DE69232760T2

DE69232760T2 - Synthetische pulmonäre oberflächenaktive peptide

Info

Publication number: DE69232760T2
Application number: DE69232760T
Authority: DE
Inventors: G. Cochrane; D. Revak
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1991-06-14
Filing date: 1992-06-01
Publication date: 2003-02-06
Anticipated expiration: 2012-06-02
Also published as: WO1992022315A1; US5407914A; EP0590006A1; DK0590006T3; US5789381A; ATE223436T1; JP3459248B2; US5260273A; CA2111342A1; IE921897A1; ES2182821T3; AU666857B2; DE69232760D1; IE20040101A1; JPH06508619A; EP0590006B1; AU2177792A; EP0590006A4

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Polypeptide, die eine Sequenz umfassen, welche alternierende, hydrophobe und hydrophile Regionen von Aminosäureresten hat. Gemäß einer anderen Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf Polypeptide, die eine Sequenz umfassen, die alternierende, hydrophobe und positiv geladene Regionen von Aminosäureresten hat. Ferner bezieht sich die Erfindung auf Polypeptide, die für die Herstellung von synthetischen, pulmonalen, oberflächenwirksamen Mittel nützlich sind. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül, welches ein Strukturgen trägt, das für eine Polypeptidsequenz mit alternierenden, hydrophoben und hydrophilen (oder positiv geladenen) Regionen von Aminosäureresten codiert. Die vorliegende Erfindung offenbart auch die Verwendung von solchen rekombinanten Molekülen für die Herstellung von Polypeptiden mit alternierenden, hydrophoben und hydrophilen (oder positiv geladenen) Regionen von Aminosäureresten.
Pulmonale, oberflächenwirksame Mittel (PS) kleiden das Alveolarepithel von ausgewachsenen Säugetierlungen aus. Ein natürliches PS wurde als ein "Lipoproteinkomplex" beschrieben, da es Phospholipide und Apoproteine enthält, die aufeinander wirken zur Reduktion der Oberflächenspannung an der Grenzfläche zwischen Lungenluft-Flüssigkeit.
Seit der Entdeckung des pulmonalen, oberflächenwirksamen Mittels und der nachfolgenden Erkenntnis, dass sein Fehlen die primäre Ursache für das neonatale Atemnotsyndrom (RDS) ist, wurden eine Vielzahl von Studien durchgeführt hinsichtlich der Entwicklung einer effektiven Ersatztherapie für das oberflächenwirksame Mittel bei betroffenen Individuen, insbesondere bei Säuglingen, wobei exogenes PS verwendet wurde. Es konnte beispielsweise gezeigt werden, dass die Verwendung von exogenen Mittel bei menschlichen Frühgeborenen zu einer Verbesserung der Lungenfunktion, die durch einen Abfall bei dem mittleren Atemdruck gemessen wurde, und der Sauerstofferfordernisse führt (siehe Hallman, et al. Pediatrics, 71: 473-482 (1983); Merritt, et al. J. Pediatr., 108: 741-745 (1986); Hallman, et al. J. Pediatr., 106: 963-969 (1985); Morley, et al. Lancet, i: 64-68 (1981); Merritt, et al. New England J. Med., 315: 785-790 (1986), Smyth, et al. Pediatrics, 71: 913-917 (1983); Enhorning, et al. Pediatrics, 76: 145-153 (1985); Fujiwara, et al. The Lancet, 1: 55-59 (1980); Kwong, et al. Pediatrics, 76: 585-592 (1985); Shapiro, et al, Pediatrics 76: 593-599 (1985); Fujiwara, in "Pulmonary Surfactant", Robertson, B., Van Golde, L. M. G., Batenburg J. (Hrsg.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, S. 479-503, (1984)).
Aus einem pharmakologischen Gesichtspunkt heraus bestünde das optimale exogene PS, welches bei der Behandlung von RDS zu verwenden wäre, aus einem vollständig im Labor unter kontrollierten und sterilen Bedingungen synthetisierten PS mit vernachlässigbaren Veränderungen in den Eigenschaften bei seiner Herstellung. Um die Möglichkeit von immunologischen Komplikationen zu minimieren, sollte die Apoprotein-Komponente eines exogenen PS identisch zu der im Menschen gefundenen Komponente sein. Unglücklicherweise ist jedoch die Zusammensetzung des natürlich auftretenden PS komplex und in der Wissenschaft wurden bis jetzt noch nicht alle biochemischen Komponenten identifiziert, welche die biophysikalischen Eigenschaften erzeugen, die für eine hohe physiologische Aktivität in der Lunge notwendig sind. Insbesondere hat die Wissenschaft bisher noch nicht alle Apoproteine, die in dem natürlichen PS vorkommen, charakterisiert oder die Funktion der bisher bekannten PS-Apoproteine identifiziert.
Es sei angemerkt, dass die Literatur hinsichtlich der PS-Apoproteine und ihren Funktionen bei der Oberflächenwirkung komplex, nicht konsistent und manchmal etwas widersprüchlich ist, da bei vielen Studien heterogene Apoprotein-Zubereitungen verwendet werden. Der Wissenschaft ist es bisher noch nicht gelungen, die Zahl der verschiedenen Apoproteine, die in natürlichem PS vorkommen, definitiv zu bestimmen.
Von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung ist die Verwendung eines Polypeptides als eine Komponente in einem exogenen, oberflächenwirksamen Mittel, wobei das Polypeptid verschiedene Eigenschaften besitzt, die analog zu einem niedrigmolekularen (LMW), menschlichen, PS-assoziierten Apoprotein sind. Verschiedene Untersuchungen haben versucht, menschliche PS LMW Apoproteine unter Verwendung von biochemischen Techniken zu isolieren oder zu definieren (siehe zum Beispiel Phizackerley, et al. Biochem. J., 183: 731-736 (1979), Revak, et al. Am. Rev. Resp. Dis., 134: 1258-1265 (1986), Suzuki, et al. Eur. J. Respir. Dis., 69: 335-345 (1986), Taeusch, et al. Pediatrics, 77: 572-581 (1986), Yu, et al. Biochem. J., 236: 85-89 (1986), Whitsett, et al. Pediatric Res., 20: 460-467 (1986), Whitsett, et al. Pediatric Res., 20: 744-749 (1986), Takahashi, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm., 135: 527-532 (1986), Suzuki, et al. Exp. Lung. Res., 11: 61-73 (1986), Curstedt, et al. Eur. J. Biochem., 168: 255-262 (1987), Notter, et al. Chem. Phys. Lipids, 44: 1-17 (1987), und Phelps, et al. Am. Rev. Respir. Dis., 135: 1112-1117 (1987)).
Vor kurzem hat die Wissenschaft begonnen, die Methoden der rekombinanten DNA- Technologie anzuwenden, um die Probleme zu überwinden, die mit der Isolierung von homogenen, individuellen LMW PS Apoproteinen zusammenhängen. Beispielsweise haben Glasser, et al. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 84: 4007-4011 (1987) berichtet, dass eine von cDNA abstammende Sequenz von Aminosäureresten gebildet wurde, die wenigsten ein Teil eines menschlichen Vorläuferproteins darstellt, welches zu wenigstens einem reifen LMW Apoprotein führt. Diese Sequenz wurde als SPL (Phe) bezeichnet. Obwohl Glasser, et al. nicht in der Lage waren, den Carboxy-Terminus von SPL (Phe) zu bestimmen und somit auch nicht die komplette Sequenz bestimmen konnten, haben sie andererseits vorhergesagt, dass das reife SPL (Phe) etwa 60 Aminosäure umfasst.
Jacobs, et al. J. Biol. Chem., 262: 9808-9811 (1987) haben eine cDNA und eine davon abstammende Aminosäuresequenz für ein menschliches Vorläuferprotein beschrieben, welches ähnlich zu dem ist, das beschrieben wurde von Glasser, et al., siehe oben. Gemäß Jacobs et al. hat jedoch das von dem Vorläufer gebildete, reife LMW Apoprotein, welches sie als PSP-B bezeichneten, eine Länge von 76 Aminosäureresten. Jacobs et al. stellten ferner fest, dass es nicht klar ist, dass jedes PS Apoprotein, welches von dem berichteten Vorläuferprotein abstammt, in den Zubereitungen der oberflächenwirksamen Mittel vorhanden ist, die klinisch von anderen Wissenschaftlern untersucht wurden. Das von dem Vorläuferprotein abstammende, von Glasser et al., siehe oben, und Jacobs et al., siehe oben, beschriebene reife Apoprotein wird allgemein als "SP18" bezeichnet, wobei die monomeren und dimeren Formen als "SP18 Monomer" und "SP18 Dimer" bezeichnet werden.
Aus der vorhergehenden Darstellung ist erkennbar, dass für das wahrscheinlich gleiche PS Apoprotein verschiedene Bezeichnungen in der Literatur existieren. Ferner haben Warr, et al., in Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 84: 7915-7919 (1987) eine von einer cDNA abstammende Sequenz aus 197 Aminosäureresten beschrieben, die ein Vorläuferprotein bilden, aus dem ein reifes LMW Apoprotein, welches sie als SP5 bezeichnet haben, gebildet wird, was wahrscheinlich anzeigt, dass PS mehr als ein LMW Apoprotein enthält.
Cochrane und Revak, siehe die offengelegte PCT-Patentanmeldung mit der Nummer WO 89/06657, waren in der Lage, die reife, biologisch aktive Form von SP18 zu definieren und verschiedene von SP18-abstammende Polypeptide und Analoga zu offenbaren, die eine therapeutisch nützliche, oberflächenwirksame Aktivität zeigen.
Die US-4,861,756 beschreibt einen Polypeptid-Phospholipid-Komplex, der aus alternierenden hydrophoben/hydrophilen Regionen besteht, der für die Behandlung von RDS verwendet werden könnte. Die EP-A-0 348 967 offenbart die Synthese von synthetischen, pulmonalen, oberflächenwirksamen Mittel, die aus einem Polypeptid mit Alphahelixstruktur, das mit einem Lipid verbunden ist, sich zusammensetzen. Ein Verfahren für den Ersatz von Aminosäureresten mit Leucin oder Lysin wurde beschrieben von Ono et al. in FEBS Letters 220: 332-336 (1987).
Die biologische Aktivität der obigen Proteine passt jedoch nicht zu den hier offenbarten Polypeptiden, die für therapeutische Anwendungen nützlich sind, insbesondere bei der Bildung von synthetischen, pulmonalen, oberflächenwirksamen Zusammensetzungen.
Ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung hat eine Aminosäuresequenz, die durch die folgende Formeln dargestellt ist:
Gemäß einer anderen Ausführungsform beinhaltet die vorliegende Erfindung ein synthetisches, pulmonales, oberflächenwirksames Mittel, welches zwei pharmazeutisch akzeptable Phospholipide in Beimischung mit einer Fettsäure und einem Polypeptid umfasst, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz hat, die durch die folgende Formeln dargestellt ist:
Die vorliegende Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Behandlung des Atemnotsyndroms unter Verwendung der offenbarten, synthetischen, pulmonalen, oberflächenwirksamen Mittel.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen Medikamentes, welches für die Behandlung des Atemnotsyndroms nützlich ist, wobei das Verfahren das Mischen von einem oder mehreren, pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Polypeptides umfasst, wobei das Polypeptid eine Sequenz mit alternierenden, hydrophoben und hydrophilen Regionen aus Aminosäureresten beinhaltet und eine Aminosäuresequenz hat, die aus einer Gruppe von Polypeptiden ausgewählt ist, die
umfasst.
Gemäß einer anderen Ausführungsform bildet ein Polypeptid gemäß den obigen Formeln, wenn es mit einem oder mehreren, pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden gemischt wird, ein synthetisches, pulmonales, oberflächenwirksames Mittel mit einer Oberflächenwirksamkeit, die größer ist als die Oberflächenwirksamkeit des Phospholipids allein.
Verschiedene Verfahren für die Behandlung des Atemnotsyndroms, welche die Beimischung einer therapeutisch wirksamen Menge eines synthetischen, pulmonalen, oberflächenwirksamen Mittels gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, werden auch in Betracht gezogen. Bei alternativen Ausführungsformen wird ein oberflächenwirksames Mittel, welches ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, das mit einem oder mehreren, pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden gemischt ist, beigemischt. Ein synthetisches, oberflächenwirksames Mittel, welches ein oder mehrere Polypeptide bemaß der hier offenbarten Formel enthält, kann auch therapeutisch wirksam sein und kann vor der Verabreichung mit einem oder mehreren, pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden gemischt werden.
Fig. 1 zeigt den Effekt der Verabreichung eines RL4 enthaltenden, oberflächenwirksamen Mittels auf die Lungenfunktion bei verfrüht neugeborenen Affen. In der Fig. 1A ist der Oxygenierungsindex (a/A) gegen die Zeit in Stunden nach der Geburt des Tieres aufgetragen. Das oberflächenwirksame Mittel wurde in Teildosis etwa 28 Stunden nach der Geburt, wie dies durch den Pfeil dargestellt ist, verabreicht. In der Fig. 1B wurde das oberflächenwirksame Mittel in Teildosis während der ersten 2,5 Stunden nach der Geburt verabreicht. Die zwei unterbrochenen Linien unterteilen das Diagramm in drei Quadrante, die anzeigen, dass die Diagnose eines schweren Atemnotsyndroms (RDS) auf a/A-Werte von 0,0 bis 0,2 anzuwenden ist; eines RDS auf einen a/A-Bereich von 0,2-0,4 anzuwenden ist und das ein a/A von 0,4 oder besser als "normal" anzusehen ist.
Die Fig. 2 zeigt den Effekt einer Verabreichung eines KL4 enthaltenden, synthetischen oberflächenwirksamen Mittels auf die Lungenfunktion. In den Fig. 2A und 2B sind die Daten von acht Affen gezeigt, wobei später bestätigt wurde, dass die Affen, die das KL4 enthaltende, synthetische, oberflächenwirksame Mittel erhalten haben, den Affen mit den Nummern 6,7,8 und 10 entsprachen (die Fig. 2A-3 und 4, 2B-1 und 3). Diejenigen Affen, die ein anderes oberflächenwirksames Mittel erhielten (das heißt, die kein oberflächenwirksames Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung enthielten) waren die Affen mit den Nummern 5,9 und 11 (die Fig. 2A-1 und 2, 2B-2 und 4). Bei allen Darstellungen ist a/A gegen die Stunden nach der Geburt aufgetragen, wobei der Zeitpunkt der Verabreichung des oberflächenwirksamen Mittels angezeigt ist.
Die Fig. 3 zeigt die graduelle Sauerstoffabnahme über die Zeit (in Stunden) von einem geborenen Primaten, bei dem RDS diagnostiziert wurde, nach Verabreichung eines KL4 enthaltenden, oberflächenwirksamen Mittels. FiO&sub2; ist gegen die Zeit in Stunden aufgetragen. Der Zeitpunkt, an dem das KL4 enthaltende, oberflächenwirksame Mittel verabreicht wurde, ist durch den Pfeil angezeigt. Zum Zeitpunkt Null und 100% eingeatmeten Sauerstoff (FiO&sub2; = 1,0) empfing das Tier 100% Sauerstoff, wobei es nach 22-25 Stunden 20% Sauerstoff empfing, was der Raumluft entspricht.
Die Fig. 4 zeigt die Ergebnisse eines in vivo dynamischen Compliancetests unter Verwendung der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel RL4-CYS, (RL4)&sub4;R, (RL4)&sub5;R, (RL4)&sub6;R, (RL4)&sub7;R und (RL4)&sub8;R. Wie angezeigt ist n = 3 oder 4. Die Figur zeigt die Wirkung der Verabreichung von verschiedenen Formulierungen des RL4 enthaltenden, oberflächenwirksamen Mittels auf die Lungenfunktion und zeigt die Ergebnisse einer Untersuchung an, um die optimale Länge eines RL4 enthaltenden Peptides zu bestimmen. Der durchschnittliche dynamische Compliancewert für die getesteten Tiere unter Verwendung der angegebenen Formulierung (ml Luft/cm H&sub2;O/q · 10&sup6;) ist gegen die Zeit in Minuten nach Verabreichung des oberflächenwirksamen Mittels aufgetragen.

