DE69004094T2

DE69004094T2 - Mehrphasige injizierbare emulsionen.

Info

Publication number: DE69004094T2
Application number: DE90910772T
Authority: DE
Inventors: Bernard Brancq; Gerard Trouve
Original assignee: Societe dExploitation de Produits pour les Industries Chimiques SEPPIC SA
Current assignee: Societe dExploitation de Produits pour les Industries Chimiques SEPPIC SA
Priority date: 1989-07-03
Filing date: 1990-06-29
Publication date: 1994-02-17
Anticipated expiration: 2010-06-30
Also published as: ATE96037T1; EP0480981A1; US5424067A; EP0480981B1; WO1991000106A1; DK0480981T3; AU5961090A; JP2851422B2; ES2061054T3; FR2649012B1; NZ234336A; AU643690B2; JPH04507405A; FR2649012A1; BR9007501A; DE69004094D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft mehrphasige Emulsionen, die zur Verabreichung von Wirkstoffen oder Antigenen durch Injektion geeignet sind. Diese Emulsionen stellen neue, gut verträgliche Träger dar, die eine schrittweise Freisetzung von Wirkstoffen oder Antigenen ermöglichen.
Eine besondere Anwendung der vorliegenden Erfindung betrifft mehrphasige Impfstoffe, diese enthaltende Immunitätsadjuvantien und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Bei den Immunitätsadjuvantien handelt es sich um Produkte, die die Reaktionen des Immunsystems verstärken, wenn sie in Gegenwart von Antigenen viralen, bakteriellen oder synthetischen Ursprungs verabreicht werden. Sie führen zu einem massiven Auftreten von Makrophagen an der Verabreichungsstelle, vermehren in den Lymphknoten die Bildung von spezifischen Immunoglobulinen (Antikörpern) und stimulieren zahlreiche Zellen, die an den Mechanismen der Immunabwehr beteiligt sind.
Was die Adjuvantien betrifft, ist bekannt, daß solche, die sich durch Vereinigung eines Mineralöls und eines Mannitesters ergeben und gegebenenfalls abgetötete Mycobakterien enthalten, die unter der Bezeichnung Freund-Adjuvantien (IFA) bekannt sind, besonders wirksam sind.
Die durch Vermischen von gleichen Teilen Freund-Adjuvans und antigenem Medium erhaltenen Impfstoffe sind auf der ganzen Welt Gegenstand von immunologischen Laboruntersuchungen. Diese Impfstoffe liegen in Form von Emulsionen mit einer kontinuierlichen Ölphase (W/Ö) vor, die sehr viskos sind, in der Größenordnung von 5000 mPa s bei 20ºC, und daher schwer injizierbar sind. Außerdem sind diese Emulsionen wenig stabil. Phasentrennungen werden bereits nach einigen Tagen beobachtet.
Derartige Impfstoffe sind schlecht verträglich und rufen an der Verabreichungsstelle bei den Tieren sehr schwerwiegende lokale Reaktionen mit Ödemen, Abzessen und Nekrosen hervor, die von den Gesundheitsbehörden nicht akzeptiert werden und die dann das Fleisch der Schlachttiere für den Verbrauch ungeeignet machen.
Beim Menschen rufen mit Freund-Adjuvans hergestellte Antidiphtherie-Impfstoffe schwere Unverträglichkeiten und sogar Fehlgeburten hervor.
