JPH06508619A

JPH06508619A - 合成肺界面活性ペプチド

Info

Publication number: JPH06508619A
Application number: JP5500888A
Authority: JP
Inventors: コークラン　チャールズ　ジー; リーヴァック　スーザン　ディー
Original assignee: ザスクリップスリサーチインスティテュート
Priority date: 1991-06-14
Filing date: 1992-06-01
Publication date: 1994-09-29
Anticipated expiration: 2018-10-20
Also published as: AU2177792A; JP3459248B2; EP0590006A4; US5789381A; AU666857B2; WO1992022315A1; EP0590006A1; CA2111342A1; DK0590006T3; IE20040101A1; IE921897A1; DE69232760T2; US5260273A; ES2182821T3; EP0590006B1; ATE223436T1; US5407914A; DE69232760D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に有する配列を含むポリペプチドに関する。もう１つの態様においては、本発明は、疎水性及び正に荷電したアミノ酸残基領域を交互に有する配列を含むポリペプチドに関する。更に、本発明は、合成肺界面活性剤を形成するのに有用なポリペプチドに関する。本発明は、また、疎水性及び親水性（又は正に荷電した）アミノ酸残基領域を交互に有する配列を含むポリペプチドをコードする構造遺伝子を保持する組換え核酸分子に関する。本発明は、また、疎水性及び親水性（又は正に荷電した）アミノ酸残基領域を交互に有する配列を含むポリペプチドを産生ずるかかる組換え分子の使用法を開示する。

鼠！肺界面活性剤（ＰＳ）は、成熟した哺乳動物の肺の肺胞上皮に並んでいる。天然のＰＳは、相互作用して肺の空気−液体界面における表面張力を減じるリン脂質とアポタンパク質両方を含存しているので、“リポタンパク質複合体”として記載されてきた。

肺界面活性剤の発見、及びその欠如が新生児呼吸困難症候群（ＲＤＳ）の主要な原因であるというその後の研究結果によって、患った個体、特に乳児のための、外生ＰＳを使用する効果的な界面活性剤代替治療法の開発に向けて多くの研究がなされてきた。例えは、ヒト早産児に外生界面活性剤を使用すると、平均気道圧及び酸素要求量の減少によって測定される肺機能が向上することが明らかにされた。ハルマン（Ｈａｌｌｍａｎ）ら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、　７１：４７３− ４８２　（１９８３）　：　メリット（ｌｌｅｒｒｉｌｌ）ら、Ｊ、　Ｐｅｄｉａｔｒ、、　１０８ニア４１−７４５　（１９８６）　：　ハルマンら、Ｊ、　Ｐｅｄｉａｔｒ、、　＋０６：９６３−９６９　（１９８５）　；モーレイＱｌｏｒｌｅｙ）ら、Ｌａｎｃｅｔ、１：６４−６８　（１９８１）　；メリットら、Ｎｅｗ　Ｅｒ＋ｇｌａｎｄ　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３１５ニア８５−７９０　（＋９８６）　：　スミス（Ｓｍｙｔｈ）　ら、Ｐｅｄｉａｔｒ奄モ刀B ７１：９１３−９１７　（１９８３）　：エンホーニング（Ｅｎｈｏｒｎｉｎｇ）ら、ＰｅｄｉａｔｒｉＣ３，７６：１４５−１５３（１９８５）　；フジワラ（Ｐｕｊｉｗａｒａ）ら、Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ、　１：５５−５９　（１９８０）　；クオン（Ｋｗ。

ｎｇ）　ら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、　７６：５８５−５９２　（１９８５）　：　シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）ら、ＰｅｄｉａｔｒｉｃｓB ７６：５９３−５９９　（１９８５）　；“Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　５ｕｒｆａｃｔａｎｔ”、ロバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、　Ｂ、）A ファン・ゴルデ（Ｖａｎ　Ｇｏｌｄｅ　Ｌ、　Ｍ、　Ｇ、　）、バテンプルグ（Ｂａｔｅｎｂｕｒｇ　Ｊ、　）編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｉｓｈｅｒｓ、アムステルダム、ｐｐ、　４７９−５０３．　（１９８４）におけるフジワラの報文を参照のこと。

薬学的観点から、ＲＤＳの治療に使用するのに最適な外生ＰＳは、僅かなバッチ間の特性変動を伴うが、制御されかつ無菌化された条件下で製造所で完全合成されたものである。免疫学的問題の可能性を最小限にするために、外生ＰＳのアポタンパク質成分はヒトのものと同一であるべきである。不運にも、天然に存在するＰＳの組成は複雑なので、肺における高生理活性に必要な生物物理的特性を生じる生化学的成分の全ては当該技術分野において未だに同定されていない。特に、天然ＰＳに存在する全てのアポタンパク質の特質を明らかにすることも、現時点て既知のＰＳアポタンパク質の機能を同定することも、当該技術分野において成功していない。

不均質なアポタンパク質試料が多くの研究で使用されたので、ＰＳアポタンパク質及び界面活性機能におけるそれらの役割についての文献は複雑で一貫性がな（矛盾していることに留意すべきである。今日までのところ、当該技術分野において、天然ＰＳに存在する異なるアポタンパク質の数は明確に確定されていない。

特に興味があるのは、低分子量（ＬＭＷ）ヒトＰＳ関連アポタンパク質に類似する種々の特質を有するポリペプチドを外生界面活性剤のｌ成分として使用することである。ヒトＰＳ　ＬＭＷアポタンパク質を単離又は特定するために、多くの研究が生化学的技術を使用して試みられてきた。例えば、フィザカーレイ（Ｐｈｉｚａｃｋｅｒｌｅｙ）　ら、Ｂｊｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、１８３ニア３１−７３６　（１９７９）　：　レバク（Ｒｅｖａｃ）ら、Ｍ。

Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐ、　Ｄｉｓ、、　１３４：１２５８−１２６５　（１９８６）　：スズキら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　ＤｉｓA。

６９：３３５−３４５　（１９８６）　；タウシュ（Ｔａｅｕｓｃｈ）ら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、　７７：５７２−５８１　（１９８６）、ニーら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　２３６：８５−８９　（＋９８６）　；　ウィツエソト（ＷｈｉｔｓｅｔＤ　ら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒｅｓ、、　２０：４６０−４６７　（１９８６）　：　ウィツエットら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　Ｒｅｓ、、　２０ニア４４−７４９　（＋９８６）　；タカハシら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、、　＋３５：５２７−５３２（＋９８６）　；スズキら、Ｅｘｐ、　Ｌｕｎｇ、　Ｒｅｓ、、　１１：６１−７３　（１９８６）　；クルシュチット（Ｃｕｒｓｔｅｄｔ）　ら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１６８：２５５−２６２　（１９８７）　：ノッター（Ｎｏｔｔｅｒ）ら、Ｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ、　Ｌｉｐｉｄｓ、　４４：ｌ−１７（１９８７）、及びフエルブス（Ｐｈｅｌｐｓ）ら、Ａｍ、　Ｒｅｖ。

Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、、　１３５二１１１２−１１１７　（１９８７）を参照のこと。

最近、当該技術分野において、個々のＬＭＷ　ＰＳアポタンパク質を均質なまでに単離できないことに関連する問題を克服するために、組換えＤＮＡ技術を応用し始めた。例えば、グラッセル（Ｇｌａｓｓｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、υ、　Ｓ、　Ａ、　。

８４：４００７−４０１１　（１９８７）は、彼らがＳＰＬ　（Ｐｈｅ）と名付けた少なくともｌの成熟ＬＭＷアポタンパク質を生成するヒト前駆体タンパク質の少なくとも一部を形成するアミノ酸残基を誘導するｃＤＮＡ配列を報告した。

しかし、グラッセルらはＳＰＬ　（Ｐｈｅ）のカルボキシ末端残基を確認することができなかったので、その完全な配列を同定することはできず、成熟ＳＰＬ　（Ｐｈｅ）が約６０アミノ酸長であることを予測できなかった。

ヤコブ（Ｊａｃｏｂ）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６２＋９８０８ −９８１１　（１９８７）は、前記のグラッセルらにより記載されたものと類似するヒト前駆体タンパク質についてのｃＤＮＡ及びそれから誘導されたアミノ酸残基配列を記載した。しかしながら、ヤコブらによれば、前駆体から生成し、かれらがＰＳＰ−Ｂと名付けた成熟ＬＭＷアポタンパク質は、７６アミノ酸残基長を存する。更に、ヤコブらは、該報告された前駆体タンパク質から誘導したＰＳアポタンパク質が、他の研究者によって臨床的に研究された界面活性剤製剤に存在したかは明らかではないと記した。前記のグラソセルら及び前記のヤコブらにより記載された前駆体タンパク質から誘導された成熟アポタンパク質は一般に“ ５Ｐ１８”と言われ、その単量体型及び二量体型はそれぞれ“ＳＰ＋８単量体“ 及び“５Ｐ１８二量体”と言われる。

上記から、該文献は見掛は上同じＰＳアポタンパク質であるものについて複数の命名を含んでいることが分かる。更に、ワール（Ｗａｒｒ）らは、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８４ニア９１５−７９１９　（１９８７）において、彼らがＳＦ３と名付けた成熟ＬＭＷアポタンパク質を生成する前駆体タンパク質を形成する、１９７アミノ酸残基の配列を誘導するｃＤＮＡを記載した。これは、ＰＳが１より多いり、ＭＷアポタンパク質を含むことを示唆するように思われる。

コクラン（Ｃｏｃｈｒａｎｅ）及びレバクは、公表されたＰＣＴ特許出願第ＷＯ３９１０６６５７号において、成熟した、生物学的に活性型の５Ｐ１８を特定することができた。

そして、治療的に有用な界面活性を示す種々の５Ｐ１８誘導ポリペプチド及び類縁体を開示している。

それにも拘らず、上記タンパク質の生物活性は、本明細書に開示した、治療的応用、特に合成肺界面活性剤組成物の形成に有用なポリペプチドの活性と一致しない。

発明の要旨本発明は、少なくともｌＯアミノ酸残基で約６０アミノ酸残基以下を含むポリペプチドであって、式（Ｚ、Ｕ、）ｅＺ、で表される、疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に有する配列を含む前記ポリペプチドを意図している。１つの態様においては、ＺはＲ及びＫから成る群から独立に選ばれる親水性アミノ酸残基である。もう１つの異なる態様においては、ＵはＶ、Ｉ、Ｌ、ＣＳＹ及びＦから成る群から独立に選ばれる疎水性アミノ酸残基である。１つの異なる態様においては、Ｖ、Ｉ、Ｌ及びＣか好ましく、もう１つの異なる態様においては、Ｌ及びＣが特に好ましい。他の異なる態様においては、ａは約１〜約５の平均値を育し、ｂは約３〜約２０の平均値を有し、Ｃは１−１０であり、そしてｄはθ〜３である。

もう１つの態様においては、本発明は、ＺがＲ及びＫから成る群から独立に選ばれる親水性アミノ酸残基であることを意図している。もう１つの異なる態様においては、ＵはＶ、■、Ｌ、　Ｃ及びＦから成る群から独立に選ばれる疎水性アミノ酸残基てあつて、Ｌ及び／又はＣであるのが特に好ましい。他の異なる態様においては、ａは約１〜約５の平均値を有し、ｂは約３〜約２０の平均値を有し、Ｃは１〜１０であり、モしてｄはθ〜３である。他の態様においては、ａは約１〜約３の平均値を有し、ｂは約３〜約８の平均値を育し、Ｃは約２〜約６であり、そしてｄは０、Ｉ又は２である。

本発明は、更に、上記の式に対応するポリペプチドであって、薬学的に許容できるリン脂質と混合したときに、リン脂質単独の界面活性よりも大きい界面活性を有する合成肺界面活性剤を形成するポリペプチドを企図している。

別の態様においては、本発明によるポリペプチドは、それぞれ配列番号１〜９である、式ユＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲ。

