenikoli - Kiprofloksasiini - Piperasilliini 4. Kontrollit 10 - Normaali yhdistelmäplasma (NPP) - VerifyR - Normaali sitraattiplasmakontrolli-VNC (Verify on Organon Teknika Corporation -yhtiön, Durham, N.C., USA, tavaramerkki).

- VerifyR Epänormaali sitraattitaso I (VACI) - epä-15 normaali plasma - VerifyR Epänormaali sitraattitaso II (VACII) epänormaali plasma - VerifyR 1 - normaali plasmakontrolli - VerifyR 2 ja 3 (epänormaalit plasmakontrollit) 2 0 Esimerkki 1

Nestemäisen tromboplastiinireagenssin valmistus

Kanin aivoasetonijauhe pestiin deionisoidulla ve-•| dellä 10 °C:ssa pitoisuudessa 28 g RBAP/1 H2O. RBAP pes- ,:. tiin sekoittamalla 150 RPM:n nopeudella 15 minuuttia. Mär-

I t > I

i 25 kä RBAP seisoi yön yli 10 °C:ssa. Supernatantti poistet- i .,,: I t> tiin imemällä ja heitettiin pois. Märkä RBAP lämmitettiin 25 °C:een ja 45 °C:een esilämmitetty uuttoliuos lisättiin.

t 9 ' fi;' Uuttoliuos koostui 0,85-%:isen natriumkloridin, ’·' 0,40-%:isen natriumsitraatin ja 3,0 mM:n kalsiumglukonaa- 30 tin vesiliuoksesta. Dispersio lämmitettiin 45 °C:een sa- * » ·.'·: maila kun sitä sekoitettiin 400 RPM:n nopeudella 50 mi- ‘ · nuuttia. Sen jälkeen uute sentrifugoitiin 1 800 RPM:n no- peudella 20 minuuttia 4 °C:ssa ja supernatantti poistet- 1 * tiin.

f » 35 Supernatantti laimennettiin 1:1 l-%:isen BSA:n ja 19 109152 0.019 M:n kalsiumglukonaatin liuoksella, ja sitä inkuboi-tiin 1 tunti 37 °C:ssa. Sen jälkeen laimennettu uute jäähdytettiin 25 °C:een ja 0,05 % natriumatsidia, 0,01 % pipe-rasilliinia, 0,01 % kloramfenikolia ja 0,01 % kiproflok-5 sasiinia lisättiin. Laimennetun uutteen pH säädettiin arvoon 6,65 ja se pantiin yön yli 2-8 °C:een.

Jotta eri RBAP -erien vaihtelevuuden vaikutus voitaisiin minimoida, laimennetun uutteen tromboplastiinipi-toisuus määritettiin tyypillisesti käyttäen yksinkertais-10 tettua Bulkin laimennostekijä (BDF) - menetelmää. BDF:n saamiseksi laimennetusta uutteesta valmistetaan sarja pieniä laimennoksia. Esimerkiksi kunkin bulkkikomponentin lopullinen pitoisuus, kuten taulukosta 2 voidaan havaita, pidetään vakiona kuudessa pullossa ja niihin lisätään 15 vaihtelevia määriä tromboplastiiniuuttoliuosta, jonka jälkeen kunkin pullon sisältö laimennetaan vedellä vakiotila-vuuteen. Halutut lopulliset tromboplastiinipitoisuudet ovat 1,4 - 1,9 kertaisia. Tosiasiassa vain tromboplastii-nipitoisuus muuttuu liuoksesta toiseen. Liuosten PT-arvot 20 analysoidaan sen jälkeen käyttäen normaaliplasmapoolia, kontrolliplasmoja, tekijä VII -puutosplasmaa ja erilaisia Coumadin -käsiteltyjä potilasplasmoja. Optimi BDF (ts. op- I * timaalinen tromboplastiinipitoisuus) valitaan saaduista "! tuloksista.

*;; 25 Mikäli optimaalisia suoritusarvoja ei voida saada, • ·' valmistetaan toinen sarja koeliuoksia käyttäen parasta * · · : .' edellä saatua BDF:ää ja eri natriumpropionaattipitoisuuk- V : siä. Koska laimennettua uutetta voidaan joustavasti sää dellä sekä BDF:n että natriumpropionaatin avulla, RBAP:n 30 vaihtelevuuden vaikutus pienenee.

