DE69129743T2

DE69129743T2 - Humanisierte chimäre anti-"icam-1" antikörper, herstellungsverfahren und verwendung

Info

Publication number: DE69129743T2
Application number: DE69129743T
Authority: DE
Inventors: John Robert 23 George Road Stokenchurch Buckinghamshire Hp14 3Rn Adair; Susan Margaret Buckinghamshire Sl7 2Ay Bright; Martyn Kim 62 Strawberry Vale Middlesex Tw1 4Se Robinson; Robert A. Danbury Ct 06811 Rothlein
Original assignee: Celltech R&D Ltd; Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc
Current assignee: UCB Celltech Ltd; Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1990-04-27
Filing date: 1991-04-29
Publication date: 1999-02-11
Anticipated expiration: 2011-04-30
Also published as: AU649682B2; NO924088D0; NO984136D0; NO924088L; EP0528931A1; NO984136L; DE69129743D1; AU7860391A; ATE168013T1; DK0528931T3; HU9203370D0; FI924819A0; EP0528931A4; BR9106394A; FI924819A; WO1991016928A1; HUT66103A; CA2081479A1; JPH05507406A; EP0528931B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein humanisiertes chimäres Antikörper-Molekül mit Spezifizität gegenüber einem antigenen Determinanten des Zwischenzelladhäsionsmoleküls 1 (ICAM-1 = "Intercellular Adhesion Molecule 1") sowie dessen therapeutische Verwendung.
Verwendet wird im vorliegenden der Terminus "chimäres Antikörper-Molekül" zur Beschreibung eines Antikörper-Moleküls mit schweren und/oder leichten Ketten und dessen schwere und/oder leichte Ketten zumindest in deren variablen Bereichen von einem einzelnen Immunoglobulin-Molekül abgeleitet sind, welches mit zumindest einem Teil eines zweiten Proteins verbunden ist. Das zweite Protein kann zusätzliche Domänen konstanter Antikörperbereiche enthalten, die von einem anderen Immunoglobulin-Molekül oder von einem Nicht-Immunoglobulin-Molekül abgeleitet sind. Verwendet wird der Terminus "humanisiertes chimäres Antikörper-Molekül" zur Beschreibung eines Moleküls, dessen Domänen variabler Bereiche der schweren und leichten Ketten von einem Immunoglobulin einer nicht- humanen Spezies abgeleitet sind, während die restlichen Domänen konstanter Immunoglobulin-Bereiche des Moleküls von einem humanen Immunoglobulin abgeleitet sind. Das Kürzel "MAb" wird verwendet, um einen monoklonalen Antikörper zu bezeichnen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von humanisierten chimären Antikörpern, die zur Bindung an ICAM-1 fähig sind und so die Zwischenzelladhäsion von Zellen aus den Stämmen der Granulozyten oder Makrophagen hemmen. Verwendbar sind solche Moleküle bei der Herstellung eines Mittels zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung von spezifischer und unspezifischer Entzündung.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch noch einen humanisierten chimären Antikörper, der bei der Behandlung von viraler und insbesondere rhinoviraler Erkrankung zur Bindung an ICAM-1 fähig ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch noch ein Mittel zur Verwendung bei therapeutischen und prophylaktischen Verfahren zur Unterdrückung der Infektion von Leukozyten durch HIV und insbesondere HIV-1 bei einem Individuum, das dem HIV ausgesetzt oder durch HIV infiziert ist und deswegen eine solche Unterdrückung durch Verabreichung eines zur Bindung an ICAM-1 fähigen humanisierten chimären Antikörpers benötigt. Sie stellt somit ein Mittel zur Verfügung zur Verwendung bei einer Behandlung von Erkrankungen wie AIDS ( = "Acquired Immunodeficiency Syndrome" = Syndrom der erworbenen Immundefizienz), die vom HIV-Virus verursacht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch noch ein Mittel zur Verwendung bei einem therapeutischen Verfahren zur Unterdrückung der Migration von durch HIV-1 infizierten Zellen aus dem Kreislaufsystem heraus durch Verwendung eines zur Bindung an ICAM-1 fähigen humanisierten chimären Antikörpers. Sie stellt somit ein Mittel zur Verfügung zur Verwendung bei einer Behandlung von Erkrankungen wie AIDS, die vom HIV-1-Virus verursacht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines zur Bindung an ICAM-1 fähigen humanisierten chimären Antikörpers zur Herstellung eines bei der Behandlung von Asthma verwendbaren Mittels.

Hintergrund der Erfindung

A. Humanisierte Antikörper

Natürliche Immunoglobuline sind seit Jahren bekannt, wie auch deren verschiedene Fragmente wie die Fragmente Fab, (Fab')&sub2; und Fc, die durch enzymatische Spaltung ableitbar sind. Natürliche Immunoglobuline enthalten ein allgemein Y- förmiges Molekül mit einer Antigen-Bindungsstelle in der Gegend des freien Endes eines jeden oberen Armes. Die restliche Struktur und insbesondere der Stamm des Y vermittelt die dem Immunoglobulin zugeordneten Effektorfunktionen.
Natürliche Immunoglobuline sind bei Untersuchungen (As says), bei der Diagnose und in geringerem Umfang bei der Therapie verwendet worden. Verwendungen dieser Art, insbesondere bei der Therapie, wurden jedoch von der polyklonalen Beschaffenheit der natürlichen Immunoglobuline gehemmt. Ein bedeutsamer Schritt bei der Wahrnehmung des Potentials der Immunoglobuline als therapeutische Mittel bestand in der Entdeckung von Techniken zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern von definierter Spezifizität [Kohler et al., Nature 265: 295- 497 (1975)]. Jedoch werden die meisten monoklonalen Antikörper durch Fusion von Nager-Milzzellen mit Nager-Myelomzellen hergestellt. Deshalb handelt es sich dabei grundsätzlich um Nager-Proteine. Berichte über die Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern gibt es nur sehr wenige.
Da die meisten verfügbaren monoklonalen Antikörper von Nager-Herkunft sind, sind sie von Natur aus beim Menschen antigenartig, und sie können zu einer unerwünschten Immunantwort führen, die als HAMA-Antwort (HAMA = "Human Anti-Mouse Antibody") bezeichnet wird. Somit wird die Verwendung von monoklonalen Nager-Antikörpern als therapeutische Mittel inhärent durch die Tatsache beschränkt, dass das humane Subjekt eine immunologische Antwort auf den monoklonalen Antikörper aufbaut und ihn entweder ganz entfernt oder zumindest dessen Wirksamkeit vermindert. In der Praxis sind monoklonale Antikörper von Nager-Herkunft bei einem Patienten nicht für mehr als eine oder einige wenige Behandlungen verwendbar, da sich eine HAMA-Antwort bald einstellt und den monoklonalen Antikörper unwirksam macht sowie unerwünschte Reaktionen verursacht.
Es sind deshalb Vorschläge gemacht worden im Hinblick darauf, die nicht-humanen monoklonalen Antikörper beim Menschen weniger antigenartig zu machen. Solche Techniken werden allgemein als Humanisierungstechniken bezeichnet. Diese Techniken umfassen im allgemeinen eine Verwendung der Technologie der rekombinanten DNA zur Manipulation von DNA-Sequenzen, welche für die Polypeptid-Ketten der Antikörper-Moleküle codieren.
Insbesondere ist eine zur Herstellung von humanisierten Antikörpern vorgeschlagene Vorgehensweise die sogenannte Chimärisierungs-Prozedur.
Solche Chimärisierungs-Prozeduren umfassen die Produktion von chimären Antikörpern, bei denen eine die vollständigen variablen Domänen des einen Antikörpers umfassende Antigen- Bindungsstelle mit von einem anderen Antikörper abgeleiteten konstanten Domänen verbunden ist. Einige der älteren Methoden zur Durchführung einer solchen Chimärisierungs-Prozedur sind in EP-A-0120694 (Celltech Limited), EP-A-0125023 (Genentech Inc. und City of Hope), EP-A-0171496 (Res. Dev. Corp. Japan), EP-A-0173494 (Stanford University) und EP-A-0194276 (Celltech Limited) beschrieben. Die letztgenannte Patentanmeldung von Celltech offenbart auch die Produktion eines Antikörper-Moleküls, welches die variablen Domänen eines murinen monoklonalen Antikörpers, die CH1- und CL-Domänen eines humanen Immunoglobulins und anstelle des Fc-Teiles des humanen Immunoglobulins ein nicht-imunoglobulinartiges abgeleitetes Protein umfasst.

B. Leukozyten-Anhaftung und Funktionen davon

Leukozyten und Granulozyten müssen fähig sein, sich an zelluläre Substrate anzuhaften, um eine Entzündungsantwort entstehen zu lassen und den Wirtsorganismus auf richtige Weise gegen fremde Eindringlinge wie Viren, Bakterien und Allergene zu verteidigen. Diese Tatsache wurde aus zwei konvergenten Forschungsrichtungen offensichtlich.
Die erste Forschungsrichtung umfasst Untersuchungen von Proteinen der Leukozytenmembran [Wallis W. J. et al., J. Immunol. 135: 2323-2330 (1985); Mentzer S. J. et al., J. Cell. Physiol. 126: 285-290 (1986); Haskard D. O. et al., J. Immunol. 137: 2901-2906 (1986); Harlan J. M. et al., Blood 66: 167-178 (1985)]. Von besonderer Bedeutung für die Prozesse der Zelladhäsion ist eine Familie von Proteinen der Leukozytenmembran, die als "CD18"-Familie oder -Komplex bekannt ist. Diese Familie besteht aus drei Heterodimeren (welche als "Mac-1", "LFA-1" und "p150,90" bekannt sind) und von denen alle eine (als β-Untereinheit bezeichnete) gemeinsame Untereinheit und eine (als α-Untereinheit bezeichnete) einzigartige Untereinheit haben [Springer T. A. et al., Immunol. Rev. 68: 111-135 (1982); Springer T. et al., Fed. Proc. 44: 2660-2663 (1985); Sanchez-Madrid et al., J. Exper. Med. 158: 1785-1803 (1983)].
Monoklonale Antikörper gegen die CD18-Familie von Proteinen der Leukozytenmembran hemmen in vitro durch ihre Einwirkung als Antagonisten dieser Proteine eine Vielzahl von Ereignissen, die von der Leukozytenadhäsion abhängig sind. Diese umfassen die Fähigkeit von Granulozyten zur Aggregation in Antwort auf geeignete Stimuli, die Fähigkeit von Granulozyten zur Anhaftung an proteinbeschichteten Kunststoff, die Fähigkeit von Granulozyten zur Migration in zweidimensionalen Agarose-Untersuchungen (Assays) und die Fähigkeit von Granulozyten zur Anhaftung an Endothelzellen.
Die zweite Forschungsrichtung ergibt sich aus Untersuchungen an Individuen, die zufolge eines erblichen Defekts an dem für die gemeinsame Untereinheit der CD18-Familie von Leukozytenadhäsionsmolekülen codierenden Gen unfähig sind, jegliche dieser Adhäsionsmoleküle an den Oberflächen ihrer Zellen zu exprimieren. Von diesen Individuen sagt man, dass sie an "Leukozytenadhäsionsdefizienzkrankheit" (LAD = "Leukozyte Adherence Deficiency Disease") leiden [Anderson D. C. et al., Fed. Proc. 44: 2671-2677 (1985); Anderson D. C. et al., J. Infect. Dis. 152: 668-689 (1985)]. Charakteristische Erscheinungen an LAD-Patienten umfassen nekrotische Läsionen von Weichgewebe, verhinderte Eiterbildung und Wundenheilung sowie Abnormitäten der adhäsionsabhängigen Leukozytenfunktionen in vitro und Empfindlichkeit für chronische und wiederkehrende bakterielle Infektionen. Granulozyten dieser LAD-Patienten verhalten sich in vitro auf gleiche defekte Weise wie ihre normalen Pendants in Gegenwart von monoklonalen Anti-CD18- Antikörpern. In anderen Worten, sie sind unfähig, mit der Adhäsion im Zusammenhang stehende Funktionen wie Aggregation oder Anhaftung an Endothelzellen auszuführen. Viel wichtiger ist jedoch die Beobachtung, dass diese Patienten wegen der Unfähigkeit ihrer Granulozyten zur Anhaftung an zellulären Substraten unfähig sind, eine normale Entzündungsantwort aufzubauen. Ganz besonders bemerkenswert ist die Beobachtung, dass Granulozyten dieser LAD-Patienten wegen ihrer Unfähigkeit zur Anhaftung an die Endothelzellen in den Blutgefässen in Nähe der Entzündungsläsionen unfähig sind, zu den Entzündungsstellen wie beispielsweise Hautinfektionen zu gelangen. Eine solche Anhaftung ist ein zur Extravasation unerlässlicher Schritt.
Zusammenfassend ist somit zur Fähigkeit der Lymphozyten und Granulozyten, die Gesundheit und Lebensfähigkeit eines Tieres zu erhalten, erforderlich, dass sie fähig sind, sic h an andere Zellen (wie Endothelzellen) anzuhaften. Es wurde festgestellt, dass die Anhaftung von Granulozyten an die Endothelzellen Kontakte zwischen Zellen erfordert, an denen spezifische, an der Zelloberfläche der Granulozyten vorhandene Rezeptormoleküle mitbeteiligt sind. Diese Rezeptoren ermöglichen einem Leukozyten, sich an andere Leukozyten oder an Endothelzellen oder andere nicht-vaskuläre Zellen anzuhaften.
Es wurde festgestellt, dass die Rezeptormoleküle der Zelloberfläche der Leukozyten miteinander sehr stark verwandt sind. Menschen, bei deren Leukozyten diese Rezeptormoleküle der Zelloberfläche fehlen, weisen chronische und wiederkehrende Infektionen wie auch andere klinische Symptome auf. Entzündungsreaktionen werden milder, wenn die Leukozyten wegen des Fehlens von funktionellen Adhäsionsmolekülen des CD18-Komplexes unfähig sind, sich auf normale Weise anzuhaften. Da die Leukozytenadhäsion am Prozess mitbeteiligt ist, nach welchem eine Gewebeentzündung entsteht, ist es bei der Definition eines Behandlung von spezifischer und nicht- spezifischer Entzündung von beachtlichem Wert, den Prozess der Leukozytenadhäsion zu verstehen.
Da zudem die Lymphozytenadhäsion am Prozess mitbeteiligt ist, nach welchem Fremdkörper und Fremdgewebe identifiziert und verstossen wird, ist es auf den Gebieten der Organtransplantation, der Gewebeverpflanzung, der Allergie und der Onkologie von beachtlichem Wert, diesen Prozess zu verstehen.