ＲＬＬＬＬＬＬＬＬＲＬＬＬＬＬＬＬＬＲＬＬ。

ＲＲＬＬＬＬＬＬＬＲＲＬＬＬＬＬＬＬＲＲＬｌＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲ。

ＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬ。

ＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲ。

ＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫ。

ＫＬＬＬＬＬＬＬＬＫＬＬＬＬＬＬＬＬＫＬＬ、又はＫＫＬＬＬＬＬＬＬＫＫＬＬＬＬＬＬＬＫＫＬにより表されるアミノ酸残基配列を有する。

もう１つの態様においては、本発明は、少なくともｌＯアミノ酸残基で約６０アミノ酸残基以下を含むポリペプチドと混合された薬学的に許容できるリン脂質を含む合成肺界面活性剤であって、該ポリペプチドが式（Ｚ、Ｕ、）ｃＺ、により表される、疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に有する配列を含む合成肺界面活性剤を企図している。１つの態様においては、ＺはＲ及びＫから成る群から独立に選ばれる親水性アミノ酸残基である。もう１つの異なる態様においては、ＵはＶ、Ｉ、Ｌ、Ｃ，Ｙ及びＦから成る群から独立に選ばれる疎水性アミノ酸残基である。１つの異なる態様においては、ＶＳ　Ｉ、Ｌ及びＣが好ましく、もう１つの異なる態様においては、Ｌ及びＣが特に好ましい。他の異なる態様においては、ａは約１〜約５の平均値を有し、ｂは約３〜約２０の平均値を有し、Ｃは１〜１０てあり、モしてｄは０〜３である。

もう１つの態様においては、本発明は、ＺがＲ及びＫから成る群から独立に選ばれる親水性アミノ酸残基であることを企図している。もう１つの異なる態様においては、ＵはＶ、Ｌ　Ｌ、Ｃ及びＦから成る群から独立に選ばれる疎水性アミノ酸残基であって、Ｌ及び／又はＣであるのが特に好ましい。他の異なる態様においては、ａは約１〜約５の平均値を有し、ｂは約３〜約２０の平均値を有し、Ｃは１−１０であり、そしてｄはθ〜３である。他の態様においては、ａは約１〜約３の平均値を有し、ｂは約３〜約８の平均値を有し、Ｃは２〜約６であり、そしてｄは１又は２である。

本発明は、また、上式に対応する合成肺界面活性剤であって、ポリペプチドが、それぞれ配列番号１〜９である、ＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲ。

ＲＬＬＬＬＬＬＬＬＲＬＬＬＬＬＬＬＬＲＬＬ。

ＲＲＬＬＬＬＬＬＬＲＲＬＬＬＬＬＬＬＲＲＬ。

ＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲ。

ＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬ。

ＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲｌＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫ。

ＫＬＬＬＬＬＬＬＬＫＬＬＬＬＬＬＬＬＫＬＬ、又はＫＫＬＬＬＬＬＬＬＫＫＬＬＬＬＬＬＬＫＫＬから成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を有する合成肺界面活性剤を企図している。

なお、もう１つの態様においては、本発明は、治療的に有効量の合成肺界面活性剤を投与することを含む呼吸困難症候群の治療方法であって、前記界面活性剤が少なくとも１０アミノ酸残基で約６０アミノ酸残基以下を含む有効量のポリペプチドと混合された薬学的に許容できるリン脂質を含み、前記ポリペプチドが上に開示した式て表される疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に有する配列を含む治療方法を企図している。

別の態様においては、呼吸困難症候群の治療方法に有用なポリペプチドは、それぞれ配列番号１〜９である、式：％式％により表されるアミノ酸残基配列を育する。

もう１つの異なる態様においては、本発明は、脂肪酸及びそれぞれ配列番号１〜９である、式。

ＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲ。

ＲＬＬＬＬＬＬＬＬＲＬＬＬＬＬＬＬＬＲＬＬ。

ＲＲＬＬＬＬＬＬＬＲＲＬＬＬＬＬＬＬＲＲＬ、ＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲ。

ＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬ。

ＫＬＬＬＬＬＬＬＬＫＬＬＬＬＬＬＬＬＫＬＬ、又はＫＫＬＬＬＬＬＬＬＫＫＬＬＬＬＬＬＬＫＫＬにより表されるアミノ酸残基配列を有するポリペプチドと混合された２種の薬学的に許容できるリン脂質を含む合成肺界面活性剤を企図している。本発明は、また、該開示した合成肺界面活性剤を使用する呼吸困難症候群の治療方法を企図している。

もう１つの態様においては、本発明は、ｌ又は２以上の薬学的に許容できるリン脂質を少なくともＩＯアミノ酸残基で約６０アミノ酸残基以下を含む治療的に有効量のポリペプチドと混合することを含む、呼吸困難症候群の治療に有用な治療薬の製造方法であって、前記ポリペプチドが式（Ｚ、Ｕ、）ｅＺ、で表される、疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に有する配列を含む製造方法を企図している。１つの態様においては、ＺはＲ及びＫから成る群から独立に選ばれる親水性アミノ酸残基である。もう１つの態様においては、ＵはＶ、■、Ｌ、ＣＳＹ及びＦから成る群から独立に選ばれる疎水性アミノ酸残基であり、好ましくは、Ｕは■、Ｌ、　Ｃ及びＦから成る群から選ばれ、より好ましくは、ＵはＬ及びＣから成る群から選ばれる。他の態様においては、ａは約１〜約５、好ましくは約１〜約３の平均値を有する。他の異なる態様においては、ｂは約３〜約２０．好ましくは約３〜約８の平均値を有する。なお、他の態様においては、Ｃは１−１０、好ましくは３〜８、より好ましくは２〜６であり、モしてｄは０〜３、好ましくはＯ〜２、より好ましくはｌ又は２である。

もう１つの態様においては、本発明は、！又は２以上の薬学的に許容できるリン脂質を、少なくともｌＯアミノ酸残基で約６０アミノ酸残基以下を含む治療的に有効量のポリペプチドと混合することを含む、呼吸困難症候群の治療に有用な治療薬の製造方法であって、前記ポリペプチドが疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に有する配列を含み、かつ、それぞれ配列番号１〜９である、ＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲ。

ＲＬＬＬＬＬＬＬＬＲＬＬＬＬＬＬＬＬＲＬＬ。

ＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬ。

ＫＬＬＬＬＬＬＬＬＫＬＬＬＬＬＬＬＬＫＬＬ、又はＫＫＬＬＬＬＬＬＬＫＫＬＬＬＬＬＬＬＫＫＬを含むポリペプチドの群から選ばれるアミノ酸残基配列を存する製造方法を企図している。

他の異なる態様においては、上式に対応するポリペプチドは、前記ｌ又は２以上の薬学的に許容できるリン脂質と混合したときに、リン脂質単独の界面活性よりも大きい界面活性を育する合成肺界面活性剤を生成する。

本発明は、また、少なくともＩＯアミノ酸残基で約６０アミノ酸残基以下を含むポリペプチドであって、式：ＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫ（配列番号７）で表される、疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に有する配列を含む前記ポリペプチドを企図している。もうｉつの態様においては、本発明は、少なくとも１０アミノ酸残基で約６０アミノ酸残基以下を含むポリペプチドと混合された薬学的に許容できるリン脂質を含む合成肺界面活性剤であって、前記ポリペプチドが、式：ＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫ　（配列番号７）で表される、疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に育する配列を含み、薬学的に許容できるリン脂質と混合したときに、リン脂質単独の界面活性よりも大きい界面活性を育する合成肺界面活性剤を生成する、合成肺界面活性剤を企図している。

最後に、本発明は、更に、ｌ又は２以上の薬学的に許容できるリン脂質を、少なくともＩＯアミノ酸残基で約６０アミノ酸残基以下を含む治療的に有効量のポリペプチドと混合することを含む、呼吸困難症候群の治療に有用な治療薬の製造方法であって、前記ポリペプチドが、式：ＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫ　（配列番号７）で表される、疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に有する配列を含み、！又は２以上の薬学的に許容できるリン脂質と混合したときに、リン脂質単独の界面活性よりも大きい界面活性を有する合成肺界面活性剤を形成する、製造方法を企図している。

また、本発明に従って治療的に有効量の合成肺界面活性剤を投与することを含む呼吸困難症候群の種々の治療方法も企図している。別の態様においては、■又は２以上の薬学的に許容できるリン脂質と混合された本発明のポリペプチドを含む合成肺界面活性剤が投与される。本明細書中に開示した式に対応する１又は２以上のポリペプチドを含む合成界面活性剤も治療的に有用であり得、投与前に１又は２以上の薬学的に許容できるリン脂質と混合してもよい。

アミノ酸：本明細書て特定される全てのアミノ酸残基は、天然のし一装置にあるものである。標準的ポリペプチド命名法であるＢｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２４３：３５５７−５９゜（＋９６９）を守って、アミノ酸残基の略号を以下の対照表に示す。

対照表Ｆ　Ｐｈｅ　Ｌ−フェニルアラニンＭ　Ｍｅｔ　Ｌ−メチオニンＨＨｉｓ　Ｌ−ヒスチジンＱ　Ｇｉｎ　Ｌ−グルタミンＥ　Ｇｌｕ　Ｌ−グルタミン酸ＷＴｒｐＬ−）リプトファンＲＡｒｇ　Ｌ−アルギニンＤ　Ａｓｐ　Ｌ−アスパラギン酸Ｎ　Ａｓｎ　Ｌ−アスパラギンＣＣｙｓ　Ｌ−システィン全てのアミノ酸残基配列は、本明細書では、その左から右の方向がアミノ末端からカルボキシ末端の慣用の方向である式により表されることに留意すべきである。更に、アミノ酸残基配列の始点又は終点におけるダッシュは、アミノ及びカルボキシ末端でのＨ及びＯＨ（水素及び水酸基）への、又はｌ又は２以上のアミノ酸残基の更なる配列の如き基への結合を示していることに留意すべきである。

加えて、残基配列の右側の末端における斜線（１）は、その配列が次の行に続（ことを示していることに留意すべきである。

ポリペプチド及びペプチド：ポリペプチド及びペプチドは、隣接する残基のα− アミノ基とカルボキシ基の間のペプチド結合により、あるアミノ酸残基がら他のアミノ酸残基に結合した約６０アミノ酸残基以下の線状連結体を示すために、本明細書では互換的に使用される用語である。

タンパク質：タンパク質は、ポリペプチドにおけるように、あるアミノ酸残基から他のアミノ酸残基に結合した約６０アミノ酸残基より大きい線状連結体を示すために、本明細書で使用される用語である。

ヌクレオチド：糖部分（ペントース）、リン酸、及び窒素系へテロ環塩基から成るＤＮＡ又はＲＮＡの単量体単位。該塩基は該糖部分にグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介して連結しており、塩基と糖のその組み合わせがヌクレオシドである。ヌクレオシドがペントースの３゛又は５゛位に結合したリン酸基を含をする場合、それをヌクレオチドという。

鬼１ｉ甚（ｂｐ）：二本ｌＤＮＡ分子におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、又はシトシン（Ｃ）とグアニジン（Ｇ）の対関係。

保存的置換は、１つのアミノ酸残基がもう１つの生物学的に類似の残基によって置換されることである。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンの如き１つの疎水性残基の他の疎水性残基との置換、又はアルギニンとりシン間、グルタミン酸とアスパラギン酸間又はグルタミンとアスパラギン間及びそれらに類したものの如き１つの極性残基の別の１つの極性残基との置換が含まれる。“保存的置換“という用語には、未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含まれる。但し、かかるポリペプチドも必要な結合活性を示すことを条件とする。

Ｂ　ポリペプチド本発明のポリペプチド（主題ポリペプチド）は、そのアミノ酸残基配列及び新規な機能的特性によって特徴付けられる。主題ポリペプチドは、薬学的に許容できるリン脂質と混合されたときに、該リン脂質単独の界面活性よりも大きい界面活性を有する合成肺界面活性剤を生成する。

好ましい態様においては、本発明のポリペプチドは、ゼロ未満、好ましくは一１未膚かそれに等しい、より好ましくは一２未満かそれに等しい複合疎水性を有するアミノ酸残基配列を有する。ペプチドの複合疎水性値の決定法は実施例１に詳細に記載されている。これら疎水性ポリペプチドは、５Ｐ１８の疎水性領域の機能を果たす。１つの態様においては、該アミノ酸配列は５Ｐ１８の疎水性及び親水性残基のパターンによく似ている。

