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Die Erfindung bezieht sich auf Polypeptide, die eine Sequenz umfassen, welche
alternierende, hydrophobe und hydrophile Regionen von Aminosäureresten hat. Gemäß einer
anderen Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf Polypeptide, die eine Sequenz
umfassen, die alternierende, hydrophobe und positiv geladene Regionen von
Aminosäureresten hat. Ferner bezieht sich die Erfindung auf Polypeptide, die für die
Herstellung von synthetischen, pulmonalen, oberflächenwirksamen Mittel nützlich sind. Die
vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül,
welches ein Strukturgen trägt, das für eine Polypeptidsequenz mit alternierenden,
hydrophoben und hydrophilen (oder positiv geladenen) Regionen von Aminosäureresten
codiert. Die vorliegende Erfindung offenbart auch die Verwendung von solchen rekombinanten
Molekülen für die Herstellung von Polypeptiden mit alternierenden, hydrophoben und
hydrophilen (oder positiv geladenen) Regionen von Aminosäureresten.
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Pulmonale, oberflächenwirksame Mittel (PS) kleiden das Alveolarepithel von
ausgewachsenen Säugetierlungen aus. Ein natürliches PS wurde als ein "Lipoproteinkomplex"
beschrieben, da es Phospholipide und Apoproteine enthält, die aufeinander wirken zur
Reduktion der Oberflächenspannung an der Grenzfläche zwischen Lungenluft-Flüssigkeit.
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Seit der Entdeckung des pulmonalen, oberflächenwirksamen Mittels und der
nachfolgenden Erkenntnis, dass sein Fehlen die primäre Ursache für das neonatale
Atemnotsyndrom (RDS) ist, wurden eine Vielzahl von Studien durchgeführt hinsichtlich der
Entwicklung einer effektiven Ersatztherapie für das oberflächenwirksame Mittel bei betroffenen
Individuen, insbesondere bei Säuglingen, wobei exogenes PS verwendet wurde. Es konnte
beispielsweise gezeigt werden, dass die Verwendung von exogenen Mittel bei menschlichen
Frühgeborenen zu einer Verbesserung der Lungenfunktion, die durch einen Abfall bei dem
mittleren Atemdruck gemessen wurde, und der Sauerstofferfordernisse führt (siehe Hallman,
et al. Pediatrics, 71: 473-482 (1983); Merritt, et al. J. Pediatr., 108: 741-745 (1986); Hallman,
et al. J. Pediatr., 106: 963-969 (1985); Morley, et al. Lancet, i: 64-68 (1981); Merritt, et al. New
England J. Med., 315: 785-790 (1986), Smyth, et al. Pediatrics, 71: 913-917 (1983);
Enhorning, et al. Pediatrics, 76: 145-153 (1985); Fujiwara, et al. The Lancet, 1: 55-59 (1980);
Kwong, et al. Pediatrics, 76: 585-592 (1985); Shapiro, et al, Pediatrics 76: 593-599 (1985);
Fujiwara, in "Pulmonary Surfactant", Robertson, B., Van Golde, L. M. G., Batenburg J. (Hrsg.),
Elsevier Science Publishers, Amsterdam, S. 479-503, (1984)).
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Aus einem pharmakologischen Gesichtspunkt heraus bestünde das optimale exogene
PS, welches bei der Behandlung von RDS zu verwenden wäre, aus einem vollständig im
Labor unter kontrollierten und sterilen Bedingungen synthetisierten PS mit vernachlässigbaren
Veränderungen in den Eigenschaften bei seiner Herstellung. Um die Möglichkeit von
immunologischen Komplikationen zu minimieren, sollte die Apoprotein-Komponente eines
exogenen PS identisch zu der im Menschen gefundenen Komponente sein.
Unglücklicherweise ist jedoch die Zusammensetzung des natürlich auftretenden PS komplex
und in der Wissenschaft wurden bis jetzt noch nicht alle biochemischen Komponenten
identifiziert, welche die biophysikalischen Eigenschaften erzeugen, die für eine hohe
physiologische Aktivität in der Lunge notwendig sind. Insbesondere hat die Wissenschaft
bisher noch nicht alle Apoproteine, die in dem natürlichen PS vorkommen, charakterisiert oder
die Funktion der bisher bekannten PS-Apoproteine identifiziert.
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Es sei angemerkt, dass die Literatur hinsichtlich der PS-Apoproteine und ihren
Funktionen bei der Oberflächenwirkung komplex, nicht konsistent und manchmal etwas
widersprüchlich ist, da bei vielen Studien heterogene Apoprotein-Zubereitungen verwendet
werden. Der Wissenschaft ist es bisher noch nicht gelungen, die Zahl der verschiedenen
Apoproteine, die in natürlichem PS vorkommen, definitiv zu bestimmen.
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Von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung ist die Verwendung eines
Polypeptides als eine Komponente in einem exogenen, oberflächenwirksamen Mittel, wobei
das Polypeptid verschiedene Eigenschaften besitzt, die analog zu einem niedrigmolekularen
(LMW), menschlichen, PS-assoziierten Apoprotein sind. Verschiedene Untersuchungen haben
versucht, menschliche PS LMW Apoproteine unter Verwendung von biochemischen
Techniken zu isolieren oder zu definieren (siehe zum Beispiel Phizackerley, et al. Biochem.
J., 183: 731-736 (1979), Revak, et al. Am. Rev. Resp. Dis., 134: 1258-1265 (1986), Suzuki, et
al. Eur. J. Respir. Dis., 69: 335-345 (1986), Taeusch, et al. Pediatrics, 77: 572-581 (1986), Yu,
et al. Biochem. J., 236: 85-89 (1986), Whitsett, et al. Pediatric Res., 20: 460-467 (1986),
Whitsett, et al. Pediatric Res., 20: 744-749 (1986), Takahashi, et al. Biochem. Biophys. Res.
Comm., 135: 527-532 (1986), Suzuki, et al. Exp. Lung. Res., 11: 61-73 (1986), Curstedt, et al.
Eur. J. Biochem., 168: 255-262 (1987), Notter, et al. Chem. Phys. Lipids, 44: 1-17 (1987), und
Phelps, et al. Am. Rev. Respir. Dis., 135: 1112-1117 (1987)).
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Vor kurzem hat die Wissenschaft begonnen, die Methoden der rekombinanten DNA-
Technologie anzuwenden, um die Probleme zu überwinden, die mit der Isolierung von
homogenen, individuellen LMW PS Apoproteinen zusammenhängen. Beispielsweise haben
Glasser, et al. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 84: 4007-4011 (1987) berichtet, dass eine von
cDNA abstammende Sequenz von Aminosäureresten gebildet wurde, die wenigsten ein Teil
eines menschlichen Vorläuferproteins darstellt, welches zu wenigstens einem reifen LMW
Apoprotein führt. Diese Sequenz wurde als SPL (Phe) bezeichnet. Obwohl Glasser, et al. nicht
in der Lage waren, den Carboxy-Terminus von SPL (Phe) zu bestimmen und somit auch nicht
die komplette Sequenz bestimmen konnten, haben sie andererseits vorhergesagt, dass das
reife SPL (Phe) etwa 60 Aminosäure umfasst.
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Jacobs, et al. J. Biol. Chem., 262: 9808-9811 (1987) haben eine cDNA und eine davon
abstammende Aminosäuresequenz für ein menschliches Vorläuferprotein beschrieben,
welches ähnlich zu dem ist, das beschrieben wurde von Glasser, et al., siehe oben. Gemäß
Jacobs et al. hat jedoch das von dem Vorläufer gebildete, reife LMW Apoprotein, welches sie
als PSP-B bezeichneten, eine Länge von 76 Aminosäureresten. Jacobs et al. stellten ferner
fest, dass es nicht klar ist, dass jedes PS Apoprotein, welches von dem berichteten
Vorläuferprotein abstammt, in den Zubereitungen der oberflächenwirksamen Mittel vorhanden
ist, die klinisch von anderen Wissenschaftlern untersucht wurden. Das von dem
Vorläuferprotein abstammende, von Glasser et al., siehe oben, und Jacobs et al., siehe oben,
beschriebene reife Apoprotein wird allgemein als "SP18" bezeichnet, wobei die monomeren
und dimeren Formen als "SP18 Monomer" und "SP18 Dimer" bezeichnet werden.
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Aus der vorhergehenden Darstellung ist erkennbar, dass für das wahrscheinlich gleiche
PS Apoprotein verschiedene Bezeichnungen in der Literatur existieren. Ferner haben Warr, et
al., in Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 84: 7915-7919 (1987) eine von einer cDNA abstammende
Sequenz aus 197 Aminosäureresten beschrieben, die ein Vorläuferprotein bilden, aus dem ein
reifes LMW Apoprotein, welches sie als SP5 bezeichnet haben, gebildet wird, was
wahrscheinlich anzeigt, dass PS mehr als ein LMW Apoprotein enthält.
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Cochrane und Revak, siehe die offengelegte PCT-Patentanmeldung mit der Nummer
WO 89/06657, waren in der Lage, die reife, biologisch aktive Form von SP18 zu definieren
und verschiedene von SP18-abstammende Polypeptide und Analoga zu offenbaren, die eine
therapeutisch nützliche, oberflächenwirksame Aktivität zeigen.
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Die US-4,861,756 beschreibt einen Polypeptid-Phospholipid-Komplex, der aus
alternierenden hydrophoben/hydrophilen Regionen besteht, der für die Behandlung von RDS
verwendet werden könnte. Die EP-A-0 348 967 offenbart die Synthese von synthetischen,
pulmonalen, oberflächenwirksamen Mittel, die aus einem Polypeptid mit Alphahelixstruktur,
das mit einem Lipid verbunden ist, sich zusammensetzen. Ein Verfahren für den Ersatz von
Aminosäureresten mit Leucin oder Lysin wurde beschrieben von Ono et al. in FEBS Letters
220: 332-336 (1987).
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Die biologische Aktivität der obigen Proteine passt jedoch nicht zu den hier offenbarten
Polypeptiden, die für therapeutische Anwendungen nützlich sind, insbesondere bei der
Bildung von synthetischen, pulmonalen, oberflächenwirksamen Zusammensetzungen.
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Ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung hat eine Aminosäuresequenz, die
durch die folgende Formeln dargestellt ist:
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Gemäß einer anderen Ausführungsform beinhaltet die vorliegende Erfindung ein
synthetisches, pulmonales, oberflächenwirksames Mittel, welches zwei pharmazeutisch
akzeptable Phospholipide in Beimischung mit einer Fettsäure und einem Polypeptid umfasst,
wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz hat, die durch die folgende Formeln
dargestellt ist:
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Die vorliegende Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Behandlung des Atemnotsyndroms
unter Verwendung der offenbarten, synthetischen, pulmonalen, oberflächenwirksamen Mittel.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen Medikamentes, welches für die Behandlung
des Atemnotsyndroms nützlich ist, wobei das Verfahren das Mischen von einem oder
mehreren, pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden mit einer therapeutisch wirksamen
Menge eines Polypeptides umfasst, wobei das Polypeptid eine Sequenz mit alternierenden,
hydrophoben und hydrophilen Regionen aus Aminosäureresten beinhaltet und eine
Aminosäuresequenz hat, die aus einer Gruppe von Polypeptiden ausgewählt ist, die
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umfasst.
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Gemäß einer anderen Ausführungsform bildet ein Polypeptid gemäß den obigen
Formeln, wenn es mit einem oder mehreren, pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden
gemischt wird, ein synthetisches, pulmonales, oberflächenwirksames Mittel mit einer
Oberflächenwirksamkeit, die größer ist als die Oberflächenwirksamkeit des Phospholipids
allein.
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Verschiedene Verfahren für die Behandlung des Atemnotsyndroms, welche die
Beimischung einer therapeutisch wirksamen Menge eines synthetischen, pulmonalen,
oberflächenwirksamen Mittels gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, werden auch in
Betracht gezogen. Bei alternativen Ausführungsformen wird ein oberflächenwirksames Mittel,
welches ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, das mit einem oder
mehreren, pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden gemischt ist, beigemischt. Ein
synthetisches, oberflächenwirksames Mittel, welches ein oder mehrere Polypeptide bemaß
der hier offenbarten Formel enthält, kann auch therapeutisch wirksam sein und kann vor der
Verabreichung mit einem oder mehreren, pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden
gemischt werden.