C. Das Zwischenzelladhäsionsmolekül ICAM-1 und die Zelladhäsion

Erstmals wurde das Zwischenzelladhäsionsmolekül ICAM-1 nach der Vorgehensweise von Rothlein et al. [J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)] identifiziert und teilweise bestimmt. ICAM-1, dessen Herstellung, Reinigung und Merkmale werden in WO-90/03400 offenbart.
Anfänglich wurde ICAM-1 aufgefasst als am Prozess der Zelladhäsion zwischen Endothelzellen und Leukozyten mitbeteiligt. Zelladhäsion ist der Prozess, durch welchen sich Leukozyten an Zellsubtrate wie Endothelzellen heften, um vom Kreislauf zu Stellen zu wandern, an denen eine Entzündung stattfindet, und den Wirtsorganismus gegen fremde Eindringlinge wie Bakterien oder Viren richtig zu verteidigen. Eine ausgezeichnete Übersicht des Verteidigungssystems wird von Eisen, H. W. in Microbiology, 3. Ausgabe, Harper & Row, Philadelphia PA (1980), Seiten 290-295 und 381-418 gegeben.
Eines der Moleküle an der Oberfläche der am Adhäsionsprozess beteiligten Endothelzellen ist ICAM-1. Es wurde nachgewiesen, dass dieses Molekül Adhäsion vermittelt, indem es sich an Moleküle der CD18- und CD-11/18-Familie von Glykoproteinen bindet, die sich an den Zelloberflächen von Leukozyten befinden [Sanchez-Madrid F. et al., J. Exper. Med. 158: 1785- 1803 (1983); Keiser et al., Eur. J. Immunol. 15: 11421147 (1985)].
Das Zwischenzelladhäsionsmolekül (ICAM-1) ist ein induzierbares Zelloberflächenglykoprotein, das auf verschiedenen Typen von Zellen und insbesondere vaskulären Endothelzellen und vorzugsweise an Entzündungsstellen exprimiert wird. Da ICAM-1 der natürliche Bindungsligand von LFA-1 ist, spielen Wechselwirkungen zwischen ICAM-1 und LFA-1 eine zentrale Rol le bei der Zelladhäsion, bei der Aushebung von Lymphozyten zu den Entzündungsstellen und beim Auslösen der Lymphozytenfunktionen, die der spezifischen sowie der nicht-spezifischen Entzündung beitragen,

D. Der Zellrezeptor für humanen Rhinovirus

Abraham et al. [J. Virol. 51: 340-345 (1984)] haben entdeckt, dass die Mehrzahl der zufallsweise ausgewählten Serotypen des humanen Rhinovirus fähig sind, sich an denselben Zellrezeptor zu binden. Später wurde von Colonno et al. [Colonno et al., J. Cell. Biochem. Suppl. 10(D): 266 (1986); Colonno et al., J. Virol. 57: 7-12 (1986); Colonno et al., EP-A- 0169146] ein monoklonaler Antikörper entwickelt, der fähig war, die Anhaftung von HRV des Haupt-Setotypus an die Oberflächen von Endothelzellen zu blockieren. Das von diesem Antikörper erkannte Endothelzellen-Rezeptorprotein wurde isoliert, und es wurde gefunden, dass es ein 90-kd-Protein ist [Tomassini et al., J. Virol. 58: 290-295 (1986)] und später gezeigt, dass es das ICAM-1-Molekül ist [Staunton et al., Cell 56: 849-854 (1989)].
Es wurde eine Behandlung von Rhinovirus-Infektion, insbesondere der Infektion durch den Haupttypus des humanen Rhinovirus, unter Verwendung eines gegen den viralen Rezeptor, ICAM-1, gerichteten murinen monoklonalen Antikörpers vorgeschlagen (EP-0391088).

E. Infektion durch HIV

Infektion durch HIV ist die Ursache von AIDS. Es wurden zwei Hauptvarianten von HIV beschrieben: HIV-1 und HIV-2. HIV-1 ist in Nordamerika und Europa vorherrschend, dies im Gegensatz zu HIV-2, welches nur in Afrika vorherrschend ist. Die Viren haben ähnliche Strukturen und codieren für Proteine von ähnlicher Funktion. Es wurde gefunden, dass die Nucleotid- und Proteinsequenzen der Gene und Genprodukte der beiden Varianten miteinander eine Homologie von etwa 40% aufweisen.
Es wird gemeint, dass die Infektion durch HIV über die Bindung eines als "gp120" bezeichneten viralen Proteins an ein als "CD4" bezeichnetes Rezeptormolekül erfolgt, das an der Oberfläche von als "T-Helfern" bezeichneten T4-Lymphocyten vorhanden ist [Schnittman S. M. et al., J. Immunol. 141: 4181-4186 (1988)]. Daraufhin tritt das Virus in die Zelle ein, und es fängt an, sich zu vermehren in einem Prozess, der schliesslich zum Tod der T-Zelle führt. Die Vernichtung der T4-Population eines Individuums ist ein unmittelbares Ergebnis der Infektion durch HIV. HIV kann aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes und aus humanem Plasma gewonnen werden (J. Clin. Microbiol. 26: 2371-2376 (1988); N. Engl. J. Med. 321: 1621-1625 (1989)]. Resultate deuten hin auf mehr Viremie, als früher geschätzt wurde, und auf eine bis zu 1%ige Frequenz der Infektion der T-Zellen.
Aus der Vernichtung der T-Zellen ergibt sich eine Verhinderung der Fähigkeit des infizierten Patienten, opportunistische Infektionen zu bekämpfen. Obwohl an AIDS leidende Individuen oft Krebs entwickeln, ist eine Beziehung zwischen diesen Krebserscheinungen und der Infektion durch HIV in den meisten Fällen unsicher.
Obwohl bereits nur die Vermehrung des HIV-Virus für die infizierten Zellen tödlich ist, wird diese Vermehrung typisch nur in einem kleinen Bruchteil der T4-Zellen eines infizierten Individuums festgestellt. Mehrere Forschungsrichtungen haben andere Mechanismen aufgedeckt, mit denen das HIV-Virus die Vernichtung der T4-Population vermittelt.
Ausser durch die Vermehrung des HIV können durch HIV infizierte Zellen durch die Wirkung von zytotoxischen Killerzellen vernichtet werden. Killerzellen sind beim Menschen normalerweise vorhanden und dienen der Überwachung des Wirtsorganismus und der Vernichtung jeglicher angetroffenen fremder Zellen (wie bei nicht zusammenpassender Bluttransfusion oder Organtransplantation usw.). Nach einer Infektion durch HIV zeigen die T4-Zellen das gp120-Molekül auf deren Zell oberfläche. Killerzellen erkennen solche T4-Zellen als fremd (statt als einheimische Zellen) und vermitteln dementsprechend ihre Zerstörung.
Die Infektion durch HIV kann auch zur Vernichtung von nicht infizierten gesunden Zellen führen. Infizierte Zellen können das gp120-Protein in das Blutsystem sekretieren. Die freien gp120-Moleküle können sich dann an die CD4-Rezeptoren von gesunden nicht infizierten Zellen binden. Eine solche Bindung verursacht, dass die Zelle die Erscheinungsform einer durch HIV infizierten Zelle annimmt. Zytotoxische Killerzellen erkennen das an die nicht infizierten T4-Zellen gebundene gp120, schliessen daraus, dass die Zelle fremd ist, und vermitteln die Zerstörung der T4-Zellen.
Ein zusätzlicher Mechanismus, nach welchem HIV den T4- Tod verursachen kann und der zudem bei der vorliegenden Erfindung von besonderem Interesse ist, läuft über die Bildung von Synzytien ab. Ein "Synzytium" ist eine Riesenzelle mit mehreren Nuclei, die aus der Fusion von bis zu Hunderten von T4-Zellen gebildet wurde. Die Infektion durch HIV hat zur Folge, dass die infizierten Zellen fähig werden, mit anderen T4-Zellen zu fusionieren. Solche Fusionspartner können ihrerseits durch HIV infiziert sein, oder sie können nicht- infizierte gesunde Zellen sein. Das Synzytium ist nicht funktionsfähig und stirbt bald ab. Sein Tod verursacht die Vernichtung sowohl der durch HIV infizierten als auch der durch HIV nicht infizierten T4-Zellen. Dieser Prozess ist bei der vorliegenden Erfindung von besonderem Interesse, weil er den direkten Zellen-Zellen-Kontakt der T4-Zellen beteiligt. Somit können Zellen-Zellen-Kontakte beim Prozess, nach welchem innerhalb eines Individuums die Infektion durch HIV von der einen auf die andere Zelle übertragen wird, von grundlegender Wichtigkeit sein.
Es zeigt sich, dass die Infektion durch HIV und insbesondere die Infektion durch HIV-1 die Expression der Leukozyten-Integrine an der Zelloberfläche sowie die von diesen Heterodimeren vermittelten Zelladhäsionsreaktionen beeinflusst [Petit A. J. et al., J. Clin. Invest. 79: 188 (1987); Hildreth J. E. K. et al., Science 244: 1075 (1989); Valentin A. et al., J. Immunol. 144; 934-937 (1990); Rossen R. D. et al., Trans. Assoc. American Physicians 102: 117-130 (1989)]. Nach einer Infektion durch 111 V erhöht sich die homotypische Aggregation von U937-Zellen wie auch die Expression von CD18 und CD11b an der Zelloberfläche [Petit A. J. et al., J. Clin. Invest. 79: 188 (1987)]. Die durch HIV infizierten U937-Zellen heften sich an das durch IL-1 stimulierte Endothel mit grösserer Frequenz als die nicht infizierten U937-Zellen; dieses Verhalten kann unterdrückt werden durch Behandlung der infizierten Zellen mit monoklonalen Anti-CD18- oder Anti-CD11a-Antikörpern oder durch Behandlung der Endothelsubstrate mit Anti- ICAM-1 [Rossen R. D. et al., Trans. Assoc. American Physicians 102: 117-130 (1989)]. Es wurde auch gefunden, dass monoklonale Antikörper gegen CD18 oder CD11a fähig sind, die Bildung von Synzytien zu hemmen, an denen durch Phytohemagglutinin (PHA) stimulierte Lymphoblastoidzellen und grundsätzlich infizierte CD4-negative T-Zellen beteiligt sind [Hildreth J. E. K. et al., Science 244: 1075 (1989)]. Es zeigte sich, dass die Behandlung nur der durch das Virus infizierten Zellen mit monoklonalen Anti-CD18- oder Anti-CD11a-Antikörpern auf die Bildung von Synzytien nur wenig wirkt, was nahelegt, dass diese Antikörper hauptsächlich nicht-infizierte Zielzellen schützen [Hildreth J. E. K. et al., Science 244: 1075 (1989); Valentin A. et al., J. Immunol. 144: 934-937 (1990)]. Dabei haben Valentin A. et al. diese Beobachtungen kürzlich bestätigt [Valentin A. et al., J. Immunol. 144: 934-937 (1990)], indem sie aufgezeigt haben, dass gegenüber CD18 spezifische monoklonale Antikörper Synzytien hemmen, die sich bilden, wenn kontinuierliche T- Zellenstämme zusammen mit durch HIV infizierten U937-Zellen co-kultiviert werden.
Obschon der Mechanismus unbekannt bleibt, durch welchen empfindliche Zellen von monoklonalen Antikörpern gegen CD18 oder CD11a vor der Fusion mit durch HIV infizierten Zellen geschützt werden, und dieser Mechanismus zur Wahrnehmung der vorliegenden Erfindung nicht benötigt wird, deuten Untersuchungen mit radiomarkiertem gp120 an, dass CD18 enthaltende Heterodimere keine Bindungsstelle für das Virus zur Verfügung stellen [Valentin A. et al., J. Immunol. 144: 934-937 (1990)]. Beteiligt sind somit an der Infektion durch HIV Zellen-Zellen-Wechselwirkungen und/oder Viren-Zellen-Wechselwirkungen, die solche Zellen-Zellen-Wechselwirkungen nachahmen. Die Zellen-Zellen-Wechselwirkungen können zum Transport des zellfreien Virus oder zum Transport des Virus innerhalb des Cytoplasmas infizierter mononukleärer Zellen bei der Durchquerung von Endothelschranken führen. Viren-Zellen-Wechselwirkungen, welche die Zellen-Zellen-Wechselwirkungen nachahmen, können freiem Virus erleichtern und ermöglichen, sich an gesunde Zellen zu heften und/oder diese zu infizieren.
Somit leitet sich die vorliegende Erfindung teilweise von der Beobachtung ab, dass die Infektion durch HIV und insbesondere durch HIV-1 zu einer erhöhten Expression des CD11a/CD18-Heterodimers und dessen Bindungsliganden ICAM-1 führt. Diese erhöhte Expression ist bedeutsam, indem sie die Fähigkeit der durch HIV infizierten T-Zellen erhöht, sich aneinander zu heften oder miteinander Aggregate zu bilden (d. h. "homotypische Aggregation" einzugehen). Da das Vorkommen einer derartigen homotypischen Aggregation bei ruhenden normalen Leukozyten nicht beobachtet wird, zeigt diese Entdeckung auf, dass die Expression der CD11/CD18-Rezeptoren und/oder von ICAM-1 für eine solche Aggregation erforderlich ist. Eine derartige Adhäsion ermöglicht dem HIV-1, von einer infizierten Zelle zu einer gesunden Zelle eines Individuums übertragen zu werden, und sie ermöglicht oder erleichtert auch die Infektion der gesunden Zellen durch freies Virus.
Da ICAM-1 bei den Zellen-Zellen-Wechselwirkungen eine zentrale Rolle spielt, wurden sich an ICAM-1 bindende murine monoklonale Antikörper als Methode zur Vorbeugung gegen Infektion durch HIV vorgeschlagen [WO-90/13281].

F. Migration von durch HIV infizierten Zellen

Die Migration und Verbreitung von Leukozyten ist im Hinblick auf den Schutz eines Individuums vor den Folgen einer Infektion wichtig. Diese Prozesse sind jedoch auch für die Migration und Verbreitung von durch Viren infizierten Leukozyten verantwortlich. Von besonderem Belang ist die Migration und Verbreitung von durch HIV infizierten Leukozyten. Die Migration von derartigen Zellen hat die Bildung von extravaskulären Fokussen zur Folge und kann Tumore und andere Missbildungen verursachen.
Eine histologische Untersuchung der befallenen Organe bringt extravaskuläre Infiltrate von mononukleären Zellen zum Vorschein. Versuche, im zentralen Nervensystem durch Viren infizierte Zellen in derartigen Infiltraten zu identifizieren, brachten die Anwesenheit von durch HIV-1 infizierten Zellen zum Vorschein. Diese Untersuchungen zeigten, dass HIV- 1 sich in erster Linie in Monozyten und Makrophagen sowie anderen Zellen gleicher Abstammung befindet [Johnson R. T. et al., FASEB J. 2: 2970 (1988); Stoler M. H. et al., J. Amer. Med. Assn. 256: 2360 (1986); Gartner 5. et al., J. Amer. Med. Assn. 256: 2365 (1986); Gartner S. et al., Science 233: 215 (1986)].
Die Mechanismen, welche die Bildung von extravaskulären Infiltraten von durch HIV-1 infizierten Monozytoidzellen stimulieren, wurden bisher nicht gut definiert. An diesen Mechanismen können entweder der Transport des zellfreien Virus oder der Transport des Virus innerhalb des Cytoplasma infizierter mononukleärer Zellen bei der Durchquerung von Endothelschranken beteiligt sein.
Da die Infektion durch HIV-1 die Expression von Molekülen stimuliert, welche die Anhaftung von Leukozyten an extravaskuläre Endothelzellen und die Translokation von Leukozyten aus dem Blut zu extravaskulären Gewebestellen erleichtern [Smith C. W. et al., J. Clin. Invest. 82: 1746 (1988)], wurde vorgeschlagen, zur Vermeidung der Verbreitung von durch HIV infizierten Zellen Antikörper zu verwenden, welche die Zellmigration hemmen [WO-90/13316].

