DE60125007T2

DE60125007T2 - Schichtförmige und kryogenisch gelagerte Impstoffe und Verfahren zur deren Bereitung

Info

Publication number: DE60125007T2
Application number: DE60125007T
Authority: DE
Inventors: c/o Institute for Animal Health Paul Pirbright Barnett; Vincent Ganne; Jerôme Aucouturier
Original assignee: Societe dExploitation de Produits pour les Industries Chimiques SEPPIC SA
Current assignee: Societe dExploitation de Produits pour les Industries Chimiques SEPPIC SA
Priority date: 2000-10-06
Filing date: 2001-09-19
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2021-09-20
Also published as: FR2814956A1; US20020090375A1; US20040022798A1; ES2277887T3; JP2002121151A; FR2814956B1; DE60125007D1; JP4316174B2; EP1201251B1; US7807169B2; US6669947B2; EP1201251A1; BR0104342A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Impfstoffformulierung, die mindestens ein Antigen, insbesondere ein Antigen viralen, bakteriellen oder parasitischen Ursprungs, umfasst, sowie ein Verfahren für ihre Herstellung.
Zurzeit haben die üblichen Impfstoffe eine Lagerstabilität, die 18 bis 24 Monate bei +4°C nicht übersteigt, seien sie nun ölbasiert oder wässrig. Studien, die vom Institute for Animal Health (IAH) in Großbritannien durchgeführt wurden, haben gezeigt, dass ölbasierte Impfstoffe, die bei –20°C und bei –70°C eingefroren wurden, ihre Aktivität verloren. Folglich werden kommerziell erhältliche Impfstoffe in diesem Land mit der Aufschrift: "nicht einfrieren" versehen.
Antigene können für längere Zeiträume, bis zu 15 Jahre, bei sehr niedriger Temperatur in Form, von Konzentraten gelagert werden. In diesem Fall ist wesentlich, dass man über Mittel zum Formulierung von Impfstoffen nahe ihres Lagerortes verfügt, um einen Zeitverlust zu vermeiden, wenn der Impfstoff dringend benötigt wird.
Die internationale Anmeldung WO 96/32964 offenbart Emulsionen, die eine Antigenphase und eine ölige Hilfsstoffphase enthalten und die während mindestens eines Jahres bei 4°C stabil sind.
Die internationale Anmeldung WO 00/03744 offenbart eine gefrorene wässrigen Impfstoffzusammensetzung, die eine wässrige kolloidale Suspension von Monophosphoryllipid A als Hilfsstoff und ein Pneumokokken-Glykokonjugat als Antigen enthält.
Diese Überlegungen haben den Anmelder dahin geführt, Arbeiten zu unterstützen, die auf die Entwicklung von Impfstoffen zielen, die mehrere Jahre gelagert werden können und nach dem Auftauen gebrauchsfertig sind.
Unter einem ersten Aspekt ist der Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, bestehend aus einer Antigenphase, einer öligen Hilfsstoffphase und gegebenenfalls einer Verdünnungsmittelphase für die Antigenphase, in der das Antigenmedium eine Phase ausmacht, die sich von der Hilfsstoffphase unterscheidet, wenn die Zusammensetzung im festen Zustand ist, wobei die Zusammensetzung im flüssigen Zustand ist, wenn ihre Temperatur größer oder gleich 4°C ist, dadurch gekennzeichnet, dass

a) – die erste Phase aus der öligen Hilfsstoff-, Verdünnungsmittel- oder Antigenphase, die bei Raumtemperatur flüssig ist, auf eine Temperatur von kleiner oder gleich ihrem Erstarrungspunkt gebracht wird, so dass eine erste feste Phase erhalten wird,
b) – die zweite Phase aus der öligen Hilfsstoff-, Verdünnungsmittel- oder Antigenphase im flüssigen Zustand über die in a) hergestellte feste Phase gegeben wird, und dann die neue Kombination auf eine Temperatur kleiner oder gleich dem niedrigsten Erstarrungspunkt der beiden Phasen gebracht wird, so dass eine feste Kombination mit zwei verschiedenen Phasen erhalten wird,
c) – gegebenenfalls die letzte aus der öligen Hilfsstoff-, Verdünnungsmittel- oder Antigenphase im flüssigen Zustand über die in Schritt b) hergestellte feste Kombination gegeben wird und dann die neue Kombination auf eine Temperatur kleiner oder gleich dem niedrigsten Erstarrungspunkt der drei Phasen gebracht wird, so dass eine feste Kombination mit drei verschiedenen Phasen erhalten wird.

Der Ausdruck getrennte Phasen bedeutet, dass in der Zusammensetzung, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, keine der Phase im festen Zustand in einer anderen eingeschlossen, gelöst, emulgiert oder dispergiert ist.
Unter einem ersten besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die verschiedenen Phasen, die die Zusammensetzung im festen Zustand ausmachen, zu höchstens zwei unterschiedlichen Phasen benachbart; genauer gesagt, sind sie in der Zusammensetzung auf geschichtete Weise angeordnet und vorzugsweise übereinander geschichtet.
Der Ausdruck Antigenmedium soll so verstanden werden, dass er im Kontext der vorliegenden Erfindung ein Konzentrat aus Antigenmaterial oder ein Gemisch von Konzentraten von Antigenmaterialien bedeutet, seien diese Konzentrate unverdünnt oder in einem geeigneten flüssigen Vehikel verdünnt. Das Antigenmedium wird im Folgenden als "Antigenphase" bezeichnet.
Der Ausdruck Antigenmaterial bezeichnet ein Antigen, eine Mischung von Antigenen, einen In-vivo-Erzeuger einer Verbindung, die eine Aminosäuresequenz umfasst, eine Mischung von In-vivo-Erzeugern einer Verbindung, die eine Aminosäuresequenz umfasst, oder alternativ eine Mischung von einem oder mehreren Antigenen mit einem oder mehreren In-vivo-Erzeugern einer Verbindung, die eine Aminosäuresequenz umfasst.
Der Ausdruck Antigen oder mindestens ein In-vivo-Erzeuger einer Verbindung, die eine Aminosäuresequenz umfasst, bezeichnet entweder abgetötete Mikroorganismen, wie Viren, Bakterien oder Parasiten, oder gereinigte Fraktionen dieser Mikroorganismen oder lebende Mikroorganismen, deren pathogene Stärke abgeschwächt wurde.
Als Viren, die ein erfindungsgemäßes Antigen darstellen können, können das Tollwut-Virus, Herpesviren, wie das Virus der Aujeszky-Krankheit, Orthomixoviren, wie Influenzavirus, Picornaviren, wie Maul-und-Klauen-Virus, oder Retroviren, wie HIVs, genannt werden.
Als Mikroorganismen des Bakterientyps, die ein erfindungsgemäßes Antigen darstellen können, können E. coli und diejenigen der Gattungen Pasteurella, Furonculosis, Vibrio, Staphylococcus und Streptococcus genannt werden.
Als Parasit können diejenigen der Gattungen Trypanosoma, Plasmodium und Leishmania genannt werden.
Rekombinante Viren, insbesondere Viren ohne Hülle, wie Adenoviren, Vacciniavirus, Kanarienpockenvirus, Herpesviren oder Baculoviren können ebenfalls genannt werden.
Man kann auch einen rekombinanten, lebenden, nicht-umhüllten viralen Vektor nennen, dessen Genom, vorzugsweise inseriert in einen Abschnitt, der für die Replikation des entsprechenden umhüllten Virus nicht wesentlich ist, eine Sequenz enthält, die eine Antigenuntereinheit codiert, welche die Synthese von Antikörpern und/oder eine Schutzwirkung gegen das oben genannten umhüllte Virus oder einen pathogenen Mikroorganismus induziert; eine derartige Antigenuntereinheit ist zum Beispiel ein Protein, ein Glykoprotein, ein Peptid oder eine Peptidfraktion und/oder eine Fraktion, die gegen eine Infektion durch einen lebenden Mikroorganismus, wie ein umhülltes Virus, ein Bakterium oder einen Parasiten, schützt. Das in den Mikroorganismus inserierte exogene Gen stammt zum Beispiel von einem Aujeszky-Virus oder einem HIV-Virus.
Insbesondere kann ein rekombinantes Plasmid genannt werden, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, in die eine exogene Nukleotidsequenz inseriert wird, die von einem Mikroorganismus oder einem pathogenen Virus erhalten wird. Die Rolle der letzteren Nukleotidsequenz ist, die Expression einer Verbindung zu ermöglichen, die eine Aminosäuresequenz umfasst, deren Aufgabe es ist, eine Immunantwort in einem Wirtsorganismus auszulösen.
Der "In-vivo"-Expressionserzeuger einer Verbindung, die eine Aminosäuresequenz umfasst, bezeichnet ein beliebiges biologisches Produkt, das in der Lage ist, die Verbindung in dem Wirtsorganismus zu exprimieren, in den der In-vivo-Erzeuger eingebracht wird. Die Verbindung, die die Aminosäuresequenz umfasst, kann ein Protein, ein Peptid oder ein Glykoprotein sein. Diese In-vivo-Erzeuger werden gewöhnlich durch Verfahren erhalten, die von der Gentechnologie stammen. Genauer gesagt, können sie aus lebenden Mikroorganismen, in der Regel einem Virus, bestehen, das als rekombinanter Vektor fungiert, in den eine Nukleotidsequenz, insbesondere ein exogenes Gen, inseriert wird. Diese Verbindung sind an sich bekannt und werden insbesondere als rekombinanter Untereinheiten-Impfstoff verwendet. In dieser Hinsicht wird auf den Artikel von M. ELOIT et al., Journal of Virology (1990) 71, 2925-2431 und auf die internationalen Patentanmeldungen, die unter den Nummern WO-A-91/00107 und WO-A-94/16681 veröffentlicht sind, verwiesen.
Die erfindungsgemäßen In-vivo-Erzeuger können auch aus einem rekombinanten Plasmid bestehen, das eine exogene Nukleotidsequenz umfasst und in der Lage ist, in einem Wirtsorganismus eine Verbindung zu exprimieren, die eine Aminosäuresequenz umfasst. Derartige rekombinante Plasmide und ihre Verabreichungsweise in einem Wirtsorganismus wurden 1990 von LIN et al., Circulation 82: 2217, 2221; COX et al., J. of Virol., Sept. 1993, 67, 9, 5664-5667 und in der internationalen Anmeldung, die unter der Nummer WO 95/25542 veröffentlicht ist, beschrieben. Je nach der Art der Nukleotidsequenz, die in dem In-vivo-Erzeuger enthalten ist, kann die Verbindung, die die Aminosäuresequenz umfasst, die in dem Wirtsorganismus exprimiert wird,:

