DE69031797T2

DE69031797T2 - Promoterregionen der Gene, die für die Pilus-Untereinheiten fim2, fim3 und fimx von Bordetella pertussis kodieren und ihre Verwendung bei der Expression von Genen, die für ein interessierendes Protein kodieren

Info

Publication number: DE69031797T2
Application number: DE69031797T
Authority: DE
Inventors: Anna Cuzzoni; Ferra Francesca De; Guido Grandi; Paola Pedroni; Barbara Riboli
Original assignee: Eniricerche SpA
Current assignee: Eni Tecnologie SpA
Priority date: 1989-11-03
Filing date: 1990-10-29
Publication date: 1998-04-09
Anticipated expiration: 2010-10-30
Also published as: EP0426059B1; IT1236971B; DE69031797D1; DK0426059T3; IT8922252A0; CA2029146A1; ES2112248T3; ATE161047T1; IT8922252A1; EP0426059A1; US5395764A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Isolierung und Charakterisierung der Promotorregionen der Gene, die für die Pilus-Untereinheiten FIM2, FIM3 und FIMX von Bordetella pertussis kodieren, diese Regionen enthaltende Vektoren, mit den Vektoren transformierte Mikroorganismen und ihre Verwendung zur Expression von Genen, die für ein Protein von Interesse kodieren.
Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der Promotorregionen oder deren Nukleotidfragmente zur regulierten oder nicht-regulierten Expression von Genen, die für ein Protein von Interesse kodieren, in einem Stamm von Bordetella, und die Verwendung dieses Stammes zur Entwicklung eines wirksamen anti- Pertussis Impfstoffes.
Bordetella pertussis (B. pertussis) ist der natürliche Erreger von Keuchhusten (Pertussis), einer Krankheit des Atmungstraktes, die während der virulenten Phase von einer kranken Person auf ein anfälliges gesundes Individuum übertragen wird.
Pertussis, die durch krampfartige Hustenanfälle und eine schwere Atmungssymptomologie charakterisiert ist, befällt Individuen jeden Alters und kann in den ersten Lebensjahren in 0,5% aller Fälle zum Tode führen.
Das Auftreten der Infektion kann durch Immunisierung mit einem geeigneten Impfstoff wirksam kontrolliert werden.
Gegenwärtig wird ein zelluläres anti-Pertussis-Vakzin verwendet, welches ein aus mit Merthiolat behandelten und bei 56ºC abgetöteten ganzen virulenten B. pertussis- Zellen hergestellter Impstoff ist. Obwohl er einen Immunschutz bewirkt, kann dieser Impfstoff unter Umständen unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen, die von einfachen Schwellungen, Erythema und Fieber bis hin zu Krämpfen und Hirnschädigungen reichen können. Aus diesen Gründen wurde die Verwendung dieses Impfstoffes in den letzten Jahren drastisch verringert, was zu einer neuen explosionsartigen Ausbreitung von Pertussis-Fällen führte.
Im Ergebnis besteht der Bedarf, einen anti-Pertussis- Impfstoff zu entwickeln, der die oben beschriebenen Nachteile nicht auweist.
Es ist bekannt, daß B. pertussis während der virulenten Phase (Phase I) eine Reihe von toxischen Komponenten (Virulenzfaktoren) produziert, die zur Entstehung und dem Bestehen der Infektion notwendig sind und von denen einige als Immunogene zur Entwicklung eines zellfreien anti-Pertussis-Impfstoffes besonders geeignet erscheinen.
So sind zum Beispiel die Pili oder Fimbrien, die auf der Oberfläche des Bakteriums vorliegende Proteine darstellen und aus polymerisierten (Pilus) Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 21000 bis 24000 Dalton bestehen, an der spezifischen Adhäsion der Bakterien an die Cilien der Epithelzellen des oberen Atmungstraktes beteiligt.
Dieses stellt eine essentielle Phase bei der Pathogenese von Pertussis dar, weil sie den Mikroorganismus dazu befähigt, dem Abwehrsystem des Wirtes zu entgehen. Ein Impfstoff gegen diese Phase wäre daher wünschenswert.
Ashworth et al. (1982) (Infect. Immun., 37, 1278-1281) schlugen zuerst vor, daß die Pili von B. pertussis Serotyp-spezifische Agglutinogene darstellen, das sind Oberflächen-Antigene, welche die Produktion von Antikörpern stimulieren, die bakterielle Zellen desselben Serotyps agglutinieren.
Bisher konnten Antigen-verschiedene Pilus-Proteine der Serotypen 1, 2, 3, 4, 5, 6 und x identifiziert werden.
Die Verwendung von gereinigten Pih zur Herstellung eines Impf stoffes muß jedoch auch die in Stämmen von B. pertussis beobachtete Antigen-Variation berücksichtigen.
Tatsächlich konnte gefunden werden, daß einige dieser Antigene in allen Stämmen von B. pertussis vorkommen, jedoch diejenigen, die mit den Fimbrien 2, 3, 4, 5, und 6 in verschiedenen Kombinationen assoziiert vorliegen, nicht nur in verschiedenen Stämmen, sondern auch in verschiedenen isolierten Proben desselben Stammes vorkommen.
Ein idealer Impfstoff, also ein Impfstoff der Immunschutz gegen jeden infektiösen Stamm von B. pertussis bewirkt, sollte deshalb alle Antigene der verschiedenen Serotypen enthalten.
Die Herstellung eines solchen Impfstoffes bringt viele Probleme mit sich, die zum einen aus der Tatsache stammen, daß es schwierig ist, diese Antigene zu isolieren und zu reinigen und zum anderen aus ihrer begrenzten Verfügbarkeit.
Aus diesen Gründen wäre es wünschenswert, einen Stamm von B. pertussis herzustellen, der alle Pilus-Untereinheiten mit hoher Ausbeute produziert.
Die Strukturgene, die für die Untereinheiten FIM2 und FIMX von B. pertussis kodieren, wurden kürzlich kloniert und sequenziert (Livey, J. et al., (1987), Mol. Microbiol., 1 (2), 203-20; Pedroni, P. et all (1988), Mol. Microbiol., 2, 539-543).
Bis jetzt war jedoch nichts über die Regulation der Expression dieser Gene bekannt und insbesondere waren die Nukleotidsequenzen der Promotorregionen der FIM3 und FIMX-Gene nicht bekannt.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist deshalb die Isolierung und Charakterisierung der Promotorregionen der FIM3 und FIMX-Gene von Bordetella pertussis.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Promotorregionen oder deren Fragmente zur regulierten und nicht-regulierten Expression von Genen in Bordetella, die für ein Protein von Interesse kodieren.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein die Promotorregion oder ein Fragment davon enthaltender Klonierungsvektor zur Expression in Wirtsorganismen aus der Gruppe Bordetella.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein mit dem Vektor transformierter Stamm von Bordetella.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein anti-Pertussis-Impfstoff, der einen Stamm von Bordetella umfaßt, der mindestens eine der genannten Promotorregionen enthält und ein Protein von Interesse auf regulierte oder nicht-regulierte Weise exprimieren kann.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Promotorregion des Gens, welches für die Pilus-Untereinheit FIM2 von Bordetella pertussis kodiert und die folgende Nukleotidsequenz umfaßt:
