JP4316174B2 - 層状化して冷凍貯蔵したワクチン、それらを調製するための方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、少なくとも一つの抗原、特にウイルス、細菌、または寄生虫起源の抗原を含む新しいワクチン製剤、およびそれを調製するための方法に関する。
【０００２】
現在、慣習的ワクチンは、それらがオイルベース、または水性であるかどうかにかかわらず、貯蔵期間は４℃において１８〜２４月を上回らない。
【０００３】
英国の動物健康研究所（ＩＡＨ）において行われた試験では、−２０℃、および−７０℃で凍結させたオイル−ベースのワクチンは、その活性を失うことが示された。したがって、この国では、商用のワクチンには、「凍らせないように」のラベルがつけられている。
【０００４】
抗原は、濃縮物の形で、ごく低温において最高１５年の長期間貯蔵することができるであろう。この場合、ワクチンが緊急に必要とされるときに、時間の損失を避けるために、それらの貯蔵地域の近くにワクチンを製造するための手段を有することが必須である。
【０００５】
これらの事情により、数年間貯蔵することができ、かつ解凍後にすぐに使用できるるワクチンの開発を目的とする研究を支持する気を出願人におこさせた。
【０００６】
第一の側面に従って、本発明の主題は少なくとも一つの抗原性媒質、および少なくとも一つのアジュバントから成る組成物であって、
（ａ）前記組成物が固体状のとき、前記抗原性媒質、前記アジュバント相とは異なった相を構成することと、
（ｂ）前記組成物の温度が４℃より高いか、または同じとき、前記組成物が液状であること、
とによって特徴づけられる組成物である。
【０００７】
本発明の主題である組成物においては、前記「異なった相」の表現は、前記相が固体状のときに、他の相に含まれないか、溶解されないか、エマルジョンにされないか、または拡散されないことをいう。
【０００８】
本発明の第１の特定の側面に従って、固体状の組成物を構成する多様な相は、多くとも二つの異なった相と隣接している：それらは、特に前記組成物において層状に配置され、および好ましくはもう一方の上段に重ねられたものである。
【０００９】
本発明に関して、前記「抗原性媒質」の表現は、前記濃縮物が、適当な液状担体によって稀釈されていないか、または稀釈されたかどうかにかかわらず、抗原性物質の濃縮液、または抗原性物質の濃縮液の混合液を意味すると理解される。前記抗原性媒質は、以下において「抗原性相」と呼ぶこととする。
【００１０】
抗原性媒質の表現は、抗原、抗原の混合液、アミノ酸配列を含むインビボにおける化合物のジェネレーター、アミノ酸配列を含む化合物のインビボジェネレーターの混合液、またはあるいはアミノ酸配列を含む化合物の一以上のインビボジェネレーターと一以上の抗原の混合液を示す。
【００１１】
「抗原または少なくとも一つの、アミノ酸配列を含む化合物のインビボジェネレーター」の表現は、殺された微生物（例えばウイルス、バクテリア、または寄生虫）、またはこれらの微生物の精製画分、または病原性の威力が弱められた生きた微生物を示す。
【００１２】
本発明による抗原を構成し得るウイルスを通じて、狂犬病ウイルス、仮性狂犬病ウイルスなどのヘルペスウイルス、インフルエンザウイルスなどのオルトミクソウイルス、口蹄病ウイルスなどのピコルナウイルス、またはＨＩＶなどのレトロウイルスについて述べられてもよい。
【００１３】
本発明による抗原を構成し得る細菌型の微生物としては、大腸菌、およびパスツレラ、フルンケル、ビブリオ、ブドウ球菌、および連鎖球菌に属するものについて述べることができる。
【００１４】
寄生虫としては、トリパノゾーマ、プラスモディウム、およびリーシュマニアに属するものについて述べることができる。
【００１５】
また、組換え型ウイルス、特にアデノウイルス、ワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、ヘルペスウイルス、またはかん状ウイルスなどのエンベロープ化されていないウイルスベクターについても述べることができる。
【００１６】