Um die Injizierbarkeit derartiger Impfstoffe zu verbessern, wurde von Herbert (The Lancet, Bd. 16 (1965), S. 771) ein Verfahren beschrieben, das darin besteht, eine wäßrige Phase mit einem hydrophilen Tensid (Polysorbate 80) zu redispergieren.
Bei den erhaltenen doppelten Emulsionen handelt es sich um Flüssigkeiten, deren Stabilität aber auf einige Tage begrenzt ist.
Das verwendete hydrophile Tensid ist gegenüber den Zellen toxisch, da es ansonsten in der Biologie in großem Umfang zur Entfernung von Lipiden aus Zellmembranen eingesetzt wird.
Die Herstellung dieses Typs von Mehrfachemulsionen ist schwierig: sie hängt nicht nur von der Zusammensetzung der Phasen sondern auch von der Arbeitsweise ab. Bedient man sich der von Herbert beschriebenen Ultraschallbehandlung, so erhielten Autoren bei einer Ultraschallbehandlung von 10 Sekunden eine Mehrfachemulsion, während sich bei einer Ultraschallbehandlung von 30 Sekunden, ein Produkt vom Typ W/Ö ergibt.
Ein derart großer Einfluß der Parameter des Verfahrens, das außerdem zwei Stufen erfordert, ist für den großtechnischen Maßstab schwer hinzunehmen. In immunologischer Hinsicht haben sich die nach diesem Verfahren erhaltenen Impfstoffe im Vergleich zu den Impfstoffen vom Typ W/Ö als weniger wirksam erwiesen (Anderson, Res. Vet. Sci., Bd. 12 (1971), S. 18; Herbert, Immunological standardization, Symposium Series, Bd. 6 (1967), S. 29).
Es besteht daher ein Interesse daran, über flüssige, leicht injizierbare und stabile Emulsionen zu verfügen, die bei Umgebungstemperatur den Typ W/Ö/W aufweisen und sich bei der Körpertemperatur von Menschen oder Tieren in ein wirksameres Präparat vom Typ W/Ö umwandeln können.
Diese als Phaseninversion bezeichnete Umwandlung wurde von Shinoda und seinem Arbeitskreis eingehend untersucht. Die Temperatur, bei der der Übergang der W/Ö-Form zur W/Ö/W-Form erfolgt, ist die Phasenumwandlungstemperatur. Sie wird bestimmt, indem man die elektrische Leitfähigkeit einer in der Wärme hergestellten und in einem Eisbad gekühlten Suspension verfolgt.
Die Phaseninversion erfolgt mit zahlreichen nicht-ionogenen Tensiden, wurde aber hauptsächlich an Produkten vom Typ der ethoxylierten Alkylphenole, die für eine medizinische oder veterinärmedizinische Verwendung ungeeignet sind, untersucht.
Die erfindungsgemäßen Emulsionen werden in einem einzigen Arbeitsgang ausgehend von pharmazeutisch verträglichen Emulgatoren hergestellt, die in Lösung in einem injizierbaren Öl eine klare homogene Phase bilden und Umwandlungspunkte in der Nähe der Körpertemperatur von Tieren oder Menschen aufweisen. Ferner wurde überraschenderweise festgestellt, daß diese Impfstoffe sehr gut verträglich sind und keine lokalen Reaktionen, Abszesse oder Nekrosen hervorrufen, wie dies bei Impfstoffen vom Typ W/Ö, die unter Verwendung des gleichen Öls hergestellt worden sind, der Fall ist.

