KR0173123B1 - 인간 판크레아틱 프로포스포리파제 a2를 인식하는 단일클론항체 - Google Patents
인간 판크레아틱 프로포스포리파제 a2를 인식하는 단일클론항체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간 판크레아틱 포스포리파제 A2를 특이적으로 인식하는 단일 클론항체를 제공한다. 이 단일클론 항체는 포스포리파제 A2와는 교차 반응성이 매우 낮다. 따라서, 이 항체를 사용하면 포스포리파제 A2의 혈청 수준을 정확하고도 간편하게 어세이하는 것이 가능하게 되며, 이로써 췌장염과 다른 각종 질병의 진단 및 모니터를 손쉽게 할 수 있다.
Description
제1도는 본 발명의 단일클론 항체를 사용하여 방사선 면역 어세이에 의해 proPLA2를 측정한 검정곡선을 나타낸 그래프이고,
제2(a)도 및 제2(b)도는 각각 건강한 인간 및 췌장염 환자의 혈청을 이온 교환 크로마토그래피 하였을 때 얻어지는 용출 프로파일을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 인가 프로포스포리파제 A2(이후, proPLA2mAb라고 언급한다)를 인식하는 단일클론항체, 단일클론항체를 사용하여 인간 판크레아틱 프로포스포리파제 A2를 어세이(assay)하는 방법 및 단일클론항체를 생산하는 히브리도마에 관한 것이다.
인간 판크레아틱 포스포리파제 A2(EC 3,1,1,4; 다음 설명에서, 포스포리파제 A2는 PLA2로 언급한다)는 효소적으로 불활성인 프로포스포리파제 A2(이후, proPLA2)라고 언급한다)로부터 형성되고, 췌장의 아키나세포(acinar cells)에 의해 생산된다. 췌장에서 생산된 후, proPLA2는 십이지장으로 분비되고, 거기에서 트립신에 의해 분해된 다음 활성형 PLA2로 전환된다. PLA2및 proPLA2는 둘다 혈청에 존재하는 것으로 공지되어 있다. PLA2의 혈청수준은 이미 효소적방법[참조. Zieve L 및 Vogel WC, J. Lab. Clin. Med., 57, 586(1961); Doizaki WM 및 Zieve L, J. Lab. clin. Med., 67, 108(1966); Hashihira S et al., Jpn. Arch. Intern. Med., 24, 243(1977); 그리고 Schroder Tet al., Scand. J. Gastroent., 15, 633(1980)]에 측정되었으며, 더욱이, 이 효소의 면역학적 어세이도 역시 수행되었다[참조 Nishijima J et al., J. Biochem., 94, 137 (1983); 그리고 Eskola JU et al., Clin. Chem., 29, 1777(1983)]. PLA2의 혈청수준 상승은 급성췌장염의 경우에 일어나는 것으로 보고되어 있다.
또한 PLA2에 대한 단일 클론항체를 제조(일본국 공개특허공보 제63-258898호)하고 이들 항체를 사용한 방사선 면역 어세이에서 건강한 사람의 혈청에 있는 상기 효소의 거의 대부분이 proPLA2형인 것으로 추정되는 반면, 건강한 혈청내의 활성 PLA2의 양이 극소량이라는 것이 제시되었다[참조. Misaki et al., Ann. Jpn. Clin. Chem. Soc., 27, 109(1987)]. 미자키 등의 상기 보고서도 역시 proPLA2가 몇몇 급성 췌장염 환자의 혈청 내에서 활성 PLA2로 전환되다는 것을 암시하고 있다. 뷔흘러 등[Buchler M et al., Klin. Wochenschr, 67, 186(1989)]은 면역학적으로 활성인 PLA2양(PLA2및 proPLA2둘다의 양을 반영) 및 PLA2촉매 활성(proPLA2)가 불활성이기 때문에, PLA2의 양만을 반영)이 괴사성 췌장염 환자의 혈청에서는 상승되는 반면에 부종성 췌장염 환자에 있어서는 면역학적으로 활성인 PLA2수준만이 상승된다고 보고하였다.
