Gebiet der Erfindung
-
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen
und Konzentrieren von saurem Peptid, speziell Phosphopeptid
mit einem Phosphoserinrest, aus einem durch Aufschluß von
Kasein mit Protease hergestellten Peptidgemisch.
-
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Abtrennung und Konzentration dieser Peptide entweder ohne
eine Verwendung irgendeines organischen Lösungsmittels, wie
beispielsweise Ethylalkohol, Pyridin usw., oder ohne Zugabe
von Calcium, Eisen usw.. Zusätzlich ist die vorliegende
Erfindung auch nicht nur auf Trypsinhydrolysate von Kasein
anwendbar, welche Kaseinphosphopeptide (nachfolgend als CPP
bezeichnet) sind, wie mehrere Arten von Peptiden, die einen
Phosphoserinrest enthalten, allgemein bezeichnet werden,
sondern auch in breitem Umfang auf Hydrolysate mit anderen
Proteasen als Trypsin.
Stand der Technik
-
Um 1970 herum wurden mehrere Verfahren zur Herstellung von aus
Kasein stammenden Phosphopeptiden im Labormaßstab eingeführt.
-
Zum Beispiel fällen und fraktionieren W. Manson und W. D.
Annan Phosphopeptide durch Zugabe von Bariumchlorid und
Ethylalkohol zu einer löslichen Fraktion mit pH 4,6 in der
Lösung, die man erhält, indem man β-Kasein bei pH 8 bei 20ºC
mit Trypsin spaltet (Arch. Biochem., 145, 15-26 (1971)).
-
Andererseits fraktionieren Naito und Suzuki grob eine Lösung
von Trypsinabbauprodukten von β-kasein durch Gelfiltration,
führen die Fraktion durch eine Ionenaustauscher(Dowex 50-X2)-
Säule und führen dann die Elution mit Pyridinacetatpuffer (pH
2,5, 0,2N-Pyridin) durch, um Phosphopeptide zu fraktionieren
(Arg. Biol. Chem., 38 (8), 1543-1545 (1974)).
-
Auch West stellt den pH einer mit Trypsin behandelten Lösung
von α-Kasein ein, um die Fällungsprodukte zu entfernen,
unterwirft dann das Filtrat einer Gelfiltration (Sephadex G-
25M), fängt eine im Porenvolumen eluierte großmolekulare
Fraktion auf und führt dann die Fraktion durch einen
Anionenaustauscher (DEAE Sepharose A50), um Phophopeptide am
Anionenaustauscher zu adsorbieren.
-
Jedoch dienen diese Verfahren grundsätzlich dazu, CPP zu
Forschungszwecken herzustellen, oder die Anwesenheit oder
Reinheit von CPP zu bestätigen. Um diese Verfahren zur
Herstellung von Stoffen für Nahrungsmittel industriell
anzuwenden, werden ungeeignete Reagenzien, wie beispielsweise
Bariumchlorid, Pyridin usw. verwendet, oder es sind Vorgänge
damit verbunden, die zur Maßstabsvergrößerung für eine
Industrialisierung schwierig sind.
-
Andererseits hat man zum Zweck einer großtechnischen
Herstellung vorgeschlagen, Phosphopeptide von anderen
Peptiden mittels einer Ultrafiltrationsmembran abzutrennen,
wobei man ihre Eigenschaft ausnutzt, daß Phosphopeptide unter
den durch Abbau von Kasein mit Protease gebildeten Peptiden
durch Zugabe von Mineralstoffen, wie beispielsweise Calcium,
nicht ausgefällt werden, sondern ein großes Aggregat bilden
(Offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 12392/81).
-
Außerdem ist es bekannt, Phosphopeptide durch Zugabe von
Calcium und Ethylalkohol oder durch Zugabe von Eisenchlorid zu
den Spaltungsprodukten von Kasein mit Trypsin zu fällen und zu
isolieren (0ffengelegte Japanische Patentanmeldungen Nr.
170440/83 und 159793/84).