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Fig. 1 zeigt den Effekt der Verabreichung eines RL4 enthaltenden,
oberflächenwirksamen Mittels auf die Lungenfunktion bei verfrüht neugeborenen Affen. In der
Fig. 1A ist der Oxygenierungsindex (a/A) gegen die Zeit in Stunden nach der Geburt des
Tieres aufgetragen. Das oberflächenwirksame Mittel wurde in Teildosis etwa 28 Stunden nach
der Geburt, wie dies durch den Pfeil dargestellt ist, verabreicht. In der Fig. 1B wurde das
oberflächenwirksame Mittel in Teildosis während der ersten 2,5 Stunden nach der Geburt
verabreicht. Die zwei unterbrochenen Linien unterteilen das Diagramm in drei Quadrante, die
anzeigen, dass die Diagnose eines schweren Atemnotsyndroms (RDS) auf a/A-Werte von 0,0
bis 0,2 anzuwenden ist; eines RDS auf einen a/A-Bereich von 0,2-0,4 anzuwenden ist und
das ein a/A von 0,4 oder besser als "normal" anzusehen ist.
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Die Fig. 2 zeigt den Effekt einer Verabreichung eines KL4 enthaltenden, synthetischen
oberflächenwirksamen Mittels auf die Lungenfunktion. In den Fig. 2A und 2B sind die
Daten von acht Affen gezeigt, wobei später bestätigt wurde, dass die Affen, die das KL4
enthaltende, synthetische, oberflächenwirksame Mittel erhalten haben, den Affen mit den
Nummern 6,7,8 und 10 entsprachen (die Fig. 2A-3 und 4, 2B-1 und 3). Diejenigen Affen,
die ein anderes oberflächenwirksames Mittel erhielten (das heißt, die kein
oberflächenwirksames Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung enthielten) waren die Affen mit den
Nummern 5,9 und 11 (die Fig. 2A-1 und 2, 2B-2 und 4). Bei allen Darstellungen ist a/A
gegen die Stunden nach der Geburt aufgetragen, wobei der Zeitpunkt der Verabreichung des
oberflächenwirksamen Mittels angezeigt ist.
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Die Fig. 3 zeigt die graduelle Sauerstoffabnahme über die Zeit (in Stunden) von einem
geborenen Primaten, bei dem RDS diagnostiziert wurde, nach Verabreichung eines KL4
enthaltenden, oberflächenwirksamen Mittels. FiO&sub2; ist gegen die Zeit in Stunden aufgetragen.
Der Zeitpunkt, an dem das KL4 enthaltende, oberflächenwirksame Mittel verabreicht wurde, ist
durch den Pfeil angezeigt. Zum Zeitpunkt Null und 100% eingeatmeten Sauerstoff (FiO&sub2; =
1,0) empfing das Tier 100% Sauerstoff, wobei es nach 22-25 Stunden 20% Sauerstoff
empfing, was der Raumluft entspricht.
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Die Fig. 4 zeigt die Ergebnisse eines in vivo dynamischen Compliancetests unter
Verwendung der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel RL4-CYS, (RL4)&sub4;R, (RL4)&sub5;R,
(RL4)&sub6;R, (RL4)&sub7;R und (RL4)&sub8;R. Wie angezeigt ist n = 3 oder 4. Die Figur zeigt die Wirkung der
Verabreichung von verschiedenen Formulierungen des RL4 enthaltenden,
oberflächenwirksamen Mittels auf die Lungenfunktion und zeigt die Ergebnisse einer
Untersuchung an, um die optimale Länge eines RL4 enthaltenden Peptides zu bestimmen.
Der durchschnittliche dynamische Compliancewert für die getesteten Tiere unter Verwendung
der angegebenen Formulierung (ml Luft/cm H&sub2;O/q · 10&sup6;) ist gegen die Zeit in Minuten nach
Verabreichung des oberflächenwirksamen Mittels aufgetragen.
A. Definitionen
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Aminosäure: Alle hier identifizierten Aminosäurereste haben die natürliche L-
Konfiguration. Unter Beibehaltung der Standard-Polypeptidnomenklatur, J. Biol. Chem., 243:
3557-59, (1969), sind die Abkürzungen für die Aminosäurereste in der folgenden
Korrespondenztabelle gezeigt:
Korrespondenztabelle
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Es sei angemerkt, dass alle Aminosäuresequenzen hier durch Formeln dargestellt sind,
deren Links - Rechtsorientierung der konventionellen Richtung vom Amino-Terminus zum
Carboxy-Terminus entspricht. Es sei ferner hinzugefügt, dass ein Bindungsstrich am Beginn
oder am Ende einer Aminosäuresequenz eine Bindung zu einem Radikal, wie H und OH
(Wasserstoff und Hydroxyl) am Amino-Terminus beziehungsweise Carboxy-Terminus anzeigt,
oder eine weitere Sequenz mit einem oder mehreren Aminosäureresten. Es sei weiterhin
angemerkt, dass ein Schrägstrich (/) am rechten Ende einer Sequenz anzeigt, dass die
Sequenz in der nächsten Zeile weitergeführt wird.
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Polypeptid und Peptid: Polypeptid und Peptid sind hier Ausdrücke, die austauschbar
verwendet werden und die eine lineare Reihe von nicht mehr als etwa 60 Aminosäureresten
kennzeichnen, die über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino- und Carboxy-Gruppen
von benachbarten Resten miteinander verbunden sind.
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Protein: Protein ist ein Ausdruck, der hier verwendet wird, um eine lineare Reihe von
mehr als etwa 60 Aminosäureresten zu kennzeichnen, die wie in einem Polypeptid
miteinander verbunden sind.
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Nucleotid: Eine monomere Einheit von DNA oder RNA, die aus einem Zuckerrest
(Pentose), einem Phosphat und einer Stickstoff enthaltenden, heterozyklischen Base besteht.
Die Base ist mit dem Zuckerrest über einen glycosidischen Kohlenstoff (1'-Kohlenstoff der
Pentose) verbunden und diese Kombination von Base und Zucker stellt ein Nucleosid dar.
Wenn das Nucleosid eine Phosphatgruppe enthält, die an der 3'-oder 5'-Position der Pentose
gebunden ist, wird es als ein Nucleotid bezeichnet.
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Basenpaar (bp): Eine Paarung von Adenin (A) mit Thymin (T) oder von Cytosin (C) mit
Guanin (G) in einem doppelsträngigen DNA-Molekül.
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Konservative Substitutionen sind solche, wo ein Aminosäurerest durch einen anderen,
biologisch ähnlichen Rest ersetzt wird. Beispiele für konservative Substitutionen umfassen die
Substitution eines hydrophoben Restes, wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin, durch
einen anderen hydrophoben Rest oder die Substitution eines polaren Restes durch einen
anderen polaren Rest, wie zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutaminsäure und
Asparaginsäure oder zwischen Glutamin und Asparagin und ähnliches. Der Ausdruck
"konservative Substitution" umfasst auch die Verwendung einer substituierten Aminosäure
anstelle einer nicht-substituierten Eltern-Aminosäure, vorausgesetzt, dass solch ein Polypeptid
die erforderliche Bindungsaktivität auch anzeigt.
B. Polypeptide
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Ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung ist gekennzeichnet durch seine
Aminosäuresequenz und durch neue funktionelle Eigenschaften. Ein Polypeptid gemäß der
Erfindung bildet in Beimischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Phospholipid ein
synthetisches, pulmonales, oberflächenwirksames Mittel mit einer Oberflächenaktivität, die
größer ist als die Oberflächenaktivität des Phospholipids alleine.
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Bei einer bevorzugten Ausführungsform hat ein Polypeptid nach der Erfindung eine
Aminosäuresequenz, die eine zusammengesetzte Hydrophobie von weniger als Null hat,
vorzugsweise weniger oder gleich -1, wobei weiter ein Wert von weniger als oder gleich -2
bevorzugt ist. Die Bestimmung des Wertes der zusammengesetzten Hydrophobie für ein
Peptid ist im Detail im Beispiel 1 beschrieben. Diese hydrophoben Polypeptide erfüllen die
Funktion der hydrophoben Region von SP18. In einer Ausführungsform ahmt die
Aminosäuresequenz das Muster der hydrophoben und hydrophilen Reste von SP18 nach.
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Ein bevorzugtes, hydrophobes Polypeptid beinhaltet eine Sequenz mit alternierenden,
hydrophoben und hydrophilen Aminosäureregionen und ist gekennzeichnet durch wenigstens
10 Aminosäurereste, welche durch die folgende Formel dargestellt ist:
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(ZaUb)cZd
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Z und U sind Aminosäurereste, die bei jedem Auftreten von Z und U unabhängig
voneinander ausgewählt werden. Z ist ein hydrophober Aminosäurerest, der vorzugsweise aus
der Gruppe ausgewählt ist, die aus R, D, E und K besteht. In einer bevorzugten
Ausführungsform ist "Z" aus der Gruppe ausgewählt, die aus R und K besteht.
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Die Polypeptide nach der Erfindung sind in der Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
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¹ Die Bezeichnung ist eine Abkürzung für die angezeigte Aminosäuresequenz.
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Ein Polypeptid nach der vorliegenden Erfindung kann durch alle Techniken synthetisiert
werden, die dem Fachmann bekannt sind. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung von vielen
verfügbaren Techniken kann gefunden werden in J. M. Steward und J. D. Young, "Solid Phase
Peptide Synthesiss, W. H. Freeman Co., San Francisco, 1969, und J. Meienhofer, "Hormonal
Proteins und Peptides", Bd. 2, S. 46, Academic Press (New York), 1983 für die Festphasen-
Peptidsynthese, und E. Schroder und K. Kubke, "The Peptides" Bd. 1, Academic Press (New
York), 1965 für klassische Lösungssynthese.
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Ein Polypeptid nach der Erfindung kann auch hergestellt werden unter Verwendung der
synthetischen Festphasentechnik, die ursprünglich beschrieben wurde von Merrifield, in J. Am.
Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963). Andere Synthesetechniken für Polypeptide können
beispielsweise gefunden werden in M. Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley &
Sons, 2. Ausgabe, (1976) sowie in anderen Referenzarbeiten, die dem Fachmann bekannt
sind. Eine Zusammenfassung der Polypeptid-Synthesetechniken kann gefunden werden in J.
Stuart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford,
IL, 3. Ausgabe, Neurath, H. et al., Hrsg., S. 104-237, Academic Press, New York, NY (1976).
Geeignete Schutzgruppen für die Verwendung bei solchen Synthesen sind in den obigen
Literaturstellen angegeben sowie in J. F. W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry,
Plenum Press, New York, NY (1973).
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Diese Verfahren umfassen im Allgemeinen die sequentielle Zugabe von einem oder
mehreren Aminosäureresten oder in geeigneter Weise geschützten Aminosäureresten zu
einer wachsenden Peptidkette. Normalerweise ist entweder die Aminogruppe oder die
Carboxylgruppe des ersten Aminosäurerestes durch eine geeignete, selektiv entfernbare
Schutzgruppe geschützt. Eine andere, selektiv entfernbare Schutzgruppe wird für
Aminosäuren verwendet, die eine reaktive Seitengruppe enthalten, wie Lysin.
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Bei der Festphasensynthese als Beispiel wird die geschützte oder derivatisierte
Aminosäure an einem inerten Festträger über ihre ungeschützte Carboxylgruppe oder
Aminogruppe befestigt. Die Schutzgruppe für die Aminogruppe oder die Carboxylgruppe wird
dann selektiv entfernt und die nächste Aminosäure in der Sequenz, wobei die komplimentäre
(Amino- oder Carboxyl-) Gruppe in geeigneter Weise geschützt ist, wird beigemischt und
reagiert unter Bedingungen, die für die Bildung der Amidverbindung mit dem Rest, der bereits
an den festen Träger befestigt ist, geeignet ist. Die Schutzgruppe der Aminogruppe oder der
Carboxylgruppe wird dann von dieser neu hinzugefügten Aminosäure entfernt und die nächste
Aminosäure (in geeigneter Weise geschützt) wird dann hinzugefügt und so weiter. Nachdem
alle gewünschten Aminosäuren in einer geeigneten Sequenz miteinander verbunden wurden,
werden die verbleibenden Endschutzgruppen und Seitengruppen-Schutzgruppen (und
Festträger) sequentiell oder gleichzeitig entfernt, um das Endpolypeptid zu erzielen.
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Aminosäure-Linker liegen normalerweise an wenigstens einem Rest vor und können
auch an 40 oder mehr Resten vorhanden sein, öfters an 1 bis 10 Resten. Typische
Aminosäuren, die für das Verbinden benutzt werden, sind Tyrosin, Cystein, Lysin,
Glutaminsäure, Asparaginsäure oder ähnliches. Ferner kann eine Polypeptidsequenz nach der
Erfindung von der natürlichen Sequenz durch eine Sequenz unterschiedlich sein, die durch
terminale NH&sub2;-Acylierung, zum Beispiel Acetylierung, oder Thioglycolsäure-Amidierung,
terminale Carboxylamidierung, zum Beispiel Ammoniak, Methylamin etc. modifiziert ist.