PLA2및 proPLA2의 혈청수준은 상기한 바와 같이 췌장염에서 뿐만 아니라, 다른 연구 결과에 따라 암, 관절성 류머티스, 외부 찰과상 및 다른 질병에서도 증가한다는 것이 공지되어 있다. 그러므로, PLA2및 proPLA2의 혈청수준의 정밀한 정량이 상기 질병의 환자를 진단 및 모니터하는데 있어서 중요한 자료로서 간주되고 있다. 상기한 바와 같이, PLA2에 단일클론 항체는 이미 개발되어 있다. 그러나, 이들 단일클론항체는 proPLA2와 상당한 교차-반응성을 나타내는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 예를 들면 이들 항체로 수행한 방사선 면역 어세이로는 PLA2수준을 정밀하게 측정할 수 없다. 상기 질병의 진단 및 임상 모니터의 관점에서, PLA2및 proPLA2모두의 혈청 수준을 정확하고도 특이하게 측정할 수 있는 단일클론 항체의 개발이 중요한 과제가 되어 있다.
본 발명의 단일클론 항체는 상기 언급한 불잇점 및 많은 다른 불잇점과 선행기술의 결점을 극복한 것으로, 인간 판크레아틱 프로포스포리파제 A2를 특이적으로 인식한다.
바람직한 실시예에서 인간 판크레아틱 포스포리파제 A2와 단일클론 항체의 교차-반응성은 1% 미만이다.
바람직한 실시예에서, 상기 항체는 히브리도마 PR414(FERM BP-2978)에 의해 생산된 단일클론항체 PR414이다.
본 발명의 인간 판크레아틱 프로포스포리파제 A2의 어세이 방법은 다음 단계로 이루어진다 :
(a) 인간 판크레아틱 프로포스포리파제 A2검체를 함유한 샘플에 표식된 인간 판크레아틱 프로포스포리파제 A2의 소정량을 첨가하는 단계,
(b) (a) 단계에서 얻은 혼합물에 상기 단일클론 항체를 첨가함으로써, 항체-항원 복합체를 형성시키는 단계, 그리고
(c) (b)단계에서 얻은 복합체 내에 결합된 표식된 것의 양을 측정한 결과로 부터 샘플내의 인간 판크레아틱 프로포스포리파제 A2량을 산출하는 단계, 본 발명의 히브리도마는 상기한 단일클론 항체를 생산한다.
따라서, 여기서 기술된 본 발명은 다음 목적을 달성할 수 있다 :
(1) proPLA2의 인간 혈청수준을 정밀하게 측정할 수 있게하는 proPLA2에 대한 단일클론 항체를 제공하는 것, 그리고
(2) 상기 단일클론항체를 사용하여 proPLA2의 어세이 방법을 제공하는 것.
이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게는 첨부된 도면에 의거하여 본 발명의 많은 목적과 잇점이 자명하게 될 것이다.
본 발명은 히브리도마가 상기 단일클론 항체를 생산하는 것으로 이루어진다. proPLA2를 특이적으로 인식하는 본 발명의 단일클론 항체는 히브리도마를 사용하여 통상 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 그라타로리 등의 방법[참조. Grataroli, R et al., Biochimie, 63, 677(1981)]을 이용하여 proPLA2를 췌장액으로 부터 추출 정제하고, 쥐 또는 다른 적합한 동물을 면역시키는데 사용한다. 그리고나서, 비장세포 또는 다른 항체-생산 세포를 미에로마세포와 융합시켜 히브리도마를 얻는다. 예를 들면, 쥐의 미에로마로부터 유도된 세포를 상기 미에로마세포로서 사용할 수 있다. 상기 세포융합은, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜을 사용하여 통상 방법으로 수행할 수 있다. 그리고 나서, 이와 같이 얻은 융합 세포로부터 proPLA2에 대한 단일클론 항체를 스크리닝(screening)하여 수득할 수 있다. 이러한 스크리닝은 통상적인 효소-결합 면역 흡수 어세이(ELISA)법으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 정제된 proPLA2를 고체상에 흡수시키고, 이것을 히브리도마 배양물의 상등액과 접속시키는데, proPLA2를 인식하는 항체가 이 상등액 내에 존재하면, 이들 항체는 proPLA2에 결합한다. 다음에 적절한 효소-표식된 항체, 예를 들면 쥐의 항-IgG 항체를 작용시켜 항-proPLA2항체에 결합시킨다. 그리하여, 효소 표식의 검색으로 proPLA2를 인식하는 항체에 대한 스크리닝이 가능해진다.