好ましい疎水性ポリペプチドには、疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に有する配列が含まれ、式：％式％）により表される、少なくとも１０アミノ酸残基を有するものとして特徴付けられる。

Ｚ及びＵは、アミノ酸残基なのでそれぞれの存在においてＺ及びＵが独立に選ばれる。Ｚは親水性アミノ酸残基であり、好ましくはＲＳＤＳＥ及びＫから成る群から選ばれる。好ましい態様においては、ＺはＲ及びＫから成る群から選ばれる。Ｕは疎水性アミノ酸残基であり、好ましくは■、Ｉ、　Ｌ、　Ｃ，Ｙ及びＦから成る群から選ばれる。好ましい態様においては、ＵはＶ、　Ｌ、　Ｃ及びＦから成る群から選ばれ、より好ましい態様においては、ＵはＬ及びＣから成る群から選ばれる。ａ、ｂ、ｃ及びｄは親水性及び疎水性残基の数を示す数字である。

ａは約１〜約５、好ましくは約１〜約３の平均値を存する。ｂは約３〜約２０、好ましくは約３〜約１２、より好ましくは約３〜約ｌＯの平均値を有する。Ｃの値は１〜ｌＯ１好ましくは２〜１０、より好ましくは３〜６である。ｄの値は０〜３、好ましくは０〜２、より好ましくはｌ又は２である。

Ｚ及びＵによって表されるアミノ酸残基は独立に選ばれると言うことによって、それぞれの存在において特定された群から残基が選ばれることを意味する。即ち、ａが２である場合は、例えば、Ｚにより表されるそれぞれの親水性残基は独立に選ばれ、かくして、ＲＲ％ＲＤ、ＲＥ、ＲＫＳＤＲ，ＤＤ、ＤＥＳＤＫ等を含むことができる。ａ及びｂが平均値を有すると言うことによって、繰り返し配列（Ｚ、Ｕ、）内の残基の数はそのペプチド配列内で幾分変動できることを意味するが、ａ及びｂの平均値はそれぞれ約１〜約５及び約３〜約２０であろう。

上式の好ましいポリペプチドの例を表１に示す。

ＤＬ４　１０　ＤＬＬＬＬＤＬＬＬＬＤＬＬＬＬＤＬＬＬＬＤＲＬ４　１　ＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲＬＬＬＬＲＲＬ８　２　ＲＬＬＬＬＬＬＬＬＲＬＬＬＬＬＬＬＬＲＬＬＲＬ７　３　ＲＲＬＬＬＬＬＬＬＲＲＬＬＬＬＬＬＬＲＲＬＲＣＬＩ　４　ＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＲＣＬ２　５　ＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＲＣＬ３　’６　ＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＬＬＬＬＣＬＬＬＲＫＬ４　７　ＫＬＬＬＬＫＬＬＬＬＫＬ、ＬＬＬＫＬＬＬＬＫＫＬ８　８　ＫＬＬＬＬＬＬＬＬＫＬＬＬＬＬＬＬＬＫＬＬＫＬ７　９　ＫＫＬＬＬＬＬＬＬＫＫＬＬＬＬＬＬＬＫＫＬ１呼称は所定のアミノ酸残基配列の略号である。

本発明のポリペプチドは、ポリペプチド分野における当業者に既知のあらゆる方法によって合成することができる。利用できる多くの方法を纏めた優れた抄録は、ステワード（Ｊ、Ｍ、　Ｓｔｅｗａｒｄ）及びヤング（Ｊ、Ｄ、　Ｙｏｕｎｇ）、“固相ペプチド合成法（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）”、　Ｗ、）１．　Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃ奄唐モ潤B ＋９６９．及びメイエンホファー〇、　Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）、固相ペプチド合成法のための“ホルモン性タンパク質及びペプチド（Ｈｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）”、　Ｖｏｌ、２゜ｐ、４６．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、　１９８３、及びスフローダ−（Ｅ、　５ｃｈｒｏｄｅｒ）及びクブケ（Ｋ、　Ｋｕｂｋｅ）、典型的な溶液合成法のための“ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）−、Ｖｏｌ、　１．　ｐ、４６．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、　１９６５に見出すことができる。

主題ポリペプチドは、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ）により、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、　８５：２＋４９−２１５４　（１９６３）に最初に記載された固相合成法を使用しても調製することかできる。他のポリペプチド合成法は、例えば、ボダンスッキー（ＢｏｄａｎｓｚｋＹ）ら、ペプチド合成法（Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　２ｄ　Ｅｄ、、（＋９７６）において、並びに当業者に既知の他の参考文献にみることができる。ポリペプチド合成法の抄録は、スチュアート（Ｊ、　５ｔｕａｒｔ）及びヤング（Ｊ、　Ｄ、　Ｙｏｕｎｇ）、“固相ペプチド合成法（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）”、　Ｐｉｅｒｃｅ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＬＬ、　３ｄ　Ｅｄ、、　Ｎｅｕｒａｔｈ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｄｓ、、　ｐ、１０４−２R７．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ　（１９７６）に見出すことができる。かかる合成法において使用する適当な保護基は、上記の文献並びにマクオミ−（ＭｃＣｈｎｉｅ）、“有機化学における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）”、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ　（！９７３）に見出せるであろう。

一般に、これらの方法は、生長しているペプチド鎖への１又は２以上のアミノ酸残基又は適当に保護されたアミノ酸残基の連続的付加反応を含む。通常、最初のアミノ酸残基のアミノ基又はカルボキシル基のいずれかが、選択的除去可能な適当な保護基によって保護されている。リシンの如き反応性の側鎖を発育するアミノ酸については、異なる選択的除去可能な保護基が利用される。

典型的な固相合成法を使用した場合、保護された又は誘導体化されたアミノ酸をその未保護カルボキシル基又はアミノ基を介して不活性な固体支持体に結合させる。次いで、アミノ又はカルボキシル基の保護基を選択的に除去し、適当に保護された結合できる（アミノ又はカルボキシル）基を存する、該配列に含まれることになる次のアミノ酸を混合して、該固体支持体に既に結合している残基とアミド結合を形成するのに適した条件下で反応させる。次いで、この新たに付加したアミノ酸残基からアミノ又はカルボキシル基の保護基を除去して、次いで、（適当に保護された）次のアミノ酸を添加し、同じように先に進める。全ての目的のアミノ酸を連結して適当な配列にした後、残っている末端及び側鎖のあらゆる保護基（及び固体支持体）を連続的に又は同時に除去して、最終ポリペプチドを得る。

１つの態様においては、主題ポリペプチドは、先に挙げた式と一致する疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に存する配列と対応する、少なくとも約１０、好ましくは少なくとも１１アミノ酸残基であって、６０以下、より普通には約３５よりも少なく、好ましくは約２５よりも少ないアミノ酸残基から本質的に成る。

本発明のポリペプチドは、更に追加のアミノ酸残基をアミノ又はカルボキシ末端に含む複合ポリペプチドであってもよい。前記の追加配列は、該ポリペプチドの発現を促進するのに役立っても、また“リンカ−”配列として役立ってもよいが、好ましくは、本発明のポリペプチドの生物学的活性を低下させたり、又は他のやり方で干渉しないものである。

好ましくは、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドを標識又は固体マトリックス又は担体に固定するのに便利な”リンカ−”を付けるためにいずれかの末端に追加の残基を付加させる場合を除いて、先に開示した式（Ｚ、Ｕ、）。

Ｚ４　。

に合致する配列を有する。本発明のポリペプチドに使用できる標識又は固体マトリックス及び担体は後に記載する。

アミノ酸残基リンカ−は、通常、少なくとも１の残基であり、４ｏ又はそれより多い残基であってもよく、ｌ−１０残基であることがより多い。リンカ−に使用される典型的なアミノ酸残基は、チロシン、システィン、リシン、グルタミン酸及びアスパラギン酸、若しくはそれらに類したものである。加えて、本発明のポリペプチド配列は、末端ＮＨ，アシル（１例えば、アセチル（Ｅ、、又はチオグリコール酸アミド化、末端カルボキシアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミン等により修飾された配列によって、天然の配列と異なってもよい。

リンカ−を介して担体と結合して、担体−ハブテン複合体として当該技術分野で既知であるものを形成すると、本発明のポリペプチドは、本発明の合成界面活性剤と免疫反応する抗体を誘発することができる。従って、充分に確立された免疫学的交叉反応の原理からみて、本発明は、表１に示したポリペプチドの抗原的に関連する変異体を意図している。“抗原的に関連する変異体″とは、表１からのポリペプチドの少なくとも６アミノ酸残基間列部分を含み、かつ、表１からのポリペプチド及びそれを含有する合成界面活性剤と免疫反応する抗体分子を誘発することができるポリペプチドである。

Ｃ１咳酸セグメント生きている生物においては、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸残基配列は、遺伝子コートを介して、該タンパク質をコードする構造遺伝子のデオキシリホ核酸（ＤＮＡ）配列に直接に関連している。かくして、構造遺伝子はそれがコートするアミノ酸残基配列、即ち、タンパク質又はポリペプチドから定義することができる。

遺伝子フードの重要かつ周知の特徴はその１剰性である。即ち、タンパク質を造るのに使用されるアミノ酸の殆どについては、ｌを越えるコードヌクレオチドトリブレット（コドン）が、特定のアミノ酸残基をコード又は指定する。従って、幾つかの異なるヌクレオチド配列が特定のアミノ酸残基配列をコードすることかできる。かかる幾つかのヌクレオチド配列は、全ての生物において同じアミノ酸配列を生成することになるので、機能的に等価であると考えられる。時折、プリン又はピリミジンのメチル化変異体が所定のヌクレオチド配列の中に取り込まれ得る。しかしながら、かかるメチル化は如何なる点においてもコード関係に影響を与えない。

本発明のＤＮＡセグメントは、本明細書中に開示した式に対応するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列から本質的になるものとして特徴付けられる。即ち、本発明のＤＮＡセグメントは、疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に育するポリペプチドを発現することのできる構造遺伝子を形成する。該ＤＮＡセグメントのコドンは、イントロンが存在しているので、ここに開示されているポリペプチドのアミノ酸残基配列と共線的であることを要さないが、該構造遺伝子か前記ポリペプチドを成熟型で発現できる、即ち、翻訳後のタンパク質分解プロセシングか不必要であるのが好ましい。好ましくは、それぞれのコドンが本発明のポリペプチドに見出されるアミノ酸残基をコードする分断されていないコドンの線状連続体、即ち、イントロンを含有しない遺伝子として存在する。

Ｄ　組換え核酸分子主題ポリペプチドは、当該技術分野で周知の組換え核酸法を使用して調製することもてきる。例えば、主題ポリペプチドを生成するのに有用なりＮＡ配列は、バイツ（Ｐａｉｋ）ら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８２：３４４５−３４４９．　（１９８５）　：　７クリーン（＾Ｉｃ１ｅａｎ）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９：６４９８−６５０４．　（１９８４）　：及びラール（Ｒａｌｌ）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５７：４１７１−４１７８．　（１９８２）に記載されている。

本発明のポリペプチドをコートするＤＮＡセグメントは、化学的方法、例えば、マットインＱｌａｔｔｅｕｃｃｉ）ら、Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　１０３：３１８５．　（１９８１）のリン酸トリエステル法で合成することかできる。次いて、ＤＮＡセグメントを発現ベクター内に連結し、それて形質転換された宿主を使用してポリペプチドを産生できる。例えば、分子生物学における最近の実験手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、Ｊｏｈｎ　Ｗｌｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ　；及び米国特許第４．２３７．２２４号及び４．３５６．２７０号を参照のこと。該開示内容は、参照によって本明細書に取り込まれる。勿論、該コード配列を化学的に合成することにより、天然のアミノ酸残基配列をコードする塩基を適当な塩基と置換することによって、あらゆる望まし　゛い修飾を簡単に行うことかできる。