(i) ein Antigen sein und das Auslösen einer Immunreaktion ermöglichen,
(ii) eine heilende Wirkung auf eine Erkrankung, im Wesentlichen eine Erkrankung funktioneller Art, die in dem Wirtsorganismus ausgelöst wird, haben. In diesem Fall gestattet der In-vivo-Erzeuger eine Behandlung des Gentherapietyps für den Wirt. Eine solche heilende Wirkung besteht zum Beispiel aus einer Synthese von Cytokinen, wie Interleukinen, insbesondere Interleukin-2, durch den In-vivo-Erzeuger. Diese ermöglichen das Auslösen oder Verstärken einer Immunreaktion, die sich auf die selektive Beseitigung von Krebszellen richtet.

Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung umfasst eine Antigenkonzentration, die von der Art dieses Antigens und von der Art des behandelten Individuums abhängt. Die angemessene Antigenkonzentration kann durch den Fachmann auf herkömmliche Weise bestimmt werden. Im Allgemeinen liegt diese Dosis in der Größenordnung von 0,1 μg/cm³ bis 1 g/cm³, noch allgemeiner zwischen 1 μg/cm³ und 100 mg/cm³ der Zusammensetzung im flüssigen Zustand.
Die Konzentration des In-vivo-Erzeugers in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung hängt auch hier wiederum insbesondere von der Art des Erzeugers und von dem Wirt ab, in den sie verabreicht wird. Diese Konzentration kann durch den Fachmann auf Basis eines Routineexperiments leicht bestimmt werden. wenn der In-vivo-Erzeuger ein rekombinanter Mikroorganismus ist, kann jedoch als Richtwert angegeben werden, dass seine Konzentration in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zwischen 10² und 10¹⁵ Mikroorganismen/cm³, vorzugsweise zwischen 10⁵ und 10¹² Mikroorganismen/cm³ der Zusammensetzung im flüssigen Zustand liegt.
Ist der In-vivo-Erzeuger ein rekombinantes Plasmid, beträgt seine Konzentration in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung in der Regel zwischen 0,01 g/dm³ und 100 g/dm³ der Zusammensetzung im flüssigen Zustand.
Die Form der Antigenkonzentrate hängt im Wesentlichen von der Art, wie die Antigene aus dem Organismus extrahiert werden, oder von dem Molekül, das sie enthält, und von ihrer Art ab. Die Antigenkonzentrate sind nicht an sich ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Sie können in flüssiger Form, beispielsweise als Überstände von Antigenmaterialien oder Konzentrate von Überständen von Antigenmaterialien, oder alternativ in fester Form, wie Lyophilisate, bereitgestellt werden.
Die Zusammensetzung, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, kann ein oder mehrere Antigene und eine oder mehrere Antigenphasen umfassen.
Unter einem ersten besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ihr Gegenstand eine Zusammensetzung, wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigenmedium aus einem Lyophilisat von Antigenmaterial besteht.
Unter einem zweiten besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ihr Gegenstand eine Zusammensetzung, wie vorstehend definiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigenmedium eine wässrige oder wässrig-alkoholische Phase von Antigenmaterial ist.
Die Lösungsmittel, die die Antigenphase bilden, sind zum Beispiel Wasser, PBS-Puffer, TRIS-Puffer oder ein Gemisch davon.
Der Begriff Hilfsstoff bezeichnet im Kontext der vorliegenden Erfindung Produkte, welche die Reaktionen des Immunsystems steigern, wenn sie in Gegenwart von Antigenmaterial, gleich ob viralen, bakteriellen, parasitischen oder synthetischen Ursprungs, verabreicht werden. Sie verursachen das massive Auftreten von Makrophagen an der Injektionsstelle und dann in den Lymphknoten sowie einen Anstieg in der Produktion spezifischer Immunglobuline, der Antikörper, und sie stimulieren somit zahlreiche Zellen, die an Immunabwehrmechanismen beteiligt sind.
Die Art dieser Hilfsstoffe ist vielfältig. Sie können anorganische Salze, die in Wasser löslich oder unlöslich sind, wässrige oder wässrig-alkoholische Lösungen von Salzen, organische Verbindungen, Öle oder Mischungen dieser verschiedenen Typen von Hilfsstoffen sein. Die Phase, die einen oder mehrere Hilfsstoffe enthält, wird im Folgenden als Hilfsstoffphase bezeichnet.
Als übliche Hilfsstoffe in Salzform gibt es auch Metallsalze, wie Aluminiumhydroxid, Cernitrat, Zinksulfat, kolloidales Eisenhydroxid oder Calciumchlorid. Unter diesen wird Aluminiumhydroxid am häufigsten verwendet. Diese Hilfsstoffe sind in dem Artikel von Rajesh K. Gupta et al., "Adjuvants, balance between toxicity and adjuvanticity", Vaccine, Bd. 11, Ausgabe 3, 1993, Seiten 993-306 beschrieben.
Als Beispiele für wasserlösliche Salze gibt es Salze von Metallkationen und organischen Säuren, die mindestens eine Phosphorsäuregruppe oder eine Carboxylgruppe besitzen, wie Salze von Glycerophosphor-, Essig-, Milch-, Wein-, Äpfel-, Zitronen-, Brenztrauben-, Glucon-, Glucuron-, Fructohepton-, Gluconohepton- oder Glucohepton-, Glutamin- und Asparaginsäure oder Methionin. Diese Salze von Metallkationen werden insbesondere aus den Salzen von Mangan, Aluminium, Calcium oder Zink ausgewählt, wie beispielsweise Mangangluconat, Calciumgluconat, Zinkgluconat, Calciumfructoheptonat, Calciumglycerophosphat, lösliches Aluminiumacetat und Aluminiumsalicylat. Einige dieser Hilfsstoffe sind in den internationalen Patentanmeldungen beschrieben, die unter den Nummern WO 96/32964 und WO 98/17311 veröffentlicht sind.