다음에, 이들 항체를 생산하는 히브리도마는 PLA2와 최소의 교차-반응성을 나타내는 항체, 즉 proPLA2를 특이적으로 결합하는 단일 클론항체를 생산하는 히브리도마에 대해 다시 스크린한다. 예를 들면 PLA2및 proPLA2를 사용하여 ELISA 또는 RIA(방사선 면역어세이) 방법으로, 히브리도마를 proPLA2에 특이적으로 결합하되 PLA2에는 거의 결합하지 않는 단일클론 항체에 대해 스크린 할 수 있다. 그리하여 proPLA2를 특이적으로 인식하는 단일클론 항체를 생산하는 히브리도마가 얻어진다. 본 발명에서 PR304, PR306, PR307, PR312, PR 314, PR318, PR414 및 PR424로 지정된 8개의 히브리도마 셀라인은 상기 방법으로 얻는다. 이들 셀라인 중에서, PR414는 부다페스트 조약에 따라 기탁번호 FERM BP-2978로서 1990년 6월 21자로 일본국 이바리기껭 쭈꾸바시 히가시 1죠메 1-3에 주소를 둔 기탁기관(The Fermentation Research Institute Agency for Industrial Science and Technology]에 기탁되어 있다.
통상적인 배양방법의 조건하에서, 본 발명의 단일클론 항체는 상등액에 분비된다. 더욱이, 쥐의 복강에 상기한 히브리도마를 조직 이식함으로써, 상기 단일클론 항체를 고농도로 함유하는 복수액을 얻을 수 있다. 이들 단일클론 항체를 사용함으로써 proPLA2도는 PLA2를 정확하게 측정할 수 있다.
이 측정은 일반적으로 공지된 RIA 또는 효소 면역 어세이 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를들면, proPLA2는 다음 방법(경쟁 어세이)으로 측정할 수 있다.
먼저, 표식된(예를 들면, 방사표식된) proPLA2의 소정량을 기지량의 proPLA2를 함유한 샘플에 첨가한 후, proPLA2를 특이적으로 인식하는 상기 단일클론 항체를 이 혼합물에 첨가한다. 그리하여, 표식된 또는 표식되지 않은 proPLA2가 각각의 단일클론 항체분자에 결합함으로써 항체-항원 복합체를 형성한다. 그리고 나서, 예를 들면 면역비드(Bio-Rad Co.)를 이 샘플에 첨가하여 상기 복합체를 결합시킨다. 그리고 나서, 결합된 물질을 반응 혼합물로 부터 펠렛(pellet)형태로 분리하고, 이 펠렛상의 표식량을 측정한다. 이 방법에서, 샘플내의 proPLA2량을 다양하게 변화시킴으로써 검정곡선을 제작한다. 이 검정곡선을 사용하여 미지의 proPLA2량을 유사한 방법으로 측정할 수 있다.
proPLA2및 PLA2둘다를 함유하는 혈청중의 PLA2함량을 다음 방법으로 측정할 수 있다. 먼저, proPLA2와의 교차-반응성(x%)이 공지되어 있는 항-PLA2단일클론 항체를 제조한다. PLA2및 proPLA2를 미지의 농도로 함유하는 샘플내의 proPLA2량을 상기 방법으로 측정할 수 있다.
이 방법으로 측정된 proPLA2물농도를 A로 나타낸다. 다음에, 항-proPLA2단일 콜론 항체 대신 상기의 교차-반응성 항-PLA2단일클론 항체를 사용하여 동일하게 측정한다. 이와 같이하여 얻어진 몰농도를 B로 나타낸다. B는 PLA2에 상응하는 총계치와 proPLA2에 상응하는 x%치이므로, PLA2의 농도는 식(B-(X/100)A)로 나타낸다. 그리하여 본 발명의 단일클론 항체를 사용하여, PLA2및 proPLA2의 혈청수준을 정확하게 측정할 수 있다.
[실시예]
다음에, 본 발명을 구체적 실시예에 준하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 단지 설명하기 위한 것이며, 이로써 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
[실시예 1]
(1) PLA2및 proPLA2의 제조
PLA2는 니시지마등(Nishijima et al.)의 방법[참조. J. Biochem., 94, 137(1983)]에 따라서 췌장액으로부터 추출 및 정제한다. proPLA2는 그라타로리 등(Grataroli et al.)의 방법[참조. Biochimie, 63, 677(1981)]에 따라서 췌장액으로부터 추출 및 정제한다(단, CM-세팔로스 크로마토그래피를 두 번 실시한다). PLA2및 proPLA2의 순도는 아미노산 분석에 의해 확인한다.