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Wenn das Polypeptid mit einem Träger über einen Linker verbunden ist, um ein im Stand
der Technik bekanntes Träger-Hapten-Konjugat zu bilden, ist das Polypeptid gemäß der
vorliegenden Erfindung in der Lage, Antikörper zu induzieren, die mit den synthetischen,
oberflächenwirksamen Mitteln immunreagieren. Angesichts des gut etablierten Prinzips der
immunologischen Kreuzreaktivität umfasst die vorliegende Erfindung somit auch
antigenverwandte Varianten der in der Tabelle 1 gezeigten Polypeptide. Eine
"antigenverwandte Variante" ist ein Polypeptid, welches einen Sequenzabschnitt eines
Polypeptides nach Tabelle 1 aus wenigstens sechs Aminosäuren umfasst und das in der Lage
ist, Antikörpermoleküle zu induzieren, die mit einem Polypeptid nach Tabelle 1 und einem
synthetischen, oberflächenwirksamen Mittei, welches solch ein Polypeptid enthält,
immunreagieren können.
C. Nukleinsäure-Segmente
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In lebenden Organismen ist die Aminosäuresequenz eines Proteins oder eines
Polypeptids direkt über den genetischen Code mit der Deoxyribonukleinsäure (DNA)-Sequenz
des Strukturgens, welches für das Protein codiert, verbunden. Somit kann solch ein
Strukturgen auch anhand der Aminosäuresequenz, das heißt Protein oder Polypeptid, definiert
werden, für welches es codiert. Ein wichtiges und gut bekanntes Merkmal des genetischen
Codes ist seine Redunanz. Dies bedeutet, das für die meisten Aminosäuren, die für die
Herstellung von Protein verwendet werden, mehr als ein codierendes Nukleotidtriplet (Codon)
für eine besondere Aminosäure codieren oder bestimmen kann. Deshalb können eine Reihe
von unterschiedlichen Nukleotidsequenzen für eine bestimmte Aminosäuresequenz codieren.
Solche Nukleotidsequenzen werden funktionell als äquivalent betrachtet, da sie zu der
Herstellung der gleichen Aminosäuresequenz in allen Organismen führen können. Manchmal
kann eine methylierte Variante eines Purins oder eines Pyrimidins in eine vorgegebene
Nukliotidsequenz eingebaut werden. Solche Methylierungen beeinflussen jedoch nicht die
codierende Beziehung.
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Ein DNA-Segment gemäß der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass
es im Wesentlichen aus einer DNA-Sequenz besteht, die für ein Polypeptid gemäß den
offenbarten Formeln codiert. Dies bedeutet, dass ein DNA-Segment nach der vorliegenden
Erfindung ein Strukturgen bildet, welches in der Lage ist, ein Polypeptid mit alternierenden,
hydrophoben und hydrophilen Aminosäureregionen zu exprimieren. Während die Codons des
DNA-Segmentes nicht co-linear mit der Aminosäuresequenz eines hier offenbarten
Polypeptides wegen der Gegenwart eines Introns sein muss, ist es andererseits bevorzugt,
dass das Strukturgen in der Lage ist, diese Polypeptide in reifer Form zu exprimieren, das
heißt, ohne die Notwendigkeit einer post-translationalen proteolytischen Verarbeitung. Das
Gen liegt vorzugsweise in einer nicht-unterbrochenen, linearen Reihe von Codons vor, wobei
jedes Codon für eine Aminosäure in einem Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung
codiert, das heißt, ein Gen, welches keine Introns enthält.
D. Rekombinante Nukleinsäuremoleküle
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Ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch unter Verwendung von
rekombinanten Nukleinsäure-Technologien, die im Stand der Technik gut bekannt sind,
hergestellt werden. DNA-Sequenzen, die beispielsweise für die Herstellung eines
Polypeptides nach der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind beschrieben in Paik et al.,
PNAS USA 82: 3445-3449, (1985); MCLean et al., J. Biol. Chem. 259: 6498-6504, (1984) und
Rall et al., J. Biol. Chem. 257: 4171-4178, (1982). Ein DNA-Segment, welches für ein
Polypeptid nach der Erfindung codiert, kann durch chemische Techniken synthetisiert werden,
zum Beispiel durch das Phospotriester-Verfahren nach Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc.
103: 3185, (1981). Das DNA-Segment kann dann in einen Expressionsvektor eingesetzt
werden und ein damit transformierter Wirt kann benutzt werden, um das Polypeptid
herzustellen (siehe zum Beispiel Current Protocols In Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg.,
John Wiley & Sons, New York, NY, und die U.S. Patente Nr. 4,237,224 und Nr. 4,356,270).
Diese Veröffentlichungen sind hiermit durch Referenz eingeführt. Bei der chemischen
Synthese der codierenden Sequenz können selbstverständlich alle gewünschte Modifikationen
hergestellt werden, indem einfach die geeigneten Basen durch solche ersetzt werden, die für
die native Aminosäuresequenz codieren.
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Die rekombinanten Expressionsvektoren, die zur Expression eines Polypeptides nach
der Erfindung in der Lage sind, sowie die Verfahren für deren Verwendung zur Herstellung
eines Polypeptides nach der Erfindung, werden als Teil der vorliegenden Erfindung
angesehen.
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Von der vorliegenden Erfindung sind auch Ribonukleinsäure (RNA)-Äquivalente der
oben beschriebenen DNA-Segmente umfasst.
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Nukleinsäuremoleküle können auch mittels Amplifikationsverfahren synthetisiert werden,
was auch als Polymerase-Kettenreaktion ("PCR") -Technologie bekannt ist. Die PCR-
Amplifikationsverfahren sind im Detail in den U.S. Patenten mit den Nummern 4,683,192;
4,683,202; 4,800,159 und in 4,965,188 beschrieben und wenigstens in verschiedenen Texten,
einschließlich "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", H. Erlich,
Hrsg., Stockton Press, New York (1989) und "PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications", Innis et al., Hrsg., Academic Press, San Diego, California (1990), wobei diese
Offenbarungen hiermit durch Referenz eingeführt sind. Andere Verfahren und Primer sind
beschrieben in Nilsson, et al., Cell 58: 707 (1989), Ennis, et al., PNAS USA 87: 2833-7 (1990)
und Zemmour, et al., Immunogenetics 33: 310-20 (1991). Restriktionsorte können auch in die
5'- und 3'-Primer eingeführt werden, um die Amplifikationsprodukte in Sequenzierungsvektoren
oder Expressionsvektoren zu subklonieren. Es kann auch hilfreich sein, eine 4-
Basen-Spacer-Sequenz proximal zu der Restriktionsstelle anzuordnen, um die Effizienz des
Schneidens der Amplifikationsprodukte mit Enzymen zu verbessern.
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Die rekombinanten Nukleinsäuremoleküle nach der vorliegenden Erfindung können
durch operative Verbindung eines Vektors mit einem Nukleinsäuresegment nach der
vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
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Der Ausdruck "operativ verbunden" bedeutet hier, dass das Nukleinsäuresegment mit
dem Vektor verbunden ist, so dass die Expression des durch das Segment gebildete
Strukturgen unter der Kontrolle des Vektors ist.
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Der Ausdruck "Vektor" bezieht sich hier auf ein Nukleinsäuremolekül, welches zur
Replikation in einer Zelle in der Lage ist und mit dem ein anderes Nukleinsäuresegment
operativ verbunden werden kann, so dass die Replikation des angehefteten Segmentes
bewirkt werden kann. Vektoren, die eine Expression eines Strukturgens, welches für ein
Polypeptid nach der vorliegenden Erfindung codiert, bewirken können, werden hier als
"Expressionsvektoren" bezeichnet. Ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül (rDNA oder rRNA)
ist somit ein Hybridmolekül, welches wenigstens zwei Nukleotidsequenzen umfasst, die
normalerweise in der Natur nicht zusammen gefunden werden.
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Die Wahl des Vektors, an den ein Nukleinsäuresegment nach der vorliegenden
Erfindung operativ gebunden wird, hängt direkt, wie es im Stand der Technik gut bekannt ist,
von den gewünschten funktionellen Eigenschaften ab, das heißt, von der Proteinexpression,
sowie von der zu transformierenden Wirtszelle, wobei diese Beschränkungen spezifisch für die
Konstruktion von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen sind. Ein Vektor, der bei der
vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist zumindest in der Lage, die Replikation und
vorzugsweise auch die Expression eines Strukturgens zu steuern, welches für ein Polypeptid
nach der vorliegenden Erfindung codiert, das in einem Nukleinsäuresegment vorliegt, mit dem
es operativ verbunden ist.
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Ein Vektor umfasst ein prokaryotisches Replikon, das heißt, eine DNA-Sequenz mit der
Fähigkeit der Steuerung der autonomen Replikation und der extrachromosomalen
Aufrechterhaltung eines rDNA-Moleküls in einer prokaryotischen Wirtszelle, wie eine
bakterielle Wirtszelle, die damit transformiert ist. Solche Replikons sind im Stand der Technik
gut bekannt. Ferner umfassen solche Ausführungen, die ein prokaryotisches Replikon
beinhalten, auch ein Gen, dessen Expression mit einer Antibiotikaresistenz eines bakteriellen
Wirtes, der damit transformiert ist, verbunden ist. Typische bakterielle Antibiotikaresistenzgene
sind solche, die eine Resistenz gegen Ampicillin oder Tetracyclin verleihen.
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Die Vektoren, die ein prokaryotisches Replikon beinhalten, können auch einen
prokaryotischen Promoter umfassen, der zur Steuerung der Expression (Transcription und
Translation) eines Gens in einer bakteriellen Wirtszelle, wie E. coli, die damit transformiert ist,
in der Lage ist. Ein Promoter ist ein Expressionskontrollelement, welches von einer DNA-
Sequenz gebildet ist, welche die Bindung einer RNA-Polymerase und die Transcription
erlaubt. Promotersequenzen, die mit bakteriellen Wirten kompatibel sind, werden in typischer
Weise von Plasmidvektoren bereitgestellt, die geeignete Restriktionsorte für den Einbau eines
DNA-Segmentes enthalten. Typische Vektorplasmide sind pUC8, pUC9, pBR322 und
pBR329, die verfügbar sind von Biorad Laboratories (Richmond, CA), und pPL und pKK223,
die verfügbar sind von Pharmacia, Piscataway, N. J..
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Expressionsvektoren, die mit eukaryotischen Zellen kompatibel sind, vorzugsweise
solche, die mit Wirbeltierzellen kompatibel sind, können auch verwendet werden, um ein
rDNA-Molekül zu bilden. Eukaryotische Zellexpressionsvektoren sind im Stand der Technik
gut bekannt und sind von verschiedenen kommerziellen Quellen verfügbar. Solche Vektoren
enthalten geeignete Restriktionsorte für den Einbau des gewünschten DNA-Segmentes.
Typische Vektoren sind pSVL und pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d (International
Biotechnologies, Inc.) und pTDT1 (ATCC, #31255).
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In Ausführungsformen umfasst ein eukaryotischer Zellexpressionsvektor, der zur
Herstellung eines rDNA-Moleküls nach der vorliegenden Erfindung verwendet wird, einen
Selektionsmarker, der in einer eukaryotischen Zelle wirksam ist, vorzugsweise ein
Antibiotikaresistenz-Selektionsmarker. Ein bevorzugter Resistenz-Marker ist das Gen, dessen
Expression zu einer Neomycinresistenz führt, das heißt, die Neomycinphosphotransferase
(neo)-Gen (Southern, et al. J. Mol. Appl. Genet., 1: 327-341 (1982)).
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Die Verwendung von retroviralen Expressionsvektoren für die Bildung eines
rekombinanten Nukleinsäuremoleküls nach der vorliegenden Erfindung ist auch vorgesehen.
Der Ausdruck "retroviraler Expressionsvektor" bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, das
eine Promotersequenz umfasst, die von der langen terminalen Wiederholungs (LTR) -Region
eines Retrovirusgenoms abstammt.
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In bevorzugten Ausführungsformen ist der Expressionsvektor ein retroviraler
Expressionsvektor, der in eukaryotischen Zellen nicht replizieren kann. Die Herstellung und
die Verwendung von retroviralen Vektoren wurde beschrieben von Sorge, et al. Mol. Cell.
Biol., 4: 1730-37 (1984).
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Eine Reihe von Verfahren wurden entwickelt, um Nukleinsäuresegmente über
komplementäre kohäsive Enden mit den Vektoren operativ zu verbinden. Beispielsweise
können komplementäre Homopolymerstränge den zu inserierenden Nukleinsäuresegmenten
und einem terminalen Abschnitt der Vektornukleinsäure hinzugefügt werden. Der Vektor und
das Nukleinsäuresegment werden dann über Wasserstoffbindung zwischen den
komplementären homopolymeren Schwänzen verbunden, um ein rekombinantes
Nukleinsäuremolekül zu bilden.