主題ポリペプチドを発現することにできる組換え発現ベクター及び主題ポリペプチドの産生にそれらを使用する方法が、本発明の一部として企図されている。

また、上記のＤＮＡセグメントのリボ核酸（ＲＮＡ）等価物も本発明によって企図されている。

核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法としても知られている増幅法により合成することもできる。ＰＣＲ増輻法は米国特許第４．６８３．１９２号、４．６８３．２０２号、４．８００．１５９号及び４．９６５．１８８号、並びに”ＰＣＲ法：ＤＮＡ増幅のための原理と応用（ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉモ≠■ ｉｏｎ）”、ｘルリソヒ（Ｈ，Ｅｒ１ｉｃｈ）纒、５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）；及び”ＰＣＲ実験手順　方法及び応用への手引き（ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）−、イニス（［ｎｎ１ｓ）ら纒、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　（１９９０）を含む少なくとも幾つかの文献に詳細に記載されている。これらの開示内容は参照により本明細書に取り込まれる。他の方法及びプライマーは、例えば、エルシン（Ｎｉ　１ｓｓｏｎ）ら、Ｃｅ１ｌ　５８ニア０７　（１９８９）、エニス（Ｅｎｎｉｓ）ら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８７：２８３３−７　（＋９９０）及びゼモウア−（Ｚｅｍｍｏｕｒ）ら、ＩＩＩＷＩｌｕｎＯｇｅｎｅｔｉＣ３３３：３１０−２０　（１９９＋）に記載されている。５°及び３°プライマー内に制限部位を取り込んで、増幅産物が配列決定ベクター又は発現ベクター内でサブクローンされ得るようにしてもよい。また、該制限部位に隣接する４塩基スペ一サー配列を配置して、酵素で増幅産物を切断する効率を向上させてもよい。

本発明の組換え核酸分子は、本発明の核酸セグメントにベクターを適切に連結することによって、産生ずることができる。

本明細書で使用する場合、“適切に連結される”という語句は、主題の核酸セグメントが、該セグメントにより形成される構造遺伝子の発現がベクターの制鍾下になるように、該ベクターに結合されることを意味する。

本明細書で使用する場合、“ベクター“という用語は、細胞内で複製できる核酸分子であって、他の核酸セグメン）・がそれに適切に連結し、その結果該結合したセグメントの複製を引き起こす核酸分子のことをいう。本発明のポリペプチドをコードする構造遺伝子の発現を行えるベクターを、本明細書では“発現ベクター”という。かくして、組換え核酸分子（ｒＤＮＡ又はｒＲＮＡ）というのは、通常は自然界で一緒に見出されない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッド分子である。

本発明の核酸セグメントを適切に連結するベクターの選択は、当該技術分野で周知のように、目的の機能的特性、例えば、タンパク質発現、及び形質転換される宿主細胞に直接依存し、これらは組換え核酸分子を構築する当該技術分野における固有の限界である。しかしながら、本発明によって企図されるベクターは、それが適切に連結している核酸セグメント内に含まれ、本発明のポリペプチドをコートする構造遺伝子の複製を少なくとも行うことができ、好ましくは発現も行うことができる。

好ましいＩ！！様においては、本発明によって企図されるベクターには、原核レプリコン、即ち、それて形質転換された、細菌性宿主細胞の如き原核宿主細胞内において染色体外てｒＤＮＡ分子の自律的複製及び維持を行う能力を存するＤＮＡ配列か含まれる。かかるレプリコンは当該技術分野で周知である。更に、原核レプリコンか含まれるそれら態様には、その発現がそれで形質転換された細菌性宿主に薬物耐性を授ける遺伝子も含まれる。典型的な細菌性薬物耐性遺伝子は、アンピシリン又はテトラサイクリンに対する耐性を授けるものである。

原核レプリコンを含むそれらベクターは、本発明による遺伝子で形質転換された大腸菌の如き細菌性宿主細胞内で該遺伝子の発現（転写及び翻訳）を行うことのできる原核プロモーターも含むことができる。プロモーターというのはＤＮＡ配列により形成される発現制御要素であって、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写か起こるのを可能にするものである。細菌性宿主に適合するプロモーター配列は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に都合のよい制限部位を含有するプラスミドベクター内に備わっている。かかるベクタープラスミドの代表例は、バイオラッド研究所（Ｂｉｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、（リッチモンド、　ＣＡ）がら入手可能なｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、及びファルマシア、ビスカタヮエイ、Ｎ、　Ｊ、がら入手可能なｐＰＬ及びｐＫＫ２２３である。

真核細胞に適合する発現ベクター、好ましくはを椎動物細胞に適合するものも本発明のｒＤＮＡ分子を形成するのに使用することができる。真核細胞発現ベクターは当該技術分野において周知であり、幾つがの商業的供給元から入手可能である。典型的には、かかるベクターは、目的のＤＮＡセグメントを挿入するのに都合のよい制限部位を含有して提供される。かかるベクターの典型例は、ｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ　１０　（７フル７：／７）　、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ　（イン９−ナショナル・バイオチクノロシーズ社）、及びｐＴＤＴｌ（ＡＴｃｃ＃３Ｉ２５５）である。

好ましい態様においては、本発明のｒＤＮＡ分子を構築するのに使用される真核細胞発現ベクターには、真核細胞内で有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーが含まれる。好ましい薬剤耐性マーカーは、その発現がネオマイシン耐性をもたらす遺伝子、即ち、ネオマイシンリン酸転移酵素（ネオ）遺伝子である。サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１：３２７−３４１　（１９８２）。

また、本発明の組換え核酸分子を形成するのにレトロウィルス発現ベクターを使用することも企図している。本明細書で使用する場合、“レトロウィルス発現ベクター“という用語は、レトロウィルスゲノムのＬＴＲ領域がら誘導されるプロモーター配列を含む核酸分子のことをいう。

好ましい態様においては、該発現ベクターは、真核細胞内で複製不全なレトロウィルス発現ベクターである。レトロウィルスベクターの構築及び使用法は、ゾルゲ（Ｓｏｒｇｅ）ら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　４：１７０３−３７　（１９８４）により記載されている。

相補的粘着末端を介して核酸セグメントをベクターに適切に連結するのに、多様な方法か開発されてきた。例えば、相補的ホモポリマー領域を、挿入すべき核酸セグメント及びベクター核酸の末端部分に付加することができる。次いで、該ベクター及び核酸セグメントを相補的ホモポリマー尾部間の水素結合によって接合して、組換え核酸分子を形成する。

ｌ又は２以上の制限部位を含有する合成リンカ−は、核酸セグメントをベクターに接合する別の方法を提供する。例えば、本発明のＤＮＡセグメントを、はみ出ている３′一本鎖末端をそれらの３°−５°エキソヌクレアーゼ活性で除去してそれらの重合活性で引っ込んだ３°末端を充填する酵素である、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ又は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩで処理する。従って、これら活性の組み合わせは、平滑末端ＤＮＡセグメントを生成する。次いで、該平滑末端ＤＮＡセグメントを、大過剰モルのリンカ−分子と共に、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼの如き、平滑末端ＤＮＡ分子の連結を触媒できる酵素の存在下でインキュベートする。かくして、該反応の生成物は、その末端に重合体リンカ−配列を保持するＤＮＡセグメントとなる。次いで、これらＤＮＡセグメントを適当な制限酵素で開裂し、該ＤＮＡセグメントの末端に適合する末端を生成する酵素で開裂した発現ベクターと連結する。

種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカ−が、インターナショナル・バイオチクノロシーズ社、ニュー・ヘイブン、　ＣＴを含む幾つかの供給元から市販されている。

また、上記組換えＤＮＡ分子のＲＮＡ等個物も、本発明により意因されている。

Ｅ、形質転換細胞及び培養本発明は、また、本発明の組換え核酸分子、好ましくは本発明のポリペプチドを発現できるｒＤＮＡで形質転換された宿主細胞にも関する。宿主細胞は原核又は真核のいずれであってもよい。

“細胞“又は“形質転換宿主細胞”又は“宿主細胞′は、文脈から明らかになるようにしばしば互換的に使用される。これら用語には主題細胞そのものか含まれ、勿論、それらの娘細胞も含まれる。突然変異や環境の変化の機会のために全ての娘細胞が親細胞と正確に同一であるとは限らないということが理解できる。

しかしながら、かかる変化した娘細胞は、上記の用語が使用される場合に含まれる。

細菌性細胞が好ましい原核宿主細胞であって、典型的には、例えば、ベセスダ調査研究社（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ、）から入手可能な大腸菌株ＤＨ５の如き大腸菌の株である。好ましい真核宿主細胞には、酵母及び哺乳動物細胞、好ましくは、マウス、ラット、サル及びヒト繊維芽細胞株の如きを椎動物細胞が含まれる。好ましい真核宿主細胞には、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手できるチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞及びＡＴＣＣからＣＲＬ１６５Ｂとして入手できるＮＩＨスイスマウス胎児細胞ＮＩＨ／３Ｔ３が含まれる。本発明の組換え核酸分子での適当な細胞宿主の形質転換は、使用されるベクターのタイプに概して依存する周知の方法により行われる。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

ＡＣａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　６９：２１１０　（１９７２）：及びマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２）を参照■■ と。レトロウィルスベクターを含有する組換え核酸分子でのを椎動物細胞の形質転換に関しては、例えば、ゾルゲら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　４：１７３０−３７　（１９８４）　：ブラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、Ｖｉｒｏｌ、、　５２：４５６　（１９７３）　；及びウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７６：１３７３−７６　（１９７９）を参照のこと。

うまく形質転換された細胞、即ち、本発明の組換え核酸分子を含有する細胞は周知の方法で同定することができる。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入の結果得られた細胞をクローン化して、モノクローナルコロニーを産生ずることができる。

それらコロニーからの細胞を採取し、細胞溶解して、ｒＤＮＡの存在について、サザーン、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　９８：５０３　（１９７５）又はベレント（Ｂｅｒｅｎｔ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ、。

３：２０８　（＋９８５）により記載されている如き方法使用して、それらのＤＮＡ含量を試験することができる。

ｒＤＮＡの存在について直接分析するのに加えて、ｒＤＮＡが本発明のポリペプチドの発現を行うことができるときには、周知の免疫学的方法により形質転換がうまく行ったことを確認することができる。例えば、本発明のＤＮＡセグメントに適切に連結した発現ベクターでうまく形質転換された細胞は、抗原性を示すポリペプチドを産生ずる。かくして、形質転換細胞を含有すると思われる細胞培養のサンプルを採取し、その抗原に特異的な抗体を使用して、本発明の疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に有する配列を含むポリペプチドについて分析する。かかる抗体の産生及び使用法は当該技術分野で周知である。

かくして、形質転換宿主細胞それ自体に加えて、本発明は、栄養培地中でのそれら細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に均質な）培養物、又はモノクローナル培養物から誘導される培養物も企図している。好ましくは、該培養物は、先に挙げた抗原性を示すポリペプチド又はタンパク質、より好ましくは、本発明の界面活性組成物に有用な生物学的に活性なポリペプチドも含有する。

形質転換宿主細胞を培養するのに有用な栄養培地は当該技術分野で周知であり、幾つかの商業的供給元から得ることができる。宿主細胞か哺乳動物である態様においては“無血清培地”が好ましく使用される。

Ｆ４　ポリペプチドを産生ずるための組換え体性本発明のもう１つの側面は、ポリペプチド、好ましくは界面活性を示すポリペプチドを産生ずる方法に関する。

該方法は、本発明のポリペプチドを発現することのできる本発明のｒＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞、好ましくは、ヒト細胞を含有する栄養培地を含む培養を伴う。該培養は、形質転換細胞が前記ポリペプチドを発現するのに充分な期間維持される。次いで、発現したタンパク質又はポリペプチドを該培養物から回収する。

発現したタンパク質を培養物から回収する方法は当該技術分野で周知であり、周知の生化学方法を使用する培養物のタンパク質含有部分の分別が含まれる。例えば、タンパク質分別に関して既知のゲル濾過、ゲルクロマトグラフィー、超濾過、電気泳動、イオン交換、アフィニティークロマトグラフィー等を使用して、培養物中に見出される発現タンパク質を単離することができる。加えて、周知の方法を使用してイムノアフィニティー法、免疫吸着法等の如き免疫学的方法も行うことかできる。

