DE69129387T2

DE69129387T2 - Mit Ipoxantin ausgestattete Oligopeptidderivate mit immunomodulatorischer Wirksamkeit und diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69129387T2
Application number: DE69129387T
Authority: DE
Inventors: Piero Foresta; Mauro Marzi; Patrizia Minetti; Maria Ornella Tinti
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 1990-06-28
Filing date: 1991-06-26
Publication date: 1998-09-17
Anticipated expiration: 2011-06-27
Also published as: JPH04230298A; EP0464009B1; DK0464009T3; EP0464009A3; EP0464009A2; IT9048102A0; ATE166063T1; IT9048102A1; DE69129387D1; US5298621A; IT1241452B; ES2117003T3

Description

Diese Erfindung betrifft Ipoxantindipeptidderivate der allgemeinen Formel (I)
sowohl in der Racematform als auch der chiralen Form und die Salze davon mit pharmakologisch akzeptablen Kationen, worin n eine ganze Zahl zwischen 2 und 6, bevorzugt 5 ist und A der Rest des Dipeptides Glycylaspartat ist.
Diese Dipeptide weisen immunmodulierende Aktivität auf und können in oral oder parenteral verabreichbare pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden.
Die bekannte Verbindung, die nach Kenntnis des Anmelders zu den erfindungsgemäßen Verbindungen die nächstkommende ist und deren pharmakologische Daten deren immunomodulierende Aktivität stützen, die in der Literatur beschrieben sind, ist N-(5-(Ipoxantin-9-yl)pentyloxycarbonylarginin (vgl. BP 0077460) und Il Farmaco, 45 (1), 39-47, 1990).
Andere ähnliche Verbindungen, d.h. Ipoxantipeptide und -tripeptide, worin jedoch der Oligopeptidanteil anders ist als bei den erfindungsgemäßen Verbindungen, sind in PCT 89/05818 genannt. Die physico-chemischen Eigenschaften dieser Verbindungen sind jedoch nicht offenbart, und die pharmakologischen Daten, die deren behauptete immunmodulierende Aktivität belegen, sind auch nicht angegeben. Im Hinblick auf diesen Stand der Technik sieht daher der Anmelder die in BP 0077460 offenbarte Verbindung als Referenzverbindung an und hat festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen stärkere immunmodulierende Mittel als die bekannten Verbindungen sind.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden hergestellt, wie es in dem folgenden Reaktionsschema gezeigt ist (aus Gründen der Einfachheit ist n = 5). Peptid
Die Kondensationsreaktion zwischen dem Peptid und dem Chlorcarbonat als Zwischenprodukt findet in einer alkalischen wässrigen Umgebung bei Temperaturen zwischen 10 und 40ºC für 12 bis 48 Stunden statt, wobei das molare Verhältnis der Reaktionsmittel 1:1-2:1 ist. Das rohe Reaktionsprodukt wird durch chromatographie aus Silicagel mit Eluenten wie Ethylacetat- Methanol in variierenden Verhältnissen oder durch Ionenaustauschchromatographie mit sauren und basischen Harzen gereinigt.
Wenn das verwendete Peptid eine weitere funktionelle Gruppe bei der Kondensationsreaktion enthält, wird das geeignet geschützte Dipeptid verwendet und anschließend die Schutzgruppe durch in der Peptidsynthese bekannte Techniken entfernt.
Das folgende Beispiel erläutert die Herstellung einer Verbindung dieser Erfindung.

Beispiel

Herstellung von N-5-(Ipoxantin-9-yl)pentyloxycarbonylglycyl-L-aspartatdinatriumsalz (ST 657/Na&sub2;)