(2) PLA2에 대한 단일클론항체(항-PLA2mAb)의 제조
미사끼 등(Misaki et al.)의 방법(일본국 공개 특허공보 제63-258898호)으로 수득한 항-PLA2mAb의 변종 중에서 본 발명에서는 mAb1008로 지정된 것을 사용한다. mAb1008의 친화계수는 4x1011M-1이고, 이 항체의 proPLA2와의 교차-반응성은 49%이다.
(3) 항-proPLA2mAb의 제조
BALB/c 암컷 쥐를 다음 방법으로 proPLA2를 사용하여 면역시킨다.
먼저, 프루인트 완전 아주반트(Freund's complete adjuvant)로 유화시킨 25㎍의 proPLA2를 쥐에 3주 간격으로 3회 피하 주사한다. 추가로, 50㎍의 proPLA2를 함유하는 생리염수를 쥐로부터 비장세포를 채취하기 4일전에 복강내로 투여한다.
그리고나서, 비장세포를 상기한 쥐로부터 채취하여 갈프리(Galfre) 및 밀스테인(Milstein)의 방법[참조. Methods Enzymol., 73, 3(1981)]에 따라 50% 폴리에틸렌 글리콜(분자량 4000, Merck)를 사용하여 쥐의 미에로마세포(p3-NS1-1-Ag4-1)와 융합시킨다. 다음에, 융합된 세포를 HAT 매체내에서 현탁시키고, 코스타 96-웰 조직 배양 클러스터(상품명)에 접종시킨다. 그리고나서, 히브리도마가 성장한 1503 웰 전체내의 배양액 상등액을 다음 ELISA 방법에 의해 스크린 한다.
96-웰 면역 플레이트(Nunc Co.)의 웰을 50㎕의 0.05M 중탄산나트륨 완충용액(pH 8.5) 중의 10ng의 proPLA2또는 10ng의 PLA2로 4℃에서 하룻밤 코팅한다. 다음에, 그 웰을 0.2% BSA-PBS로 블록킹하고 0.5% 트윈 80-PBS로 세척한다. 상기 1503 히브리도마 각 배양액으로부터 25㎕ 분취액을 상기 PLA2-코팅 웰 및 proPLA2-코팅웰에 첨가한 후, 이들 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양시킨다. 이 웰상에서 proPLA2또는 PLA2가 결합된 항체는 ABTS를 발색제로서 사용하여 벡타스타틴 ABC 킷트(Vectastain ABC Kit, Vector Co.) 방법에 의해 정량한다. 측정 방법에 서 반응 혼합물을 실온에서 방치하고, 발색되도록 한다. 시약을 첨가하고 나서 12분 후에 이 반응혼합물은 코로나 MTP-32 마이크로플레이트 흡광계를 사용하여 415nm에서 측정한다. proPLA2-코팅 플레이트를 사용하는 ELISA 방법에서 큰 흡수(1.0이상)를 나타내는 웰, 그리고 PLA2-코팅 플레이트를 사용할 때는 적은 흡수(0.5미만)를 나타내는 웰을 선택한다. 이 방법에서, 항-proPLA2mAb를 생산하는(예를 들어, proPLA2에 결합하고 PLA2와 매우 낮은 교차-반응성을 나타내는) 히브리도마를 수득한다(31웰).
몇몇의 ELISA 양성 히브리도마를 스크린 후 즉시 클론하여 더욱 증식시키고 이어서 이들 히브리도마를 동결시킨다. proPLA2에 대한 선택된 히브리도마에 의해 생산된 항체의 친화력은 이들 히브리도마를 동결할 때 회수한 상등액을 사용하여 대략 평가할 수 있다. 이 친화력은 바람직한 실시예의 설명에 기술된 경쟁 RIA 방법으로 측정할 수 있다. 필요시, 높은 친화력을 나타내는 항체를 생산하는 히브리도마를 클론시킨다.
이 방법에서 항-proPLA2mAb를 생산하는 쥐의 히브리도마 셀라인 8개 (PR304, PR306, PR307, PR312, PR314, PR318, PR414 및 PR424로 지정)를 설정한다. 배양 상등액은 본 발명의 실시예에서 항-proPLA2mAb원으로서 사용된다.