また、本発明は、本明細書に記載した組換え核酸法により産生じたポリペプチド、好ましくは、界面活性を示すポリペプチドも企図する。

Ｇ　ポリペプチド含有組成物本発明は、ポリペプチドが実質的に単離されて又は実質的に純粋に存在するポリペプチド含有組成物（主題ポリペプチド又はタンパク質組成物）を企図している。”単離されて“により、該ポリペプチドが、界面活性を示す他のポリペプチド又はタンパク質を含まない組成物の一部として存在することを意味している。

“実質的に純粋“により、主題ポリペプチドが、他のポリペプチド又はタンパク質を含まない組成物の一部として存在していることを意味している。

タンパク質又はポリペプチドについての“界面活性”は、脂質と組み合わせたときに、単独で又は他のタンパク質と組み合わせたいずれかで、ロバートソン（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）ら、Ｌｕｎｇ、　１５８：５７−６８　（１９８０）のｉｎ　ｖｉｖｏ分析法において活性を示す能力として定義される。この分析では、評価すべきサンプルを、帝王切開により成熟前に分娩させたウサギ又はヒツジ胎児に気管内挿入管を通して投与する。

（これら“早産児”はそれら自身のＰＳを欠いているので、人工呼吸器で維持される。）肺伸展性、血液ガス及び人工呼吸器圧の測定値が、活性の指標を提供する。活性の予備的評価は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ分析法、例えば、キング（Ｋｉｎｇ）ら、Ｍ。

Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　２２３ニア１５−７２６　（＋９７２）の分析法、又はタンパク質又はポリペプチドをリン脂質と混合したときの空気−水界面における表面張力の測定を利用する以下に説明する分析法によっても行うことができる。

Ｈ０合合成面活性剤組換え体性で産生じた、界面活性を示すポリペプチド及び／又は主題ポリペプチドを薬学的に許容できるリン脂質と混合して、呼吸困難症候群の治療に有用な合成肺界面活性剤（ＰＳ）を形成することができる。

“薬学的に許容できる”という語句は、ヒトに投与したときにアレルギー性又は類似の面倒な作用を起こさない分子単位及び組成物のことをいう。

タンパク質との混合物により合成肺胞界面活性剤を形成するのに有用なリン脂質は当該技術分野で周知である。合成界面活性剤について天然及び合成の両方のリン脂質の使用法を調べるには、ノツター（Ｎｏｔｔｅｒ）ら、Ｃｌ１ｎ、　Ｐｅｒｉｎａｔｏｌｏｇｙ。

１４：４３３−７９　（１９８７）を参照のこと。

１つの態様においては、本発明は、薬学的に許容できるリン脂質と混合した有効量の主題ポリペプチドを含む、ＲＤＳの治療に有効な合成肺界面活性剤を企図している。所定のポリペプチド−リン脂質の組み合わせに最適なポリペプチドニリン脂質重量比を決定する方法は周知であるが、治療的に有効な比率は、約１５〜約１：Ｉｏ、ｏｏｏ１好ましくは約１　：　１００〜約１：５．ｏｏｏ、より好ましくは約１：５００〜約１：１０００の範囲にある。より好ましい聾様においては、ポリペプチドニリン脂質重量比は、約１：５〜約１＋２，０００、好ましくは約ｌ・７〜約１：１．０００、より好ましくは約１：ｌＯ〜約１：ｌＯの範囲にある。

かくして、本発明の合成肺界面活性剤は、約５０から、通常は約８０からほぼ１００重量％までの脂質と、約５０から、通常は約２０から１重量％未満までのポリペプチドを含有することができる。好ましくは、主題ポリペプチドは、疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に有するポリペプチドについての界面活性剤の約１〜約ＩＯ重量％である。

脂質部分は、好ましくは約５０〜約９０、より好ましくは約５０〜約７５重量％がジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）であって、残余が不飽和ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール（ＰＣ）、トリアジルグリセロール、パルミチン酸スフィンゴミエリン又はそれらの混合物である。該合成肺界面活性剤は、主題ポリペプチドの溶液をリポソームの懸濁液と混合することによって、又は有機溶媒の存在下で主題ポリペプチドと脂質を直接混合することによって調製される。次いで、窒素気流下及び／又は真空下での透析又は蒸発により溶媒を除く。

主題の合成肺界面活性剤は、好ましくは気管内投与用に、例えば、典型的には、液状懸濁剤として、乾燥粉末“粉剤′として、又はエアゾール剤として製剤される。例えば、合成界面活性剤（ポリペプチド−脂質ミセル）を、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール等の如き薬学的に許容できる賦形剤と液中で懸濁する。咳界面活性剤含有治療用組成物は、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等を含むｐＨ［衝剤の如き少量の無毒性補助剤も含有できる。合成界面活性剤を粉剤の形に製剤するには、合成界面活性剤をここに記載したようにして調製し、次いで、乾燥散剤として凍結乾燥して回収する。

エアゾール剤投与に使用する場合には、主題の合成界面活性剤は、微細に分割された形態で追加の界面活性剤及び噴射剤と共に供給される。投与してもよい典型的な界面活性剤は、脂肪酸及びそのエステルである。しかしながら、この場合には、界面活性剤複合体ＤＰＰＣとＰＧ以外の成分を使用するのが好ましい。有用な噴射剤は、典型的には、周囲条件でガスであり加圧により圧縮される。低分子量アルカン及びフレオンの如きフッ素化アルカンを使用することができる。エアゾール剤は、成分を噴射するまで加圧下に維持することができる適当なバルブを装備した容器中に封入する。

合成界面活性剤は、投与形態に相応しいように、エアゾール剤投与により、又は吸入ガスの中に懸濁剤又は粉剤を噴霧化することにより気管内挿入管により投与される。約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは約７０ｍｇ〜約９０ｍｇの量の合成ＰＳが、１回の服用で投与される。新生児に使用するには、１回又は２回の投与で概して充分である。大人には、正常範囲内のＰＯ，をもたらすのに充分な戻した複合体を投与する（ハルマンら、　Ｊ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、　７０：６７３−６８２、１９８２）。

以下の実施例は、本発明を説明することを意図したものであり、限定を意図したものではない。

空気−液体界面を横断する表面圧力（Ｈ２Ｃ圧の負のｃｍで表される）の最小（８分）気泡半径での測定を、エンホーニング（Ｅｎｈｏｒｎ　ｉｎｇ）、Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、。

４３：ｌ９８−２０３　（１９７７）に記載された脈動気泡法を用いて、種々の時間で行った。

簡単に説明すれば、エンホーニング・サーフアクトメーター（サーフアクトメーター・インターナショナル、オンタリオ州トロント）で、液体−空気界面を横断する、最大（０，５５ｍｍ）及び最低（０，４ｍｍ）半径の間で２０サイクル／分の速度で脈動する気泡の圧力勾配（ΔＰ）を測定する。３７℃で形成され、水で取り囲まれた２０μ！試料空間の気泡を、０及び−２ｃｍＨｔＯについて基準化した帯記録紙に圧力変化を記録しながら、顕微鏡を使用して視覚でモニターする。

２、複合疎水性値の決定各ペプチドの複合疎水性値を、ペプチド中の各アミノ酸残基に、ホップ（Ｈｏｐｐ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　７８：３８２４−３８２９　（１９８１）の表１に記載されたその対応する親水性値を割り当てることにより決定した。なお、この開示内容は参照により本明細書に取り込まれる。所定のペプチドについて、親水性値を全溶媒と混合した後に、各ペプチドをリン脂質（ＤＰＰＣ：　ＰＧ）と混合（３：１）し、以下の方法の１つに従って合成界面活性剤を調製した。

方法Ａは、１６μｌのペプチド／溶媒混合液（４０℃ｇペプチド）を４００μｇリン脂質を含有する１００μｌのクロロホルムと混合し、該混合液を３７°Ｃで約１０分間攪拌してペプチド／リン脂質混合液を生成することにより行った。Ｎ。

気流下で乾燥することによりペプチド／リン脂質混合液からクロロホルムを除去した。次いで、このようにして生成した合成界面活性剤を、９０μｌのＨｌＯと混合して３７°Ｃで約１０分間緩やかに攪拌した。続いて、１０μｌの９％ＮａＣｆを該界面活性剤含有溶液に混合した。

方法Ｂは、まず、４００μｇリン脂質を含有する１００μｌのクロロホルムをガラス管に入れ、Ｎ、気流下で３７°Ｃで約１０分間乾燥することによりクロロホルムを除去することにより行った。１６μｌのペプチド／溶媒混合液と７４μｌＨ，Ｏを該乾燥したリン脂質と混合し、次いで、３７°Ｃで約ＩＯ分間緩やかに攪拌した。このようにして生成した合成界面活性剤に、１０μｌの９％ＮａＣ１を混合した。

方法Ｃは、まず、ポリペプチド−ＰＬ混合液を４３°Ｃで１０分間維持し、その後、Ｎ、気流下で乾燥することにより溶媒を該混合液から除去することにより行った。必要な場合には、１５分間真空下に置くことによって該混合物を更に乾燥して、乾燥ポリペブチＩ”−ＰＬ混合物を形成した。次いで、５又はｌＯ■／ｒｎｌのいずれかの最終ＰＬＪ度にするのに必要な容量の９０％に相当すると計算される量で、水をそれぞれの乾燥混合物と混合して第２混合液を生成した。この第２混合液を攪拌しなから１時間４３°Ｃに維持した。続いて、目的のＰＬ濃度にするのに必要な容量の１０％に相当する量の６％ＮａＣｆを該第２混合液と混合し、得られた最終混合液を１０分間４３°Ｃに維持した。殆どの場合、最終混合液を凍結及び解凍を３サイクル行う最終工程に付した。

４、オクチルグルコピラノシド分析スピロ（Ｓｐｉｒｏ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　８：３−５　（１９６６）のアンスロン法に基づくｎ−才クチル−β−Ｄ−グルコピラノシドの定量のための分析法が、以前にレバクら、Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、、　１３４：１２５８−１２６５　（１９８６）により記載されている。

５、タンパク質測定５μｇまでのタンパク質を含有する有機サンプルを窒素気流下で１２Ｘ７５ｍｍガラス管中で乾燥した。Ｈ，Ｏ中の１５μｌ１％ＳＤＳ及び３００μｆＢＣＡタンパク質分析試薬（ピアス・ケミカル社、ロックフォード、　［Ｌ）をそれぞれの管の中に入ったタンパク質と混合した。管にカバーをして６０°Ｃで３０分間インキュベートした。冷却後、サンプルを９６ウエル平底ポリスチレンマイクロタイタープレートに移してＯＤｓ！６を測定した。スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用した。脂質が存在する場合（即ち、Ｂｌｏ−３ｉｌ　ＨＡクロマトグラフィーの前）は、幾らかの脂質がＢＣＡタンパク質分析中に反応して、タンパク質定量を不正確にすることに留意すべきである。更に、一旦精製すると、疎水性ＬＭＷアポタンパク質自体がＢＣＡ試薬とあまり反応しないので、単離したタンパク質の全定量はアミノ酸組成に基づいた。

６、　リン脂質ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｃ，β、γ−ジパルミトイルーし一α−レソチン）及びＬ−α−ホスファチジル−ＤＬ−グリセロール（ＰＧ。

鶏卵レシチンの誘導体）をカルビオケムーベーリング社（ラジョラ、ＣＡ）又はアバンチ・ボラーーリピッズ社（バーミンガム、ＡＬ）から購入した。ＤＰＰＣは、クロロホルム中のＰＧに３・ｌの重量比で加えた。

７、界面活性分析脈動気泡の表面張力を低下させる能力として評価される、界面活性のｉｎ　ｖｉｔｒ。

分析法、及びウサギ胎児を利用するｉｎ　ｖｉｖｏ分析法が、以前にレバクら、Ｍ。

Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、、　＋３４：１２５８−１２６５　（１９８６）により詳細に記載されている。

８、形態的分析３０ｃｍＨｔ　Ｏに膨らませてＩＯｃｍＨｚＯに収縮させたウサギ胎児の肺を１０％ホルマリン中に７２時間浸した。パラフィン切片を頂部から基部に向かう方向にして、腹側から背側に５ミクロンの切片を取った。ヘマトキシリン及びエオシンで染色した後、複数の切片について頂部から基部にｌＯの領域（１００ｘ）を点勘定した。標準化された形態的方法（“立体学的方法（Ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）”、Ｖｏｌ、　１．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、３３−５８．１９７９におけるウェイバー　（Ｗｅｉｂｅｒ）の報文）を使用して、各処理群について、空気空間に対する肺間質の比率を測定した。肺胞視野計の交叉点も測定した。