エンベロープ化されていない生きた組換えウイルスについても述べることができる。このウイルスのゲノムには、上述されたエンベロープ化されたウイルス、または病原性微生物に対する抗体の合成および／または保護効果を誘発する抗原性サブユニットをコードしている配列を含む（好ましくは、この配列が対応するエンベロープ化されたウイルスの複製に必須ではない部分に挿入される）：
この種の抗原性サブユニットは、例えばタンパク質、グリコプロテイン、ペプチド、またはペプチド画分、および／または生きた微生物（例えば外膜ウイルス、バクテリア、または寄生虫）の感染に対する保護薬となる画分である。前記微生物に挿入される外来遺伝子は、例えば、アウエスキーウイルス、またはＨＩＶウイルスに由来する。
【００１７】
特に、微生物から、または病原ウイルスから得られる外来性ヌクレオチド配列が挿入されたヌクレオチド配列からなる組換えプラスミドについて述べることができる。そして、後者のヌクレオチド配列の役割は、アミノ酸配列を含む化合物の発現を可能にすることである。その役割は、宿主生物において免疫反応を誘導することである。
【００１８】
アミノ酸配列を含む化合物の「インビボ」ジェネレーターの表現は、前記インビボジェネレーターが導入されている宿主生物内において、前記化合物を発現することが可能な生物産物を意味する。前記アミノ酸配列を含む化合物は、タンパク質、ペプチド、またはグリコプロテインであってもよい。これらのインビボジェネレーターは、一般に、遺伝子操作に由来する方法によって得られる。より詳しくは、それらは生きた微生物（一般にヌクレオチド配列（特に外来遺伝子）が挿入された組換えベクターとして作用するウイルス）から成るであろう。これらの化合物は、本質的に公知であり、特に組換え型サブユニット・ワクチンとして使用される。この点に関しては、Ｍ． ＥＬＯＩＴらによる論文、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）７１、２９２５−２４３１、並びにＷＯ−Ａ−９１／００１０７、およびＷＯ−Ａ−９４／１６６８１番として発行された国際特許出願が、参照文献となるであろう。
【００１９】
また、本発明によるインビボジェネレーターは、宿主生物において、アミノ酸配列を含む化合物を発現することが可能な外来ヌクレオチド配列を含有する組換えプラスミドから成るであろう。
【００２０】
この種の組換えプラスミド、およびそれらの宿主生物への投与方法は、１９９０年のＬＩＮらによるＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８２：２２ １７，２２２１；ＣＯＸらのＪ．ｏｆ． Ｖｉｒｏｌ． Ｓｅｐｔ．１９９３，６７，９，５６６４−５６６７に、およびＷＯ ９５／２５５４２として発行された国際出願に記載されている。前記インビボジェネレーターに含まれるヌクレオチド配列の性質に依存して、宿主生物において発現される、アミノ酸配列を含む化合物は：
（ｉ）抗原であって、かつ免疫反応を引き起こすできることが可能であろう
（ｉｉ）疾患（宿主生物によって引き起こされる本質的な機能性の疾患）を治癒する作用を有するであろう。この場合、前記インビボジェネレーターは、宿主において遺伝子治療型の治療を可能にする。この種の治癒的な作用は、例えば、インビボジェネレーターによってインターロイキン（特にインターロイキン２）などのサイトカインが合成されることからなる。これらは、癌細胞を選択的に除去することを目的とした免疫反応を引き起こすこと、または増強することを可能にする。
【００２１】
本発明による組成物は、この抗原の性質、および治療される患者の性質に依存した抗原の濃度を含む。適切な抗原の濃度は、当業者によって、従来の方法で決定されるであろう。通常、この用量は、０．１μｇ／ｃｍ３〜１ｇ／ｃｍ３の桁であり、より一般的には．１μｇ／ｃｍ３〜１００ｍｇ／ｃｍ３の間の液状組成物である。
【００２２】
ここで再び、本発明による組成物中の前記インビボジェネレーターの濃度は、特に前記ジェネレーターの性質に、およびそれが投与される宿主に依存する。この濃度は、ルーチンの実験に基づいて、当業者が容易に決定することができる。しかし、ガイドとして、インビボジェネレーターが組換え微生物である場合、本発明による組成物中におけるその濃度は、１０２〜１０１５微生物／ｃｍ３の間で、好ましくは１０５〜１０１２微生物／ｃｍ３の間の液状組成物であり得ることが、明記されるであろう。