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Synthetische Linker, die einen oder mehrere Restriktionsorte einhalten, stellen ein
alternatives Verfahren für die Verbindung eines Nukleinsäuresegmentes mit Vektoren dar. Ein
DNA-Segment nach der vorliegenden Erfindung wird mit der Bakteriophagen T4 DNA-
Polymerase oder mit der E. coli DNA-Polymerase I behandelt, wobei diese Enzyme
vorstehende, 3'-einzelsträngige Enden mit ihren 3'-5'exonukleolytischen Aktivitäten entfernen
und ausgesparte 3' Enden mit ihren Polymeraseaktivitäten auffüllen. Die Kombination von
diesen Aktivitäten erzeugen somit DNA-Segmente mit einem glatten Ende. Die Segmente mit
einem glatten Ende werden dann mit einem großen molaren Überschuss von Linker-
Molekülen in Gegenwart eines Enzyms inkubiert, welches in der Lage ist, die Ligation der
DNA-Moleküle mit einem glatten Ende zu katalysieren, wie die Bakteriophagen T4 DNA-
Ligase. Die Produkte dieser Reaktion sind somit DNA-Segmente, die an ihren Enden die
polymeren Linkersequenzen tragen. Diese DNA-Segmente werden dann mit einem
geeigneten Restriktionsenzym geschnitten und in einen Expressionsvektor eingebracht, der
mit einem Enzym geschnitten wurde, welches Enden produziert, die mit denen des DNA-
Segmentes kompatibel sind.
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Synthetische Linker, die eine Vielzahl an Restriktionsendonukleasen-Orten enthalten,
sind kommerziell verfügbar von einer Reihe von Unternehmen, einschließlich International
Biotechnologies, Inc., New Haven, CT..
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Von der vorliegenden Erfindung sind auch die RNA-Äquivalente der oben
beschriebenen, rekombinanten DNA-Moleküle umfasst.
E. Transformierte Zellen und Kulturen
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Wirtszelle, die mit einem
rekombinanten Nukleinsäuremolekül nach der Erfindung transformiert ist, vorzugsweise eine
rDNA, die zur Expression eines Polypeptides gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage
ist. Die Wirtszelle kann entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein.
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Die begriffe "Zellen" oder "transformierte Wirtszellen" oder "Wirtszellen" werden oft
gegenseitig austauschbar verwendet, wie dies aus dem Zusammenhang klar wird. Die
Ausdrücke umfassen die direkte Zelle nach der Erfindung und selbstverständlich auch deren
Nachkommen. Es sei angemerkt, dass nicht alle Nachkommen exakt identisch mit der
Wirtszelle sind aufgrund von zufälligen Mutationen oder Unterschieden in der Umgebung.
Solche veränderten Nachkommen sind jedoch von den obigen Begriffen umfasst.
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Bakterielle Zellen sind bevorzugte prokaryotische Wirtszellen und stellen in typischer
Weise einen Stamm von E. coli dar, wie beispielsweise der E. coli Stamm DH5, der verfügbar
ist von Bethesda Research Laboratories, Inc., Bethesda, MD.. Bevorzugte eukaryotische
Wirtszellen umfassen Hefezellen und Säugetierzellen, vorzugsweise Wirbeltierzellen, wie
solche von der Maus, der Ratte, dem Affen oder eine menschliche Fibroplastenzelllinie.
Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen umfassen Eizellen vom chinesischen Hamster (CHO),
die von ATCC als CCL61 verfügbar sind, sowie NIH schweizerische Mausembryozellen
NIH/3T3, die verfügbar sind von ATCC als CRL 1658. Die Transformation von geeigneten
Wirtszellen mit einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül gemäß der vorliegenden Erfindung
wird durch bekannte Verfahren durchgeführt, die von dem Typ des verwendeten Vektors
abhängig sind. Hinsichtlich der Transformation von prokaryotischen Wirtszellen sei
beispielsweise verwiesen auf Cohen, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972) und
Maniatis, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY (1982). Hinsichtlich der Transformation von Wirbeltierzellen mit
rekombinanten Nukleinsäuremolekülen, die retrovirale Vektoren enthalten, sei beispielsweise
verwiesen auf Sorge, et al. Mol. Cell. Biol., 4: 1730-37 (1984); Graham, et al. Virol., 52: 456
(1973) und Wigler, et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 76: 1373-76 (1979).
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Erfolgreich transformierte Zellen, das heißt Zellen, die ein rekombinantes
Nukleinsäuremolekül nach der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch bekannte
Techniken identifiziert werden. Zellen, die von der Einführung einer rDNA nach der
vorliegenden Erfindung abstammen, können beispielsweise kloniert werden, um monoklonale
Kolonien herzustellen. Zellen von solchen Kolonien werden dann geerntet, lysiert und ihr DNA-
Gehalt wird auf die Gegenwart der rDNA überprüft, wobei ein Verfahren verwendet wird, das
beschrieben ist von Southern, J. Mol. Biol., 98: 503 (1975) oder Berent, et al. Biotech., 3: 208
(1985).
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Zusätzlich zu dem direkten Nachweis der Gegenwart von rDNA kann eine erfolgreiche
Transformation auch durch bekannte immunologische Verfahren bestätigt werden, wenn die
rDNA zur Steuerung der Expression eines Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung in
der Lage ist. Zellen, die erfolgreich mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, der mit
einem DNA-Segment operativ verbunden ist, stellen Polypeptide her, die eine Antigenität
anzeigen. Eine Probe einer Zellkultur, von der angenommen wird, dass die transformierte
Zellen enthält, wird geerntet und auf ein Polypeptid geprüft, welches alternierende hydrophobe
und hydrophile Aminosäureregionen gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt, wobei
Antikörper verwendet werden, die für dieses Antigen spezifisch sind. Die Herstellung und die
Verwendung von solchen Antikörpern sind gut bekannt im Stand der Technik.
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Zusätzlich zu den transformierten Wirtszellen selbst umfasst die vorliegende Erfindung
auch eine Kultur von solchen Zellen in einem Nährmedium, vorzugsweise eine monoklonale
(klonal homogen) Kultur oder eine Kultur, die von einer monoklonalen Kultur abstammt. Die
Kultur enthält vorzugsweise auch ein Polypeptid oder ein Protein, welches die oben erwähnte
Antigenität anzeigt, wobei mehr bevorzugt ein biologisch aktives Polypeptid ist, das nützlich ist
in oberflächenwirksamen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung.
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Die Nährmedien, die für die Kultur von transformierten Wirtszellen nützlich sind, sind im
Stand der Technik gut bekannt und können von verschiedenen kommerziellen Quellen
erhalten werden. Bei Ausführungen, wo die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist, wird bevorzugt
"Serum-freies" Medium verwendet.
F. Rekombinante Verfahren für die Herstellung von Polypeptiden
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Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur
Herstellung von Polypeptiden, insbesondere von Polypeptiden, die eine oberflächenwirksame
Aktivität zeigen. Das Verfahren erfordert das Anlegen einer Kultur, die ein Nährmedium
umfasst, das Wirtszellen enthält, vorzugsweise menschliche Zellen, welche mit einem rDNA-
Molekül nach der vorliegenden Erfindung transformiert sind, das zur Expression eines
Polypeptids gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage ist. Die Kultur wird für einen
Zeitraum aufrecht erhalten, der ausreichend ist, damit die transformierten Zellen das
Polypeptid exprimieren können. Das exprimierte Protein oder Polypeptid wird dann aus der
Kultur gewonnen.
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Verfahren zur Gewinnung eines exprimierten Proteins aus einer Kultur sind im Stand der
Technik gut bekannt und umfassen die Fraktionierung des Protein enthaltenden Teils der
Kultur, wobei bekannte biochemische Techniken verwendet werden. Verfahren der
Gelfiltration, der Gelchromatographie, der Ultrafiltration, der Elektrophorese, des Ionenaustausches,
der Affinitätschromatographie und ähnliches sind beispielsweise für Proteinfraktionierungen
gut bekannt und können verwendet werden, um die in der Kultur gefundenen, exprimierten
Proteine zu isolieren. Zusätzlich können immunochemische Verfahren, wie die Immunoaffinität
und die Immunoabsorption und ähnliches, unter Anwendung von bekannten Methoden
durchgeführt werden.
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Von der Erfindung ist auch ein Polypeptid umfasst, vorzugsweise ein Polypeptid, das
eine oberflächenwirksame Aktivität zeigt, welches von einem der hier beschriebenen,
rekombinanten Nukleinsäureverfahren hergestellt wird.
G. Zusammensetzungen, die ein Polypeptid enthalten
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Die vorliegende Erfindung sieht eine Polypeptid enthaltende Zusammensetzung vor
(Polypeptid- oder Proteinzusammenseztung nach der Erfindung), wobei das Polypeptid
entweder im wesentlichen in isolierter oder im wesentlichen in reiner Form vorhanden ist. Mit
"isoliert" ist gemeint, dass das Polypeptid als Teil einer Zusammensetzung frei von anderen
Polypeptiden oder Proteinen vorliegt, die eine oberflächenwirksame Aktivität zeigen.
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Mit "im wesentlichen rein" ist gemeint, dass ein Polypeptid nach der Erfindung als Teil
einer Zusammensetzung frei von anderen Polypeptiden oder Proteinen vorliegt.
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"Oberflächenwirksame Aktivität" für ein Protein oder ein Polypeptid ist als die Fähigkeit
definiert, alleine oder in Kombination mit anderen Proteinen sowie in Kombination mit Lipiden
eine Aktivität in dem in vivo Assay von Robertson, Lung, 158: 57-68 (1980) zu zeigen. Bei
diesem Test wird die zu prüfende Probe durch einen Endotrachealtubus fetalen Kaninchen
oder Lämmern verabreicht, wobei mit einem Kaiserschnitt Frühgeburten eingeleitet werden
(diesen "Frühgeburten" fehlt ihre eigene PS und werden durch einen Ventilator unterstützt). Die Messungen der Lungencompliance, der Blutgase und des Ventilatordrucks stellen
Aktivitätsindices bereit. Eine vorläufige Bestimmung der Aktivität kann auch mit einem in vitro
Test durchgeführt werden, zum Beispiel mit dem Test von King, et al. Am. J. Physiol., 223:
715-726 (1972) oder mit dem unten gezeigten Test, der eine Messung der
Oberflächenspannung an der Luft-Wasser-Grenzfläche verwendet, wenn ein Protein oder ein Polypeptid
mit einem Phospholipid gemischt wird.
H. Synthetische, oberflächenwirksame Mittel
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Rekombinant hergestellte Polypeptide, die eine oberflächenwirksame Aktivität zeigen,
und/oder ein Polypeptid nach der Erfindung können mit einem pharmazeutisch akzeptablen
Phospholipid gemischt werden, um ein synthetisches, pulmonales, oberflächenwirksames
Mittel (PS) herzustellen, welches bei der Behandlung des Atemnotsyndroms nützlich ist.
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Der Ausdruck "pharmazeutisch akzeptabel" bezieht sich auf molekulare Einheiten und
Zusammensetzungen, die keine allergische oder ähnlich ungünstige Reaktion bewirken, wenn
sie einem Menschen verabreicht werden.
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Phospholipide, die für die Herstellung von synthetischen, alveolaren,
oberflächenwirksamen Mittel durch Beimischung mit einem Protein nützlich sind, sind im
Stand der Technik gut bekannt. Hinsichtlich einer Übersicht für native und synthetische
Phospholipide für synthetische, oberflächenwirksame Mittel sei auf Notter, et al. Clin.
Perinatology, 14: 433-79 (1987) verwiesen.
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Nach einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein synthetisches
pulmonales, oberflächenwirksames Mittel, welches für die Behandlung von RDS wirksam ist
und das eine wirksame Menge eines Polypeptides nach der Erfindung umfasst, das mit einem
pharmazeutisch akzeptablen Phospholipid gemischt ist. Während Verfahren zur Bestimmung
der optimalen Gewichtsverhältnisse von Polypeptid : Phospholipid für eine gegebene
Polypeptid-Phospholipid Kombination gut bekannt sind, liegen die therapeutisch wirksamen
Verhältnisse in dem Bereich von etwa 1 : 5 bis etwa 1 : 10.000, vorzugsweise bei etwa 1 : 100 bis
etwa 1 : 5.000, wobei etwa 1 : 500 bis etwa 1 : 1.000 mehr bevorzugt ist. Nach einer mehr
bevorzugteren Ausführungsform liegt das Gewichtsverhältnis von Polypeptid : Phospholipid in
dem Bereich von etwa 1 : 5 bis etwa 1 : 2.000, vorzugsweise bei 1 : 7 bis etwa 1 : 1.000, wobei
etwa 1 : 10 bis etwa 1 : 100 mehr bevorzugt ist. Somit kann ein synthetisches, pulmonales,
oberflächenwirksames Mittel nach der Erfindung etwa 50, normalerweise etwa 80 und bis zu
fast 100 Gewichtsprozent Lipid und etwa 50, normalerweise etwa 20 und bis zu weniger als 1
Gewichtsprozent Polypeptid enthalten. Vorzugsweise liegt das Polypeptid für solche
Polypeptide, die alternierende, hydrophobe und hydrophile Aminosäureregionen haben, zu
etwa 1 bis etwa 10 Gewichtsprozent des oberflächenwirksamen Mittels vor.