A. Definitionen

Aminosäure: Alle hier identifizierten Aminosäurereste haben die natürliche L- Konfiguration. Unter Beibehaltung der Standard-Polypeptidnomenklatur, J. Biol. Chem., 243: 3557-59, (1969), sind die Abkürzungen für die Aminosäurereste in der folgenden Korrespondenztabelle gezeigt: Korrespondenztabelle
Es sei angemerkt, dass alle Aminosäuresequenzen hier durch Formeln dargestellt sind, deren Links - Rechtsorientierung der konventionellen Richtung vom Amino-Terminus zum Carboxy-Terminus entspricht. Es sei ferner hinzugefügt, dass ein Bindungsstrich am Beginn oder am Ende einer Aminosäuresequenz eine Bindung zu einem Radikal, wie H und OH (Wasserstoff und Hydroxyl) am Amino-Terminus beziehungsweise Carboxy-Terminus anzeigt, oder eine weitere Sequenz mit einem oder mehreren Aminosäureresten. Es sei weiterhin angemerkt, dass ein Schrägstrich (/) am rechten Ende einer Sequenz anzeigt, dass die Sequenz in der nächsten Zeile weitergeführt wird.
Polypeptid und Peptid: Polypeptid und Peptid sind hier Ausdrücke, die austauschbar verwendet werden und die eine lineare Reihe von nicht mehr als etwa 60 Aminosäureresten kennzeichnen, die über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino- und Carboxy-Gruppen von benachbarten Resten miteinander verbunden sind.
Protein: Protein ist ein Ausdruck, der hier verwendet wird, um eine lineare Reihe von mehr als etwa 60 Aminosäureresten zu kennzeichnen, die wie in einem Polypeptid miteinander verbunden sind.
Nucleotid: Eine monomere Einheit von DNA oder RNA, die aus einem Zuckerrest (Pentose), einem Phosphat und einer Stickstoff enthaltenden, heterozyklischen Base besteht. Die Base ist mit dem Zuckerrest über einen glycosidischen Kohlenstoff (1'-Kohlenstoff der Pentose) verbunden und diese Kombination von Base und Zucker stellt ein Nucleosid dar. Wenn das Nucleosid eine Phosphatgruppe enthält, die an der 3'-oder 5'-Position der Pentose gebunden ist, wird es als ein Nucleotid bezeichnet.
Basenpaar (bp): Eine Paarung von Adenin (A) mit Thymin (T) oder von Cytosin (C) mit Guanin (G) in einem doppelsträngigen DNA-Molekül.
Konservative Substitutionen sind solche, wo ein Aminosäurerest durch einen anderen, biologisch ähnlichen Rest ersetzt wird. Beispiele für konservative Substitutionen umfassen die Substitution eines hydrophoben Restes, wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, durch einen anderen hydrophoben Rest oder die Substitution eines polaren Restes durch einen anderen polaren Rest, wie zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutaminsäure und Asparaginsäure oder zwischen Glutamin und Asparagin und ähnliches. Der Ausdruck "konservative Substitution" umfasst auch die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer nicht-substituierten Eltern-Aminosäure, vorausgesetzt, dass solch ein Polypeptid die erforderliche Bindungsaktivität auch anzeigt.

B. Polypeptide

Ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung ist gekennzeichnet durch seine Aminosäuresequenz und durch neue funktionelle Eigenschaften. Ein Polypeptid gemäß der Erfindung bildet in Beimischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Phospholipid ein synthetisches, pulmonales, oberflächenwirksames Mittel mit einer Oberflächenaktivität, die größer ist als die Oberflächenaktivität des Phospholipids alleine.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform hat ein Polypeptid nach der Erfindung eine Aminosäuresequenz, die eine zusammengesetzte Hydrophobie von weniger als Null hat, vorzugsweise weniger oder gleich -1, wobei weiter ein Wert von weniger als oder gleich -2 bevorzugt ist. Die Bestimmung des Wertes der zusammengesetzten Hydrophobie für ein Peptid ist im Detail im Beispiel 1 beschrieben. Diese hydrophoben Polypeptide erfüllen die Funktion der hydrophoben Region von SP18. In einer Ausführungsform ahmt die Aminosäuresequenz das Muster der hydrophoben und hydrophilen Reste von SP18 nach.
Ein bevorzugtes, hydrophobes Polypeptid beinhaltet eine Sequenz mit alternierenden, hydrophoben und hydrophilen Aminosäureregionen und ist gekennzeichnet durch wenigstens 10 Aminosäurereste, welche durch die folgende Formel dargestellt ist:
(ZaUb)cZd
Z und U sind Aminosäurereste, die bei jedem Auftreten von Z und U unabhängig voneinander ausgewählt werden. Z ist ein hydrophober Aminosäurerest, der vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus R, D, E und K besteht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist "Z" aus der Gruppe ausgewählt, die aus R und K besteht.
Die Polypeptide nach der Erfindung sind in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
¹ Die Bezeichnung ist eine Abkürzung für die angezeigte Aminosäuresequenz.
Ein Polypeptid nach der vorliegenden Erfindung kann durch alle Techniken synthetisiert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung von vielen verfügbaren Techniken kann gefunden werden in J. M. Steward und J. D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesiss, W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969, und J. Meienhofer, "Hormonal Proteins und Peptides", Bd. 2, S. 46, Academic Press (New York), 1983 für die Festphasen- Peptidsynthese, und E. Schroder und K. Kubke, "The Peptides" Bd. 1, Academic Press (New York), 1965 für klassische Lösungssynthese.
Ein Polypeptid nach der Erfindung kann auch hergestellt werden unter Verwendung der synthetischen Festphasentechnik, die ursprünglich beschrieben wurde von Merrifield, in J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963). Andere Synthesetechniken für Polypeptide können beispielsweise gefunden werden in M. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2. Ausgabe, (1976) sowie in anderen Referenzarbeiten, die dem Fachmann bekannt sind. Eine Zusammenfassung der Polypeptid-Synthesetechniken kann gefunden werden in J. Stuart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 3. Ausgabe, Neurath, H. et al., Hrsg., S. 104-237, Academic Press, New York, NY (1976). Geeignete Schutzgruppen für die Verwendung bei solchen Synthesen sind in den obigen Literaturstellen angegeben sowie in J. F. W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, NY (1973).
Diese Verfahren umfassen im Allgemeinen die sequentielle Zugabe von einem oder mehreren Aminosäureresten oder in geeigneter Weise geschützten Aminosäureresten zu einer wachsenden Peptidkette. Normalerweise ist entweder die Aminogruppe oder die Carboxylgruppe des ersten Aminosäurerestes durch eine geeignete, selektiv entfernbare Schutzgruppe geschützt. Eine andere, selektiv entfernbare Schutzgruppe wird für Aminosäuren verwendet, die eine reaktive Seitengruppe enthalten, wie Lysin.
Bei der Festphasensynthese als Beispiel wird die geschützte oder derivatisierte Aminosäure an einem inerten Festträger über ihre ungeschützte Carboxylgruppe oder Aminogruppe befestigt. Die Schutzgruppe für die Aminogruppe oder die Carboxylgruppe wird dann selektiv entfernt und die nächste Aminosäure in der Sequenz, wobei die komplimentäre (Amino- oder Carboxyl-) Gruppe in geeigneter Weise geschützt ist, wird beigemischt und reagiert unter Bedingungen, die für die Bildung der Amidverbindung mit dem Rest, der bereits an den festen Träger befestigt ist, geeignet ist. Die Schutzgruppe der Aminogruppe oder der Carboxylgruppe wird dann von dieser neu hinzugefügten Aminosäure entfernt und die nächste Aminosäure (in geeigneter Weise geschützt) wird dann hinzugefügt und so weiter. Nachdem alle gewünschten Aminosäuren in einer geeigneten Sequenz miteinander verbunden wurden, werden die verbleibenden Endschutzgruppen und Seitengruppen-Schutzgruppen (und Festträger) sequentiell oder gleichzeitig entfernt, um das Endpolypeptid zu erzielen.
Aminosäure-Linker liegen normalerweise an wenigstens einem Rest vor und können auch an 40 oder mehr Resten vorhanden sein, öfters an 1 bis 10 Resten. Typische Aminosäuren, die für das Verbinden benutzt werden, sind Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutaminsäure, Asparaginsäure oder ähnliches. Ferner kann eine Polypeptidsequenz nach der Erfindung von der natürlichen Sequenz durch eine Sequenz unterschiedlich sein, die durch terminale NH&sub2;-Acylierung, zum Beispiel Acetylierung, oder Thioglycolsäure-Amidierung, terminale Carboxylamidierung, zum Beispiel Ammoniak, Methylamin etc. modifiziert ist.
Wenn das Polypeptid mit einem Träger über einen Linker verbunden ist, um ein im Stand der Technik bekanntes Träger-Hapten-Konjugat zu bilden, ist das Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage, Antikörper zu induzieren, die mit den synthetischen, oberflächenwirksamen Mitteln immunreagieren. Angesichts des gut etablierten Prinzips der immunologischen Kreuzreaktivität umfasst die vorliegende Erfindung somit auch antigenverwandte Varianten der in der Tabelle 1 gezeigten Polypeptide. Eine "antigenverwandte Variante" ist ein Polypeptid, welches einen Sequenzabschnitt eines Polypeptides nach Tabelle 1 aus wenigstens sechs Aminosäuren umfasst und das in der Lage ist, Antikörpermoleküle zu induzieren, die mit einem Polypeptid nach Tabelle 1 und einem synthetischen, oberflächenwirksamen Mittei, welches solch ein Polypeptid enthält, immunreagieren können.