Durch die Erfindung zu lösende Probleme
-
Um Phosphopeptide als Stoffe für Nahrungsmittel oder für
medizinische Zwecke zu verwenden, sollte die Aufnahme von
jeglichem Bariumsalz vermieden werden. Daher ist das Verfahren
von Manson und Annan unter Verwendung von Bariumchlorid im
oben beschriebenen Stand der Technik ungeeignet.
-
Außerdem benötigt das Verfahren, welches Ethylalkohol
verwendet, große Mengen an teurem Ethylalkohol. Im Fall einer
großtechnischen Behandlung stößt man somit speziell aus
wirtschaftlichen und die Sicherheit betreffenden Überlegungen
heraus auf Schwierigkeiten. Da bekannt ist, daß CPP auch ein
Calciumabsorptionsbeschleuniger ist (British J. of Nutrition,
43, 457-467 (1980)), werden Mineralstoffe, wie Calcium und
dergleichen in Kombination getrennt von anderen Quellen
verwendet, wo Phosphopeptide in Stoffen für Nahrungsmittel als
Calciumabsorptionsbeschleuniger verwendet werden; daher wird
bevorzugt, daß Mineralstoffe, wie beispielsweise Calcium in
Phosphopeptiden nicht enthalten sind. In einem derartigen Fall
ist es empfehlenswert, Phosphopeptide in einem calciumfreien
oder eisenfreien Zustand auf den Markt zu bringen, weil ihr
Anwendungsbereich erweitert werden kann, und somit ihr
kommerzieller Wert hoch wird.
-
Andererseits sind die oben beschriebenen Verfahren im
Labormaßstab mit verschiedenen Problemen verbunden. Erstens
ist das Verfahren, welches das Bariumsalz verwendet, auf
Stoffe für Nahrungsmittel nicht anwendbar. Wendet man sich als
nächstes dem Verfahren zu, das eine Gelfiltration in
Kombination mit einer Ionenaustauschersäulenchromatographie
benutzt, so ist es diesmal unmöglich, die Gelfiltration auf
ein großtechnisches Verfahren anzuwenden.
-
Bei dem letzteren Verfahren besitzt weiter ein anionisches
Austauscherharz grundsätzlich eine Affinität für
Phosphopeptide mit einem Phosphoserinrest. Jedoch ist Kasein
selbst ein saures Protein, und Proteaseaufschlußprodukte
besitzen insgesamt ebenfalls eine Affinität für den
Anionenaustauscher. Um Phosphopeptide aus den gesamten
Peptiden zu isolieren, ist daher eine starke Selektivität
erforderlich. In Wirklichkeit weisen die meisten
Anionenaustauscherharze, wenn sie einzeln verwendet werden,
eine äußerst schwache Adsorption mit Phosphopeptiden auf.
Obwohl ein Anionenaustauscherharz mit einer Affinität für eine
großmolekulare Substanz, wie beispielsweise Phosphopeptide
verwendet wird, ist die Selektivität der Adsorption gering.
Zusätzlich ist das Adsorptionsvermögen in einem engen pH-
Bereich schwach, der eine relativ starke Selektivität ergibt.
Dementsprechend ist das Verfahren nicht anwendbar, wenn
Phosphopeptide nicht aus einer äußerst stark verdünnten Lösung
eines Peptidgemischs unter Verzicht auf eine Ausbeute oder
einen Produktionswirkungsgrad hergestellt werden. Überdies
findet bei der Verbindung zwischen einem gewöhnlichen
Anionenaustauscherharz und Peptid nicht nur eine ionische
Wechselwirkung statt, sondern eine hydrophobe Verbindung hat
ebenfalls einen starken Anteil daran. Um eine einmal
adsorbierte Substanz in ausreichender Weise zu eluieren und
zurückzugewinnen, ist es erforderlich, ein Eluent vom
Lösungsmitteltyp, wie beispielsweise Pyridin zu verwenden,
oder ein Salz mit einer sehr hohen Konzentration zuzugeben,
was seine Anwendung für eine praktische Herstellung unmöglich
macht.