Charakterisierung der erfindungsgemäßen Emulsionen

Die erhaltenen Emulsionen sind durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet:
- Fluidität: Die mit einem Brookfield-Gerät bei 20ºC gemessenen Viskositäten liegen immer unter 300 mPa s, im allgemeinen unter 100 mPa s;
- Injizierbarkeit: Die Emulsionen strömen aus einer 10 ml- Spritze mit einer Nadel von 0,8 mm Durchmesser bei Anlegen einer konstanten Kraft von 3,3 kg leicht aus.
Die zum Ausströmen von 10 ml Emulsion erforderliche Zeitspanne ist mit der Zeitspanne eines Ö/W-Präparats vergleichbar und deutlich geringer als bei einer Emulsion mit Freund- Adjuvans. Emulsion Ausströmzeit (s) Erfindung mit einem gehalt an IFA
- Leitfähigkeit: Dieser Wert legt den Charakter der kontinuierlichen Phase der Emulsion fest. Sie liegt im allgemeinen zwischen 0,1 und 10 Millisiemens in der Kälte und zwischen 0,05 und 5 Mikrosiemens in der Wärme;
- Dispergierbarkeit in Wasser: Die erfindungsgemäß erhaltenen Emulsionen dispergieren sich leicht in Wasser, mit dem sie eine milchige Lösung mit einem öligen Film bilden;
- mikroskopisches Erscheinungsbild: Die erfindungsgemäßen Emulsionen weisen die Form von öligen Tropfen auf, die kleiner als 1 um sind oder eine Größe in der Nähe dieses Werts haben.
Die Mikrotröpfchen der wäßrigen Phase in diesem öligen Tropfen sind mit dem optischen Mikroskop unsichtbar. Die Teilchengrößen, die im Vergleich zu denen der Präparate von Herbert-Typ sehr klein sind, erklären die gute Stabilität der erfindungsgemäßen Impfstoffemulsionen:
- Stabilität: Die erfindungsgemäßen Emulsionen sind bei 4ºC mindestens 12 Monate stabil.
Um zu bestimmen, ob ein Gemisch aus Öl, Emulgatoren und antigenem Medium, das nach der erfindungsgemäßen Arbeitsweise gerührt worden ist, die Ausbildung einer Mehrfachemulsion bewirkt hat, reicht es aus, einige Tropfen des erhaltenen Präparats in einen Behälter mit Wasser eintropfen zu lassen und vorsichtig mit einem Spatel zu rühren.
Eine Emulsion des Wasser-in-Öl-Typs ergibt weiße, klar getrennte Tropfen, die sich rasch umschichten und an der Wasseroberfläche schwimmen.
Eine Emulsion vom Öl-in-Wasser-Typ ergibt eine Milch mit homogener Beschaffenheit in bezug auf Färbung und Erscheinungsbild.
Eine Mehrfachemulsion ergibt gleichzeitig eine homogene Milch und kleine an der Wasseroberfläche schwimmende Tröpfchen.

Charakterisierung der in den injizierbaren Emulsionen enthaltenen Öle

Die Öle müssen frei von Toxizität sein und bei Lagerung bei 4ºC flüssige Emulsionen ergeben.
Sie werden unter Mineralölen, pflanzlichen Ölen oder tierischen Ölen, die für ihre geringe Toxizität bekannt sind, ausgewählt. Man wählt Mineralöle mit linearen Ketten mit mehr als 16 Kohlenstoffatomen, die frei von aromatischen Verbindungen sind, aus.
Bekannte Beispiele hierfür sind MARCOL 52 (Produkt der Firma ESSO Frankreich) oder DRAKEOL 6VR (Produkt der Firma PENRECO, USA). Man kann auch synthetische Kohlenwasserstoffe verwenden, wie Polyisobuten oder Polyisopropen. Was pflanzliche Öle betrifft, wählt man ungesättigte Öle vom Ölsäuretyp aus, die biologisch abbaubar sind und für ihr immunogenes Vermögen bekannt sind, z.B. Erdnußöl, Olivenöl, Sesamöl, Sojaöl, Weizenkeimöl, Jojobaöl und dergl. Was tierische Öle betrifft, ermöglichen die gleichen Kriterien hinsichtlich der Verträglichkeit und immunologischen Wirksamkeit beispielsweise die Verwendung von Squalen, Squalan und Spermacetöl.
Auch Ester aus Fettsäuren mit mindestens 14 Kohlenstoffatomen und Alkoholen, vorzugsweise verzweigten Alkoholen, die bei der Lagerungstemperatur flüssig sind, können verwendet werden.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich beim verwendeten Öl um ein Mineralöl oder einen synthetischen Kohlenwasserstoff, der bei 4ºC flüssig ist und bei 40ºC eine Viskosität unter 100 mPa s aufweist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich beim verwendeten Öl um ein metabolisierbares Öl oder flüssiges Wachs pflanzlichen Ursprungs, das in natürlicher oder raffinierter Form eingesetzt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung handelt es sich beim verwendeten Öl um ein Öl tierischen Ursprungs, insbesondere um Fischöl.
Beim erfindungsgemäß verwendeten Öl kann es sich auch um ein Gemisch aus zwei oder mehr der vorstehend beschriebenen Öle handeln.