G. Asthma: Klinische Merkmale

Asthma ist eine heterogene Familie von Krankheiten. Es kennzeichnet sich durch das Merkmal einer Überreaktion der Trachea und der Bronchien gegenüber Reizen [McFadden E. R. et al., Harrison's Principles of Internal Medicine, 10. Ausgabe, Herausgeber: Petersdorf R. G. et al., McGraw-Hill, NY (1983), Seiten 1512-1519; Kay A. B., Allergy and Inflammation, Academic Press, NY (1987)]. Klinisch manifestiert sich Asthma durch ausgeprägte Verengung der Trachea und der Bronchien, durch dicke, zähe Absonderungen, durch Anfälle von Atemnot, Husten und pfeifende Atmung. Obwohl der relative Beitrag eines jeden dieser Zustände nicht bekannt ist, ist das Endergebnis eine Zunahme des Widerstandes der Luftwege, ein überstarkes Aufblähen der Lungen und des Thorax, eine anomale Verteilung der Ventilation und des Lungenblutflusses. Die Krankheit manifestiert sich durch episodische Zeitabschnitte akuter Symptome unterbrochen von symptomfreien Zeitabschnitten. Die akuten Episoden haben Sauerstoffmangel zur Folge und können tödlich verlaufen. Ungefähr 3% der Weltbevölkerung leidet an dieser Krankheit.
Es wurden zwei Typen von Asthma beschrieben: allergisches Asthma und idiosynkratisches Asthma. Allergisches Asthma kommt normalerweise zusammen mit einer vererbbaren allergischen Krankheit wie Rhinitis, Urtikaria, Ekzeme, usw. vor. Der Zustand kennzeichnet sich durch positive "Quaddel- und-Hof"-Reaktionen auf intradermale Injektionen von in der Luft befindlichen Antigenen (wie Pollen, Umweltverschmutzungen oder am Arbeitsplatz auftretenden Schadstoffe, usw.) sowie erhöhte IgE-Spiegel im Serum. Bei vielen Patienten scheint die Entwicklung des allergischen Asthmas kausal mit der Anwesenheit von IgE-Antikörpern zusammenzuhängen. Bei Asthmapatienten, welche die oben beschriebenen Merkmale nicht aufweisen, spricht man von idiosynkratischem Asthma.
Es wird gemeint, dass allergisches Asthma von einer durch T- und B-Lymphozyten kontrollierten IgE-Antwort abhängig ist und durch eine Wechselwirkung von in der Luft befindlichen Antigenen mit an Mastzellen gebundenen vorgebildeten IgE-Molekülen aktiviert wird. Um ein Individuum zu sensibilisieren, muss das Zusammentreffen mit dem Antigen bei Konzentrationen stattfinden, die ausreichend hoch sind, um zu einer IgE-Produktion über einen längeren Zeitraum zu führen. Sobald ein Asthmapatient sensibilisiert wurde, kann er die Symptome schon als Antwort auf ausserordentlich kleine Mengen an Antigen zeigen.
Asthmasymptome können durch die Anwesenheit und die Menge an auslösendem Antigen, Umweltfaktoren, am Arbeitsplatz auftretenden Faktoren, körperlicher Anstrengung und emotionalem Stress verschlimmert werden.
Asthma kann mit Methylxanthinen (wie Theophyllin), Beta- Adrenalin-Agonisten (wie Catecholaminen, Resorcinolen, Saligeninen und Ephedrin), Glucocortikoiden (wie Hydrocortison), Inhibitoren der Mastzelldegranulation (d. h. Chromonen wie Natriumcromolyn) und Anticholinergika (wie Atropin) behandelt werden.
Es wird gemeint, dass beim Asthma das Einströmen von Eosinophilen ("Eosinophilie") in das Lungengewebe mitbeteiligt ist [Frigas E. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 77: 527- 537 (1986)].
Einblick in die immunologische Grundlage des Asthmas wurde gewonnen durch Studien von bronchoalveolaren Spülungen (Godard P. et al., J. Allergy Clin. Imunol. 70: 88 (1982)] und Studien über vom Epithel befreiten glatten Atemmuskel [Flavahan N. A. et al., J. Appl. Physiol. 58: 834 (1985); Barnes P. J. et al., Br. J. Pharmacol. 86: 685 (1985)]. Obwohl diese Studien über die Mechanismen, die der Immunologie des Asthma zugrundeliegen, keinen Aufschluss ergaben, haben sie doch zur Entwicklung einer allgemein akzeptierten Hypothese über die immunologische Ursache der Krankheit geführt [vgl. Frigas E. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 77: 527-537 (1986)].
Die Kennzeichen der Pathologie des Asthmas sind eine massive Infiltration des Lungenparenchymas mit Eosinophilen und die Zerstörung der Fähigkeit zur Schleimbildung. Die "Eosinophil-Hypothese" schlägt vor, dass die Eosinophilen zum Bronchus hingezogen werden, um die von den Lungenmastzellen abgegebenen schädlichen Vermittler zu neutralisieren. Der Hypothese entsprechend werden die Eosinophilen zu den Bronchien hingezogen, um dort zu degranulieren und somit zytotoxische Moleküle abzugeben. Bei der Degranulation geben die Eosinophilen Enzyme wie Histaminase, Arylsulfatase und Phospholipase D ab, welche die schädlichen Vermittler der Mastzellen enzymatisch neutralisieren. Diese Moleküle bewirken auch die Zerstörung des Schleimbildungssystems und verhindern somit die Beseitigung der Bronchialsekretionen, und sie tragen zu einem für das Asthma charakteristischen Lungenschaden bei.
Da am Asthma die Zellmigration beteiligt ist, wurde zur Linderung der Wirkungen von Allergenen bei einem Subjekt vorgeschlagen, Antikörper zu verwenden, welche diese Migration hemmen [WO-90/10453].

H. Schlussfolgerung

Es wurde bisher vorgeschlagen: Behandlung einer von Leukozyten vermittelten Entzündung durch Verabreichung u. a. eines Anti-ICAM-1-Antikörpers an Patienten, die an solchen Entzündungen leiden [vgl. EP-0289949 und EP-0314863]; Behandlung einer viralen Infektion durch Verabreichung u. a. eines Anti- ICAM-1-Antikörpers an Patienten, die an solchen Entzündungen leiden [EP-0391088]; Vorbeugung der Infizierung eines Subjektes durch HIV durch Verabreichung u. a. eines Anti-ICAM-1-Antikörpers [WO-90/13281]; Vermeidung der Verbreitung von durch HIV infizierten Zellen durch Verabreichung u. a. eines Anti- ICAM-1-Antikörpers [WO-90/13316]; und Verabreichung u. a. eines Anti-ICAM-1-Antikörpers, um die Wirkungen von Allergenen zu lindern [WO-90/10453].
EP-289949 beschreibt die Herstellung eines murinen monoklonalen Antikörpers (R6-5-D6) mit Spezifizität gegenüber ICAM-1, welcher für die im vorstehenden erwähnten Therapien der bevorzugte Antikörper ist. Muster von R6-5-D6 wurden bei der American Type Culture Collection am 30. Oktober 1987 als Hinterlegung ATCC HB9580 hinterlegt. R6-5-D6 wurde beim ATCC unter den Bestimmungen der Regel 28(4) EPÜ hinterlegt.
Gegenwärtig erhältliche monoklonale Anti-ICAM-1-Antikörper, welche die Basis der vorstehend beschriebenen Therapien bilden, sind murine monoklonale Antikörper, woraus sich ergibt, dass sie mit ansehnlicher Wahrscheinlichkeit eine beachtliche HAMA-Antwort verursachen, wenn sie humanen Patienten in wiederholten Dosen verabreicht werden. Es wäre sehr erwünscht, durch geeignete Humanisierung oder andere geeignete Manipulation der rekombinanten DNA dieser potentiell hochnützlichen Antikörper deren unerwünschte HAMA-Antwort zu vermindern oder zu beseitigen und somit deren Verwendung zu vergrössern und zu verbreitern. Es wäre ebenfalls erwünscht, die Techniken der rekombinanten DNA an diesen Antikörpern anzuwenden, um ganz allgemein humanisierte chimäre Anti-ICAM-1- Antikörper herzustellen.
Es wurden nun von murinen monoklonalen Antikörpern abgeleitete humanisierte chimäre Anti-ICAM-1-Antikörper-Moleküle hergestellt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein humanisiertes chimäres Antikörper-Molekül zur Verfügung, das schwer- und/oder leichtkettige Bereiche des murinen Anti-ICAM-1-Antikörpers umfasst.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf detektierbar markierte humanisierte chimäre Antikörper der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner DNA zur Verfü gung, die für einen variablen schwer- und/oder leichtkettigen Bereich eines humanisierten chimären Anti-ICAM-1-Antikörpers codiert.
Die Erfindung umfasst zudem ein rekombinantes DNA- Molekül, das zur Expression der erfindungsgemässen humanisierten chimären Antikörper fähig ist.
Die Erfindung umfasst ferner eine Wirtszelle, die fähig ist, die erfindungsgemässen humanisierten chimären Antikörper zu produzieren, wenn sie mit den vorstehend offenbarten rekombinanten DNA-Molekülen transformiert wurde.
Die Erfindung umfasst zudem die Verwendung der erfindungsgemässen humanisierten chimären Antikörper als Mittel zur Diagnose oder Therapie.
Die Erfindung stellt ferner ein Mittel zur Verfügung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung einer Entzündung, die sich aus einer Antwort des spezifischen Abwehrsystems in einem Säuger-Subjekt ergibt, bei welchem Verfahren einem Subjekt, der eine solche Behandlung benötigt, eine zur Unterdrückung der Entzündung ausreichende Menge eines Mittels zur Entzündungshemmung verabreicht wird, wobei das Mittel zur Entzündungshemmung ein zur Bindung an ICAM-1 fähiger humanisierter chimärer Antikörper ist.
Die Erfindung stellt ferner ein Mittel zur Verfügung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung einer nicht- spezifischen Entzündung beim Menschen und bei anderen Säugern.
Im einzelnen umfasst das Verfahren zur Behandlung einer Entzündung, die sich aus einer Antwort des spezifischen und des nicht-spezifischen Abwehrsystems in einem Säuger-Subjekt ergibt, dass einem Subjekt, der eine solche Behandlung benötigt, ein zur Bindung an ICAM-1 fähiges Mittel zur Entzündungshemmung in einer zur Unterdrückung der Entzündung ausreichenden Menge verabreicht wird, wobei das Mittel zur Entzündungshemmung ein zur Bindung an ICAM-1 fähiger humanisierter chimärer Antikörper ist.
Das im vorstehenden beschriebene Verfahren bezieht sich auf die Behandlung einer Entzündung, wobei diese Entzündung mit einem Zustand assoziiert ist, welcher aus der gemäss nachstehender Liste gebildeten Gruppe ausgewählt ist: Erwachsenen-Atemnot-Syndrom; sekundär zu Septikämie auftretender Multipler-Organschaden-Syndrom; sekundär zu Trauma auftretender Multipler-Organschaden-Syndrom; Reperfusionsschaden von Myokard- oder anderem Gewebe; akute Glomerulonephritis; reaktive Arthritis; Dermatosis mit Komponenten akuter Entzündung; akute purulente Meningitis oder andere entzündungsbedingte Störungen des zentralen Nervensystems wie beispielsweise Schlaganfall; thermischer Schaden; Hämodialyse; Leukapheresis; Colitis ulcerosa; Crohn-Krankheit; nekrotisierende Enterocolitis; der Granulozyten-Transfusion assoziiertes Syndrom; und von Zytokin induzierte Toxizität.
Die Erfindung stellt ferner ein Mittel zur Verfügung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Unterdrückung der Metastasierung einer hämatopoetischen Tumorzelle, wobei zur Migration der Zelle ein funktionelles Mitglied der LFA-1-Familie erforderlich ist, bei welchem Verfahren einem Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, eine zur Unterdrückung der Metastasierung ausreichende Menge eines Mittels zur Entzündungshemmung verabreicht wird, wobei das Mittel zur Entzündungshemmung ein zur Bindung an ICAM-1 fähiger humanisierter chimärer Antikörper ist.
Die Erfindung stellt ferner ein Mittel zur Verfügung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Unterdrückung des Wachstums einer ICAM-1 exorimierenden Tumorzelle, bei welchem Verfahren einem Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, eine zur Wachstumsunterdrückung ausreichende Menge Toxin verabreicht wird, wobei das Toxin zu einem der erfindungsgemässen chimären Antikörpern derivatisiert ist.
Die Erfindung stellt ferner ein Mittel zur Verfügung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Diagnose der Anwesenheit und Lokalisierung einer Entzündung, die sich aus einer Antwort des spezifischen Abwehrsystems in einem Säuger-Subjekt ergibt, bei welchem der Verdacht besteht, dass es diese Ent zündung hat, wobei das Verfahren umfasst, dass man:
(a) einem Subjekt eine Zusammensetzung verabreicht, die einen detektierbar markierten Antikörper enthält, der fähig ist, eine ICAM-1 exprimierende Zelle zu identifizieren; und
(b) den Bindungsliganden detektiert.
Die Erfindung stellt zudem ein Mittel zur Verfügung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Diagnose der Anwesenheit und Lokalisierung einer Entzündung, die sich aus einer Antwort des spezifischen Abwehrsystems in einem Säuger-Subjekt ergibt, bei welchem der Verdacht besteht, dass es diese Entzündung hat, wobei das Verfahren umfasst:
(a) Inkubation einer Gewebeprobe des Subjekts mit einer Zusammensetzung, die einen detektierbar markierten chimären Antikörper enthält, der fähig ist, eine ICAM-1 exprimierende Zelle zu identifizieren; und
(b) Detektion des Bindungsliganden.
Die Erfindung stellt ferner ein Mittel zur Verfügung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Diagnose der Anwesenheit und Lokalisierung einer ICAM-1 exprimierenden Tumorzelle in einem Säuger-Subjekt ergibt, bei welchem der Verdacht besteht, dass es diese Zelle hat, wobei das Verfahren umfasst, dass man:
(a) einem Subjekt eine Zusammensetzung verabreicht, die einen detektierbar markierten, zur Bindung an ICAM-1 fähigen chimären Antikörper enthält; und
(b) den Bindungsliganden detektiert.
Die Erfindung stellt ferner ein Mittel zur Verfügung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Diagnose der Anwesenheit und Lokalisierung einer ICAM-1 exprimierenden Tumorzelle in einem Säuger-Subjekt ergibt, bei welchem der Verdacht besteht, dass es diese Zelle hat, wobei das Verfahren umfasst:
(a) Inkubation einer Gewebeprobe des Subjekts mit einer Zusammensetzung, die einen zur Bindung an ICAM-1 fähigen, detektierbar markierten chimären Antikörper enthält; und
(b) Detektion des Bindungsliganden.
Die Erfindung umfasst zudem eine Arzneimittelzusammensetzung, umfassend:
(a) ein Mittel zur Entzündungshemmung, das aus einem zur Bindung an ICAM-1 fähigen humanisierten chimären Antikörper besteht; und
(b) mindestens ein Mittel zur Immunsuppression, das aus der von Dexamethason, Azathioprin und Cyclosporin A gebildeten Gruppe ausgewählt ist.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung von zur Bindung an ICAM-1 fähigen humanisierten chimären Antikörpern zur Herstellung eines Mittels zur Verwendung in antiviraler Therapie.
Im einzelnen umfasst das Verfahren zur Behandlung von viraler Infektion, bei welcher das genannte Virus sich an den ICAM-1-Rezeptor bindet, in einem Individuum, das eine solche Behandlung benötigt, dass dem Individuum eine zur Unterdrückung der viralen Infektion ausreichende Menge eines zur Bindung an ICAM-1 fähigen chimären Antikörpers verabreicht wird.
Die Erfindung stellt ferner ein Mittel zur Verfügung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Unterdrückung der Infektion von Leukozyten durch HIV, wobei das Verfahren umfasst, dass einem Patienten, der dem HIV ausgesetzt oder durch HIV infiziert ist, eine wirksame Menge eines Mittels zur Unterdrückung einer Infektion durch HIV-1 verabreicht wird, wobei das Mittel ein zur Bindung an ICAM-1 fähiger humanisierter chimärer Antikörper ist.
Beim vorgenannten Verfahren kann das HIV HIV-1 sein.
Die Erfindung stellt ferner ein Mittel zur Verfügung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Unterdrückung der extravaskulären Migration eines viral infizierten Leukozyten bei einem Patienten, der einen solchen Leukozyten aufweist, wobei das Verfahren umfasst, dass einem Patienten eine wirksame Menge eines humanisierten chimären Antikörpers verabreicht wird, der fähig ist, die Fähigkeit des genannten Leukozyten zur Bindung an ICAM-1 zu unterdrücken.
Beim vorstehend beschriebenen Verfahren können die viral infizierten Leukozyten durch HIV infiziert sein.
Beim vorstehend beschriebenen Verfahren kann das Mittel ein zur Bindung an ICAM-2 fähiger humanisierter chimärer Antikörper sein.
Die Erfindung stellt ferner ein Mittel zur Verfügung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung von Asthma bei einem Patienten, wobei das Verfahren umfasst, dass dem Patienten eine therapeutisch wirksame Menge eines zur Bindung an ICAM-1 fähigen humanisierten chimären Antikörpers verabreicht wird.
Beim vorstehend beschriebenen Verfahren kann der zur Bindung an ICAM-1 fähiger chimärer Antikörper vom murinen monoklonalen Antikörpers R6-5-D6 abgeleitet sein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt für die leichte Kette des murinen monoklonalen Antikörpers R6-5-D6 die cDNA-Sequenz für den 5'-nichttranslatierten Bereich, die Signalsequenz, den variablen Bereich und teilweise den konstanten Bereich;
Fig. 2 zeigt ähnliche cDNA- und Aminosäure-Sequenzen für die schwere Kette des murinen monoklonalen Antikörpers R6-5-D6;
Fig. 3 zeigt ein Plasmiddiagramm des Plasmidexpressionsvektors pEE6hCMV;
Fig. 4 zeigt Plasmiddiagramme unter Angabe der Strategie zur Konstruktion des Plasmids pAL5 für die Expression der leichten Kette;
Fig. 5 zeigt Plasmiddiagramme unter Angabe der Strategie zur Konstruktion des Plasmids pAL6 für die Expression der schweren Kette;
Fig. 6 zeigt ein Diagramm mit den Resultaten einer Kompetitivuntersuchung mit der Bindung von rekombinanten und murinen R6-5-D6 und einem monoklonalen Refe renz-Antikörper UPC10;
Fig. 7 zeigt Plasmiddiagramme unter Angabe der Strategie zur Konstruktion des Expressionsvektors pAL7 für die chimäre leichte Kette;
Fig. 8 zeigt Plasmiddiagramme unter Angabe der Strategie zur Konstruktion des Expressionsvektors pAL8 für die chimäre schwere Kette (IgG2-Isotypus);
Fig. 9 zeigt skizzenhaft Restriktionskarten für die Expressionsvektoren pAL8 und pAL9 für die chimäre schwere Kette;
Fig. 10 zeigt Plasmiddiagramme unter Angabe der Vorgehensweisen, die an der Konstruktion des Expressionsvektors pAL10 der GS-Amplifikation für die chimäre leichte Kette beteiligt sind;
Fig. 11 zeigt ähnliche Plasmiddiagramme für die Konstruktion des Expressionsvektors pAL12 für die GS chimäre schwere Kette (IgG2-Isotypus);
Fig. 12 zeigt ähnliche Diagramme für die chimäre schwere Kette (IgG4-Isotypus);
Fig. 13 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse unter nichtreduzierenden und reduzierenden Bedingungen; Die Überschrift über jeder Bahn beschreibt den beim Experiment der transienten Expression verwendeten Gentypus:
mL: Maus leicht cL: chimär leicht
γ&sub4;: chimär γ&sub4; schwer mH: Maus schwer
γ&sub2;: chimär γ&sub2; schwer B72.3: Referenz cL/cH-Gene
Fig. 14 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse eines gereinigten chimären Anti-ICAM-1-Antikörpers mit reduzierenden (A) und nichtreduzierenden (B) Gelen; Auf jedem Gel ist/sind:
Bahn 1 ein chimärer Referenz-Antikörper B72.3 (IgG4)
Bahn 2 niedermolekulare Gewichtsmarkierer von Pharmacia
Bahn 3-9 chimäre Anti-ICAM-1 IgG2 4 ug bis 0,125 ug in aufeinanderfolgend ver doppelten Verdünnungen
Bahn 10 niedermolekulare Gewichtsmarkierer von Pharmacia
Bahn 11-17 chimäre Anti-ICAM-1 IgG4 4 ug bis 0,125 ug in aufeinanderfolgend verdoppelten Verdünnungen
Fig. 15 zeigt eine HPLC-Gelfiltration von chimären Anti- ICAM-1-Antikörpern der IgG2- und IgG4-Isotypen; Die Profile sind deckungsgleich und werden zu einem Zeitpunkt eluiert, der einem tetrameren 150-kd-Antikörper entspricht;
Fig. 16 und 17 zeigen Diagramme von Bindungsuntersuchungen (Assays) für chimäre Antikörper im Vergleich zu Referenzen;
Fig. 18, 19 und 20 zeigen Diagramme von Kompetitivbindungs-Untersuchungen für chimäre Antikörper im Vergleich zu Referenzen;
Fig. 21 zeigt die Hemmung der Reaktion von Lymphozytengemisch (MLR = "Mixed Lymphocyte Reaction") durch Antikörper;
Fig. 22 zeigt die Hemmung der vaskulären Durchlässigkeit in einer modifizierten Schwartzmann-Untersuchung (Assay) mit Antikörpern.