Lopullisen nestemäisen tromboplastiinireagenssi-valmisteen koostumus oli 11,0 mM kalsiumglukonaattia, 1 · ’ 1,5 % PEG-1450:tä, 0,25 % natriumkloridia, 0,2 % natriumsitraattia, 0,3 % BSA:ta, 0 - 0,5 % natriumpropio-'·_ 35 naattia (vaihteleva), 0,03 % natriumatsidia, 0.008 % piperasilliinia, 0,006 % kloramfenikolia ja 0,006 % 20 109152 j nia, 0,006 % kloramfenikolia ja 0,006 % kiprofloksasiinia. Esimerkki 2

Uuttolämpötila ja -aika

Tutkimuksia ajan ja lämpötilan vaikutuksesta uut-5 totehoon tehtiin lämpötiloissa 37 °C, 42 °C, 45 °C, 47 °C

ja 50 °C.

Kussakin tutkitussa viidessä lämpötilassa käytettiin vaipallista 600 ml:n astiaa vesihauteen valmistamiseen. 200 ml: n sentrifuugiputkia käytettiin reaktioasti-10 oina. Kiertävää vesihaudetta käytettiin lämpötilakontrol-lina. Uuttoliuosta sekoitettiin jatkuvasti pyörösekoitti-messa 500 RPM:n nopeudella.

Uuttoliuos pantiin reaktioastiaan ja sen annettiin tasapainottua lämpötilaan, sekoituksen läsnä ollessa, 15 puolen tunnin ajan. Sen jälkeen siroteltiin 20 grammaa RBAP:tä liuokseen. Liuosta sekoitettiin jatkuvasti 750 RPM:n nopeudella. 10 ml:n eriä poistettiin aikavälein (10, 20, 30, 60, 90, 120 minuuttia jne. aina 24 tuntiin asti).

Eriä sentrifugoitiin 1 800 RPM:n nopeudella J 20 5 °C:ssa 20 minuuttia. Kunkin näytteen supernatantti siir- I rettiin 10 ml:n lasipulloihin ja niiden tromboplastiiniak- ! tiivisuus määritettiin.

• · _· Kuviossa 5 nähdään uutetun tromboplastiinin määrä "! (yksikköinä/ml) ajan ja lämpötilan funktiona. Kuvio 5 25 osoittaa, että 25 - 50 minuutin alkuvaiheen jälkeen uute- ' ·’ tun tromboplastiinin määrä on ajan lineaarinen funktio : .* kaikissa lämpötiloissa. Uuttokäyrien epälineaarinen alku V : johtuu todennäköisesti RBAP:n vettymisestä.

Pintavastekäyrä tehtiin, jolloin saatiin matemaat-30 tinen suhde, uutetun tromboplastiinin määrän (TPLN) sekä ajan ja lämpötilan välille. Tulokset sopivat hyvin kuutio-t>·, malliin, minkä standardideviaatio ja saadut influenssi- : parametrit osoittivat. Kaava on seuraava: 2,1 T2t + 2,5Tt + 0,70T2 - 0,60t2 + 3,5T + l,6t + 35 2,0 (3) 21 109152 missä T on lämpötila ja t on aika. Kuvio 5 osoittaa myös, että uutetun TPLN:n määrä kasvaa uuttolämpötilan kasvaessa.

Yksinkertainen matemaattinen malli johdettiin suh-5 teuttamalla uuttolämpötila uutetun TPLN:n määrään. Malli perustuu siihen, että TPLN:n kemiallisen potentiaalin, μ, tasapainotilassa, pitäisi olla vakio kummassakin faasissa: μ(RBAP) = μ(B) (4) 10 μ° (RBAP) + RT In y = μ°(Β) + RT In x (5) missä p°:t ovat kemiallisia potentiaaleja standar-direferenssitiloissa, B on uuttopuskuri, x on TPLN-pitoisuus uuttopuskurissa, y on TPLN:n pitoisuus RBAP:ssä 15 ja R on yleinen kaasuvakio. Mallin oletusarvona on, että järjestelmä lähestyy tasapainoa neljän tunnin uuton jälkeen. Kuvio 5 osoittaa, että tämä on hyväksyttävä oletus, paitsi ehkä 50 °C:ssa, jossa uuttonopeus on suuri ja jossa myös sekundaarinen mekanismi saattaa vaikuttaa.