C. Nukleinsäure-Segmente

In lebenden Organismen ist die Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines Polypeptids direkt über den genetischen Code mit der Deoxyribonukleinsäure (DNA)-Sequenz des Strukturgens, welches für das Protein codiert, verbunden. Somit kann solch ein Strukturgen auch anhand der Aminosäuresequenz, das heißt Protein oder Polypeptid, definiert werden, für welches es codiert. Ein wichtiges und gut bekanntes Merkmal des genetischen Codes ist seine Redunanz. Dies bedeutet, das für die meisten Aminosäuren, die für die Herstellung von Protein verwendet werden, mehr als ein codierendes Nukleotidtriplet (Codon) für eine besondere Aminosäure codieren oder bestimmen kann. Deshalb können eine Reihe von unterschiedlichen Nukleotidsequenzen für eine bestimmte Aminosäuresequenz codieren. Solche Nukleotidsequenzen werden funktionell als äquivalent betrachtet, da sie zu der Herstellung der gleichen Aminosäuresequenz in allen Organismen führen können. Manchmal kann eine methylierte Variante eines Purins oder eines Pyrimidins in eine vorgegebene Nukliotidsequenz eingebaut werden. Solche Methylierungen beeinflussen jedoch nicht die codierende Beziehung.
Ein DNA-Segment gemäß der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es im Wesentlichen aus einer DNA-Sequenz besteht, die für ein Polypeptid gemäß den offenbarten Formeln codiert. Dies bedeutet, dass ein DNA-Segment nach der vorliegenden Erfindung ein Strukturgen bildet, welches in der Lage ist, ein Polypeptid mit alternierenden, hydrophoben und hydrophilen Aminosäureregionen zu exprimieren. Während die Codons des DNA-Segmentes nicht co-linear mit der Aminosäuresequenz eines hier offenbarten Polypeptides wegen der Gegenwart eines Introns sein muss, ist es andererseits bevorzugt, dass das Strukturgen in der Lage ist, diese Polypeptide in reifer Form zu exprimieren, das heißt, ohne die Notwendigkeit einer post-translationalen proteolytischen Verarbeitung. Das Gen liegt vorzugsweise in einer nicht-unterbrochenen, linearen Reihe von Codons vor, wobei jedes Codon für eine Aminosäure in einem Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, das heißt, ein Gen, welches keine Introns enthält.

D. Rekombinante Nukleinsäuremoleküle

Ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch unter Verwendung von rekombinanten Nukleinsäure-Technologien, die im Stand der Technik gut bekannt sind, hergestellt werden. DNA-Sequenzen, die beispielsweise für die Herstellung eines Polypeptides nach der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind beschrieben in Paik et al., PNAS USA 82: 3445-3449, (1985); MCLean et al., J. Biol. Chem. 259: 6498-6504, (1984) und Rall et al., J. Biol. Chem. 257: 4171-4178, (1982). Ein DNA-Segment, welches für ein Polypeptid nach der Erfindung codiert, kann durch chemische Techniken synthetisiert werden, zum Beispiel durch das Phospotriester-Verfahren nach Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103: 3185, (1981). Das DNA-Segment kann dann in einen Expressionsvektor eingesetzt werden und ein damit transformierter Wirt kann benutzt werden, um das Polypeptid herzustellen (siehe zum Beispiel Current Protocols In Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons, New York, NY, und die U.S. Patente Nr. 4,237,224 und Nr. 4,356,270). Diese Veröffentlichungen sind hiermit durch Referenz eingeführt. Bei der chemischen Synthese der codierenden Sequenz können selbstverständlich alle gewünschte Modifikationen hergestellt werden, indem einfach die geeigneten Basen durch solche ersetzt werden, die für die native Aminosäuresequenz codieren.
Die rekombinanten Expressionsvektoren, die zur Expression eines Polypeptides nach der Erfindung in der Lage sind, sowie die Verfahren für deren Verwendung zur Herstellung eines Polypeptides nach der Erfindung, werden als Teil der vorliegenden Erfindung angesehen.
Von der vorliegenden Erfindung sind auch Ribonukleinsäure (RNA)-Äquivalente der oben beschriebenen DNA-Segmente umfasst.
Nukleinsäuremoleküle können auch mittels Amplifikationsverfahren synthetisiert werden, was auch als Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") -Technologie bekannt ist. Die PCR- Amplifikationsverfahren sind im Detail in den U.S. Patenten mit den Nummern 4,683,192; 4,683,202; 4,800,159 und in 4,965,188 beschrieben und wenigstens in verschiedenen Texten, einschließlich "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", H. Erlich, Hrsg., Stockton Press, New York (1989) und "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Innis et al., Hrsg., Academic Press, San Diego, California (1990), wobei diese Offenbarungen hiermit durch Referenz eingeführt sind. Andere Verfahren und Primer sind beschrieben in Nilsson, et al., Cell 58: 707 (1989), Ennis, et al., PNAS USA 87: 2833-7 (1990) und Zemmour, et al., Immunogenetics 33: 310-20 (1991). Restriktionsorte können auch in die 5'- und 3'-Primer eingeführt werden, um die Amplifikationsprodukte in Sequenzierungsvektoren oder Expressionsvektoren zu subklonieren. Es kann auch hilfreich sein, eine 4- Basen-Spacer-Sequenz proximal zu der Restriktionsstelle anzuordnen, um die Effizienz des Schneidens der Amplifikationsprodukte mit Enzymen zu verbessern.
Die rekombinanten Nukleinsäuremoleküle nach der vorliegenden Erfindung können durch operative Verbindung eines Vektors mit einem Nukleinsäuresegment nach der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
Der Ausdruck "operativ verbunden" bedeutet hier, dass das Nukleinsäuresegment mit dem Vektor verbunden ist, so dass die Expression des durch das Segment gebildete Strukturgen unter der Kontrolle des Vektors ist.
Der Ausdruck "Vektor" bezieht sich hier auf ein Nukleinsäuremolekül, welches zur Replikation in einer Zelle in der Lage ist und mit dem ein anderes Nukleinsäuresegment operativ verbunden werden kann, so dass die Replikation des angehefteten Segmentes bewirkt werden kann. Vektoren, die eine Expression eines Strukturgens, welches für ein Polypeptid nach der vorliegenden Erfindung codiert, bewirken können, werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül (rDNA oder rRNA) ist somit ein Hybridmolekül, welches wenigstens zwei Nukleotidsequenzen umfasst, die normalerweise in der Natur nicht zusammen gefunden werden.
Die Wahl des Vektors, an den ein Nukleinsäuresegment nach der vorliegenden Erfindung operativ gebunden wird, hängt direkt, wie es im Stand der Technik gut bekannt ist, von den gewünschten funktionellen Eigenschaften ab, das heißt, von der Proteinexpression, sowie von der zu transformierenden Wirtszelle, wobei diese Beschränkungen spezifisch für die Konstruktion von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen sind. Ein Vektor, der bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist zumindest in der Lage, die Replikation und vorzugsweise auch die Expression eines Strukturgens zu steuern, welches für ein Polypeptid nach der vorliegenden Erfindung codiert, das in einem Nukleinsäuresegment vorliegt, mit dem es operativ verbunden ist.
Ein Vektor umfasst ein prokaryotisches Replikon, das heißt, eine DNA-Sequenz mit der Fähigkeit der Steuerung der autonomen Replikation und der extrachromosomalen Aufrechterhaltung eines rDNA-Moleküls in einer prokaryotischen Wirtszelle, wie eine bakterielle Wirtszelle, die damit transformiert ist. Solche Replikons sind im Stand der Technik gut bekannt. Ferner umfassen solche Ausführungen, die ein prokaryotisches Replikon beinhalten, auch ein Gen, dessen Expression mit einer Antibiotikaresistenz eines bakteriellen Wirtes, der damit transformiert ist, verbunden ist. Typische bakterielle Antibiotikaresistenzgene sind solche, die eine Resistenz gegen Ampicillin oder Tetracyclin verleihen.
Die Vektoren, die ein prokaryotisches Replikon beinhalten, können auch einen prokaryotischen Promoter umfassen, der zur Steuerung der Expression (Transcription und Translation) eines Gens in einer bakteriellen Wirtszelle, wie E. coli, die damit transformiert ist, in der Lage ist. Ein Promoter ist ein Expressionskontrollelement, welches von einer DNA- Sequenz gebildet ist, welche die Bindung einer RNA-Polymerase und die Transcription erlaubt. Promotersequenzen, die mit bakteriellen Wirten kompatibel sind, werden in typischer Weise von Plasmidvektoren bereitgestellt, die geeignete Restriktionsorte für den Einbau eines DNA-Segmentes enthalten. Typische Vektorplasmide sind pUC8, pUC9, pBR322 und pBR329, die verfügbar sind von Biorad Laboratories (Richmond, CA), und pPL und pKK223, die verfügbar sind von Pharmacia, Piscataway, N. J..
Expressionsvektoren, die mit eukaryotischen Zellen kompatibel sind, vorzugsweise solche, die mit Wirbeltierzellen kompatibel sind, können auch verwendet werden, um ein rDNA-Molekül zu bilden. Eukaryotische Zellexpressionsvektoren sind im Stand der Technik gut bekannt und sind von verschiedenen kommerziellen Quellen verfügbar. Solche Vektoren enthalten geeignete Restriktionsorte für den Einbau des gewünschten DNA-Segmentes. Typische Vektoren sind pSVL und pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d (International Biotechnologies, Inc.) und pTDT1 (ATCC, #31255).
In Ausführungsformen umfasst ein eukaryotischer Zellexpressionsvektor, der zur Herstellung eines rDNA-Moleküls nach der vorliegenden Erfindung verwendet wird, einen Selektionsmarker, der in einer eukaryotischen Zelle wirksam ist, vorzugsweise ein Antibiotikaresistenz-Selektionsmarker. Ein bevorzugter Resistenz-Marker ist das Gen, dessen Expression zu einer Neomycinresistenz führt, das heißt, die Neomycinphosphotransferase (neo)-Gen (Southern, et al. J. Mol. Appl. Genet., 1: 327-341 (1982)).
Die Verwendung von retroviralen Expressionsvektoren für die Bildung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls nach der vorliegenden Erfindung ist auch vorgesehen. Der Ausdruck "retroviraler Expressionsvektor" bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, das eine Promotersequenz umfasst, die von der langen terminalen Wiederholungs (LTR) -Region eines Retrovirusgenoms abstammt.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Expressionsvektor ein retroviraler Expressionsvektor, der in eukaryotischen Zellen nicht replizieren kann. Die Herstellung und die Verwendung von retroviralen Vektoren wurde beschrieben von Sorge, et al. Mol. Cell. Biol., 4: 1730-37 (1984).
Eine Reihe von Verfahren wurden entwickelt, um Nukleinsäuresegmente über komplementäre kohäsive Enden mit den Vektoren operativ zu verbinden. Beispielsweise können komplementäre Homopolymerstränge den zu inserierenden Nukleinsäuresegmenten und einem terminalen Abschnitt der Vektornukleinsäure hinzugefügt werden. Der Vektor und das Nukleinsäuresegment werden dann über Wasserstoffbindung zwischen den komplementären homopolymeren Schwänzen verbunden, um ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül zu bilden.
Synthetische Linker, die einen oder mehrere Restriktionsorte einhalten, stellen ein alternatives Verfahren für die Verbindung eines Nukleinsäuresegmentes mit Vektoren dar. Ein DNA-Segment nach der vorliegenden Erfindung wird mit der Bakteriophagen T4 DNA- Polymerase oder mit der E. coli DNA-Polymerase I behandelt, wobei diese Enzyme vorstehende, 3'-einzelsträngige Enden mit ihren 3'-5'exonukleolytischen Aktivitäten entfernen und ausgesparte 3' Enden mit ihren Polymeraseaktivitäten auffüllen. Die Kombination von diesen Aktivitäten erzeugen somit DNA-Segmente mit einem glatten Ende. Die Segmente mit einem glatten Ende werden dann mit einem großen molaren Überschuss von Linker- Molekülen in Gegenwart eines Enzyms inkubiert, welches in der Lage ist, die Ligation der DNA-Moleküle mit einem glatten Ende zu katalysieren, wie die Bakteriophagen T4 DNA- Ligase. Die Produkte dieser Reaktion sind somit DNA-Segmente, die an ihren Enden die polymeren Linkersequenzen tragen. Diese DNA-Segmente werden dann mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten und in einen Expressionsvektor eingebracht, der mit einem Enzym geschnitten wurde, welches Enden produziert, die mit denen des DNA- Segmentes kompatibel sind.
Synthetische Linker, die eine Vielzahl an Restriktionsendonukleasen-Orten enthalten, sind kommerziell verfügbar von einer Reihe von Unternehmen, einschließlich International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT..
Von der vorliegenden Erfindung sind auch die RNA-Äquivalente der oben beschriebenen, rekombinanten DNA-Moleküle umfasst.