Mittel zur Lösung der Probleme
-
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen
und Konzentrieren von Phosphopeptiden, in dessen Verlauf man
Protease auf einen Rohstoff einwirken läßt, der Kasein
und/oder einen Rohstoff auf Kaseinbasis enthält, die
resultierenden Eiweißabbauprodukte auf einer vernetzten, aus
Chitosan gebildeten Substanz adsorbiert, und die
Eiweißabbauprodukte dann desorbiert. Die vorliegende Erfindung
betrifft auch das Verfahren, bei welchem die Adsorption im pH-
Bereich von 1,5 bis 5,0 durchgeführt wird.
-
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die vorgenannten
Mängel zu beseitigen, und ein großtechnisches Verfahren zu
entwickeln, mit dem man wirkungsvoll Phosphopeptide isolieren
und zurückgewinnen kann, die frei von schädlichen oder
unnötigen Mineralstoffen, wie beispielsweise Ba, Ca, Fe, usw.
sind, ohne daß man teure Rohstoffe, wie beispielsweise
Ethylalkohol verwendet.
-
Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, nicht
lediglich ein industrielles Verfahren zu entwickeln, das für
eine großtechnische Herstellung geeignet ist, sondern es
besteht darin, ein großtechnisches Verfahren zu entwickeln,
bei dem Vorrichtungen, die bereits in der milchverarbeitenden
Industrie oder in der Nahrungsmittelindustrie installiert
sind, verwendet werden können, ohne neue Vorrichtungen zu
installieren.
-
Die jetzigen Erfinder haben daher verschiedene Untersuchungen
über eine wirtschaftliche Herstellung durch Konzentrieren und
Isolieren von Phosphopeptiden aus Proteaseaufschlußprodukten
von Kasein in einem industriellen Maßstab durchgeführt, wobei
Vorrichtungen verwendet wurden, die herkömmlicherweise in der
milchverarbeitenden Industrie oder der Nahrungsmittelindustrie
installiert sind, ohne neue Vorrichtungen zu installieren und
ohne irgendwelche Reagenzien zu verwenden, die aus
hygienischen Überlegungen ungeeignet sind. Als Ergebnis hat
man herausgefunden, daß die Ziele durch den Einsatz eines
Trennmittels (nachfolgend eines vernetzten Chitosan-Formteils)
erreicht werden können, das durch Formen von Chitosan (ein
Polysaccharid, das als Hauptbestandteil 2-Arnino-2-Deoxy-D-
Glucose enthält) gefolgt von einer Vernetzungsbehandlung
hergestellt wird. Die vorliegende Erfindung ist so
verwirklicht worden.
-
Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete vernetzte
Chitosan-Formteil auf Chitosanbasis kann man erhalten, indem
man Chitosan formt, dann das Formteil einer
Vernetzungsbehandlung unterzieht, wodurch man dem Formteil
eine Säurebeständigkeit verleiht.
-
Das Chitosan-Formteil kann aus Partikeln, Schichten, Fasern
usw. bestehen, jedoch besteht es im Hinblick auf die Größe der
Oberfläche oder den Betrieb beim Gebrauch vorzugsweise aus
porösen Partikeln.
-
Die porösen Partikel aus Chitosan kann man durch das in der
Japanischen Patentveröffentlichung Nr. 16420/89 offenbarte
Verfahren erhalten. Das heißt, die porösen Partikel erhält man
durch Auflösen von niedrigermolekularem Chitosan mit einem
mittleren Molekulargewicht von 10 000 bis 230 000 in einer
sauren Lösung, wie beispielsweise einer Essigsäurelösung, um
eine 2 bis 20%-ige saure Chitosanlösung zu erhalten,
tropfenweise Zugabe der Lösung auf eine basische Lösung, wie
beispielsweise eine Natriumhydroxidlösung zur Regenerierung
und Verfestigung und ein anschließendes gründliches Waschen
mit Wasser.
-
In diesem Fall kann ein Partikeldurchmesser der porösen
Partikel durch einen Düsendurchmesser einer Tropfdüse der
sauren Chitosanlösung, einen Abgabedruck und dergleichen
gesteuert werden.