20 Kaava 5 voidaan muuttaa seuraavaan muotoon:

In K = δ/R (1/T) (6) missä K on partitiokerroin (x/y) ja δ on vakioiden ···· 25 yhdistelmä. Kuviossa 6 nähdään kuvaaja 1/T yksikköinä esi- : .* tetyn, uutetun tromboplastiinin logaritmin funktiona. Lu- ! kuunottamatta 50 °C:n kohdalla olevaa pistettä, pisteet '<t‘ · osuvat lineaariselle käyrälle, kuten mallista saattoi en nustaa.

30 Poikkeama mallista 50 °C:ssa korostaa tässä lämpö- .’··. tilassa huomattavan erilaista uutetun tromboplastiinin määrää. Taulukosta 3 nähdään uuttonopeuksien vertailu eri I ·* lämpötiloissa.

22 109152

Taulukko 3 RBAP:n uuttonopeus eri lämpötiloissa Lämpötila Uuttonopeus myksikköä/min 5 37,0 2,67 42.0 5,40 45.0 5,14 47.0 11,3 50.0 25,6 10

Lisääntynyt uuttonopeus 47 - 50 °C:ssa saattaa merkitä sitä, että tämä lämpötila-alue on suspensiossa oleville lipideille kriittinen lämpötila (Te). Te:n yläpuolella lipidivesikkelit ovat nestemäisempiä ja siksi ne 15 dispergoituvat tehokkaammin. Te:n alapuolella vesikkelit ! | ovat jäykempiä ja uutto vähenee. Taulukosta 3 nähdään, että uuttonopeus vaihtelee erittäin vähän alueella 42 -45 °C. Tällä lämpötila-alueella erästä toiseen tapahtuva muuntelu olisi pienimmillään.

20 Esimerkki 3

Sekoitusolosuhteet

Tutkimukset tehtiin sekoitusnopeuden vaikutuksesta ': RBAP:n uuttonopeuteen.

:* Kokeet tehtiin 100, 175, 250, 350 ja 500 RPM:n no- ;· 25 peudella seuraavasti: 1 000 ml esimerkissä 1 kuvattua uuttoliuosta pan- :v. tiin kahden litran ruostumattomasta teräksestä olevaan • * , Dewar-pulloon (halkaisija 10,5 cm, korkeus 31 cm) ja sen annettiin lämmetä 45 °C:n uuttolämpötilaan. Tankin lämpö-, , 30 tilaa seurattiin. 20 grammaa RBAP:tä siroteltiin uuttoliu- 1 * oksen pinnalle ilman sekoitusta. Nollahetki määritettiin hetkeksi, jolloin sekoitin käynnistettiin kullakin edellä mainitulla RPM-asetuksella. Näytteitä otettiin joka kymme-nes minuutti ja ne sentrifugoitiin 1 200 RPMrn nopeudella 35 3 minuuttia. Supernatantti laimennettiin puskurilla ja ! 109152 j 23 ί ] pantiin jääkaappiin. Laimennetuista näytteistä määritettiin tromboplastiinipitoisuus edellä kuvatulla tromboplas-tiini menetelmällä.

Saadut tulokset osoittivat, ettei uuttonopeus sano-5 ttavammin vaihdellut sekoitusnopeuden kasvaessa. Toisaalta ajan kuluessa uutettu määrä lisääntyi huomattavasti sekoituksen nopeutuessa.

Nopeampi sekoitus kasvattaa uutetun määrän arvoja vaikuttamatta juurikaan käyrien kaltevuuteen. Kuviosta 7 10 nähdään 45 °C:ssa uutetun tromboplastiinin määrä eri se-koitusnopeuksilla 60 minuutin jälkeen. Kuvio 7 osoittaa, että uutetun tromboplastiinin määrän ja sekoitusnopeuden suhde on lineaarinen.

Esimerkki 4 15 lonivahvuuden vaikutus tromboplastiinin uuttoon RBAP:stä RBAP:tä (0,15 g) pantiin 8 - 5 ml:n muovisiin koeputkiin. Valmistettiin 1 M NaCl:n kantaliuos ja 3 ml NaCl-liuosta (pitoisuudeltaan 0 - 1 M) lisättiin kuhunkin put-20 keen. Kutakin putkea sekoitettiin 5 sekunttia Vortex-se-koittimella ja ne asetettiin 45 C:n vesihauteeseen. 10 minuutin inkuboinnin jälkeen putkia sekoitettiin 5 sekunttia Vortex-sekoittimella ja pantiin takaisin vesihautee-• seen vielä 5 minuutiksi. 15 minuutin ajanjakson jälkeen 25 putket sentrifugoitiin 4 °C:ssa 1 800 RPM:n nopeudella 20 minuuttia. Supernatantista tehtiin 30 -kertainen laimennos ,· puskuriin ja siitä analysoitiin tromboplastiinipitoisuus.