E. Transformierte Zellen und Kulturen

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül nach der Erfindung transformiert ist, vorzugsweise eine rDNA, die zur Expression eines Polypeptides gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage ist. Die Wirtszelle kann entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein.
Die begriffe "Zellen" oder "transformierte Wirtszellen" oder "Wirtszellen" werden oft gegenseitig austauschbar verwendet, wie dies aus dem Zusammenhang klar wird. Die Ausdrücke umfassen die direkte Zelle nach der Erfindung und selbstverständlich auch deren Nachkommen. Es sei angemerkt, dass nicht alle Nachkommen exakt identisch mit der Wirtszelle sind aufgrund von zufälligen Mutationen oder Unterschieden in der Umgebung. Solche veränderten Nachkommen sind jedoch von den obigen Begriffen umfasst.
Bakterielle Zellen sind bevorzugte prokaryotische Wirtszellen und stellen in typischer Weise einen Stamm von E. coli dar, wie beispielsweise der E. coli Stamm DH5, der verfügbar ist von Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD.. Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen umfassen Hefezellen und Säugetierzellen, vorzugsweise Wirbeltierzellen, wie solche von der Maus, der Ratte, dem Affen oder eine menschliche Fibroplastenzelllinie. Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen umfassen Eizellen vom chinesischen Hamster (CHO), die von ATCC als CCL61 verfügbar sind, sowie NIH schweizerische Mausembryozellen NIH/3T3, die verfügbar sind von ATCC als CRL 1658. Die Transformation von geeigneten Wirtszellen mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch bekannte Verfahren durchgeführt, die von dem Typ des verwendeten Vektors abhängig sind. Hinsichtlich der Transformation von prokaryotischen Wirtszellen sei beispielsweise verwiesen auf Cohen, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972) und Maniatis, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982). Hinsichtlich der Transformation von Wirbeltierzellen mit rekombinanten Nukleinsäuremolekülen, die retrovirale Vektoren enthalten, sei beispielsweise verwiesen auf Sorge, et al. Mol. Cell. Biol., 4: 1730-37 (1984); Graham, et al. Virol., 52: 456 (1973) und Wigler, et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 76: 1373-76 (1979).
Erfolgreich transformierte Zellen, das heißt Zellen, die ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül nach der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch bekannte Techniken identifiziert werden. Zellen, die von der Einführung einer rDNA nach der vorliegenden Erfindung abstammen, können beispielsweise kloniert werden, um monoklonale Kolonien herzustellen. Zellen von solchen Kolonien werden dann geerntet, lysiert und ihr DNA- Gehalt wird auf die Gegenwart der rDNA überprüft, wobei ein Verfahren verwendet wird, das beschrieben ist von Southern, J. Mol. Biol., 98: 503 (1975) oder Berent, et al. Biotech., 3: 208 (1985).
Zusätzlich zu dem direkten Nachweis der Gegenwart von rDNA kann eine erfolgreiche Transformation auch durch bekannte immunologische Verfahren bestätigt werden, wenn die rDNA zur Steuerung der Expression eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage ist. Zellen, die erfolgreich mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, der mit einem DNA-Segment operativ verbunden ist, stellen Polypeptide her, die eine Antigenität anzeigen. Eine Probe einer Zellkultur, von der angenommen wird, dass die transformierte Zellen enthält, wird geerntet und auf ein Polypeptid geprüft, welches alternierende hydrophobe und hydrophile Aminosäureregionen gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt, wobei Antikörper verwendet werden, die für dieses Antigen spezifisch sind. Die Herstellung und die Verwendung von solchen Antikörpern sind gut bekannt im Stand der Technik.
Zusätzlich zu den transformierten Wirtszellen selbst umfasst die vorliegende Erfindung auch eine Kultur von solchen Zellen in einem Nährmedium, vorzugsweise eine monoklonale (klonal homogen) Kultur oder eine Kultur, die von einer monoklonalen Kultur abstammt. Die Kultur enthält vorzugsweise auch ein Polypeptid oder ein Protein, welches die oben erwähnte Antigenität anzeigt, wobei mehr bevorzugt ein biologisch aktives Polypeptid ist, das nützlich ist in oberflächenwirksamen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung.
Die Nährmedien, die für die Kultur von transformierten Wirtszellen nützlich sind, sind im Stand der Technik gut bekannt und können von verschiedenen kommerziellen Quellen erhalten werden. Bei Ausführungen, wo die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist, wird bevorzugt "Serum-freies" Medium verwendet.

F. Rekombinante Verfahren für die Herstellung von Polypeptiden

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden, insbesondere von Polypeptiden, die eine oberflächenwirksame Aktivität zeigen. Das Verfahren erfordert das Anlegen einer Kultur, die ein Nährmedium umfasst, das Wirtszellen enthält, vorzugsweise menschliche Zellen, welche mit einem rDNA- Molekül nach der vorliegenden Erfindung transformiert sind, das zur Expression eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage ist. Die Kultur wird für einen Zeitraum aufrecht erhalten, der ausreichend ist, damit die transformierten Zellen das Polypeptid exprimieren können. Das exprimierte Protein oder Polypeptid wird dann aus der Kultur gewonnen.
Verfahren zur Gewinnung eines exprimierten Proteins aus einer Kultur sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen die Fraktionierung des Protein enthaltenden Teils der Kultur, wobei bekannte biochemische Techniken verwendet werden. Verfahren der Gelfiltration, der Gelchromatographie, der Ultrafiltration, der Elektrophorese, des Ionenaustausches, der Affinitätschromatographie und ähnliches sind beispielsweise für Proteinfraktionierungen gut bekannt und können verwendet werden, um die in der Kultur gefundenen, exprimierten Proteine zu isolieren. Zusätzlich können immunochemische Verfahren, wie die Immunoaffinität und die Immunoabsorption und ähnliches, unter Anwendung von bekannten Methoden durchgeführt werden.
Von der Erfindung ist auch ein Polypeptid umfasst, vorzugsweise ein Polypeptid, das eine oberflächenwirksame Aktivität zeigt, welches von einem der hier beschriebenen, rekombinanten Nukleinsäureverfahren hergestellt wird.

G. Zusammensetzungen, die ein Polypeptid enthalten

Die vorliegende Erfindung sieht eine Polypeptid enthaltende Zusammensetzung vor (Polypeptid- oder Proteinzusammenseztung nach der Erfindung), wobei das Polypeptid entweder im wesentlichen in isolierter oder im wesentlichen in reiner Form vorhanden ist. Mit "isoliert" ist gemeint, dass das Polypeptid als Teil einer Zusammensetzung frei von anderen Polypeptiden oder Proteinen vorliegt, die eine oberflächenwirksame Aktivität zeigen.
Mit "im wesentlichen rein" ist gemeint, dass ein Polypeptid nach der Erfindung als Teil einer Zusammensetzung frei von anderen Polypeptiden oder Proteinen vorliegt.
"Oberflächenwirksame Aktivität" für ein Protein oder ein Polypeptid ist als die Fähigkeit definiert, alleine oder in Kombination mit anderen Proteinen sowie in Kombination mit Lipiden eine Aktivität in dem in vivo Assay von Robertson, Lung, 158: 57-68 (1980) zu zeigen. Bei diesem Test wird die zu prüfende Probe durch einen Endotrachealtubus fetalen Kaninchen oder Lämmern verabreicht, wobei mit einem Kaiserschnitt Frühgeburten eingeleitet werden (diesen "Frühgeburten" fehlt ihre eigene PS und werden durch einen Ventilator unterstützt). Die Messungen der Lungencompliance, der Blutgase und des Ventilatordrucks stellen Aktivitätsindices bereit. Eine vorläufige Bestimmung der Aktivität kann auch mit einem in vitro Test durchgeführt werden, zum Beispiel mit dem Test von King, et al. Am. J. Physiol., 223: 715-726 (1972) oder mit dem unten gezeigten Test, der eine Messung der Oberflächenspannung an der Luft-Wasser-Grenzfläche verwendet, wenn ein Protein oder ein Polypeptid mit einem Phospholipid gemischt wird.