zur Expression anderer immunogener Proteine als die Pilus-Untereinheit FIM2 in einem aus der Gruppe Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis und Bordetella bronchiseptica ausgewählten Wirtsorganismus.
Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden nach der Lektüre der folgenden Beschreibung und den experimentellen Beispielen deutlich werden.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurden die Promotorregionen der Gene fim2, fim3 und fimx durch bekannte Techniken isoliert, aus positiven Klonen einer Genbank in Cosmiden, ausgehend vom Bordetella pertussis- Stamm SA 1 (SCLAVO). In der Praxis wurde die Genbank durch partiellen oder vollständigen Verdau der aus dem Bakterium extrahierten chromosomalen DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen, der Klonierung der Restriktionsfragmente in Cosmide und der Transformation eines Wirtsorganismus mit den Cosmiden hergestellt und abschließender Selektion der positiven Klone, das sind diejenigen, die das Cosmid mit einem Fragment der chromosomalen DNA enthalten, welches ein Hybridisierungssignal mit spezifischen Proben ergibt.
Drei Klone wurden wie oben beschrieben isoliert und enhielten jeweils ein 4400-Basenpaare (BP) großes Fragment mit dem Strukturgen und der Promotorregion von FIM2, ein 2900-BP Fragment mit dem Strukturgen und der Promotorregion von FIM3 und ein Fragment von ungefähr 3300 BP mit dem Strukturgen und der Promotorregion von FIMX.
Die Promotorregionen wurden dann aus den Fragmenten isoliert.
In der Praxis wurde ein ungefähr 400 BP großes BamHI- HindIII Fragment mit der Promotorregion des FIM2-Gens aus dem 4400-BP-Fragment isoliert und in einen Klonierungsvektor kloniert, um so das Hybridplasmid pSM 351 zu erhalten (Beispiel 8).
Parallel dazu wurde ein ungefähr 550 BP großes HaeII- BamHI Fragment mit der Promotorregion des FIMX-Gens aus dem ungefähr 3300 BP großen Fragment isoliert und nachdem sein HaeII-Ende in ein "blunt end" überführt wurde, in einen Vektor kloniert, um so das Hybridplasmid pSM 346 zu erhalten (Beispiel 5).
Ein ungefähr 1300 BP großes PstI-AvaI Fragment mit der Promotorregion von fim3 wurde ebenfalls aus dem ungefähr 2900 BP großen Fragment isoliert und dann in einen Vektor kloniert, um so das Hybridplasmid pSM 349 zu erhalten (Beispiel 6).
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurden diese Promotorregionen mit der Methode nach Sanger et al., (1977), (PNAS, 74: 5463) unter Verwendung der von Strauss et al., (1986), (Anal. Biochem., 154: 553) beschriebenen "successive primers"-Strategie sequenziert.
Die Sequenzierungsreaktionen wurden nach der normalen Boehringer Methode auf den Plasmiden ausgeführt, die unter Verwendung eines "pUC sequencing-kit" denaturiert wurden.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten das Vorhandensein von Regionen hoher Homologie stromaufwärts von den wahrscheinlichen Transskriptions-Startpunkten in den drei Promotoren.
Im einzelnen konnten diese Regionen wie folgt identifiziert werden:
1) eine Reihe von Cs, bekannt als die "Cs-Box", um das Nukleotid in Position -35 herum gelegen;
2) eine zweite ähnliche Region, bekannt als die "Pilus- Box", die direkt stromaufwärts der "Cs-Box" gelegen war und keine Ähnlichkeit zu anderen Sequenzen von B. pertussis Genen aufwies.
Es ist bekannt, daß alle Gene, die für Virulenzfaktoren kodieren, auf dem Chromosom von Bordetella gelegen sind und positiv auf koordinierte Weise durch einen einzelnen vir-Locus reguliert werden, dessen Genprodukte mit den Sequenzen stromaufwärts dieser Gene interagieren.
Tatsächlich geht die Fähigkeit der Bakterien zur Produktion ihrer Virulenzfaktoren verloren, wenn der vir-Locus durch Transposon-Mutagenese inaktiviert wird (Weiss et al., (1983), Infect. Immun., 42, 33-41).
Ein ähnlicher Verlust der über den vir-Locus gesteuerten Virulenz wird in B. pertussis unter folgenden Umständen beobachtet:
- Wechsel von der virulenten Phase I zur nicht-virulenten Phase III, und
- Modulation durch einen Wechsel in der Zusammensetzung des Kulturmediums oder der Temperatur.
Während der Phasenwechsel einen stabilen Verlust der Virulenz verursacht, der nur selten reversibel ist, entsteht durch die Modulation durch externe Faktoren eine reversible phänotypische Exression, die durch das Wachstum der Bakterien bei hoher oder niedriger Temperatur oder in Anwesenheit oder Abwesenheit von chemischen Substanzen, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Nikotinsäure, induziert oder reprimiert werden kann.
Um zu überprüfen, ob die die isolierten Promotorregionen und insbesondere die identifizierten Sequenzen mit Elementen korrespondieren, die durch den vir Locus gesteuerte Transkription regulieren oder durch einen Wechsel der Kulturbedingungen beeinflußt werden, wurden die Nukleotidfragmente, welche die Promotorregionen des FIM2, FIM3 und FIMX Gens enthielten, jeweils aus den Plasmiden pSM 351, pSM 349 und pSM 346 isoliert, an das 1630 BP HindIII-XbaI Fragment mit dem CAT-Gen ohne seinen eigenen Promotor ligiert und dann in ein Weitspektrum Plasmid, wie zum Beispiel pLA FR2 kloniert.
Diejenigen rekombinanten Plasmide, welche die korrekte Insertion der Promotorregion und des CAT-Gens zeigten, wurden dann durch Konjugation nach der von Gross et al. (PNAs, USA 85, 3913-3917, 1988) beschriebenen Technik in die B. bronchiseptica (Bb)-Stämme 7865 und 7866 übertragen. Der Bb-Stamm 7866 ist ein durch spontane Mutation aus dem Bb-Stamm 7865 (vir&spplus;) hervorgegangener vir&supmin;-Stamm. Beide Stämme sind öffentlich erhältlich.
Die Extrakte der Konjuganten wurden dann auf ihre Chloramphenicol-Acetyltransferase-Aktivitäten hin untersucht, wie von Gross et al. (PNAS, USA 85, 3913-3917, 1988) beschrieben. Die erhaltenen Ergebnisse (Figur 9) zeigten, - die vir&spplus;-Stamme mit den Promotoren der Gene, die für die Pilin-Untereinheiten FIM2, FIM3 und FIMX kodieren, in der Lage waren, die Expression des heterologen CAT-Gens zu steuern; und