-
Der Partikeldurchmesser der porösen Chitosanpartikel ist nicht
in besonderer Weise begrenzt, beträgt bei der vorliegenden
Erfindung jedoch aus betrieblichen und die Adsorptionsmenge
betreffenden Gesichtspunkten vorzugsweise 0,1 bis 1,0 mm.
-
Das Vernetzungsmittel, das zu dem Zweck verwendet wird, dem
derart erhaltenen Chitosan-Formteil eine Säurebeständigkeit zu
verleihen, können diejenigen sein, welche mit der Aminogruppe
von Chitosan reagieren, und Beispiele davon schließen
Diisocyanate, Dialdehyde, Dicarbonsäurederivate und Diepoxi-
Verbindungen ein. Im Hinblick auf das Volumen und die
Reaktivität des Ionenaustauschers werden bevorzugt Diepoxi-
Verbindungen verwendet, die durch die folgenden Formeln
dargestellt sind.
-
(wobei n = 1 bis 10, m = 3 bis 10)
-
In den obigen Formeln schließen Beispiele von [1]
Ethylenglykoldiglycidylether, Diethylenglykoldiglycidylether
und Triethylenglykoldiglycidylether ein; und Beispiele von [2]
schließen Trimethylenglykoldiglycidylether,
Tetramethylenglykoldiglycidylether und
Hexamethylenglykoldiglycidylether ein.
-
Wenn der Vernetzungsgrad in diesem Fall übermäßig hoch ist,
wird ein Porendurchmesser klein, so daß eine
Diffusionsgeschwindigkeit von CPP in den Partikeln abnimmt;
wenn der Vernetzungsgrad zu gering ist, nimmt die Festigkeit
und Säurebeständigkeit ab. Daher findet die Behandlung mit dem
Vernetzungsmittel vorzugsweise in einem Bereich von 5 bis 30
Mol% pro Chitosanrest statt.
-
Als das bei der vorliegenden Erfindung als Rohstoff verwendete
Kasein werden eine Sorte saures Kasein, Natriumkaseinat oder
Calciumkaseinat am meisten bevorzugt, jedoch können auch
ungereinigtes Kasein, wie beispielsweise Milch oder entrahmte
Milch verwendet werden. Konzentrate oder behandelte
Substanzen, wie beispielsweise Reste nach einer
Ultrafiltration derselben können vorteilhafterweise ebenfalls
verwendet werden. Außerdem können auch ungereinigte
Phosphopeptide oder verschiedene Phosphokaseinate verwendet
werden. Somit können verschiedene Kasein enthaltende Rohstoffe
oder Rohstoffe auf Kaseinbasis in breitem Umfang verwendet
werden.
-
Bei der vorliegenden Erfindung werden derartige Rohstoffe mit
Protease behandelt, um Eiweißabbauprodukte zu erzeugen. Dieser
Schritt kann wie bei dem Schritt zur Herstellung von CPP unter
Verwendung von Trypsin als Protease durchgeführt werden. Zum
Beispiel wird nach einer Neutralisation von saurem Kasein oder
einem Auflösen von Natriumkaseinat unter Bildung einer 1 bis
10%-igen Lösung der Lösung Protease zugesetzt, und man läßt
die Mischung bei einem pH von 8,0, einer Temperatur von 30 bis
45ºC 3 bis 24 Stunden lang stehen. Aus wirtschaftlichen
Gesichtspunkten wird der pH und ein Verhältnis von löslichem N
zu gesamtem N nach Beendigung der Enzymreaktion auf 4,6 und
0,8 oder mehr eingestellt.
-
Bei der vorliegenden Erfindung ist Protease nicht nur auf
gereinigtes Trypsin beschränkt, wie im Fall von CPP, sondern
es kann Protease, wie beispielsweise tierisches Enzym, wie zum
Beispiel Pankreatin, Pepsin oder Chymotrypsin; pflanzliches
Enzym, wie beispielsweise Papain, Bromelain oder Ficus-
Protease; von Mikroorganismen stammendes Enzym, wie
beispielsweise Schimmel-, Hefe- oder Bakterien-Protease
verwendet werden.