; : NaCl-pitoisuus muutettiin ionivahvuudeksi.

Kuviossa 8 nähdään saadun tromboplastiiniaktiivi- | 30 suuden määrä ionivahvuuden funktiona uuttopuskurissa. Ku vio 8 osoittaa, että uuttonopeus kasvaa ionivahvuuden kasvaessa maksimipisteeseen asti, jonka jälkeen nopeus laskee ionivahvuuden edelleen kasvaessa. Eräs selitys maksimipis-teen olemassaololle on se, että ionivahvuus kiihdyttää : , 35 myös sedimentaationopeutta sentrifugoinnin aikana. Sen 24 109152 vuoksi lisääntynyt sedimentaationopeus johtaa ilmeiseen uuttonopeuden alenemiseen, koska näytteiden TPLN-pitoisuus määritetään supernatantista uutteen sentrifugoinnin jälkeen.

5 Esimerkki 5

Reagenssin optimaalinen tromboplastiinipitoisuus

Pullosta uutettua tromboplastiinia tehtiin laimennoksia puskuriin aina laimennokseen 1:32 asti ja eri laimennokset määritettiin normaalia yhdistelmäplasmaa (NPP), 10 plasmakontrolleja VerifyR-normaalisitraattia (VNC) ja Verify" -normaalisitraattitasoja I ja II (VACI ja VACII) käyttäen. Laimennoksista määritettiin tromboplastiinikons-entraatiot.

Kuviossa 9 on kuvaaja TPLN-pitoisuuden vaikutukses-15 ta hyytymisaikaan käyttäen NPP:tä, Verify" -normaalisi-traattia ja Verify" -epänormaaleja tasoja I ja II. Kuviossa 9 nähdään tyypillisiä saturaatiokäyriä NPP:lie ja VNC:lie, ja niiden arvoissa nähdään hienoinen nousu korkeissa TPLN-pitoisuuksissa. Kuitenkin epänormaalien plasmojen tapauk-20 sessa arvot nousevat huomattavasti TPLN-pitoisuuden kasvaessa. Tämä vaikutus havaitaan myös tekijä VII -puutosplas-. maila ja Coumadin -käsitellyillä potilasplasmoilla.

Nämä tulokset osoittavat, että kun uutto-olosuh- > ·' teissä saadaan noin 1,5 yksikköä TPLN:ää, pienetkin erot , : 25 tuottaisivat huomattavia eroja käyttäytymisessä. Lisäksi pitkällä säilyvyysajalla pienet TPLN-pitoisuuden laskut ' havaitaan selvästi hyytymisajoissa. Toisaalta TPLN-arvot ; : alueella 0,5 - 1,0 yksikköä mukautuvat TPLN-muutokseen paljon paremmin ja näillä valmisteilla olisi parempi pit- . . : 30 käaikaissäilyvyys.

» · ,··, Esimerkki 6

Nestemäisen tromboplastiinireagenssin käyttäytymi- : .· nen

Kuten taulukosta 4 havaitaan, neljä tutkimuserää ; . 35 (RLl - RL4), jotka on valmistettu esimerkin 1 mukaisesti, 25 109152 antavat samanlaisia tuloksia eri kokeissa kuin teollisuuden tromboplastiinireagenssistandardi, Simplastin Exel, ja niillä on yleensä hyvä toistettavuus erästä toiseen.