９、　リン脂質のリン分析リン脂質は、バートレット（Ｂａｒｔｌｅｔｔ）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２３４：４６６−４６８　（１９５９）の方法に従って定量した。

１０、アミノ酸分析アミノ酸組成物についての３サンプルを、ＨＣｊ！で１１０°Ｃで２４時間、ＨＣｆで１５０°Ｃで２４時間、又は過ギ酸中で＋１０°Ｃで２４時間ののちＨＣＩ！で１１０°Ｃで２４時間かけて加水分解した。分析は、ベックマンモデル１２１−Ｍアミノ酸分析装置（ベックマン・インスツルメン゛人フラートン、ＣＡ）で行った。トリプトファンは確認されなかった。

＋１．アミノ酸配列決定気相タンパク質配列決定法を、オンラインモデル＋２０Ａ　ＨＰＬＣを備えたアプライド・バイオシステムダ４フ０Ａアミノ酸配列分析器（アプライド・バイオシステムズ社、フォスター・シティ、ＣＡ）で行った。

Ｂ、結果以下の表２に示した合成界面活性剤を該表に示したようにして調製した。表２に示した典型的な合成界面活性剤それぞれを、上に記載したエンホーリングの“気泡測定法“を使用するｉｎ　ｖｉｔｒｏでのそれらの表面張力低下能力により明示される界面活性について分析した。

この研究の結果は、低いΔＰ値によって明示されるように、主題ポリペプチドは、薬学的に許容できるリン脂質と混合したときに、リン脂質単独よりも大きな界面活性を育する合成肺界面活性剤を形成することを示している。典型的には、１０％〜８０％低いΔＰ値が該ポリペプチドを使用して得られた。

各ポリペプチドを所定の溶媒と、溶媒１ｍｌ当たり２．５ｍｇのポリペプチドの濃度に混合した。得られた混合液を観察して、溶液又は不溶性ポリペプチドの懸濁液のいずれが生成したかを確認した。懸濁液を生成するそれら混合液は、１０秒間の水浴音波処理により更に混合して、ガラスピペットを使用するピペッティングに充分な非常に微細な懸濁液にした。

溶媒と混合した後、各ペプチドをガラス管中でクロロホルム中でリン脂質（ＰＬ）、ＤＰＰＣ：ＰＧ、３　：　１と混合して、添加したポリペプチドの量が添加したＰＬの量の１０分の１　（１０重量％）に等しくなるようにし、方法Ａ、Ｂ又はＣのいずれかに従って合成界面活性剤を生成した。

次いで、各合成界面活性剤を、上に記載したようにして行った気泡測定法におけるｉｎ　ｖｉｔｒｏでの表面張力低下能力により明示される界面活性について測定した。圧力勾配（ΔＰ）は、上記のエンホーニング・サーフアクトメーターを使用して測定したポリペプチド−ＰＬ第３混合物における界面活性の指標である。測定値は、１５秒（１５“）、１分（１′）及び５分（５′）の時点で得たれ、所定のポリペプチド−ＰＬ混合物の３つの独立測定値の平均として表されている。

ＰＬ単独（ＰＬ）及び天然ヒト界面活性剤の比較サンプルについての圧力勾配測定値をコントロールとして測定した。

この研究の結果を表２に示す。

ＤＬ４　４７９６’）ロロホ／ｌ、ム　溶液　Ｃ−４２，００１，８０１，３０（３１ｍｅｒ）　５３％メタノールＲＬ４　３２％りｏロホルム　溶液　Ｃ−４０，５８０，６５０，３３６８％メタノールＰＬ８　１９％クロロホルム　懸濁液　Ｃ＋　１０　０．６８　０．６９　０．１９８１％メタノールＲＲＬ、７　４９％クロロホルム　溶液　Ｃ−４１，６５１，２５１，００５１％メタノールＲＣＬ−１７９％クロロホルム　懸濁液　Ｃ＋１０　０．５０　０．５９　０．０６２１％メタノールＲＣＬ−２６７％クロロホルム　懸濁液　Ｃ＋１０　０．００　０．００　０．００３３％メタノールＲＣＬ−３７５％クロロホルム　懸濁液　Ｃ＋　１０　０．５５　０．５１　０．３３５％メタノールＰＬ　Ｃ＋　１０　＞２．５０＞２．５０２．３３（１）　ペプチドの初期混合物が溶液と懸濁液のいずれであったがを示している。

（２）　この項目は使用した合成界面活性剤の調製法を示している。それら方法は上に記載されている。“十″は最終混合液を凍結及び解凍を３サイクル行う最終工程に付したことを示す。−“はその工程が行われなかったことを示す。

（３）最終第３混合液におけるリン脂質（ＰＬ）の濃度をミリリッター混合液当たりのミリグラムＰＬ　（ｍｇ／ｍｌ）で示している。

（４）圧力勾配は、実施例２に記載するようにエンホーニング・サーフアクトメーターを使用して測定したポリペプチド−ＰＬ最終混合物における界面活性の指標である。測定値を１５秒（１５”）、１分（１′）及び５分（５′）の３点て得、所定のポリペプチド−ＰＬ混合物の３つの独立測定値の平均として表している。ＰＬ単独（ＰＬ）及び天然ヒト界面活性剤の比較サンプルについての圧力勾配測定値も示しである。

（５）　これら溶液は、２０　ｍｇ／ｍｌ　Ｐ　Ｌの濃度で調製し、試験前にＩ　Ｏｍｇ／ｍｌに希釈した。

これら結果は、所定の圧力に対して容量が高いことより明らかなように、主題ポリペプチドが、薬学的に許容できるリン脂質と混合したときに、リン脂質単独よりも大きな界面活性を有する合成肺界面活性剤を形成することを示している。

実施例２ウサギを使用する合成界面活性のｉｎ　ｖｉｖｏ評価Ａ評価法主題ポリペプチドを、まず、本明細書に記載した溶媒と混合した。得られた混合液を更にリン脂質と混合して、以下に示すように、添加したポリペプチドの量が添加したＰＬの量の３．７又は１０重量％のいずれかになるようにした。最終混合液が最終混合液ｍ１当たり２０ｍｇの濃度を有したことを除いては、実施例１の３節における“合成界面活性剤の調製“の節に詳細に記載した最終凍結解凍工程を使用する方法Ｃに従って、最終ポリペプチド、ＰＬ混合液（合成界面活性剤）を形成した。

有する０、１ｍｌ溶液、又は実施例１に記載したようにして調製した２ｍｇの天然界面活性剤又は２ｍｇＰＬのいずれかを気管の中に注射することによってウサギ胎児を治療した。

±噸至：合成界面活性剤を、以下の３成分を以下の順に存在させた１本のシリンジから気管の中に注射することによって、ウサギ胎児内に滴注した：（１）　ｏ、　０５ｍｌ空気：（２）実施例！におけるようにして調製したＯ、１ｍｌの合成界面活性剤、又は２ｍｇのＰＬ若しくは２ｍｇの天然界面活性剤のいずれか：及び（３）０．１ｍｌ空気。

手順３：１つのシリンジから、施例１に記載したようにして調製した０、１ｍｌの合成界面活性剤（又は２ｍｇの天然界面活性剤若しくはＰＬ）を上記のようにウサギの気管の中に滴注し、続けて０．０５ｍ１乳酸加リンゲル液と０．２ｍｌ空気を第２のシリンジから注射した。

手順４：１つのシリンジから、実施例１に記載したようにして調製した０、１ｍｌの合成界面活性剤（又は２ｍｇの天然界面活性剤若しくはＰＬ）、０．１５ｍ１空気、０．１ｍｌ生理食塩水、及び０．３ｍｌ空気を上記のように気管の中に注射した。

続けて、０．３ｍｌ空気を２回注射した。

ｆ＝叩邊：注射する際に以下の４成分を以下の順に存在させた１本のシリンジから気管の中に注射することによって、ウサギ胎児を治療した：（１）実施例１におけるようにして調製したいずれかの合成界面活性剤を含有する０、２ｍｌ溶液又は４ｍｇの天然界面活性剤若しくは４ｍｇＰＬ；（２）０．１５ｍ１容量の空気：（３）０．１ｍｌの通常生理食塩水；及び（４）０．３ｍｌ容量の空気次いで、第１回目の注射１５分後に上記の注射を繰り返した。

±懸旦：最初の注射後に０．３ｍｌ空気を続けて２回注射したこと及び１５分での追加の滴注を行わなかったことを除き、手順５に記載したようにしてウサギを治療した。

３、界面活性を研究するためのウサギ胎児モデル本発明の典型的なポリペプチドの界面活性を、以下に記した以外はレバクら、Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、、　１３４：１２５８−１２６５　（１９８６）により以前に詳細に記載された方法を用いて研究した。

在胎２７日間のウサギ胎児を子宮切開により分娩させ、すぐに０．０５ｍ１ノルクロン（Ｎｏｒｃｕｒｏｎ）　（オルガノン社、ＮＪ）を注射して自発呼吸を行わないようにした。次いで、ウサギ胎児の体重を計ってから気管切開により気管の中に小さなカニユーレを挿入した。次いで、上記のようにして１４製した合成界面活性剤を上記の滴注手順のうちの１つによりウサギ胎児の肺の中に滴注した。

滴注後にウサギを人工呼吸器（ベビーバード、ベビーバード社、パームスプリングス、ＣＡ）に連結された特別設計のブレチスモグラフ（セレスコ（Ｃｅｌｅｓｃｏ）変換器を内蔵している）内に置き、該滴注した肺を分当たり３０サイクルの速度で、２５ｃｍＨｔｏのピーク吸気圧、４ｃｍＨ＊Ｏの終末呼気陽圧及び０．５秒の吸気時間で人工呼吸した。幾つかの研究において、人工呼吸操作全体にわたる種々の時点において、動的伸展性測定を行った。他の研究においては、人工呼吸の後に静的伸展性測定を行った。

静的伸展性測定は、人工呼吸の３０分後に行った。動物達を人工呼吸器から外し、肺をペルジャー内−２０ｃｍＨｔＯで真空下に脱ガスした。その後、気管カニユーレに付けられたＴ−コネクターを介して肺をまず膨らませ次に収縮させた。

５．１０．１５．２０．２５及び３０ｃｍＨｔｏの静的圧力に達するのに必要な空気の容量を膨張及び収縮の両段階の量測定して、静的伸展性の指標として静的圧力対容量曲線を作成した。

ブレチスモグラフを用いて、６０分間の人工呼吸期間の全体にわたる種々の時点で動的伸展性の測定を行った。コンピューターを使用したデータ解析により、各時点における体重１グラムについてのｃｍＨｔｏ当たりのｍｌ空気として表される伸展性データが得られた。伸展性は、以下の式により計算した。

伸展性＝ΔＶ／ΔＰ ΔＰ、、＝　（Ｃ）−１・　（ΔＶ）＋　（Ｒ）　・　（Ｆ）ｐ、、＝　経肺圧Ｃ；　伸展性（弾性成分−容量対圧力の変化に関連する）Ｒ＝　抵抗（流れ対圧力に関連する）Ｆ　＝　流れ ■　＝　容量＝時間に関する流れの積分値上記の方程式は、Ｃ及びＲについての複数の一次回帰で解かれた。伸展性（Ｃ）は肺の弾性を表し、抵抗（Ｒ）は肺の中への及び外へのガスの流れに対する抵抗に打ち勝つのに必要な圧力を表す。

表３〜５に示される研究を、本明細書に開示した方法及びパラメーターに従って調製した種々の合成界面活性剤を使用して上記のようにして行った。ＰＬ２、ＰＬ４、ＰＬ４−ＣＹＳ又はＲＬ８ペプチド、又はＰＬ４の“多重体″　（例えば、（ＰＬ４）ｇＲ）から成る合成界面活性剤を、ペプチド又はタンパク質を含有しないリン脂質界面活性剤（コントロール界面活性剤）と比較した。ブレチスモグラフを用いて、６０分間の人工呼吸期間の全体にわたる種々の時点で動的伸展性の測定を行った。データ解析により、各時点において、ｍ１空気／ｃｍＨｔｏ／ｇ体重ＸＩＯ＠として表される伸展性データが得られた。伸展性は、先に挙げた式により計算した。