-
Aus einer Mischlösung verschiedener Peptide, die durch
Aufschluß von Kasein oder einem hauptsächlich Kasein
enthaltenden Material mit Protease hergestellt wurden, können
saure Peptide (hauptsächlich Phosphopeptide) mit sehr hoher
Selektivität und Adsorptionsrate auf einem Trennmittel, d.h.
dem vernetzten Chitosan-Formteil wie oben hergestellt,
adsorbiert werden. Beim Eluieren von Phosphopeptiden kann ein
Elutionsgrad von etwa 80% oder mehr einfach erreicht werden,
indem man lediglich den pH-Wert verändert. Dort wo der
Elutionsgrad auf einmal so nahe wie möglich bei 100% liegen
sollte, kann dies durch Zugabe einer kleinen Menge
Natriumchlorid erreicht werden.
-
Obwohl bisher noch nicht ausreichend geklärt ist, warum das
vernetzte Chitosan-Formteil für Phosphopeptide ausgezeichnete
Ergebnisse liefert, wird angenommen, daß positiv geladene
Aminogruppen gleichförmig in geeigneten Abständen verteilt
sind, wobei die hydrophile Eigenschaft des Gerüsts mit
Ausschluß der positiv geladenen Teile stark ist und
wirkungsvoll wäre.
-
Eine Konzentration der Peptidlösungsmischung ist nicht
besonders begrenzt, als Anhaltspunkt für die Konzentration
kann man jedoch die nach Beendigung der Enzymreaktion
erhaltene Konzentration verwenden, so wie sie ist; oder, falls
notwendig, wird dieselbe vorzugsweise auf etwa 0,1 bis 5% des
Feststoffgehalts verdünnt.
-
Um aus der Lösung von Kasein und Enzymaufschlußprodukten
Phophopeptide selektiv zu adsorbieren, ist es am wichtigsten,
den pH-Wert zu steuern. Der pH-Wert sollte im Bereich von 1,5
bis 5,0, am besten von 2,5 bis 4,5 liegen.
-
Bei einem pH-Wert, der größer als 5,0 ist, ist das
Adsorbtionsvermögen schlecht, da sowohl primäres Amin und
sekundäres Amin im vernetzten Chitosan-Formteil eine äußerst
geringe Dissoziierung aufweisen und somit eine ionische
Wechselwirkung mit Phosphopeptiden schwach ist. Zusätzlich
sind außer den Phosphopeptiden viele andere Peptide in der
Kasein-Enzymaufschlußlösung in einem derart hohen pH-Bereich
negativ geladen, so daß eine Selektivität der Adsorption
gering wird. Umgekehrt ist bei einem pH-Wert unter 1,5 der
geladene Zustand bei den meisten der Phosphopeptide entweder
äußerst schwach oder besitzt dasselbe Vorzeichen wie derjenige
des vernetzten Chitosan-Formteils, so daß keine Adsorption
stattfindet.
-
Die Adsorptionstemperatur kann bei Raumtemperatur liegen.
Selbst bei einer üblichen Temperaturänderung wird keine große
Veränderung der Adsorptionsrate beobachtet.
-
Die Adsorption von Phosphopeptiden beginnt in dem Augenblick,
wenn die Enzymaufschlußlösung von Kasein mit dem vernetzten
Chitosan-Formteil in Kontakt gebracht wird. Um jedoch die
Adsorptionsmenge auf ein Maximum zu bringen, nimmt man
bevorzugt eine Reaktionszeit von 10 bis 30 Minuten nach der
pH-Einstellung.
-
Aus der derart hergestellten Substanz mit adsorbierten
Phosphopeptiden können die Phosphopeptide durch herkömmliche
Fest-Flüssig-Trennverfahren mühelos isoliert und abgetrennt
werden. Zur Fest-Flüssig-Trennung können Zentrifugation,
Dekantation, Filtration, Membranfiltration usw. verwendet
werden, jedoch ist die Trennung nicht nur auf diese Techniken
beschränkt.