- die Promotoren der drei Pilin-Gene verschiedene Stärken aufwiesen. Im einzelnen war der Promotor des FIM2-Gens der stärkste, während die der Gene fimx und fim3 150, bzw. 3 mal schwächer als der von fim2 waren.
Zusätzlich bestätigte das Fehlen der CAT-Aktivität bei den von dem vir&supmin;-Stamm abstammenden Konjuganten mit den Promotorregionen der FIM2 und FIMX Gene, daß die als "Cs Box" und "Pilus Box" identifizierten Bereiche Sequenzen representieren, welche die Regulation der Transkription der Gene kontrollieren und daß ihre Aktivierung von der Anwesenheit von funktionsfähigen Komponenten des vir- Systems abhängt.
Das Vorhandensein einer CAT-Aktivität in dem die Promotorregion des FIM3-Gens enthaltenden vir&supmin;-Stamm deutete jedoch darauf hin, daß die oben identifizierten Sequenzen nicht durch den vir-Locus reguliert werden und das der fim3-Promotor sich wie ein konstitutiver Promotor verhält.
Dieser Ausdruck bezeichnet einen Promotor, der unabhängig von der Anwesenheit von Effektoren aktiv ist; gemeint sind Proteine oder chemische oder physikalische Agenzien, welche die Expression eines Gens regulieren können.
Um die Rolle der "Cs-Box" und "Pilus-Box" Sequenzen der fim2 und fimx-Promotoren zu überprüfen, wurden drei Mutanten der fim2-Promotorregion konstruiert.
Entweder die Cs-Box (pr2 Δ1) oder die Pilus-Box (pr2 Δ2) oder beide Boxen (pR2 Δ1-2) wurden bei diesen Promotoren deletiert. Eine Analyse der Acetyltransferase-Aktivitäten der vir&spplus; B. bronciseptica-Stämme, die das CAT-Gen enthielten, dessen Promotor durch jeden der oben beschriebenen mutierten Promotoren ersetzt wurde, zeigte, daß beide Sequenzen zum Antrieb der Transkription essentiell waren. Zusätzlich wurde in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung die Modulation durch die Anzucht von mit dem Plasmid pR2 und jedem anderen, den mutierten Promotor enthaltenden Plasmid transformierten vir&spplus; B. bronciseptica Zellen in Anwesenheit und ohne MgSO&sub4; überprüft. Die Ergebnisse (Figur 11) zeigen, daß der Promotor des FIM2-Gens einer Modulation unterzogen wird und seine Aktivität in Anwesenheit von 50 mM MgSO&sub4; vollständig verliert. Derselbe Promotor war nach Modifikation durch die Deletion einer oder beider Boxen nicht mehr in der Lage, seine Aktivität unter ungünstigen Bedingungen zu variieren.
Nach der vorliegenden Erfindung scheinen die Promotorregionen der FIM2 und FIMX-Gene oder deren Fragmente, welche die die Transkription regulierenden Elemente enthalten, zur Konstruktion eines Vektors zur regulierten Expression eines Strukturgens in Bordetella, welches für ein Protein von Interesse kodiert, besonders geeignet zu sein, wobei das Gen in der richtigen Lesephase unter der Kontrolle der Promotoren vorliegt.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Vektoren können aus denjenigen des Standes der Technik ausgewählte Plasmide sein, die in Bordetella replizieren oder in das Genom integrieren.
Bordetella-Stämme können aus der Gruppe von B. pertussis, B. bronchiseptica und B. parapertussis ausgewählt sein.
Das heterologe Gen kann jedes Gen sein, daß für ein Protein von Interesse kodiert.
Vorzugsweise kodiert das Gen für ein immunogenes Protein, welches von virulenten Bordetella pertussis produziert wird, wie zum Beispiel Untereinheiten des Pilus, Pertussis-Toxin oder Untereinheiten davon, Adenylat- Cyclase, Haemagglutinin filamentosa oder das Protein 69K.
Nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der konstitutive Promotor des FIM3 Gens oder ein Fragment von ihm zur nicht-regulierten Expression von einem Protein von Interesse in vir&supmin;-Stämmen von Bordetella verwendet werden. Dies erscheint besonders vorteilhaft, da es ein Arbeiten mit nicht-pathogenen Stämmen ermöglicht.
Die so erhaltenen vir&spplus; oder vir&supmin;-Stämme von Bordetella sind zur Herstellung eines anti-Pertussis Impfstoffes sehr nützlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt die Nukleotidsequenzen der Promotorregionen der Gene, die für die Pilus-Untereinheiten FIM2 (Seq. ID. Nr. 1), FIM3 (Seq. ID. Nr. 2) und FIMX (Seq. ID. Nr. 3) kodieren,
Figur 2 zeigt die Nukleotidsequenzen der "Cs-Boxen" und der "Pilus Boxen" in den Promotorregionen der Gene, die für die Pilus-Untereinheiten FIM2, FIM3 und FIMX (Seq. ID. Nr. 4, Nr. 5, Nr. 6) kodieren,
Figur 3 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pSM 346,
Figur 4 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pSM 349,
Figur 5 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pSM 351,
Figur 6 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pR2,
Figur 7 zeigt die Restriktionskarte der Plasmide pR3 und pR3P,
Figur 8 zeigt die Restriktionskarte des Plasmids pRx,
Figur 9 zeigt die Ergebnisse des an Zellextrakten von vir&spplus; und vir&supmin; B. bronchiseptica-Stämmen durchgeführten CAT-Tests, die mit den Plasmiden pR2, pR3P, pRx sowie Positv- und Negativ-Kontrollplasmiden transformiert wurden, wobei:
1 und 2 sich auf die Negativ-Kontrolle in den vir&spplus; und vir&supmin;-Stämmen beziehen,
3 sich auf die Positiv-Kontrolle in einem vir&spplus;-Stamm bezieht, der ein Pertussis-Toxin-Gen enthält,
4 und 5 sich jeweils auf die mit pR2 transformierten vir&spplus; und vir&supmin;-Stämmen beziehen,
6 und 7 sich jeweils auf die mit pR3P transformierten vir&spplus; und vir&supmin;-Stämmen beziehen,
8 und 9 sich jeweils auf die mit pRx transformierten vir&spplus; und vir&supmin;-Stämmen beziehen,
Figur 10 zeigt die Konstruktion der Promotormutanten des FIM2-Gens,
Figur 11 zeigt die Überprüfung der Modulation mittels des CAT-Tests an den Zellextrakten von mit pR2 transformierten und in Abwesenheit (1) und Anwesenheit (2) von MgSO&sub4; angezogenen vir&spplus;-B. bronchiseptica.
Die Vektoren, welche die Promotorregionen von fim2, fim3 und fimx enthalten, wurden als E.coli 71.18 (pSM 351), E.coli JM 101 (pSM 349) und E.coli 71.18 (pSM 346) bei der American Type Culture Collection jeweils als ATCC 68069, ATCC 68105 und ATCC 68068 hinterlegt.
Die nun folgenden experimentellen Beispiele illustrieren die Erfindungen und sind nicht begrenzend.