Wenn wasserlösliche Salze in der Zusammensetzung, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, vorhanden sind, beträgt ihre Gesamtkonzentration zwischen 0,02 mg/cm³ und 3000 mg/cm³, vorzugsweise 0,1 mg/cm³ und 1000 mg/cm³ und insbesondere von 0,1 mg/cm³ bis 150 mg/cm³ der Zusammensetzung im flüssigen Zustand.
Als andere Hilfsstoffe gibt es ferner oberflächenaktive Mittel oder Gemisch von oberflächenaktiven Mitteln mit einer Gesamt-HLB-Zahl zwischen 5 und 15. Für die Zwecke vorliegenden Erfindung wird die HLB-Zahl durch die Formel HLB = 20(1 – I_s/I_a) berechnet, wobei I_s für den Verseifungswert und I_a für den Säurewert des oberflächenaktiven Mittels oder des Gemischs von oberflächenaktiven Mitteln steht. Diese beiden Werte, Verseifungswert und Säurewert, werden durch Verfahren bestimmt, die in der europäischen Pharmakopoe beschrieben sind.
Als Beispiele für derartige oberflächenaktive Mittel gibt es modifizierte Fettsubstanzen mit einer Gesamt-HLB-Zahl zwischen 6 und 14. Die modifizierten Fettsubstanzen können anorganischen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs sein. Als modifizierte Fettsubstanzen anorganischen Ursprungs gibt es modifizierte Öle des Erdölursprungs. Als modifizierte Fettsubstanzen pflanzlichen Ursprungs gibt es modifizierte Pflanzenöle, wie modifiziertes Erdnuss-, Oliven-, Sesam-, Sojabohnen-, Weizenkeim-, Traubenkern-, Sonnenblumen-, Rizinus-, Leinsamen-, Mais-, Kopra-, Palm-, Nuss-, Haselnuss- oder Rapsöl. Als modifizierte Fettsubstanzen tierischen Ursprungs gibt es zum Beispiel modifiziertes Spermacetiöl oder modifiziertes Talgöl.
Der Ausdruck modifizierte Fettsubstanzen bezeichnet im Allgemeinen die alkoxylierten Derivate von Fettsubstanzen und, genauer gesagt, die alkoxylierten Derivate von Ölen oder die alkoxylierten Derivate von Alkylestern von Ölen und insbesondere die ethoxylierten und/oder propoxylierten Derivate von Ölen oder die ethoxylierten und/oder propoxylierten Derivate von geraden oder verzweigten Methyl-, Ethyl-, Propyl-, oder geraden oder verzweigten Butylestern dieser Öle. Der Gegenstand der Erfindung ist, genauer gesagt, eine Zusammensetzung, wie vorstehend definiert, in der, wenn der Hilfsstoff eine modifizierte Fettsubstanz oder eine Mischung modifizierter Fettsubstanzen ist, die Letzteren aus den ethoxylierten Derivaten von Ölen mit einer EO-Anzahl zwischen 1 und 60 und insbesondere aus den alkoxylierten Derivaten von Maisöl, Gemischen von alkoxylierten Derivaten von Maisöl mit einer Gesamt-HLB-Zahl zwischen 10 und 14 oder aus den ethoxylierten Derivaten von Rizinusöl oder Gemischen von alkoxylierten Derivaten von Rizinusöl mit einer Gesamt-HLB-Zahl zwischen 7 und 10 ausgewählt sind.
Wenn oberflächenaktive Mittel oder Gemische von oberflächenaktiven Mitteln mit einer Gesamt-HLB-Zahl zwischen 5 und 15 in der Zusammensetzung vorliegen, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, liegt ihre Gesamtkonzentration zwischen 0,2 mg/cm³ und 500 mg/cm³, insbesondere zwischen 2 mg/cm³ und 500 mg/cm³ des Hilfsstoffs und vorzugsweise zwischen 50 mg/cm³ und 200 mg/cm³ der Zusammensetzung im flüssigen Zustand.
Als andere Hilfsstoffe gibt es ferner die alkoxylierten Derivate von Estern von Fettsäuren und Polyolen oder die alkoxylierten Derivate von Ethern von Fettalkoholen und Polyolen und insbesondere die Triglyceride alkoxylierter Fettsäuren, die alkoxylierten Ester von Polyglycerin und Fettsäuren, die alkoxylierten Ester von Fettsäuren mit einem Hexol, wie beispielsweise Sorbit oder Mannit, oder die alkoxylierten Ester von Fettsäuren mit einem Hexolanhydrid, wie Sorbitan oder Mannitan.
Als Fettsäuren, die sich für die Herstellung dieser modifizierten Ester ganz besonders eignen, gibt es diejenigen, die 12 bis 22 Kohlenstoffatome umfassen, vorteilhafterweise eine Fettsäure, die bei 20°C flüssig ist, wie zum Beispiel diejenigen, die 16 bis 18 Kohlenstoffatome umfassen, wie Oleinsäure, Ricinoleinsäure oder Isostearinsäure. Als Beispiele für diese Derivate gibt es ethoxylierte Derivate von Mannitanoleat mit einer EO-Anzahl zwischen 5 und 15 und vorzugsweise zwischen 7 und 11.
Als weitere Beispiele für Hilfsstoffe gibt es die Saponine, die Lecithine oder die Zusammensetzungen, die Folgendes umfassen:

a) eine Verbindung der Formel (I): R₁-O-(G)_x-H (I)worin R₁ für einen gesättigten oder ungesättigten, geraden oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest steht, der 1 bis 30 Kohlenstoffatome umfasst, G für den Rest eines Saccharids steht und x für eine Dezimalzahl zwischen 1 und 5 steht, oder ein Gemisch von Verbindungen der Formel (I), und wenn gewünscht
b) eine Verbindung der Formel (II): R₂-OH (II)worin R₂ unabhängig von R₁ für einen gesättigten oder ungesättigten, geraden oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest steht, der 8 bis 30 Kohlenstoffatome umfasst, oder ein Gemisch von Verbindungen der Formel (II).