Kurze Beschreibung der bevorzugten Ausbildungen

A. Humanisierte Antikörper

Die erfindungsgemässe erste Ausbildung stellt ein humanisiertes chimäres Antikörper-Molekül zur Verfügung, das entsprechend den Ansprüchen schwerkettige und/oder leichtkettige variable Bereiche des Anti-ICAM-1-Antikörpers umfasst.
Die für solche humanisierte chimäre schwere und/oder leichte Ketten codierende DNA umfasst DNA, welche für die Domänen nicht-humaner variabler Bereiche codiert, die an DNA gebunden sind, welche für Domänen konstanter Human-IgG1- Bereiche codiert.
Die erfindungsgemässen chimären Antikörper-Moleküle können umfassen: ein vollständiges Antikörper-Molekül mit schweren und leichten Ketten in voller Länge; ein Fragment davon, wie das Fab- oder (Fab')&sub2;-Fragment; ein leichtkettiges und/oder schwerkettiges Monomer oder Dimer, einschliesslich Fragmenten davon oder jeglichen chimären Antikörper-Moleküls mit derselben Spezifizität wie ein Anti-ICAM-1-Antikörper.
Die erfindungsgemässen chimären Antikörper können ein "chemisches Derivat" des Antikörpers sein. Im Sinne des vorliegenden Textes nennt man ein Molekül ein "chemisches Derivat" eines anderen Moleküls, wenn es zusätzliche chemische Molekülteile enthält, die nicht normalerweise Teil dieses Moleküls sind. Solche Molekülteile können die Löslichkeit des Moleküls, die Absorption, die biologische Halbwertszeit, usw. verbessern. Diese Molekülteile können andererseits die Toxizität des Moleküls abschwächen, jegliche unerwünschte Nebeneffekte des Moleküls beseitigen oder vermindern, usw. Molekülteile, welche eine derartige Wirkung vermitteln, sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart. "Toxin- derivatisierte" Moleküle stellen eine spezielle Klasse der "chemischen Derivate" dar. Ein "toxin-derivatisiertes" Molekül ist ein Molekül (wie ICAM-1 oder ein Antikörper), welches einen toxischen Molekülteil enthält. Das Binden eines solchen Moleküls an eine Zelle bringt den Toxin-Molekülteil ganz in die Nähe der Zelle und bewirkt dadurch den Zelltod. Es ist jegliches geeignetes Toxin-Molekülteil verwendbar; bevorzugt wird jedoch die Verwendung von Toxinen wie beispielsweise Ricintoxin, Diphterietoxin, radioisotopischer Toxine, membrankanalbildender Toxine, usw. Verfahren zur Kupplung solcher Molekülteile mit einem Molekül sind wohlbekannter Stand der Technik. Andererseits kann der chimäre Antikörper zur Chelation eines Schwermetallatoms an einen Makrocyclus gebunden werden.
In der Alternative sind die Vorgehensweisen der Technologie der rekombinanten DNA verwendbar, um ein "chemisches Derivat" des chimären Antikörpers zu produzieren, bei dem das Fc-Fragment oder die CH3-Domäne eines vollständigen Antikörper-Moleküls mit einem funktionellen Nicht-Immunoglobulin- Protein wie ein Enzym oder ein Toxin-Molekül ersetzt wurde oder damit durch Peptidbindung verbunden ist.
Bei den humanisierten chimären Antikörper-Molekülen kann der restliche Teil des Moleküls von jeglichem humanem Immunoglobulin abgeleitet sein. Humane Domänen konstanter Bereiche können mit Bezug auf die ins Auge gefasste Funktion des Antikörpers, insbesondere die gegebenenfalls erforderlichen Effektorfunktionen ausgewählt werden. Beispielsweise können die Domänen konstanter Bereiche humane IgA-, IgE-, IgG oder IgM-Domänen sein. Insbesondere sind die humanen Domänen konstanter Bereiche verwendbar, einschliesslich jeglichen der IgG1-, IgG2-, IgG3- und IgG4-Isotypen. Somit sind IgG2- oder vorzugsweise IgG4-Isotypen verwendbar, wenn der humanisierte chimäre Antikörper für therapeutische Zwecke vorgesehen ist, wozu das Fehlen von Antikörper-Effektorfunktionen beispielsweise zum Blockieren von ICAM-1-LFA-1-Wechselwirkungen erforderlich ist. Chimäre IgG-Anti-ICAM-1-Antikörper können je nach dem Isotypus verschiedene Bindungsneigungen aufweisen, und dies kann die therapeutische Wahl beeinflussen. Auf meistbevorzugte Weise werden IgG1-humane Domänen konstanter Bereiche verwendet. Es wurde gefunden, dass ein IgG1-chimärer Antikörper anscheinend eine höhere Bindungsneigung für ICAM-1 aufweist als IgG2- oder IgG4-chimäre Antikörper, was möglicherweise herbeigeführt wird durch einer höhere Flexibilität des IgG1-Gelenkes, welche eine zweiwertige Bindung an das Antigen fördert.
Der restliche Teil des humanisierten chimären Antikörper-Moleküls braucht nicht nur Proteinsequenzen aus dem humanen Immunoglobulin zu umfassen. Beispielsweise kann ein Gen konstruiert werden, bei dem eine DNA-Sequenz, die für einen Teil einer Kette von humanen Immunoglobulin codiert, mit einer DNA-Sequenz fusioniert ist, die für die Aminosäuresequenz eines Effektor- oder Reporter-Polypeptidmoleküls codiert.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemässe chimäre Antikörper-Molekül durch die Technologie der rekombinanten DNA produziert.
Eine erfindungsgemässe zweite Ausbildung stellt eine DNA zur Verfügung, die für einen schwerkettigen und/oder leichtkettigen variablen Bereich eines anspruchsgemässen humanisierten chimären Antikörper-Moleküls codiert.
Die DNA in den Codiersequenzen für die leichte und die schwere Kette kann cDNA oder Genom-DNA oder beides enthalten. Es wird jedoch bevorzugt, dass die für die leichte oder die schwere Kette codierende DNA-Sequenz zumindest teilweise Genom-DNA umfasst. Auf meistbevorzugte Weise umfasst die für die leichte oder die schwere Kette codierende Sequenz eine Fusion von cDNA und Genom-DNA.
Somit umfasst die vorliegende Erfindung auch die beim erfindungsgemässen Verfahren verwendete Klonierung und verwendeten Expressionsvektoren und transfizierten Zellstämme.
Die allgemeinen Methoden, nach denen die Vektoren konstruiert werden können, die Transfektionsmethoden und Kultivierungsmethoden sind an sich wohlbekannt und kein Teil der Erfindung. Derartige Methoden werden beispielsweise dargestellt in Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York (1982) und in Primrose und Old, Principles of Gene Manipulation, Blackwell, Oxford (1980).
Die erfindungsgemässen Anti-ICAM-1-Antikörper umfassen alle Anti-ICAM-1-Spezifizitäten, Typisch haben jedoch die Antikörper eine Spezifizität für antigene Epitope von ICAM-1, welche, wenn sie an den Antikörper gebunden sind, die ICAM- 1/LFA-1- und/oder, die ICAM-1/Mac-1-Wechselwirkungen hemmen oder auf andere Weise modifizieren. Vorzugsweise haben die Antikörper eine Spezifizität für dieselben oder ähnliche ICAM-1-antigene Epitope wie die Antikörper R6-5-D6 usw. Ganz besonders sind die Antikörper vom Antikörper R6-5-D6 abgeleitet.

B. Therapeutika und Diagnostika

Die vorliegende Erfindung umfasst auch therapeutische und diagnostische Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemässen chimären Antikörper enthalten, sowie Verwendungen solcher Zusammensetzungen zur Herstellung eines Mittels zur Verwendung bei der Therapie und der Diagnose.
Die therapeutischen Verwendungen, bei denen die Produkte der Anti-ICAM-1-Erfindung einsetzbar sind, umfassen jegliche therapeutische Verwendungen, bei denen Anti-ICAM-1-Antikörper einsetzbar sind, beispielsweise jegliche oder alle therapeutischen Verwendungen, die in EP-0289949, EP-0314863 und den entsprechenden Anmeldungen beschrieben sind.