상기 8개의 히브리도마 셀라인에 의해 생산된 항-proPLA2mAb의 특성을 표1에 나타낸다. 우크터로니 확산 방법(Ouchterlony diffusion method)으로 측정된 면역글로불린군은 모든 경우에 IgG1이다. 친화계수는 스카트챠드플롯트[참조. Scatchard G, Ann. N. Y. Acad. Sci., 51, 660 (1949)]으로 부터 산출하였다.
표 1로부터 명백하듯이, 모든 단일클론 항체의 친화계수는 1.7x10 M 내지 2.8x10 M 범위이며, proPLA에 대해 높은 친화력을 나타낸다.
PLA와의 교차-반응성은 상기한 바와 동일한 방법으로 경쟁 RIA에 의해 산출된 검정곡선의 50% 저해율로부터 평가한다. MAbPR304 및 mAbPR312는 PLA와 유의적인 교차-반응성을 나타내나, 다른 6개의 mAb 변종의 교차반응성은 1% 미만이었다.
상기한 항-proPLA단일클론 항체의 8개의 변종중에서, mAbPR414을 다음 실험에 사용한다. PLA와의 mAbPR414의 교차-반응성은 0.9%이다.
(4) proPLA및 PLA의 어세이
proPLA의 측정을 위한 RIA는 상기 proPLAmAbPR414(예를 들면, 분석 완충 용액으로 320-배 희석시킨 배양 상등액을 사용; PLA와의 항-proPLAmAbPR414의 교차-반응성은 0.9%이다) 및 I-표식된 proPLA를 사용하여 수행한다. PLA의 측정을 위한 RIA는 상기 항-PLAmAb1008(예를 들면, 어세이 완중용액으로 300,000-배 희석한 복수액을 사용; 항-PLAmAb1008의 proPLA와의 교차-반응성은 49%이다) 및 I-표식된 PLA를 사용하여 수행한다. RIA에 사용한 어세이 완충용액은 1mM EDTA, 0.01% NaN3 및 0.2% BSA를 함유하는 0.01M PBS(pH 7.4)이다. I-proPLA및 I-PLA는 모두 클로라민 T법에 의해 제조한다.
proPLA및 PLA에 대한 검정곡선은 다음방법에 의해 제작한다. 먼저, proPLA또는 PLA를 지정량 함유하는 100㎕의 표준용액, I-proPLA또는 IproPLA(40,000cpm)을 함유하는 100㎕의 용액, 100㎕의 mAb용액(예를 들면, mAb PR414를 함유하는 상기의 희석상등액 또는 mAb1008을 함유하는 상기의 희석 복수액) 및 200㎕의 분석 완충용액을 폴리스티렌 튜브내에서 혼합한 후, 이 혼합물을 실온에서 하룻밤 잠복시킨다.
그리고 나서, 100㎕의 면역비드(1mg항-쥐의 면역 글로불린/ml 분석 완중, Bio-Rad Co.)를 첨가하고, 이 혼합물을 실온에서 1시간동안 교란되지 않는 상태로 방치한다. 다음에, 이 튜브를 5분 동안 3000rpm으로 원심분리하고, 이렇게 얻어진 펠렛의 방사능을 측정한다. 제1도는 측정된 방사능과 표준용액의 proPLA농도와의 관계를 나타내는 검정곡선을 나타낸다. 제1도의 그래프에서 종좌표 B/B는 각각의 표준용액에 상응하는 방사능 B와 proPLA의 0 노도에 상응하는 방사능 B간의 비율이다.
검정곡선의 감도, 즉 측정가능한 최저농도(예를 들면, 90% 저해에 상응하는 proPLA농도)는 0.4ng/ml이고, 반면에 50% 저해에 상응하는 proPLA의 농도는 3.2ng/ml이다. PLA의 RIA에 대한 검정곡선(나타나지 않음)은 90% 저해에 상응하는 PLA농도가 0.4ng/ml이고, 반면에 50% 저해에 상응하는 농도는 3.0ng/ml이라는 것을 나타낸다.
다음 실시예에서, 상기 분석은 인간 혈청을 함유한 샘플액체 또는 다양한 농도의 proPLA또는 PLA를 가진 상기 표준용액 대신 인간혈청을 이은 교환 크로마토그래피하여 얻은 용리액을 사용하여 같은 방법으로 수행한다.