H. Synthetische, oberflächenwirksame Mittel

Rekombinant hergestellte Polypeptide, die eine oberflächenwirksame Aktivität zeigen, und/oder ein Polypeptid nach der Erfindung können mit einem pharmazeutisch akzeptablen Phospholipid gemischt werden, um ein synthetisches, pulmonales, oberflächenwirksames Mittel (PS) herzustellen, welches bei der Behandlung des Atemnotsyndroms nützlich ist.
Der Ausdruck "pharmazeutisch akzeptabel" bezieht sich auf molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die keine allergische oder ähnlich ungünstige Reaktion bewirken, wenn sie einem Menschen verabreicht werden.
Phospholipide, die für die Herstellung von synthetischen, alveolaren, oberflächenwirksamen Mittel durch Beimischung mit einem Protein nützlich sind, sind im Stand der Technik gut bekannt. Hinsichtlich einer Übersicht für native und synthetische Phospholipide für synthetische, oberflächenwirksame Mittel sei auf Notter, et al. Clin. Perinatology, 14: 433-79 (1987) verwiesen.
Nach einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein synthetisches pulmonales, oberflächenwirksames Mittel, welches für die Behandlung von RDS wirksam ist und das eine wirksame Menge eines Polypeptides nach der Erfindung umfasst, das mit einem pharmazeutisch akzeptablen Phospholipid gemischt ist. Während Verfahren zur Bestimmung der optimalen Gewichtsverhältnisse von Polypeptid : Phospholipid für eine gegebene Polypeptid-Phospholipid Kombination gut bekannt sind, liegen die therapeutisch wirksamen Verhältnisse in dem Bereich von etwa 1 : 5 bis etwa 1 : 10.000, vorzugsweise bei etwa 1 : 100 bis etwa 1 : 5.000, wobei etwa 1 : 500 bis etwa 1 : 1.000 mehr bevorzugt ist. Nach einer mehr bevorzugteren Ausführungsform liegt das Gewichtsverhältnis von Polypeptid : Phospholipid in dem Bereich von etwa 1 : 5 bis etwa 1 : 2.000, vorzugsweise bei 1 : 7 bis etwa 1 : 1.000, wobei etwa 1 : 10 bis etwa 1 : 100 mehr bevorzugt ist. Somit kann ein synthetisches, pulmonales, oberflächenwirksames Mittel nach der Erfindung etwa 50, normalerweise etwa 80 und bis zu fast 100 Gewichtsprozent Lipid und etwa 50, normalerweise etwa 20 und bis zu weniger als 1 Gewichtsprozent Polypeptid enthalten. Vorzugsweise liegt das Polypeptid für solche Polypeptide, die alternierende, hydrophobe und hydrophile Aminosäureregionen haben, zu etwa 1 bis etwa 10 Gewichtsprozent des oberflächenwirksamen Mittels vor.
Der Lipidanteil beträgt vorzugsweise etwa 50 bis etwa 90 mehr bevorzugt etwa 50 bis etwa 75 Gewichtsprozent Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), wobei die verbleibenden Anteile auf ungesättigtes Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerin (PG), Triacylglycerine, Palmitinsäure-Sphingomyelin oder Mischungen davon entfallen. Das synthetische, pulmonale, oberflächenwirksame Mittel wird hergestellt durch Mischen einer Lösung eines Polypeptides nach der Erfindung mit einer Suspension von Liposomen oder durch Mischen des Polypeptides nach der Erfindung und der Lipide direkt in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels. Das Lösungsmittel wird dann durch Dialyse oder Verdampfen unter Stickstoff und/oder Vakuumexposition entfernt.
Das synthetische, pulmonale, oberflächenwirksame Mittel wird vorzugsweise formuliert für eine endotracheale Verabreichung, zum Beispiel typischerweise als eine Flüssigsuspension, als Trockenpulver "Staub" oder als ein Aerosol. Ein synthetisches oberflächenwirksames Mittel (Polypeptid-Lipid-Mizette) wird beispielsweise in einer Flüssigkeit mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff, wie Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerin und ähnliches, suspendiert. Eine therapeutische Zusammensetzung mit einem oberflächenwirksamen Mittel kann auch geringe Mengen von nicht-toxischen Hilfssubstanzen enthalten, wie pH-Puffermittel, einschließlich Natriumacetat, Natriumphosphat und ähnliches. Um ein synthetisches oberflächenwirksames Mittel in Staubform herzustellen, wird ein synthetisches, oberflächenwirksames Mittel, wie hier beschrieben, hergestellt, dann lyophilisiert und als Trockenpulver gewonnen.
Falls es in einer Aerosolverabreichung verwendet werden soll, wird ein synthetisches oberflächenwirksames Mittel in feiner Form zusammen mit einem zusätzlichen oberflächenwirksamen Mittel und einem Treibmittel zugeführt. Typische oberflächenwirksame Mittel, die verabreicht werden können, sind Fettsäuren und Ester. Im vorliegenden Fall ist jedoch bevorzugt, die anderen Komponenten des oberflächenwirksamen Komplexes DPPC und PG zu verwenden. Nützliche Treibmittel sind in typischer Weise Gase bei Umgebungszuständen, die unter Druck kondensiert werden. Niederes Alkan und fluoriertes Alkan, wie Freon, können verwendet werden. Das Aerosol wird in einen Behälter gepackt, der mit einem geeigneten Ventil ausgerüstet ist, so dass die Inhaltsstoffe unter Druck gehalten werden können, bis sie freigesetzt werden.
Ein synthetisches oberflächenwirksames Mittel wird gemäß einer geeigneten Dosisformulierung mit einem Endotrachealtubus, durch Aerosolverabreichung oder durch Versprühen der Suspension oder des Staubes in die eingeatmeten Gase verabreicht. Die Mengen des synthetischen PS betragen zwischen etwa 0,1 mg und etwa 100 mg, vorzugsweise etwa 70 mg bis etwa 90 mg, und werden in einer Dosis verabreicht. Bei Verwendung für Neugeborene ist im allgemeinen eine oder zwei Verabreichungen ausreichend. Für Erwachsene wird ein ausreichend rekonstituierter Komplex verabreicht, um ein PO&sub2; innerhalb des normalen Bereiches herzustellen (Hallman, et al, J. Clinical Investigation, 70: 673-682, 1982).
Die folgenden Beispiele dienen zur Darstellung, aber nicht zur Limitierung der vorliegenden Erfindung. Einige Beispiele zeigen Verbindungen, die zur Erläuterung angegeben sind, wobei sie aber nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst sind.

Beispiel 1

In vitro Bestimmung der oberflächenwirksamen Aktivität des Polypeptides

A. Methoden

1. Messung der Aktivität des oberflächenwirksamen Mittels

Messungen des Oberflächendrucks entlang einer Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ausgedrückt in negativen cm des H&sub2;O-Drucks) bei einem minimalen (8 Minuten) Blasenradius wurden zu verschiedenen Zeiten unter Verwendung der pulsierenden Blasentechnik bestimmt, die beschrieben ist von Enhorning, J. Appl. Physiol., 43: 198-203 (1977).
Das Enhorning-Surfactometer (Surfactometer International, Toronto, Ontario) misst den Druckgradienten (AP) entlang einer Flüssigkeit-Luft-Grenzfläche einer Blase, die mit einer Rate von 20 Schwingungen/Minute zwischen einem maximalen (0,55 mm) und einem minimalen (0,4 mm) Radius pulsiert. Die Blase, die in einer 37ºC, wasserumschlossenen, 20 ul Probenkammer gebildet wird, wird durch eine mikroskopische Optik überwacht, wobei die Druckveränderungen mit einem auf Null und -2 cm H&sub2;O kalibrierten Bandschreiber aufgezeichnet werden.

2. Bestimmung des zusammengesetzten Hydrophobiewertes

Der zusammengesetzte Hydrophobiewert von jedem Peptid wurde bestimmt, indem jedem Aminosäurerest in einem Peptid der entsprechende Hydrophiliewert zugeordnet wird, wie dies in der Tabelle 1 von Hopp, et al. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 78: 3824-3829 (1981) beschrieben ist, wobei diese Publikation hiermit durch Verweis eingeführt ist. Für ein gegebenes Peptid werden die Hydrophiliewerte addiert und die Summe stellt den zusammengesetzten Hydrophiliewert dar.

3. Herstellung der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel

Nach Mischung mit einem Lösungsmittel wurde jedes Peptid mit Phospholipiden (DPPC : PG), 3 : 1, kombiniert, um ein synthetisches, oberflächenwirksames Mittel gemäß einem der folgenden Verfahren zu bilden.
Das Verfahren A wurde durchgeführt, indem 16 ul einer Peptid/Lösungsmittel-Mischung (40 ug Peptid) mit 100 ul Chloroform, welches 400 ug Phospholipide enthielt, gemischt wurden. Die Mischung wurde für etwa 10 Minuten bei 37ºC gerührt, um eine Peptid/Phospholipid-Mischung zu bilden. Das Chloroform wurde durch Trocknung unter N&sub2; aus der Peptid/Phospholipid-Mischung entfernt. Das synthetische, oberflächenwirksame Mittel wurde dann mit 90 ul H&sub2;O gemischt und für etwa 10 Minuten bei 37ºC langsam gerührt. Anschließend wurden 10 ul von 9% NaCl der Lösung, welche das oberflächenwirksame Mittel enthielt, zugegeben.
Das Verfahren B wurde durchgeführt, indem zunächst 100 ul Chloroform, welches 400 ug Phospholipide enthielt, in einer Glasröhre angeordnet wurden, wobei das Chloroform dann durch Trocknung unter N&sub2; für etwa 10 Minuten bei 37ºC entfernt wurde. 16 ul der Peptid/Lösungsmittel-Mischung und 74 ul H&sub2;O wurden mit den getrockneten Phospholipiden gemischt und dann vorsichtig für etwa 10 Minuten bei 37ºC gerührt. Zu dem synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel, das so hergestellt wurde, wurden 10 ul von 9% NaCl zugegeben.
Das Verfahren C wurde durchgeführt, indem zunächst die Polypeptid-PL-Mischung bei 43ºC für 10 Minuten gehalten wurde und anschließend die Lösungsmittel aus der Mischung durch Trocknung unter N&sub2; entfernt wurden. Falls notwendig, wurden die Mischungen weiter bei 15 Minuten unter Vakuum getrocknet, um eine getrocknete Polypeptid-PL-Mischung herzustellen. Wasser wurde dann zu jeder getrockneten Mischung in einer Menge zugegeben, das 90% des Volumens vorlag, welches notwendig ist, um eine PL-Endkonzentration von 5 oder 10 mg/ml zu erzielen, wobei so eine zweite Mischung hergestellt wurde. Diese zweite Mischung wurde dann für eine Stunde bei 43ºC unter Rühren gehalten. Anschließend wurde ein Volumen von 6% NaCl, das 10% des Volumens entsprach, das notwendig ist, um die gewünschte PL-Konzentration zu erzielen, mit der zweiten Mischung gemischt und die erzielte Endmischung wurde für 10 Minuten bei 43ºC gehalten. In den meisten Fällen wurde die Endmischung in einem letzten Schritt drei Kreisläufen von Einfrieren und Auftauen unterzogen.

4. Octylglucopyranosid-Test

Ein Test für die Quantifizierung von n-Octyl-beta-D-glucopyranosid, der auf dem Anthron-Verfahren von Spiro, Methods Enzymol., 8: 3-5 (1966) beruht, wurde zuvor beschrieben von Revak, et al. Am. Rev. Respir. Dis., 134: 1258-1265 (1986).

5. Proteinbestimmungen

Organische Proben, die bis zu 5 ug Protein enthielten, wurden unter Stickstoff in 12 · 75 mm Glasröhrchen getrocknet.
15 ul von 1% SDS in H&sub2;O und 300 ul BCA Protein Assay Reagens (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) wurden mit dem Protein in jedem Röhrchen gemischt. Die Röhrchen wurden abgedeckt und bei 60ºC für 30 Minuten inkubiert. Nach Abkühlung wurden die Proben zu einer Polystyrol-Mikrotiterplatte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen überführt und die OD&sub5;&sub5;&sub0; wurden gemessen. Rinderserumalbumin wurde als Standard verwendet. Es sei angemerkt, dass einige Phospholipide in dem BCA-Proteintest reagieren, was die Proteinquantifizierungen ungenau werden lässt, wenn Lipid anwesend ist (das heißt, vor der Bio-Sil HA Chromatographie). Ferner reagieren die hydrophoben LMW Apoproteine, wenn sie einmal gereinigt sind, selbst schwach mit den BCA-Reagenzien und alle Quantifizierung der isolierten Proteine basierten somit auf den Aminosäurezusammensetzungen.

6. Phospholipide

Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC, beta, gamma-Dipalmitoyl-L-alpha-lecithin) und L- alpha-phosphatidyl-DL-glycerol (PG, Derivat von Eilecithin) wurden gekauft entweder von Calbiochem-Behring (La Jolla, CA) oder von Avanti Polar-Lipids, Inc. (Birmingham, AL). DPPC wurde zu PG in Chloroform in einem Gewichtsverhältnis von 3 : 1 zugesetzt.

7. Tests auf oberflächenwirksame Aktivitäten

In vitro Tests der oberflächenwirksamen Aktivität, die auf der Fähigkeit beruht, die Oberflächenspannung einer pulsierenden Blase zu erniedrigen, sowie in vivo Tests, wobei fetale Kaninchen verwendet wurden, wurden jeweils im Detail beschrieben von Revak, et al. Am. Rev. Respir. Dis., 134: 1258-1265 (1986).