5 Taulukko 4

Yhteenveto tutkimuserien tuloksista 10 Bakteeri taso 4f4 χ ίο3 0 0 0 0

Home 0 0 0 0 o

Normaali keskiarvo 12,0__12,0__12,3 12,4__12,0 15 ------j--- VNC__12,4__12,3 12,6 12,5 12,2 VACI__18,8__18,1 18,2 18,5 18,5 VACII_ 29,6 26,8 26,7 27,4 27,9 20 Verify 1__11,0__11,4 11,7 11,6 11,6

Verify 2__16,8__16,3 16,5 16,6 17f2 •i Verify 3_ 23,1 21,5 21,6 22,1 23,8 ;· ISI 2,04 2,06 1,97 2,05 2,06 ···· 25 -—-------‘- I'·'. Tekiiä herkkyys ;**; _V__2ZZ__31__35__40__37 VII__---__33__37__33__33 x__2ZI__li__li__12__3i

. *.j 3Q Hyväksytty SD

·"; VNC__0,13__0,07 0,13 0,13 _ VACI__0,21__0,12 0,09 0,07 _ '..I VACII_ 0,60 0,22 0,24 0,33 _ ·" Hyväksytty CV (%) ·'· 35 ~ : “ VNC__1?09__0,61 1,08 1,02__ VACI__1,13__0,69 0,49 0,.39__ VACII__2,16__0,88 0,94 ly24 26 109152

Taulukossa 5 on lisäksi yhteenveto samanlaisista tuloksista vielä viidelle nestemäiselle tromboplastiin-ireagenssierälle, jotka myös on valmistettu esimerkin 1 mukaan (Verify" l:tä, 2:ta ja 3:a on käytetty kontrolli-5 plasmoina). Nämä kolme kehityserää valmistettiin esimerkin 1 mukaan. Esitetty toistettavuus erästä toiseen on tuloksena tämän spesifikaation mukaisesta menetelmästä, jossa on stabilointiaineet ja antimikrobiaaliset aineet.

j 10 Taulukko 5

Tromboplastiivi reagenssin kehityserien käyttäyty-mistulokset _BDF*_ 1,6 1-,6 1,6 lf6 1,6

Propionaatti 000 0,1 0,1

Verify 1 11,7 11,3 11,6 11,2 11,4 20

Verify 2 17,5 17,2 16,9 17,2 17,5

Verify 3 25,7 25,0 25,9 25,8 25,1 * » j ‘ Bakteeri 0 0 0 0 0

Honie 0 0 0 0 0 20 ____——------ » 1 · • _cv______ v : Verify 1 1,20 0,51 0,90 0,90 1,0 verify 3 0,93 0,23 1,00 0,40 1,2 30 •·*: Normaali keskiavro j2/ 1 12,2 12,1 11,7 11,6 : *. ·. ISI__2,03 2,03 1,96 1,95 2,02 35 BDF - Bulkin laimennostekijä i 27 109152 ;

Esimerkki 7

Nestemäisen tromboplastiinireagenssin optimaalinen ISI -arvo

Kansainvälinen herkkyysindeksi (ISI) on kokeel-5 lisesti määritetty kalibrointiarvo, joka kuvastaa suun kautta annettavan tromboplastiinireagenssin antikoagulant-tiherkkyyttä verrattuna Maailman terveysjärjestön kansainväliseen vertailuvalmisteeseen. Esimerkin 1 mukaan valmistetun nestemäisen reagenssin ISI -arvot määritettiin käyt-10 täen vertailuerää, joka oli kalibroitu Maailman terveysjärjestön referenssiä vastaan.

Coumadin-käsitellyn potilasplasmasarjan ja normaa-liplasmasarjan PT -arvot analysoitiin koetromboplastiini-reagenssilla ja vertailutromboplastiinireagenssilla. Ku-15 vaajalle vertailunäytteiden PT -arvoista koenäytteiden funktiona saatiin log-log ortogonaalinen regressio. Regressiosuoran kaltevuus kerrottuna vertailureagenssin ISI:llä antaa koereagenssin ISI:n. Viidelle nestemäisen tromboplastiinireagenssin kehityserälle saadut tulokset on 20 esitetty taulukossa 5 ja neljälle nestemäisen tromboplastiinireagenssin tutkimuserälle taulukossa 4.

Esimerkki 8

Nestemäisen tromboplastiinireagenssin säilyvyys A. Suljetut pullot 25 Yksi nestemäisen tromboplastiinireagenssin erä val- ; mistettiin kuten on kuvattu esimerkissä 1, ja se sisälsi : RBAP:tä, PEG-1450:aa, BSArta, natriumsitraattia, natrium- kloridia, kalsiumglukonaattia, natriumatsidia ja tiomer-saalia. Näytteitä tästä erästä on säilytetty 2-8 °C:ssa ,· ; 30 24 kuukautta. Tästä erästä tehtiin PT-määritykset rinnak- karsina ja tulokset nähdään taulukossa 6. Tulokset osoittavat, että 20 kuukauden PT -arvot ovat vertailukelpoisia teollisuuden standardin, Simplastin Excel'in ja tämän erän * kesken ja että erä antoi samanlaisia tuloksia 0 hetkellä 35 ja 20 kuukauden jälkeen.