Beispiel 1

Extraktion der chromosomalen DNA aus B. pertussis SA1

100 ml Fermentationsmedium der folgenden Zusammensetzung:
Beta Casaminosäuren (Difco) 14 g
KCl 0,2 g
MgCl&sub2; 6H&sub2;O 0,1 g
K&sub2;PO&sub4; 0,5 g
Nikotinsäure 0,02 g
Glutathion 0,01 g
Stärke 1,00 g
H&sub2;O 1 l
pH 6,8
wurde vor der Verwendung bei 120ºC für 15 Minuten sterilisiert, mit dem B. pertussis Stamm SA1 inokuliert und unter Schütteln (200 Umdrehungen pro Minute, U/min) für 3 Tage bei 37ºC gehalten.
Am Ende dieses Abschnittes wurden die Zellen vom flüssigen Überstand durch Zentrifugation in einem Sorvall RC- 5B Model SS34 Rotor bei 4ºC und 5000 U/min für 10 Minuten getrennt und dann mit einer Lösung von 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 gewaschen (2 x 120 ml).
Die so erhaltene Suspension wurde nochmals wie oben beschrieben zentrifugiert und die Zellen nach Ernte in 10 ml einer Pufferlösung (100 mM EDTA, 50 mM NaCl, 2,5% Saccharose, pH 6,9) mit 1 mg/ml Lysozym (SIGMA) resuspendiert.
Die Lösung wurde unter sanftem Schütteln für 30 Minuten bei 37ºC gehalten und SDS (Natriumdodecylsulfat) wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 1% hinzugegeben und die Lösung bei 60ºC für 30 Minuten inkubiert.
1 mg/ml Proteinase K, die vorher bei 37ºC für 30 Minuten in 1 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat) inkubiert wurde, wurde dann zu der Lösung hinzugegeben und das erhaltene Gemisch wurde für 2 Stunden bei 37ºC reagiert.
Nach der Zugabe von NaCl bis zu einer Endkonzentration von 1M, wurde das Gemisch für 30 Minuten auf Eis gehalten und dann zentrifugiert. Die im flüssigen Überstand enthaltende DNA wurde mit 2-3 Volumen kaltem Ethanol (-20ºC) gefällt, mit einem Glasstab aufgewickelt und in 10 ml 0,1 x SSC resuspendiert. Die Suspension wurde unter sanftem Schütteln über Nacht bei Raumtemperatur (20-25ºC) gehalten und nach der Zugabe von RNAse (1 mg/ml) für 30 Minuten bei 37ºC gehalten.
Die Salzkonzentration der Lösung wurde dann auf die von 1 x SSC gebracht, die Lösung wurde mit Phenol extrahiert (1 Volumen) und die DNA durch die tropfenweise Zugabe von Isopropanol zu der Lösung, die unter leichtem Schütteln und bei Raumtemperatur gehalten wurde, gefällt. Die DNA wurde dann durch Zentrifugation geerntet und in 1 ml 0,01 x SSC resuspendiert.
Die durch eine spektrophotometrische Messung bei 260 nm unter Verwendung eines Perkin Elmer Spektrophotometers Mod. 515 ermittelte Quantität chromosomaler DNA war 0,645 mg/ml.

Beispiel 2

Isolierung der Promotorregionen der FIM2 und FIM3-Gene

Um die Sequenzen der Promotorregionen der FIM2 und FIM3- Gene zu isolieren und zu charakterisieren wurde eine genomische Bank von B. pertussis SA1 unter Verwendung des Cosmids pHC 79 (Honn, B. und Collins, J., (1980), Gene 11, 291-298) hergestellt.
500 µg der wie in Beispiel 1 beschrieben extrahierten chromosomalen DNA von B. pertussis SA1 wurden mit 5 Units Sau3A (BRL) partiell verdaut. Der Verdau wurde in einer Puffermischung bei 37ºC für 15 Minuten durchgeführt.
Die so verdaute DNA wurde durch die Zugabe eines gleichen Volumens Ethanol zu der Lösung gefällt, nach Abtrennung wurde die DNA in 0,5 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA Puffer resuspendiert. Die Lösung wurde auf einen in 35 ml 1 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA Puffer gelösten 10% zu 40% Saccharosegradienten geladen. Der Gradient wurde dann für 16 Stunden bei 26000 U/min in einem Beckman SW28 Rotor zentrifugiert und Fraktionen, jede 1 ml groß, wurden gesammelt. Das Molekulargewicht der in jeder Fraktion enthaltenen DNA wurde durch Elektrophorese auf Agarose bestimmt (Maniatis et al. "Molecular cloning: a practical laboratory manual", Cold Spring Harbour, New York, 1982). Diejenigen Fraktionen, die DNA-Fragmente zwischen 35-45 KB enthielten wurden dann dialysiert, die DNA wurde wie oben beschrieben mit Ethanol gefällt und, nach Abtrennung durch Zentrifugation, in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA-Puffer in einer Konzentration von 1 µg/ml resuspendiert. Die chromosomalen DNA-Fragmente wurden dann in das Cosmid pHC 79 kloniert.
In der Praxis wurden 10 µg des Cosmids mit 40 Units des Restriktionsenzyms BamHI (BRL) bei 37ºC für 1 Stunde in 200 µl einer Puffermischung verdaut.
2 µg chromosomaler DNA wurden mit 0,5 µg Cosmid DNA in Anwesenheit von 1 Unit T&sub4; DNA Ligase in 10 µl Ligationsansatz bei 14ºC über Nacht ligiert.
Am Ende dieser Periode wurden 2,5 µl des Ligationsansatzes mit Stratagenes "in vitro packaging kit" verwendet. Die daraus erhaltenen rekombinanten Cosmide wurden verwendet, um den E. coli-Stamm JM 109 (BRL) zu infizieren, Transformanten wurden auf LB Agarmedium (DIFCO) selektioniert. 15000 positive Kolonien wurden selektioniert.
Ungefähr 1500 dieser Kolonien wurden unter Verwendung der folgenden Proben analysiert:
Probe 3: CCTTCAGCTTGATGAT (Seq. ID. Nr. 7)
Probe 4: GTGATGACGATGGTG (Seq. ID. Nr. 8)
Die Oligonukleotide wurden unter Verwendung eines Beckman System One Plus automatischen Systems synthetisiert und dann an ihren 5'OH-Enden mit 10&sup5; µCi γ-(P³²)-ATP wie folgt markiert:
200 ng jedes Oligonukleotids wurden in 30 µl einer wäßrigen Lösung aus 3 µl Kinasepuffer (Boehringer), 21 µl ATP, und 10 Units pro ml T&sub4;-Polynukleotid-Kinase (1 µl) resuspendiert.
Das Gemisch wurde für 45 Minuten bei 37ºC und dann für 10 Minuten bei 65ºC inkubiert, um daß Enzym zu inaktivieren.
Die markierten Proben wurden in pH 8,00 TE-Puffer über Sephadex G-50 Säulen gereinigt, um nicht inkorporierte Marker zu entfernen. 13 Fraktionen von je 150 µl wurden gesammelt. 2 µl jeder Fraktion wurden in 4 ml Szintillationsflüssigkeit überführt und in einem Szintillator gemessen.
Die positiven Kolonien der Cosmid-Bank wurden auf Nitrocelluose-Filter transferiert (Schleicher und Schuell 0,45 µm) und ihre DNA nach der Lyse mit NaOH durch die Southern blot-Technik immobilisiert (Maniatis et al., 1982).
Die Filter wurden parallel mit dem Paar der oben beschriebenen Proben hybridisiert. Die Prähybridisierungs-Behandlung wurde bei 65ºC für 6 Stunden durchgeführt, während die Hybridisierungsbehandlung bei:
41ºC über Nacht mit Probe 3, und
45ºC über Nacht mit Probe 4 erfolgte.
Die Filter wurden dann bei 25ºC mit 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 6 x SSC für eine Stunde gewaschen und in Kontakt mit Kodax X-Omat AR Radiographieplatten gebracht. 5 Klone, die mit beiden Proben hybridisierten, wurden wie oben beschrieben isoliert.
Eines der aus den Klonen extrahierten Cosmide enthielt das 4400-BP PstI-Fragment mit dem fim2-Promotor und seinem Strukturgen, während ein anderes Cosmid das 2900- PstI-Fragment mit dem fim3-Promotor und seinem Strukturgen enthielt.
Diese Fragmente wurden durch den Verdau der Cosmid-DNA mit PstI isoliert und in das vorher mit PstI verdaute Plasmid pUC 18 eingebracht, um so die Hybridplasmide pSM 352 und pSM 348 herzustellen.