8. Morphometrische Analysen

Fetale Kaninchenlungen, die mit 30 cm H&sub2;O aufgebläht und dann wieder auf 10 cm H&sub2;O entleert wurden, wurden in 10% Formalin für 72 Stunden eingetaucht. Paraffinabschnitte wurde vom Apex bis zur Basis ausgerichtet und 5 Micron-Abschnitte wurden von anterior zu posterior genommen. Nach Hematoxylin- und Eosinanfärbung wurden 10 Felder (100 x) vom Apex bis zur Basis auf mehreren Abschnitten auf Punktbasis ausgewertet. Standartisierte, morphometrische Verfahren (Weiber, in "Stereological Methods," Bd. I, Academic Press, New York, S. 33-58, 1979) wurden verwendet, um die Anteile von Lungeninterstitium zu Hohlräumen für jede Behandlungsgruppe zu bestimmen. Schnitte von Lungenperimetern wurden auch bestimmt.

9. Phopholipid-Phosphortests

Phospholipide wurden quantitativ gemäß dem Verfahren von Bartlett, J. Biol. Chem., 234: 466-468 (1959) bestimmt.

10. Aminosäureanalyse

Dreifach Proben von Aminosäurezusammensetzungen wurden mit HCl bei 110ºC für 24 Stunden, mit HCl bei 150ºC für 24 Stunden oder in Perameisensäure bei 110ºC für 24 Stunden, gefolgt von einer HCl-Hydrolyse bei 110ºC für 24 Stunden hydrolysiert. Die Analysen wurden durchgeführt auf einem Beckman-Modell 121-M Aminosäure-Analyzer (Beckman Instruments, Fullerton, CA). Tryptophan wurde nicht bestimmt.

11. Aminosäuresequenzierung

Gasphasen-Proteinsequenzierung wurde durchgeführt auf einem Applied Biosystems 470A Aminosäuresequenziergerät (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) mit einem online Modell 120A HPLC.

B. Ergebnisse

Die in der folgenden Tabelle 2 dargestellten, synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel wurden hergestellt, wie dies in der Tabelle angezeigt ist. Jedes der in der Tabelle 2 angezeigten, beispielhaften, synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel wurde hinsichtlich seiner oberflächenwirksamen Aktivität überprüft, wobei die Fähigkeit zur Reduktion der Oberflächenspannung in vitro bestimmt wurde, unter Verwendung des oben beschriebenen "Blasentests" von Enhorning.
Die Ergebnisse von dieser Studie zeigen, dass ein Polypeptid nach der Erfindung, wenn es mit pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden gemischt wird, ein synthetisches, pulmonales, oberflächenwirksames Mittel bildet, dass eine größere oberflächenwirksame Aktivität besitzt als die des Phospholipids alleine, wie dies durch die niedrigeren ΔP-Werte angezeigt ist. Bei diesen Polypeptiden wurden 10% bis 80% niedrigere ΔP-Werte erzielt.
Jedes Polypeptid wurde mit dem angezeigten Lösungsmittel mit einer Konzentration von 2,5 mg Polypeptid pro ml Lösungsmittel gemischt. Die erzielte Mischung wurde beobachtet, um zu bestimmen, ob eine Lösung oder eine Suspension des unlöslichen Polypeptids sich bildete. Solche Mischungen, die eine Suspension bildeten, wurde ferner durch Beschallung im Wasserbad für 10 Sekunden vermischt, um eine sehr feine Suspension herzustellen, die für ein Pipettieren mit Glaspipetten ausreichend war.
Nach Mischung mit dem Lösungsmittel wurde jedes Peptid mit Phospholipiden (PL), DPPC : PG, 3 : 1, in Chloroform in einem Glasröhrchen gemischt, so dass die Menge des zugefügten Polypeptides 1/10 (10 Gewichtsprozent) der Menge des zugefügten PL entsprach, wobei dann ein synthetisches, oberflächenwirksames Mittel gemäß einem der Verfahren A, B, oder C gebildet wurde.
Jedes der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel wurde dann auf seine oberflächenwirksame Aktivität überprüft, was ihre Fähigkeit anzeigt, die Oberflächenspannung in vitro in dem oben beschriebenen Blasentest zu reduzieren. Der Druckgradient (ΔP) ist ein Wert der oberflächenwirksamen Aktivität in der dritten Polypeptid-PL-Mischung, die unter Verwendung eines Enhorning-Surfactometers, wie oben beschrieben, bestimmt wurde. Die Messungen wurden an den Zeitpunkten 15 Sekunden (15"), 1 Minute (1') und 5 Minuten (5') erzielt und als Mittel von drei unabhängigen Messungen der angezeigten Polypeptid-PL- Mischung ausgedrückt. Die Messungen des Druckgradienten für Vergleichsproben von PL alleine (PL) und von einem natürlichen, menschlichen, oberflächenwirksamen Mittel wurden als Kontrollwerte bestimmt.
Die Resultate von dieser Studie sind in der Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
(1) Ob eine Anfangsmischung von Peptid und Phospholipid eine Lösung oder eine Suspension war, ist angezeigt.
(2) Die Buchstaben bezeichnen das verwendete Herstellungsverfahren für das synthetische, oberflächenwirksame Mittel. Diese Verfahren sind oben beschrieben. Ein "+" zeigt an, dass die Endmischung einem letzten Schritt von drei Kreisläufen des Einfrierens und des Auftauens unterworfen wurde. Ein "-" zeigt an, dass dieser Schritt nicht durchgeführt wurde.
(3) Konzentration ("Konz.") von Phospholipid (PL) in der dritten Endmischung ist in Milligramm PL pro Milliliter Mischung (mg/ml) angezeigt.
(4) Der Druckgradient ist ein Wert der oberflächenwirksamen Aktivität in der Polypeptid-PL- Endmischung, der unter Verwendung eines Enhorning-Surfactometers, wie dies im Beispiel 2 beschrieben wurde, bestimmt wurde. Die Messungen wurden an drei Zeitpunkten nach 15 Sekunden (15"), 1 Minute (1') und nach 5 Minuten (5') erzielt und sind als Mittel von drei unabhängigen Messungen der angezeigten Polypeptid-PL-Mischung ausgedrückt. Die Bestimmungen des Druckgradienten für die Vergleichsproben von PL alleine (PL) und von einem natürlichem, menschlichen, oberflächenwirksamen Mittel sind auch gezeigt.
(5) Diese Lösungen wurden mit einer Konzentration von 20 mg/ml PL hergestellt und vor der Testung auf 10 mg/ml verdünnt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Polypeptid nach der Erfindung, wenn es mit pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden gemischt wird, ein synthetisches, pulmonales, oberflächenwirksames Mittel bildet, welches eine größere oberflächenwirksame Aktivität besitzt als die der Phospholipide alleine, wie dies durch das größere Volumen pro vorgegebenem Druck gezeigt ist.

Beispiel 2

In vivo Bestimmung der Aktivität des synthetischen, oberflächenwirksamen Mittels bei Kaninchen

A. Verfahren

1. Herstellung des synthetischen, oberflächenwirksamen Mittels

Ein Polypeptid nach der Erfindung wurde zunächst mit einem Lösungsmittel, wie hier beschrieben, gemischt. Die erzielte Mischung wurde dann mit einem Phopholipid (PL) vermischt, so dass die Menge des zugesetzten Polypeptides entweder 3%, 7% oder 10% auf Gewichtsbasis in Bezug auf die Menge des zugesetzten PL betrug, wie dies unten angezeigt ist. Das Endpolypeptid und die PL Mischung (synthetisches, oberflächenwirksames Mittel) wurde gemäß dem Verfahren C unter Verwendung des Gefrier-Auftau-Endschrittes hergestellt, wie dies im Detail im Abschnitt "Herstellung der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel" im Beispiel 1, Abschnitt 3 beschrieben ist, wobei aber die Endmischung eine Konzentration von 20 mg Phospholipid pro ml Endmischung hatte.

2. Instillationsprotokolle

Protokoll 1: Fetale Kaninchen wurden mit einer Injektion in die Luftröhre behandelt, wobei eine 0,1 ml Lösung injiziert wurde, die entweder ein im Beispiel 1 hergestelltes, synthetisches, oberflächenwirksames Mittel oder 2 mg eines nativen, oberflächenwirksamen Mittels, welches gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt wurde, oder 2 mg PL enthielt.
Protokoll 2: Das synthetische, oberflächenwirksame Mittel wurde in die Lunge von dem fetalen Kaninchen mittels Injektion in die Luftröhre und unter Verwendung einer einzelnen Spritze gemäß den folgenden drei Komponenten eingeführt, wobei die Komponenten die Spritze in der folgenden Reihenfolge verließen: (1) 0,05 ml Luft; (2) 0,1 ml eines in Beispiel 1 hergestellten, synthetischen, oberflächenwirksamen Mittels oder 2 mg von PL oder 2 mg des nativen, oberflächenwirksamen Mittels; und (3) 0,1 ml Luft.
Protokoll 3: Aus einer Spritze wurde ein 0,1 ml Aliquot eines synthetischen, oberflächenwirksamen Mittels, das gemäß der Beschreibung von Beispiel 1 hergestellt wurde, (oder 2 mg von NS oder von PL) in die Kaninchen-Luftröhre, wie oben beschrieben, eingeführt und nachfolgend wurde 0,05 ml Ringer-Lactat-Lösung und 0,2 ml Luft aus einer zweiten Spritze injiziert.
Protokoll 4: Aus einer Spritze wurden 0,1 ml eines synthetischen, oberflächenwirksamen Mittels, das gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt wurde, (oder 2 mg von NS oder von PL), 0,15 ml Luft, 0,1 ml Kochsalzlösung und 0,3 ml Luft in die Luftröhre, wie oben beschrieben, injiziert. Es wurden zwei nachfolgende Aliqouots von 0,3 ml Luft gegeben.
Protokoll 5: Fetale Kaninchen wurden mit einer Iniektion die Luftröhre aus einer einzelnen Spritze mit den folgenden vier Komponenten behandelt, so dass die vier Komponenten die Spritze bei der Injektion in der folgenden Reihenfolge verließen: (1) 0,2 ml, die entweder das in Beispiel 1 hergestellte, synthetische, oberflächenwirksame Mittel oder 4 mg des nativen, oberflächenwirksamen Mittels oder 4 mg PL enthielten; (2) 0,15 ml Luft; (3) 0,1 ml normale Kochsalzlösung; und (4) 0,3 ml Luft. Die obige Injektion wurde dann 15 Minuten nach der ersten Injektion wiederholt.
Protokoll 6: Kaninchen wurden gemäß Protokoll 5 behandelt, wobei aber zwei nachfolgende Aliquots von 0,3 ml Luft nach der Anfangsinstilliation verabreicht wurden und keine zusätzliche Instillation nach 15 Minuten.