-
Das vernetzte Chitosan-Formteil, an dem das wie oben
beschrieben hergestellte saure Peptid adsorbiert ist, wird
behandelt, um die Lösung, welche nicht adsorbierte Peptide
enthält, durch ein in einem Reaktionsgefäß angebrachtes Sieb
abzuführen, und dann wird das vernetzte Chitosan-Formteil
falls erforderlich mit Wasser abgewaschen und wird schließlich
dem Schritt eines Eluierens der Phosphopeptide unterzogen.
-
Daß die Desorbtion der meisten Phosphopeptide einfach durch
Einstellung des pH-Werts bewirkt werden kann, ist
charakteristisch für die Verwendung des vernetzten Chitosan-
Formteils. Spezieller wird das vernetzte Chitosan-Formteil
nach dem Abführen der nicht adsorbierten Fraktion in Wasser
dispergiert, und sein pH-Wert wird mit einer Säure oder einer
Lauge auf 1,5 oder weniger oder 5 oder mehr eingestellt.
-
Durch alleiniges Einstellen des pH-Werts können etwa 10 bis
etwa 20% der adsorbierten Phosphopeptide zurückbleiben; in
diesem Fall nehmen die Peptidreste bei wiederholter Verwendung
des vernetzten Chitosan-Formteils zu. In einem solchen Fall
können die Peptidreste durch Zugabe von ungefähr 0,2 bis 1
mol/l wäßrige Natriumchloridlösung herauseluiert und
zurückgewonnen werden.
-
Als Vorrichtung zur Adsorption und Desorption (Elution) der
Phosphopeptide unter Verwendung des vernetzten Chitosan-
Formteils kann eine mit dem vernetzten Chitosan-Formteil
gefüllte, aus nichtrostendem Stahl oder synthetischem Polymer
hergestellte Säule verwendet werden, jedoch ist es
ausreichend, ein einfaches System zu benutzen, bei dem die
Enzymaufschlußlösung von Kasein in einen Behälter oder Gärtank
geleitet wird, der gewöhnlich in der milchverarbeitenden
Industrie verwendet wird, und eine bestimmte Menge des
vernetzten Chitosan-Formteils damit vereinigt wird.
-
Die eluierte Lösung, welche die Phosphopeptide enthält, wird
konzentriert und sterilisiert; das Konzentrat kann abgepackt
werden, um es so wie es ist für einen Gebrauch
bereitzustellen, oder das Konzentrat kann zur Bildung von
Pulver sprühgetrocknet werden. Dort wo während des Verlaufs
der Elution große Mengen an Salz verwendet werden, kann eine
Entsalzung durch Ionenaustausch oder Elektrodialyse gefolgt
von einer Konzentration und Trocknung erfolgen.
-
Als nächstes werden die Herstellung des bei der vorliegenden
Erfindung verwendeten vernetzten Chitosan-Formteils und das
Isolieren und Konzentrieren der Phosphopeptide in den
folgenden Beispielen ausführlich beschrieben.
Kontrollbeispiele sind ebenfalls dargestellt.
Beispiel 1
-
Nachdem 1,8 kg niedrigmolekulares Chitosan mit einem
Deacetylationsgrad von 82% und einem mittleren
Molekulargewicht von 42 000 in 27,9 kg einer 3%-igen
Essigsäurelösung augelöst worden waren, wurde die
resultierende Lösung zur Verfestigung und Regenerierung
tropfenweise durch eine Düse mit einem Lochdurchmesser von
0,15 mm einer Lösungsmischung aus Natriumhydroxid : Ethanol
Wasser = 6,5 20 : 73,5 zugesetzt. Dann wurde das Produkt
gewaschen, bis es neutral wurde. So erhielt man 30 l (in
nassem Zustand) des Chitosan-Formteils mit einem mittleren
Partikeldurchmesser von 0,3 mm.