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Der Lipidanteil beträgt vorzugsweise etwa 50 bis etwa 90 mehr bevorzugt etwa 50 bis
etwa 75 Gewichtsprozent Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), wobei die verbleibenden
Anteile auf ungesättigtes Phosphatidylcholin, Phosphatidylglycerin (PG), Triacylglycerine,
Palmitinsäure-Sphingomyelin oder Mischungen davon entfallen. Das synthetische, pulmonale,
oberflächenwirksame Mittel wird hergestellt durch Mischen einer Lösung eines Polypeptides
nach der Erfindung mit einer Suspension von Liposomen oder durch Mischen des
Polypeptides nach der Erfindung und der Lipide direkt in Gegenwart eines organischen
Lösungsmittels. Das Lösungsmittel wird dann durch Dialyse oder Verdampfen unter Stickstoff
und/oder Vakuumexposition entfernt.
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Das synthetische, pulmonale, oberflächenwirksame Mittel wird vorzugsweise formuliert
für eine endotracheale Verabreichung, zum Beispiel typischerweise als eine
Flüssigsuspension, als Trockenpulver "Staub" oder als ein Aerosol. Ein synthetisches
oberflächenwirksames Mittel (Polypeptid-Lipid-Mizette) wird beispielsweise in einer Flüssigkeit
mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff, wie Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose,
Glycerin und ähnliches, suspendiert. Eine therapeutische Zusammensetzung mit einem
oberflächenwirksamen Mittel kann auch geringe Mengen von nicht-toxischen Hilfssubstanzen
enthalten, wie pH-Puffermittel, einschließlich Natriumacetat, Natriumphosphat und ähnliches.
Um ein synthetisches oberflächenwirksames Mittel in Staubform herzustellen, wird ein
synthetisches, oberflächenwirksames Mittel, wie hier beschrieben, hergestellt, dann
lyophilisiert und als Trockenpulver gewonnen.
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Falls es in einer Aerosolverabreichung verwendet werden soll, wird ein synthetisches
oberflächenwirksames Mittel in feiner Form zusammen mit einem zusätzlichen
oberflächenwirksamen Mittel und einem Treibmittel zugeführt. Typische oberflächenwirksame
Mittel, die verabreicht werden können, sind Fettsäuren und Ester. Im vorliegenden Fall ist
jedoch bevorzugt, die anderen Komponenten des oberflächenwirksamen Komplexes DPPC
und PG zu verwenden. Nützliche Treibmittel sind in typischer Weise Gase bei
Umgebungszuständen, die unter Druck kondensiert werden. Niederes Alkan und fluoriertes
Alkan, wie Freon, können verwendet werden. Das Aerosol wird in einen Behälter gepackt, der
mit einem geeigneten Ventil ausgerüstet ist, so dass die Inhaltsstoffe unter Druck gehalten
werden können, bis sie freigesetzt werden.
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Ein synthetisches oberflächenwirksames Mittel wird gemäß einer geeigneten
Dosisformulierung mit einem Endotrachealtubus, durch Aerosolverabreichung oder durch
Versprühen der Suspension oder des Staubes in die eingeatmeten Gase verabreicht. Die
Mengen des synthetischen PS betragen zwischen etwa 0,1 mg und etwa 100 mg,
vorzugsweise etwa 70 mg bis etwa 90 mg, und werden in einer Dosis verabreicht. Bei
Verwendung für Neugeborene ist im allgemeinen eine oder zwei Verabreichungen
ausreichend. Für Erwachsene wird ein ausreichend rekonstituierter Komplex verabreicht, um
ein PO&sub2; innerhalb des normalen Bereiches herzustellen (Hallman, et al, J. Clinical
Investigation, 70: 673-682, 1982).
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Die folgenden Beispiele dienen zur Darstellung, aber nicht zur Limitierung der
vorliegenden Erfindung. Einige Beispiele zeigen Verbindungen, die zur Erläuterung
angegeben sind, wobei sie aber nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst sind.
Beispiel 1
In vitro Bestimmung der oberflächenwirksamen Aktivität des Polypeptides
A. Methoden
1. Messung der Aktivität des oberflächenwirksamen Mittels
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Messungen des Oberflächendrucks entlang einer Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche
(ausgedrückt in negativen cm des H&sub2;O-Drucks) bei einem minimalen (8 Minuten) Blasenradius
wurden zu verschiedenen Zeiten unter Verwendung der pulsierenden Blasentechnik bestimmt,
die beschrieben ist von Enhorning, J. Appl. Physiol., 43: 198-203 (1977).
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Das Enhorning-Surfactometer (Surfactometer International, Toronto, Ontario) misst den
Druckgradienten (AP) entlang einer Flüssigkeit-Luft-Grenzfläche einer Blase, die mit einer
Rate von 20 Schwingungen/Minute zwischen einem maximalen (0,55 mm) und einem
minimalen (0,4 mm) Radius pulsiert. Die Blase, die in einer 37ºC, wasserumschlossenen, 20
ul Probenkammer gebildet wird, wird durch eine mikroskopische Optik überwacht, wobei die
Druckveränderungen mit einem auf Null und -2 cm H&sub2;O kalibrierten Bandschreiber
aufgezeichnet werden.
2. Bestimmung des zusammengesetzten Hydrophobiewertes
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Der zusammengesetzte Hydrophobiewert von jedem Peptid wurde bestimmt, indem
jedem Aminosäurerest in einem Peptid der entsprechende Hydrophiliewert zugeordnet wird,
wie dies in der Tabelle 1 von Hopp, et al. Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 78: 3824-3829 (1981)
beschrieben ist, wobei diese Publikation hiermit durch Verweis eingeführt ist. Für ein
gegebenes Peptid werden die Hydrophiliewerte addiert und die Summe stellt den
zusammengesetzten Hydrophiliewert dar.
3. Herstellung der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel
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Nach Mischung mit einem Lösungsmittel wurde jedes Peptid mit Phospholipiden
(DPPC : PG), 3 : 1, kombiniert, um ein synthetisches, oberflächenwirksames Mittel gemäß einem
der folgenden Verfahren zu bilden.
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Das Verfahren A wurde durchgeführt, indem 16 ul einer Peptid/Lösungsmittel-Mischung
(40 ug Peptid) mit 100 ul Chloroform, welches 400 ug Phospholipide enthielt, gemischt
wurden. Die Mischung wurde für etwa 10 Minuten bei 37ºC gerührt, um eine
Peptid/Phospholipid-Mischung zu bilden. Das Chloroform wurde durch Trocknung unter N&sub2; aus
der Peptid/Phospholipid-Mischung entfernt. Das synthetische, oberflächenwirksame Mittel
wurde dann mit 90 ul H&sub2;O gemischt und für etwa 10 Minuten bei 37ºC langsam gerührt.
Anschließend wurden 10 ul von 9% NaCl der Lösung, welche das oberflächenwirksame Mittel
enthielt, zugegeben.
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Das Verfahren B wurde durchgeführt, indem zunächst 100 ul Chloroform, welches 400
ug Phospholipide enthielt, in einer Glasröhre angeordnet wurden, wobei das Chloroform dann
durch Trocknung unter N&sub2; für etwa 10 Minuten bei 37ºC entfernt wurde. 16 ul der
Peptid/Lösungsmittel-Mischung und 74 ul H&sub2;O wurden mit den getrockneten Phospholipiden
gemischt und dann vorsichtig für etwa 10 Minuten bei 37ºC gerührt. Zu dem synthetischen,
oberflächenwirksamen Mittel, das so hergestellt wurde, wurden 10 ul von 9% NaCl
zugegeben.
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Das Verfahren C wurde durchgeführt, indem zunächst die Polypeptid-PL-Mischung bei
43ºC für 10 Minuten gehalten wurde und anschließend die Lösungsmittel aus der Mischung
durch Trocknung unter N&sub2; entfernt wurden. Falls notwendig, wurden die Mischungen weiter bei
15 Minuten unter Vakuum getrocknet, um eine getrocknete Polypeptid-PL-Mischung
herzustellen. Wasser wurde dann zu jeder getrockneten Mischung in einer Menge zugegeben,
das 90% des Volumens vorlag, welches notwendig ist, um eine PL-Endkonzentration von 5
oder 10 mg/ml zu erzielen, wobei so eine zweite Mischung hergestellt wurde. Diese zweite
Mischung wurde dann für eine Stunde bei 43ºC unter Rühren gehalten. Anschließend wurde
ein Volumen von 6% NaCl, das 10% des Volumens entsprach, das notwendig ist, um die
gewünschte PL-Konzentration zu erzielen, mit der zweiten Mischung gemischt und die erzielte
Endmischung wurde für 10 Minuten bei 43ºC gehalten. In den meisten Fällen wurde die
Endmischung in einem letzten Schritt drei Kreisläufen von Einfrieren und Auftauen
unterzogen.
4. Octylglucopyranosid-Test
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Ein Test für die Quantifizierung von n-Octyl-beta-D-glucopyranosid, der auf dem
Anthron-Verfahren von Spiro, Methods Enzymol., 8: 3-5 (1966) beruht, wurde zuvor
beschrieben von Revak, et al. Am. Rev. Respir. Dis., 134: 1258-1265 (1986).
5. Proteinbestimmungen
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Organische Proben, die bis zu 5 ug Protein enthielten, wurden unter Stickstoff in 12 · 75
mm Glasröhrchen getrocknet.
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15 ul von 1% SDS in H&sub2;O und 300 ul BCA Protein Assay Reagens (Pierce Chemical
Co., Rockford, IL) wurden mit dem Protein in jedem Röhrchen gemischt. Die Röhrchen wurden
abgedeckt und bei 60ºC für 30 Minuten inkubiert. Nach Abkühlung wurden die Proben zu
einer Polystyrol-Mikrotiterplatte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen überführt und die
OD&sub5;&sub5;&sub0; wurden gemessen. Rinderserumalbumin wurde als Standard verwendet. Es sei
angemerkt, dass einige Phospholipide in dem BCA-Proteintest reagieren, was die
Proteinquantifizierungen ungenau werden lässt, wenn Lipid anwesend ist (das heißt, vor der
Bio-Sil HA Chromatographie). Ferner reagieren die hydrophoben LMW Apoproteine, wenn sie
einmal gereinigt sind, selbst schwach mit den BCA-Reagenzien und alle Quantifizierung der
isolierten Proteine basierten somit auf den Aminosäurezusammensetzungen.
6. Phospholipide
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Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC, beta, gamma-Dipalmitoyl-L-alpha-lecithin) und L-
alpha-phosphatidyl-DL-glycerol (PG, Derivat von Eilecithin) wurden gekauft entweder von
Calbiochem-Behring (La Jolla, CA) oder von Avanti Polar-Lipids, Inc. (Birmingham, AL). DPPC
wurde zu PG in Chloroform in einem Gewichtsverhältnis von 3 : 1 zugesetzt.
7. Tests auf oberflächenwirksame Aktivitäten
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In vitro Tests der oberflächenwirksamen Aktivität, die auf der Fähigkeit beruht, die
Oberflächenspannung einer pulsierenden Blase zu erniedrigen, sowie in vivo Tests, wobei
fetale Kaninchen verwendet wurden, wurden jeweils im Detail beschrieben von Revak, et al.
Am. Rev. Respir. Dis., 134: 1258-1265 (1986).
8. Morphometrische Analysen
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Fetale Kaninchenlungen, die mit 30 cm H&sub2;O aufgebläht und dann wieder auf 10 cm H&sub2;O
entleert wurden, wurden in 10% Formalin für 72 Stunden eingetaucht. Paraffinabschnitte
wurde vom Apex bis zur Basis ausgerichtet und 5 Micron-Abschnitte wurden von anterior zu
posterior genommen. Nach Hematoxylin- und Eosinanfärbung wurden 10 Felder (100 x) vom
Apex bis zur Basis auf mehreren Abschnitten auf Punktbasis ausgewertet. Standartisierte,
morphometrische Verfahren (Weiber, in "Stereological Methods," Bd. I, Academic Press, New
York, S. 33-58, 1979) wurden verwendet, um die Anteile von Lungeninterstitium zu
Hohlräumen für jede Behandlungsgruppe zu bestimmen. Schnitte von Lungenperimetern
wurden auch bestimmt.