Beispiel 3

Isolierung der Promotorregion von FIMX

5 µg der wie in Beispiel 1 präparierten chromosomalen DNA wurden vollständig mit 80 Units EcoRI (BRL) unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen verdaut. Der Verdau wurde dann auf ein 0,8%iges Agarosegel geladen und bei 20 Volt über Nacht gelaufen. Am Ende dieser Periode wurde der Bereich zwischen 3,0 und 4,0 KB elektroeluiert und durch Extraktion mit Phenol gereinigt. Nach der Fällung der DNA mit kaltem Ethanol und Abtrennung durch Zentrifugieren, wurden 190 ng DNA mit 50 ng von EcoRI verdautem pUC 13 Plasmid ligiert. Die Reaktion wurde durch Suspension der Reagenzien in 25 µl Ligationspuffer in Anwesenheit von 1 Unit T&sub4;-DNA-Ligase bei 12ºC über Nacht durchgeführt.
Das Gemisch wurde dann verwendet, um kompetente Zellen von E.coli JM 101 (BRL) zu transformieren. Die Transformanten wurden auf LB Agarmedium (DIFCO) selektioniert, zu dem 50 µg/ml Ampicillin, 125 µg/ml IPTG und 40 µg/ml X- Gal (PROMEGA) hinzugefügt wurden. Die so erhaltenen positiven Klone (600) wurden auf Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schuell) transferiert und die aus den Klonen extrahierte DNA wurde mit einer Probe hybridisiert, deren Nukleotidsequenz der 790-BP BamHI-PstI Region des Strukturgens von FIMX entsprach und das nach der Boehringer "random primer labelling"-Methode markiert wurde.
Die Prähybridisierungsreaktion wurde bei 68ºC für 6 Stunden und die Hybridisierungsreaktion bei 68ºC über Nacht unter Verwendung der von Maniatis et al. (1982) beschriebenen Southern-Transfertechnik durchgeführt. Die Filter wurden nach der von Maniatis et al. (1982) beschriebenen Platten-Waschtechnik gewaschen.
15 der untersuchten Klone gaben ein positives Signal und alle aus den Klonen extrahierte Cosmide enthielten EcoRI- EcoRI Banden von ungefähr 3300 BP mit dem Strukturgen von FIMX und seiner Promotorregion.
Dieses 3300 BP-Fragment wurde in das vorher mit EcoRI verdaute pUC 12 Plasmid inseriert, um so Plasmid pSM 281 zu erhalten.

Beispiel 4

Sequenzierung der Promotorregionen der Gene von FIM2, FIM3 und FIMX

Die in den Plasmiden pSM 352, pSM 348 und pSM 281 enthaltenen Promotorregionen der Gene von FIM2, FIM3 und FIMX wurden ausgehend vom ATG Translations-Startpunkt mit der Methode von Sanger et al. (1977), (PNAS, 24, 5463) unter der Verwendung der von Strauss et al., (Anal. Biochem., 154: 553 (1986)) beschriebenen "successive primers"-Strategie jeweils partiell sequenziert. Die als Primer verwendeten Oligonukleotide wurden mittels eines automatischen System 1 Plus DNA Synthesiser Systems (Beckman) synthetisiert. Die Sequenzreaktionen wurden nach der normalen Boehringer-Methode auf den denaturierten Plasmiden unter Verwendung eines "pUC sequencing kits" mit α-(P³²)-dATP als Marker durchgeführt. Die zur elektrophoretischen Trennung verwendete Ausrüstung war ein Macrophor Sequencing System (LKB).
Die partiellen Nukleotidsequenzen der Promotorregionen der drei Gene bestanden aus jeweils 430 BP, 166 BP und 586 BP und sind in Figur 1 dargestellt.
Eine Analyse der Sequenzen stromaufwärts der wahrscheinlichen Transkriptions-Startpunkte ergab Regionen mit hoher Homologie in den drei Promotoren, die wie folgt identifiziert werden konnten:
1) eine Reihe von Cs, die "Cs-Box", um das Nukleotids in Position -35 herum gelegen;
2) eine zweite homologe Region, die "Pilus-Box", die direkt stromaufwärts davon gelegen war und keine Ähnlichkeit mit anderen Sequenzen der B. pertussis Gene aufwies.
Die Sequenzen der Boxen sind in Figur 2 dargestellt.

Beispiel 5

Konstruktion des Plasmides pSM 346

Das Plasmid pSM 281 wurde mit den Restriktionsenzymen HaeII und BamHI (BRL) nach den Herstellerangaben verdaut.
Das HaeII-BamHI-Fragment von ungefähr 550 BP mit nur der fimx-Promotorregion darauf wurde aus dem Verdau isoliert, am HaeII-Ende mit "blunt ends" versehen und dann in das mit SmaI und BamHI verdaute pUC 12 Plasmid subkioniert. Das so erhaltene Plasmid wurde pSM 346 (Figur 3) genannt.

Beispiel 6

Konstruktion des Plasmids pSM 349

Das 1300-BP PstI-AvaII Fragment mit dem fim3-Promotor wurde aus pSM 348 isoliert. Weil das Restriktionsenzym AvaII 36 Basen stromaufwärts des Transkriptions-Startpunktes (CAT) schneidet, wurde, um diesen Sequenzabschnitt wieder zu erhalten, ein AvaII-HindIII-Oligonukleotid synthetisiert, das die folgende Sequenz aufwies:
und in dem die HindIII Schnittstelle direkt hinter dem mRNA Transkriptions-Startpunkt eingefügt wurde.
1,5 µg des 1300-BP PstI-AvaII-Fragmentes und 3,75 µg des vorher mit Polynukleotid-Kinase phophorylierten synthetischen AvaII-HindIII-Oligonukleotids wurden in 75 µl Ligationsansatz miteinander ligiert. Das so erhaltene Ligationsprodukt (1336 BP) wurde über über ein 0,8%iges Agarosegel gereinigt, wiedergewonnen und bei -20ºC über Nacht gefällt. Das Produkt (75 ng) wurde dann zu 50 ng des vorher mit 2 Units PstI und HindIII verdauten Vektors pUC 13 in 20 µl Ligationsansatz mit 1 Unit T&sub4;-DNA-Ligase bei 14ºC über Nacht ligiert.
Der Ligationsansatz wurde verwendet, um kompetente Zellen von E.coli JM 101 zu transformieren, die Transformanten wurden auf LB Medium selektioniert, zu dem Ampicillin, X- Gal und IPTG hinzugefügt wurde.
Das Plasmid pSM 349 mit dem 1336-BP PstI-HindIII-Fragment wurde aus einem der positiven Klone isoliert (Figur 4).

Beispiel 7

Konstruktion des Plasmids pSM 350

Das in Beispiel 4 hergestellte Plasmid pSM 349 wurde mit 5 Units HindIII verdaut, das an der Stelle in direktem Anschluß an den Transkriptions-Startpunkt schneidet und 5 Units HindII, welches 370 BP stromaufwärts der HindIII Schnittstelle schneidet.
Das aus dem Verdau isolierte 370-BP DNA-Fragment wurde dann mit dem vorher mit HindIII und HindII verdauten Plasmid pUC 13 ligiert.
Das Plasmid pSM 350 mit dem 370-BP DNA-Fragment der Promotorregion von fim3 konnte nach Transformation von E.coli JM 101 Zellen mit dem Ligationsansatz isoliert werden.