Der Ausdruck Rest eines Saccharids bezeichnet für G einen zweiwertigen Rest, der sich ergibt, wird an einem Zuckermolekül einerseits ein Wasserstoffatom aus einer seiner Hydroxylgruppen und andererseits die anomere Hydroxylgruppe entfernt. Der Begriff Saccharid bezeichnet insbesondere Glucose oder Dextrose, Fructose, Mannose, Galactose, Altrose, Idose, Arabinose, Xylose, Ribose, Gulose, Lyxose, Maltose, Maltotriose, Lactose, Cellobiose, Dextran, Talose, Allose, Raffinose, Lävoglucan, Cellulose oder Stärke. Die oligomere Struktur (G)_x kann in jeder Isomerieform vorkommen, gleich ob dies optische Isomerie, geometrische Isomerie oder Positionsisomerie umfasst; sie kann auch ein Gemisch von Oligomeren darstellen.
Die Zahl x, die in der Formel (I) den durchschnittlichen Grad an Polymerisation des Saccharids angibt, liegt insbesondere zwischen 1 und 3, insbesondere zwischen 1,05 und 2,5, ganz besonders zwischen 1,1 und 2,0, und ist vorzugsweise kleiner oder gleich 1,5.
G stellt insbesondere den Glucoserest oder den Xyloserest dar.
Der Rest R₁ stellt insbesondere einen Rest dar, der aus 5 bis 22 Kohlenstoffatomen besteht und aus den Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Tridecyl-, Tetradecyl-, Pentadecyl-, Hexadecyl-, Heptadecyl-, Octadecyl-, Nonadecyl-, Eicosyl-, Uneicosyl-, Docosyl-, Heptadecenyl-, Eicosenyl-, Uneicosenyl-, Docosenyl-, Heptadecadienyl- oder Decenylresten ausgewählt ist, wobei die Reste gerade oder verzweigt sind. R₁ stellt vorzugsweise einen Rest dar, der von 8 bis 20 Kohlenstoffatomen enthält, wobei die Reste gerade oder verzweigt sind.
R₂ stellt insbesondere einen Rest dar, der von 8 bis 22 Kohlenstoffatomen enthält und aus den Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Tridecyl-, Tetradecyl-, Pentadecyl-, Hexadecyl-, Heptadecyl-, Octadecyl-, Nonadecyl-, Eicosyl-, Uneicosyl-, Docosyl-, Heptadecenyl-, Eicosenyl-, Uneicosenyl-, Docosenyl-, Heptadecadienyl- oder Decenylresten ausgewählt ist, wobei die Reste gerade oder verzweigt sind.
Wenn das Gemisch, wie oben definiert, mindestens eine Verbindung der Formel (I) und mindestens eine Verbindung der Formel (II) umfasst, ist das Gewichtsverhältnis von Verbindung der Formel (I)/Verbindung der Formel (II) gewöhnlich zwischen 10/90 und 90/10, insbesondere zwischen 10/90 und 60/40.
Als andere Hilfsstoffe gibt es Öle, insbesondere Öle, die für ihre geringe Toxizität bekannt sind, gleich ob Mineralöle, synthetische Öle, pflanzliche Öle oder tierische Öle.
Als Beispiele für Mineralöle gibt es weiße Mineralöle in Übereinstimmung mit den Vorschriften FDA 21 CFR 172.878 und CFR 178.3620 (a), wie beispielsweise MARCOL^TM 52, ein kommerziell erhältliches Öl, das der Definition flüssiger Paraffine des französischen CODEX entspricht, oder DRAKEOL^TM 6VR.
Als Beispiele für synthetische Öle gibt es Polyisoprene, Polyisobutene, hydriertes Polyisobuten, die unter der Bezeichnung PARLEAM-POLYSYNLANE^TM vermarktet werden und in: Michel und Irene Ash; Thesaurus of Chemical Products, Chemical Publishing Co, Inc. 1986, Band 1, Seite 211 (ISBN 0 7131 3603 0) genannt sind, Squalan, das unter der Bezeichnung PHYTOSQUALAN^TM vermarktet und in den Chemical Abstracts unter der Nummer RN = 111-01-3 identifiziert wird; es handelt sich um ein Gemisch von Kohlenwasserstoffen, das mehr als 80 Gew.-% 2,6,10,15,19,23-Hexamethyltetracosan enthält; zudem gibt es Squalen, Isohexadecan, in den Chemical Abstracts unter der Nummer RN = 93685-80-4 identifiziert, wobei es sich um ein Gemisch von C₁₂-, C₁₆- und C₂₀-Isoparaffinen handelt, das mindestens 97% C₁₆-Isoparaffine enthält, unter denen der Hauptbestandteil 2,2,4,4,6,8,8-Heptamethylnonan (RN = 4390-04-9) ist; Isododecan.
Als weitere Beispiele für synthetische nicht-mineralische Öle gibt es die Ester von Alkoholen und Fettsäuren, wie Ethyloleat, Isopropylmyristat, Oleyloleat, Mono-, Di- oder Triglyceride von Fettsäuren oder die Ester von Propylenglycol.
Als Beispiele für Öle pflanzlichen Ursprungs gibt es Erdnuss-, Oliven-, Sesam-, Sojabohnen-, Weizenkeim-, Traubenkern-, Sonnenblumen-, Rizinus-, Leinsamen-, Mais-, Kopra-, Palm-, Nuss-, Haselnuss- oder Rapsöle.
Als Beispiel für einen öligen Hilfsstoff sind die Freundschen Adjuvantien sehr wirksam; sie ergeben sich aus der Kombination eines Mineralöls und eines Mannitesters, die ein abgetötetes oder anderes Mycobacterium enthält.
Als Beispiele für Öle tierischen Ursprungs gibt es Squalan, Squalen oder Spermacetiöl.
Wenn die Zusammensetzung, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, in flüssigem Zustand, einer Emulsion, vorliegt, wird das Öl gewöhnlich mit einem oder mehreren nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln kombiniert, die vorzugsweise pharmazeutisch annehmbar sind. Sie sollten insbesondere frei von Schwermetallen sein und sehr kleine Säure- oder Peroxidwerte aufweisen. Es ist ebenfalls wünschenswert, dass sie die Standards für Sicherheitstests, wie beispielsweise die von S. S. Berllin, Annals of Allergy, 1962, 20, 473 beschriebenen, oder die Standards für Tests von anomaler Toxizität, die in der europäischen Pharmacopoe beschrieben sind, erfüllen.
Als Beispiele für oberflächenaktive Mittel, die mit einem Öl in der gleichen Hilfsstoffphase vereinigt werden können, gibt es diejenigen, von zuvor beschrieben wurde, dass ihnen Hilfsstoffeigenschaften innewohnen. Allgemeiner gesagt, gibt es nichtionische oberflächenaktive Mittel der folgenden chemischen Familien:

– Die Ester oder Ether von Fettsäuren und einem Zucker, wie Sorbit, Mannit, Saccharose oder Glucose;
– die Ester von Fettsäuren und Glycerin oder einem
Polyol;
– die hydrophilen Derivate dieser Ester, die durch Pfropfen funktioneller Alkohol-, Etheroxid-, Amin- oder Amidgruppen erhalten werden,
– Lecithine,
– ethoxylierte und/oder propoxylierte Fettalkohole oder -säuren;
– die Fettketten dieser oberflächenaktiven Mittel, die 8 bis 22 Kohlenstoffatome umfassen.

Unter diesen oberflächenaktiven Mitteln haben die Bevorzugten eine Fettkette, die 14 bis 20 Kohlenstoffatome umfasst, und sind insbesondere Olein-, Ricinolein- und Ketostearinsäuren und Derivate davon und insbesondere Mannitoleate und die Derivate von Mannitoleaten, die durch Pfropfen hydrophiler funktioneller Gruppen, wie zum Beispiel funktioneller Amid-, Amin-, Alkohol-, Polyol- oder Carboxylgruppen oder von Ethoxy-, Propoxy- und/oder Butoxyresten erhalten werden, oder Mannitanoleate oder Derivate davon; sie werden durch Dehydratisierung der polyhydroxylierten Kohlenstoffkette von Mannit, die an der 1-4- oder 2-6-Position zyklisiert wird, erhalten.
Wenn ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel oder ein Gemisch nichtionischer oberflächenaktiver Mittel in einer Impfstoffzusammensetzung, kombiniert mit einem Öl, um seine emulgierenden Eigenschaften hervorzuheben, vorliegt, liegt seine Konzentration im Allgemeinen zwischen 0,01 mg/ml und 500 mg/ml und vorzugsweise zwischen 0,1 mg/ml und 200 mg/ml.
Als Beispiele für Kombinationen von Ölen mit einem nichtionischen Detergenz gibt es die Produkte, die unter der Bezeichnung MONTANIDE^TM vermarktet werden, deren Eigenschaften in der folgenden Tabelle dargestellt sind:

*PEG: Polyethylenglycol

In diesem Fall bildet die Ölphase im festem Zustand insbesondere die unterste Phase der Zusammensetzung. Tatsächlich wurde beobachtet, dass bei diesem Aufbau durch einfaches manuelles Rühren bei Raumtemperatur leichter eine Emulsion erhalten wurde.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann ein herkömmliches immunstimulierendes Mittel, wie Avridine^®, N,N-Dioctadecyl-N',N'-bis(2-hydroxyethyl)propandiamin, MDP-(Muramyldipeptid-)Derivate, insbesondere Threonyl-MDP, Mycolsäurederivate oder Derivate von Lipid A, enthalten.
Die Phase oder die Phasen, die den (die) Hilfsstoff(e) ausmacht/en, wird/werden im Folgenden als Hilfsstoffphase bezeichnet. Die Zusammensetzung, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, kann eine oder mehrere Hilfsstoffphasen enthalten.
Die Zusammensetzung, wie vorstehend definiert, kann zusätzlich eine oder mehrere Verdünnungsmittelphasen für mindestens eine der Antigenphasen enthalten, deren Verdünnungsmittelcharakter sich im flüssigen Zustand zeigt und die von der Antigenphase oder von den Antigenphasen und von der Hilfsstoffphase oder den Hilfsstoffphasen verschieden ist/sind, wenn die Zusammensetzung im festen Zustand vorliegt.
Die Zusammensetzung, wie vorstehend definiert, kann zusätzlich eine oder mehrere Verdünnungsmittelphasen für mindestens eine der Hilfsstoffphasen enthalten, deren Verdünnungsmittelcharakter sich im flüssigen Zustand zeigt und die von der Antigenphase oder von den Antigenphasen und von der Hilfsstoffphase oder den Hilfsstoffphasen verschieden ist/sind, wenn die Zusammensetzung im festen Zustand vorliegt.
Unter einem dritten besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht die Zusammensetzung, wie vorstehend definiert, aus einer Antigenphase und einer öligen Hilfsstoffphase.
Unter einem vierten besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht die Zusammensetzung, wie vorstehend definiert, aus einer Antigenphase, einer öligen Hilfsstoffphase und einer Verdünnungsmittelphase für die Antigenphase.
Bei den beiden letzteren Bauweisen bildet in der Zusammensetzung, wie vorstehend definiert, im festen Zustand die ölige Phase vorzugsweise die unterste Schicht und die Antigenphase die oberste Schicht.
Genauer gesagt, ist zur Herstellung einer Zusammensetzung, die aus einer Antigenphase, einer öligen Hilfsstoffphase und gegebenenfalls einer Verdünnungsmittelphase für die Antigenphase besteht, bei dem Verfahren, wie vorstehend definiert, die im Schritt a) verwendete Phase die ölige Hilfsstoffphase, die im Schritt b) verwendete Phase entweder die Verdünnungsmittelphase, wenn die Zusammensetzung eine solche umfasst, oder die Antigenphase, und die Phase, die gegebenenfalls im Schritt c) verwendet wird, die Antigenphase.
Noch genauer gesagt, umfasst das Verfahren zur Herstellung einer Impfstoffemulsion aus einer Antigenphase und einer öligen Phase, die aus einer Kombination von einem oder mehreren Ölen mit einem oder mehreren nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln besteht, die folgenden hauptsächlichen Schritte:

(a) Erforderliche Volumina der öligen Phase werden in gewünschte Primärbehälter aliquotiert, in die Gasphase mit ultraniedriger Temperatur von flüssigem Stickstoff eingebracht und schockgefroren;
(b) die aus Schritt (a) erhaltene gefrorene Phase wird kurzfristig aus der Niedrigtemperaturumgebung entnommen, und das benötigte Volumen an wässrigem Puffer wird vorsichtig oben auf die gefrorene Phase geschichtet, wodurch zwei unterscheidbare Schichten oder Schichtungen erhalten werden; dies wird sofort wieder in die Umgebung mit ultraniedriger Temperatur zurück gestellt, um den wässrigen Puffer schockzugefrieren;
(c) die aus Schritt (b) erhaltene geschichtete Kombination wird kurzfristig aus der Niedrigtemperaturumgebung entnommen, und das benötigte Volumen an konzentriertem Antigen wird dann vorsichtig oben auf die gefrorene Pufferschicht der geschichteten Kombination geschichtet, wodurch eine dritte unterscheidbare Schichte oder Schichtung erhalten wird; dies wird sofort wieder in die Umgebung mit ultraniedriger Temperatur zurück gestellt, um das Antigenkonzentrat schockzugefrieren.

Unter einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ihr Gegenstand die Zusammensetzung, wie vorstehend definiert, zur Durchführung eines Verfahrens zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers mittels subkutaner Injektion, intramuskulärer Injektion oder intravenöser Injektion.
Genauer gesagt, wird, wenn erforderlich, der geschichtete und kryogenisch gelagerte (SACS-)Impfstoff bei Raumtemperatur aufgetaut, durch einfaches Schütteln vermischt und in den Zielwirt verabreicht.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann als präventives oder kuratives Medikament verwendet werden. Je nach der Art des Antigens oder des In-vivo-Erzeugers kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung an Fische, Crustaceen, wie Krabben, Geflügel, insbesondere Gänse, Truthähne, Tauben und Hühner, an Canidae, wie Hunde, an Felidae, wie Katzen, an Schweine, Primaten, Bovidae, Ovidae und an Pferde verabreicht werden.
Unter einem letzten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ihr Gegenstand ein Verfahren zur Gefrierkonservierung einer Zusammensetzung, die aus einer Antigenphase, einer öligen Hilfsstoffphase und gegebenenfalls einer Verdünnungsmittelphase für die Antigenphase besteht, wobei das Antigenmedium eine Phase ausmacht, die sich von der Hilfsstoffphase unterscheidet, wenn die Zusammensetzung im festen Zustand ist, wobei die Zusammensetzung im flüssigen Zustand ist, wenn die Temperatur größer oder gleich 4°C ist, dadurch gekennzeichnet, dass

a) eine erste der Hilfsstoff-, Verdünnungsmittel- oder Antigenphasen, die bei Raumtemperatur flüssig ist, auf eine Temperatur von kleiner oder gleich ihrem Erstarrungspunkt gebracht wird, so dass eine erste feste Phase erhalten wird,
b) eine zweite der anderen Antigen-, Hilfsstoff-, oder Verdünnungsmittelphasen im flüssigen Zustand über die in a) hergestellte feste Phase gegeben wird, und dann die neue Kombination auf eine Temperatur kleiner oder gleich dem niedrigsten Erstarrungspunkt der beiden Phasen gebracht wird, so dass eine feste Kombination mit zwei verschiedenen Phasen erhalten wird,
c) gegebenenfalls eine neue Antigen-, Hilfsstoff- oder Verdünnungsmittelphase im flüssigen Zustand über die in Schritt b) hergestellte feste Kombination gegeben wird, und dann die neue Kombination auf eine Temperatur kleiner oder gleich dem niedrigsten Erstarrungspunkt der drei Phasen gebracht wird, so dass eine feste Kombination mit drei verschiedenen Phasen erhalten wird,
d) die so gefrorene Zusammensetzung bei einer Temperatur gehalten wird, die kleiner ist als der niedrigste Gefrierpunkt der Phasen, die sie ausmachen.

Unerwarteterweise wurde beobachtet, dass zwar Impfstoffe in Form von Wasser-in-Ö1-W/O-), Öl-in-Wasser-(O/W-) und Wasser-in-Öl-in-Wasser-(W/O/W-)Emulsionen ihre Aktivität verloren, nachdem sie 7 Monate lang bei –20°C gelagert wurden, dass aber diejenigen, die gemäß dem Verfahren, wie vorstehend definiert, unter den gleichen Bedingungen von Temperatur und Dauer gelagert wurden, genauso aktiv blieben.
Genauer gesagt, ist zur Konservierung einer Zusammensetzung, die aus einer Antigenphase, einer öligen Hilfsstoffphase und gegebenenfalls einer Verdünnungsmittelphase für die Antigenphase besteht, bei dem Verfahren, wie vorstehend definiert, die im Schritt a) verwendete Phase die öligen Hilfsstoffphase, die im Schritt b) verwendete Phase entweder die Verdünnungsmittelphase, wenn die Zusammensetzung eine solche enthält, oder die Antigenphase, und die Phase, die gegebenenfalls im Schritt c) verwendet wird, die Antigenphase.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, jedoch ohne sie zu beschränken.
1. ERSTE REIHE VON EXPERIMENTEN
A. Herstellung von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
5-Milliliter-(ml)-Dosen des Impfstoffs zur Behandlung von Maul-und-Klauen-Seuche wurden auf folgende Weise hergestellt:

1 – 2,5-ml-Proben von MONTANIDE^TM ISA 206, das aus der Kombination von etwa 2,15 ml injizierbarem Mineralöl mit 0,35 ml eines Gemischs aus Mannitanoleat und PEG 500 besteht, werden bei etwa –18°C eingefroren;
2 – Nach dem Einfrieren werden die Proben aus dem Gefrierschrank entnommen, sofort mit 2,45 ml Phosphatpuffer (PBS) versetzt und dann erneut eingefroren;
3 – wiederum werden die Proben aus dem Gefrierschrank entnommen und sofort mit 0,05 ml Konzentrat versetzt, das 10 mg/ml Antigen der Maul-und-Klauen-Seuche enthält, und erneut eingefroren, um die Impfstoffzusammensetzungen A_i herzustellen.

B. Herstellung von Zusammensetzungen des Standes der Technik
5-ml-Dosen von Impfstoffen zur Behandlung von Maul-und-Klauen-Seuche bei Ovinen werden hergestellt, indem 2,5 ml eines öligen Hilfsstoffs, MONTANIDE^TM ISA 206, der aus der Kombination von etwa 2,25 ml injizierbarem Mineralöl mit 0,25 ml eines Gemischs aus Mannitanoleat besteht, das gemäß dem in der internationalen Veröffentlichung WO 91/00106 beschriebenen Verfahren emulgiert wird, in 2,5 ml einer PBS-Lösung, die 0,5 mg Maul-und-Klauen-Antigen enthält, eingemischt werden, um Impfstoffzusammensetzungen in Form von Wasser-Öl-Wasser Emulsionen herzustellen (Zusammensetzungen B_j).
C. Vergleichende Studie der Impfstoffwirksamkeit
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Impfstoffe wird untersucht, indem sie mit der Wirksamkeit von Placebodosen von 5 ml, die 2,5 ml MONTANIDE^TM ISA 206 und 2,5 ml PBS-Puffer enthalten, (Zusammensetzungen P_k) und mit denjenigen des Standes der Technik verglichen werden.
Studie 1
Es wird 1 ml verschiedener Konzentrationen von Antigenen in Gruppen von 5 Meerschweinchen unter Verwendung der Zusammensetzungen A_i injiziert, die sofort nach dem Auftauen, gegebenenfalls Verdünnen in PBS und manuellem Rühren, um eine Emulsion kurz vor der Injektion herzustellen, verwendet werden. Das gleiche Verfahren wird mit Placebozusammensetzungen durchgeführt.
Die Impfstoffaktivität wird nach einer Auffrischungsinjektion nach 28 Tagen mittels ELISA-Assay des IG1, um die humorale Immunantwort zu bestimmen, und des IG2a, um die zelluläre Immunantwort zu bestimmen, ermittelt.
Für jede Gruppe von fünf Meerschweinchen wird die Anzahl an Tieren gezählt, die 90 Tage nach der ersten Impfung geschützt sind.
Die Ergebnisse sind, ausgedrückt als % geschützter Tiere, in der folgenden Tabelle dargestellt:
Studie 2
Es wird 1 ml verschiedener Konzentrationen von Antigenen in Gruppen von 5 Meerschweinchen unter Verwendung der Zusammensetzungen A₄ injiziert, die 7 Monate bei –20°C gelagert wurden und sofort nach dem Auftauen, gegebenenfalls Verdünnen in PBS und manuellem Rühren, um eine Emulsion kurz vor der Injektion herzustellen, verwendet werden. Das gleiche Verfahren wird mit den Placebozusammensetzungen P₄ und einer WOW-Emulsion (Zusammensetzung B₄), die 7 Monate bei –20°C gelagert wurde, durchgeführt. Die Impfstoffaktivität wird nach einer Auffrischungsinjektion nach 28 Tagen mittels ELISA-Assay des IG1, um die humorale Immunantwort zu bestimmen, und des IG2a, um die zelluläre Immunantwort zu bestimmen, ermittelt. Für jede Gruppe von fünf Meerschweinchen wird die Anzahl an Tieren, die 90 Tage nach der ersten Impfung geschützt sind, gezählt, und der PD₅₀-Index, der den Grad der Verdünnung angibt, unterhalb dessen weniger als 50% der Gruppe geschützt sind, wird bestimmt. Die Ergebnisse sind, ausgedrückt als % geschützter Tiere, in der folgenden Tabelle dargestellt:
Ein PD₅₀-Index gleich 106,5, der einer Verdünnung der Zusammensetzung von etwa 1/100 entspricht, wird für die Zusammensetzungen A₄ durch Extrapolation abgeleitet, und ein PD₅₀-Index gleich 46,71, der einer Verdünnung der Zusammensetzung von etwa 1/50 entspricht, wird für die Zusammensetzungen B₄ durch Extrapolation abgeleitet.
Diese Studie zeigte, dass eine Impfstoffzusammensetzung, die im festen Zustand eine Antigenphase und eine Hilfsstoffphase umfasst, die in Bezug zueinander unterschiedlich sind, wobei der Begriff unterschiedlich in der Definition verstanden wird, die in der vorliegenden Beschreibung gegeben wird, wenn sie an 7-monatiger Lagerung bei 20°C verwendet wird, wirksamer ist als eine Impfstoffzusammensetzung, die die gleichen Bestandteile enthält, die aber für den gleichen Zeitraum und bei der gleichen Temperatur in Form einer Emulsion (gefroren) der verschiedenen Phasen gelagert wurde.
Studie 3
Es wird 1 ml verschiedener Konzentrationen von Antigenen in Gruppen von 5 Meerschweinchen unter Verwendung von erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen injiziert, die 7 Monate bei –20°C gelagert, aufgetaut, bei +4°C (im flüssigen Zustand) für 4 Monate (Zusammensetzungen A₅) oder 7 Monate (Zusammensetzung A₆) gelagert und in verschiedenen optionalen [Lacuna] in PBS verwendet werden. Das gleiche Verfahren wird mit den Placebozusammensetzungen P₅ und P₆ durchgeführt. Die Impfstoffaktivität wird nach einer Auffrischungsinjektion nach 28 Tagen mittels ELISA-Assay der IG1, um die humorale Immunantwort zu bestimmen, und des IG2a, um die zelluläre Immunantwort zu bestimmen, ermittelt. Für jede Gruppe von fünf Meerschweinchen wird die Anzahl an Tieren, die 90 Tage nach der ersten Impfung geschützt sind, gezählt. Die Ergebnisse sind, ausgedrückt als % geschützter Tiere, in der folgenden Tabelle dargestellt:
Diese Studie zeigte, dass die Gefrierdauer keine schädliche Wirkung auf die anschließende Lagerung der Impfstoffzusammensetzung im flüssigen Zustand hatte. Im Fall dringender Eingriffe können die erfindungsgemäßen gefrorenen Zusammensetzungen daher unter identischen Kühlbedingungen, wie im Stand der Technik, (+ 4°C) an den Ort ihrer Verwendung transportiert werden.
2. ZWEITE REIHE VON EXPERIMENTEN
A. Impfstoffherstellung
Impfstoffformulierungen, die inaktiviertes FMDV-O₁-Lausanne-Antigen entweder als Wasser-in-Öl-in-Wasser-(W/O/W-) Emulsion mit Montanide^TM ISA 206 oder als Öl-in-Wasser-(O/W-) Emulsion mit Montanide^TM ISA 25 enthielten, wurden auf herkömmliche Weise (Barnett et al., Vaccine 14 (13), Seiten 1187-1198; 1996) oder durch das neue Verfahren unter Verwendung von Antigenkonzentrat, das von der International Vaccine Bank (IVB) über flüssigem Stickstoff gehalten wird, mit einem PD₅₀-Wert von 41 pro boviner Dosis hergestellt.
Der formulierte Impfstoff enthielt 5,62 μg 1465-Antigen pro boviner 2-ml-Dosis.
Das neue Formulierungsverfahren beinhaltete 4 hauptsächliche Schritte wie folgt:

1. Die Öl-Hilfsstoffe Montanide ISA 206 oder 25 wurden in dem erforderlichen Volumen in den gewünschten Primärbehälter aliquotiert, in die Gasphase mit ultraniedriger Temperatur von flüssigem Stickstoff eingebracht und schockgefroren.
2. Der gefrorene Öl-Hilfsstoff wird dann kurzfristig aus der Niedrigtemperaturumgebung entnommen, und das benötigte Volumen an wässrigem Puffer wird vorsichtig oben auf den gefrorenen Öl-Hilfsstoff geschichtet, wodurch zwei unterscheidbare Schichten oder Schichtungen erhalten werden. Dies wird sofort und vorsichtig wieder in die Gasphase mit ultraniedriger Temperatur von flüssigem Stickstoff zurück gestellt, um den wässrigen Puffer schockzugefrieren.
3. Die Schichten von gefrorenem Öl-Hilfsstoff und wässrigem Puffer werden wiederum kurzfristig aus der Niedrigtemperaturumgebung entnommen, und das benötigte Volumen an konzentriertem Antigen wird dann oben auf den gefrorenen Puffer geschichtet. Dies wird sofort wieder in die Umgebung mit ultraniedriger Temperatur zurück gestellt, um das Antigenkonzentrat schockzugefrieren.
4. Wenn erforderlich, wird der geschichtete und kryogenisch gelagerte (SACS-) Impfstoff bei Raumtemperatur aufgetaut, durch einfaches Schütteln vermischt und in den Zielwirt verabreicht.

Zu Vergleichszwecken wurden herkömmlich formulierte Impfstoffe, die Montanide ISA 206 und 25 als Hilfsstoffe enthielten, ebenfalls schockgefroren, indem sie in die Gasphase mit ultraniedriger Umgebung von flüssigem Stickstoff eingebracht wurden.
B. In-vivo-Tests der Stärke
Impfstoffzubereitungen wurden an weiblichen Duncan-Hartley-Meerschweinchen mit einem Gewicht von etwa 400-500 g getestet. Jede Gruppe von fünf Tieren erhielt ein spezifisches Impfstoffvolumen, entweder 1 ml, 0,33 ml oder 0,11 ml, das subkutan verabreicht wurde. Die Tiere wurden 28 Tage nach der Impfung mit 3 × 10³ ID₅₀ des homologen, an Meerschweinchen angepassten Virus, der auf intraplantarem Weg verabreicht wurde, angeregt. Alle Tiere wurden 7-10 Tage genau überwacht, und immunisierte Meerschweinchen wurden als geschützt angesehen, wenn sich das Virus nicht über die Anregungsstelle hinaus generalisieren konnte.
Spätere Experimente schlossen Verdünnungen des Impfstoffs anstelle der vorstehend beschriebenen Dosis mit verringertem Volumen ein. Im Wesentlichen wurden die Impfstoffe in einem ähnlich formulierten Impfstoff verdünnt, der die Antigenkomponente nicht enthielt, so dass das Antigen, aber nicht der Hilfsstoff verdünnt wurde. Der verwendete Verdünnungsbereich war dreifach von rein bis 1/81. Wiederum wurden die Tiere 28 Tage nach der Impfung mit 3 × 10³ ID₅₀ des homologen, an Meerschweinchen angepassten Virus, der auf intraplantarem Weg verabreicht wurde, angeregt und wie vorstehend beschrieben überwacht. Dieser Verdünnungsbereich gestattete es, die Stärke (PD₅₀) des Impfstoffs mit dem Verfahren von Karber (Karber, Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 1931, 162, 480) zu berechnen.
Ergebnisse
In der ersten Studie wurden SACS-Impfstoffe entweder auf Basis von Montanide^TM ISA 206 oder Montanide^TM ISA 25 hinsichtlich ihrer Stabilität bei ultraniedriger Temperatur über einen Zeitraum von 7 Monaten untersucht. Unter Verwendung eines Schemas mit geteilten Dosen waren die Ergebnisse ermutigend und zeigten, dass in Abwesenheit von jeglichem Verlust an Impfstoffstärke das Verfahren für keine der Formulierungen mit Hilfsstoff schädlich war (Tabelle 1). Tabelle 1: Stärke von SACS-Impfstoffen auf Basis von Impfstoffen mit Montanide^TM ISA 25 (Öl-in-Wasser) und Montanide^TM ISA 206 (Wasser-in-Öl-in-Wasser) als Hilfsstoffen nach Lagerung bei +4°C für bis zu 7 Monate

*Die Zahlen zeigen die Prozent der geschützten Meerschweinchen pro Dosierungsgruppe.

In der zweiten Studie wurden SACS-Impfstoffe auf Basis von Montanide^TM ISA 206 oder ISA 25 in ebenso behandeltem Impfstoff ohne die Antigenkomponente verdünnt und mit dem PD₅₀-Wert herkömmlicherweise formulierter Impfstoffe verglichen (Tabelle 2). Tabelle 2: Untersuchung der Stärke (PD₅₀) von SACS-ISA 206- und -ISA 25-Impfstoffen

*Die Zahlen zeigen die Prozent der geschützten Meerschweinchen pro Dosierungsgruppe.
**Dies steht im Vergleich zu einem herkömmlich hergestellten Öl-Impfstoff unter Verwendung der gleichen Charge von Montanide ISA 206 mit einem PD₅₀-Wert von 46,71, der bei einer anderen Gelegenheit hergestellt wurde.

Weitere Studien zeigten, dass Proben von SACS-Impfstoffen unter Verwendung der beiden Mineralöl-Hilfsstoffe, wenn sie aufgetaut, vermischt und anschließend bei +4°C gelagert wurden, nach 7 Monaten immer noch Stärke besaßen (Tabelle 3). Dies war gut vergleichbar mit früheren Beobachtungen bezüglich herkömmlicherweise formulierter Notimpfstoffe, die aus den gleichen Hilfsstoffen bestanden (Barnett et al., Vaccine 14 (13), Seiten 1187-1198; 1996). Tabelle 3: Stärke von SACS-Impfstoffen auf Basis von Impfstoffen mit Montanide ISA 25 (Öl-in-Wasser) und 206 (Wasser-in-Öl-in-Wasser) als Hilfsstoffen nach Auftauen, Mischen und Lagerung bei +4°C für bis zu 7 Monate

Interessanterweise erzeugte das Schockgefrieren von herkömmlicherweise formulierter Ölemulsion unterschiedliche Ergebnisse und hing von dem verwendeten Öl-Hilfsstoff ab. Während ein mit ISA 25 formulierter herkömmlicher Impfstoff einen erheblichen Verlust der Stärke aufwies (Tabelle 4), schien der Impfstoff auf Basis von Montanide^TM ISA 206 nicht durch das Schockgefrieren in der Gasphase von flüssigem Stickstoff beeinflusst zu werden. Dies stand im Gegensatz zu den früheren Beobachtungen bei der Lagerung dieses Impfstofftyps bei –20°C und –70°C und deutet darauf hin, dass das neue Verfahren zur Formulierung mittels Schichtung einen größeren Vorteil für einige "formulierungsfertige" Öl-Hilfsstoffe bietet als andere. Tabelle 4: Stärke herkömmlich formulierter Impfstoffe auf Basis der Hilfsstoffe Montanide^TM ISA 25 (Öl-in-Wasser) und Montanide^TM ISA 206 (Wasser-in-Öl-in-Wasser) nach Schockgefrieren und anschließendem Auftauen

*Die Zahlen zeigen die Prozent der geschützten Meerschweinchen pro Dosierungsgruppe.
**Herkömmlicherweise formulierter Impfstoff, der in der Gasphase von flüssigem Stickstoff schockgefroren und sofort anschließend für die Verabreichung aufgetaut wurde.

Um dies weiter zu untersuchen, wurde die Stärke eines herkömmlicherweise formulierten ISA 206-Impfstoffs, der schockgefroren worden war, mit der gleichen Charge verglichen, die nicht schockgefroren, aber über Nacht bei +4°C belassen wurde (Tabelle 5). Diese Ergebnisse legen nahe, dass bei einem mit Montanide ISA 206 formulierten Impfstoff dieser gefroren gelagert werden kann, vorausgesetzt das Gefrierverfahren ist schnell und erfolgt bei sehr niedriger Temperatur. Tabelle 5: Untersuchung der Stärke (PD₅₀) von herkömmlich Formulierten mit Montanide ISA 206 als Hilfsstoff mit und ohne Schockgefrieren

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung, bestehend aus einer Antigenphase, einer öligen Hilfsstoffphase und gegebenenfalls einer Verdünnungsmittelphase für die Antigenphase, in der das Antigenmedium eine Phase ausmacht, die sich von der Hilfsstoffphase unterscheidet, wenn die Zusammensetzung im festen Zustand ist, wobei die Zusammensetzung im flüssigen Zustand ist, wenn ihre Temperatur größer oder gleich 4°C ist, dadurch gekennzeichnet, dass a) die erste Phase aus der öligen Hilfsstoff-, Verdünnungsmittel- oder Antigenphase, die bei Raumtemperatur flüssig ist, auf eine Temperatur von kleiner oder gleich ihrem Erstarrungspunkt gebracht wird, so dass eine erste feste Phase erhalten wird, b) die zweite Phase aus der öligen Hilfsstoff-, Verdünnungsmittel- oder Antigenphase im flüssigen Zustand über die in a) hergestellte feste Phase gegeben wird, und dann die neue Kombination auf eine Temperatur kleiner oder gleich dem niedrigsten Erstarrungspunkt der beiden Phasen gebracht wird, so dass eine feste Kombination mit zwei verschiedenen Phasen erhalten wird, c) gegebenenfalls die letzte aus der öligen Hilfsstoff-, Verdünnungsmittel- oder Antigenphase im flüssigen Zustand über die in Schritt b) hergestellte feste Kombination gegeben wird, und dann die neue Kombination auf eine Temperatur kleiner oder gleich dem niedrigsten Erstarrungspunkt der drei Phasen gebracht wird, so dass eine feste Kombination mit drei verschiedenen Phasen erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Zusammensetzung, wobei die verschiedenen Phasen, die die Zusammensetzung in der festen Phase ausmachen, in einer geschichteten Weise in der Zusammensetzung angeordnet sind und vorzugsweise übereinander überlagert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2 zur Herstellung einer Zusammensetzung, wobei das Antigenmedium eine wässrige oder wässrig-alkoholische Phase des Antigenmaterials ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer Zusammensetzung, wobei die ölige Hilfsstoffphase oder die öligen Hilfsstoffphasen ausgewählt sind aus Mineralölen, Syntheseölen, Pflanzenölen oder tierischen Ölen.
Verfahren nach Anspruch 4 zur Herstellung einer Zusammensetzung, wobei das Öl oder das Gemisch von Ölen, die die ölige Phase ausmachen, kombiniert wird mit einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel oder mit einem Gemisch von nichtionischen oberflächenaktiven Mitteln.
Verfahren nach Anspruch 5 zur Herstellung einer Zusammensetzung, wobei eines der nichtionischen oberflächenaktiven Mittel, das mit dem Öl oder dem Gemisch von Ölen kombiniert wird, ausgewählt wird aus Olein-, Ricinol- und Ketostearinsäuren und deren Derivaten und insbesondere aus Mannitololeaten und den Derivaten der Mannitololeate, die durch Pfropfen hydrophiler funktioneller Gruppen, wie beispielsweise funktioneller Amid-, Amin-, Alkohol-, Polyol- oder Carboxylgruppen oder von Ethoxy-, Propoxy- und/oder Butoxy-Resten oder Mannitanoleaten oder Derivaten davon erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung einer Zusammensetzung, die aus einer Antigenphase und einer öligen Hilfsstoffphase besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 6 zur Herstellung einer Zusammensetzung, die aus einer Antigenphase, einer öligen Hilfsstoffphase und einer Verdünnungsmittelphase für die Antigenphase besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung einer Zusammensetzung, wobei in dem festen Zustand die ölige Phase die untere Schicht und die Antigenphase die obere Phase ausmacht.
Verfahren zur Gefrierkonservierung einer Zusammensetzung, die aus einer Antigenphase, einer öligen Hilfsstoffphase und gegebenenfalls einer Verdünnungsmittelphase für die Antigenphase besteht, wobei das Antigenmedium eine Phase ausmacht, die sich von der Hilfsstoffphase unterscheidet, wenn die Zusammensetzung im festen Zustand ist, wobei die Zusammensetzung im flüssigen Zustand ist, wenn die Temperatur größer oder gleich 4°C ist, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine erste der Hilfsstoff-, Verdünnungsmittel- oder Antigenphasen, die bei Raumtemperatur flüssig ist, auf eine Temperatur von kleiner oder gleich ihrem Erstarrungspunkt gebracht wird, so dass eine erste feste Phase erhalten wird, b) eine zweite der anderen Antigen-, Hilfsstoff-, oder Verdünnungsmittelphasen im flüssigen Zustand über die in a) hergestellte feste Phase gegeben wird, und dann die neue Kombination auf eine Temperatur kleiner oder gleich dem niedrigsten Erstarrungspunkt der beiden Phasen gebracht wird, so dass eine feste Kombination mit zwei verschiedenen Phasen erhalten wird, c) gegebenenfalls eine neue Antigen-, Hilfsstoff- oder Verdünnungsmittelphase im flüssigen Zustand über die in Schritt b) hergestellte feste Kombination gegeben wird, und dann die neue Kombination auf eine Temperatur kleiner oder gleich dem niedrigsten Erstarrungspunkt der drei Phasen gebracht wird, so dass eine feste Kombination mit drei verschiedenen Phasen erhalten wird, d) die so gefrorene Zusammensetzung bei einer Temperatur gehalten wird, die kleiner ist als der niedrigste Gefrierpunkt der Phasen, die sie ausmachen.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die in Schritt a) verwendete Phase die ölige Hilfsstoffphase ist, die in Schritt b) verwendete Phase entweder die Verdünnungsmittelphase ist, wenn die Zusammensetzung eine umfasst, oder die Antigenphase ist, und die gegebenenfalls in Schritt c) verwendete Phase die Antigenphase ist.