DE69314959T2

DE69314959T2 - Verfahren zum zählen von objekten in einem rasterabgetasteten teilbild.

Info

Publication number: DE69314959T2
Application number: DE69314959T
Authority: DE
Inventors: Steven Floeder; Joseph Graessele; John Schultz; Werner Schwarz; Frederick Waltz
Original assignee: Minnesota Mining and Manufacturing Co
Current assignee: 3M Co
Priority date: 1992-07-13
Filing date: 1993-06-14
Publication date: 1998-06-18
Anticipated expiration: 2013-06-15
Also published as: DE69314959D1; EP0656938A1; US5403722A; AU4634593A; MX9304118A; DK0656938T3; EP0656938B1; CA2138272A1; JPH07509084A; WO1994001528A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Zählen der Anzahl unterscheidbarer Objekte in einem abgetasteten Bild. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Zählen der Anzahl von Mikroorganismus- Kolonien, die auf einem im wesentlichen planaren Substrat vorhanden sind.

Hintergrund der Erfindung

Es sind verschiedene Verfahren und Vorrichtungen zurn Zählen von Mikroorganismus- Kolonien beispielsweise in Petrischalen bekant. Das manuelle Zählen von Kolonien durch ausgebildetes Laborpersonal ist bekannt. Dieses Verfahren hat zahlreiche Nachteile. Dies sind unter anderem die mit dem Einsatz qualifizierter Techniker für das zeitaufwendige manuelle Zählen verbundenen Kosten sowie die begrenz:te Genauigkeit der erhaltenen Zählungen.
Ferner sind automatisierte Zählsysteme bekannt. Diese können in zwei Grundkategorien unterteilt werden. Die erste Kategorie enthält die Systeme, die Kameras oder eine Videoausrüstung in Verbindung mit hart-verdrahteten Schaltungen oder digitalen Computem zu Zählen der Anzahl der Kolonien in einer Petrischale verwenden. Beispiele für solche Systeme sind in der EP-Veröffentlichung 0 301 600, dem US-Patent 3 811 036 an Perry, und der französischen Veröffentlichung 2 602 074 beschrieben.
Auf Video basierende Systeme haben eine Anzahl von Nachteilen. Der hauptsächliche Nachteil ist die teure und komplizierte Ausrüstung, die bei solchen Systemen verwendet wird, um das von den Videokameras erzeugte grobe Pixelbild zu verarbeiten. Um ein mehrfaches Zählen der selben Kolonien zu vermeiden, weisen solche System üblicherweise verarbeitungsintensive Markierungsschemata auf, die verhältnismäßig leistungsstarke Computersysteme erfordern, um die Zahl der Kolonien in einem akzeptablen Zeitrahmen genau zu zählen.
Ein zusätzlicher Nachteil besteht darin, daß viele der auf Video basierenden Systeme erfordern, die Petrischalen durch deren Bodenfläche zu beleuchten, welches ein zur Gewährleistung einer genauen Zählung ein lichtdurchlässiges Substrat erfordert. Die Beleuchtung wird üblicherweise erforderlich, da die Dicke des in Petrischalen verwendeten Agars dazu führt, daß Kolonien sowohl an der Oberfläche, als auch in der Miffe und am Boden des Agars wachsen. Eine Oberflächenbeleuchtung würde lediglich dazu führen, daß zu wenige Kolonien in der Miffe und am Boden des Agar gezählt werden. In anderen Systemen, beispielsweise in dem in P 0 301 600 beschriebenen System, werden die Absorptionsfähigkeit und Lichtdurchlässigkeit zum Erkennen von Kolonien verwendet.
Das Kolonienwachstum durch die gesamte Dicke des Mediums ist kein besonderes Problem für Benutzer der wegwerfbaren Mikroorganismenzuchtvorrichtungen wie PETRIFILM-Kulturplatten, die von 3M hergestellt werden. Solche Vorrichtungen haben eine sehr dünnen Schicht eines Anzuchtmediums, wodurch sämtliche Kolonien durch Oberflächenbelichtung sichtbar werden. Das Substrat ist jedoch nicht ausreichend lichtdurchlässig für eine Verwendung mit vielen der bekanten automatischen Zählsysteme.
Zusätzlich zu den Kosten und der Komplexität der Hardware-Konflgurationen bekannter automatischer Video-Zählsysteme, weisen auch die Objektzählalgorithmen, die in Systemen verwendet werden, welche eine Digitalisierung der Bilder verwenden, Nachteile auf.
Eine einfache Euler-Zahl kann zum Identifizieren von Objekten in einem raster-abgetasteten Bild und in einem einzigen Durchlauf durch das Bild verwendet werden, jedoch erkennt sie nur 4-verbundene Objekte. Dies kann zu fehlerhafien Ergebnissen führen, wenn 8-verbundene Objekte in dem abgetasteten Bild vorhanden sind.
Auf der anderen Seite erkennt ein Analyse der voll-verbundenen Komponenten sämtliche Objekte, egal ob sie 4 oder 8 untereinander verbundene Pixel aufweisen. Diese Art der Analyse erfordert jedoch ein kompliziertes Markieren und Kennzeichnen, das mehrere Buddurchläufe sowie erheblich komplexere und kostspieligere Hardware erfordern kann.
Die zweite Kategorie der automatischen Zählsysteme verwendet üblicherweise eine Anordnung aus Photodetektoren und hart-verdrahteten Schaltungen zum Durchführen des Zählvorgangs. Wie die meisten auf Video basierenden Systeme, unterliegen auch die Photodetektoren verwendenden Zählsysteme der Beschränkung, daß die Petrischale durch ihr Substrat hindurch beleuchtet werden muß, um eine genaue Zählung zu erhalten. Infolgedessen muß das Substrat, auf dem die Kolonien enthalten sind, lichtdurchlässig sein, was insbesondere ein Problem bei wegwerfbaren Anzuchtvorrichtungen wie PETRIFILM-Kulturplatten ist.