9. Phopholipid-Phosphortests
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Phospholipide wurden quantitativ gemäß dem Verfahren von Bartlett, J. Biol. Chem.,
234: 466-468 (1959) bestimmt.
10. Aminosäureanalyse
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Dreifach Proben von Aminosäurezusammensetzungen wurden mit HCl bei 110ºC für 24
Stunden, mit HCl bei 150ºC für 24 Stunden oder in Perameisensäure bei 110ºC für 24
Stunden, gefolgt von einer HCl-Hydrolyse bei 110ºC für 24 Stunden hydrolysiert. Die
Analysen wurden durchgeführt auf einem Beckman-Modell 121-M Aminosäure-Analyzer
(Beckman Instruments, Fullerton, CA). Tryptophan wurde nicht bestimmt.
11. Aminosäuresequenzierung
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Gasphasen-Proteinsequenzierung wurde durchgeführt auf einem Applied Biosystems
470A Aminosäuresequenziergerät (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) mit einem
online Modell 120A HPLC.
B. Ergebnisse
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Die in der folgenden Tabelle 2 dargestellten, synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel
wurden hergestellt, wie dies in der Tabelle angezeigt ist. Jedes der in der Tabelle 2
angezeigten, beispielhaften, synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel wurde hinsichtlich
seiner oberflächenwirksamen Aktivität überprüft, wobei die Fähigkeit zur Reduktion der
Oberflächenspannung in vitro bestimmt wurde, unter Verwendung des oben beschriebenen
"Blasentests" von Enhorning.
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Die Ergebnisse von dieser Studie zeigen, dass ein Polypeptid nach der Erfindung, wenn
es mit pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden gemischt wird, ein synthetisches,
pulmonales, oberflächenwirksames Mittel bildet, dass eine größere oberflächenwirksame
Aktivität besitzt als die des Phospholipids alleine, wie dies durch die niedrigeren ΔP-Werte
angezeigt ist. Bei diesen Polypeptiden wurden 10% bis 80% niedrigere ΔP-Werte erzielt.
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Jedes Polypeptid wurde mit dem angezeigten Lösungsmittel mit einer Konzentration von
2,5 mg Polypeptid pro ml Lösungsmittel gemischt. Die erzielte Mischung wurde beobachtet,
um zu bestimmen, ob eine Lösung oder eine Suspension des unlöslichen Polypeptids sich
bildete. Solche Mischungen, die eine Suspension bildeten, wurde ferner durch Beschallung im
Wasserbad für 10 Sekunden vermischt, um eine sehr feine Suspension herzustellen, die für
ein Pipettieren mit Glaspipetten ausreichend war.
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Nach Mischung mit dem Lösungsmittel wurde jedes Peptid mit Phospholipiden (PL),
DPPC : PG, 3 : 1, in Chloroform in einem Glasröhrchen gemischt, so dass die Menge des
zugefügten Polypeptides 1/10 (10 Gewichtsprozent) der Menge des zugefügten PL entsprach,
wobei dann ein synthetisches, oberflächenwirksames Mittel gemäß einem der Verfahren A, B,
oder C gebildet wurde.
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Jedes der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel wurde dann auf seine
oberflächenwirksame Aktivität überprüft, was ihre Fähigkeit anzeigt, die Oberflächenspannung
in vitro in dem oben beschriebenen Blasentest zu reduzieren. Der Druckgradient (ΔP) ist ein
Wert der oberflächenwirksamen Aktivität in der dritten Polypeptid-PL-Mischung, die unter
Verwendung eines Enhorning-Surfactometers, wie oben beschrieben, bestimmt wurde. Die
Messungen wurden an den Zeitpunkten 15 Sekunden (15"), 1 Minute (1') und 5 Minuten (5')
erzielt und als Mittel von drei unabhängigen Messungen der angezeigten Polypeptid-PL-
Mischung ausgedrückt. Die Messungen des Druckgradienten für Vergleichsproben von PL
alleine (PL) und von einem natürlichen, menschlichen, oberflächenwirksamen Mittel wurden
als Kontrollwerte bestimmt.
-
Die Resultate von dieser Studie sind in der Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
-
(1) Ob eine Anfangsmischung von Peptid und Phospholipid eine Lösung oder eine Suspension war,
ist angezeigt.
-
(2) Die Buchstaben bezeichnen das verwendete Herstellungsverfahren für das synthetische,
oberflächenwirksame Mittel. Diese Verfahren sind oben beschrieben. Ein "+" zeigt an, dass die
Endmischung einem letzten Schritt von drei Kreisläufen des Einfrierens und des Auftauens
unterworfen wurde. Ein "-" zeigt an, dass dieser Schritt nicht durchgeführt wurde.
-
(3) Konzentration ("Konz.") von Phospholipid (PL) in der dritten Endmischung ist in Milligramm PL pro
Milliliter Mischung (mg/ml) angezeigt.
-
(4) Der Druckgradient ist ein Wert der oberflächenwirksamen Aktivität in der Polypeptid-PL-
Endmischung, der unter Verwendung eines Enhorning-Surfactometers, wie dies im Beispiel 2
beschrieben wurde, bestimmt wurde. Die Messungen wurden an drei Zeitpunkten nach 15
Sekunden (15"), 1 Minute (1') und nach 5 Minuten (5') erzielt und sind als Mittel von drei
unabhängigen Messungen der angezeigten Polypeptid-PL-Mischung ausgedrückt. Die
Bestimmungen des Druckgradienten für die Vergleichsproben von PL alleine (PL) und von einem
natürlichem, menschlichen, oberflächenwirksamen Mittel sind auch gezeigt.
-
(5) Diese Lösungen wurden mit einer Konzentration von 20 mg/ml PL hergestellt und vor der Testung
auf 10 mg/ml verdünnt.
-
Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Polypeptid nach der Erfindung, wenn es mit
pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden gemischt wird, ein synthetisches, pulmonales,
oberflächenwirksames Mittel bildet, welches eine größere oberflächenwirksame Aktivität
besitzt als die der Phospholipide alleine, wie dies durch das größere Volumen pro
vorgegebenem Druck gezeigt ist.
Beispiel 2
In vivo Bestimmung der Aktivität des synthetischen, oberflächenwirksamen Mittels bei
Kaninchen
A. Verfahren
1. Herstellung des synthetischen, oberflächenwirksamen Mittels
-
Ein Polypeptid nach der Erfindung wurde zunächst mit einem Lösungsmittel, wie hier
beschrieben, gemischt. Die erzielte Mischung wurde dann mit einem Phopholipid (PL)
vermischt, so dass die Menge des zugesetzten Polypeptides entweder 3%, 7% oder 10%
auf Gewichtsbasis in Bezug auf die Menge des zugesetzten PL betrug, wie dies unten
angezeigt ist. Das Endpolypeptid und die PL Mischung (synthetisches, oberflächenwirksames
Mittel) wurde gemäß dem Verfahren C unter Verwendung des Gefrier-Auftau-Endschrittes
hergestellt, wie dies im Detail im Abschnitt "Herstellung der synthetischen,
oberflächenwirksamen Mittel" im Beispiel 1, Abschnitt 3 beschrieben ist, wobei aber die
Endmischung eine Konzentration von 20 mg Phospholipid pro ml Endmischung hatte.
2. Instillationsprotokolle
-
Protokoll 1: Fetale Kaninchen wurden mit einer Injektion in die Luftröhre behandelt,
wobei eine 0,1 ml Lösung injiziert wurde, die entweder ein im Beispiel 1 hergestelltes,
synthetisches, oberflächenwirksames Mittel oder 2 mg eines nativen, oberflächenwirksamen
Mittels, welches gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt wurde, oder 2 mg PL
enthielt.
-
Protokoll 2: Das synthetische, oberflächenwirksame Mittel wurde in die Lunge von dem
fetalen Kaninchen mittels Injektion in die Luftröhre und unter Verwendung einer einzelnen
Spritze gemäß den folgenden drei Komponenten eingeführt, wobei die Komponenten die
Spritze in der folgenden Reihenfolge verließen: (1) 0,05 ml Luft; (2) 0,1 ml eines in Beispiel 1
hergestellten, synthetischen, oberflächenwirksamen Mittels oder 2 mg von PL oder 2 mg des
nativen, oberflächenwirksamen Mittels; und (3) 0,1 ml Luft.
-
Protokoll 3: Aus einer Spritze wurde ein 0,1 ml Aliquot eines synthetischen,
oberflächenwirksamen Mittels, das gemäß der Beschreibung von Beispiel 1 hergestellt wurde,
(oder 2 mg von NS oder von PL) in die Kaninchen-Luftröhre, wie oben beschrieben, eingeführt
und nachfolgend wurde 0,05 ml Ringer-Lactat-Lösung und 0,2 ml Luft aus einer zweiten
Spritze injiziert.
-
Protokoll 4: Aus einer Spritze wurden 0,1 ml eines synthetischen, oberflächenwirksamen
Mittels, das gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt wurde, (oder 2 mg von NS oder
von PL), 0,15 ml Luft, 0,1 ml Kochsalzlösung und 0,3 ml Luft in die Luftröhre, wie oben
beschrieben, injiziert. Es wurden zwei nachfolgende Aliqouots von 0,3 ml Luft gegeben.
-
Protokoll 5: Fetale Kaninchen wurden mit einer Iniektion die Luftröhre aus einer
einzelnen Spritze mit den folgenden vier Komponenten behandelt, so dass die vier
Komponenten die Spritze bei der Injektion in der folgenden Reihenfolge verließen: (1) 0,2 ml,
die entweder das in Beispiel 1 hergestellte, synthetische, oberflächenwirksame Mittel oder 4
mg des nativen, oberflächenwirksamen Mittels oder 4 mg PL enthielten; (2) 0,15 ml Luft; (3)
0,1 ml normale Kochsalzlösung; und (4) 0,3 ml Luft. Die obige Injektion wurde dann 15
Minuten nach der ersten Injektion wiederholt.
-
Protokoll 6: Kaninchen wurden gemäß Protokoll 5 behandelt, wobei aber zwei
nachfolgende Aliquots von 0,3 ml Luft nach der Anfangsinstilliation verabreicht wurden und
keine zusätzliche Instillation nach 15 Minuten.
3. Fetales Kaninchenmodell für die Untersuchung der oberflächenwirksamen
Aktivität
-
Die oberflächenwirksame Aktivität von beispielhaften Polypeptiden nach der Erfindung
wurde untersucht unter Verwendung der Verfahren, die im Detail zuvor beschrieben wurden
von Revak, et al. Am. Rev. Respir. Dis., 134: 1248-1256 (1986), wobei die Ausnahmen unten
beschrieben sind.
-
Fetale Kaninchen nach 27-tägiger Schwangerschaft wurden mittels Hysterotomie
erhalten. Es wurden ihnen sofort 0,05 ml Norcuron (Organon, Inc., NJ) injiziert, um ein
spontanes Atmen zu verhindern. Die fetalen Kaninchen wurden dann gewogen und eine kleine
Kanüle wurde mittels Luftröhrenschnitt in die Luftröhre eingeführt. Das gemäß der obigen
Beschreibung hergestellte, synthetische, oberflächenwirksame Mittel wurde dann in die Lunge
des fetalen Kaninchens durch eines der obigen Instillationsprotokolle eingeführt.
-
Nach der Instillation wurde das Kaninchen in einen besonders aufgebauten
Plethysmographen (enthaltend einen Celesco-Transducer), verbunden mit einem Ventilator
(Baby Bird, Baby Bird Corp., Palm Springs, CA) angeordnet und die instillierte Lunge wurde
mit einer Rate von 30 Kreisläufen pro Minute mit einem Peak-Einatmungsdruck von 25 cm
H&sub2;O, einem positiven Endausatmungsdruck von 4 cm H&sub2;O und einer Atmungszeit von 0,5
Sekunden beatmet. Bei einigen Studien wurden dynamische Compliancemessungen zu
verschiedenen Zeiten während des Beatmungsverfahrens vorgenommen. Bei anderen
Studien wurden nach der Beatmung statische Compliancemessungen durchgeführt.
-
Statische Compliancemessungen wurden 30 Minuten nach der Ventilation durchgeführt.
Die Tiere wurden aus dem Ventilator entfernt und die Lungen wurden bei -20 cm H&sub2;O in einer
Glasglocke unter Vakuum entgast. Die Lungen wurden dann aufgebläht und wieder entleert
über einen T-Stecker, der mit einem Luftröhrenkatheter verbunden war. Das Luftvolumen,
welches erforderlich war, um statische Drücke von 5, 10, 15, 20, 25 und 30 cm H&sub2;O zu
erreichen, wurde während der Inflationsphase und der Deflationsphase gemessen, um den
statischen Druck zu den Volumenkurven zu bestimmen als Maß der statischen Compliance.