表３及び４に示された研究について、合成界面活性剤溶液は、以下の割合でＤＰＰＣ，ＰＧ及びペプチドを含む。ＤＰＰＣ：　１５ｍｇ／ｍｌ：　ＰＧ：　５ｍｇ／ｍｌ　；及びペプチド：　２ｍｇ／ｍ１．表３の研究において、パルミチン酸も含有する投与溶液を“十”記号で示すと共に、パルミチン酸を含有しないものを“−″記号で示した。表３及び４で示した研究では、投与手順４を用いた。

表４及び図４は、ＲＬ４含有界面活性剤の種々の製剤の肺機能についての投与効果を示すものであり、ＲＬ４含有ペプチドの最適な長さを確認しようと試みた結果を明らかにしている。表４及び図４において、指定した製剤を用いて試験した動物についての平均動的伸展性値を界面活性剤投与後の時間（分）に対してプロットしている。該界面活性剤を、上記のように、手順４を参考にして投与した。

Ｂ、結果滴注手順１及び５を用いた静的伸展性データを収集して分析した（データは示していない）。リン脂質（ＰＬ）だけで治療した被験肺に比較して向上した肺伸展性が、１つの例外を除いて、天然界面活性剤又は被験合成界面活性剤で処理した全ての肺に見られた。ｐｌ−１５を用いて調製した合成界面活性剤は、静的伸展性により測定した場合、ＰＬ単独よりも向上した肺伸展性をもたらさなかった。

動的伸展性研究の結果を表３〜５及び図４に示す。

＋　３４　４６　８８　１１４　１３４　１９３　４＋　２７　３７　５５　９６　１１３　１４８　４ａ　”十″を付した溶液はパルミチン酸を含有し、“− ”を付した溶液は含有しない。

表４１０　２０　３０　４０　５０　６０　手順４０４０４８５１６６　ｎ／ｄゝ　４３２５１３２３７３７５１（ＰＴＸ）　４４２５０５４６５６９８４、４４６５０５０５４５４　ｎ／ｄ　４８０９２１１２　＋４１１４９１４３　４４０　５２　６０　６５　６５　６０（円■）４（ＰＬ４）ＩＲ１５３９６６１２３１１２７３（ＰＴＸ）　４ｂ　ｎ／ｄ＝測定せずｃ　ＰＴＸ＝気胸表３〜５に示されるように、本発明の各合成界面活性剤（及び天然界面活性剤）は、リン脂質単独に比較して動的伸展性値を向上させる。

Ｃ０考察このｉｎ　ｖｉｖｏ伸展性研究は、幾つかの本発明の典型的な合成界面活性剤を使用すると、各分析した合成界面活性剤について、リン脂質単独の場合に比較して向上した伸展性がもたらされることを明らかにするものである。かくして、本発明のタンパク質及びポリペプチドは、薬学的に許容できるリン脂質と混合したときに、リン脂質単独よりも大きな界面活性を有する合成界面活性剤を形成する。

該合成界面活性剤を使用することはｉｎ　ｖｉｖｏで向上した伸展性値をもたらすのに有利である。

本明細書に記載し表３〜５及び図４に示した研究は、本発明の合成界面活性剤が顕著な治療的育用性を示すことを明らかにしている。例えば、全合成界面活性剤について観察された動的伸展性値は、リン脂質単独で得られた典型的な値をかなり越えている。更に、動的伸展性試験は明らかにヒトを含む哺乳動物におけるｉｎ　ｖｉｖｏ効能の指標であるので、本明細書に記載したデータが以下の実施例３において議論する霊長類のデータとよく相関しているのは驚くことではない。

更には、これらｉｎ　ｖｉｖｏ動的伸展性研究により明らかとなった治療的効能は、これら同一の組成物を上記の実施例１に記載し及び説明した“脈動気泡”ｉｎ　ｖｉｔｒｏ分析法を用いて試験したときに記録した結果と一致している。特に本明細書に記載したｉｎ　ｖｉｖｏ研究が、開示した製剤と同じ合成界面活性剤の治療的効能を明らかにしているという事実からみて、本明細書に記載した界面活性の“脈動気泡”ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ分析法はｉｎ　ｖｉｖｏ効能を予測させるものと考えられる。これらｉｎ　ｖｉｖｏ研究において見られた動的伸展性値の大きな向上は、本明細書に開示し主題のポリペプチドを、まず、実施例２に記載したようにして溶媒と混合した。

得られた混合液を更にリン脂質（ＰＬ）と混合して、以下に示すように、添加したポリペプチドの量が添加したＰＬの量の３．７又は１０重量％のいずれかになるようにした。最終混合液がｍｌ最終混合液当たり２０ｍｇのリン脂質濃度を有したことを除いては、実施例１の３節における“合成界面活性剤の調製”の節に詳細に記載されたようにして最終凍結解凍工程を使用する方法Ｃに従って、最終ポリペプチド、ＰＬ混合液（合成界面活性剤）を形成した。

２、界面活性を研究するためのサル胎児モデル上記の適用において記載した新規なポリペプチド（及びそれらポリペプチドを含有する合成界面活性剤）の効能を確認するためにｉｎ　ｖｉｖｏ研究を行った。リン脂質及びＰＬ４又はＫＬ４ペプチドから成る界面活性剤をペプチドもタンパク質も含有しないリン脂質界面活性剤（コントロール界面活性剤）と比較した。

標準的手順に従って、在胎約１２８〜１３１日間のアカゲサルを分娩させた。

次いで、気管切開により気管内挿入管を挿入した。続いて、各サルを人工呼吸器に連結し、血液ガス及び血圧を測定するためにカテーテルを請動脈内に取り付け、該サルに栄養分／水化溶液（ＤＩＯＷ）を供給するために第２カテーテルを膝静脈内に取り付けた。動物が安定した後、呼吸困難症候群（ＲＤＳ）の存在及び程度を評価するためにＸ線撮影を行った。種々のパラメーターを調節して、酸素圧（１）０２）を５０〜７０トル、二酸化炭素（ｐｃＯｔ）を４５〜５０）ルの範囲内に維持した。動脈血のヘモグロビン飽和度を継続的にモニターするために脈拍酸素測定法（ｐｕｌｓｅ　ｏｘｉ＠ｅｔｒｙ）を用いた。

酸素化の指数として、動脈ｐｏｔの各測定時にａ／Ａ（動脈／肺胞）０．比を計算した。これら値は、サルの症状のＸ線写真及び臨床的評価と共に、ＲＤＳの存在及び重さの確認を可能にした。０．２〜０．４のａ／Ａ比によりＲＤＳの存在が確認でき、０，２未満の値はＲＤＳが重いことを示す。

ＲＤＳの診断が終わると、それぞれのサルを人工呼吸器で約２時間維持した。

次いで、ペプチド含有又はコントロール界面活性剤を気管内挿入管の下方に挿入した栄養管を通して投与した。合成界面活性剤の投与量の半分をその右脇腹で保持された該動物に投与し、もう半分をその左脇腹で保持された該動物に投与した。

図２Ａ及び２Ｂに示した実験において盲検を行った。即ち、個々の合成界面活性剤の滴注において、該動物にどの界面活性剤を投与したか（即ち、ペプチド含有界面活性剤かリン脂質コントロール界面活性剤か）について知らさなかった。

更に６〜１２時間人工呼吸器をつけて、各動物の症状を継続的にモニターした。

実験途中及び終了前のＸ線撮影も行った。実験が終了したときに、各動物を殺して（フェノバルビタール注射による）検死を行った。

Ｂ６結果上記の研究から得られたデータを図１．２及び３に示す。該図は以下の事柄を説明するものである。

図１は、肺機能に関するＲＬ４含有界面活性剤の投与の効果を示すものである。

図ＩＡで、酸素化指数（ａ／Ａ）を該動物の分娩後の時間（時間）に対してプロットしている。該界面活性剤を、上記のように、分娩後約２８時間に分割線量で投与した。図ＩＢては、第２のサルについて、上記のように、ＲＬ４含有界面活性剤を、分娩後最初の２．５時間の間に分割線量で投与した。第１のサル（図ＩＡ）におけるように、ペプチド含有界面活性剤投与後の数時間内にａ／Ａ比が劇的に向上した。

図２Ａ及びＢでは、肺機能に関するＫＬ４含有合成界面活性剤の投与の効果が示されている。図２Ａ及び２Ｂでは、８匹のサルについてのデータが示されている。ＫＬ４含有界面活性剤を投与したことが後に確認されたものか、サルＮ０１６．７．８及びｌＯとして特定されており、一方、他の界面活性剤（即ち、本発明の界面活性ペプチドを含有していないもの）を投与したサルがサルＮｏ、　３．５．９及び１１である。全てのプロットにおいて、ａ／Ａを誕生後の時間に対してプロットしており、所定の界面活性剤を投与した時間もプロットしている。

最終酸素についての値は、ペプチド含有界面活性剤を投与された動物が低濃度の吸気酸素に耐えたことを明らかにした。それらのｐｃＯｓレベルは低く、それらの血液の最終ｐＨは正常であり、そして、肉眼及び顕微鏡検査で確認されるように、それらの肺は膨張していた（この研究は上記したように盲検法で行った）。

それぞれの場合において、界面活性剤投与の直前に行ったＸ線撮影により肺領域が曇っていることが明らかになったが、ＫＬ４含有界面活性剤を投与した４匹のサルにおいてのみ、該肺領域は誕生後８〜ＩＯ時間まで鮮明であった。

サルＮｏ、　８において、ａ／Ａ比が向上しないのは、酸素の乏しい静脈血に右左シャントをさせてしまう心室中隔欠損の結果であることが分かった。ここに開示した合成界面活性剤を投与された他の全てのサルにおいては、ＲＤＳからの回復は劇的であった。

それぞれの霊長類の最終Ｆｉｇｓ、最終ｐｃＯ＊、最終ｐＨ，及び肺膨張（肉眼及び顕微鏡）も同しく測定した。収集しかつ記録したデータは以下の通りである。

サルＮｏ、３（図２Ａ−１）：最終ＦｉＯｔ５０；最終ｐｃＯｔ　７９．４；最終　、ｐＨ−７，２１；肺膨張、肉眼−０：肺膨張、　Ｉｊｌ微鏡−０゜サルＮｏ、５（図２Ａ−２）　・最終Ｆｉｇｓ　９０；最終ｐｃＯｔ　５８．６：最終ｐＨ−７，１７：肺膨張、肉眼−〇：肺膨張、Ｕ微鏡−０゜サルＮｏ、６（図２Ａ−３）：最終ＦｉＯ＊２１；最終ｐｃＯ＊−３９，４；最終ｐＨ−７，３９＋肺膨張、肉眼−４＋；肺膨張、顕微鏡−４＋。

サルＮｏ、７（図２Ａ−４）　・最終ＦｉＯｔ２１；最終ｐＣｏｔ　２９．３；最終ｐＨ−７，４７：肺膨張、肉眼−４＋；肺膨張、顕微鏡−３＋。

サルＮｏ、　８　（図２Ｂ−１）：最終Ｆ１０２２１；最終ｐｃＯ＊　３２．１；最終ｐＨ−７，４２；肺膨張、肉眼−４＋：肺膨張、顕微鏡−４＋。

サルＮｏ、９（図２　Ｂ−２）　最終ＦｆＯｔ　１００：最終ｐｃＯｔ　１５０．１　；最終ｐＨ−６，９０；肺膨張、肉眼−０：肺膨張、顕微鏡−０゜サルＮｏ、１０Ｃ図２Ｂ−３）：最終ＦｉＯｔ２１；最終ｐｃ’ｓ　３１．５　；最終ｐＨ−７，４２；肺膨張、肉眼−２＋；肺膨張、顕微鏡−３＋。　９サルＮｏ、１１（図２Ｂ−４）：最終ＦｉＯｔ５０；最終ｐｃＯ＊　５５．６；最終ｐＨ− ７，３１；肺膨張、肉眼−〇；肺膨張、顕微鏡−〇。