Beispiele für solche Systeme sind in em US-Patent 3 493 772 an Daughters II et al. Sowie im US-Patent 3 736 432 an Sweet offenbart. Die Vorrichtung nach Daughters weist eine Lichtquelle unter der Petrischale auf und verwendet die Kolonien als Linsen zum Fokussieren des Lichts auf eine lineare Anordnung von Photodetektoren. Die Vorrichtung nach Sweet verwendet eine Lichtquelle unterhalb der Petrischale, welche die Lichtabsorptionsfahigkeit der Bakterienkolonien zur Erzeugung schwarzer Flecken auf einem linearen Photodetektor verwendet. Beide Systeme verwenden gewidmete Schaltungen zum Durchführen des Zählvorgangs.
Sowohl die Vorrichtung nach Daughters, als auch die Vorrichtung nach Sweet verwendet eine lineare Anordnung von Photodetektoren und verlassen sich zum Verhindern eines Zählens durch benachbarte Photodetektoren auf Spannungsänderungen, wodurch sie ein mehrfaches Zählen einzelner Kolonien vermeiden. Diese Schaltung zu Fehlern beim Zählen Führen, da Kolonien, die opak oder lichtdurchlässig sind oder nicht, mit einem jeweiligen System nicht gezählt werden können. Es können andere Fehler beim Zählen von baumartigen oder anderen komplex geformten Kolonien auftreten.
DE-A-39 16804 beschreibt eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Zählen von Bakterienkolonien in einem im wesentlichen flachen Substrat, das üblicherweise Kreisform hat. Die Fläche des Substrats wird von einer Erkennungseinrichtung abgetastet, die in definierten Linien über das Substrat bewegt wird. Vorzugsweise wird eine Anordnung lichtempfindlicher Detektoren verwendet, die in einer zur Erstreckung der Anordnung senkrechten Richtung über die Anordnung bewegt wird. Die Vorrichtung weist ferner eine Einrichtung zum Zählen der Bakterienkolonien und einen spezifischen Algorithmus auf, die es ermöglichen, festzustellen, ob eine Kolonie vorhanden ist und ob sie gezählt werden soll oder nicht. Eine Lichtquelle für die vorzugsweise gleichmäßige Beleuchtung des Substrats wird nicht erwähnt. Ferner wird nicht auf die Erkennungseinrichtung als solche oder eine Abbildungseinrichtung irgend einer Art eingegangen. Typischerweise wird eine vollständige Zeile durch die Anordnung der Erkennungseinrichtung aufgezeichnet und in einem Speicher gespeichert. Anschließend wird die Erkennungseinrichtung schrittweise weiterbewegt und eine zweite Zeile wird aufgezeichnet. Das System unterscheidet zwischen dem Vorhandensein eines Objekts (Hochpegelsignal) und dem Hintergrund (Niederpegelsignal). In einem relativ kornplexen logischen Auswertungsvorgang werden die Daten der beiden Zeilen aufgezeichnet und schrittweise (durch elektronisches Bewegen von einem Ende einer Leitung zum anderen) ausgewertet, so daß am Ende eine Entscheidung getroffen werden kann, ob eine oder mehrere Kolonien vorhanden sind. Die ist jedoch keine endgültige Entscheidung. In einem nachfolgenden Schriff wird die Anordnung um einen weiteren Schritt bewegt. Die neue Zeile wird aufgezeichnet und gespeichert sowie mit der vorhergehenden Zeile verglichen. Die Daten werden erneut schrittweise verglichen und die Objekte entsprechend gekennzeichnet. Dies wird fortgeführt, bis das Ende der Kolonie schließlich identifiziert ist. Figur 13 zeigt eine andere Ausbildung, in der das Substrat auf einem Zylinder angeordnet ist, der unter der Anordnung der Erkennungseinrichtungen gedreht wird.
US-A-4456380 betrifft ein Testsystem für die Identifizierung von Bakterienkolonien, bei dem eine Vielzahl von in einer rechteckigen Anordnung vorgeseheneü Zellen nacheinander getestet wird. Zu diesem Zweck wird ein Beleuchtungssystem verwendet, das aus einer Lampe, einer Sammellinse und einer Lichtleitfaser besteht, welche ein Beleuchten der einzelnen Zellen ermöglicht. Das reflektierte Licht wird durch das Anordnen von Filtern zwischen der Zelle und der Erkennungseinrichtung aufgezeichnet, um eine Spektralanalyse zu erhalten. Die Lichtquelle ist üblicherweise eine Habgenlampe, deren Licht auf ein Ende einer Gruppe von optischen Fasern fokussiert wird. Diese optischen Fasern selbst haben keinerlei fokussierende Eigenschaften und werden nur zum Übertragen des Lichts an die gewünschte zu analysierende Zelle verwendet.
GB-A-2227346 beschreibt ein Verfahren für eine Bildanalyse. Es ist das Ziel dieser Analyse, eine Aahl von Objekten zu identifizieren und zu markieren. Daher wird für jeden Objekt ein Speicher gebildet. Das Bild wird von einer nicht näher erläuterten Erkennungseinrichtung vollständig abgetastet. Zur Identifizierung wird eine Anordnung von fünf Pixeln verwendet, die eine logische Eins oder eine logische Null annehmen. Miffels eines relativ komplexen Algorithmus wird das Bild vollständig abgetastet und die einzelnen Flächen werden in Beziehung zu den Objekten gesetzt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Merkmale der vorliegenden Erfindung sind in den beigefügten Patentansprüchen dargelegt.
Die vorliegende Erfindung bietet bedeutende Vorteile gegenüber bekannten automatischen Zählsystemen. Der wesentlichste dieser Vorteile liegt darin, daß die bevorzugte Vorrichtung speziell zur Verwendung mit Wegwerfvorrichtungen zum Züchen von Mikroorganismen, wie in dem US-Patent 4 565 783 an Hansen et a. Beschrieben, entwickelt wurde.
Handelsübliche Ausführungsformen der Vorrichtungen nach Hansen werden unter der Handelsbezeichnung PETRIFILM von 3M vertrieben. Zahlreiche PETRIFILM-Produkte weisen Substrate auf, die im wesentlichen nicht lichtdurchlässig sind und daher zahlreiche der bekannten Vorrichtungen zum Zählen von Kolonien in Petrischalen unbrauchbar machen. Ferner sind viele dieser Systeme zur Verwendung mit Standard- Petrischalen, die eine tiefe Aufnahme zum Halten des Kulturmediums aufweisen, jedoch nicht mit den im wesentlichen planaren PETRIFILM-Produkten ausgebildet.