28 109152

Taulukko 6

Suljetun pullon säilyvyys PT tulokset (sekuntteina) 5 Γ Kuukausi 0 3 6 9 12 18 20

Koe-erä LOT (1,2 % propionikäppo _VNC__11,9 12,6 12,3 12,0 12,3 12,8 12,8 10 _VACI__19,5 18,8 20,3 20,0 19,4 19,8 18,7 _VACII__30,1 30,3 30,1 33,0 29,6 30,9 30,3

Simplasin Excel

Kuukausi 0 3 6 12 18 20 15 VNC__12,5 12,9 12,0 12,3 12,7 12,8__ _VACI__19,2 17, 8 20,8 19,3 18,7 18,7__ _VACII__28,5 27,2 30,9 29,6 29,5 30,3__ 20 Lisäksi esimerkissä 6 kuvattujen tutkimuserien to dellinen säilyvyys on määritetty 2-8 eC:ssa 12 kuukauteen asti. Tulokset nähdään jäljempänä olevassa taulukossa 7, ja ne osoittavat, että reagenssi käyttäytyy hyväksyttä-' ! vissä rajoissa, kuten kontrolliplasmoilla VNC, VACI ja I;'! 25 VACII on osoitettu.

! : 1 : t 1 > t · I I · t » · » ·

I I

> » » 109152 ! 29

Taulukko 7

Suljetun pullon säilyvyys, tutkimuserät PT-tulokset (sekuntteina) l 5 r-------- — , i ,

Kuukausi 0.3 6 10 12 RL1______

VNC__12,3__11,9__12,8__N/A__N/A

VACI__18,1__18 , 1__18,1__18,2__18,1 10 VACII__26,5__26,5__27,7__27,7 27,9

Simp. Excel

VNC .__12,4__12,3__12,9 N/A__N/A

VACI__18,5__18,1__18,8__18,5__17,8 15 VACII__29,4__29,6__33,2__30,0__28,9 RL2__

VNC__12,6__12,5__12, 5__N/A__N/A

VACI__18,3__17,6__18,2__18,1__18,6 VACII__26,1__26,9__27,4__27,1__28,2 20 _

Kuukausi 0 3 6 9 11 • RL3___

_VNC__12,5__12,5__12,5__N/A__N/A

;· VACI 18,7 17,6 18,2 18,1 18,6 25--}--1--1--1--1- j '·*: VACII 27,7 26,9 27,4 27,1 28,2 __0__3__9__10__ RL4___ 30 VNC__12,2__12,6__N/A__N/A__ •'" : VACI__18,5__17,9__17,9__17, 6__ . VACII__27,9__27,8__27,7__27, 2 i 30 109152 B. Avatut pullot

Esimerkissä 6 kuvattujen nestemäisen tromboplastii-nireagenssin erien kuudella avatulla pullolla, tutkimus-erillä 1 - 3 ja kehityserillä DL 1 - 3, on ainakin 14 päi-5 vän säilyvyys mitattuna PT-kokeella, jäljempänä oleva taulukko 8.

Taulukko 8

Avatun pullon säilyvyys PT -tulokset (sekuntteina) 10 Päivä o Päivä 7__Päivä 14 RL 1____(__ _VNC__12,4__12 | 5__12,2_ 15 _VACI__18,4__18,7__18 , 2_ VACII__27,4_ 27,8 26,9_ RL 2_______ _VNC__12^2__12,2__12,4_ _VACI·__18,2__18,3__18,3_ 20 VACII__26,5 26,6 26,7_ RL 3_________ i VNC__12,4__12,4__12,1_ :· _VACI__18,8__18,8__18,9_ i· 25 VACII__28,1__28,5__28,1_ : DLi____

Verify 1__11,8__11,7__11,3_ ; : : verify 2__17,6__17 , 6__17, l_

Verify 3 24,0__24,1__24,8_ 30 DL2 _______________ "’s Verify 1__11,8__11 ,6__11,3_ :v. Verify 2__17,4__17,4__17,o_ ,·*, Verify 3__25,7__25,2__24,7_ DL3 35---- verify 1__11,0__11,0__11,5_ ··*’ Verify 2__16,7__16,7__16,8_