3. Fetales Kaninchenmodell für die Untersuchung der oberflächenwirksamen Aktivität

Die oberflächenwirksame Aktivität von beispielhaften Polypeptiden nach der Erfindung wurde untersucht unter Verwendung der Verfahren, die im Detail zuvor beschrieben wurden von Revak, et al. Am. Rev. Respir. Dis., 134: 1248-1256 (1986), wobei die Ausnahmen unten beschrieben sind.
Fetale Kaninchen nach 27-tägiger Schwangerschaft wurden mittels Hysterotomie erhalten. Es wurden ihnen sofort 0,05 ml Norcuron (Organon, Inc., NJ) injiziert, um ein spontanes Atmen zu verhindern. Die fetalen Kaninchen wurden dann gewogen und eine kleine Kanüle wurde mittels Luftröhrenschnitt in die Luftröhre eingeführt. Das gemäß der obigen Beschreibung hergestellte, synthetische, oberflächenwirksame Mittel wurde dann in die Lunge des fetalen Kaninchens durch eines der obigen Instillationsprotokolle eingeführt.
Nach der Instillation wurde das Kaninchen in einen besonders aufgebauten Plethysmographen (enthaltend einen Celesco-Transducer), verbunden mit einem Ventilator (Baby Bird, Baby Bird Corp., Palm Springs, CA) angeordnet und die instillierte Lunge wurde mit einer Rate von 30 Kreisläufen pro Minute mit einem Peak-Einatmungsdruck von 25 cm H&sub2;O, einem positiven Endausatmungsdruck von 4 cm H&sub2;O und einer Atmungszeit von 0,5 Sekunden beatmet. Bei einigen Studien wurden dynamische Compliancemessungen zu verschiedenen Zeiten während des Beatmungsverfahrens vorgenommen. Bei anderen Studien wurden nach der Beatmung statische Compliancemessungen durchgeführt.
Statische Compliancemessungen wurden 30 Minuten nach der Ventilation durchgeführt. Die Tiere wurden aus dem Ventilator entfernt und die Lungen wurden bei -20 cm H&sub2;O in einer Glasglocke unter Vakuum entgast. Die Lungen wurden dann aufgebläht und wieder entleert über einen T-Stecker, der mit einem Luftröhrenkatheter verbunden war. Das Luftvolumen, welches erforderlich war, um statische Drücke von 5, 10, 15, 20, 25 und 30 cm H&sub2;O zu erreichen, wurde während der Inflationsphase und der Deflationsphase gemessen, um den statischen Druck zu den Volumenkurven zu bestimmen als Maß der statischen Compliance.
Unter Verwendung des Plethysmographen wurden zu verschiedenen Zeiten dynamische Compliancemessungen während einer 60-minütigen Ventilationsperiode durchgeführt. Eine mit Computerunterstützung durchgeführte Datenanalyse führte zu Compliancedaten, die als ml Luft pro cm H&sub2;O pro Gramm Körpergewicht zu jedem Zeitpunkt ausgedrückt sind. Die Compliance wurde durch die folgende Formel berechnet.
Compliance = ΔV/ΔP
ΔPtp = (C)&supmin;¹·(ΔV) + (R)·(F)
Ptp = transpulmonaler Druck
C = Compliance (elastische Komponente - bezieht sich auf die Änderung im Volumen zum Druck)
R = Widerstand (bezieht sich auf die Strömung zum Druck)
F = Strömung
V = Volumen = das Integral der Strömung bezogen auf die Zeit
Die obige Gleichung wurde mit einer multiplen linearen Regression für C und R gelöst. Die Compliance (C) stellt die elastische Natur der Lungen dar und der Widerstand (R) stellt den Druck dar, der notwendig ist, um den Widerstand eines Gasstromes in die Lunge und aus der Lunge heraus zu überwinden.
Die in den Tabellen 3-5 gezeigten Studien wurden, wie oben dargestellt, durchgeführt, wobei eine Reihe von synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel verwendet wurden, die gemäß den hier offenbarten Verfahren und Parametern hergestellt wurden. Synthetische, oberflächenwirksame Mittel, die aus RL2, RL4, RL4-CYS oder aus RL8 Peptiden oder aus "Mehrfachen" von RL4 (zum Beispiel (RL4) &sub6;R) bestanden, wurden mit einem oberflächenwirksamen Phospholipidmittel verglichen, welches kein Peptid oder Protein enthielt ("oberflächenwirksames Kontrollmittel"). Unter Verwendung des Plethysmographen wurden die dynamischen Compliancemessungen zu verschiedenen Zeiten während eines 60- minütigen Ventilationszeitraumes durchgeführt. Die Datenanalyse führte zu Compliancedaten, die als ml Luft pro H&sub2;O pro Gramm Körpergewicht · 10&sup6; bei jedem Zeitpunkt ausgedrückt sind. Die Compliance wurde gemäß der oben erwähnten Formel berechnet.
Für die in den Tabellen 3 und 4 gezeigten Studien wurden die synthetischen, oberflächenwirksamen Lösungen gemäß den folgenden Anteilen an DPPC, PG und Peptid hergestellt. DPPC: 15 mg/ml; PG: 5 mg/ml und Peptid: 2 mg/ml. Bei den Studien der Tabelle 3 wurden die verabreichten Lösungen, die auch Palmitinsäure enthielten, mit einem "+" Symbol gekennzeichnet, während solche, die keine Palmitinsäure enthielten, mit einem "-" gekennzeichnet sind. Das Verabreichungsprotokoll 4 wurde bei den in den Tabellen 3 und 4 dargestellten Studien verwendet.
Die Tabelle 4 und die Fig. 4 zeigen den Effekt der Verabreichung von verschiedenen Formulierungen von RL4-haltigen, oberflächenwirksamen Mitteln auf die Lungenfunktion und zeigen die Ergebnisse eines Versuchs, die optimale Länge eines RL4-haltigen Peptides zu bestimmen. In der Tabelle 4 ist auch die in vivo Wirksamkeit eines Cystein enthaltenden, synthetischen, oberflächenwirksamen Mittels dargestellt. In der Tabelle 4 und in der Fig. 4 ist der durchschnittliche dynamische Compliancewert für die getesteten Tiere unter Verwendung der angegebenen Formulierung gegen die Zeit in Minuten nach Verabreichung des oberflächenwirksamen Mittels aufgetragen. Das oberflächenwirksame Mittel wurde gemäß Protokoll 4, wie oben beschrieben, verabreicht.

B. Resultate

Die statischen Compliancedaten, die mit den Instillationsprotokollen 1 und 5 erzielt wurden, wurden gesammelt und analysiert (Daten nicht gezeigt). Eine verbesserte Lungencompliance wurde in allen Lungen erzielt, die mit einem natürlichen, oberflächenwirksamen Mittel oder mit den getesteten, synthetischen, oberflächenwirksamen Mitteln behandelt wurden, im Vergleich zu solchen Lungen, die mit Phospholipiden (PL) alleine behandelt wurden, wobei es nur eine Ausnahme gab. Das unter Verwendung von p1-15 hergestellte, synthetische, oberflächenwirksame Mittel führte zu keiner verbesserten Lungencompliance gegenüber PL alleine, wenn dies durch statische Compliance gemessen wurde.
Die Ergebnisse der dynamischen Compliancestudien sind in den Tabellen 3-5 und in der Fig. 4 dargestellt. Tabelle 3 Dynamische Compliance in ml Luft/cm H&sub2;O/g Körpergewicht · 10&sup6;
a: mit einem "+" bezeichnete Lösungen enthalten Palmitinsäure;
"-" bedeutet keine Palmitinsäure. Tabelle 4 Dynamische Compliance in ml Luft/cm H&sub2;O/g Körpergewicht · 10&sup6; Tabelle 5 Dynamische Compliance in ml Luft/cm H&sub2;O/g Körpergewicht · 10&sup6;
b n/d = nicht bestimmt c PTX = Pneumothorax
Wie in den Tabellen 3-5 gezeigt, verbesserten alle synthetischen oberflächenwirksamen Mittel (und die natürlichen, oberflächenwirksamen Mittel) die dynamischen Compliancewerte im Vergleich zum Phospholipid alleine.

C. Diskussion

Die in vivo Compliancestudien zeigen, dass die Verwendung einer Reihe von beispielhaften, synthetischen, oberflächenwirksamen Mitteln nach der Erfindung zu einer erhöhten Compliance im Vergleich zum Phospholipid alleine für jedes der getesteten, synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel führte. Die Proteine und die Polypeptide nach der Erfindung bilden, wenn sie mit pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden gemischt werden, synthetische, oberflächenwirksame Mittel, die eine größere oberflächenwirksame Aktivität als das Phospholipid alleine haben. Die Verwendung der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel ist vorteilhaft bei der Erzeugung von verbesserten Compliancewerten in vivo.
Die hier beschriebenen Studien, die in den Tabellen 3-5 und in der Fig. 4 dargestellt sind, zeigen, dass synthetische, oberflächenwirksame Mittel eine nennenswerte therapeutische Verwendbarkeit zeigen. Die dynamischen Compliancewerte, die für alle synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel beobachtet wurden, übersteigen signifikant solche Werte, die für das Phospholipid alleine erzielt wurden. Ferner, da die dynamischen Complianceteste klare Indikatoren für die in vivo Wirksamkeit in Säugetieren, einschließlich dem Menschen, sind, ist es nicht überraschend, dass die hier beschriebenen Daten gut mit den Primatendaten übereinstimmen, die in dem obigen Beispiel 3 diskutiert wurden.
Ferner ist die therapeutische Wirksamkeit, die durch diese in vivo dynamischen Compliancestudien gezeigt wurde, konsistent mit den erzielten Ergebnissen, wenn die gleichen Zusammensetzungen getestet wurden unter Verwendung der beschriebenen in vitro Tests "pulsierende Blase", die im obigen Beispiel 1 beschrieben und dargestellt sind. Die in vitro Tests "pulsierende Blase" der oberflächenwirksamen Aktivität, die hier beschrieben sind, scheinen die in vivo Wirksamkeit vorher zu bestimmen können, insbesondere unter dem Gesichtspunkt, dass die in vivo Studien, die hier beschrieben sind, die therapeutische Wirksamkeit der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel, welche den offenbarten Formulierungen entsprechen, belegen. Die signifikante Verbesserung in den dynamischen Compliancewerten, die bei diesen in vivo Studien beobachtet wurden, belegen den therapeutischen Wert der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel, die gemäß der hier erfolgten Offenbarung hergestellt und verwendet werden.

Beispiel 3: In vivo Bestimmung der synthetischen, oberflächenwirksamen Aktivität unter Verwendung von Primaten

A. Methoden

1. Herstellung der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel

Ein Polypeptid wurde zunächst mit einem Lösungsmittel gemischt, wie dies in Beispiel 2 beschrieben ist. Die erzielte Mischung wurde ferner mit einem Phospholipid (PL) versehen, so dass die Menge des zugesetzten Polypeptides entweder 3%, 7% oder 10% auf Gewichtsbasis der Menge des zugesetzten PL, wie unten angezeigt, entsprach. Das Endpolypeptid, die PL-Mischung (synthetisches, oberflächenwirksames Mittel) wurde gemäß dem Verfahren C unter Verwendung des abschließenden Gefrier-Auftau-Schrittes erzielt, wie dies im Detail beschrieben ist unter "Herstellung der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel" von Beispiel 1, Abschnitt 3, wobei aber die Endmischung eine Konzentration von 20 mg Phospholipid pro ml Endmischung hatte.