Die vorliegende Erfindung eliminiert die zuvor beschriebenen bekannten Systeme. Insbesondere erfordert die vorliegende Erfindung keine Beleuchtung durch das Substrat hindurch und ist zur Verwendung mit Mikroorganismen-Anzuchtvorrichtungen mit einem im wesentlichen planaren Substrat, wie beispielsweise PETRIFILM, geeignet. Die vorliegende Erfindung ermöglicht ferner eine schnelle und genaue Zählung von Kolonien durch Verwendung leicht verfügbarer linearer Anordnungen von Lichtquellen, Linsen und Bildsensoren - von denen viele zur Verwendung in Fax-oderFotokopiergeräten entwickelt wurden. Diese Bauteile sind mit leicht verfügbaren Mikroprozessoren verbunden und verwenden den im folgenden beschriebenen Algorithmus zur genauen und schnellen Zählung ohne das Markieren oder das längerfristige Speichern von Daten zur Vermeidung des mehrfachen Zählens einzelner Kolonien.
In der einfachsten Form weist die bevorzugte erfindungsgemäße Vorrichtung eine LED-Leiste, die die Oberfläche des Substrats beleuchtet, und eine lineare Anordnung von SELFOC-Linsen auf, welche das con dem Substrat reflektierte Licht auf eine lineare CCD-Sensoranordnung fokussieren. Die CCD-Sensoranordnung ist mit einem Mikroprozessor verbunden, welcher gerasterten Daten unter Verwendung des bevorzugten Algorithmus analysiert.
Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Vorrichtung zum automatischen Übertragen und Speichern von Daten elektrisch mit einem entfernten Computer verbunden.
Das bevorzugte Bildverarbeitungssystem weist eine automatische Kalibrierfunktion auf, welche die Sensoren durch Abtasten eines Leer-Substrats kalibriert, uin einen Schwellenwert zu bestimmen, oberhalb dessen ein Gegensand gezählt wird.
Ferner ist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ein Kassettenmechanismus vorgesehen, der eine Anzahl von Substraten auf eine Art und Weise automatisch durch die Abtastvorrichtung führt, die der automatischen Führung von Papier durch einen Fotokopierer ähnlich ist.
Es können ferner Strichcode-Etiketten an den Kulturvorrichtungen vorgesehen werden, um die Informationsübertragung von der bevorzugten Vorrichtung zu anderen elektronischen Vorrichtungen zu vereinfachen. Bei der bevorzugten Vorrichtung werden die LED-Anordnung und die CCD-Sensoren, die zum Erkennen von Kolonien eingesetzt werden, auch zum Lesen der Strichcode-Etiketten verwendet.
Der zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung entwickelte bevorzugte Algorithmus bietet ebenfalls Vorteile gegenüber bekannten Algorithmen zum Zählen von Objekten. Wie eine Euler-Zahl-Analyse kann der bevorzugte Algorithmus derart eingesetzt werden, daß nur ein Durchlauf durch das Bild efforderlich ist. Sein Vorteil gegenüber der Euler-Zahl-Analyse besteht darin, daß der bevorzugte Algorithmus zusätzlich zu den 4 untereinander verbundenen Pixeln, auf die eine Euler-Zahl-Analyse beschränkt ist, auch 8 untereinander verbundene Pixel erkennen kann. Der bevorzugte Algorithmus erfordert dazu keine mehrfachen Durchläufe durch das Bild oder die Komplexität und die Kosten, die mit einem Algorithmus für eine vollverbundene Komponentenanalyse, einschließlich des Markierens der Pixel des gesamten Bildes, einhergeht.
Darüber hinaus ist der bevorzugte Algorithmus besonders geeignet für Betrachtungsaufgaben, die eine relativ hohe Bildverarbeitungsgeschwindigkeit erfordern, da der Algorithmus mit seiner Verwendung von gerasterten Daten und dem begrenzten Verarbeitungsbereich für eine Hochgeschwindigkeitsdatenverarbeitung unter Verwendung relativ einfacher Hardware ausgelegt sind. Im Gegensatz dazu erfordern die zuvor beschriebenen bekanten Systeme komplexe Hardwarekonfigurationen für das Implementieren komplexer Datenanalyseschemata. Infolgedessen beträgt ihr Preis üblicherweise 10000 $ und mehr.
Für ein besseres Verständnis der Erfindung, ihrer Vorteile und der durch ihren Einsatz erfüllten Aufgaben wird auf die Zeichnungen bezug genommen, die einen weiteren Teil der Anmeldung bilden sowie auf die zugehörige Beschreibung, in welchen bevorzugte Ausführungsbeispiele der Erfindung dargestellt und beschrieben werden.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine geschniffene Seitenansicht der vorliegendem Erfindung, welche die Beziehung der Bestandteile des bevorzugten Ausführungsbeispiels untereinander darstellt.
Figur 2 ist eine perspektivische Draufsicht auf eine wegwerfbare Mikroorgansimen- Anzuchtvorrichtung, beispielsweise eine PETRIFILM-Kulturvorrichtung, mit einer Anzahl von darauf befindlichen Kolonien.
Figur 3 ist eine vergrößerte geschnittene Seitenansicht des Abtastbereichs des bevorzugten Ausführungsbeispiels
Figur 4 ist ein Blockdiagramm des erfindungsgemäßen Steuersystems.
Figur 5 ist ein Flußdiagramm zur Darstellung der Funktionsweise eines bevorzugten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung.
Figur 6 ist ein Diagramm des in dem bevorzugten Algorithmus der vorliegenden Erfindung verwendeten Pixelbereichs.
Figur 7 zeigt eine Tabelle der 16 möglichen Pixelbereiche, die beim Verarbeiten von Bilddaten in dem bevorzugten Algorithmus der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Figur 8 ist eine Tabelle von Beispielen möglicher Objekte, die durch den vorliegenden Algorithmus aufgefünden werden, und des Ergebnisses des bevorzugten Algorithmus nach dem Verarbeiten dieser Objekte.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