Charakterisierung der Emulgatoren

Hierbei handelt es sich um nicht-ionogene Produkte, die frei von einer merklichen Toxizität sind und für die Injektion geeignet sind. Sie können aus den nachstehend aufgeführten chemischen Klassen, die als nicht-beschränkende Beispiele dienen, ausgewählt werden:
- Ester oder Ether von Fettsäuren und Zuckern (Sorbit, Mannit, Saccharose, Glucose...);
- Ester von Fettsäuren und Glycerin oder Polyolen;
- hydrophile Derivate dieser Ester, die durch Aufpfropfen von Alkohol-, Etheroxid-, Carboxyl-, Amin-, Amidfunktionen und dergl. erhalten worden sind;
- Lecithine;
- Fettsäuren oder Fettalkohole, die mit Ethylenoxid oder Propylenoxid kondensiert sind.
Die Fettketten der verwendeten Emulgatoren weisen 8 bis 22 Kohlenstoffatome und vorzugsweise 14 bis 20 Kohlenstoffatome auf. Flüssige Ketten werden bevorzugt.
Oleyl-, Ricinoleyl-, Linoleyl-, Isostearyl- und Cetostearylalkohole und -säuren und ihre Derivate stellen die Verbindungen der Wahl dar.
Die Emulgatoren aus der Familie der Oleate von Mannit sind aufgrund ihrer weitgehenden Unschädlichkeit und ihrer Eignung zur Bildung von sehr stabilen, mehrphasigen Emulsionen von besonderem Interesse. Vorteilhafterweise können Derivate von Ölsäuremannitestern, die durch Aufpfropfen von hydrophilen Funktionen, beispielsweise Amin-, Amid-, Ethoxy-, Alkohol-, Polyol-, Carboxylfunktionen und dergl. erhalten worden sind, verwendet werden.
Einsatzbereite Immunitätsadjuvantien, die das Öl und die Emulgatoren enthalten und in Form einer klaren, stabilen und homogenen öligen Flüssigkeit vorliegen, stellen die bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäß verwendeten Emulgatoren dar.

Verfahren zur Herstellung der mehrphasigen Impfstoffe vom Typ W/Ö/W

Zur Herstellung von sehr stabilen Impfstoffen ist es wichtig, sich an folgende Vorgehensweise zu halten:
- die ölige Phase (Öl und Emulgatoren) einerseits und die wäßrige Phase mit einem Gehalt an den Antigenen oder Wirkstoffen andererseits werden jeweils auf eine Temperatur von 20 bis 40ºC gebracht. Eine Temperatur von 30ºC ist häufig optimal.
- Die wäßrige Phase wird unter mäßigem Rühren ohne Scherbeanspruchung in die Ölphase gegossen. Der Rührvorgang wird bis zum Erreichen von Umgebungstemperatur fortgesetzt.
Nach diesem Verfahren wurden Präparate erhalten, die bei 4ºC und bei Umgebungstemperatur mehr als 1 Jahr stabil waren.