Verify 3 24,6 24,8 24,3 ί

Claims (11)

109152 ! t

1. Stabiili nestemäinen tromboplastiinireagenssi, tunnettu siitä, että se sisältää tromboplastiiniku-5 dosuutetta, kalsiumioneja, stabilointiaineita ja antimik-robiaalisia aineita ja on saatavissa menetelmällä, joka käsittää seuraavat vaiheet (a) runsaasti tromboblastiinia sisältävä kudos uutetaan liuoksella, joka sisältää metallikloridin ja heikon 10 metalli-ionikelaattorin, konsentraatiossa alueella 25 - 40 grammaa kudosta/litra uuttoliuosta, (b) laimennetaan 1:1 liuoksella, joka sisältää kalsiumioneja ja albumiinia, ja (c) inkuboidaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen nestemäinen tromboplastiinireagenssi, tunnettu siitä, että runsaasti tromboplastiinia sisältävä kudos on kanin aivoista tehty asetonijauhe.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen nestemäi- 20 nen tromboplastiinireagenssi, tunnettu siitä, että kalsiumionit valitaan ryhmästä, joka sisältää kalsiumglu-: konaatin, kalsiumtartraatin ja kalsiumlaktaatin.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen nestemäinen tromboplastiinireagenssi, tunnettu siitä, 25 että ainakin yksi stabiloiva aine valitaan ryhmästä, joka • » * ; sisältää albumiinin, natriumpropionaatin, polyetyleenigly- : ·' kolin ja glukonaatti-ionit. I

* » ·.* ' 5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen nestemäinen tromboplastiinireagenssi, tunnettu siitä, I · : ‘.j 30 että se sisältää lisäksi natriumpropionaattia protom- ’biiniajan säätämisaineeksi.

6. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksista 1-5 t > mukaisen nestemäisen tromboplastiinireagenssin valmistami-’··’ seksi, tunnettu siitä, että siinä on vaiheet: *, 35 a) pestään kanin aivoista tehtyä asetonijauheuu- tetta (RBAP) vedellä pitoisuudessa noin 10 - 40 g RBAP/1, 109152 b) lämmitetään pesty RBAP-uute noin 25 °C:een, c) sekoitetaan lämmitetty RBAP-uute uuttoliuok- seen, joka sisältää metallikloridin ja heikon metalli-ionikelaattorin, konsentraatioalueella 25 - 40 g RBAP/1 5 uuttoliuosta, samalla jatkuvasti lämmittäen noin 45 °C:ssa, d) sentrifugoidaan liuos noin 2-10 °C:n lämpötilassa, e) laimennetaan supernatantti noin 1:1 liuoksella, 10 joka sisältää albumiinia ja kalsiumioneita, f) inkuboidaan laimennettua supernatanttia, g) säädetään pH noin neutraaliksi ja lisätään an-ti-mikrobiaaliset aineet, h) lisätään polyetyleeniglykolia noin 0,1 - 5 %, 15 i) määritetään liuoksen protrombiiniaika-arvot ja mikäli tarvitaan, j) lisätään natriumpropionaattia.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että metallikloridi vaiheessa (c) on 20 natriumkloridi, heikko metalli-ionikelaattori vaiheessa (c) valitaan natriumsitraatista ja natriumoksalaatista ja kalsiuminonit vaiheessa (e) valitaan kalsiumglukonaatista, kalsiumtartraatista ja kalsiumlaktaatista. - » -*

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, ? > * 25 tunnettu siitä, että vaiheessa (c) uuttoliuos sisältää t i * * »* lisäksi kalsiumglukonaattia, kalsiumtartraattia tai kal- : .* siumlaktaattia.

,·: 9. Patenttivaatimuksen 6-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ennen natriumpropionaatin lisäys-| 30 tä liuos lisäksi säädetään bulkin laimennuskertoimen avul- I la.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen • » * : *' nestemäinen tromboplastiinreagenssi käytettäväksi diagnos- tisessa menetelmässä. t I 109152

11. Diagnostinen välineistö, tunnettu siitä, että se sisältä jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen nestemäisen tromboplastiinreagenssin. i 109152