Figur 1 zeigt aus Gründen der Klarheit eine Querschmif durch die bevorzugte Vorrichtung der vorliegenden Erfindung. Die bevorzugte Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung dient dem Zählen der Anzahl von Mikroorganismuskolonien auf wegwerfbaren Kulturvorrichtungen, wie beispielsweise PETRIFILM-Kulturplatten (Siehe Figur 2), obwohl Objekte auf jedem Substrat bei geeigneten Veränderungen der Hardware- und Steuersysteme gezählt werden können. Ein Beispiel für eine andere Anwendung ist das Untersuchen sich bewegender Gewebe auf Defekte, die als deutlich erkennbare Objekte auftreten.
Figur 2 zeigt eine Einweg-Mikroorganismen-Kulturvorrichtung 40, beispielsweise das zuvor beschriebene PETRIFILM-Produkt. Die Vorrichtung weist ein Substrat 42 mit an der Oberfläche befindlichen Kolonien 44 von Mikroorganismen auf. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel weist das Substrat 40 ferner vorzugsweise einen Strichcode 46 an seinem oberen Rand zum Kennzeichnen der einzelnen Proben auf Der Strichcode ist besonders zum Nachvollziehen des Speicherns und des Übertragens von Daten nützlich. PETRIFILM-Produkte weisen ferner üblicherweise eine Reihe von Gitterlinien 48 auf, die für das manuelle Zählen von Kolonien nützlich sind. Obwohl die bevorzugte Vorrichtung zur Verwendung mit PETRIFILM-Produkten ausgelegt ist, ist es ersichtlich, daß ein ähnliches Produkt mit eine im wesentlichen planaren Substrat und daran anhafienden Nährstoffen zum Kultivieren von Mikroorganismen anstelle von PETRIFILM-Produkten verwendet werden kann.
Figur 1 zeigt ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Der Zähler 10 weist einen Motor 12 auf, der vorzugsweise ein Gleichstrom-Schriffmotor ist. Der Motor 12 ist betriebsmäßig mit Rollen 1 4a, 1 4b und 16 zum Bewegen eines Substrats 26 zu Abtastzwecken durch den Zähler 10 verbunden. Das Substrat 26 tritt in den Zähler 10 auf der rechten Seite ein und bewegt sich hindurch zum linken Ende der Vorrichtung. Ein Schrittmotor bewirkt eine genaue schrittweise Bewegung des Substrats 26 durch den Zähler 10.
Der bevorzugte Zähler 10 weist eine lineare LED-Anordnung 20 auf, die auf das Substrat 26 gerichtet ist. Die bevorzugte LED-Anordnung trägt die Modellbezeichnung TLG6A13P und ist von Toshiba Corporation hergestellt. Diese LED-Anordnung ist besonders nützlich, da sie Licht mit Wellenlängen erzeugt, welche die auf einer Art des PETRIFILM-Produkts vorhandene Gifferanordnung 48 neutralisieren (siehe Figur 2). Diese Gitteranordnung erscheint dem bloßen Auge gelb. Ein ähnlicher Effekt könnte auch mit Lichtquellen erreicht werden, die andere Wellenlängen erzeugen, indem ein Rötlich-Gelb-Filter (Wratten-Filter #9 oder Corion LL-550-S-4385) zwischen dem CCD-Sensor 24 und der Lichtquelle verwendet wird.
Die bevorzugte LED Anordnung 20 ist ebenfalls für die vorliegende Anwendung nützlich, da die Intensität des von der Anordnung erzeugten Lichts im wesentlichen gleichmäßig ist, wodurch die Genauigkeit der Vorrichtung unterstützt wird.
Über dem Substrat 26 ist in dem bevorzugten Zähler eine Anordnung von SELFOC- Linsen 22, Modell SLA-12-TC43A6, hergestellt von Nippon Sheet Glass Co., angeordnet. Diese Stablinsenanordnung 22 wird verbreitet in Fax-Geräten und in einigen Fotokopiergeräten verwendet. Über der SELFOC-Linsenanordnung befinde sich eine lineare CCD-Sensoranordnung 24, vorzugsweise des Modells TCD127AC, hergestellt von Toshiba Corporation.
Figur 3 ist eine vergrößerter Darstellung des Abtastbereichs der bevorzugten Vorrichtung. Wie dargestellt, erzeugt die LED-Anordnung 20 Licht 21, das von dem Substrat 26 reflektiert wird und wenigstens teilweise durch die SELFOC-Linse 22 hindurch reflektiert wird, welche das Licht auf den CCD-Bildsensor 24 fokussiert. Die Rollen 14a und 14b dienen zum Bewegen des Substrats 26 durch den Abtastbereich. Wie zuvor erwähnt, sind die Rollen vorzugsweise mit dem Schriffmotor 12 zum genauen schrittweisen Bewegen des Substrats 26 durch den Abtastbereich verbunden.
In Figur 1 ist ferner dargestellt, daß das Eingangsende des Zählers 10 zur Aufnahme einer Kassette 18 ausgebildet ist, die einen Stapel Substrate 26 zum automatischen Führen durch den Zähler 10 aufweist. Die Rolle 16 ist über dem Kassettenmechanismus 18 angeordnet und liegt auf dem obersten Substrat 26, um dieses automatisch in den Zähle 10 zu führen.
Figur 4 ist ein Blockdiagramm, das das bevorzugte Steuersystem der vorliegenden Erfindung darstellt. Wie gezeigt, ist der CCD-Bildsensor 24 mit dem Mikroprozessor 50 verbunden. Der bevorzugte Mikroprozessor so ist ein 8-Bit-CMOS-Microcontroller, Modell 80C535, hergestellten von Siemens AG.
Vom CCD-Bildsensor 24 kommende Daten werden im Bildspeicher 860 gespeichert, der ebenfalls mit dem Mikroprozessor 50 verbunden ist. Beim bevorzugten Ausführungsbeispiel werden diese Daten in einem rasterförmig abgetasteten Format zur Verwendung mit dem bevorzugten Algorithmus gespeichert, wie im folgenden im einzelnen beschrieben.
Die LCD-Anzeige 30 dient dem Liefern von Nachrichten an den Bediener und dem Auffordern zu Handlungen desselben. Der Kassettenschalter 52 zeigt an, ob eine Kassette 18 (siehe Figur 1) in den Zähler 10 geladen ist. Die Starttaste 54 dient dem Starten des Vorgangs des Bewegens eines Substrats 26 in den Abtastbereich und dem Durchführen des Abtastvorgangs. Der Eingangslichtschalter 56 dient dazu, anzuzeigen, ob ein Substrat 26 in den Abtastbereich eingegeben wurde.
Der Schriffmotor 12 dient dem schriffweisen Vorschieben der Substrate 26 durch den Abtastbereich und aus dem Zähler hinaus und ist betriebsmäßig mit den Rollen 14a, 14b und 16 gemäß den Figuren 1 und 3 verbunden. Die Rollen sind vorzugsweise zahhradgetrieben, obwohl jegliche geeignete genaue Verbindungsart verwendet werden kann.