-
Zu 30 l (in nassem Zustand) des erhaltenen Chitosan-Formteils
wurden 15 l Isopropylalkohol und 300 g
Ethylenglykoldiglycidylether zugesetzt. Nach einer Einwirkung
über 2 Stunden bei 70ºC wurde das zur Reaktion gebrachte
Formteil mit Wasser gewaschen, was 30 l des vernetzten
Chitosan-Formteils mit einer spezifischen Oberfläche von 85,2
m²/g und einem Ionenaustauschervolumen von 0,45 Milligram-
Äguivalent/ml ergab.
-
Getrennt davon wurde der pH-Wert von 100 kg einer aus saurem
Kasein hergestellten 5%-igen Kaseinlösung auf 8 eingestellt,
und unter Verwendung von Schweinetrypsin (Trypsin-65, Novo Co.
Ltd.) wurde Kasein aufgespalten, bis die bei einem pH-Wert von
4,6 unlöslichen Stickstoffbestandteile auf 10% oder weniger
absanken. Die bei dem pH-Wert von 4,6 hervorgerufenen
Fällungsprodukte wurden durch Zentrifugation entfernt; in der
Lösung wurden etwa 3 960 g Peptid festgestellt, welches etwa
450 g Phosphopeptide enthielt. Die Lösung wurde in einen
Reaktionsbehälter überführt, der in seinem unteren Teil mit
einem Sieb versehen war. Nachdem 30 l (in nassem Zustand) des
wie oben beschrieben hergestellten vernetzten Chitosan-
Formteils in die Lösung gegeben wurden, wurde der pH-Wert mit
Salzsäure auf 3,5 eingestellt. Man ließ das System 30 Minuten
lang stehen, und dann wurde die Flüssigkeit durch das Sieb
hindurch abgelassen, wodurch nur das vernetzte Chitosan-
Formteil zurückblieb. Nachdem das vernetzte Chitosan-Formteil
mit 50 kg Wasser gewaschen war, wurden 100 kg Wasser in den
Behälter zugeführt, und der pH-Wert wurde unter gemeinsamem
sanftem Umrühren mit dem vernetzten Chitosan-Formteil auf 1,5
eingestellt, gefolgt von einem Stehenlassen über 20 Minuten,
wodurch die hauptsächlich aus Phosphopeptiden bestehenden
sauren Peptide aus dem vernetzten Chitosan-Formteil eluiert
wurden. Die etwa 520 g der hauptsächlich aus den Peptiden
bestehenden Feststoffe waren im Eluat enthalten; unter diesen
befanden sich etwa 320 g Phosphopeptide.
Beispiel 2
-
30 l (in nassem Zustand) des Chitosan-Formteils mit einem
mittleren Partikeldurchmesser von 0,3 mm, die man in einer
ähnlichen Weise wie in Beispiel 1 erhalten hatte, wurden 15 l
Isopropylalkohol und 325 g Trimethylenglykoldiglycidylether
zugesetzt. Nach einer Einwirkung über 2 Stunden bei 70ºC wurde
das zur Reaktion gebrachte Formteil mit Wasser gewaschen, was
30 l des vernetzten Chitosan-Formteils mit einer spezifischen
Oberfläche von 85,5 m²/g und einem Ionenaustauschvolumen von
0,48 Milligramm-Äguivalent/ml ergab.
-
Eine Lösung der Aufschlußprodukte von Kasein und Trypsin wurde
unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 1 hergestellt, und
die Lösung wurde in denselben Reaktionsbehälter überführt.
Nachdem man 30 l des wie oben beschrieben hergestellten
vernetzten Chitosan-Formteils in die Lösung gegeben hatte,
wurde der pH-Wert mit Salzsäure auf 3,5 eingestellt. Man ließ
das System 30 Minuten lang stehen, und dann wurde die
Flüssigkeit durch das Sieb hindurch abgelassen, wodurch nur
das vernetzte Chitosan-Formteil zurückblieb. Nachdem das
vernetzte Chitosan-Formteil mit 50 kg Wasser gewaschen war,
wurden 100 kg Wasser in den Behälter zugeführt, und der pH-
Wert wurde unter gemeinsamem sanftem Umrühren mit dem
vernetzten Chitosan-Formteil auf 7,3 eingestellt, gefolgt von
einem Stehenlassen über eine Stunde, wodurch die sauren
Peptide aus dem vernetzten Chitosan-Formteil herauseluiert
wurden. Die etwa 590 g der hauptsächlich aus den Peptiden
bestehenden Feststoffe waren im Eluat enthalten; unter diesen
befanden sich etwa 360 g Phosphopeptide.