2. Fetales Affenmodell für das Studium der oberflächenwirksamen Aktivität

In vivo Studien wurden begonnen, um die Wirksamkeit der neuen Peptide (und der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel, welche diese Peptide enthielten), die in der oben erwähnten Anmeldung beschrieben sind, zu bestätigen. Die oberflächenwirksamen Mittel, die aus Phospholipid und RL4 oder KL4 Peptiden bestanden, wurden mit einem oberflächenwirksamen Phospholipidmittel verglichen, welches kein Peptid oder Protein ("oberflächenwirksames Kontrollmittel") enthielt.
Gemäß den Standardprotokollen wurde mit fetalen Rhesusaffen nach etwa 128-131 Tagen Schwangerschaft gearbeitet. Ein Endotrachealtubus wurde dann durch einen Luftröhrenschnitt eingeführt. Jeder Affe wurde dann mit einem Ventilator verbunden und ein Katheter wurde in der Nabelarterie angeordnet, um Blutgase und den Blutdruck zu messen. Ein zweiter Katheter wurde in die Nabelvene eingeführt, um eine Nähr-/Hydratisierungslösung (D1OW) dem Affen zuzuführen. Nachdem die Tiere stabilisiert worden waren, wurde mit Röntgenstrahlen das Vorhandensein und das Ausmaß des Atemnotsyndroms (RDS) bestimmt. Verschiedene Parameter wurden eingestellt, um den Sauerstoffdruck (pO&sub2;) in dem Bereich von 50-70 Torrund den Kohlendioxiddruck (pCO&sub2;) bei 45-50 Torr aufrecht zu erhalten. Pulsoxymetrie wurde verwendet, um kontinuierlich die Hämoglobinsättigung des arteriellen Blutes zu überwachen.
Als Oxygenierungsindex wurden die a/A (arteriell/Alveolar) O&sub2; Verhältnisse zu jedem Zeitpunkt der Messung des arteriellen pO&sub2; berechnet. Diese Werte erlaubten zusammen mit dem radiographischen Beweis und den klinischen Bestimmungen der Zustände der Affen die Bestimmung der Gegenwart und der Schwere des RDS. Ein a/A Verhältnis von 0,2 bis 0,4 bestätigte die Gegenwart von RDS und Werte unterhalb 0,2 sind ein Anzeichen für ein schweres RDS.
Nach Etablierung der Diagnose eines RDS wurde jeder Affe im allgemeinen mit Atemunterstützung für zwei Stunden erhalten. Oberflächenwirksame Mittel, die das Peptid enthielten oder die als Kontrolle dienten, wurden dann über eine Zuführungsröhre, die unterhalb der Endotrachealröhre eingesetzt wurde, verabreicht. Eine Hälfte der Dosis des synthetischen, oberflächenwirksamen Mittels wurde dem Tier gegeben, wobei es auf seiner rechten Seite gehalten wurde, während die andere Hälfte der Dosis dem Tier gegeben wurde, wobei es auf seiner linken Seite gehalten wurde. Bei den in den Fig. 2A und 2B dargestellten Experimenten wurden Blindversuche durchgeführt, das heißt, die Person, welche das synthetische, oberflächenwirksame Mittel verabreichte, war nicht darüber informiert, welches oberflächenwirksame Mittel (das heißt, Peptid enthaltendes, oberflächenwirksames Mittel oder oberflächenwirksames Phospholipid-Kontrollmittel) das Tier erhielt.
Die Atemunterstützung wurde für weitere 6-12 Stunden aufrecht erhalten und der Zustand von jedem Tier wurde kontinuierlich überwacht. Zur Mitte des Experimentes sowie präterminal wurden auch Röntgenaufnahmen genommen. Bei Beendigung des Experimentes wurde jedes Tier getötet (durch Phenobarbital-Injektion) und es wurde eine Nekropsie durchgeführt.

B. Ergebnisse

Die von den obigen Studien erzeugten Daten sind in den Fig. 1, 2 und 3 dargestellt. Die Figuren zeigen das folgende an.
Fig. 1 zeigt den Effekt der Verabreichung eines oberflächenwirksamen Mittels, welches RL4 enthält, auf die Lungenfunktion. In der Fig. 1A ist der Oxygenierungsindex (a/A) gegen die Zeit nach Geburt des Tieres in Stunden aufgetragen. Das oberflächenwirksame Mittel wurde in einer aufgeteilten Dosis verabreicht, wie oben beschrieben, und zwar etwa 28 Stunden nach Geburt des Tieres. In der Fig. 1B wurde einem zweiten Affen ein synthetisches, oberflächenwirksames Mittel, das RL4 enthielt, in einer aufgeteilten Dosis, wie oben beschrieben, während der ersten 2,5 Stunden nach Geburt verabreicht. Wie bei dem ersten Affen (Fig. 1A) verbesserte sich das a/A Verhältnis in den Stunden nach Verabreichung des Peptid-enthaltenden, oberflächenwirksamen Mittels dramatisch.
In den Fig. 2A und B ist der Effekt der Verabreichung eines synthetischen, oberflächenwirksamen Mittels, das KL4 enthielt, hinsichtlich der Lungenfunktion dargestellt. In der Fig. 2A und 2B sind die Daten von acht Affen gezeigt. Solche, bei denen später bestätigt wurde, dass sie das synthetische, oberflächenwirksame Mittel mit KL4 erhalten haben, wurden als die Affen mit den Nummern 6, 7, 8 und 10 identifiziert. Die Affen, die das andere oberflächenwirksame Mittel erhielten (das heißt, ein Mittel, welches kein oberflächenwirksames Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung enthielt) waren die Affen mit den Nummern 3, 5, 9 und 11. In allen Diagrammen ist a/A gegen die Stunden nach Geburt aufgetragen, wobei der Zeitpunkt der Verabreichung des oberflächenwirksamen Mittels angezeigt ist.
Die Werte für den Endsauerstoff zeigen, dass die Tiere, die das oberflächenwirksame Mittel mit dem Peptid erhielten, geringe Konzentrationen an eingeatmeten Sauerstoff tolerierten, ihre pCO&sub2; Niveaus waren niedrig, der End-pH ihres Blutes war normal und ihre Lungen expandierten gemäß Bestimmung durch grobe (brutto) und mikroskopische Beobachtung (die Studien waren wie oben verblindet). In jedem Fall zeigten Röntgenaufnahmen, die direkt vor der Verabreichung des oberflächenwirksamen Mittels gemacht wurden, eine Schattenbildung der Lungenfelder, während nur bei den vier Affen, die das oberflächenwirksame Mittel mit KL4 erhielten, die Lungenfelder deutlich nach 8-10 Stunden nach der Geburt klar wurden.
Bei dem Affen Nummer 8 wurde gefunden, dass der Mangel der Verbesserung bei dem a/A Verhältnis das Ergebnis eines Defektes der Herzkammerscheidewand war, was ein Rechts-nach-Links-Verschieben des sauerstoffarmen, venösen Blutes erlaubte. Bei allen anderen Affen, welche die hier offenbarten synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel erhielten, war die Genesung von dem RDS dramatisch.
End-FiO&sub2;, End-pCO&sub2;, End-pH und die Lungenexpansion (brutto und mikroskopisch) wurden bei jedem Affen auch gemessen. Die gesammelten und aufgezeichneten Daten waren die folgenden.
Affe Nummer 3 (Fig. 2A-1): End-FiO&sub2; - 50; End-pCO&sub2; - 79,4; End-pH - 7,21; Lungenexpansion, brutto - 0; Lugenexpansion, mikroskopisch - 0.
Affe Nummer 5 (Fig. 2A-2): End-FiO&sub2; - 90; End-pCO&sub2; - 58,6; End-pH - 7,17; Lungenexpansion, brutto - 0; Lugenexpansion, mikroskopisch - 0.
Affe Nummer 6 (Fig. 2A-3): End-FiO&sub2; - 21; End-pCO&sub2; - 39,4; End-pH - 7,39; Lungenexpansion, brutto - 4+; Lugenexpansion, mikroskopisch - 4+.
Affe Nummer 7 (Fig. 2A-4): End-FiO&sub2; - 21; End-pCO&sub2; - 29,3; End-pH - 7,47; Lungenexpansion, brutto - 4+; Lugenexpansion, mikroskopisch - 3+.
Affe Nummer 8 (Fig. 2B-1): End-FiO&sub2; - 21; End-pCO&sub2; - 32,1; End-pH - 7,42; Lungenexpansion, brutto - 4+; Lugenexpansion, mikroskopisch - 4+.
Affe Nummer 9 (Fig. 2B-2): End-FiO&sub2; - 100; End-pCO&sub2; - 150,1; End-pH - 6,90; Lungenexpansion, brutto - 0; Lugenexpansion, mikroskopisch - 0.
Affe Nummer 10 (Fig. 2B-3): End-FiO&sub2; - 21; End-pCO&sub2; - 31,5; End-pH - 7,42; Lungenexpansion, brutto - 2+; Lugenexpansion, mikroskopisch - 3+.
Affe Nummer 11 (Fig. 2B-4): End-FiO&sub2; - 50; End-pCO&sub2; - 55,6; End-pH - 7,31; Lungenexpansion, brutto - 0; Lugenexpansion, mikroskopisch - 0.
Die Fig. 3 zeigt die graduelle Abnahme von Sauerstoff über die Zeit (in Stunden) beim Affen Nr. 13 in Folge einer Verabreichung eines oberflächenwirksamen Mittels, das KL4 enthielt. Wie in der Fig. 3 angezeigt ist, wurde das oberflächenwirksame, KL4 enthaltende Mittel zwischen etwa einer und zwei Stunden nach Geburt verabreicht. Zum Zeitpunkt Null und 100% eingeatmeten Sauerstoff (FiO&sub2; = 1,0) empfing das Tier 100% Sauerstoff und bei 22- 25 Stunden empfing das Tier 20% Sauerstoff, das heißt, Raumluft.

C. Diskussion

Aus diesen Daten wurde geschlossen, dass die synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung nicht bloß therapeutisch nützlich sind, sondern das sie eine dramatische Verbesserung in der Lungenfunktion des Empfängers innerhalb eines relativ kurzen Zeitraumes bewirken. Diese Verwendbarkeit wird sehr gut durch die Tatsache dargestellt, dass die Tiere, die ein synthetisches, oberflächenwirksames Mittel erhielten, welches ein Peptid enthielt, das den Formulierungen entsprach, die in der obigen Anmeldung offenbart sind, vollständig sich von RDS erholten nach Verabreichung eines oberflächenwirksamen RL4- oder KL4-Mittels.
Zusätzlich zeigen die Daten an, dass die Verabreichung von diesen neuen, Peptid enthaltenden, oberflächenwirksamen Mittel eine Wiederherstellung erlauben, die ausreichend ist, um die Entfernung der angereicherten Sauerstoffverabreichung zu garantieren, wenn das a/A-Verhältnis anzeigt, dass der Organismus nicht mehr länger unter Atemnot leidet.
Die oben diskutierten, experimentellen Ergebnisse stimmen überein mit der Information, die von den "pulsierenden Blasen"-Tests gewonnen wurden, die ein wertvolles in vitro Modell der in vivo Wirksamkeit (siehe Beispiel 1) und der in vivo dynamischen Compliancestudien (Beispiel 2) bereitstellen. Ferner scheinen die Ergebnisse des "Blasen"-Tests zu prognostizieren, dass die synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel (einschließlich RL4 und KL4 zum Beispiel) eine therapeutische Wirksamkeit zeigen, wie dies hier dargestellt ist.
Die obige Beschreibung, einschließlich der spezifischen Ausführungsformen und Beispiele, dient zur Darstellung der vorliegenden Erfindung und soll nicht beschränkend wirken. Zahlreiche andere Variationen und Modifikationen können vorgenommen werden, ohne das der wahre Gehalt und Umfang der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

Sequenzliste

(1) Allgemeine Information:
(i) Anmelder: Cochrane, Charles G Revak, Susan D
(ii) Titel der Erfindung: Synthetic Pulmonary Surfactant Peptides
(iii) Zahl der Sequenzen: 10
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: The Scripps Research Institute, Büro des Patentanwalts
(B) Straße: 10666 North Torrey Pines Road, Mail Drop TPC8
(C) Stadt: La Jolla
(D) Staat: Kalifornien
(E) Land: USA
(F) Postleitzahl: 92037
(v) computerlesbare Form:
(A) Mediumtyp: Floppy Disk
(B) Computer: IBM PC kompatibel
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) gegenwärtige Anmeldungsdaten:
(A) Anmeldenummer: PCT/US92/04537
(B) Einreichungsdatum: 01. Juni 1992
(C) Klassifikation:
(vii) frühere Anmeldedaten:
(A) Anmeldenummer: US 07/715,397
(B) Anmeldedatum: 14. Juni 1991
(viii) Anwalt-/Agent-Information:
(A) Name: Bingham, Douglas A
(B) Registrierungsnummer: 32,457
(C) Referenz-/Akten-Nummer: SCR1025P
(ix) Telekommunikationsinformation:
(A) Telefon: 619-554-2937
(B) Fax: 619-554-6312
(2) Information für SEQ ID Nr. 1:
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(ii) Molekültyp: Peptid (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 1:
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(ii) Molekültyp: Peptid (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 10:

Claims

1. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch die folgenden Formeln dargestellt ist:

2. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch die folgende Formel dargestellt ist:

3. Synthetisches, pulmonales, oberflächenaktives Mittel, welches ein pharmazeutisch akzeptables Phospholipid in Beimischung zu einem Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 umfasst.

4. Synthetisches, pulmonales, oberflächenaktives Mittel, welches zwei pharmazeutisch akzeptable Phospholipide in Beimischung mit einer Fettsäure und einem Polypeptid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 umfasst.

5. Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen, zur Behandlung des Atemnotsyndroms nützlichen Medikamentes, welches das Mischen von einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines Polypeptides nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 umfasst.