이들 샘플액체내의 proPLA및 PLA의 농도는 각각 상기 지시한 방법으로 제작한 proPLA및 PLA에 대한 검정곡선을 이용하여 산출한다.
[실시예 2]
항-proPLAmAb 및 항-PLAmAb를 사용한 RIAD에 의한 proPLA및 PLA의 혈청수준 분석 : 다음 건강한 인간 및 환자의 혈청을 상기 실시예 1에서 기술한 RIA 방법과 동일하게 분석한다. 대상자는 3명의 건강인, 3명의 췌장염 환자(No. 1 : 대췌관의 대비방사선 사진법에 따른 중정도의 췌장염환자; No. 3 : 급성 괴사성 췌장염 환자), 한명의 췌장암 환자, 한명의 만성 심부전증을 지닌 환자로 구성된다. RIA 연구결과는 표2에 나타낸다.
표 2에 나타낸 proPLA의 혈청수준은 proPLA의 실제 혈청 농도와 거의 완전하게 일치하는 것으로 간주된다. 한편, PLA분석에 사용한 단일클론 항체는 proPLA와 49% 교차-반응성을 나타내기 때문에, 표 2에서 나타낸 PLA의 혈청수준은 실제치보다 비례적으로 더 높다. 이표의 데이터에 따르면, 췌장염, 췌장암 및 만성 신 부전증 환자의 혈청내에 proPLA및 PLA의 측정된 수준은 췌장염환자 No.2를 제외한 건강인의 상응치보다 더 높았다. proPLA의 측정 수준은 췌장암 환자 및 만성 신부전증 환자뿐만 아니라, 건강인의 PLA의 수준보다도 더 높았다(대략 2요인에 의해).
또한, 췌장염 환자 3명 중 2명(No. 2 및 No.3)에 있어서 측정된 PLA의 수준이 proPLA의 수준보다 더 높았다.
상기의 측정된 proPLA치는 proPLA의 혈청농도로서 직접 기록한다.
다음에, 상기의 mAb1008의 교차-반응성을 고려하여, PLA의 혈청농도를 측정된 PLA치에 근거하여 산출한다. 이와 같은 방법으로 산출한 proPLA및 PLA의 혈청수준과 proPLA및 PLA농도의 비율을 표3에 나타낸다.
[실시예 3]
이온 교환 크로마토그래피에 대한 혈청 proPLA및 PLA의 분리와 RIA에 의한 측정
인간 혈청내의 proPLA를 S-세파로스(Pharmacia)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리한 후, RIA에 의해 측정을 행한다. 크로마토그래피에 대한 완충 용액으로서 0.05% CHAPS를 함유하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.0)을 사용하여 전체 크로마토그래피 공정을 실온에서 수행한다.
먼저, 칼럼 보정 목적으로 제조된 proPLA및 PLA표준물(0.2% BSA를 함유하는 크로마토그래피용 완충 용액에 용해시킨다)을 상기 크로마토그래피용 완충용액으로 평형시킨 S-세파로스 칼럼(베드능 2ml)에 주입한다. 그리고나서, 이 칼럼을 염화나트륨의 0 내지 0.2M 선형 기울기하에서, 약 12ml/시간의 흐름 속도로 40ml의 크로마토그래피용 완충용액을 사용하여 용리시킨다.
선형 기울기 용리를 끝낸 후, 컬럼을 0.5M 염화나트륨으로 다시 용리시킨다.
컬럼으로부터 모든 용리액 1㎕씩으로 100㎕의 2% BSA-PBS를 함유하는 폴리프로필렌 튜브내에 수집한다. proPLA및 PLA표준물을 높은 회수율로 S-세파덱스 칼럼으로부터 회수한다. 이 피이크 분획은 proPLA의 경우, 분획 19이고 PLA의 경우 분획 26이다.
다음에 상기 크로마토그래피용 완충용액으로 5-배 희석시킨 인간혈청(예를 들면, 실시예 2에서 사용한 8개의 샘플액체와 동일량)을 칼럼내에 주입시키고 동일방법으로 분리를 수행한다.