Glycylasparaginsäure (0,076 Mol) wurde in einer Lösung aus NaHCO&sub3; (19,15 g; 0,228 Mol) in 300 ml H&sub2;O aufgelöst. Zu der resultierenden Lösung wurde 9-[5-Chlorcarbonyloxy)pentyl]ipoxantinhydrochlond (26,7 g; 0,083 Mol) portionsweise zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 12 h lang bei Raumtemperatur unter Rühren gehalten. Die resultierende Mischung wurde dann im Vakuum zur Trockene konzentriert. Der Rest wurde in Methanol aufgelöst und auf Silicagel chromatographiert, wobei mit Ethylacetat-Methanol (3:7) eluiert wurde. Die Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert und der somit erhaltene Rest in H&sub2;O aufgelöst und lyophilisiert.
(Ausbeute: 80%)
TLC MeOH Rf = 0,3
EA entspricht C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub0;N&sub6;Na&sub2;O&sub8;
Smp (erweicht 120ºC) = 150ºC
[α]²&sup5;D = -12,9 (0,9% H&sub2;O)
NMR H (300 MHz) D&sub2;O δ 8,2 (1 H, s, Atom); 8,1 (1H, s, Atom), 4,25
(2H, t, CH&sub2;-OC=O); 4,05 (2H, t, CH&sub2;-N ); 3,9 (3H, s+m, CH&sub2;C(=O)N, CH-COOMe); 2,8 (2H, m, CH&sub2;-COONa); 1,9 (2H, m, CH&sub2;-C-O); 1,7 (2H, m, CH&sub2;-C-N ); 1,4 (2H, m, C-CH&sub2;-C)
Die Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde durch mehrere pharmakologische Tests untersucht. Einige dieser Tests, worin N-5- (Ipoxantin-9-yl)pentyloxycarbonylarginin (nachfolgend kurz mit "ST789" bezeichnet) als Referenzverbindung verwendet wurde, sind nachfolgend erläutert.
Test 1 Untersuchung der Wirkung von ST 657 und ST 789 bei der primären Antikörperproduktion (Jerne Test) in der Milz von SRBC (rote Blutzellen vom Schaf) - immunisierten Mäusen
Männliche Hybrid B&sub6;D&sub2;F&sub1;-Mäuse (Charles River, Italien) mit einem Alter von 7 bis 8 Wochen (6 Tiere pro Gruppe) wurden verwendet. Bei diesem Test wurde jedes Tier einzeln untersucht.
Die Verbindungen wurden i.p. mit der Dosis von 2,5 und 25 mg/kg (Einzelverabreichung) am selben Tag der Immunisierung (Tabelle 1) oder bei der Dosis von 2,5 mg/kg/Tag (wiederholte Verabreichungen) an den Tagen -2, und +2 (Immunisierung am Tag 0) (Tabelle 2) verabreicht.
Die experimentelle Vorgehensweise ist von Jerne, N.K. et al. Transpl. Rev., 18, 130 (1974) beschrieben. Insbesondere wurden die Tiere durch i.p.- Verabreichungen einer SRBC-Suspension (1 × 10&sup7; Zellen pro Maus in 0,2 ml steriler Salzlösung) immunisiert.
5 Tage nach der Behandlung wurde die Milz aseptisch von den getöteten Tieren exzisiert.
Die Konzentration der von der Milz erhaltenen Splenocyten wurde auf 1 × 10&sup7; Zellen/ml eingestellt. Aliquote von 0,1 ml Suspension wurden mit warmen Agar-Hanks (2 ml) und 10% SRBC in PBS-Puffer (0,2 ml) vermischt, in Petri-Schalen gesät und bei 37ºC 60 Minuten inkubiert (Proben wurden in Triplikaten untersucht). Nach der Zugabe des Komplements (2 ml Meerschweinchenserum, verdünnt 1:10 in Tris-Puffer), wurden Petri-Schalen weiterhin bei 37ºC 30 Minuten inkubiert. In der Gegenwart des Komplements verursachen die Antikörper sekretierenden Zellen von Splenozyten, die von der Milz von SRBC-immunisierten Mäusen extrahiert waren, eine hämolytische Reaktion. Diese Rekation verursacht die Bildung von lytischen Plaques in der Probe. Die erhaltenen Ergebnisse werden wie folgt ausgedrückt:
(a) Anzahl der Plaque-bildenden Zellen (PFC) von 10&sup6; Zellen;
(b) Anzahl der Plaque-bildenden Zellen in der gesamten Milz.
Die erhaltenen Daten werden mit dem Dunnettts Test (Biostatistics in Pharmacology, Bd. II, Pergamon Press) bearbeitet, um die statistische Signifikanz von Unterschieden zu untersuchen, die zwischen Gruppen von behandelten und Kontrolltieren aufgezeichnet wurden.
Wie in den folgenden Tabellen gezeigt ist, ist ST 657 aktiver als ST 789 bezüglich der Erhöhung der PFC-Zahl im Hinblick auf die Kontrolle. Tabelle 1 Untersuchung der Zahl von Plaque-bildenden Zellen (PFC) in der Milz von SRBC-immunisierten Mäusen, die am Tag der Immunisierung mit ST 657 behandelt wurden Tabelle 2 Untersuchung der Anzahl der Plaque-bildenden Zellen (PFC) in der Milz von SRBC-immunisierten Mäusen, die mit ST 657 am Tage -2, 0, +2 (Immunisierung am Tag 0) behandelt wurden
Dunnett's Test = A p≤0,05

Test 2

Untersuchung der Schutzwirkung, die durch ST 657 und ST 789 in immununterdrückten Mäusen, die experimentell infiziert waren, induziert wird.
Männliche CD1-Mäuse (Charles River, Italien) mit unterschiedlichem Alter wurden verwendet: 6 Wochen und 12 Wochen alte Mäuse wurden mit Klebsiella und 7 Wochen alte Mäuse wurden mit Salmonella infiziert (10 Mäuse pro Gruppe).
Die systemische Infektion de Mäuse wurde über i.p. Impfung mit Klebsiella pathogenem Stamm (K. pneumoniae) oder Salmonella pathogenem Stamm (S. typhimurium) induziert, die in der Lage waren, den Tod der Tiere innerhalb von 5 bis 20 Tagen nach der Aussetzung zu verursachen.
Die infektiöse Dosis wurde von Über-Nacht-Prüfkulturen hergestellt, die 1,5 × 10&sup5; und 3,5 × 10&sup5; lebende Zellen von K. pneumoniae und 1 × 10³ lebende Zellen von S. typhimunum in 0,2 ml 5%-igem Magenmucin enthielten.
Der Immunsuppressor (Cyclophosphamid) wurde i-p. in 0,2 ml steriler Salzlösung, 100 mg/kg, 5 Tage vor dem infektiösen Aussetzen verabreicht.
Die Verbindungen wurden i.p. 0,25 und 25 mg/kg/Tag vom Tage -5 bis zum Tag -1 (Befall am Tage 0) verabreicht.
Die erhaltenen Ergebnisse werden als Prozent Sterblichkeit ausgedrückt und statistisch mit dem chi²-Test (Biostatistics in Pharmacology, Bd. II, Pergamon Press) bearbeitet.
Wie in der folgenden Tabelle gezeigt ist, entfaltet ST 657 eine stärkere Schutzwirkung als ST 789. Tabelle 1 Schutzwirkung von ST 657, verabreicht i.p. vom Tag -5 bis zum Tag -1 (Befall am Tage 0) in immununterdrückten Mäusen, die experimentell mit K. pneumoniae infiziert waren.
a = infizierte Tiere
b = infizierte Tiere nach der Immununterdrückung
c = immununterdrückte Tiere, behandelt mit ST 789 (Dosis und Route gezeigt) und dann infiziert
d = immununterdrückte Tiere, behandelt mit ST 657 (Dosis und Route gezeigt) und dann infiziert
* Befall bei 6 Wochen alten Tieren
** Befall bei 12 Wochen alten Tieren
*** Gruppe, bestehend aus 9 Tieren
Statistische Berechnungen wurden mit dem chi²-Test durchgeführt. Tabelle 2 Schutzwirkung von ST 657, i.p. verabreicht vom Tag -5 bis zum Tag -1 (Befall am Tag 0) immununterdrückten Mäusen, die experimentell mit Salmonella typhimunum ( 1 × 10³ Zellen) infiziert waren.
a = infizierte Tiere
b = infizierte Tiere nach der Immununterdrückung
c = immununterdrückte Tiere, behandelt mit ST 789 (bei der angezeigten Dosis) und dann infiziert
d = immununterdrückte Tiere, behandelt mit ST 657 (bei der angezeigten Dosis) und dann infiziert
Statistische Berechnungen wurden mit Fischer's Genauigkeitstest durchgeführt.
Test 3 Untersuchung der "in vitro" und "in vitro-ex vivo" Wirkung von ST 657 und ST 789 bei der chemotaktischen Aktivität von Rattengranulocyten
Männliche Fisher-344-Ratten mit einem Alter von etwa 3 Monaten wurden verwendet (6 bis 8 Tiere für jede experimentelle Gruppe).
Die Verbindungen wurden "in vitro" 10 ug/ml und "in vitro-ex vivo" nach der Verabreichung von 25 mg/kg/Tag vom Tag -5 bis zum Tag -1 (Abnahme der Blutprobe am Tag 0) untersucht.
Die experimentelle Vorgehensweise wird von Cates, L.K. et al (1978) Modified Boyden chamber method of measuring polymorphonuclear leukocyte chemotaxis, Leukocyte Chemotaxis, Raven Press, N.Y. 67, beschrieben.
Blutproben wurden von Tieren, die durch Enthauptung getötet waren, gesammelt. Nach einer Passage durch heparinisierte Gaze wurde Blut mit Dextan (1,5% in Salzlösung) verdünnt (1:1) und konnte sich 90 Minuten lang absetzen.
Die Konzentration der Granulocyten, gesammelt von Blut durch bekannte Techniken, wurde auf 2 × 10&sup6; Zellen/ml in Hank¹5 Medium eingestellt. Sie wurden dann auf 3 um Milliporefilter gesät, die in Migrationskammern angeordnet waren.
Diese Kammern wurden unter Verwendung von Hank's Medium zum Auswerten der spontanen Migration und Casein (2 ml Lösung, bei der Konzentration 5 mg/ml) zum Auswerten der induzierten Migration hergetellt.
Bei der Durchführung des "in vitro" Testes wurden Granulocyten von unbehandelten Tieren verwendet, zu denen die Verbindungen vor dem Säen davon auf den Millipore-Filtern unter Herstellung der Migrationskammern begeben waren.
Nach der Inkubation der Proben bei 37ºC und 5% CO&sub2; für 60 Minuten wurden die Filter gefärbt und auf Mikroskop-Objektträger gegeben.
Die mikroskopische Untersuchung der Proben gegenüber der Kontrolle erlaubt die Feststellung der Entfernung (in um), die durch die zwei vordersten Granulocyten in dem abgesteckten, zu untersuchenden Gebiet durchgelaufen waren. Die Granulocyten-Migration wird durch Berechnen des Mittelwertes von 10 Ablesungen bestimmt, die als ein gesamtes auf zwei Filtern pro Probe durchgeführt wurden.
Wie in der folgenden Tabelle gezeigt ist, ist ST 657 bezüglich der Erhöhung der chemotaktischen Aktivität von Rattengranulocyten gegenüber der Kontrolle wirksam. ST 789 ist vollkommen inaktiv.
Die erhaltenen Ergebnisse wurden mit Student's "t"-Test (Biostatistics in Pharmacology, loc. cit.) statistisch bearbeitet. Tabelle 1 Wirkung von ST 657 bei der "in vitro" und "in vitro-ex vivo"-chemotaktischen Aktivität von Rattengranulocyten.
a = Verbindungen wurden i-p. bei der Dosis von 25 mg/kg/Tag vom Tag -5 bis zum Tag -1 verabreicht
A Student's "t" Test = p≤0,05
Test 4 Untersuchung der Schutzwirkung von ST 657 und ST 789 in tumorhaltigen Mäusen
Männliche DBA/2 Mäuse und männliche CD1 Mäuse (Charles River), jeweils mit einem Alter von 6 Wochen, wurden verwendet.
DBA/2-Mäuse wurden i.p. mit 1 × 10&sup5; Leukämie L 1210 Zellen (ATCC - American Type Cultur Collection - Cell Lines & Hybridomas, 5. Ausg., 1985) in 0,1 ml Hank's Medium geimpft.
CD1 Mäuse wurden i.p. mit 1 × 10³ Sarcoma S 180 Zellen (ATCC, loc. cit.) in 0,1 ml Hank's Medium geimpft.
Die Verbindungen wurden i.p. in steriler Salzlösung (0,25 mg/kg/Tag) vom Tag + 1 bis zum Tag +10 (Tumortransplantation am Tag 0) verabreicht.
Ebenso wurde das Körpergewicht der Tiere vom Tag 0 bis zum Tag +16 für die L 1210 Leukämie-haltigen Mäuse und vom Tag 0 bis zum Tag +21 für die S 180 Sarcoma-haltigen Mäuse aufgezeichnet.
Das Aufzeichnen des Körpergewichtes wurde durchgeführt, um die Evolution des neoplastischen Prozesses auszuwerten. Die Aktivität der Verbindungen wurde als mittlere Überlebenszeit (MST) bewertet.
Wie in den nachfolgenden Tabellen gezeigt ist, entfaltet ST 657 einen höheren MST-Wert und/oder einen besseren Schutz als ST 789. Tabelle 1 Schutzwirkung von ST 657a in S 180 Sarcoma-haltigen Mäusen
a = i.p. Verabreichungen vom Tag +1 bis zum Tag +10
b = Mittlere Überlebenszeit, berechnet durch den Mittelwert und den ersten interquartilen Bereich.
Kontrolle = unbehandelte sarcomhaltige Mäuse Tabelle 2 Gewichtskontrolle (x ± S.E.) von 5 180 Sarcom-haltigen Mäusen, i.p. behandelt mit ST 657 vom Tag +1 bis zum Tag +10. Neben den Gewichten wird die Anzahl an überlebenden Tieren am angegebenen Tag angegeben.
a = 0,25 mg/kg/Tag
b = Anzahl der Tiere in der Gruppe
* = Ein Tier der Kontrollgruppe starb am Tag + 21, ein anderes am Tag +22 und ein drittes am Tag +24. Zwei Tiere überlebten. Von den 5 Tieren der ST 789 Gruppe starb ein Tier am Tag +22, ein zweites am Tag +23, ein drittes am Tag +25 und ein viertes am Tag +26, ein Tier überlebte. Von den sechs Tieren der Gruppe ST 657 starb ein Tier am Tag +25 und ein zweites am Tag +26; 4 Tiere überlebten.
Banks = gesunde Tiere
Kontrolle = unbehandelte tumorhaltige Tiere Tabelle 3 Schutzwirkung von ST 657 a in L 1210 leukämiehaltigen Mäusen
a = i.p.-Verabreichung vom Tag +1 bis zum Tag +10
b = mittlere Überlebenszeit, berechnet durch den Mittelwert und den ersten interquartilen Bereich
Kontrolle = unbehandelte tumorhaltige Mäuse Tabelle 4 Gewichtskontrolle (x ± S.E.) von L1210 Leukämie-haltigen Mäusen, behandelt i.p. mit ST 657 vom Tag +1 bis zum Tag +10. Neben den Gewichten wird die Anzahl an überlebenden Tieren am angegebenen Tag angegeben.
a = 0,25 mg/kg/Tag
b = Anzahl der Tiere in der Gruppe
* = Das Tier der Kontorllgruppe starb am Tag +18.
Das Tier der ST 789 Gruppe starb am Tag +17.
Von den drei Tieren der ST 657 Gruppe starben zwei am Tag +17 und eines am Tag +18.
Blanks = gesunde Tiere
Kontrolle = unbehandelte tumorhaltige Tiere.

Claims

1. Dipeptide von Ipoxantin der allgemeinen Formel (I):

in deren razemischer und chiralen Form und die Salze davon mit pharmakologisch akzeptablen Kationen, worin n eine ganze Zahl zwischen 2 und 6 ist und A der Rest des Dipeptides Glcylaspartat ist.

2. Das Dipeptid von Anspruch 1, worin n 5 ist.

3. N-5-(Ipoxantin-9-yl)pentyloxycarbonylglycyl-L-aspartatdinatriumsalz.

4. Oral oder parenteral verabreichbare pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Menge von einer der Verbindungen nach Anspruch 1, die zum Induzieren einer immunmodulierenden Wirkung in einem immununterdrückten Patienten wirksam ist, und einen pharmakologisch akzeptablen Exzipienten hierfür.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4 in Einheitsdosierungsform, umfassend von etwa 20 bis etwa 100 mg von einer der Verbindungen.