Beispiel 1

Ein Impfstoff mit folgender Zusammensetzung wird hergestellt:
Öliges Adjuvans 50 %
Pufferlösung mit einem Gehalt an 100 ug/ml Rinderserumalbumin 50 %
Die Zusammensetzung des öligen Adjuvans wird so gewählt, daß sich ein Inversionspunkt der Emulsion von etwa 35ºC ergibt.
Die Eigenschaften dieses Adjuvans und des entsprechenden Impfstoffs sind in Tabelle 1 - 1 zusammengestellt. Dieser Impfstoff wird auf subkutanem Wege SWISS-Mäusen verabreicht. Die Entwicklung des durch ELISA-Technik bestimmten Antikörpertiters (Durchschnitt von 10 Mäusen) ist in Tabelle 1 - 2 angegeben.
Zu Vergleichszwecken ist in dieser Tabelle auch die Entwicklung des Antikörpertiters für einen mit inkomplettem Freund- Adjuvans (IFA) hergestellten Impfstoff und für eine Albumin- Pufferlösung ohne Immunitätsadjuvans angegeben.
Der in diesem Beispiel beschriebene Impfstoff ermöglicht in signifikanter und dauerhafter Weise die Erhöhung des Antikörpertiters bei Mäusen im Vergleich zu einem Impfstoff ohne Adjuvans, ohne daß jedoch die Eigenschaften des Impfstoffs mit einem Gehalt an IFA erreicht werden. Tabelle 1 - 1 Physikochemische Eigenschaften des Impfstoffs RSA Eigenschaften des Adjuvans Erscheinungsbild klares, strohgelbes Öl Zusammensetzung flüssiges Mineralöl Mannit- und PEG*500-oleat Säurezahl Hydroxylzahl Verseifungszahl Brechungsindex Viskosität Eigenschaften des Impfstoffs (bei 20ºC) Typ Teilchengröße Leitfähigkeit Stabilität bei 4ºC * PEG : Polyethylenglykol Tabelle 1 - 2 anti-RSA-Antikörpertiter (angegeben als Kehrwert der zur Erzielung von einer optischen Dichte von 1 erforderlichen Verdünnung Tage nach der Impfung Impfstoff gemäß Beispiel 1 Impfstoff auf IFA-Basis Albumin ohne Adjuvans

Beispiel 2

Ein Grippeimpfstoff wurde an SWISS-Mäusen getestet. Der Impfstoff wies folgende Zusammensetzung auf:
Öl-Adjuvans (Mineralöl mit einem Gehalt an PEG 500- und Anhydromannitölsäureester) 47%
antigenes Medium 53 %
Das antigene Medium bestand aus Influenza A/PR8-Virus, das mit Formaldehyd inaktiviert worden war und einen Titer von 800 Hämagglutinierungseinheiten/ml aufwies.
Das Adjuvans und der Impfstoff weisen im wesentlichen die gleichen physikochemischen Eigenschaften wie in Beispiel 1 auf. Der Inversionspunkt des Impfstoffs liegt bei 37ºC.
Die Impfung wurde mit einer einzigen Injektion von 0,2 ml auf subkutanem Wege durchgeführt.
In Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Antikörpermessung (angegeben in log 2 der Verdünnungen) zusammengestellt. Es läßt sich feststellen, daß der mehrphasige Impfstoff sich ebenso günstig verhält wie der Impfstoff auf IFA-Basis und deutlich wirksamer als der Vergleichsimpfstoff ohne Adjuvans ist. Tabelle 2 Eigenschaften eines mehrphasigen Grippe-Impfstoffs Impfstoff Antikörpertiter 42 Tage nach der Impfung mehrphasig IFA-Adjuvans ohne Adjuvans

Beispiel 3

Zwei Impfstoffe gegen die Aujeszky-Krankheit wurden aus dem gleichen antigenen Medium hergestellt. Bei einem Impfstoff handelte es sich um einen klassischen öligen Impfstoff vom Typ W/Ö (3A) und beim anderen um einen erfindungsgemäßen mehrphasigen Impfstoff W/Ö/W (3B).
Die in diesen beiden Impfstoffen enthaltenen Adjuvantien beruhen auf einem flüssigen synthetischen Öl, das durch Polymerisation von Isobutylen erhalten worden ist. Der mehrphasige Impfstoff enthält ein Emulgatorsystem, das ihm einen Inversionspunkt von etwa 33ºC verleiht.
Die Eigenschaften der Impfstoffe und ihrer Adjuvantien sind in Tabelle 3 - 1 angeführt. Tabelle 3 - 1 Präparat Eigenschaften des Adjuvans Erscheinungsbild Öl Emulgator Säureindex Viskosität bei 20ºC hell, klar, gelb Polyisobuten Mannitmonooleat PEG 10-Oleat Eigenschaften des Impfstoffs bei 20ºC Viskosität Größe der Tropfen Leitfähigkeit Stabilität 4ºC > 12 Monate
Zwei Gruppen von jeweils 6 Schlachtschweinen einer Großschweinezucht wurden geimpft. Die Impfung wurde durch intramuskuläre Injektion von 2 ml des Impfstoffs gefolgt von einer Auffrischungsimpfung nach 15 Tagen durchgeführt. Der Antikörpertiter wurde durch Seroneutralisation 59 Tage nach der ersten Injektion bestimmt.
Aus Tabelle 3-2 geht der Wert des mehrphasigen Impfstoffs 3B klar hervor, der nur geringe Unverträglichkeitsreaktionen (Nekrose, Eiterung, Fibrose, Muskelatrophie) zeigt und eine positive immunologische Reaktion ergibt, die die serologischen Ergebnisse und das Vorliegen von Makrophagengranulomen belegen. Tabelle 3 - 2 Ergebnisse der Impfung Impfstoff Serologie (Hämagglutination) Antikörpertiter (10g2) Histologie * Nekrose Eiterung Fibrose schwere Muskelatrophie Makrophagengranulome * Häufigkeit der beobachteten Läsionen