Beispiel 8

Konstruktion des Plasmids pSM 351

Das aus ungefähr 430 BP der Sequenz der Promotorregion von fim2 und 280 BP seines Strukturgens zusammengesetzte StuI Fragment von ungefähr 700 BP wurde aus dem Plasmid pSM 352 isoliert und in das vorher mit 5 Units des Restriktionsenzyms SmaI (BRL) verdaute Plasmid pUC 12 (1 µg) kloniert.
Die Klonierung wurde unter Verwendung von 60 ng des Vektors und 40 ng des Fragmentes in 20 µl Ligationsansatz in Anwesenheit von 1 Unit T&sub4;-DNA-Ligase bei 23ºC über Nacht durchgeführt. Der Ligationsansatz wurde dann dazu verwendet, Zellen von E.coli zu transformieren, die Transformanten wurden auf LB-Medium selektioniert, zu dem X-Gal, IPTG und Ampicillin hinzugegeben wurde.
Ein Plasmid mit dem ungefähr 700 BP großen Fragment wurde aus einem positiven Klon extrahiert. Die Promotorregion von ungefähr 380 BP wurde dann nach Verdau mit BamHI (BRL), dessen Schnittstelle direkt vor der SmaI-Schnittstelle in der "multiple cloning site" (MCS) des Vektors liegt und mit DdeI, welches 21 BP stromaufwärts des Transkriptions-Startpunktes schneidet, aus dem Plasmid isoliert.
Um den 21-BP langen Sequenzabschnitt, der sich von der Transkriptions-Startstelle (CAT) zu der DdeI-Schnittstelle und der Position der HindIII-Schnittstelle direkt nach CAT erstreckt zurückzuerhalten, wurde ein DdeI- HindIII-Oligonukleotid mit der folgenden Sequenz synthetisiert:
Die HindIII Schnittstelle ist in direktem Anschluß an den Transkriptions-Startpunkt lokalisiert.
Das BamHI-DdeI DNA Fragment von ungefähr 380 BP (1,5 µg), und das vorher mit Polynukleotid-Kinase Enzym (Boehringer) phosphorylierte synthetische DdeI-HindIII- Oligonukleotid (3,75 µg) wurden miteinander in 75 µl Ligationsansatz ligiert.
Die Reaktion wurde in Anwesenheit von 20 Units T&sub4;-DNA- Ligase bei 14ºC über Nacht durchgeführt.
Das so erhaltene Ligationsprodukt wurde über ein 0,8%iges Agarosegel gereinigt, durch die in Methods in Enzymology, 65, 52 (1980) beschriebene Methode zurückgewonnen und mit Ethanol bei -20ºC über Nacht gefällt.
Das gereinigte Produkt (22 ng) wurde dann zu 50 ng mit einer Unit BamHI und HindIII verdautem Vektor pUC 12 in 25 µl Ligationsansatz ligiert.
Die Reaktion wurde in Anwesenheit von 1 Unit T&sub4;-DNA- Ligase bei 14ºC über Nacht durchgeführt.
Der Ligationsansatz wurde dann dazu verwendet, Zellen von E. coli 71.18 zu transformieren und die Transformanten wurden auf LB Medium selektioniert, zu dem 50 µg/ml Ampicillin, X-Gal und IPTG hinzugegeben wurde.
Das Plasmid pSM 351 mit ungefähr 400 BP der fim2-Promotorregion wurde aus einem der positiven Klone isoliert (Figur 5).

Beispiel 9

Konstruktion des Plasmids pR 2

Das durch enzymatischen Verdau des Klons pSM 351 erhaltene ungefähr 400 BP große BamHI-HindIII-Fragment der Promotorregion des FIM2 Gens (100ng) wurde mit 100 ng des 1630 BP HindIII-XbaI-Fragmentes mit dem CAT-Gen ohne seinen eigenen Promotor und mit 200 ng des vorher mit 10 Units BamHI und 10 Units XbaI verdauten Plasmides pLA FR2 ligiert. Die Ligationsreaktion (30 µl) wurde in Anwesenheit von 3 Units T&sub4;-DNA-Ligase bei 14ºC über Nacht durchgeführt und dazu verwendet, kompetente E. coli 5K-Zellen zu transformieren. Die Transformanten wurden auf LB- Medium selektioniert, zu dem 12,5 µg/ml Tetracyclin zugegeben wurde.
Das Plasmid pR 2, welches die korrekte Insertion der Promotorregion und des CAT-Gens zeigte, wurde aus einem der Klone isoliert (Figur 6).

Beispiel 10

Konstruktion des Plasmids pRx

Das EcoRI-BamHI Fragment von ungefähr 560 BP mit dem Promotor des FIMX-Gens wurde aus dem Plasmid pSM 346 nach Verdau mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI isoliert.
110 ng des auf beiden Seiten mit "blunt ends" versehenen Fragmentes und 100 ng des HindIII-XbaI-Fragmentes mit dem CAT-Gen ohne seinen Promotor und auf der HindIII-Seite mit einem "blunt end" versehen, wurden mit dem Plasmid pLA FR2 (200 ng) ligiert, welches vorher mit BamHI und XbaI verdaut und auf der BamHI-Seite mit einem "blunt end" versehen wurde. Die Ligationsreaktion (30 µl) wurde in Anwesenheit von 5 Units T&sub4;-DNA-Ligase bei 23ºC über Nacht durchgeführt und dazu verwendet, kompetente E. coli 5K-Zellen zu transformieren. Die Transformanten wurden auf-LB-Medium selektioniert, zu dem 12,5 µg/ml Tetracyclin zugegeben wurde. Das Plasmid pRx wurde aus einem der positiven Klone isoliert und zeigte die korrekte Insertion der Promotorregion und des CAT-Gens (Figur 7).

Beispiel 11

Konstruktion der Plasmide pR3. pR3P

A) Konstruktion von pR3

Das aus dem Plasmid pSM 349 erhaltene 1336 BP PstI- HindIII-Fragment mit der Promotorregion des FIM3-Gens (200 ng) wurde mit 100 ng des 1630 BP HindIII-XbaI-Fragmentes mit dem CAT-Gen ohne seinen eigenen Promotor und mit 200 ng des mit 10 Units PstI und 10 Units XbaI verdauten Plasmides pLA FR 2 ligiert. Die Reaktion wurde in 30 µl Ligationsansatz in Anwesenheit von 3 Units T&sub4;-DNA- Ligase bei 14ºC über Nacht durchgeführt und dazu verwendet, kompetente E.coli 5K-Zellen zu transformieren.
Die Transformanten wurden auf LB-Medium selektioniert, zu dem 12,5 µg/ml Tetracyclin hinzugegeben wurde.
Das Plasmid pR3 wurde aus einem der positiven Klone extrahiert und wies die erwarteten Charakteristika auf (Figur 8).

B) Konstruktion von pR 3P

Das 370 BP BamHI-HindIII-Fragment mit einem Teil der Promotorregion des FIM3-Gens (200 ng) wurde nach enzymatischem Verdau mit BamHI und HindIII aus dem Plasmid pSM 350 isoliert.
Das Fragment wurde dann mit dem 1630 BP HindIII-XbaI- Fragment (100 ng) und dem mit BamHI und XbaI verdauten Plasmid pLA FR 2 ligiert. Das Plasmid pR 3P wurde nach Transformation von E. coli-Zellen und anschließender Selektion der positiven Klone isoliert (Figur 8).