図３は、サルＮｏ、　１３におけるＫＬ４含有界面活性剤投与後の漸進的な経時（時間）的酸素離脱を示すものである。図３に記したように、ＫＬ４含有界面活性剤は、分娩後約１時間から２時間の間に投与した。０時間及び１００％吸入酸素（Ｆ　ｉ　Ｏｘ＝　１．　Ｏ）の時点で、該動物は１００％酸素を吸入しており、２２〜２５時間で、該動物は２０％酸素、即ち、室内空気を吸入した。

Ｃ０考察これらのデータから、本発明の合成界面活性剤は単に治療に有用であるのみならず、比較的短時間で受容体の肺機能に劇的な向上をもたらすと結論された。この有用性は、上記の適用において開示された製剤と同じペプチドを発育する合成界面活性剤を投与された動物が、ＲＬ４又はＫＬ４界面活性剤の投与後はＲＤＳから充分に回復したという事実により十分説明されている。

加えて、該データは、これら新規なペプチド含有界面活性剤を投与すれば、一旦、生物がもはや呼吸困難に陥らないことがａ／Ａ比により示された後は、高濃度酸素の投与を止めてもよいと保証できるに十分な回復が可能になることを示している。

上記で考察した実験結果は、ｉｎ　ｖｉｖｏ効能の価値あるｉｎ　ｖｉｔｒｏモデルを提供する、“脈動気泡”測定法（実施例１を参照のこと）から確認された知見、及びｉｎ　ｖｉｖｏ伸展性研究結果（実施例２を参照のこと）と一致する。更に“気泡”測定結果により、該合成界面活性剤（例えば、ＲＬ４及びＫＬ４を含む）がここに示したような治療的効能を示すことを予測できるようである。

具体的態様及び実施例を含む上記の明細書は本発明を説明することを意図したものであって、限定するものとして解釈されるべきでなない。本発明の本旨及び範囲から逸脱することなく多くの他の変更及び修飾を行うことができる。

配列表（１）一般的情報：（ｉ）出願人：コクラン　チャールズ　ジーリーヴアック　スーザン　ディー（ｉｉ）発明の名称：合成界面活性剤プチド（ｉｉ）配列の数：ｌｏ（ｉｖ）通信住所：（Ａ）受信人：ザ　スクリップス　リサーチ　インスティチュートオフィス　オン　パテントカランセル（Ｂ）通り：１０６６６ノーストレイ　パインズロード。

郵便差入口ＴＰＣ８（Ｃ）市：ラジョラ（Ｄ）州　カリフォルニア（Ｅ）国：合衆国（Ｆ）郵便番号：９２０３７（Ｖ）読み取り可能なコンピューターの型：（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣと互換性のあるもの（Ｃ）作動システム：　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントイン　リリース　Ｓｔ、Ｏ。

バージョン＃１．２５（ｖｌ）現出願データ：（Ａ）出願番号：　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０４５３７（Ｂ）出願日：１９９２年６月１日（Ｃ）分類：（ｖｉ）先行出願データ：（Ａ）出願番号：ＵＳ０７／７１５．３９７（Ｂ）出願日：ｌ９９１年６月１４日（ｖｉ）弁理士／代理人情報：（Ａ）氏名：ビンハム　ダグラス　ニー（Ｂ）登録番号・３２．４５７（Ｃ）整理／ドケット番号：５ＣＲＩ０２５Ｐ（ｉｘ）通信情報：（Ａ）を話・６１９−５５４−２９３７（Ｂ）ＦＡＸ：６１９−５５４−６３１２（２）配列番号１についての情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ　２１アミノ酸（Ｂ）型、アミノ酸（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｉｉ）配列の種類、ペプチド（ｘｉ）配列、配列番号Ｉ。

Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｌｅｖ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　へｒｇ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　八；＆（２）配列番号２についての情報：（１）配列の特徴。

（Ａ）長さ　２１アミノ酸（Ｂ）梨　アミノ酸（Ｄ）トポロジー　直鎖状（１１）配列の種類　ペプチド（Ｘ］）配列、配列番号２゜（２）配列番号３についての情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：２１アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号３：（２）配列番号４についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ、１９アミノ酸（Ｂ）型・アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類　ペプチド（Ｘり配列・配列番号４゜Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ＬｅｌＩＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ＾ｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＣｙｓムＵＬａｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ（２）配列番号５についての情報・（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長さ　２１アミノ酸（Ｂ）梨・アミノ酸（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｉｉ）配列の種類　ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号５：（２）配列番号６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２８アミノ酸（Ｂ）盟二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（Ｘり配列：配列番号６：（２）配列番号７についての情報：（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ　２１アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｌ）配列：配列番号７・Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌａ＊　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｌｔｕ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｌｙｉ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓｌ　１０　１５（２）配列番号８についての情報：（ｉ）配列の特＠：（Ａ）長さ　２１アミノ酸（Ｂ）型アミノ酸（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｉｉ）配列の種類　ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号８（２）配列番号９についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２１アミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号９゜（２）配列番号ｌＯについての情報＝（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ：２１アミノ酸（Ｂ）型アミノ酸（Ｄ）トポロジー・直鎖状（１ｉ）配列の種類：ペプチド（ｘｉ）配列：配列番号１０・図面の簡単な説明図１は、早産の新生子サルにおける肺機能に関するＲＬ４含有界面活性剤投与の効果を示すものである。図ＩＡに、酸素化指数（ａ／Ａ）を該動物分娩後の時間（時間）に対してプロットしている。該界面活性剤を、矢印で示したように、分娩後約２８時間に分割線量で投与した。図ＩＢでは、該界面活性剤を、分娩後最初の２．５時間の間に分割線量で投与した。２本の破線は該グラフを３区画に分けており、０．０〜０．２のａ／Ａ値を重い呼吸困難症候群（ＲＤＳ）と診断し、０２〜０．４のａ／Ａ値をＲＤＳと診断し、そして０．４又はそれより良好な値を“正常゛と考えていることを示している。

図２は、肺機能に関するＫＬ４含有合成界面活性剤投与の効果を示すものである。図２Ａ及び２Ｂに８匹のサルについてのデータが示されており、ＫＬ４含有界面活性剤を投与したことが後で確認されたサルが、サルＮｏ、　６．７．８及び１０（図２Ａ−３及び４．２Ｂ−１及び３）として特定されている一方、他の界面活性剤（即ち、本発明の界面活性ペプチドを含有していないもの）を投与したサルは、サルＮｏ、　３．５．９及び１１（図２Ａ−１及び２．２Ｂ−２及び４）である。全てのプロットにおいて、誕生後の時間に対してａ／Ａをプロットしており、所定の界面活性剤を投与した時間もプロットしている。

図３は、分娩されてＲＤＳと診断された霊長類からの、ＫＬ４含有界面活性剤投与後の漸進的な経時（時間）的酸素離脱を示すものである。Ｆｉｚｚを時間（時間）に対してプロットしている。ＫＬ４含有界面活性剤を投与した時間を矢印で示している。０時間及び１００％吸入酸素（Ｆ　ｉ　Ｏ＊＝　１．　Ｏ）の時点で該動物は１００％酸素を吸入しており、２２〜２５時間で該動物は２０％酸素を吸入している。これは室内空気と等しい。

図４は、合成界面活性剤ＲＬ４−ＣＹＳ、（ＲＬ４）４Ｒ１（ＲＬ４）ＳＲ１（ＲＬ４）、Ｒ１（ＲＬ４）７Ｒ１及び（ＲＬ４）ＳＲを使用したｉｎ　ｖｉｖｏ動的伸展性試験の結果を示すものである。記しであるように、ｎ＝３又は４である。該図は肺機能に関するＲＬ４含有界面活性剤の種々の製剤の投与効果を示し、ＲＬ４含有発育ペプチド適な長さを確認しようと試みた結果を明らかにしている。指定した製剤を使用して試験した動物についての平均動的伸展性値（ｍ＋空気／ｃｍＨｔＯ／ｇＸｌｏ″）を、界面活性剤投与後の時間（分）に対してプロットしている。

誕生後０時間　ＦＩＧ、２Ａ−１誕生後の時間　ＦＩＧ、２Ａ−２誕生後の時間　ＦＩＧ、２Ａ−３誕生？麦の時間　ＦＩＧ、２Ａ−４誕生？麦の時間　ＦＩＧ、２Ｂ−１誕生１の時間　ＦＩＧ、２Ｂ−４どＯ！ヨ〔ｎ＝３又は４〕分ＦＩＧ、　４

Claims

【特許請求の範囲】

１．１０〜約６０のアミノ酸残基を含むポリペプチドであって、式（ＺａＵｂ）ｃＺｄ；（式中：ＺはＲ及びＫから成る群から独立に選はれ；ＵはＬ及びＣから成る群から選ばれ；ａは約１〜約５の平均値を有し；ｂは約３〜約８の平均値を有し；ｃは３〜８であり；そしてｄは０〜２である。）で表される、疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に有する配列を含む前記ポリペプチド。
２．前記ポリペプチドが、それぞれ配列番号７〜９である、式：【配列があります】又は【配列があります】により表されるアミノ酸残基配列を有する、請求項１記載のポリペプチド。
３．１０〜約６０のアミノ酸残基を含むポリペプチドと混合された薬学的に許容できるリン脂質を含む合成肺界面活性剤であって、前記ポリペプチドが、式（ＺａＵｂ）ｃＺｄ；（式中：ＺはＲ及びＫから成る群から独立に選ばれる親水性アミノ酸残基であり；ＵはＬ及びＣから成る群から選ばれ；ａは約１〜約５の平均値を有し；ｂは約３〜約８の平均値を有し；ｃは３〜８であり；そしてｄは０〜２である。）により表される、疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に有する配列を含む合成肺界面活性剤。
４．前記ポリペプチドが、それぞれ配列番号１〜９である、【配列があります】及び【配列があります】から成る群から選ばれるアミノ酸残基配列を有するポリペプチドである、請求項３記載の合成肺界面活性剤。
５．脂肪酸、及びそれぞれ配列番号１〜９である、式：【配列があります】又は【配列があります】により表されるアミノ酸残基配列を有するポリペプチドと混合された２種の薬学的に許容できるリン脂質を含む合成肺界面活性剤。
６．１又は２以上の薬学的に許容できるリン脂質を、１０〜約６０のアミノ酸残基を含む治療的に有効量のポリペプチドと混合することを含む、呼吸困難症候群の治療に有用な治療薬の製造方法であって、前記ポリペプチドが、式（ＺａＵｂ）ｃＺｄ；（式中：ＺはＲ及びＫから成る群から独立に選ばれる親水性アミノ酸残基であり；ＵはＬ及びＣから成る群から選ばれ；ａは約１〜約５の平均値を有し；ｂは約３〜約８の平均値を有し；ｃは３〜８であり；そしてｄは０〜２である。）により表される、疎水性及び親水性アミノ酸残基領域を交互に有する配列を含む方法。
７．前記ポリペプチドが、それぞれ配列番号１〜９である、式：【配列があります】又は【配列があります】により表されるアミノ酸残基配列を有する、請求項６記載の方法。
８．式：【配列があります】（配列番号７）により表されるポリペプチド。
９．式：【配列があります】（配列番号７）；により表されるポリペプチドと混合された薬学的に許容できるリン脂質を含む合成肺界面活性剤であって、前記ポリペプチドが、薬学的に許容できるリン脂質と混合したときに、リン脂質単独の界面活性よりも大きい界面活性を有する合成肺界面活性剤を生成する、合成肺界面活性剤。
１０．１又は２以上の薬学的に許容できるリン脂質を、式：【配列があります】（配列番号７）；により表される有効量のポリペプチドと混合することを含む、呼吸困難症候群の治療に有用な治療薬の製造方法であって、前記ポリペプチドが、１又は２以上の薬学的に許容できるリン脂質と混合したときに、リン脂質単独の界面活性よりも大きい界面活性を有する合成肺界面活性剤を生成する方法。