Beispiel 4

Auch dieser Versuch belegt die gute Verträglichkeit eines erfindungsgemäßen mehrphasigen Impfstoffs im Vergleich mit dem klassischen öligen Impfstoff des Typs W/Ö aus dem gleichen Mineralöl.
Die Eigenschaften der beiden öligen Adjuvantien und der beiden erhaltenen Impfstoffe sind in Tabelle 4 - 1 aufgeführt.
Zwei Gruppen von jeweils fünf Schlachtschweinen in einem Tierzuchtbetrieb wurden gegen die Aujeszky-Krankheit geimpft. Jedem Tier wurden auf intramuskulärem Wege 2 ml Impfstoff verabreicht. Eine Auffrischungsimpfung der gleichen Art wurde 18 Tage nach der ersten Impfung vorgenommen. Eine Resistenzüberprüfung durch intranasale Einstäubung von 4 ml einer viralen infektiösen Suspension wurde 32 Tage nach der Impfung durchgeführt. In Tabelle 4-2 sind die Ergebnisse zusammengestellt.
Die Gewichtsentwicklung der beiden Gruppen nach der Resistenzprüfung ist vergleichbar und klar der Gewichtsentwicklung der mit Impfstoff ohne Adjuvans geimpften Kontrolltiere überlegen. Die Antikörpertiter (angegeben als Kehrwert der Verdünnung) unterscheiden sich nicht signifikant.
Dagegen ist die Verträglichkeit des mehrphasigen Impfstoffs 4B erheblich besser: Weder nekrotische Abszesse noch andere Reaktionen lokaler Art, die von den Gesundheitsbehörden nicht akzeptiert werden, wurden festgestellt.
Dies ist mit mäßigen Temperaturerhöhungen zu vergleichen, die mit dem Impfstoff bei den zwei Impfungen beobachtet werden. Tabelle 4 - 1 Eigenschaften der Impfstoffe gegen die Aujeszky-Krankheit Präparat Eigenschaften des Adjuvans Öl Emulgator Hydroxylzahl Säurezahl Verseifungszahl Brechungsindex (25ºC) Viskosität (20ºC) flüssiges Mineralöl Mannitoleat Mannit- und PEG 500-oleat Eigenschaften des Impfstoffs Typ mikroskopisches Erscheinungsbild Leitfähigkeit (20ºC) Stabilität bei 4ºC Antigentiter Tropfen von etwa 1 um > 12 Monate Tropfen < 1 um Tabelle 4 - 2 Ergebnisse der Impfung beim Schwein Impfstoff Hyperthermie bei der Impfung bei der Nachimpfung bei der Resistenzprüfung durchschnittliche Gewichtsentwicklung % (in 7 Tagen nach der Resistenzprüfung) Anm.: Impfstoff ohne Adjuvans - 1,08 Serologie Antikörper-Titer Ecart-Typ lokale Reaktionen Abszesse-Nekrosen Eiterung Fibrose Muskelatrophie Makrophagengranulome Tabelle 5 Präparat Eigenschaften des Adjuvans Öl Emulgator Erscheinungsbild Viskosität bei 20ºC flüssiges Mineralöl Lecithin PEG-monooleat hellgelb Squalan Mannit- und PEG-oleat 400 hellgelb, klar Eigenschaften des Impfstoffs Typ % Adjuvans Viskosität Leitfähigkeit mikroskopisches Erscheinungsbild (Tropfengröße) mehrphasig Tabelle 5 - Fortsetzung Präparat Eigenschaften des Adjuvans Öl Emulgator Erscheinungsbild Viskosität bei 20ºC Erdnußöl Copolymer OE/OP klar Mineralöl + Erdnußöl (1:1) Mannitoleat hellgelb, strohgelb Mannitoleat + Lecithin hellgelb, klar Eigenschaften des Impstoffs Typ % Adjuvans Viskosität Leitfähigkeit mikroskopisches Erscheinungsbild (Tropfengröße) mehrphasig