Beispiel 12

Konstruktion der Negativ-Kontrolle pLA FR2-CAT

Die Negativ-Kontrolle wurde durch die Ligation von 45 ng des auf der HindIII-Seite mit einem "blunt end" versehenen 1630 BP HindIII-XbaI-Fragmentes mit 200 ng des mit BamIII und XbaI verdauten und auf der BamHI Seite mit einem "blunt end" versehenen Vektors pLA FR2 konstruiert. Die Ligationsreaktion (17 µl) wurde in Anwesenheit von 4 Units T&sub4;-DNA-Ligase bei 23ºC über Nacht durchgeführt und dazu verwendet, kompetente E.coli 5K-Zellen zu transformieren.
Die Transformanten wurden auf LB Agarmedium selektioniert, zu welchem Tetracyclin hinzugegeben wurde. Das Plasmid pLA FR2-CAT wurde aus einem der positiven Klone extrahiert.

Beispiel 13

Transformation von vir&spplus; und vir&supmin; Stämmen von B. bronchiseptica durch die Plasmide pR2, pRx, pR3 und pLA FR2-CAT

A) Konjugation

Um die Plasmide in B. bronchiseptica 7865 (vir&spplus;) und 7866 (vir&supmin;) zu übertragen, war ein vorübergehender Transfer in den Mobilisierungsstamm E.coli SM 10 notwendig. Dieser Stamm enthält alle notwendigen Gene, um das konjugative Plasmid pLA FR2 in einen Empfängerstamm, in diesem Falle B. bronchiseptica zu transferieren. Die Konjugation wurde unter Verwendung frischer Kulturen sowohl des Empfängerstammes als auch des Donorstammes (E. coli) auf Bordet- Gengou Platten (Bordet-Gengou, Ann. Inst. Pasteur (Paris), 23, 415-419, 1909) für mindestens 6 Stunden bei 35ºC durchgeführt. Die Konjuganten wurden auf Platten desselben Mediums selektioniert, zu dem Tetracyclin (10 µg/ml) und Streptomycin (40 µg/ml) hinzugegeben wurde (Gross et al., PNAS USA, 85, 3913-3917, 1988).

B) Analyse der CAT-Aktivität

Die wie in Schritt A) beschrieben erhaltenen Konjuganten wurden in Anwesenheit von 10 µg/ml Tetracyclin und 40 µg/ml Streptomycin in 10 ml Steiner-Scholte Medium (Steiner-Scholte, J. Gen. Microbiol., 63, 211-220, 1971) bei 35ºC bis zu einer optischen Dichte von 0,7-0,8 bei 580 nm angezogen.
1 ml von jeder Kultur wurde dann bei 14000 U/min für 1 Minute abzentrifugiert und die Zellen in 100 µl 0,25 M Tris-HCl, pH 7,8 Puffer resuspendiert. Die Zellen wurden dann durch 6 Zyklen Beschallung zu je 30 Sekunden in einem Soniprep 150-HSE Gerät aufgebrochen. Die Lysate wurden in einer Eppendorf Zentrifuge für 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert und die flüssigen Überstände zurückbehalten, für 8 Minuten bei 65ºC inkubiert und nochmals zentrifugiert.
0,1 µCi (C¹&sup4;)-Chloramphenicol und 20 µl 4 mM Acetyl- Coenzym A wurden dann zu je 150 µl flüssigem Überstand zugegeben, in 0,25 M Tris-HCl, pH 7,8 Puffer verdünnt und für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde dann gestoppt und das Chloramphenicol und seine Derivate mit 2 ml kaltem Ethylacetat (4ºC) extrahiert. Die organische Phase wurde abgedampft und die verschiedenen Formen des Chloramphenicols wurden durch Dünnschicht-Chromatographie unter der Verwendung von Silikaplatten in einem Chloroform/Methanol-Gemisch (95:5, Vol/Vol) getrennt. Die Platten wurden dann zur qualitativen Auswertung einer Autoradiographie unterzogen. Die quantitative Auswertung wurde durch Ausschneiden derjenigen Zonen aus den Platten durchgeführt, die den zwei monoacetylierten Formen und der nichtacetylierten Form von Chloramphenicol entsprachen. Die Radioaktivität wurde dann durch die Zugabe von 4 ml Dupont ECONOFLUOR Szintillationsflüssigkeit gemessen.
Die Ergebnisse sind in Figur 9 dargestellt. Die quantitative Analyse zeigte, daß der Promotor des FIM2-Gens die Synthese der (durch das CAT-Gen produzierten) Chloramphenical-Acetyltransferase sehr effizient steuert&sub5; Wenn ein Wert von 100% für die Aktivität des FIM2-Gens angenommen wird, sind die Promotoren des FIMX-Gens und des FIM3-Gens je 125 mal und 3 mal schwächer, als der fim2- Promotor.
Soweit es den Promotor des FIM3-Gens betrifft, konnte seine vir-Regulation nicht nachgewiesen werden, obwohl diese Region die Transkription des CAT-Gens effizient antrieb.
Dies war ein Hinweis daruf, daß dieser Promotor ein konstitutiver war.

Beispiel 14

Konstruktion der Promotormutanten des FIM2-Gens

Das 400 BP BamHI-HindIII-Fragment des Promotors des FIM2- Gens wurde aus dem Plasmid pSM 351 isoliert. Dieses Fragment (10 µg) wurde dann partiell mit 10 Units SphI für 1 Stunde bei 37ºC verdaut, um so eine BamHI-SphI Bande von 33 BP Größe zu erhalten. Dieser Schritt war wegen des Vorhandenseins zweier SphI-Schnittstellen im Abstand von 30 BP innerhalb der Promotorsequenz nötig. Die Deletionen betrafen die restlichen 65 BP und wurden unter Verwendung von synthetischen DNA-Fragmenten eingeführt.
Genauer gesagt wurden drei Doppelhelix-Oligonukleotide verwendet, die der Nukleotidsequenz des Segments zwischen der SphI und der DdeI Restriktionsstelle (wobei letztere innerhalb des 65 BP Fragmentes gelegen ist) entsprachen, aber für jede der gewünschten Deletionen Unterschiede aufwiesen, sowie ein gemeinsames DdeI-HindIII Oligonukleotid (das zur Konstruktion des Plasmids pSM 351 verwendet wurde) und die fehlenden Basen ersetzte, um so die Ausgangslage wiederherzustellen, wobei direkt im Anschluß auf den Startpunkt der Transkription eine HindIII- Schnittstelle folgt. Figur 10 zeigt ein Diagramm, das sich auf die jeweils in die "Pilus-Box", in die "Cs-Box" und in beide Boxen eingeführten Deletionen bezieht. 2 µg jedes der drei SphI-DdeI-Oligonukleotide, welche den drei Deletionen entsprachen, wurden mit 2 µg des DdeI-HindIII- Oligonukleotids in 250 µl Ligationsansatz in Anwesenheit von 5 Units T&sub4;-DNA-Ligase bei 14ºC über Nacht ligiert, um so die gesamte SphI-HindIII-Sequenz ohne die deletierten Teile zu rekonstruieren.
Die Produkte der drei Ligationen wurden über ein 8%iges Acrylamidgel gereinigt und mit Ethanol bei -20ºC über eine Nacht gefällt. Diese (160 ng) wurden dann einzeln in 100 µl Ligationsansatz mit 2 µg vorher mit 20 Units BamHI und HindIII verdautem pUC 12 ligiert. Die Reaktion wurde in Anwesenheit von 5 Units T&sub4;-DNA-Ligase bei 14ºC über eine Nacht durchgeführt. Die drei sich ergebenden Ligationsprodukte mit BamHI-SphI-Enden wurden in Anwesenheit einer finalen Konzentration von 0,5 M NaClO&sub4; und 0,5 Volumen Isopropanol für 15 Minuten bei Raumtemperatur (20-25ºC) gefällt. 20 ng wurden dann separat mit 15 ng des 330-BP BamHI-SphI-Fragmentes ligiert. Die Ligationsreaktionen wurden wie oben beschrieben durchgeführt und die Ligationsansätze dazu verwendet, kompetente E.coli JM 101-Zellen zu transformieren. Die Transformanten wurden auf LB-Medium selektioniert, zu dem Ampicillin, X-Gal und IPTG hinzugegeben wurde. Die aus den positiven Klonen isolierten rekombinanten Plasmide mit Deletionen der "Pilus-Box", der "Cs-Box" und beider Boxen wurden jeweils als pSM 355, pSM 356 und pSM 357 bezeichnet.
Die Promotorregion des FIM2-Gens mit jeweils einer der oben beschriebenen Deletionen wurden als BamHI-HindIII- Fragmente aus diesen drei Plasmiden isoliert. 100 ng jedes Fragmentes wurden mit 100 ng des 1630 BP HindIII- XbaI-Fragmentes mit dem CAT-Gen ohne seinen eigenen Promotor und 200 ng des vorher mit BamHI und XbaI (10 Units) verdauten Plasmides pLA FR2 ligiert. Der Ligationsansatz wurde dann dazu verwendet, kompetente E.coli 5K-Zellen zu transformieren. Die Transformanten wurden auf LB Medium selektioniert, zu dem Tetracyclin (12,5 µg/ml) hinzugegeben wurde. Die positiven Klone mit der Deletion der "Pilus-Box", der "Cs-Box" oder beiden Boxen wurden jeweils als pR2 Δ1, pR2 Δ2 und pR2 Δ1-2 bezeichnet. Diese Plasmide wurden dann in kompetente E. coli SM 10 Zellen und dann durch Konjugation in die B. bronchiseptica Stämme 7865 und 7866 transferiert. Der mit den Zellextrakten dieser Stämme durchgeführte CAT- Test zeigte, daß keine dieser Mutanten in der Lage war, die Transkription des CAT-Gens anzutreiben und zeigte so, daß beide Boxen essentiell waren.