1. Entzündungshemmende Mittel

A. Spezifische Entzündung

Monoklonale Antikörper für Mitglieder der CD18- oder CD11/18-Komplexe hemmen viele von der Adhäsion abhängige Funktionen der Leukozyten, einschliesslich Bindung an Endothel [Haskard D. et al., J. Immunol. 137: 2901-2906 (1986)], homotypische Adhäsionen [Rothlein R. et al., J. Exp. Med. 163: 1132-1149 (1986)], antigenisch und mitogenisch induzierter Wucherung von Lymphozyten [Davignon D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 4535-4539 (1981)], Antikörperbildung [Fischer A. et al., J. Immunol. 136: 3198-3203 (1986)], und Effektorfunktionen von allen Leukozyten wie die Lyse-Aktivität von zytotoxischen T-Zellen [Krensky A. M. et al., J. Immunol. 132: 2180-2182 (1984)], [Strassman G. et al., J. Immunol. 136: 4328-4333 (1986)], sowie aller an antikörperabhängigen zellulären Zytotoxizitätsreaktionen beteiligten Zellen [Kohl S. et al., J. Immunol. 133: 2972-2978 (1984)]. Bei allen vorstehend genannten Funktionen hemmen die Antikörper die Fähigkeit der Leukozyten zur Adhäsion am geeigneten zellulären Substrat, was seinerseits das Endergebnis davon hemmt. Obschon sowohl die polyklonalen wie die monoklonalen Antikörper zur Hemmung dieser Funktion verwendbar sind, stellt die vorliegende Erfindung durch die Verwendung eines chimären Anti-ICAM-1-Antikörpers eine Verbesserung zur Verfügung.
Wie im vorstehenden diskutiert, ist die Bindung von ICAM-1-Molekülen an die Mitglieder der LFA-1-Familie von Molekülen von zentraler Wichtigkeit bei der zellulären Adhäsion. Durch den Adhäsionsprozess sind Lymphozyten fähig, ein Tier auf die Anwesenheit von fremden Antigenen ständig zu überwachen. Obwohl diese Prozesse normalerweise erwünscht sind, sind sie auch die Ursache der Abstossung von Organtransplantaten und von verpflanztem Gewebe sowie vieler Autoimmunkrankheiten. Somit ist jegliches Mittel, das fähig ist, die zelluläre Adhäsion zu lindern oder zu hemmen, bei Empfängern von Organtransplantaten (beispielsweise einer Niere), von Gewebeverpflanzungen oder bei autoimmunkranken Patienten in hohem Grade erwünscht.
Ein zur Bindung an ICAM-1 fähiger humanisierter chimärer Antikörper eignet sich in hohem Grade bei einem Säuger als Entzündungshemmer. Auf bemerkenswerte Weise unterscheidet sich ein derartiges Mittel von allgemeinen Entzündungshemmern und von nicht-humanisierten Antikörpern darin, dass es zur selektiven Hemmung der Adhäsion fähig ist, keine anderen Nebenwirkungen wie Nephrotoxizität aufweisen, wie solche bei herkömmlichen Agenzien auftreten, und den Umfang einer mit der Verwendung muriner monoklonaler Antikörper einherkommenden HAMA-Antwort einschränken. Ein zur Bindung an ICAM-1 fähiger humanisierter chimärer Antikörper ist deshalb beim Säuger-Subjekt verwendbar, um die Abstossung eines Organs (beispielsweise einer Niere) oder von Gewebe zu vermeiden oder Autoimmun-Antworten ohne Befürchtung von Nebenwirkungen zu modifizieren.
Auf wichtige Weise ermöglicht die Verwendung von humanisierten Antikörpern, die zur Erkennung von ICAM-1 fähig sind, die Durchzuführung von Organtransplantationen sogar zwischen Individuen mit HLA-Anpassungsfehlern.
Bei der vierten Ausbildung der vorliegenden Erfindung wird ein Mittel zur Verwendung bei einem Verfahren zur Unterdrückung der spezifischen Entzündung zur Verfügung gestellt, bei welchem Verfahren Empfänger-Subjekten, die eine solche Behandlung benötigen, eine zur Entzündungsunterdrückung ausreichende Menge eines der erfindungsgemässen humanisierten chimären Antikörper verabreicht wird. Eine Menge wird als zur "Unterdrückung" der Entzündung ausreichend bezeichnet, wenn die Dosierung, der Verabreichungsweg usw. des Mittels zur Verminderung oder Vermeidung der Entzündung ausreichen.
Die humanisierten chimären Antikörper können (insbesondere einem Empfänger eines Organtransplantates, beispielsweise einer Niere, oder eines verpflanzten Gewebes) entweder einzeln oder in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen Immunsuppressiva verabreicht werden. Die Verabreichung einer solchen Zusammensetzung kann entweder zu "prophylaktischen" oder zu "therapeutischen" Zwecken erfolgen. Wenn die Verabreichung prophylaktisch erfolgt, wird die entzündungshemmende Zusammensetzung vor jeglicher Entzündungsantwort oder jeglichem Entzündungssymptom verabreicht (beispielsweise vor, am oder kurz nach dem Zeitpunkt einer Organtransplantation oder Gewebeverpflanzung aber vor jeglichen Symptomen von Organabstossung). Die prophylaktische Verabreichung der Zusammensetzung dient zur Vermeidung oder Verminderung jeglicher nachfolgenden Entzündungsantwort (wie beispielsweise die Abstossung eines transplantatierten Organs oder Gewebes usw.). Wenn die Verabreichung therapeutisch erfolgt, wird die entzündungshemmende Zusammensetzung bei (oder kurz nach) dem Einsetzen eines Symptoms einer tatsächlichen Entzündung (wie beispielsweise die Abstossung eines Organs oder Gewebes) verabreicht. Die therapeutische Verabreichung der Zusammensetzung dient zur Verminderung der tatsächlichen Entzündung (wie beispielsweise die Abstossung eines transplantatierten Organs oder Gewebes).
Die erfindungsgemässen Entzündungshemmer können somit entweder vor dem Einsetzen einer Entzündung (um dadurch eine erwartete Entzündung zu unterdrücken) oder nach dem Anfang einer Entzündung verabreicht werden.
Da ICAM-1-Moleküle am meisten an den Entzündungsstellen wie denjenigen Stellen, die an der Hyperempfindlichkeitsreaktion des verzögerten Typus beteiligt sind, exprimiert werden, haben Antikörper (insbesondere von monoklonalen Anti-ICAM-1- Antikörper abgeleitete chimäre Antikörper), die zur Bindung an ICAM-1 fähig sind, therapeutisches Potential zur Verminderung oder Vermeidung solcher Reaktionen. Diese potentielle therapeutische Verwendung kann in der einen oder anderen von zwei Arten und Weisen genutzt werden. Zunächst kann einem Patienten, der eine Hyperempfindlichkeitsreaktion des verzögerten Typus aufweist, eine Zusammensetzung verabreicht werden, die einen zur Bindung an ICAM-1 fähigen chimären Antikörper enthält. Beispielsweise können solche Zusammensetzungen einem Individuum verabreicht werden, der mit Antigenen wie Giftefeu, Gifteiche usw. in. Kontakt gekommen ist.
Bei der sechsten Ausbildung wird einer der erfindungsgemässen chimären Antikörper einem Patienten zusammen mit einem Antigen verabreicht, um eine nachfolgende Entzündungsreaktion zu vermeiden. Somit kann die zusätzliche Verabreichung eines Antigens mit einem sich an ICAM-1 bindenden chimären Antikörper ein Individuum für eine nachfolgende Präsentation dieses Antigens zeitweise tolerant machen.
Da LAD-Patienten, denen LFA-1 fehlt, keine Immunantwort aufbauen, wird gemeint, dass ein Antagonismus des natürlichen LFA-1-Ligandes, ICAM-1, ebenfalls eine Entzündungsantwort hemmt. Die Fähigkeit von Antikörpern gegen ICAM-1, Entzündung zu hemmen, liefert die Basis für deren therapeutische Verwendung bei der Behandlung von Chronischentzündungskrankheiten und Autoimmunkrankheiten wie Lupus erythematosus, autoimmuner Thyroiditis, experimenteller allergischer Encephalomyelitis (EAE), multipler Sklerose, einigen Formen von Diabetes, Reynaud-Syndrom, rheumatoider Arthritis usw. Solche Antikörper sind auch zur Herstellung eines Mittels zur Verwendung bei der therapeutischen Behandlung von Psoriasis verwendbar. Im allgemeinen ist ein zur Bindung an ICAM-1 fähiger chimärer Antikörper bei der Behandlung von solchen Krankheiten verwendbar, die gegenwärtig durch Steroidtherapie behandelt werden können.

B. Nicht-Spezifische Entzündung

Die vorliegende Erfindung leitet sich von der Entdeckung ab, dass auf Endothelzellen befindliches ICAM-1 sich an die auf Granulozyten befindlichen Mitglieder der CD18-Familie von Molekülen bindet, was für die Vermittlung der Adhäsion zwischen Granulozyten und Endothelzellen verantwortlich ist, und dass Antagonisten von ICAM-1 fähig sind, eine solche Adhäsion zu hemmen. Eine Hemmung dieser Art ergibt ein Mittel zur Behandlung von allgemeiner, nicht-spezifischer Gewebeentzündung.
Da zelluläre Adhäsion erforderlich ist, damit Leukozyten zu den Stellen nicht-spezifischer Gewebeentzündung migrieren und/oder verschiedene der Entzündung beitragende Effektorfunktionen ausführen können, führen Mittel, welche die zelluläre Adhäsion hemmen, zur Verminderung oder Vermeidung dieser Entzündung. Eine "Reaktion des nicht-spezifischen Abwehrsystems" ist eine Antwort, die von des immunologischen Gedächtnisses unfähigen Leukozyten vermittelt wird. Unter derartigen Zellen gibt es Granulozyten und Makrophagen. Im Sinne des vorliegenden Textes wird gesagt, dass Entzündung aus einer Antwort des nicht-spezifischen Abwehrsystems resultiert, wenn die Entzündung von einer Reaktion des nicht- spezifischen Abwehrsystems verursacht oder vermittelt wird oder damit assoziiert ist. Beispiele von Entzündung, die zumindest teilweise aus einer Reaktion des nicht-spezifischen Abwehrsystems resultiert, umfassen Entzündungen, die assoziiert sind mit Zuständen wie: Erwachsenen-Atemnot-Syndrom (ARDS = "Adult Respiratory Distress Syndrome") oder sekundär zu Septikämie oder Trauma auftretenden Multiplen-Organscha den-Syndrom; Reperfusionsschaden von Myokard- oder anderem Gewebe; akuter Glomerulonephritis; reaktiver Arthritis; Dermatosis mit Komponenten akuter Entzündung; akuter purulenter Meningitis oder anderen entzündungsbedingten Störungen des zentralen Nervensystems wie beispielsweise Schlaganfall; thermischem Schaden; Hämodialyse; Leukapheresis; Colitis ulcerosa; Crohn-Krankheit; nekrotisierender Enterocolitis; der Granulozyten-Transfusion assoziiertem Syndrom; und von Zytokin induzierter Toxizität.
Bei einer fünften Ausbildung der vorliegenden Erfindung wird ein Mittel zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung der nicht-spezifischen Entzündung zur Verfügung gestellt, bei welchem Verfahren einem Subjekt, das eine solche Behandlung benötigt, eine wirksame Menge eines der erfindungsgemässen chimären Antikörper verabreicht wird.

2. Diagnostische und Prognostische Anwendungen

Da ICAM-1 am meisten an Entzündungsstellen exprimiert wird, ist ein zur Bindung an ICAM-1 fähiger chimärer Antikörper als Mittel zur bildlichen Darstellung oder Sichtbarmachung der Infektions- und Entzündungsstellen bei einem Patienten verwendbar.
Bei einer achten Ausbildung der vorliegenden Erfindung wird ein erfindungsgemässer chimären Antikörper durch Verwendung von Radioisotopen, Affinitätsmarkierern (wie Biotin, Avidin usw.), fluoreszierenden Markierern, paramagnetischen Atomen usw. detektierbar markiert und als einem Patienten zu verabreichendes Mittel zum Lokalisieren der Infektions- und Entzündungsstellen verwendet. Verfahrensweisen zur Erreichung von solcher Markierung sind wohlbekannter Stand der Technik. Klinische Anwendungen von Antikörpern zur bildlichen Darstellung zu Diagnosezwecken werden rezensiert von Grossman H. B., Urol. Clin. North Amer. 13: 465-474 (1986), Unger E. C. et al., Invest. Radiol. 20: 693-700 (1985) und Khaw B. A. et al., Science 209: 295-297 (1980).
Die Detektion der Fokusse solcher detektierbar markierter Antikörper ist eine Anzeige der Stelle einer Entzündung oder einer Tumorentwicklung. Bei einer ersten Ausbildung erfolgt diese Untersuchung auf Entzündung, indem Gewebeproben einschliesslich Blutzellen entnommen und die Proben in Gegenwart der detektierbar markierten Antikörper inkubiert werden. Bei einer bevorzugten Ausbildung erfolgt der Einsatz dieser Technik auf nichtinvasive Weise durch Verwendung von magnetischer Abbildung, Fluorographie usw. Ein solcher Diagnosetest ist zur Überwachung von Empfängern von Organtransplantaten auf Frühanzeichen möglicher Gewebeabstossung verwendbar. Solche Untersuchungen (Assays) können auch vorgenommen werden, wenn man versucht, die Neigung eines Individuums zur rheumatoiden Arthritis oder zu anderen chronischen Entzündungskrankheiten festzustellen.

3. Zusatzbemerkung zur Einführung von zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken verabreichtem Antigenmaterial

Immunantworten auf Therapeutika oder Diagnostika wie Rinderinsulin, Interferon, Gewebetypus-Plasminogen-Aktivator oder murine monoklonale Antikörper verschlechtern wesentlich den therapeutischen oder diagnostischen Wert solcher Mittel und können sogar Krankheiten wie Serumkrankheit verursachen. Einer derartigen Situation kann man durch Verwendung der erfindungsgemässen chimären Antikörper abhelfen. Bei dieser Ausbildung werden derartige Antikörper in Kombination mit dem Therapeutikum oder Diagnostikum verabreicht.
Bei einer neunten Ausbildung erfolgt die Zugabe einer wirksamen Menge eines erfindungsgemässen chimären Antikörpers mit Spezifizität für ICAM-1 in einer Verwendung als Mittel, das einem Subjekt verabreicht wird, um zu vermeiden, dass der Empfänger das Mittel erkennt, und somit zu vermeiden, dass darauf beim Empfänger eine Immunantwort einsetzt. Die Abwesenheit einer derartigen Immunantwort führt zur Fähigkeit des Patienten, zusätzliche Verabreichungen des Therapeutikums oder Diagnostikums zu empfangen,

4. Antivirale Verwendung von erfindungsgemässen chimären Antikörpern

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung, dass ICAM-1 zellulärer Rezeptor für gewisse Viren und deshalb erforderlich ist, damit das Virus sich an humane Zellen heftet und diese infiziert [Greve J. M. et al., Cell 56: 839-847 (1989); Staunton D. E. et al., Cell 56: 849-853 (1989)]. Es wurde nämlich gefunden, dass Rhinoviren und insbesondere Rhinoviren des Haupt-Serotypus fähig sind, ihre Infektion durch ihre Fähigkeit zur Bindung von an Zelloberflächen vorhandenen ICAM-1-Molekülen zu vermitteln.
Die zehnte Ausbildung der vorliegenden Erfindung richtet sich auf die Verwendung von chimären Antikörpern als zur Bindung von erfindungsgemässem ICAM-1 fähiges Mittel zwecks Behandlung von viraler Infektion. Weil derartige Antikörper fähig sind, das ICAM-1 von Endothelzellen für die virale Anhaftung zu blockieren, führt deren Verabreichung bei einem Empfänger-Individuum zu einer Verminderung der zur viralen Bindung verfügbaren Rezeptoren und somit zur Verringerung des Anteils der Viren, die sich an die Zellen eines Individuums heften und diese infizieren.
ICAM-1 besitzt die Fähigkeit, mit Viren in Wechselwirkung zu treten und sich an diese zu binden, insbesondere an Rhinoviren des Haupt-Serotypus innerhalb des Genus Picornaviridae, an Cocksackieviren der Gruppe A [Colonno R. J. et al., J. Virol. 57: 7-12 (1986)] und an Mengo-Viren [Rossman M. G. et al., Virol. 164: 373-382 (1988)]. Diese Wechselwirkung wird durch in der Domäne 1 des ICAM-1-Moleküls anwesende ICAM-1-Aminosäurereste vermittelt. Solche Wechselwirkungen werden jedoch durch Beiträge von in den Domänen 2 und 3 von ICAM-1 anwesenden Aminosäureresten unterstützt. Somit gibt es unter den bevorzugten chimären Antikörpern dieser Ausbildung Antikörper, die zur Bindung an die Domänen 1, 2 und 3 von ICAM-1 fähig sind. Bevorzugter sind chimäre Antikörper, die zur Bindung an die Domänen 1 und 2 von ICAM-1 fähig sind. Am meisten bevorzugt sind chimäre Antikörper, die zur Bindung an die Domäne 1 von ICAM-1 fähig sind.
Wenn die Verabreichung therapeutisch erfolgt, wird das antivirale Mittel bei (oder kurz nach) dem Einsetzen eines Symptoms einer tatsächlichen viralen Infektion (wie beispielsweise nasaler Blutstau, Fieber usw.) verabreicht. Die therapeutische Verabreichung des Mittels dient zur Verminderung jeglicher tatsächlichen Infektion.
Die erfindungsgemässen antiviralen Mittel können somit entweder vor dem Einsetzen einer viralen Infektion (um dadurch eine erwartete Infektion zu unterdrücken) oder nach dem Anfang einer solchen Infektion verabreicht werden.