Die LED-Leistenanordnung 20 dient dem Beleuchten der Oberfläche des Substrats 26 und jeglicher Objekte auf diesem zum Abtasten durch den CCD-Bildsensor 24. Der CCD-Bildsensor 24 dient zum Erkennen von Objekten aus dem reflektierten Licht. Die Bildempfindlichkeitsschaltung 58 dient dem Einstallen der Empfindlichkeit des CCD- Bildsensors 24 auf einen Pegel, unter welchem ein Leer-Substrat 26 kein Ansprechen des Bildsensors bewirkt. Ein Vorteil dieser Schaltung liegt darin, daß sie sich automatisch an bei verschiedenen Substraten gegebene Veränderungen des Hintergrunds anpaßt.
Der Bildspeicher 60 dient dem Speichern der Daten vom CCD-Bildsensor 24 und wird zum Erkennen der Anzahl von deutlich unterscheidbaren Objekten auf der Oberfläche des Substrats 26 unter Verwendung des im folgenden beschriebenen bevorzugten Algorithmus verwendet. Das mit dem Bezugszeichen 62 versehene serielle Interface RS-232 dient der Kommunikation zwischen der vorliegenden Erfindung und einem Computer oder einer anderen elektronischen Vorrichtung. Wie in Figur 1 dargestellt, ist der Zähler 10 über das Interface RS-232 vorzugsweise mit einem Computer 32 verbunden, um eine Datenübertragung zwischen dem Computer und dem Zähler 10 zu gewährleisten.
Figur 5 ist ein Flußdiagramm des Funktionsablaufs des bevorzugten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung, welches eine Kassette zum automatischen Zuführen von Substraten in den Zähler 10 aufweist. Es ist für den Fachmann ersichtlich, daß einige Merkmale dieses Flußdiagramms nicht auf einen Zähler anwendbar sind, der zum Abtasten einzeln zugeführter Substrate ausgelegt ist.
Zum Beginnen des Vorgangs wird der Zähler 10 eingeschaltet 70 und die LCD-Anzeige zeigt an, daß eine Kassette mit einer Anzahl von Substraten in den Zähler geladen werden sollte, wobei ein Leer-Substrat obenauf liegen soll 72. Das Leer-Substrat dient der Einstellung der Empfindlichkeit der CCD-Bildsensoren, um Fehler im Erkennungsvorgang zu vermeiden. Wenn die Kassette eingesetzt ist, zeigt die LCD-Anzeige "Starttaste drücken" an 76.
Nach dem Aktivieren der Starttaste wird das Leer-Substrat in da Zentrum es Zählers bewegt 80, das zuvor als Abtastbereich bezeielinet wurde. Der Zähler weist ferner vorzugsweise einen Eingangslichtschalter auf, der anzeigt, daß ein Substrat in den Abtastbereich 82 bewegt wurde. Wenn kein Substrat (oder Film) vorhanden ist, zeigt die LCD-Anzeige "Stau" oder "Kein Film" 84 an, um em Bediener das Auftreten einer Betriebsstörung anzuzeigen.
Sobald ein Leer-Substrat in Position gebracht ist, beginnt der Abtastvorgang. Wenn das Leer-Substrat ein Signal des CCD-Bildsensors erzeugt 86, senkt die Bildempfindlichkeitsschaltung automatisch die Empfindlichkeit des CCD-Bildsensors 88 auf einen Punkt, an dem das Leer-Substrat kein Signal erzeugt.
Nach dem Einstellen der CCD-Sensorempfindlichkeit wird das Leer-Substrat aus dem Zähler bewegt 90, und das erste Substrat mit Mikroorganismus-Kolonien wird in die Abtastposition 92 bewegt. Danach wird die erste Zeile in den Speicher gelesen 94, und wenn diese Zeile einen Strichcode enthält, wird der Strichcode in den Speicher geladen, wodurch die Identität der auf dem Substrat vorhandenen Probe angegeben ist.
Danach wird das Substrat in den Abtastbereich (Datenposition) bewegt 98, und die erste Datenzeile wird in den Bildspeicher eingelesen 100. Das Substrat (der Film) wird durch den Schrittmotor 102 um einen Schritt bewegt und die nächste Zeile wird in den Speicher eingelesen 104. Der Speicherinhalt wird sodann gemäß dem im folgenden beschriebenen bevorzugten Algorithmus analysiert 106. Das Abtasten wird auf die beschriebenen schrittweise Art fortgesetzt, bis das gesamte Substrat abgetastet ist 108.
Nach dem Beenden des Abtastens werden die Ergebnisse des Abtastvorgangs angezeigt 114, und können an einen Computer oder eine andere elektronische Vorrichtung unter Verwendung des seriellen Interface RS-232, das Teil des bevorzugten Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung ist, übertragen werden. Die Steuerung stellt fest, ob ein anderes Substrat in der Kassette verfügbar ist 116, und wenn dem so ist, wird der genannte Vorgang wiederholt. Nachdem sämtliche Substrate in der Kassette abgetastet wurden, signalisiert der Zähler 10, daß der Vorgang beendet ist.
Zwar weist die zuvor beschriebene bevorzugte Vorrichtung eine LED-Anordnung auf, die Licht mit einer Spitzen-Wellenlänge von 567 nm erzeugt, jedoch ist es verständlich, daß zählreiche andere, von den zuvor beschriebenen verschiedene Arten oder Verfahren der Erkennung möglich sind. Insbesondere kann die vorliegende Erfindung fluoreszierende Lichtquellen verwenden, oder die CCD-Bildsensoren können zum Erkennen von chemiluminiszenten Kolonien verwendet werden. Darüber hinaus können die Detektoren auf bestimmte Farben ansprechen oder von den Kolonien ausgehende Strahlung erkennen.
Zwar weist das bevorzugte Ausführungsbeispiel der Vorrichtung die zuvor beschriebene Hardware auf, jedoch können alternative Ausführungsbeispiele, die andere Hardware verwenden, entwickelt werden. Da die Daten der Zeilenabtaster im Raster-Abtastformat vorliegen, bewirkt eine einfache Zeilenverzögerungsvorrichtung (z.B. mehrere miteinander verbundene FIFOs oder ein statischer RAM mit unabhängiger Lese/Schreib-Adressen-Hardware) Zugriff auf zwei Zeilen des rasterförmig abgetasteten Bildes. Ein Schieberegister und eine Komparatorbank können anschließend das Bitmuster bestimmen, das die Objektbeginn- und Objektverschmelzungszustände auslöst, die im folgenden näher beschrieben werden. Alternativ kann ein Schieberegisterausgang direkt als die Datenadresse in einer Verweistabelle verwendet werden. Summier- Hardware kann dabei die Zahl der Objektbeginn- und Objektverschmelzungszustände zählen, die entweder von der Verweistabelle oder den Komparatoren erkannt wurden.