Kontrollbeispiele
-
Es sind Kontrollbeispiele dargestellt, um das Vermögen einer
Adsorption von Phosphopeptiden durch das vernetzte Chitosan-
Formteil und bekannte Ionenaustauscherharze sowie ihr
Elutionsverhalten zu vergleichen.
-
Von einer Lösung der Aufschlußprodukte von Kasein und Trypsin,
die 0,45% Phosphopeptide enthielt, wurden jeweils 80 ml in
fünf Bechern von 100 ml entnommen. Jedem Becher wurden jeweils
5 g des in Beispiel 1 hergestellten vernetzten Chitosan-
Formteils und vier Arten von bekannten Ionenaustauscherharzen
zugeführt. Nachdem der pH-Wert mit Salzsäure auf 3,5
eingestellt worden war, ließ man das System 30 Minuten lang
stehen. Unter Verwendung eines Glastrichters als Filter wurden
das Harz und die Abtropfflüssigkeit (A), welche die nicht
adsorbierte Fraktion enthielt, voneinander getrennt. Ein
Volumen von (A) und der Phosphopeptidgehalt in (A) wurden
bestimmt. Eine Adsorptionsrate der Phosphopeptide wurde gemäß
der folgenden Gleichung berechnet:
-
Adsorptionsrate (%) =
225 mg - mg Phosphopeptide in der Abtropfflüssigkeit (A)/225 mg x 100
-
Als nächstes wurde das vernetzte Chitosan-Formteil und die auf
dem Glasfilter zurückbleibenden Ionenaustauscherharze jeweils
wieder in Becher von 100 mi zurückgebracht. Nachdem jedem
Becher 50 ml Wasser zugesetzt worden waren, wurde der pH-Wert
mit Salzsäure auf 1,5 eingestellt. Das System wurde 30 Minuten
unverändert gehalten, um die adsorbierten Phosphopeptide zu
eluieren. Dann wurden das Harz und das Eluat (B) unter
Verwendung eines Glastrichters voneinander getrennt, und der
Phosphopeptidgehalt im Eluat (B) wurde ermittelt. Eine
Elutionsrate wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet:
-
Elutionsrate (%) = mg Phosphopeptide im Eluat
(B)/225 mg - mg Phosphopeptide in der Abtropfflüssigkeit (A) x 100
-
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.
-
Die Ergebnisse zeigen, daß das vernetzte Chitosan-Formteil im
Wirkungsgrad sehr stark überlegen ist.
Gerüst
Adsorptionsrate (%)
Elutionsrate (%)
In Beispiel 1 erhaltenes vernetztes Chitosan-Formteil
DIAION PA 308 (von Mitsubishi Chemical Industry Co., Ltd.)
AMBERLITE IRA 35 (von Organo Co.)
AMBERLITE IR 45 (von Organo Co.)
DIAION WA 30 (von Mitsubishi Chemical Industry Co., Ltd.)
chitosanartig
styrolartig
acrylartig
Auswirkungen der Erfindung
-
Gemäß der vorliegenden Erfindung können aus Kasein stammende
Phosphopeptide äußerst wirtschaftlich in einem industriellen
Maßstab erzeugt werden, ohne daß irgendein organisches
Lösungsmittel, wie beispielsweise Ethanol, Pyridin, usw.
verwendet wird, wobei bereits installierte Einrichtungen
genutzt werden, und dies in einer derartigen calcium- oder
eisenfreien Form, daß man erwartet, daß die Phosphopeptide die
Absorption von Calcium oder Eisen in vivo beschleunigen.
-
Die derart erhaltenen Phosphopeptide können über einen weiten
Bereich verwendet werden, einschließlich von Stoffen für
Nahrungsmittel, funktionellen Nahrungsmitteln oder
Nährstoffen.