Beispiel 15

Modulation der Transkription

Um den modulierenden Einfluß der Kulturbedingungen auf die Expression des heterologen Gens unter der Kontrolle der Promotorregion von fim2 zu überprüfen, wurden je zweifach (a) 10 ml Stainer-Scholte Medium und (b) 10 ml desselben Mediums, zu dem MgSO&sub4; bis zu einer finalen Konzentration von 50 mM hinzugegeben wurde, mit B. bronchiseptica 7865 Zellen mit dem Plasmid pR 2 und den Plasmiden mit den Mutationen des FIM2-Promotors angeimpft.
Die Kulturen wurden über Nacht bei 35ºC inkubiert und dann dazu verwendet, dasselbe Medium anzuimpfen. Bei einer OD von 0,7 bei 580 nm wurden die Zellen wie vorher beschrieben behandelt, um ihre CAT-Aktivitäten zu bestimmen.
Die in Figur 11 dargestellten Ergebnisse zeigten, daß der Promotor des FIM2-Gens moduliert wurde und seine Aktivität in Anwesenheit von 50 mM MgSO&sub4; völlig verlor. Derselbe, durch die Deletion einer oder mehrerer Boxen modifizierte Promotor, konnte seine Aktivität unter ungünstigen Bedingungen nicht länger variieren.

Claims

1. Promotorregionen der Gene, die für die Pilus-Untereinheiten FIMX und FIM3 von Bordetella pertussis kodieren, dadurch gekennzeichnet, daß sie jeweils die folgenden Nukleotidsequenzen umfassen:

2. Klonierungsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er die Promotorregion nach Anspruch 1 oder ein Fragment derselben der Nukleotidsequenz 1 oder 2 nach Anspruch 1 umfaßt.

3. Klonierungsvektor nach Anspruch 2, worin die Promotorregion diejenige des Gens ist, das für die Pilus- Untereinheit FIMX kodiert, hinterlegt als ATCC 68068.

4. Klonierungsvektor nach Anspruch 2, worin die Promotorregion diejenige des Gens ist, das für die Pilus- Untereinheit FIM3 kodiert, hinterlegt als ATCC 68105.

5. Klonierungsvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er die Promotorregion des Gens umfaßt, welches für die Pilus-Untereinheit FIM2 von Bordetella pertussis kodiert, und die folgende Nukleotidsequenz aufweist:

hinterlegt als ATCC 68069.

6. Mit einem Vektor nach den Ansprüchen 2 bis 4 transformierter Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe von E.coli, Bacillus und Bordetella.

7. Mit einem Vektor nach Anspruch 5 transformierter Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe von Bacillus und Bordetella.

8. Mikroorganismus nach den Ansprüchen 6 und 7, worin Bordetella Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis oder Bordetella bronchiseptica ist.

9. Zur Expression eines Proteins von Interesse in einem Wirt sorganismus nützliches rekombinantes DNA-Molekül, welches das für das Protein kodierende Strukturgen umfaßt, das in korrektem Leserahmen unter der Kontrolle der Promotorregion nach Anspruch 1 oder eines Fragmentes davon vorliegt, die Nukleotidsequenz 1 oder 2 nach Anspruch 1 beinhaltend.

10. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 9, wobei der Wirtsorganismus aus der Gruppe von Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis oder Bordetella bronchiseptica stammt

11. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 9, worin das Strukturgen für ein immunogenes Protein von Bordetella pertussis kodiert.

12. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 11, worin das Protein aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: eine Pilus-Untereinheit, Pertussis-Toxin oder Untereinheiten davon, Haemagglutinin filamentosa, Adenylat- Cyclase und Protein 69K.

13. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 9, worin die Expression des Strukturgens, welches für das Protein von Interesse kodiert, vom vir-Locus reguliert oder durch Veränderungen der Kulturbedingungen moduliert wird, und die Promotorregion diejenige des Gens ist, welches für die Pilus-Untereinheit FIMX nach Anspruch 1 kodiert.

14. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 9, worin die Expression des Strukturgens, welches für das Protein von Interesse kodiert, konstitutiv ist, und die Promotorregion diejenige des Gens ist, welches für die Pilus-Untereinheit FIM3 kodiert.

15. Mit einem rekombinanten DNA-Molekül nach den Ansprüchen 9 bis 14 transformierter Stamm von Bordetella, ausgewählt aus der Gruppe Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis oder Bordetella bronchiseptica.

16. Immunogene Zusammensetzung, die wirksamen Schutz gegen Infektionen mit serotypisch unterschiedlichen Stämmen von Bordetella pertussis verleihen kann und eine immunogen wirksame Quantität eines Stammes nach Anspruch 15 beinhaltet.

17. Verwendung der Promotorregion des Gens, welches für die Pilus-Untereinheit FIM2 von Bordetella pertussis kodiert und die folgende Nukleotidsequenz umfaßt:

zur Expression von anderen immunogenen Proteinen als der Pilus-Untereinheit FIM2 in einem Wirtsorganismus aus der Gruppe von Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis und Bordetella bronchiseptica.

18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtsorganismus Bordetella pertussis ist.