Bevorzugter Objektzählalgorithmus

Der bevorzugte Algorithmus zum Zählen der Anzahl der unterscheidbaren Objekte im abgetasteten Bereich des Substrats wird im folgenden anhand der Figuren 6 - 8 beschrieben. Im Grunde durchsucht der Algorithmus den Datenstrom, um Objektbeginne und Objektverschmelzungen zu erkennen. Die Gesamtzahl unterscheidbarer Objekte in einem abgetasteten Bild ist gleich der Zahl der Objektbeginne minus der Zahl der Objektverschmelzungen.
Es ist für den Fachmann auf diesem Gebiet ersichtlich, daß zahlreiche andere Algorithmen u Abtasten von Objekten wie Substraten mit darauf befindlichen Kolonien von Mikroorganismen verwendet werden können. Beispiele für solche Algorithmen sind unter anderem der SRI(Stnnford Researeh Institute) -Algorithmus oder eine Euler-Zahl- Analyse. Die vorliegende Erfindung ist jedoch höchst vorteilhaft in Verbindung mit dem im folgenden beschriebenen bevorzugten Algorithmus verwendbar.
Der bevorzugte Algorithmus ist zur Verwendung mit einem gerasterten Datenformat ausgelegt, um Hochgeschwindigkeitsuntersuchungsfähigkeiten zu verleihen. Dieses Format behandelt das Bild als eine zweidimensionale Anordnung von Daten, auf die nur entlang aufeinanderfolgenden Zeilen von links nach rechts zugegriffen werden darf Infolgedessen ist es schwierig, zu einem Zeitpunkt auf mehr als einen kleinen Bereich des Bildes zuzugreifen. Das betreffende Pixel läuft gerastert durch das Bild und somit muß auch der Bereich des Bildes, der flir die Verarbeitung verfügbar ist, mit dem betreffende Pixel durch das Bild laufen.
Der bevorzugte Algorithmus verwendet die sigma-förmige Umgebung nach Figur 6 zur Bildverarbeitung. Das Hinzufügen des fünften Pixels (P5) zu der üblichen 2x2 Verarbeitungsumgebung ermöglicht eine Analyse von 8-verbundenen Objekten, die mit einer Euler-Zahl-Analyse nicht möglich ist. Da ferner jedes gegebene Pixel entweder Teil eines Objekts oder Teil des Hintergrunds ist, werden Graustufen-Bilder vorzugsweise in ein binäres Format konvertiert, wobei das Objekt weiß (Pixelwert = 1) und der Hintergrund schwarz ist (Pixelwert = 0). Diese Umwandlung wird vollzogen, bevor die Daten mit dem bevorzugten Algorithmus verarbeitet werden.
Im Gebrauch läßt der Algorithmus des Sigma-Bereich in rastermäßiger Ordnung über das Bild laufen, so daß das Pixel P1, das interessierende Pixel, exakt einmal auf jedem Pixel im Bild zentriert ist (geeignete Verzögerungszeilen können erforderlich sein, wenn ein Pipeline-Betrieb erwünscht ist).
Bei nur fünf Pixeln im Sigma-Bereich existieren nur 32 mögliche Kombinationen von Bilddate in einem binären System. Von den 32 Kombinationen sind nur diejenigen Teil eines Objekts, bei denen P1 = list. Ist das Pixel P1 = 0, so ist es Teil des Hintergrunds und nicht zu zählen. Nur 16 der möglichen 32 Kombinationen erfüllen die genannte Bedingung. Diese 16 Kombinationen sind in Figur 7 dargestellt.
Aus dieser Mustergruppe werden nur vier im bevorzugten Algorithmus verwendet. Sie lassen sich weiter in einen "Startzustand" 130 und drei "Verschmelzungszustände" 132 unterteilen, wie in Figur 7 gezeigt. Der Startzustand 130 hat einen binären Wert von 10000, während die drei Verschmelzungszustände 132 die Werte 10101, 11001 und 11101 aufweisen.
Der bevorzugte Algorithmus basiert auf dem Prinzip, das jedes Objekt im abgetasteten Bild eine Anfangsstelle haben muß. Dieserumstand ist am einfachsten anhand des Startzustands 130 zu erkennen, der das erste Pixel eines Objekts repräsentiert, wie es sich im gerasterten Datenformat darstellt. Es ergeben sich jedoch Probleme, da ein einzelnes unterscheidbares Objekt mehrere Pixel aufweisen kann, deren Umgebungen dem Startzustand entsprechen. Ein baumartiges Objekt kann mehrere Äse aufweisen, die jeweils einzelne Pixel haben, welche dem Startzustand entsprechen und möglicherweise zu einem einzigen Objekt "verschmelzen".
Der bevorzugte Algorithmus verwendet die drei einzigartigen Verschmelzungszustände, um ein mehrfaches Zählen eines einzelnen unterscheidbaren Objekts zu verhindern. Die Verschmelzungszustände treten ein, wenn sich scheinbar unterschiedliche Objekte zu einem einzelnen unterscheidbaren Objekt verschmelzen. Diese Verschmelzungszustände sind in Figur 7 dargestellt.
Beim Zähien wird der Datenstrom untersucht, um einen Objektbeginn (Startzustand) zu erkennen, wenn P1 = 1 und P2-P5 sämtlich gleich 0 sind (wodurch der binäre Datenstrom 10000 ist), und es wird ein Objekt der Objektsumme hinzugeftigt. Gleichermaßen wird der Datenstrom auf eine der drei Objektverschmelzungen (Verschmelzungszustand) untersucht. Wird eine Objektverschmelzung erkannt, wird ein Objekt von der Objektsumme subtrahiert. Somit ist die letztliche Objektsumme die Summe aller erkannten Objektbeginne minus der Summe aller Objektverschmelzungen.