-
Unter Verwendung des Plethysmographen wurden zu verschiedenen Zeiten dynamische
Compliancemessungen während einer 60-minütigen Ventilationsperiode durchgeführt. Eine
mit Computerunterstützung durchgeführte Datenanalyse führte zu Compliancedaten, die als
ml Luft pro cm H&sub2;O pro Gramm Körpergewicht zu jedem Zeitpunkt ausgedrückt sind. Die
Compliance wurde durch die folgende Formel berechnet.
-
Compliance = ΔV/ΔP
-
ΔPtp = (C)&supmin;¹·(ΔV) + (R)·(F)
-
Ptp = transpulmonaler Druck
-
C = Compliance (elastische Komponente - bezieht sich auf die Änderung
im Volumen zum Druck)
-
R = Widerstand (bezieht sich auf die Strömung zum Druck)
-
F = Strömung
-
V = Volumen = das Integral der Strömung bezogen auf die Zeit
-
Die obige Gleichung wurde mit einer multiplen linearen Regression für C und R gelöst.
Die Compliance (C) stellt die elastische Natur der Lungen dar und der Widerstand (R) stellt
den Druck dar, der notwendig ist, um den Widerstand eines Gasstromes in die Lunge und aus
der Lunge heraus zu überwinden.
-
Die in den Tabellen 3-5 gezeigten Studien wurden, wie oben dargestellt, durchgeführt,
wobei eine Reihe von synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel verwendet wurden, die
gemäß den hier offenbarten Verfahren und Parametern hergestellt wurden. Synthetische,
oberflächenwirksame Mittel, die aus RL2, RL4, RL4-CYS oder aus RL8 Peptiden oder aus
"Mehrfachen" von RL4 (zum Beispiel (RL4) &sub6;R) bestanden, wurden mit einem
oberflächenwirksamen Phospholipidmittel verglichen, welches kein Peptid oder Protein enthielt
("oberflächenwirksames Kontrollmittel"). Unter Verwendung des Plethysmographen wurden
die dynamischen Compliancemessungen zu verschiedenen Zeiten während eines 60-
minütigen Ventilationszeitraumes durchgeführt. Die Datenanalyse führte zu Compliancedaten,
die als ml Luft pro H&sub2;O pro Gramm Körpergewicht · 10&sup6; bei jedem Zeitpunkt ausgedrückt sind.
Die Compliance wurde gemäß der oben erwähnten Formel berechnet.
-
Für die in den Tabellen 3 und 4 gezeigten Studien wurden die synthetischen,
oberflächenwirksamen Lösungen gemäß den folgenden Anteilen an DPPC, PG und Peptid
hergestellt. DPPC: 15 mg/ml; PG: 5 mg/ml und Peptid: 2 mg/ml. Bei den Studien der Tabelle 3
wurden die verabreichten Lösungen, die auch Palmitinsäure enthielten, mit einem "+" Symbol
gekennzeichnet, während solche, die keine Palmitinsäure enthielten, mit einem "-"
gekennzeichnet sind. Das Verabreichungsprotokoll 4 wurde bei den in den Tabellen 3 und 4
dargestellten Studien verwendet.
-
Die Tabelle
4 und die Fig. 4 zeigen den Effekt der Verabreichung von verschiedenen
Formulierungen von RL4-haltigen, oberflächenwirksamen Mitteln auf die Lungenfunktion und
zeigen die Ergebnisse eines Versuchs, die optimale Länge eines RL4-haltigen Peptides zu
bestimmen. In der Tabelle 4 ist auch die in vivo Wirksamkeit eines Cystein enthaltenden,
synthetischen, oberflächenwirksamen Mittels dargestellt. In der Tabelle 4 und in der Fig. 4 ist
der durchschnittliche dynamische Compliancewert für die getesteten Tiere unter Verwendung
der angegebenen Formulierung gegen die Zeit in Minuten nach Verabreichung des
oberflächenwirksamen Mittels aufgetragen. Das oberflächenwirksame Mittel wurde gemäß
Protokoll 4, wie oben beschrieben, verabreicht.
B. Resultate
-
Die statischen Compliancedaten, die mit den Instillationsprotokollen 1 und 5 erzielt
wurden, wurden gesammelt und analysiert (Daten nicht gezeigt). Eine verbesserte
Lungencompliance wurde in allen Lungen erzielt, die mit einem natürlichen,
oberflächenwirksamen Mittel oder mit den getesteten, synthetischen, oberflächenwirksamen
Mitteln behandelt wurden, im Vergleich zu solchen Lungen, die mit Phospholipiden (PL) alleine
behandelt wurden, wobei es nur eine Ausnahme gab. Das unter Verwendung von p1-15
hergestellte, synthetische, oberflächenwirksame Mittel führte zu keiner verbesserten
Lungencompliance gegenüber PL alleine, wenn dies durch statische Compliance gemessen
wurde.
-
Die Ergebnisse der dynamischen Compliancestudien sind in den Tabellen 3-5 und in
der Fig. 4 dargestellt.
Tabelle 3 Dynamische Compliance in ml Luft/cm H&sub2;O/g Körpergewicht · 10&sup6;
-
a: mit einem "+" bezeichnete Lösungen enthalten Palmitinsäure;
-
"-" bedeutet keine Palmitinsäure.
Tabelle 4 Dynamische Compliance in ml Luft/cm H&sub2;O/g Körpergewicht · 10&sup6;
Tabelle 5 Dynamische Compliance in ml Luft/cm H&sub2;O/g Körpergewicht · 10&sup6;
-
b n/d = nicht bestimmt c PTX = Pneumothorax
-
Wie in den Tabellen 3-5 gezeigt, verbesserten alle synthetischen
oberflächenwirksamen Mittel (und die natürlichen, oberflächenwirksamen Mittel) die
dynamischen Compliancewerte im Vergleich zum Phospholipid alleine.
C. Diskussion
-
Die in vivo Compliancestudien zeigen, dass die Verwendung einer Reihe von
beispielhaften, synthetischen, oberflächenwirksamen Mitteln nach der Erfindung zu einer
erhöhten Compliance im Vergleich zum Phospholipid alleine für jedes der getesteten,
synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel führte. Die Proteine und die Polypeptide nach der
Erfindung bilden, wenn sie mit pharmazeutisch akzeptablen Phospholipiden gemischt werden,
synthetische, oberflächenwirksame Mittel, die eine größere oberflächenwirksame Aktivität als
das Phospholipid alleine haben. Die Verwendung der synthetischen, oberflächenwirksamen
Mittel ist vorteilhaft bei der Erzeugung von verbesserten Compliancewerten in vivo.
-
Die hier beschriebenen Studien, die in den Tabellen 3-5 und in der Fig. 4 dargestellt
sind, zeigen, dass synthetische, oberflächenwirksame Mittel eine nennenswerte
therapeutische Verwendbarkeit zeigen. Die dynamischen Compliancewerte, die für alle
synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel beobachtet wurden, übersteigen signifikant solche
Werte, die für das Phospholipid alleine erzielt wurden. Ferner, da die dynamischen
Complianceteste klare Indikatoren für die in vivo Wirksamkeit in Säugetieren, einschließlich
dem Menschen, sind, ist es nicht überraschend, dass die hier beschriebenen Daten gut mit
den Primatendaten übereinstimmen, die in dem obigen Beispiel 3 diskutiert wurden.
-
Ferner ist die therapeutische Wirksamkeit, die durch diese in vivo dynamischen
Compliancestudien gezeigt wurde, konsistent mit den erzielten Ergebnissen, wenn die
gleichen Zusammensetzungen getestet wurden unter Verwendung der beschriebenen in vitro
Tests "pulsierende Blase", die im obigen Beispiel 1 beschrieben und dargestellt sind. Die in
vitro Tests "pulsierende Blase" der oberflächenwirksamen Aktivität, die hier beschrieben sind,
scheinen die in vivo Wirksamkeit vorher zu bestimmen können, insbesondere unter dem
Gesichtspunkt, dass die in vivo Studien, die hier beschrieben sind, die therapeutische
Wirksamkeit der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel, welche den offenbarten
Formulierungen entsprechen, belegen. Die signifikante Verbesserung in den dynamischen
Compliancewerten, die bei diesen in vivo Studien beobachtet wurden, belegen den
therapeutischen Wert der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel, die gemäß der hier
erfolgten Offenbarung hergestellt und verwendet werden.
Beispiel 3: In vivo Bestimmung der synthetischen, oberflächenwirksamen Aktivität unter
Verwendung von Primaten
A. Methoden
1. Herstellung der synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel
-
Ein Polypeptid wurde zunächst mit einem Lösungsmittel gemischt, wie dies in Beispiel 2
beschrieben ist. Die erzielte Mischung wurde ferner mit einem Phospholipid (PL) versehen, so
dass die Menge des zugesetzten Polypeptides entweder 3%, 7% oder 10% auf
Gewichtsbasis der Menge des zugesetzten PL, wie unten angezeigt, entsprach. Das
Endpolypeptid, die PL-Mischung (synthetisches, oberflächenwirksames Mittel) wurde gemäß
dem Verfahren C unter Verwendung des abschließenden Gefrier-Auftau-Schrittes erzielt, wie
dies im Detail beschrieben ist unter "Herstellung der synthetischen, oberflächenwirksamen
Mittel" von Beispiel 1, Abschnitt 3, wobei aber die Endmischung eine Konzentration von 20 mg
Phospholipid pro ml Endmischung hatte.
2. Fetales Affenmodell für das Studium der oberflächenwirksamen Aktivität
-
In vivo Studien wurden begonnen, um die Wirksamkeit der neuen Peptide (und der
synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel, welche diese Peptide enthielten), die in der oben
erwähnten Anmeldung beschrieben sind, zu bestätigen. Die oberflächenwirksamen Mittel, die
aus Phospholipid und RL4 oder KL4 Peptiden bestanden, wurden mit einem
oberflächenwirksamen Phospholipidmittel verglichen, welches kein Peptid oder Protein
("oberflächenwirksames Kontrollmittel") enthielt.
-
Gemäß den Standardprotokollen wurde mit fetalen Rhesusaffen nach etwa 128-131
Tagen Schwangerschaft gearbeitet. Ein Endotrachealtubus wurde dann durch einen
Luftröhrenschnitt eingeführt. Jeder Affe wurde dann mit einem Ventilator verbunden und ein
Katheter wurde in der Nabelarterie angeordnet, um Blutgase und den Blutdruck zu messen.
Ein zweiter Katheter wurde in die Nabelvene eingeführt, um eine Nähr-/Hydratisierungslösung
(D1OW) dem Affen zuzuführen. Nachdem die Tiere stabilisiert worden waren, wurde mit
Röntgenstrahlen das Vorhandensein und das Ausmaß des Atemnotsyndroms (RDS)
bestimmt. Verschiedene Parameter wurden eingestellt, um den Sauerstoffdruck (pO&sub2;) in dem
Bereich von 50-70 Torrund den Kohlendioxiddruck (pCO&sub2;) bei 45-50 Torr aufrecht zu
erhalten. Pulsoxymetrie wurde verwendet, um kontinuierlich die Hämoglobinsättigung des
arteriellen Blutes zu überwachen.
-
Als Oxygenierungsindex wurden die a/A (arteriell/Alveolar) O&sub2; Verhältnisse zu jedem
Zeitpunkt der Messung des arteriellen pO&sub2; berechnet. Diese Werte erlaubten zusammen mit
dem radiographischen Beweis und den klinischen Bestimmungen der Zustände der Affen die
Bestimmung der Gegenwart und der Schwere des RDS. Ein a/A Verhältnis von 0,2 bis 0,4
bestätigte die Gegenwart von RDS und Werte unterhalb 0,2 sind ein Anzeichen für ein
schweres RDS.
-
Nach Etablierung der Diagnose eines RDS wurde jeder Affe im allgemeinen mit
Atemunterstützung für zwei Stunden erhalten. Oberflächenwirksame Mittel, die das Peptid
enthielten oder die als Kontrolle dienten, wurden dann über eine Zuführungsröhre, die
unterhalb der Endotrachealröhre eingesetzt wurde, verabreicht. Eine Hälfte der Dosis des
synthetischen, oberflächenwirksamen Mittels wurde dem Tier gegeben, wobei es auf seiner
rechten Seite gehalten wurde, während die andere Hälfte der Dosis dem Tier gegeben wurde,
wobei es auf seiner linken Seite gehalten wurde. Bei den in den Fig. 2A und 2B
dargestellten Experimenten wurden Blindversuche durchgeführt, das heißt, die Person, welche
das synthetische, oberflächenwirksame Mittel verabreichte, war nicht darüber informiert,
welches oberflächenwirksame Mittel (das heißt, Peptid enthaltendes, oberflächenwirksames
Mittel oder oberflächenwirksames Phospholipid-Kontrollmittel) das Tier erhielt.