Beispiel 5

In diesem Beispiel sind Placebo-Emulsionen und entsprechende Adjuvantien (Tabelle 5) beschrieben, die alle folgende Eigenschaften aufweisen:
- geringe Viskosität
- gute Injizierbarkeit
- Inversionspunkt bei 30 - 40ºC
- einwandfreie Stabilität bei Lagerung bei 4ºC.
Diese Beispiele zeigen, daß man erfindungsgemäß injizierbare Impfstoffe aus unterschiedlichen Ölen (mineralische Öle, pflanzliche Öle, Squalan...) und deren Gemischen, sowie aus unterschiedlichen Typen von Emulgatoren bei geeigneter Einstellung ihrer Konzentration herstellen kann. Der Anteil der die Wirkstoffe enthaltenden wäßrigen Phase kann ebenfalls stark variieren.
Es wurde jedoch festgestellt, daß die Eigenschaften der erhaltenen Emulsionen, insbesondere die Viskosität, die Stabilität und der Inversionspunkt, in sehr empfindlicher Weise von der Zusammensetzung der Adjuvantien und vom Ursprung der verwendeten Öle abhängen.

Beispiel 6

Ein Verträglichkeitstest bei intraperitonealer Injektion von 0,25 ml des Produkts wurde von S.S. Berlin (Annals of Allergy, Bd. 20 (1962), S. 473) beschrieben. Die erfindungsgemäßen Impfstoffe bestehen sämtliche Normen dieses Tests (keine Todesfälle, keine Peritonitis, Gewichtsentwicklung vergleichbar mit der Entwicklung der Vergleichstiere).
Tests, die gemäß der europäischen Pharmacopoe durchgeführt wurden, zeigten, daß die erfindungsgemäßen Impfstoff-Plazebos keine abnormale Toxizität aufweisen, was insbesondere für die beiden Präparate auf der Grundlage von Mannit- und PEG-oleaten und flüssigem Mineralöl oder synthetischem Polyisobutylenöl gilt.

Beispiel 7

Dieses Beispiel erläutert die Bedeutung des Herstellungsverfahrens für die physikochemischen Eigenschaften der mehrphasigen Impfstoffe, insbesondere die Bedeutung der Herstellungstemperatur.
Die untersuchten Präparate wiesen folgende Zusammensetzung auf:
Öl-Adjuvans (Mineralöl 85 %, Mannit- und PEG-oleate 15 %) 94 g
antigenes Plazebo-Medium 106 g

Verfahrensweise 1

- Die beiden Phasen wurden auf 30ºC gebracht und 10 Minuten mit einem YSTRAL-Rührer mit einer Drehzahl von etwa 2500 U/min gerührt.

Verfahrensweise 2

- Die Ölphase wurde auf 40ºC erwärmt. Die wäßrige Phase wurde bei Umgebungstemperatur belassen. Mikroskopisches Erscheinungsbild der erhaltenen Impfstoffe: Verfahrensweise sehr feine Tropfen (< 1 um) - homogen Die Tropfen konnten eine Größe bis 50 um erreichen - heterogene Beschaffenheit

Claims

1. Mehrphasige injizierbare Emulsionen vom Wasser/Öl/Wasser-Typ, die all Impfstoffe oder Träger von Wirkstoffen in der Veterinär- und Humanmedizin verwendbar sind, nur pharmazeutisch akzeptable Bestandteile enthalten, bei Lagerung bei 4 ºC mindestens 12 Monate stabil sind, eine Viskosität von weniger als 300 mPa.s besitzen und mindestens folgende Bestandteile enthalten:

- Ein öliges Adjuvans, das besteht aus

. einer nicht mit Wasser mischbaren Ölphase, die 20 bis 70 Gew.-% der Formulierung darstellt;

. einem Emulgatorsystem, das so ausgewählt ist, daß der Inversionspunkt der erhaltenen Emulsion zwischen 25 und 45 ºC liegt, und das 2 bis 10 Gew.-% der Formulierung ausmacht;

- einer wässerigen Phase, welche die Antigene oder Wirkstoffe enthält und 20 bis 78 Gew.-% der Formulierung darstellt,

wobei die Emulsionen in einem einzigen Mischschritt erhalten sind.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei welcher der oder die Emulgatoren einer der folgenden Klassen angehören:

Ester von Fettsäuren mit Sorbit,

Ester von Fettsäuren mit Mannit,

Ester von Fettsäuren mit Saccharose,

Ester von Fettsäuren mit Glycerin,

Kondensationsprodukte eines der vorgenannten Ester mit Ethylenoxid und/oder Propylenoxid,

Kondensationsprodukte von Fettsäuren mit Ethylenoxid und/oder Propylenoxid,

Kondensationsprodukte von Fettalkoholen mit Ethylenoxid und/oder Propylenoxid,

Glycerophospholipide.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Synthese der Emulgatoren verwendeten Fettsäuren 12 bis 22 C-Atome besitzen und insbesondere Ölsäure, Stearinsäure oder Ricinoleinsäure darstellen.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß einer der verwendeten Emulgatoren ein Mannit- oder Anhydromannitoleat ist, das ggfs. durch Aufpfropfen hydrophiler Funktionen wie Carboxylgruppen, Aminogruppen, Amidogruppen, Alkoholgruppen, Polyolgruppen oder Etheroxidgruppen modifiziert ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Öl ein Mineralöl oder ein synthetischer Kohlenwasserstoff ist, bei 4 ºC flüssig ist und bei 40 ºC eine Viskosität von weniger als 100 mPa.s aufweist.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Öl ein flüssiges, metabolisierbares Öl oder Wachs pflanzlichen Ursprungs ist, das in nichtraffinierter Form oder in raffinierter Form vorliegt.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Öl ein Öl oder ein Wachs tierischen Ursprungs ist, insbesondere ein Fischöl oder Fischwachs.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Öl ein Gemisch von 2 oder mehr Ölen ist, wie sie in den Ansprüchen 5 bis 7 beschrieben sind.

9. Flüssige, homogene ölige Adjuvantien, die mindestens einen der Emulgatoren und Öle enthalten, die in den Ansprüchen 2 bis 8 beschrieben sind, und es erlauben, durch Rühren mit einer wässerigen Phase, die einen Wirkstoff oder ein Antigen enthält, eine stabile, flüssige Emulsion vom Wasser/Öl/Wasser-Typ und einer Viskosität von weniger als 300 mPa.s herzustellen, gekennzeichnet durch einen Inversionspunkt zwischen 25 und 45 ºC.

10. Verfahren zur Herstellung der injizierbaren Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, das in folgenden Schritten besteht:

- Mischen des oder der Öle und des oder der Emulgatoren,

- Sterilisieren dieser Phase durch Filtration, Autoklavieren oder in einer beliebigen anderen, bekannten Weise,

- Erhitzen dieser Phase auf eine Temperatur zwischen 20 und 40 ºC, vorzugsweise zwischen 30 und 35 ºC,

- Herstellen einer wässerigen Lösung, welche die Wirkstoffe oder die Antigene enthält, Sterilisieren dieser wässerigen Lösung in beliebiger, geeigneter Weise,

- Erhitzen der wässerigen Lösung auf die gleiche Temperatur wie die Ölphase und

- Zugabe der wässerigen Lösung zur Ölphase unter Rühren ohne Scherbeanspruchung.