5. Unterdrückung der Infektion durch HIV und Vorbeugung einer Verbreitung von durch HIV infizierten Zellen

Bei der elften Ausbildung der vorliegenden Erfindung wird ein Mittel zur Verwendung bei einem Verfahren zur Unterdrückung der Infektion durch HIV zur Verfügung gestellt, bei welchem Verfahren einem durch HIV infizierten Individuum eine wirksame Menge eines Mittels zur Unterdrückung der Infektion durch HIV verabreicht wird. Obschon sich die Erfindung besonders mit einem Mittel zur Verwendung bei einem Verfahren zur Unterdrückung der Infektion durch HIV-1 befasst, ist zu verstehen, dass das Verfahren auf jegliche Variante des HIV-1 (wie beispielsweise auf das HIV-2) anwendbar ist, die eine Zelle auf eine Weise infizieren kann, die mit den erfindungsgemässen Mitteln unterdrückbar ist. Solche Varianten sind die Äquivalenten des HIV-1 für die Zwecke der vorliegenden Erfindung.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung leitet sich ab von der Erkenntnis, dass die von einer Infektion durch HIV stimu lierte Expression von LFA-1 und, in einigen Fällen, von ICAM- 1 die Anhaftung zwischen Zellen fördert, welche die Dauer des Kontaktes von infizierten mit nicht infizierten Zellen erhöhen kann, was die Übertragung des Virus von infizierten zu nicht infizierten Zellen erleichtert. Somit sind zur Bindung an ICAM-1 fähige chimäre Antikörper in der Lage, die Infektion durch HIV und insbesondere durch HIV-1 zu unterdrücken.
Einer der Wege, auf denen Moleküle, die sich an ICAM-1 binden, die Infektion durch HIV unterdrücken können, ist die Beeinträchtigung der Fähigkeit des von durch HIV infizierten Zellen exprimierten ICAM-1, sich an den CD11/CD18-Rezeptor von gesunden T-Zellen zu binden. Um die Fähigkeit einer Zelle zu beeinträchtigen, sich an den CD11a/CD18-Rezeptor oder an das ICAM-1-Ligand-Molekül zu binden, ist es möglich, zur Bindung an ICAM-1 fähige erfindungsgemässe chimäre Antikörper zu verwenden.
Die erfindungsgemässen Mittel sind dazu bestimmt, Empfänger-Subjekten in einer zur Unterdrückung der Infektion durch HIV ausreichenden Menge verabreicht zu werden. Eine Menge wird als zur "Unterdrückung" der Infektion durch HIV ausreichend bezeichnet, wenn die Dosierung, der Verabreichungsweg usw. des Mittels zur Verminderung oder Vermeidung einer solchen Infektion ausreichen. Die Mittel sind den Patienten zu verabreichen, die dem HIV ausgesetzt oder von einer Infektion durch HIV betroffen sind.
Der Zweck der erfindungsgemässen chimären Antikörper kann bei der Behandlung von Infektion durch HIV entweder "prophylaktisch" oder "therapeutisch" sein. Wenn die Verabreichung prophylaktisch erfolgt, wird der Antikörper vor jeglichem Symptom von viraler Infektion verabreicht (beispielsweise vor, am oder kurz nach dem Zeitpunkt einer solchen Infektion aber vor jeglichen Symptomen einer solchen Infektion). Die prophylaktische Verabreichung des Antikörpers dient zur Vermeidung oder Verminderung jeglicher nachfolgenden Infektion durch HIV. Wenn die Verabreichung therapeutisch erfolgt, wird der Antikörper bei (oder kurz nach) der Fest stellung von viral infizierten Zellen verabreicht. Die therapeutische Verabreichung des Antikörpers dient zur Verminderung jeglicher zusätzlichen Infektion durch HIV.
Die erfindungsgemässen Mittel können somit entweder vor dem Einsetzen einer viralen Infektion (um dadurch eine erwartete Infektion durch HIV zu unterdrücken) oder nach der Feststellung von solchen viral infizierten Zellen (um dadurch jegliche zusätzliche Infektion zu unterdrücken) verabreicht werden.
Insbesondere stellt die Erfindung ein verbessertes Mittel zur Verwendung bei einer Therapie gegen AIDS sowie ein verstärktes Mittel zur Unterdrückung der Infektion durch HIV und insbesondere der Infektion durch HIV-1 zur Verfügung, welche die gleichzeitige Verabreichung von:
(I) ICAM-1, einem löslichen Derivat von ICAM-1, CD11 (entweder CD11a, CD11b oder CD11c), einem löslichen Derivat von CD11, CD18, einem löslichen Derivat von CD18, einem CD11/CD18-Heterodimer oder einem löslichen Derivat eines CD11/CD18-Heterodimers, und/oder
(II) einem erfindungsgemässen zur Bindung an ICAM-1 fähigen chimären Antikörper, zusammen mit
(III) Zellen oder Teilchen assoziiertem CD4 oder einem löslichen Derivat von CD4, und/oder
(IV) einem zur Bindung an CD4 fähigen Molekül (vorzugsweise einem Antikörper oder Antikörperfragment)
umfasst.
Bei einer zwölften Ausbildung der vorliegenden Erfindung wird auch ein Mittel zur Verwendung bei einem Verfahren zur Unterdrückung der Migration von durch HIV infizierten Zellen zur Verfügung gestellt, bei welchem Verfahren einem durch HIV infizierten Individuum eine wirksame Menge eines Mittels gegen die Migration verabreicht wird.
Die erfindungsgemässen Mittel gegen die Migration umfassen jeglichen Chimären Antikörper, der fähig ist, die Fähigkeit einer durch HIV infizierten T-Zelle zur Bindung an ICAM- 1 zu beeinträchtigen. Chimäre Antikörper, welche sich an ICAM-1 binden, unterdrücken die Migration, indem sie die Fähigkeit des von durch HIV infizierten T-Zellen exprimierten ICAM-1 zur Bindung an den CD11a/CD18-Rezeptor exprimierenden Zellen beeinträchtigen. Zur Beeinträchtigung der Fähigkeit einer Zelle zur Bindung an den CD11a/CD18-Rezeptor ist es möglich, einen zur Bindung an ICAM-1 fähigen chimären Antikörper zu verwenden.
Die erfindungsgemässen Mittel sind dazu bestimmt, Empfänger-Subjekten in einer zur Unterdrückung der Migration von durch HIV infizierten T-Zellen (oder von anderen viral infizierten Zellen) ausreichenden Menge verabreicht zu werden. Eine Menge wird als zur "Unterdrückung" der Migration von T- Zellen ausreichend bezeichnet, wenn die Dosierung, der Verabreichungsweg usw. des Mittels zur Verminderung oder Vermeidung einer solchen Migration ausreichen.
Die Verabreichung eines chimären Antikörpers kann entweder zu "prophylaktischen" oder zu "therapeutischen" Zwecken erfolgen. Wenn die Verabreichung prophylaktisch erfolgt, wird der chimäre Antikörper vor jeglichem Symptom von viraler Infektion verabreicht (beispielsweise vor, am oder kurz nach dem Zeitpunkt einer solchen Infektion aber vor jeglichen Symptomen). Die prophylaktische Verabreichung des chimären Antikörpers dient zur Vermeidung oder Verminderung jeglicher nachfolgenden Migration von viral infizierten T-zellen. Wenn die Verabreichung therapeutisch erfolgt, wird der chimäre Antikörper bei (oder kurz nach) der Feststellung von viral infizierten T-Zellen verabreicht. Die therapeutische Verabreichung des Antikörpers dient zur Verminderung jeglicher zusätzlichen Migration solcher T-Zellen.
Die erfindungsgemässen chimären Antikörper können somit entweder vor dem Einsetzen einer viralen Infektion (um dadurch die erwartete Migration von infizierten T-Zellen zu unterdrücken) oder nach der tatsächlichen Feststellung von solchen viral infizierten Zellen verabreicht werden.

6. Behandlung von Asthma

Bei der dreizehnten Ausbildung der vorliegenden Erfindung wird ein zur Bindung an ICAM-1 fähiger chimärer Antikörper als Mittel zur Verwendung bei der Behandlung von Asthma verwendet.
Die therapeutischen Wirkungen der Anti-Asthma-Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung können erhalten werden, indem diese Wirkstoffe einem Patienten auf irgendeinem geeignetem Weg (d. h. intravenös, intramuskulär, subkutan, enteral oder parenteral) verabreicht werden. Vorzugsweise werden die erfindungsgemässen Wirkstoffe intranasal durch Nasenspray, Tupfer, etc. verabreicht. Speziell bevorzugt werden solche Wirkstoffe durch orale Inhalation oder via Oralspray oder Oralaerosol verabreicht. Wenn die Wirkstoffe durch Injektion verabreicht werden, kann die Verabreichung als kontinuierliche Infusion oder als einzelne oder mehrfache Bolusinjektionen erfolgen.
Die erfindungsgemässen Anti-Asthma-Wirkstoffe sind dazu bestimmt, Empfänger-Subjekten in einer zur Linderung oder Verminderung der Schwere, des Umfanges oder der Dauer der Asthma-Symptome ausreichenden Menge verabreicht zu werden.
Die erfindungsgemässen chimären Antikörper können entweder allein oder in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen Anti-Asthma-Wirkstoffen wie Methylxanthinen (wie Theophyllin), Beta-Adrenalin-Agonisten (wie Catecholaminen, Resorcinolen, Saligeninen und Ephedrin), Glucocorticoiden (wie Hydrocortison), Chromonen (wie Natriumcromolyn) und Anticholinergika (wie Atropin) verabreicht werden, um die Menge des Wirkstoffes, der zur Behandlung des Asthmas gebraucht wird, herabzusetzen.
Die Verabreichung der erfindungsgemässen chimären Antikörper kann entweder zu "prophylaktischen" oder zu "therapeutischen" Zwecken erfolgen. Wenn die Verabreichung prophylaktisch erfolgt, wird der chimäre Antikörper vor jeglichem Asthma-Symptom verabreicht. Die prophylaktische Verabreichung des chimären Antikörpers dient zur Vermeidung oder Verminde rung jeglicher nachfolgenden Asthma-Antwort. Wenn die Verabreichung therapeutisch erfolgt, wird der chimäre Antikörper bei (oder kurz nach) dem Einsetzen eines Asthma-Symptoms verabreicht. Die therapeutische Verabreichung des Antikörpers dient zur Verminderung jeglichen tatsächlichen Asthma-Anfalls. Die erfindungsgemässen chimären Antikörper können somit entweder vor dem Einsetzen eines erwarteten Asthma-Anfalls (um die erwarteten Schwere, Dauer oder Umfang des Anfalls zu vermindern) oder nach dem Einsetzen des Anfalls verabreicht werden.

C. Verabreichung der erfindungsgemässen Zusammensetzungen

Die therapeutischen Wirkungen der zur Bindung an ICAM-1 fähigen chimären Antikörper können erhalten werden, indem einem Patienten eine wirksame Menge eines chimären Antikörpers, der im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen ist, verabreicht wird. Im Sinne des. vorliegenden Textes wird gesagt, dass die im vorliegenden offenbarten erfindungsgemässen chimären Antikörper "im wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen sind", wenn die Zusammensetzungen, welche sie enthalten, im wesentlichen frei von Stoffen sind, mit denen diese Produkte normalerweise und beim natürlichen Vrkommen auftreten.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf humanisierte chimäre Antikörper, die entweder von einem Tier oder durch Gewebekultivierung oder noch durch Mittel der rekombinanten DNA produzierbar sind.
Wenn ein Patient mit einem erfindungsgemässen chimären Antikörper versorgt wird, hängt die Dosierung des verabreichten Wirkstoffes von Faktoren ab wie Alter, Gewicht, Grösse, Geschlecht, allgemeinem medizinischen Zustand, medizinischer Vorgeschichte usw. des Patienten. Im allgemeinen ist es wünschenswert, den Empfänger mit einer Antikörper-Dosis zu versorgen, die im Bereich von 1 pg/kg bis 10 mg/kg (Körpergewicht des Patienten) liegt, obwohl eine niedrigere oder höhere Dosis verabreicht werden kann.
Ein zur Bindung an ICAM-1 fähiger erfindungsgemässer chimärer Antikörper kann den Patienten intravenös, intramuskulär, subkutan, enteral, topisch inhaliert, intranasal oder parenteral verabreicht werden. Wenn ein Antikörper verabreicht wird, kann die Verabreichung als kontinuierliche Verabreichung oder als einzelne oder mehrfache Bolusinjektionen erfolgen.
Eine Zusammensetzung wird als "pharmazeutisch annehmbar" bezeichnet, wenn deren Verabreichung von einem Empfänger- Patienten tolerierbar ist. Ein solches Mittel wird als "in einer therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht bezeichnet, wenn die verabreichte Menge physiologisch erheblich ist. Ein Mittel ist "physiologisch erheblich", wenn seine Anwesenheit zu einer feststellbaren Änderung der Physiologie des Empfänger-Patienten führt.
Die erfindungsgemässen chimären Antikörper können nach bekannten Verfahren formuliert werden, um pharmazeutisch verwendbare Zusammensetzungen herzustellen, wobei diese Antikörper im Gemisch mit einer pharmazeutisch annehmbaren Trägersubstanz kombiniert sind. Geeignete Trägersubstanzen und deren Formulierung, einschliesslich anderer menschlicher Proteine wie menschlichen Serumalbumins, sind beispielsweise in Remington's Pharmaceuticah Sciences [16. Ausgabe, Herausgeber Osol A., Mack, Easton PA (1980)] beschrieben. Um eine für eine wirksame Verabreichung geeignete pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung zu bilden, sollen derartige Zusammensetzungen eine wirksame Menge eines chimären Antikörpers zusammen mit einer geeigneten Menge Trägersubstanz enthalten.
Zusätzliche pharmazeutische Methoden können angewandt werden, um die Wirkungsdauer zu steuern. Zusammensetzungen mit kontrollierter Abgabe können erhalten werden durch Verwendung von Polymeren, den welche chimären Antikörper komplexieren oder absorbieren. Die gesteuerte Freigabe kann erreicht werden durch Auswahl der geeigneten Makromoleküle (beispielsweise Polyester, Polyaminosäuren, Polyvinyl, Pyrro lidon, Ethylenvinylacetat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Protaminsulfat) und der Konzentration der Makromoleküle wie auch der Methoden der Inkorporierung im Hinblick auf die Steuerung der Abgabe. Eine andere mögliche Methode zur Steuerung der Wirkungsdauer durch Zusammensetzungen mit gesteuerter Abgabe besteht darin, die chimären Antikörper in Partikeln aus einem Polymerstoff wie Polyestern, Polyaminosäuren, Hydrogelen, Polymilchsäure- oder Ethylenvinylacetatcopolymeren einzubringen. Als Alternative ist es möglich, statt den Antikörper in polymere Partikeln einzubringen, diese Stoffe in Mikrokapseln einzuschliessen, beispielsweise durch Koazervationstechniken oder durch Grenzflächenpolymerisation, beispielsweise in Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln und Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapseln, oder in kolloidale Medikamentabgabesysteme wie Liposome, Albuminmikrokugeln, Mikroemulsionen, Nanopartikeln, und Nanokapseln, oder in Makroemulsionen. Derartige Techniken sind in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) offenbart.

METHODEN ZUR STOFFVERARBEITUNG

1. Eintreffende Zellen

Die den Anti-ICAM-1-Antikörper produzierende Hybridomzellinie R6-5-D6 wurde von Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. geliefert (Los Nr. R6-5-D6-E9B20-29-86) und in antibiotikumfreiem Medium DMEM (= "Dulbecco's Modified Eagles Medium") mit Zusatz von Glutamin und 5%igem fetalem Kälberserum gezüchtet, und wurde aufgeteilt, um sowohl einen überwachsenen Überstand zu Evaluationszwecken wie auch Zellen zum Zwecke der Extraktion von RNA zu liefern. Es zeigte sich, dass der überwachsene Überstand murinen IgG2a/k-Antikörper enthält. Der Zellkulturüberstand wurde untersucht und es wurde bestätigt, dass er den Antikörper R6-5-D6 enthält.

2. Verfahrensweisen der Molekularbiologie

Die grundlegenden Verfahrensweisen der Molekularbiologie wurden nach Maniatis et al. (1982) [Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982)] durchgeführt, mit kleineren Änderungen in einigen Fällen. Die DNA-Sequenzierung erfolgte wie von Sanger et al. (1977) [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977)] und im Sequenzierungshandbuch von Amersham International Plc beschrieben. Die Expression von COS-Zellen und Untersuchungen zur metabolischen Markierung erfolgten wie von Whittle et al. (1987) beschrieben [Whittle et al., Prot. Eng. 1,6: 499-505 (1987)]. CHO-Transfektionen und CHO-Zellkultivierung (CHO = "Chinese Hamster Ovary" = Eierstöcke des Chinesischen Hamsters) erfolgten wie von Gorman (1988) [Gorman C., DNA Cloning 2: 143- 190 ed. (1988)] und Bebbington und Hentschel (1988) [Bebbington et al., DNA Cloning 3: 163-188 ed. (1988)] beschrieben.

3. Forschungsuntersuchungen (Assays)

3.1 Untersuchung (Assay) zur sekretierten leichten Kette des Antikörpers

Als erster Schritt bei der Entwicklung von den gesamten chimären Antikörper produzierenden stabilen Zellinien wurden Überstände aus CHO-Zellinien nach Transfektion mit Expressionsvektoren der leichten Kette im Hinblick auf die sekretierte leichte Kette untersucht. Die Vorgehensweise war wie folgt:
96-Mulden-Titerplatten wurden mit F(ab')&sub2;-Ziegen-antihumaner k-leichter Kette beschichtet. Die Platten wurden mit Wasser gewaschen, und die Proben zugesetzt und während einer Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und es wurde dann ein Konjugat von F(ab')&sub2;-Ziegen-anti-humanem F(ab')&sub2; mit Meerrettich-Peroxidase (HRPO = "Horse Radish PerOxidase") zugesetzt und während einer weiteren Stunde inkubiert. Enzymsubstrat wurde dann zugegeben, um die Reaktion sichtbar zu machen.

3.2 Untersuchungen (Assays) an Zusammenbau-Proben

Untersuchungen (Assays) an Zusammenbau-Proben erfolgten an Überständen aus transfizierten COS-Zellen und aus transfizierten CHO-Zellen zur Bestimmung der anwesenden Menge von intaktem IgG.

3.2.1 Mit Maus-Genen transfizierte COS-Zellen und CHO-Zellen

Die Untersuchung (Assay) an Zusammenbau-Proben im Hinblick auf intaktes murines IgG in Zellüberständen erfolgte durch ELISA mit dem folgenden Format:
96-Mulden-Titerplatten wurden mit F(ab')&sub2;-Ziegen-anti- murinem IgG-Fc beschichtet. Die Platten wurden mit Wasser gewaschen, und die Proben zugesetzt und während einer Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und es wurde dann mit HRPO konjugiertes F(ab')&sub2;-Ziegen-anti- murines-IgG-F(ab')&sub2; zugesetzt. Enzymsubstrat wurde dann zugegeben, um die Reaktion sichtbar zu machen. Als Referenz wurde UPC10, eine murines IgG2a-Myelom, verwendet.

3.2.1 Mit chimären Genen transfizierte COS-Zellen und CHO-Zellen

Die Untersuchung (Assay) an Zusammenbau-Proben im Hinblick auf intaktes humanisiertes Anti-ICAM-1 in COS-Zellen- Überständen erfolgte durch ELISA mit dem folgenden Format:
96-Mulden-Titerplatten wurden mit F(ab')&sub2;-Ziegen-anti- humanem IgG-Fc beschichtet. Die Platten wurden gewaschen, und die Proben zugesetzt und während einer. Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und es wurde dann monoklonale murine anti-humane k-Kette zugesetzt und während einer Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und es wurde dann mit HRPO konjugiertes F(ab')&sub2;-Ziegen-anti-murines IgG-Fc zugesetzt. Enzymsubstrat wurde dann zugegeben, um die Reaktion sichtbar zu machen. Anfänglich wurden als Referenzen ein chimärer B72.3 (IgG4) [Bodmer et al., veröffentlichte Patentanmeldung WO-89/01783] und zusammengelegtes gereinigtes humanes IgG2 und IgG4 (Chemicon) verwendet. Später wurde gereinigtes chimäres IgG4 Anti-ICAM-1 als Referenz für die Arbeit an chimärem IgG4 Anti-ICAM-1 verwendet. Die Verwendung einer monoklonalen Anti-K-Kette in dieser Untersuchung (Assay) ermöglicht es, die Menge an chimärem Antikörper von den Referenzen abzulesen.

3.2 Untersuchung (Assay) auf Antigenbindungswirkung

3.3.1 Direkte Bindung

Stoff aus COS- und CHO-Zellen-Überständen sowie gereinigte chimäre Antikörper wurde in einer direkten Untersuchung auf Antigenbindungswirkung an ICAM-1-positiven Zellen untersucht. Das Vorgehen war wie folgt:
JY-Zellen (eine Human-B-Lymphoblastoid-Zellinie, die von ihrer Konstitution her ICAM-1 an der Zelloberfläche exprimiert) wurden in Kultur gehalten. Monoschichten aus J-Zellen wurden unter Verwendung von Poly-L-Lysin und Paraformaldehyd auf 96-Mulden-ELISA-Platten fixiert, und die Platten wurden mit einer Lösung von Rinderserumalbumin in PBS blockiert. Die Proben wurden den Monoschichten zugegeben und während einer Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden vorsichtig mit PBS gewaschen. Dann wurde mit HRPO konjugiertes F(ab')&sub2;-Ziegen-anti-humanes IgG-Fc oder mit HRPO konjugiertes F(ab')&sub2;-Ziegen-anti-murines IgG-Fc zugesetzt, wie es für humanisierte und murine Proben geeignet ist. Enzymsubstrat wurde dann zugegeben, um die Reaktion sichtbar zu machen. Die negative Referenz für die Zell-basierten Untersuchungen war chimäres B72.3 (IgG4) oder zusammengelegtes gereinigtes huma nes IgG2 und IgG4 (Chemicon). Die positive Referenz war muriner monoklonaler R6-5-D6-Antikörper.

3.3.2 Kompetitive Bindung

Monoschichten aus JY-Zellen wurden wie unter 3.3.1 vorbereitet. Antikörperproben wurden zugegeben und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Biotinyliertes Anti-ICAM-1 wurde allen Mulden zugegeben. Das Gemisch wurde während 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Platten wurden gewaschen, und es wurde entweder Streptavidin-HRPO oder Streptavidin- Betagalactosidase zugegeben. Nach einer weiteren Inkubation wurde Enzymsubstrat zugegeben, um die Reaktion sichtbar zu machen.

3.3.3 Untersuchungen (Assay) der Reaktion von Lymphozytengemisch

Peripheres Blut wurde durch Venipunktur von normalen gesunden Spendern erhalten. Das Blut (7,5 ml) wurde bei Raumtemperatur auf 7,5.ml eines Ficoll/Hypaque-Dichtegradients (Pharmacia, Dichte = 1,078) gestrichen und bei 1000 g während 20 Minuten zentrifugiert. Die Zellen wurden gewaschen, mit einem Hemacytometer gezählt, und in RPMI-1640-Kulturmedium (Gibco) suspendiert, das 50 ug/ml Gentamycin, 1 nM L-Glutamin (Gibco) und 5% durch Hitze (55ºC, 30 Minuten) inaktiviertes humanes AB-Serum (Flow Laboratories) enthielt (was im nachstehenden als RPMI-Kulturmedium bezeichnet wird).
Mononukleäre Zellen (Beantworter-Zellen) aus peripherem Blut wurden in Medium bei 6,25 · 10&supmin;&sup5; Zellen/ml in Linbro- Rundboden-Mikrotiterplatten (Nr. #76-013-05) kultiviert. Von einem separaten Spender gewonnene Stimulatorzellen wurden bei 0,258 C/kg bestrahlt (1000 R) und mit den Beantworter-Zellen bei derselben Konzentration kultiviert. Den Mulden wurden Beantworter-Zellen, danach die monoklonalen Antikörper und zuletzt die Stimulatorzellen zugegeben. Das Gesamtvolumen pro Kultur betrug 0,2 ml. Die Referenzen enthielten Beantworter- Zellen allein. Die Kulturplatten wurden während 5 Tagen bei 37ºC in einer 5% CO&sub2; enthaltenden befeuchteten Luftatmosphäre inkubiert. Die Mulden wurden während der letzten 18 Stunden der Kultivierung impulsweise mit 0,5 uCi tritiumhaltigem Thymidin (³HT) (New England Nuclear) behandelt.
Die Zellen wurden unter Verwendung eines Mehrproben- Erntegerätes (Skatron, Norwegen) auf Glasfaserfilter geerntet, wobei mit destilliertem Wasser gespült wurde. Die Filter wurden im Ofen getrocknet und in einem Beckman Ready Safe Flüssigszintillationscocktail in einem LKB Betaplate Flüssigszintillationszähler gezählt.

3.4 Untersuchungen in vivo

3.4.1 Modifizierte Schwartzmann-Reaktion

Die lokale Schwartzmann-Reaktion kann in der Kaninchenhaut durch intradermale Injektion von Endotoxin und 18-24 Stunden später folgende intravenöse Herausforderungsinjektion von Zymosan hervorgerufen werden. Die hämorrhagische Necrose, die sich an den vorher injizierten Hautstellen entwickelt, wird durch Mikrothromben, intravaskuläre Neutrophilenaggregation, Blutplättchen und Fibrinablagerung, Erhöhungen der vaskulären Permeabilität und massive Extravasation von Erythrozyten (RBC) gekennzeichnet. Das Protokoll wurde zur Verwendung bei Cynomologaffen abgeändert. Separate unterschiedliche Hautstellen wurden intradermal mit Endotoxin (3 ug/Stelle) oder normaler Salzlösung injiziert, und 18 Stunden später wurden dieselben Stellen mit Zymosan (300 ug/Stelle) injiziert. Die resultierende Entzündungsantwort wurde 6 Stunden nach der Zymosaninjektion quantitativ erfasst, indem unter Verwendung von ¹²&sup5;1-BSA die Erhöhung der vaskulären Permeabilität an den mit Endotoxin injizierten Stellen im Vergleich mit den mit Salzlösung injizierten Stellen gemessen wurde. Die Hemmwirkung von R6.5 (Anti-ICAM-1), IgG1, IgG2 und IgG4 sowie Chimärderivaten von R6.5 und 815.7 (LFA-1-β) wurde mit derjenigen eines normalen murinen IgG verglichen. Alle IgG- Zubereitungen wurden zu 3 mg/kg vor den Injektionen von Zymosan intravenös verabreicht.

Resultate

4. Konstruktion der cDNA-Bibliothek

4.1 mRNA-Herstellung und cDNA-Synthese

Es wurden Zellen gezüchtet, wie es in Abschnitt 1 beschrieben ist, 1,4 · 10&sup9; Zellen geerntet und mRNA unter Verwendung der Guanidinium/LiCl-Extraktionsprozedur extrahiert. cDNA wurde hergestellt, indem aus Oligo-dT initiiert wurde, um cDNA voller Länge zu erzeugen. Die cDNA wurde methyliert, und zur Klonierung wurden EcoRI-Linker zugefügt.

4.2 Konstruktion der Bibliothek

Die cDNA-Bibliothek wurde einem pSP64-Vektor anligiert, das mit EcoRI gespalten worden war, und die 5'-Phosphatgruppen wurden mit Kälberdarmphosphatase (EcoRI/CIP) (CIP = "Calf Intestinal Phosphatase") entfernt. Die Ligation wurde verwendet, um mit hoher Wirksamkeit transformierbares Escherichia coli zu transformieren, im Falle der leichten Kette Escherichia coli HB101 (E. coli HB101) von Bethesda Research Labs (BRL) und im Falle der schweren Kette E. coli LM1035, dass durch Elektroporation vorbreitet wurde [Dower et al., Nucl. Acids Res. 16: 6127 (1988)]. Es wurden cDNA-Bibliotheken hergestellt. Es wurden 11600 Kolonien einem Screening in bezug auf die leichte Kette und 25000 Kolonien einem Screening in bezug auf die schwere Kette unterzogen.

5. Screening

Kolonien von Escherichia coli, die für Sonden entweder im Hinblick auf die schweren Ketten oder im Hinblick auf die leichten Ketten positiv waren, wurden identifiziert, und zwar entweder im Hinblick auf die leichte Kette durch Oligonucleotid-Screening unter Verwendung des Oligonucleotids 5'TCC- AGATGTTAACTGCTCAC, welches einer Sequenz im konstanten murinen x-Bereich komplementär ist, oder unter Verwendung eines 980-bp-BamHI-EcoRI-Restriktionsfragments eines vorgängig isolierten Klons von konstantem murinem IgG2a-Bereich. Es wurden 6 leichtkettige und 10 schwerkettige Klone identifiziert und für eine zweite Screening-Runde beibehalten. Positive Klone aus der zweiten Screening-Runde wurden gezüchtet, und es wurde die DNA hergestellt. Die Grössen der Gen-Insertionsstücke wurde durch Gel-Elektrophorese geschätzt, und es wurden DNA- Insertionsstücke sequenziert, deren Grösse ihnen erlaubte, eine cDNA voller Länge zu enthalten.

6. DNA-Sequenzierung

Es wurden die DNA-Sequenz für 5'-nichttranslatierte Bereiche, Signalsequenzen, variable Bereiche und 3'-nichttranslatierte Bereiche von cDNAs voller Länge erhalten, die in Fig. 1 für die leichte Kette und in Fig. 2 für die schwere Kette angegeben sind.

7. Konstruktion von cDNA-Expressionsvektoren

Expressionsvektoren von CellTech sind auf Basis des Plasmids pEE6-hCMV aufgebaut, wie aus Fig. 3 ersichtlich ist [Bebbington C. R., veröffentlichte Patentanmeldung WO- 89/01036]. Ein Polylinker zur Insertion von zu exprimierenden Genen wurde nach dem grösseren unmittelbaren Frühpromotor/Enhancer des humanen Cytomegalovirus (hCMV) eingeführt. Marker- Gene zur Selektion des Plasmids in transfizierten eukaryoti schen Zellen können als BamHI-Kassetten an der einmaligen BamHI-Stelle des pEE6-hCMV inseriert werden. Es ist in der Praxis üblich, die neo- und gpt-Marker vor dem Inserieren der Gene von Belang zu inserieren, während der G5-Marker wegen der Anwesenheit von internen EcoRI-stellen in der Kassette zuletzt inseriert wird. Die auswählbaren Marker werden ausgehend vom SV-40-Spätpromotor exprimiert, der auch einen Ursprung der Replikation liefert, so dass die Vektoren zur Expression im transienten Expressionssystem der COS-Zellen verwendet werden können. Die murinen Sequenzen wurden als EcoRI- Fragmente exzisiert und entweder in EE6-hCMV-neo im Hinblick auf die leichte Kette (Fig. 4) oder in EE6-hCMV-gpt im Hinblick auf die schwere Kette (Fig. 5) hinein kloniert.

8. Expression von cDNAs in COS-Zellen

Plasmide pAL5 (Fig. 4) und pAL6 (Fig. 5) wurden in COS- Zellen co-transfiziert, und es wurde aufgezeigt, dass ein Überstand aus dem Experiment der transienten Expression einen sich an JY-Zellen bindenden Zusammenbau-Antikörper enthielt (Fig. 6). Unter Verwendung von ³&sup5;S-Methionin durchgeführte Experimente der metabolischen Markierung zeigten Expression und Zusammenbau von schweren und leichten Ketten auf.

9. Konstruktion von chimären Genen

Die Konstruktion von chimären Genen erfolgte nach einer bereits früher beschriebenen Strategie von Whittle et al. (1987) [Whittle et al., Prot. Eng. 1, 6: 499-505 (1987)]. Es wurde eine Restriktionsstelle in Nähe des 3'-Endes der Sequenz der variablen Domäne identifiziert und zur Bindung eines Oligonucleotids verwendet, welches für den restlichen Teil des murinen variablen Bereiches codiert und eine zur Bindung an den ausgewählte konstanten Bereich geeignete Restriktionsstelle enthält.

9.1 Konstruktion des Gens für die leichte Kette

Die murine-cDNA-Sequenz der leichten Kette wies eine SfaNI-Stelle in Nähe des 3'-Endes des--variablen Bereiches auf. Grösstenteils wurde die Sequenz des variablen Bereiches als 397-bp-Fragment isoliert. Es wurde ein Oligonucleotid- Adapter zusammengestellt, um ausgehend von der SfaNI-Stelle den restlichen Teil des 3'-Bereiches des variablen Bereiches zu ersetzen und die 5'-Reste des humanen konstanten Bereiches zu enthalten bis und mit einer einmaligen NarI-Stelle, die vorgängig in den variablen Bereich eingebaut worden war. Der Linker wurde mit dem humanen Ck-Gen eines durch NarI gespaltenen pRB32 ligiert, und das mit SfaNI-EcoRI adaptierte Ck- Fragment wurde aus dem Ligationsgemisch gereinigt. Der konstante Bereich wurde in einer Dreiweg-Reaktion mit der durch EcoRI-SfaNI gespaltenen DNA des variablen Bereiches mit einem EcoRI/CIP-behandelten Vektor pEE6-hCMV-neo ligiert. Nach Transformation in E. coli wurden Klone isoliert, und die Linker- und Vereinigungs-Sequenzen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Die Fig. 7 zeigt die Strategie zur Konstruktion der chimären leichten Kette.

9.2 Konstruktion des Gens für die schwere Kette

9.2.1 Wahl des Isotypus des Gens für die schwere Kette

Es wurden für die beiden Isotypen des humanen IgG2 und IgG4 codierende chimäre Gene für die schwere Kette konstruiert.

9.2.2 Konstruktion des Gens

Die cDNA-Sequenz der schweren Kette wies eine BanI- Stelle in Nähe des 3'-Endes des variablen Bereiches auf. Grösstenteils wurde die Sequenz des variablen Bereiches als 424-bp-EcoRI/CIP/BanI-Fragment isoliert. Es wurde ein Oligonucleotid-Adapter zusammengestellt, um ausgehend von der BanI-Stelle bis und mit einer einmaligen HindIII-Stelle, die vorgängig in die beiden Aminosäuren des konstanten Bereich eingebaut worden war, den restlichen Teil des 3'-Bereiches des variablen Bereiches zu ersetzen. Der Linker wurde mit den CH-Genfragmenten in durch HindIII gespaltenen pRB41 und pRB21 ligiert, und die mit BanI-BamHI adaptierten Fragmente des konstanten Bereiches wurden aus dem Ligationsgemisch gereinigt. Das EcoRI-BanI-Fragment des variablen Bereiches wurde in einer Dreiweg-Ligation mit jedem der konstanten Bereiche und in den Expressionsvektor (EcoRI/BciI/CIP-behandeltes pEE6-hCMV-gpt) ligiert. Nach Transformation in E. coli HB101 wurden Klone isoliert, und die Linker- und Vereinigungs-Sequenzen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Die Fig. 8 zeigt die Strategie zur Konstruktion der chimären schweren Ketten von IgG2 und IgG4, und die Fig. 9 zeigt skizzenhaft eine Plasmidkarte von pAL8 (IgG2) und pAL9 (IgG4).

9.2.3 Konstruktion des IaG1-Gens für die schwere Kette

Das Plasmid pE1001 ist ein Expressionsvektor auf Basis von pEE6-hCMV-gpt. Es enthält das Gen des humanen IgG1-Gens des konstanten Bereiches. Die Apal-Stelle, die beim 5. und 6. Codon der CH1-Domäne auftritt, ist in diesem Vektor einmalig, wie es auch für eine 3' zum hCMV-Promotor liegende HindIII- Stelle der Fall ist. Der VH-Bereich des Gens der Anti-ICAM-1 schweren Kette wurde zusammen mit der für die ersten fünf Reste vom humanen CH1 codierenden Sequenz aus pAL9 isoliert und in ein vorgängig durch HindIII und ApaI gespaltenes pE1001 inseriert, was pJA200 ergab. Die aus pAL9 übertragenen CH1-Reste sind mit denen für IgG1 identisch, somit wird an der V-C-Vereinigung keine neue Sequenz generiert.

10. Konstruktion von chimären Expressionsvektoren

10.1 Separate G5-Vektoren

G5-Versionen von pAL7, pAL8 und pAL9 (Fig. 7, 8 und 9) wurden konstruiert, indem die neo- und gpt-BamH1-Kassetten mit einer 5,9-kbp-Kassette ersetzt wurde, welche das zu der vom SV-40-Spätpromotor ausgehenden Expression fähige G5-Gen enthielt (vgl. Fig. 7 und 10-12 für Plasmid-Zeichnungen).

11. Expression von chimären Genen

11.1 Expression in COS-Zellen

Das chimäre Antikörper-Plasmid pAL7 (cL) wurde zusammen mit entweder pAL8 (cHIgG2), pAL9 (cHIgG4) oder pJA200 (cHIgG1) in COS-Zellen co-transfiziert, und es wurde aufgezeigt, dass ein Überstand aus dem Experiment der transienten Expression einen sich an die humane JY-B-Zelllinie bindenden Zusammenbau-Antikörper enthielt. Unter Verwendung von ³&sup5;S- Methionin durchgeführte Experimente der metabolischen Markierung zeigten Expression und Zusammenbau von schweren und leichten Ketten auf (Fig. 13). Alle chimären Antikörper konnten sich gut an die JY-Zellen binden. Die kompetitive Untersuchung (Assay) zeigte jedoch, dass von der Kombination cL/cHIgG2 oder cL/cHIgG4 derivierte Antikörper nicht so erfolgreich kompetitiv sind als der biotinylierte murine Antikörper gegen ICAM-1. Der Antikörper cL/cHIgG1 ist erfolgreicher kompetitiv als die Antikörper cL/cHIgG2 oder cL/cHBIgG4.

11.2 Expression in Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen)

Stabile Zellinien wurden wie folgt hergestellt: Chimäre Expressionsvektoren pAL7 und pAL10 für die leichte Kette, welche entweder neo- oder GS-Marker enthielten, wurden in CHO-K1-Zellen nach der CaPO&sub4;-Fällungsprozedur transfiziert. Nach Züchtung auf selektivem Medium wurden positive Zellinien identifiziert und deren spezifische Produktionsraten gemessen, wobei zur Detektion der sekretierten leichten Kette eine Untersuchung (Assay) im ELISA-Format verwendet wurde. Die beiden Zellinien, welche die höchsten Pegel an leichter Kette sekretierten (vgl. die nachstehende Tabelle) wurden ausgewählt und erneut mit entweder pAL8 oder pAL9 transfiziert, um die chimären IgG2- und IgG4- Gene der schweren Kette zusammen mit dem gpt-Marker einzuführen.
Etwa 24 Linien, von denen sich durch ELISA-Zusammenbau- Untersuchung (Assay) zeigte, dass sie chimären Antikörper sekretierten, wurden jeder Transfektion entnommen. Es wurden die spezifischen Produktionsraten gemessen, und die 8 Linien mit den höchsten spezifischen Produktionsraten sind nachstehend angegeben.
Der den gpt-Marker enthaltende chimäre IgG1-Expressionsvektor der schweren Kette pJA200 wurde nach der CaPO&sub4;-Fällungsprozedur in die chimäre, die leichte Kette exprimierende Zellinie neo24 transfiziert. Es wurden die spezifischen Produktionsraten gemessen, und die 4 besten Linien sind nachstehend angegeben.

12. Reinigung des chimären Antikörpers

Antikörper wurde aus 2 · 1-Liter-Ernten Überstand von Rollerflaschen-Kulturen von Zellinien G5 25 G2-12, neo 24 64- 24 und 24.1.48 sowie aus 2 · 0,5-Liter-Ernten von neo 24 G2-9 durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Protein- A-Sepharose gereinigt. Die Zellkultur-Überstände wurden mit 0,2 M Natriumglycinat auf pH-Wert 8,8 eingestellt und einer Protein-A-Sepharose-Säule eingegeben, die mit Glycin/Glycinat-Puffer auf pH-Wert 8,8 vorequilibriert worden war. Nach dem Laden der Proben wurde die Säule mit Equilibrierpuffer gewaschen. Der Antikörper wurde dann eluiert, indem eine Lösung mit sinkendem pH-Wert-Gradienten eingegeben wurde, die aus 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat und 0,1 M Citronensäure bestand. Es wurden Antikörper enthaltende Fraktionen zusammengelegt und der pH-Wert auf 6,5 eingestellt, dann wurden die Proben gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS = "Phosphate Buffered Saline") dialysiert. Die Reinheit und die richtige Zusammensetzung des Antikörpers wurde durch reduzierende und nicht-reduzierende SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) (Fig. 14) und durch Gelfiltration-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) (Fig. 15) über prüft. Die Identität wurde durch Sequenzierung der N- endständigen Aminosäuren und Analyse der Aminosäuren- Zusammensetzung bestätigt.

13. Analyse des gereinigten Antikörpers

13.1 Resultate der Untersuchungen (Assays) zur direkten Bindung und zur kompetitiven Bindung

Alle chimären Antikörper konnten sich gut an JY-Zellen binden (Fig. 16 und 17). In Untersuchungen (Assays) zur kompetitiven Bindung an ICAM vermochte jedoch nur der cL/cHIgG1- Antikörper gegenüber dem biotinylierten murinen Antikörper einigermassen so erfolgreich kompetitiv zu sein wie der murine Antikörper (Fig. 18). Der cL/cHIgG4-Antikörper wies etwa 30% der Hemmwirksamkeit des murinen Antikörpers auf (Fig. 19), und der cL/cHIgG2-Antikörper wies etwa 10% der Hemmwirksamkeit des murinen Antikörpers auf (Fig. 20).
Diese Daten zeigen auf, dass von R6-S-D6 derivierte chimäre Anti-ICAM-1-Antikörper je nach ihrem Isotypus verschiedene Antigenbindungswirksamkeiten aufweisen. Der IgG1-Antikörper hat eine fast so grosse Bindungsneigung wie sein ursprünglicher muriner Antikörper. Der IgG4-Antikörper weist 30% der kompetitiven Bindungsaktivität des murinen Antikörpers auf, der IgG2-Antikörper weist 10% relative Aktivität auf. Dieses Resultat ist unerwartet, da alle diese Antikörper identische Bindungsstellen haben. Diese Unterschiede werden Änderungen der Bindungsneigung zugeordnet, die den Antikörpern von den unterschiedlichen Biegestellen-Flexibilitäten der Isotypen aufgezwungen werden. Affinitätsmessungen an den chimären IgG4 Fab haben aufgezeigt, dass dieses die gleiche Affinität aufweist wie das murine Fab, was bestätigt, dass es die Bindungsneigung ist, welche sich bei der Konstruktion des chimären IgG4 geändert hat.

13.2 Resultate der Untersuchungen (Assay) zur Reaktion von Lymphozytengemisch

Die Reaktion von Lymphozytengemisch (MLR = "Mixed Lymphocyte Reaction"), die ein in-vitro-Modell der Transplantation ist, wurde in vergleichbarem Umfang vom chimären IgG4 und IgG1 wie der murine R6-5-D6-Antikörper gehemmt. Dies zeigt auf, dass der chimäre monoklonale Antikörper spezifische immunologische Ereignisse hemmen kann und somit in vivo im Umfeld von Autoimmunität und Transplantation verwendbar ist (Fig. 21).

13.1 Resultate der Untersuchungen (Assay) zur modifizierten Schwartzmann-Reaktion

Die Schwartzmann-Reaktion an Menschenaffen wurde aufgesetzt, um die Granulozyten-Funktion in vivo in Gegenwart von monoklonalem Anti-ICAM-1-Antikörper zu untersuchen. Das chimäre IgG1 war etwas aktiver als der murine monoklonale Antikörper, der seinerseits bei der Hemmung von durch aktivierte Neutrophile vermitteltem vaskulärem Durchsickern etwas aktiver war als das chimäre IgG4 beim Menschenaffen-Modell. Dies erbringt den Nachweis, dass die chimären Anti-ICAM-1-Antikörper wirksam sein können bei der Verminderung von durch Neutrophile vermittelten Schäden, die mit Reperfusionsschaden oder anderen akuten Entzündungstörungen assoziiert sind (vgl. Fig. 22).

Claims

1. Humanisiertes chimäres Antikörper-Molekül, das schwer- und/oder leichtkettige Bereiche des murinen Anti-ICAM-1-Antikörpers R6-5-D6, welcher von dem beim A.T.C.C. unter der Zugangsnummer HB 9580 hinterlegten Hybridom produzierbar ist, sowie einen konstanten Human-IgG1-Bereich umfasst, wobei der genannte Antikörper eine Neigung zur Bindung an ICAM-1 aufweist, welche derjenigen des murinen R6- 5-D6-Antikörpers äquivalent ist.

2. Humanisiertes chimäres Antikörper-Molekül nach Anspruch 1, welches mindestens eine chimäre schwere Kette und mindestens eine chimäre leichte Kette umfasst.

3. Arzneimittelzusammensetzung, welche den humanisierten chimären Antikörper nach Anspruch 1 oder 2 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.

4. Arzneimittelzusammensetzung nach Anspruch 3, welche zudem mindestens ein anderes Immunsuppressionsmittel umfasst.

5. DNA-Molekül, das für den humanisierten chimären Antikörper nach Anspruch 1 oder 2 codiert.

6. DNA-Molekül nach Anspruch 5, welches ein Vektor ist.

7. DNA-Molekül nach Anspruch 6, bei welchem eine DNA- Sequenz, die für den humanisierten chimären Antikörper nach Anspruch 1 oder 2 codiert, in funktioneller Kombination mit einer Promotor-Sequenz vorliegt.

8. Wirtszelle, welche mit einem DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 6 oder 7 transformiert ist.

9. Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2 bei der Herstellung eines Entzündungshemmers und/oder eines Mittels zur Behandlung einer Entzündung, die sich aus einer Antwort des spezifischen Abwehrsystems in einem Säuger-Subjekt ergibt.

10. Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2 bei der Herstellung eines Mittels zur Behandlung einer Entzündung, die sich aus einer Antwort des nicht-spezifischen Abwehrsystems in einem Säuger-Subjekt ergibt.

11. Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2 bei der Herstellung eines Entzündungshemmers zur Unterdrückung der Metastasierung einer hämatopoetischen Tumorzelle, wobei zur Migration der Zelle ein funktionelles Mitglied der LFA-1-Familie erforderlich ist.

12. Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2 bei der Herstellung eines Wachstumshemmers für eine ICAM-1 exprimierende Tumorzelle.

13. Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2, der genügt, um eine virale Infektion zu unterdrücken, bei der Herstellung eines Mittels zur Behandlung einer viralen Infektion in einem Individuum.

14. Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2 bei der Herstellung eines Mittels zur Unterdrückung der Infektion von Leukozyten durch HIV, wie beispielsweise HIV-1.

15. Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2 bei der Herstellung eines Anti-Migrations-Mittels zur Unterdrückung der extravaskulären Migration eines viral infizierten Leukozyten bei einem Patienten, der einen solchen Leukozyten aufweist, wenn beispielsweise die viral infizierten Zellen durch HIV infiziert sind.

16. Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2 bei der Herstellung eines Mittels zur Behandlung von Asthma.

17. Verwendung nach Anspruch 9 oder 16, bei welcher die Entzündung:

(a) eine Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typus ist;

(b) ein Symptom von Psoriasis ist;

(c) ein Symptom von Autoimmun-Erkrankung wie das Reynaud- Syndrom, Autoimmun-Schilddrüsenentzündung, EAE, Multiple Sclerose, rheumatoider Arthritis und/oder Lupus erythematosus ist;

(d) in Antwort auf die Abstossung eines Organtransplantats wie beispielsweise eines Nierentransplantats erfolgt; und/oder

(e) in Antwort auf die Abstossung eines Gewebetransplantats erfolgt.

18. Verwendung nach einem der Ansprüche 9, 16 oder 17 unter zusätzlicher Verwendung eines zur Bindung an LFA-1 fähigen Antikörpers; eines funktionellen Derivats des Antikörpers, wobei das funktionelle Derivat fähig ist, sich an LFA-1 zu binden; und/oder eines nicht-immunoglobulinartigen kompetitiven Antagonisten von LFA-1.

19. Verwendung nach Anspruch 10 oder 16, bei welcher die Entzündung assoziiert ist mit dem Erwachsenen-Atemnot-Syn drom; dem sekundär zur Septikämie auftretenden Multiplen-Organschaden-Syndrom; dem sekundär zum Trauma auftretenden Multiplen-Organschaden-Syndrom; Reperfusions-Gewebeschaden; akuter Glomerulonephritis; reaktiver Arthritis; Dermatosis mit Komponenten akuter Entzündung; entzündungsbedingter Störung des zentralen Nervensystems wie beispielsweise einem Schlaganfall; thermischem Schaden; Hämodialyse; Leukapheresis; Colitis ulcerosa; der Crohn-Krankheit; nekrotisierender Enterocolitis; dem der Granulozyten-Transfusion assoziierten Syndrom; und/oder der von Zytokin induzierter Toxizität.

20. Verwendung nach Anspruch 13, bei welcher das Virus ein Rhinovirus des Haupt-Serotypus innerhalb des Genus Picornaviridae, ein Cocksackievirus der Gruppe A oder ein Mengo-Virus ist.

21. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 20, bei welcher der chimäre Antikörper mit enteralen Mitteln, parenteralen Mitteln (wie beispielsweise intramuskulär, intravenös oder subkutan), topischen Mitteln, Inhalationsmitteln oder intranasalen Mitteln verabreicht wird.

22. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 21, bei welcher der chimäre Antikörper prophylaktisch und/oder therapeutisch verabreicht wird.

23. Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2 bei der Herstellung eines Diagnosemittels für ein Verfahren zur Diagnose einer ICAM-1 exprimierenden Tumorzelle bei einem Säuger-Subjekt, wobei das Verfahren umfasst, dass man:

(a) einem Subjekt eine Zusammensetzung verabreicht, die einen detektierbar markierten, zur Bindung an ICAM-1 fähigen chimären Antikörper enthält; und

(b) jeden an ICAM-1 gebundenen chimären Antikörper detektiert.

24. Verwendung eines chimären Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 oder 2 bei der Herstellung eines Diagnosemittels für ein Verfahren zur Diagnose von Entzündung bei einem Säuger-Subjekt, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Inkubation einer Gewebeprobe eines Subjekts mit einer Zusammensetzung, die einen detektierbar markierten chimären Antikörper enthält, der zur Bindung an eine ICAM-1 exprimierende Zelle fähig ist, und

(b) Detektion eines jeden an die Zelle gebundenen chimären Antikörpers.