-
Die Atemunterstützung wurde für weitere 6-12 Stunden aufrecht erhalten und der
Zustand von jedem Tier wurde kontinuierlich überwacht. Zur Mitte des Experimentes sowie
präterminal wurden auch Röntgenaufnahmen genommen. Bei Beendigung des Experimentes
wurde jedes Tier getötet (durch Phenobarbital-Injektion) und es wurde eine Nekropsie
durchgeführt.
B. Ergebnisse
-
Die von den obigen Studien erzeugten Daten sind in den Fig. 1, 2 und 3 dargestellt.
Die Figuren zeigen das folgende an.
-
Fig. 1 zeigt den Effekt der Verabreichung eines oberflächenwirksamen Mittels, welches
RL4 enthält, auf die Lungenfunktion. In der Fig. 1A ist der Oxygenierungsindex (a/A) gegen
die Zeit nach Geburt des Tieres in Stunden aufgetragen. Das oberflächenwirksame Mittel
wurde in einer aufgeteilten Dosis verabreicht, wie oben beschrieben, und zwar etwa 28
Stunden nach Geburt des Tieres. In der Fig. 1B wurde einem zweiten Affen ein
synthetisches, oberflächenwirksames Mittel, das RL4 enthielt, in einer aufgeteilten Dosis, wie
oben beschrieben, während der ersten 2,5 Stunden nach Geburt verabreicht. Wie bei dem
ersten Affen (Fig. 1A) verbesserte sich das a/A Verhältnis in den Stunden nach
Verabreichung des Peptid-enthaltenden, oberflächenwirksamen Mittels dramatisch.
-
In den Fig. 2A und B ist der Effekt der Verabreichung eines synthetischen,
oberflächenwirksamen Mittels, das KL4 enthielt, hinsichtlich der Lungenfunktion dargestellt. In
der Fig. 2A und 2B sind die Daten von acht Affen gezeigt. Solche, bei denen später bestätigt
wurde, dass sie das synthetische, oberflächenwirksame Mittel mit KL4 erhalten haben, wurden
als die Affen mit den Nummern 6, 7, 8 und 10 identifiziert. Die Affen, die das andere
oberflächenwirksame Mittel erhielten (das heißt, ein Mittel, welches kein
oberflächenwirksames Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung enthielt) waren die Affen mit den
Nummern 3, 5, 9 und 11. In allen Diagrammen ist a/A gegen die Stunden nach Geburt
aufgetragen, wobei der Zeitpunkt der Verabreichung des oberflächenwirksamen Mittels
angezeigt ist.
-
Die Werte für den Endsauerstoff zeigen, dass die Tiere, die das oberflächenwirksame
Mittel mit dem Peptid erhielten, geringe Konzentrationen an eingeatmeten Sauerstoff
tolerierten, ihre pCO&sub2; Niveaus waren niedrig, der End-pH ihres Blutes war normal und ihre
Lungen expandierten gemäß Bestimmung durch grobe (brutto) und mikroskopische
Beobachtung (die Studien waren wie oben verblindet). In jedem Fall zeigten
Röntgenaufnahmen, die direkt vor der Verabreichung des oberflächenwirksamen Mittels
gemacht wurden, eine Schattenbildung der Lungenfelder, während nur bei den vier Affen, die
das oberflächenwirksame Mittel mit KL4 erhielten, die Lungenfelder deutlich nach 8-10
Stunden nach der Geburt klar wurden.
-
Bei dem Affen Nummer 8 wurde gefunden, dass der Mangel der Verbesserung bei dem
a/A Verhältnis das Ergebnis eines Defektes der Herzkammerscheidewand war, was ein
Rechts-nach-Links-Verschieben des sauerstoffarmen, venösen Blutes erlaubte. Bei allen
anderen Affen, welche die hier offenbarten synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel
erhielten, war die Genesung von dem RDS dramatisch.
-
End-FiO&sub2;, End-pCO&sub2;, End-pH und die Lungenexpansion (brutto und mikroskopisch)
wurden bei jedem Affen auch gemessen. Die gesammelten und aufgezeichneten Daten waren
die folgenden.
-
Affe Nummer 3 (Fig. 2A-1): End-FiO&sub2; - 50; End-pCO&sub2; - 79,4; End-pH - 7,21;
Lungenexpansion, brutto - 0; Lugenexpansion, mikroskopisch - 0.
-
Affe Nummer 5 (Fig. 2A-2): End-FiO&sub2; - 90; End-pCO&sub2; - 58,6; End-pH - 7,17;
Lungenexpansion, brutto - 0; Lugenexpansion, mikroskopisch - 0.
-
Affe Nummer 6 (Fig. 2A-3): End-FiO&sub2; - 21; End-pCO&sub2; - 39,4; End-pH - 7,39;
Lungenexpansion, brutto - 4+; Lugenexpansion, mikroskopisch - 4+.
-
Affe Nummer 7 (Fig. 2A-4): End-FiO&sub2; - 21; End-pCO&sub2; - 29,3; End-pH - 7,47;
Lungenexpansion, brutto - 4+; Lugenexpansion, mikroskopisch - 3+.
-
Affe Nummer 8 (Fig. 2B-1): End-FiO&sub2; - 21; End-pCO&sub2; - 32,1; End-pH - 7,42;
Lungenexpansion, brutto - 4+; Lugenexpansion, mikroskopisch - 4+.
-
Affe Nummer 9 (Fig. 2B-2): End-FiO&sub2; - 100; End-pCO&sub2; - 150,1; End-pH - 6,90;
Lungenexpansion, brutto - 0; Lugenexpansion, mikroskopisch - 0.
-
Affe Nummer 10 (Fig. 2B-3): End-FiO&sub2; - 21; End-pCO&sub2; - 31,5; End-pH - 7,42;
Lungenexpansion, brutto - 2+; Lugenexpansion, mikroskopisch - 3+.
-
Affe Nummer 11 (Fig. 2B-4): End-FiO&sub2; - 50; End-pCO&sub2; - 55,6; End-pH - 7,31;
Lungenexpansion, brutto - 0; Lugenexpansion, mikroskopisch - 0.
-
Die Fig. 3 zeigt die graduelle Abnahme von Sauerstoff über die Zeit (in Stunden) beim
Affen Nr. 13 in Folge einer Verabreichung eines oberflächenwirksamen Mittels, das KL4
enthielt. Wie in der Fig. 3 angezeigt ist, wurde das oberflächenwirksame, KL4 enthaltende
Mittel zwischen etwa einer und zwei Stunden nach Geburt verabreicht. Zum Zeitpunkt Null und
100% eingeatmeten Sauerstoff (FiO&sub2; = 1,0) empfing das Tier 100% Sauerstoff und bei 22-
25 Stunden empfing das Tier 20% Sauerstoff, das heißt, Raumluft.
C. Diskussion
-
Aus diesen Daten wurde geschlossen, dass die synthetischen, oberflächenwirksamen
Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung nicht bloß therapeutisch nützlich sind, sondern das
sie eine dramatische Verbesserung in der Lungenfunktion des Empfängers innerhalb eines
relativ kurzen Zeitraumes bewirken. Diese Verwendbarkeit wird sehr gut durch die Tatsache
dargestellt, dass die Tiere, die ein synthetisches, oberflächenwirksames Mittel erhielten,
welches ein Peptid enthielt, das den Formulierungen entsprach, die in der obigen Anmeldung
offenbart sind, vollständig sich von RDS erholten nach Verabreichung eines
oberflächenwirksamen RL4- oder KL4-Mittels.
-
Zusätzlich zeigen die Daten an, dass die Verabreichung von diesen neuen, Peptid
enthaltenden, oberflächenwirksamen Mittel eine Wiederherstellung erlauben, die ausreichend
ist, um die Entfernung der angereicherten Sauerstoffverabreichung zu garantieren, wenn das
a/A-Verhältnis anzeigt, dass der Organismus nicht mehr länger unter Atemnot leidet.
-
Die oben diskutierten, experimentellen Ergebnisse stimmen überein mit der Information,
die von den "pulsierenden Blasen"-Tests gewonnen wurden, die ein wertvolles in vitro Modell
der in vivo Wirksamkeit (siehe Beispiel 1) und der in vivo dynamischen Compliancestudien
(Beispiel 2) bereitstellen. Ferner scheinen die Ergebnisse des "Blasen"-Tests zu
prognostizieren, dass die synthetischen, oberflächenwirksamen Mittel (einschließlich RL4 und
KL4 zum Beispiel) eine therapeutische Wirksamkeit zeigen, wie dies hier dargestellt ist.
-
Die obige Beschreibung, einschließlich der spezifischen Ausführungsformen und
Beispiele, dient zur Darstellung der vorliegenden Erfindung und soll nicht beschränkend
wirken. Zahlreiche andere Variationen und Modifikationen können vorgenommen werden,
ohne das der wahre Gehalt und Umfang der vorliegenden Erfindung verlassen wird.
Sequenzliste
-
(1) Allgemeine Information:
-
(i) Anmelder: Cochrane, Charles G
Revak, Susan D
-
(ii) Titel der Erfindung: Synthetic Pulmonary Surfactant Peptides
-
(iii) Zahl der Sequenzen: 10
-
(iv) Korrespondenzadresse:
-
(A) Adressat: The Scripps Research Institute, Büro des Patentanwalts
-
(B) Straße: 10666 North Torrey Pines Road, Mail Drop TPC8
-
(C) Stadt: La Jolla
-
(D) Staat: Kalifornien
-
(E) Land: USA
-
(F) Postleitzahl: 92037
-
(v) computerlesbare Form:
-
(A) Mediumtyp: Floppy Disk
-
(B) Computer: IBM PC kompatibel
-
(C) Betriebssystem: PC-DOS/MS-DOS
-
(D) Software: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
-
(vi) gegenwärtige Anmeldungsdaten:
-
(A) Anmeldenummer: PCT/US92/04537
-
(B) Einreichungsdatum: 01. Juni 1992
-
(C) Klassifikation:
-
(vii) frühere Anmeldedaten:
-
(A) Anmeldenummer: US 07/715,397
-
(B) Anmeldedatum: 14. Juni 1991
-
(viii) Anwalt-/Agent-Information:
-
(A) Name: Bingham, Douglas A
-
(B) Registrierungsnummer: 32,457
-
(C) Referenz-/Akten-Nummer: SCR1025P
-
(ix) Telekommunikationsinformation:
-
(A) Telefon: 619-554-2937
-
(B) Fax: 619-554-6312
-
(2) Information für SEQ ID Nr. 1:
-
(i) Sequenzeigenschaften:
-
(A) Länge: 21 Aminosäuren
-
(B) Typ: Aminosäure
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 1:
-
(2) Information für SEQ ID Nr. 2:
-
(i) Sequenzeigenschaften:
-
(A) Länge: 21 Aminosäuren
-
(B) Typ: Aminosäure
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 2:
-
(2) Information für SEQ ID Nr. 3:
-
(i) Sequenzeigenchaften:
-
(A) Länge: 21 Aminosäuren
-
(B) Typ: Aminosäure
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 3:
-
(2) Information für SEQ ID Nr. 4:
-
(i) Sequenzeigenschaften:
-
(A) Länge: 19 Aminosäuren
-
(B) Typ: Aminosäure
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 4:
-
(2) Information für SEQ ID Nr. 5:
-
(i) Sequenzeigenschaften:
-
(A) Länge: 21 Aminosäuren
-
(B) Typ: Aminosäure
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 5:
-
(2) Information für SEQ ID Nr. 6:
-
(i) Sequenzeigenschaften:
-
(A) Länge: 28 Aminosäuren
-
(B) Typ: Aminosäure
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 6:
-
(2) Information für SEQ ID Nr. 7:
-
(i) Sequenzeigenschaften:
-
(A) Länge: 21 Aminosäuren
-
(B) Typ: Aminosäure
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 7:
-
(2) Information für SEQ ID Nr. 8:
-
(i) Sequenzeigenschaften:
-
(A) Länge: 21 Aminosäuren
-
(B) Typ: Amonisäure
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 8:
-
(2) Information für SEQ ID Nr. 9:
-
(i) Sequenzeigenschaften:
-
(A) Länge: 21 Aminosäuren
-
(B) Typ: Aminosäure
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 9:
-
(2) Information für SEQ ID Nr. 10:
-
(i) Sequenzeigenschaften:
-
(A) Länge: 21 Aminosäuren
-
(B) Typ: Aminosäure
-
(D) Topologie: linear
-
(ii) Molekültyp: Peptid
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr. 10: