DE69119304T2 - Ein monoklonaler Antikörper gegen humane, pankreatische Prophospholipase A2 - Google Patents

Ein monoklonaler Antikörper gegen humane, pankreatische Prophospholipase A2

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen monoklonalen Antikörper gegen humane Prophospholipase A&sub2; (nachfolgend bezeichnet mit proPLA&sub2;MAk), ein Verfahren zur Analyse von humaner pankreatischer Prophospholipase A&sub2; unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers und eine Hybridoma-Zelle, die den monoklonalen Antikörper produziert.
  • Die humane pankreatische Phospholipase A&sub2; (EC 3.1.1.4; nachfolgend wird die Phospholipase A&sub2; mit PLA&sub2; bezeichnet) wird aus Prophospholipase A&sub2; (nachfolgend bezeichnet mit proPLA&sub2;) gebildet, die enzymatisch inaktiv ist und von den Azinuszellen des Pankreas produziert wird. Nach Bildung im Pankreas wird die proPLA&sub2; in den zwölffingerdarm sezerniert und wird dort durch Trypsin aufgespalten und in die aktive Form PLA&sub2; überführt. Es ist bekannt, daß sowohl PLA&sub2; als auch proPLA&sub2; im Blutserum vorhanden sind. Die Serumspiegel für PLA&sub2; sind zuvor durch enzymatische Verfahren gemessen worden [L. Zieve und W.C. Vogel, J. Lab. Clin. Med., 57, 586 (1961); W.M. Doizaki und L. Zieve, J. Lab. Clin. Med., 67, 108 (1966); S. Hashihira et al., Jpn. Arch. Intern. Med., 24, 243 (1977); und T. Schröder et al., Scand J. Gastroent., 15, 633 (1980)]. Ferner sind mit diesem Enzym auch immunologische Assays durchgeführt worden [J. Nishijima et al., J. Biochem., 94, 137 (1983); und J.U. Eskola et al., Clin. Chem., 29, 1777 (1983)]. Es ist berichtet worden, daß erhöhte Serumspiegel für PLA&sub2; in Fällen von akuter Pankreatitis auftauchen (ebd.). Ferner sind monoklonale Antikörper gegen PLA&sub2; hergestellt worden (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 63-258898), und Radioimmunoassays unter Verwendung dieser Antikörper legen nahe, daß nahezu die gesamte Menge des Enzyms im Blutserum von gesunden Menschen die Form von proPLA&sub2; annimmt, während die Menge an aktiver PLA&sub2; in gesundem Serum äußerst gering ist [Misaki et al., Ann. Jpn. Clin. Chem. Soc., 27, 109 (1987)]. Der vorgenannte Bericht von Misaki et al. legt ferner nahe, daß proPLA&sub2; im Serum einiger Patienten mit akuter Pankreatitis in die aktive PLA&sub2; transformiert wird. M. Büchler et al. [Klm. Wochenschr., 67, 186 (1989)] berichten, daß sowohl die Werte für immunologisch aktive PLA&sub2; (die die Mengen von sowohl PLA&sub2; als auch von proPLA&sub2; wiederspiegeln) als auch die katalytische Aktivität von PLA&sub2; (die lediglich die Menge von PLA&sub2; wiederspiegelt, da proPLA&sub2; inaktiv ist) im Serum von Patienten mit nekrotischer Pankreatitis erhöht sind, wohingegen in Patienten mit ödematöser Pankreatitis lediglich die Werte für immunologisch aktive PLA&sub2; erhöht sind.
  • Es ist bekannt, daß die Serumspiegel für PLA&sub2; und proPLA&sub2; nicht nur im oben beschriebenen Falle der Pankreatitis ansteigen, sondern daß dies anderen Forschungsergebnissen zufolge auch bei Krebs, artikulärem Rheumatismus, äußerlichen Verletzungen und anderen Störungen der Fall ist. Daher wird eine präzise Quantifizierung der Serumspiegel für PLA&sub2; und proPLA&sub2; im Hinblick auf die Diagnose und Überwachung von Patienten mit den vorgenannten Erkrankungen als ein wichtiges Faktum betrachtet. Wie bereits ausgeführt wurde, sind monoklonale Antikörper gegen PLA&sub2; zuvor entwickelt worden. Es ist jedoch bekannt, daß diese monoklonalen Antikörper eine beträchtliche Kreuzreaktivität gegenüber proPLA&sub2; zeigen. Folglich können beispielsweise mit diesen Antikörpern durchgeführte Radioimmunoassays keine präzisen Messungen der PLA&sub2;-Werte liefern. Unter dem Gesichtspunkt der Diagnose und der klinischen Überwachung der vorgenannten Erkrankungen stellt die Entwicklung von monoklonalen Antikörpern, die eine akurate und spezifische Messung der Serumspiegel für sowohl PLA&sub2; als auch für proPLA&sub2; erlauben, ein wichtiges Desideratum dar.
  • Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein monoklonaler Antikörper bereitgestellt, der humane pankreatische Prophospholipase A&sub2; in spezifischer Weise erkennt, wobei der Antikörper der von der Hybridoma-Zelle PR414 (FERM BP-2978) gebildete monoklonale Antikörper PR414 ist.
  • Nach einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Kreuzreaktivität des monoklonalen Antikörpers mit humaner pankreatischer Phospholipase A&sub2; weniger als 1 %.
  • Nach einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Analyse der erfindungsgemäßen humanen pankreatischen Prophospholipase A&sub2; bereitgestellt, bei dem man
  • (a) einer Probe, die humanes prankreatisches Prophospholipase A&sub2;-Analyt enthält, eine vorgeschriebene Menge an markierter humaner pankreatischer Prophospholipase A&sub2; zugibt,
  • (b) der in der Verfahrensstufe (a) erhaltenen Mischung den oben genannten monoklonalen Antikörper zugibt, wodurch ein Antikörper/Antigen-Komplex gebildet wird, und
  • (c) die Menge an humaner pankreatischer Prophospholipase A&sub2; in der Probe berechnet, ausgehend von dem Ergebnis der Messung der Menge von an den in der Verfahrensstufe (b) erhaltenen Komplex gebundenem Marker berechnet.
  • Ferner werden Hybridoma-Zellen bereitgestellt, die die zuvor genannten monoklonalen Antikörper bilden.
  • Demgemäß ermöglicht die vorliegend beschriebene Erfindung die folgenden Ziele:
  • (1) Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen proPLA&sub2;, wodurch eine präzise Messung der humanen Serumwerte für proPLA&sub2; ermöglicht wird, und
  • (2) Bereitstellung eines Verfahrens zur Analyse von proPLA&sub2; durch Verwendung des vorgenannten monoklonalen Antikörpers.
  • Zum besseren Verständnis der Erfindung und um zu zeigen, wie dieselbe ausgeführt werden kann, wird Bezug genommen auf die begleitenden Zeichnungen, von denen
  • die Figur 1 eine graphische Darstellung ist, in der die Kalibrierungskurve zur Messung von proPLA&sub2; mittels Radioimmunoassay durch Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers gezeigt wird.
  • Die Figuren 2(A) und 2(B) sind graphische Darstellungen, in denen die Elutionsprofile dargestellt sind, die erhalten werden, wenn die Blutseren eines gesunden Menschen bzw. eines Patienten mit Prankreatitis einer Ionenaustauschchromatographie unterzogen wurden.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt Hybridoma-Zellen, die den vorgenannten monoklonalen Antikörper produzieren.
  • Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper, der proPLA&sub2; in spezifischer Weise erkennt, kann mit herkömmlichen Verfahren unter Verwendung einer Hybridoma-Zelle hergestellt werden. Beispielsweise wird proPLA&sub2; unter Anwendung des Verfahrens von R. Grataroh et al. [Biochimie, 63, 677 (1981)] aus pankreatischer Flüssigkeit extrahiert und gereinigt und verwendet, um Mäuse oder andere geeignete Tiere zu immunisieren. Anschließend werden Milz- oder andere Antikörper-produzierende Zellen mit Myelom-Zellen fusioniert, um Hybridoma-Zellen zu erhalten. Als Myelom-Zellen können zum Beispiel Zellen verwendet werden, die vom Maus-Myelom abgeleitet sind. Die vorgenannte Zeilfusion kann beispielsweise nach herkömmlichen Verfahren unter Verwendung von Polyethylenglykol herbeigeführt werden. Anschließend können von den auf diese Weise erhaltenen fusionierten Zellen mittels Screening monoklonale Antikörper gegen proPLA&sub2; erhalten werden. Dieses Screening kann durch herkömmliche Enzym-gekoppelte Immunoassay (ELISA)-Verfahren erfolgen. Beispielsweise wird gereinigte proPLA&sub2; an die feste Phase adsorbiert, und diese wird mit dem Überstand der Hybridoma-Kultur in Kontakt gebracht; wenn in diesem Überstand Antikörper vorhanden sind, die proPLA&sub2; erkennen, binden diese Antikörper an die proPLA&sub2;. Im nächsten Schritt läßt man einen in geeigneter Weise Enzym-markierten Antikörper, wie z.B. einen Anti-IgG-Antikörper der Maus, mit den Anti-proPLA&sub2;- Antikörpern reagieren und an diese binden. Demgemäß erlaubt der Nachweis der Enzymmarkierung ein Screening nach Antikörpern, die proPLA&sub2; erkennen.
  • Im nächsten Schritt werden die diese Antikörper produzierenden Hybridoma-Zellen einem weiteren Screening nach denjenigen unterzogen, die Antikörper produzieren, welche gegenüber PLA&sub2; eine minimale Kreuzreaktivität aufweisen, d.h. monoklonale Antikörper, die proPLA&sub2; in spezifischer Weise erkennen. Beispielsweise können die Hybridoma-Zellen mittels ELISA oder RIA (Radioimmunoassay) unter Verwendung von PLA&sub2; und proPLA&sub2; einem Screening nach monoklonalen Antikörpern zugeführt werden, die in spezifischer Weise an proPLA&sub2; binden und nahezu keine Bindung an PLA&sub2; zeigen. Auf diese Weise werden Hybridoma-Zellen erhalten, die monoklonale Antikörper produzieren, welche proPLA&sub2; in spezifischer Weise erkennen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden in der vorgenannten Weise acht Hybridoma-Zellinien mit den Bezeichnungen PR304, PR306, PR307, PR312, PR314, PR318, PR414 und PR424 erhalten. Von diesen Zellinien ist PR414 am 21. Juni 1990 bei der Fermentation Research Institute Agency for Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, unter der Zugriffsnummer FERM BP- 2978 nach dem Budapester Vertrag hinterlegt worden.
  • Unter den Bedingungen herkömmlicher Verfahren der Kultivierung werden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper in den Überstand sezerniert. Zudem kann Aszites-Flüssigkeit, die hohe Konzentrationen an den monoklonalen Antikörpern enthält, erhalten werden, indem die vorgenannten Hybridoma-Zellen in die pentonealen Höhlen von Mäusen transplantiert werden. Die Verwendung dieser monoklonalen Antikörper ermöglicht eine akurate Messung von proPLA&sub2; oder PLA&sub2;. Diese Messung kann mittels allgemein bekannter RIA- oder Enzym-Immunoassay-Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise kann proPLA&sub2; anhand des folgenden Verfahrens (kompetitiver Assay) gemessen werden. Zuerst wird eine vorgeschriebene Menge an markierter (z.B. radioaktiv markierter) proPLA&sub2; einer Probe zugegeben, die eine bekannte Menge an proPLA&sub2; enthält, und anschließend wird der Mischung der proPLA&sub2; in spezifischer Weise erkennende vorgenannte monoklonale Antikörper zugegeben. Somit bindet die markierte oder unmarkierte proPLA&sub2; an jedes monoklonale Antikörpermolekül, wodurch Antikörper/Antigen- Komplexe gebildet werden. Anschließend wurde der Probe z.B. Immunobead (Bio-Rad Co.) zugegeben, wodurch die Komplexe gebunden werden. Im nächsten Schritt werden die gebundenen Materialien von der Reaktionsmischung in Form von Pellets abgetrennt, und die Menge an Marker auf den Pellets wird gemessen. Auf diese Weise wird durch Veränderung der Menge an proPLA&sub2; in der Probe eine Kalibrierungskurve erstellt. Durch Verwendung dieser Kalibrierungskurve können unbekannte Mengen an proPLA&sub2; in ähnlicher Weise gemessen werden.
  • Der Gehalt an PLA&sub2; im Blutserum, das sowohl proPLA&sub2; als auch PLA&sub2; enthält, kann wie folgt gemessen werden. Zunächst wird ein monoklonaler Anti-PLA&sub2;-Antikörper mit bekannter Kreuzreaktivität (x %) gegenüber proPLA&sub2; hergestellt. Die Menge an proPLA&sub2; in einer Probe, die unbekannte Konzentrationen an sowohl PLA&sub2; als auch an proPLA&sub2; enthält, kann durch das vorgenannte Verfahren gemessen werden, wobei A die in dieser Weise bestimmte molare Konzentration von proPLA&sub2; angibt. Im nächsten Schritt wird dieselbe Messung durchgeführt unter Verwendung des vorgenannten kreuzreaktiven monoklonalen Anti-PLA&sub2;-Antikörpers anstelle des monoklonalen Anti-proPLA&sub2;-Antikörpers, wobei B die auf diese Weise erhaltene molare Konzentration angibt. Da B die Summe des mit PLA&sub2; korrespondierenden Wertes und x % des mit proPLA&sub2; korrespondierenden Wertes ist, wird die Konzentration an PLA&sub2; durch die Formel (B - (X/100)A) ausgedrückt. Demgemäß können die Serumspiegel von sowohl PLA&sub2; als auch von proPLA&sub2; durch Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers akurat bestimmt werden.
    • BEISPIELE
  • Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Beispiele näher veranschaulicht. Diese Beispiele dienen jedoch lediglich der Veranschaulichung und führen in keiner Weise zur Beschränkung des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
    • BEISPIEL 1 (1) Herstellung von PLA&sub2; und proPLA&sub2;
  • PLA&sub2; wurde nach dem Verfahren von Nishijima et al. [J. Biochem., 94, 137 (1983)] aus pankreatischer Flüssigkeit extrahiert und gereinigt. proPLA&sub2; wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Grataroh et al. [Biochemie, 63, 677 (1981)] aus pankreatischer Flüssigkeit extrahiert und gereinigt mit der Abweichung, daß die Chromatographie mit CM-Sepharose (eingetragenes Warenzeichen) zweimal durchgeführt wurde. Die Reinheiten von sowohl PLA&sub2; als auch von proPLA&sub2; wurden durch Aminosäureanalyse bestätigt.
    • (2) Herstellung von monoklonalem Antikörper gegen PLA&sub2; (Anti- PLA&sub2;MAk)
  • Von den Varietäten der nach dem Verfahren von Misaki et al. (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 63-258898) erhaltenen Anti- PLA&sub2;MAk wurde für die vorliegende Erfindung der mit MAk1008 bezeichnete verwendet. Die Affinitätskonstante von MAk1008 betrug 4 × 10¹¹M&supmin;¹, und die Kreuzreaktivität dieses Antikörpers gegenüber proPLA&sub2; betrug 49 %.
    • (3) Herstellung von Anti-proPLA&sub2;MAk
  • Weibliche BALB/c-Mäuse wurden mit proPLA&sub2; in der folgenden Weise immunisiert. Zunächst wurden den Mäusen dreimal in Abständen von 3 Wochen 25 µg von mit Freund's vollständigem Adjuvans emulgierter proPLA&sub2; subkutan injiziert. Zusätzlich erfolgte 4 Tage vor der Entnahme der Milz-Zellen aus diesen Mäusen die intraperitoneale Verabreichung von 50 µg proPLA&sub2; enthaltender physiologischer Sahne.
  • Anschließend wurden aus den vorgenannten Mäusen Milz-Zellen gewonnen und nach dem Verfahren von Galfre und Milstein [Methods Enzymol., 73, 3 (1981)] unter Verwendung von 50 % Polyethylenglykol (Molekulargewicht 4000, Merck) mit Mausmyelom-Zellen fusioniert. Im nächsten Schritt wurden die fusionierten Zellen in HAT-Medium suspendiert und zur Inokulation von Costar 96-well Tissue Culture Cluster (Markenname) verwendet. Anschließend wurden die Überstände der Kulturen von insgesamt 1503 Vertiefungen, in denen die Hybridoma-Zellen kultiviert worden waren, einem Screening nach dem folgenden ELISA-Verfahren zugeführt.
  • Die Vertiefungen von 96 Vertiefungen aufweisenden Immunoplates (Nunc Co.) wurden über Nacht bei 4 ºC mit 10 ng proPLA&sub2; oder 10 ng PLA&sub2; in 50 µl 0,05 M Natriumbicarbonat-Puffer, pH-Wert 8,5, beschichtet. Als nächstes wurden die Vertiefungen mit 0,2 % BSA-PBS blockiert und mit 0,5 % Tween (eingetragenes Warenzei chen) 80-PBS gewaschen. 25 µl umfassende Aliquots der Überstände von jeder der vorgenannten 1503 Hybridoma-Kulturen wurden sowohl den vorgenannten, mit proPLA&sub2; beschichteten Vertiefungen als auch den mit PLA&sub2; beschichteten Vertiefungen zugegeben, wonach diese Platten 1 Stunde lang bei 37 ºC inkubiert wurden. Der Antikörper, der an die proPLA&sub2; oder die PLA&sub2; in den Vertiefungen gebunden hatte, wurde mittels eines Vectastain ABC Kits (Vector Co.) unter Verwendung von ABTS als Färbemittel quantifiziert. Im Verlauf der Messung ließ man die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur stehen und gestattete ihr die Farbausprägung. 12 Minuten nach Zugabe des Agens wurde die Mischung bei 415 nm unter Verwendung eines Corona MTP-32 Mikroplattenphotometers gemessen. Im Falle der Verwendung von mit proPLA&sub2; beschichteten Platten wurden die Vertiefungen mit einer starken Absorption (größer als 1,0) in dem ELISA-Verfahren ausgewählt, während im Falle der Verwen dung von mit PLA&sub2; beschichteten Platten diejenigen ausgewählt wurden, die eine geringe Absorption (niedriger als 0,5) aufwiesen. Auf diese Weise wurden Hybridoma-Zellen erhalten, die AntiproPLA&sub2;MAk bilden (d.h. die an proPLA&sub2; binden und eine sehr geringe Kreuzreaktivität gegenüber PLA&sub2; aufweisen) (31 Vertiefungen).
  • Einige dieser im ELISA positiven Hybridoma-Zellen wurden unmittelbar nach dem Screening zum Zwecke der weiteren Proliferation kloniert, und diese Hybridoma-Zellen wurden nachfolgend eingefroren. Die ungefähre Affinität der von den ausgewählten Hybridoma-Zellen gebildeten Antikörper für proPLA&sub2; wurde geschätzt durch Verwendung des beim Einfrieren dieser Hybridoma- Zellen erhaltenen Überstandes. Die vorgenannte Affinität wurde bestimmt anhand des im Abschnitt unter der Überschrift "Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform" dargelegten kompetitiven RIA-Verfahrens. Die Hybridoma-Zellen, die Antikörper mit hoher Affinität bilden, wurden erforderlichenfalls kloniert.
  • Auf diese Weise wurden acht Anti-proPLA&sub2;MAk bildende Maus- Hybridoma-Zellinien (mit den Bezeichnungen PR304, PR306, PR307, PR312, PR314, PR318, PR414 und PR424) etabliert. Die Kulturüberstände wurden in den Beispielen der vorliegenden Erfindung als Quelle für Anti-proPLA&sub2;MAk verwendet.
  • Die Eigenschaften des von den vorgenannten acht Hybridoma- Zellinien gebildeten Anti-proPLA&sub2;MAk sind in Tabelle 1 dargestellt. Die nach dem Cuchterlony-Diffusionsverfahren bestimmte Immunglobulinklasse war in jedem Fall IgG&sub1;. Die Affinitätskonstanten wurden anhand der Scatchard-Plots bestimmt [G. Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci., 51, 660 (1949)]. Tabelle 1 Eigenschaften von monoklonalen Anti-proPLA&sub2;-Antikörpern Ig-Klasse Affinitätskonstante gegenüber proPLA&sub2; Ka (M&supmin;¹) Kreuzreaktivität gegenüber PLA&sub2; (%)
  • Wie der Tabelle 1 zu entnehmen ist, zeigen sämtliche dieser monoklonalen Antikörper eine hohe Affinität gegenüber proPLA&sub2;, wobei die Affinitätskonstanten im Bereich zwischen 1,7 × 10¹&sup0;M&supmin;¹ und 2,8 × 10¹¹M&supmin;¹ liegen. Die Kreuzreaktivität gegenüber PLA&sub2; wurde geschätzt ausgehend von der 50%igen Hemmrate der Kalibrierungskurve, die durch kompetitive RIA unter Anwendung desselben Verfahrens wie dem oben beschriebenen bestimmt wurde. Der MAk PR304 und der MAk PR312 zeigten signifikante Kreuzreaktivität gegenüber PLA&sub2;, aber die Kreuzreaktivität der anderen sechs MAk- Varietäten war geringer als 1 %.
  • Von den vorgenannten acht Varietäten der monoklonalen AntiproPLA&sub2;-Antikörper wurde in den folgenden Experimenten der MAk PR414 verwendet. Die Kreuzreaktivität von MAk PR414 gegenüber PLA&sub2; beträgt 0,9 %.
    • (4) Assays für proPLA&sub2; und PLA&sub2;
  • Ein RIA zur Messung von proPLA&sub2; wurde durchgeführt mit dem vorgenannten proPLA&sub2;-MAk PR414 (d.h. unter Verwendung des 320fach mit Assay-Pufferlösung verdünnten Kulturüberstandes; die Kreuzreaktivität von Anti-proPLA&sub2;-MAk PR414 gegenüber PLA&sub2; betrug 0,9 %) und mit ¹²&sup5;I-markierter proPLA&sub2;. Der RIA zur Messung von PLA&sub2; wurde durchgeführt mit dem vorgenannten Anti-PLA&sub2;-MAk 1008 (d.h. unter Verwendung der 300 000fach mit Assay-Pufferlösung verdünnten Aszites-Flüssigkeit; die Kreuzreaktivität von Anti- PLA&sub2;-MAk 1008 gegenüber proPLA&sub2; beträgt 49 %) und mit ¹²&sup5;I-markierter PLA&sub2;. Die für den RIA verwendete Assay-Pufferlösung war eine 0,01 M PBS (pH-Wert 7,4) enthaltend 1 mM EDTA, 0,01 % NaN&sub3; und 0,2 % BSA. Sowohl die ¹²&sup5;I-proPLA&sub2; als auch die ¹²&sup5;I-PLA&sub2; wurden hergestellt nach dem Chloramin T-Verfahren.
  • Die Kalibrierungskurven für proPLA&sub2; und PLA&sub2; wurden anhand der folgenden Vorgehensweise erstellt. Zunächst wurden 100 µl einer Standardlösung, die proPLA&sub2; oder PLA&sub2; in einer vorbestimm ten Menge enthält, 100 µl einer Lösung, die ¹²&sup5;I-proPLA&sub2; oder ¹²&sup5;I- PLA&sub2; (40 000 cpm) enthält, 100 µl MAk-Lösung (d.h. der vorgenannte verdünnte Überstand enthaltend MAk PR414, oder die MAk 1008 enthaltende vorgenannte verdünnte Aszites-Flüssigkeit), und 200 µl Assay-Pufferlösung in einem Polystyrolröhrchen vermischt, wonach die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Anschließend wurden 100 µl Immunobead (1 mg Anti-Maus- Immunglobulin/ml Assaypuffer, Bio-Rad Co.) zugegeben, und man ließ die Mischung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in Ruhe stehen. Anschließend wurde das Röhrchen 5 Minuten lang bei 3000 UpM zentrifugiert, und die Radioaktivität des auf diese Weise erhaltenen Niederschlags wurde gemessen. Die Figur 1 zeigt die das Verhältnis zwischen der gemessenen Radioaktivität und der Konzentration der Standardlösung an proPLA&sub2; repräsentierende Kalibrierungskurve. Die Ordinate B/B&sub0; der graphischen Darstellung in Figur 1 betrifft das Verhältnis zwischen der gemessenen, mit den entsprechenden Standardlösungen korrespondierenden Radioakt ivität B, und der Radioaktivität B&sub0;, die mit einer Konzentration an proPLA&sub2; von Null korrespondiert.
  • Die Sensitivität der Kalibrierungskurve, d.h. die niedrigste meßbare Konzentration (d.h. die mit 90 % Inhibierung korrespondierende Konzentration an proPLA&sub2;) betrug 0,4 ng/ml, während die mit 50 % Inhibierung korrespondierende Konzentration an proPLA&sub2; 3,2 ng/ml betrug. Die Kalibrierungskurve für den RIA von PLA&sub2; (nicht dargestellt) ergab, daß die mit 90 % Inhibierung korrespondierende Konzentration an PLA&sub2; 0,4 ng/ml betrug, während die mit 50 % Inhibierung korrespondierende 3,0 ng/ml betrug.
  • In den folgenden Beispielen wurden die vorgenannten Assays in derselben Weise durchgeführt unter Verwendung von humanes Serum enthaltenden Probenflüssigkeiten oder von Eluaten, welche durch Ionenaustauschchromatographie von humanem Serum erhalten werden, anstelle der vorgenannten Standardlösungen von verschie denen Konzentrationen an proPLA&sub2; oder PLA&sub2;. Die Konzentrationen an proPLA&sub2; und PLA&sub2; in diesen Probenflüssigkeiten wurden bestimmt anhand der Kalibrierungskurven für proPLA&sub2; bzw. PLA&sub2;, die in der oben angegebenen Weise erstellt worden waren.
    • BEISPIEL 2 Bestimmung der Serumspiegel an proPLA&sub2; und PLA&sub2; mittels RIA unter Verwendung von Anti-proPLA&sub2;-MAk und Anti-PLA&sub2;-MAk
  • Blutseren der folgenden gesunden Menschen und Patienten wurden anhand des im obigen Beispiel 1 beschriebenen RIA-Verfahrens analysiert. Die Individuen umfaßten drei gesunde Individuen, drei Pankreatitis-Patienten (Nr. 1: Patient mit moderater Pankreatitis nach Kontrast-Radiographie des Pankreasganges; Nr. 2: Patient mit chronischer Pankreatitis in einer Phase der Exazerbation; Nr. 3: Patient mit akuter nekrotisierender Pankreatitis), einen Patienten mit pankreatischem Karzinom und einen Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz. Die Ergebnisse der RIA-Studien sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 serumwerte für proPLA&sub2; und PLA&sub2; in verschiedenen menschlichen Individuen, gemessen mit zwei RIA-Systemen (gemessene Werte) Gesunde Individuen Pankreatitis-Patienten RIA für proPLA&sub2; unter Verwendung von MAk PR414 RIA für PLA&sub2; unter Verwendung von MAk 1008 Einheiten: ng/ml a) Patient mit pankreatischem Karzinom b) Patient mit chronischer Niereninsuffizienz
  • Die in Tabelle 2 dargestellten Serumwerte für proPLA&sub2; werden als nahezu vollständig übereinstimmend mit den tatsächlichen Serumkonzentrationen an proPLA&sub2; betrachtet. Andererseits liegen die in der Tabelle 2 darstellten Serumwerte für PLA&sub2; entsprechend höher als die tatsächlichen Werte, da der für den Assay von PLA&sub2; verwendete monoklonale Antikörper eine Kreuzreaktivität gegenüber proPLA&sub2; von 49 % zeigte. Den Daten dieser Tabelle zufolge waren die gemessenen Werte für sowohl proPLA&sub2; als auch für PLA&sub2; in den Seren von Patienten mit Pankreatitis, pankreatischem Karzinom und chronischer Niereninsuffizienz höher als die entsprechenden Werte der gesunden Individuen mit Ausnahme des Pankreatitis-Patienten Nr. 2. Die gemessenen Werte für proPLA&sub2; waren höher (um einen Faktor von ungefähr 2) als diejenigen für PLA&sub2; in den gesunden Individuen wie auch in dem Patienten mit pankreati schem Karzinom und dem Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz. Zudem waren die bei zwei der drei Pankreatitis-Patienten (Nr. 2 und 3) gemessenen Werte für PLA&sub2; höher als diejenigen für proPLA&sub2;.
  • Die vorgenannten gemessenen proPLA&sub2;-Werte wurden direkt aufgezeichnet als Serumkonzentrationen von proPLA&sub2;. Anschließend wurden die Serumkonzentrationen von PLA&sub2; unter Berücksichtigung der vorgenannten Kreuzreaktivität von MAk1008 auf der Grundlage der gemessenen PLA&sub2;-Werte berechnet. Die auf diese Weise bestimm ten Serumspiegel für proPLA&sub2; und PLA&sub2; wie auch die Verhältnisse der Konzentrationen an proPLA&sub2; und PLA&sub2; sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Serumwerte und relative Anteile von proPLA&sub2; und PLA&sub2;, geschätzt anhand von zwei RIA-Systemen Gesunde Individuen Pankreatitis-Patienten a) Patient mit pankreatischem Karzinom b) Patient mit chronischer c) Die Einheiten der Konzentrationen für proPLA&sub2; und PLA&sub2; sind ng/ml. d) Die Ziffern in Klammern bezeichnen die relativen Anteile (Mol%) gegenüber den Gesamtkonzentrationen an proPLA&sub2; un PLA&sub2; als 100 Mol%.
    • BEISPIEL 3 Isolierung von Serum-proPLA&sub2; und -PLA&sub2; durch Ionenaustauschchromatographie und Messung mittels RIA
  • proPLA&sub2; und PLA&sub2; in menschlichem Blutserum wurden isoliert mittels Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von S- Sepharose (eingetragenes Warenzeichen) (Pharmacia), wonach sich eine Messung mittels RIA anschloß. Als Pufferlösung für die Chromatographie wurde 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,0) enthaltend 0,05 % CHAPS verwendet, und das gesamte Chromatographieverfahren erfolgte bei Raumtemperatur.
  • Zuerst wurden proPLA&sub2;- und PLA&sub2;-Standards (gelöst in chromatographischer Pufferlösung enthaltend 0,2 % BSA), die zum Zwecke der Säulenkalibrierung hergestellt wurden, in eine S-Sepharose (eingetragenes Warenzeichen)-Säule (Bettkapazität 2 ml) injiziert, die mit der vorgenannten chromatographischen Pufferlösung equilibriert worden war. Anschließend wurde die Säule mit 40 ml der chromatographischen Pufferlösung eluiert unter Anwendung eines linearen Natriumchlorid-Gradienten von 0-0,2 M und einer Fließgeschwindigkeit von ungefähr 12 ml/Stunde. Nach Vollendung der linearen Gradientenelution wurde die Säule noch einmal mit 0,5 M Natriumchlorid eluiert. Einen Milliliter umfassende Ahquots sämtlicher Eluate aus der Säule wurden in Polypropylenröhrchen gesammelt, die 100 µl 2 % BSA-PBS enthielten. ProPLA&sub2;- und PLA&sub2;-Standards wurden aus der S-Sephadex-Säule in hohen Rückgewinnungsraten erhalten. Die Peakfraktionen waren Fraktion 19 für proPLA&sub2; und Fraktion 26 für PLA&sub2;.
  • Anschließend wurden humane Seren (d.h. dieselbe Charge von acht Flüssigkeitsproben, die bereits in Beispiel 2 verwendet wurde), Sfach verdünnt mit dem vorgenannten chromatographischen Puffer, in die Säule injiziert, und die Trennung erfolgte unter Anwendung derselben Vorgehensweise.
  • Der proPLA&sub2;- und PLA&sub2;-Gehalt der verschiedenen eluierten Fraktionen der vorgenannten Standards und humanen Seren wurde gemessen mittels RIA unter Anwendung derselben Vorgehensweise wie in Beispiel 2. Mit Ausnahme eines kleinen Peaks, der in der Nähe der Fraktion 15 der Pankreatitis-Patienten auftauchte, wurden sämtliche der immunreaktiven Komponenten mit denselben Retentionsvolumina wie die Standards eluiert. Weder in der anfänglichen Fraktion noch in der Fraktion von 0,5 M Natriumchlorid wurde eine Immunreaktivität nachgewiesen. Die Figuren 2(A) und 2(B) zeigen die Elutionsprofile der Seren von einem der gesunden Individuen (Nr. 1) bzw. von einem der Pankreatitis- Patienten (Nr. 3). In diesen Figuren bezeichnen die schwarzen Punkte die Konzentrationen von proPLA&sub2;-Werten, gemessen mittels RIA unter Verwendung von MAk PR414, während die schwarzen Dreiecke die Konzentrationen von PLA&sub2;, gemessen mittels RIA unter Verwendung von MAk 1008, zeigen. Die Konzentrationen und relativen Anteile von proPLA&sub2; und PLA&sub2; in den Seren der acht Individuen, die ausgehend von den chromatographischen Peak-Regionen berechnet wurden, sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Konzentrationen und relative von proPLA&sub2; und PLA&sub2;, isoliert und gemessen mittels Ionenaustauschchromatographie Gesunde Individuen Pankreatitis-Patienten a) Patient mit pankreatischem Karzinom b) Patient mit chronischer Niereninsuffizienz c) Die serumkonzentrationen (ng/ml) für proPLA&sub2; und PLA&sub2; wurden, indem die Gesamt-Immunreaktivität der korrespondierenden Peaks durch die Volumina der jeweils verwendeten Serumproben geteilt wurde. d) Die Ziffern in Klammern bezeichnen die relativen Anteile (Mol%) gegenüber den Gesamtkonzentrationen an proPLA&sub2; un PLA&sub2; als 100 Mol%. Tabelle 5 Prozentuale Rückgewinnung der Immunreaktivität in Ionenaustauschchromatographie Gesunde Individuen Pankreatitis-Patienten RIA für proPLA&sub2; unter Verwendung von MAk PR414 RIA für PLA&sub2; unter Verwendung von MAk 1008 a) Patient mit pankreatischem Karzinom b) Patient mit chronischer Niereninsuffizienz Die prozentuale Rückgewinnung wurde berechnet für jeden RIA anhand der folgenden Formel: Gesamt-Immunreaktivität (ng) im Eluat / Serumwert (ng/ml) von in die Säule eingeführter Probenflüssigkeit
  • Die Tabelle 5 veranschaulicht die Rückgewinnungsrate der Immunreaktivität von proPLA&sub2; und PLA&sub2; durch Ionenaustauschchromatographie, wie sie mittels RIA bestimmt wurde. Wie der Tabelle zu entnehmen ist, betrug die Rückgewinnungsrate für jedes untersuchte menschliche Serum ungefähr 100 % (86 % - 104 %). Dies zeigt, daß im RIA für proPLA&sub2; unter Verwendung von MAk PR414 lediglich der Serumwert für proPLA&sub2; gemessen wird, während im RIA für PLA&sub2; unter Verwendung von MAk 1008 der Serumwert für PLA&sub2; sowie die mit der Kreuzreaktivität gegenüber proPLA&sub2; korrespon dierende Quantität gemessen werden. Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers berechneten und in der Tabelle 3 dargestellten Serumwerte für proPLA&sub2; und PLA&sub2; sind verglichen mit den in der Tabelle 4 dargestellten nahezu identisch. Daher wird deutlich, daß die Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers eine extrem präzise Messung von sowohl proPLA&sub2; als auch von PLA&sub2; ermöglicht.
  • Die Daten in den Tabellen 2-4 zeigen, daß PLA&sub2; im Serum von gesunden Menschen hauptsächlich die Form der enzymatisch inaktiven proPLA&sub2; annimmt. Dies zeigt, daß proPLA&sub2;, welche im Pankreas synthetisiert wird und in den Blutstrom diffundiert, ohne Aktivierung im normalen Serum existiert. Folglich manifestiert sich die Zytotoxizität von PLA&sub2; in gesunden Individuen nicht. In dem Patienten mit vergleichsweise moderater Pankreatitis (Nr. 1) war der Serumwert für proPLA&sub2; höher als derjenige für PLA&sub2;, die Serumkonzentration an PLA&sub2; war jedoch in dem Patienten mit chronischer Pankreatitis im Stadium der Exazerbation (Nr. 2) wie auch in dem Patienten mit akuter nekrotisierender Pankreatitis (Nr. 3) höher als diejenige an proPLA&sub2;. Dies deutet darauf hin, daß die relativen Anteile von proPLA&sub2; und PLA&sub2; den Ausmaß der Schwere der Pankreatitis reflektieren. Bei dem Patienten mit pankreatischem Karzinom und dem Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz waren die Serumwerte für sowohl proPLA&sub2; als auch für PLA&sub2; extrem hoch. Die relativen Anteile von proPLA&sub2; und PLA&sub2; waren jedoch nahezu dieselben wie bei den gesunden Individuen. Bei dem Patienten mit Niereninsuffizienz kann dieses Ergebnis auf die ungleiche Ausscheidung von proPLA&sub2; und PLA&sub2; aus den Nieren zurückgeführt werden. Dieses Merkmal unterscheidet sich von denjenigen, die bei Patienten mit Pankreatitis manifestiert sind, und könnte daher möglicherweise zur differentiellen Diagnose verwendet werden.

Claims (4)

1. Monoklonaler Antikörper, der humane pankreatische Prophospholipase A&sub2; in spezifischer Weise erkennt, wobei der Antikörper der von der Hybridoma-Zelle PR414 (FERM BP-2978) gebildete monoklonale Antikörper PR414 ist.
2. Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 1, wobei die Kreuzreaktivität des monoklonalen Antikörpers gegenüber humaner pankreatischer Phospholipase A&sub2; weniger als 1 % beträgt.
3. Verfahren zur Analyse der humanen pankreatischen Prophospholipase A&sub2;, bei dem man
(a) einer Probe, die humanes pankreatisches Prophospholipase A&sub2;-Analyt enthält, eine vorgeschriebene Menge an markierter humaner pankreatischer Prophospholipase A&sub2; zugibt,
(b) der in der Verfahrensstufe (a) erhaltenen Mischung einen monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 1 oder 2 zugibt, wodurch ein Antikörper/Antigen-Komplex gebildet wird, und
(c) die Menge an humaner pankreatischer Prophospholipase A&sub2; in der Probe ausgehend von dem Ergebnis der Messung der Menge von an den in der Verfahrensstufe (b) erhaltenen Komplex gebundenem Marker berechnet.
4. Hybridoma-Zelle, welche einen monoklonalen Antikörper gemäß Anspruch 1 oder 2 bildet.
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