Aufgrund der kleinen sigma-förmigen Verarbeitungsumgebung und der Verwendung von Objektverschmelzungen zum Ausgleichen von Mehrfachzählungen ist der bevorzugte Algorithmus von globaler Natur, d.h., es ist keine endgültige Objektsumme verfügbar, bis das gesamte Bild abgetastet und verarbeitet ist.
Es sei darauf hingewiesen, daß der bevorzugte Algorithmus nicht perfekt ist. Komplexe Formen können falsch gezählt werden, wobei die Endsumme dazu neigt, kleiner als die tatsächliche Zahl der im Bild zu findenden unterscheidbaren Objekte zu sein. In Figur 8 sind Beispiele für einige mögliche komplexe Formen zusammen mit einer Analyse der Zählung dieser Formen mit dem bevorzugten Algorithmus dargestellt. Insbesondre zählt der bevorzugte Algorithmus typischerweise keine Objekte mit Löchern, von denen zwei als die Objekte 134 und 136 dargestellt sind.
Trotz dieses Versagens liefern die bevorzugte Vorrichtung und der bevorzugte Algorithmus Koloniezählungen die im Vergleich zur manuellen Zählung weiter innerhalb der zulässigen Fehlergrenze liegen. Darüber hinaus beinhaltet das bevorzugte Anwendungsverfahren das manuelle Untersuchen der Substrate vor dem automatischen Zählen, um die Substrate zu entfernen, in denen die Kolonien zu einer umfassenden Kolonie verschmolzen sind, die durch die vorliegende Erfindung wahrscheinlich falsch gezählt würde.
Dieses versagen ist daher gegeben, daß der Algorithmus bei jeglichem Verschmelzungszustand nicht in der Lage ist, zu unterscheiden, ob die beiden das Loch umgebenden Äste eigenständig sind oder ob sie aus einem weiter oben im Bild befindlichen einzelnen Objekt abgezweigte Äste sind. Dieses Problem kann ohne eine komplizierte und kostspielige umfassende Objektkennzeichnung gelöst werden, welche zahlreiche er Vorteile des bevorzugten Algorithmus und der bevorzugten Vorrichtung zunichte machen würde. Trotz dieses Nachteils zählt der erfindungsgemäße Algorithmus die großer Mehrheit von Objekten mit ausreichender Genauigkeit, um für viele Bildverarbeitungsaufgaben sehr nützlich zu sein.
Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß zwar zahlreiche Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung in der vorhergehenden Beschreibung zusammen mit Einzelheiten des Aufbaus und der Funktion der Erfindung dargelegt wurden, die Offenbarung jedoch nur illustrativen Charakter hat und Veränderungen in Details, insbesondere bezüglich der Form, der Größe und der Anordnung von Teilen, innerhalb der Prinzipien der Erfindung in deren vollen Umfang gemäß der umfassenden Bedeutung der beigefügten Patentansprüche vorgenommen werden können.

Claims

1. Mikrobenkoloniezählvorrichtung mit:

a) einer Erkennungsvorrichtung (24) in Form einer Sensoranordnung lichtempfindlicher Detektoren zum Erkennen von Kolonien, die auf Einweg-Kulturvorrichtungen (40) wachsen, und mit einem im wesentlichen planaren Substrat (42), wobei das planare Substrat (42) die Sensoranordnungserkennungseinrichtung (24) in mehreren geraden Linien schneidet;

b) einer Fortschalteinrichtung (12) zum schrittweisen Verändern der Position des planaren Substrats (42) in bezug zur Sensoranordnung (24), um mehrere benachbarte Index-Positionen des planaren Substrats (42) zu erhalten, wobei die Veränderung der Position senkrecht zu geraden Schnittlinien der Sensoranordnung (24) und des planaren Substrats (42) erfolgt; und

c) einer Koloniezähleinrichtung (50) zum Erhalten von Daten, die von der Sensoranordnung (24) an jeder Index-Position des planaren Substrats (42) erzeugt werden, und Bestimmen der Zahl der Kolonien (44) auf dem planaren Substrat (42), wobei die von jeder Index-Position des planaren Substrats (42) erhaltenen Daten mit den Daten einer benachbarten Index-Position verglichen werden, dadurch gekennzeichnet, daß

die Erkennungseinrichtung eine CCD-Sensoranordnung (24) ist, die zwischen verschiedenen Lichtstärken unterscheidet,

und wobei die Vorrichtung ferner aufweist:

d) eine lineare LED-Anordnung (20), die derart angeordnet ist, daß sie Licht erzeugt, das auf eine Oberseite des planaren Substrats (42) auftrifft, und die in der Lage ist, Licht mit gleichmäßiger Stärke über die geraden Schnittlinien der linearen Anordnung (20) und des planaren Substrats (42) zu liefern; und

e) eine lineare Anordnung von SELFOC-Linsen (22) zum Fokussieren von Licht, das von der Oberseite des planaren Substrats (42) reflektiert wird, auf die Sensoranordnung (24).