다양한 용리분획의 상기 표준물 및 인간 혈청의 proPLA및 PLA함유량을 실시예 2와 동일한 방법을 이용하여 RIA로 측정한다. 췌장염 환자에 대한 분획 15 부근에 나타난 작은 피이크를 제외하고, 모든 면역 반응성 성분은 표준물과 동일한 정체 부피를 사용하여 용리한다. 초기 분획 또는 0.5M 염화나트륨 분획 중 어느 것에서도 면역 반응성이 검지되지 않았다. 제2(a)도 및 제2(b)도는 각각 한명의 건강인(No.1) 및 한명의 췌장염 환자(No.3)의 혈청에 대한 용리프로파일을 나타낸다. 이들 도면에서, 흑색점은 mAb PR414를 사용하여 RIA에 의해 측정한 proPLA치의 농도를 나타내며, 반명 흑색 삼각형은 mAb1008을 사용하여 RIA에 의해 측정한 PLA의 농도를 나타낸다.
대상자 8명의 혈청내의 proPLA및 PLA의 농도 및 상대비율은 크로마토그래픽피이크 영역으로 부터 산출하고, 이를 표4에 나타낸다.
표 5는 RIA에 의해 산출된 이온 교환 크로마토그래피에 의한 proPLA및 PLA의 면역 반응성의 회수율을 나타낸다. 표에 나타난 바와 같이, 테스트된 모든 인간 혈청의 회수율은 약 100%(86%-104%)이다. 이는 mAbPR414를 사용한 proPLA에 대한 RIA가 proPLA만의 혈청수준을 측정하고, 반면 mAb1008을 사용한 PLA에 대한 RIA가 PLA의 혈청 수준과 더불어 proPLA와의 교차-반응성에 상응하는 양을 측정한다는 것을 나타낸다. 본 발명의 단일클론 항체를 사용하여 산출한 proPLA및 PLA의 혈청수준은 표3에 나타냈고, 이는 표4에 나타난 바와 거의 동일하다. 따라서, 본 발명의 단일클론 항체를 사용함으로써 proPLA및 PLA를 둘다 매우 정밀하게 측정할 수 있다는 것을 알 수 있다.
표 2-4의 데이터는 건강인의 혈청내 PLA가 효소적으로 불활성형인 proPLA가 주류임을 나타내고 있다. 이는 췌장내에서 합성되고 혈류에 확산되는 proPLA가 정상혈청 내에서 활성화되지 않고 존재한다는 것을 지적하는 것이다. 따라서 PLA의 세포독성이 건강한 인간에게는 발현되지 않는다. 비교적 증정도의 췌장염(No.1)을 지닌 환자에 있어서, proPLA의 혈청수준은 PLA의 수준보다 높으나, 급성괴사성 췌장염의 환자(No.3)뿐 아니라 외분비 기간동안 만성췌장염을 지닌 환자(No.2)에 있어서, PLA의 혈청농도는 proPLA의 농도보다 높다. 이는 proPLA및 PLA의 상대적 비율이 췌장염의 심각성 정도를 반영한다는 것을 제시해주는 것이 췌장암 환자 및 만성 신부전증 환자에 있어서, proPLA및 PLA의 혈청수준은 매우 높다. 그러나 proPLA및 PLA의 상대적 비율은 건강한 대상자 내의 것과 거의 동일하다.
신부전증 환자에 있어서, 이 결과는 신장으로부터 proPLA및 PLA의 외분비 기능이 손상되었기 때문일 수 있다. 이 특성은 췌장염 환자에게서 발현되는 것과는 다르며, 따라서 다른 진단에 이용될 수 있다.
이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게는 본 발명의 범주 및 정신으로부터 벗어나지 않고 다양한 다른 변형이 명백하며, 이러한 변형을 용이하게 할 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서 여기에 첨부된 특허 청구범위는 여기에 기술된 내용에 한정시키려는 것이 아니라, 본 청구범위는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 사람에 의해 균등물로서 취급될 수 있는 모든 특징을 포함하여, 본 발명에 내재하는 특허 가능한 신규성에 대한 모든 특징을 포괄적으로 작성한 것임을 알아야 한다.
Claims (3)
- 히브리도마 PR414(FERM-2978)에 의해 생산되는 단일 클론항체 PR414로서, 인간 판크레아틱 프로포스포리파제 A2를 특이적으로 인식하는 단일 클론항체.
- 제1항에 있어서, 인간 판크레아틱 포스포리파제 A2와 단일 클론 아체와의 교차 반응도가 1% 미만인 단일 클론항체.
- 제1항 또는 제2항의 단일 클론항체를 생산하는 히브리도마.
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| EP0465008A3 (en) | 1993-02-24 |
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