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, bei der die Fortschalteinrichtung einen Inkremental-Schnifmotor (12) aufweist, der betriebsmäßig mit wenigstens einer Rolle (14a, 14b) zum Verändern der Position des planaren Substrats (42) verbunden ist.

3. Verfahren zum Zählen von Mikrobenkolonien, die auf einer Einweg-Kulturvorrichtung (40) mit einem planaren Substrat (42) wachsen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist;

a) inkrementales Abtasten benachbarter Geraden entlang dem planaren Substrat (42) zum Erzeugen erster Zeilenpixeldaten und zweiter Zeilenpixeldaten entsprechend erkannten Kolonien;

b) Speichern der ersten Zeilenpixeldaten und der zweiten Zeilenpixeldaten;

c) Vergleichen von Teilen der gespeicherten ersten Zeilenpixeldaten und der zweiten Zeilenpixeldaten zum Erkennen von Kolonien, und

d) Verändern der Position des planaren Substrats (42), um inkrementale Zeilen des planaren Substrats (42) abzutasten, dadurch gekennzeichnet, daß

der Schritt c) des Vergleichens von Teilen der gespeicherten ersten Zeilenpixeldaten und der zweiten Zeilenpixeldaten zum Aufzeichnen von Objektbeginnen und Objektverschmelzungen geeignet ist; wobei der Teil der zweiten Zeilenpixeldaten aus P1, einem gegenwärtigen Pixel, und P2 einem vorhergehenden benachbarten Pixel der zweiten Zeilenpixeldaten besteht, und der Teil der ersten Zeilenpixeldaten -aus P4, einem Pixel der ersten Zeilenpixeldaten an der gleichen Position wie P1, P3, einem vor P4 aufgezeichneten benachbarten Pixel, und P5, einem nach P4 aufgezeichneten benachbarten Pixel besteht;

und wobei das Verfahren ferner die folgenden Schriffe aufweist:

e) Aufzeichnen eines Objektbeginns, wenn der Pixelwert von P1 1 und die Pixelwerte von P2, P3, P4, P5 0 sind; oder

f) Aufzeichnen einer Objektverschmelzung, wenn

i) die Pixelwerte von P1, P3 und P5 1 sind und die Pixelwerte von P2 und P4 0 sind; oder

ii) die Pixelwerte von P1, P2 und P5 1 und die Pixelwerte von P3 und P4 0 sind; oder

iii) die Pixelwerte von P1, P2, P3 und P5 1 sind und der Pixeiwert von P4 0 ist;

wobei die Zahl der auf einer der Einweg-Kulturvorrichtungen (40) wachsenden Kolonien (44) die Gesamtzahl aus aufgezeichneten Objektbeginnen minus den aufgezeichneten Objektverschmelzungen ist.

4. Mikrobenkoloniezählvorrichtung mit

a) einer linearen Anordnung lichtempfindlicher Sensoren (24), die ein planares Substrat (42), das auf Binweg-Kulturvorrichtungen (40) angeordnet ist und auf dem Mikrobenkolonien (44) wachsen, aufweist, wobei die Detektoren (24) das planare Substrat (42) in einer geraden Linie schneiden und Pixelwerte in der linearen Anordnung messen, wobei Pixelwerte auf der weißen Seite eines vorbestimmten Schwellenwerts als Wert 0 und Pixeiwerte auf der schwarzen Seite des Schwellenwerts als Wert 1 gespeichert werden,

b) einer Verarbeitungseinrichtung zum Aufzeichnen und Manipulieren der von den Detektoren gemessenen Pixelwerte,

c) einer Fortschalteinrichtung (12) zum schrittweisen Verändern der Position des planaren Substrats (42) in bezug zu den Detektoren (24), um mehrere benachbarte Index-Positionen des planaren Substrats zu erhalten, wobei die Veränderung der Position senkrecht zur geraden Schnittlinie der Geraden der linearen Anordnung und des planaren Substrats erfolgt; und

d) einer Koloniezähleinrichtung (50) zum Bestimmen der Zahl der Kolonien (44) auf dem planaren Substrat (42), wobei die für jede Index-Position des planaren Substrats (42) gespeicherten Pixelwerte mit den Pixelwerten einer benachbarten zweiten Index- Position verglichen werden, dadurch gekennzeichnet, daß

die Koloniezählvorrichtung (50) zum Bestimmen der Zahl der Kolonien (44) auf dem planaren Substrat (42) in der Lage ist, drei Pixelwerte, die an einer ersten Index-Position des planaren Substrats gespeichert wurden, mit zwei Pixeiwerten einer benachbarten zweiten Position zu vergleichen, wobei die Pixel der zweiten Index-Position aus P1, einem gegenwartigen Pixel auf der zweiten linearen Anordnung, und P2 einem vorhergehenden benachbarten Pixel der zweiten linearen Anordnung besteht, und die Pixel der ersten Index-Position aus P4, einem Pixel an der gleichen Position wie das an der ersten Index-Position befindliche Pixel P1, P3, einem vor P4 aufgezeichneten benachbarten Pixel, und P5, einem nach P4 aufgezeichneten benachbarten Pixel besteht, wobei ein Objektbeginn aufgezeichnet wird, wenn der Pixelwert von P1 1 und die Pixelwerte von P2, P3, P4, P5 0 sind; oder eine Objektverschmelzung aufgezeichnet wird, wenn

ii) die Pixeiwerte von P1, P2 und P5 1 und die Pixelwerte von P3 und P4 0 sind; oder

iii) die Pixeiwerte von P1, P2, P3 und P5 1 sind und der Pixeiwert von P4 0 ist; wobei die Zahl der auf einer der Binweg-Kulturvorrichtungen (40) wachsenden Kolonien (44) die Gesamtzahl aus aufgezeichneten Objektbeginnen minus den aufgezeichneten Objektverschmelzungen ist.