【００２３】
前記インビボジェネレーターが組換えプラスミドである場合、本発明による組成物中のその濃度は、一般に０．０１ｇ／ｄｍ３〜１００ｇ／ｄｍ３の間の液状組成物である。
【００２４】
前記抗原濃縮物の形態は、生物から、またはそれらを含んでいる分子から抗原を抽出した方法に、およびそれらの性質に本質的に依存する。前記抗原濃縮物は、本質的に本発明の主題ではない。それらは、抗原性物質の上清、もしくは抗原性物質の上清の濃縮物などの液体状、またはあるいは凍結乾燥物などの固体状として提供されてもよい。
【００２５】
本発明の主題である組成物は、一以上の抗原および一以上の抗原性の相を含んでいてもよい。
【００２６】
本発明の第一の特定の態様にしたがって、その主題は、上記記載の通りの組成物であって、前記抗原性媒質が抗原性物質の凍結乾燥物から成ることを特徴とする。
【００２７】
本発明の第二の特定の態様にしたがって、その主題は、上記記載の通りの組成物であって、前記抗原性媒質が抗原性物質の水性、または水性−アルコール性の相であることによって特徴づけられる。
【００２８】
例えば、前記抗原性の相を構成している溶媒は、水、ＰＢＳ緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液、またはその混合液である。
【００２９】
本発明において、前記「アジュバント」の用語は、ウイルス、細菌、寄生虫、または合成を起源とするかどうかに関わらず、それらが抗原性物質の存在下において投与された場合に、免疫系の反応を増加する産物をいう。それらによって、接種部位に塊状のマクロファージの出現を引き起こし、次に、リンパ結節、および特異的免疫グロブリン、抗体生産を増加することによって、免疫防衛機構に関係している多数の細胞を刺激する。
【００３０】
これらのアジュバントの性質は、変化する。それらは、水に可溶または不溶である無機塩、または塩の水性もしくは水性―アルコール性溶液、有機化合物、オイル、またはこれらの様々なタイプのアジュバントの混合液であってもよい。前記一以上のアジュバントを含む相は、以下においてアジュバント相と呼ぶこととする。
【００３１】
塩の形態の通常のアジュバントとして、金属塩（例えば、水酸化アルミニウム、硝酸セリウム、硫化亜鉛、コロイド状の水酸化鉄、または塩化カルシウム）もある。これらの中で、水酸化アルミニウムは最も一般的に使用される。Ｒａｊｅｓｈ Ｋ Ｇｕｐｔａらによる論文、「アジュバント、毒性とアジュバント活性の間のバランス」、Ｖａｃｃｉｎｅ、第１１巻、発行３、ページ９９３−３０６に、これらのアジュバントが記載されている。
【００３２】
水溶性の塩の例として、グリセロリン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、ピルビン酸、グルコン酸、グルクロン酸、フルクトヘプトン酸、グルコノヘプトン酸、またはグルコヘプトン酸、グルタミン酸、およびアスパラギン酸、またはメチオニンの塩など、少なくとも一つのリン酸基または一つのカルボキシル基を有している金属陽イオンの、および有機酸の塩がある。これらの金属陽イオンの塩は、さらに詳細には、マンガン、アルミニウム、カルシウムまたは亜鉛の塩（例えば、グルコン酸マンガン、グルコン酸カルシウム、亜鉛グルコナート、フルクトヘプトン酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、酢酸アルミニウム、およびサリチル酸アルミニウムなど）から選択される。
【００３３】
これらのアジュバントのいくつかは、ＷＯ ９６／３２９６４およびＷＯ ９８／１７３１１番として発行された国際特許出願に記載されている。
【００３４】
本発明の主題である組成物中に水溶性の塩が存在する場合、それら全体の濃度は、０．０２ｍｇ／ｃｍ３〜３０００ｍｇ／ｃｍ３、好ましくは０．１ｍｇ／ｃｍ３〜１０００ｍｇ／ｃｍ３、およびさらに詳細には０．１ｍｇ／ｃｍ３〜１５０ｍｇ／ｃｍ３までの間の液状の前記組成物である。
【００３５】
他アジュバントとしては、５〜１５の間の全体のＨＬＢ数有する界面活性剤、または界面活性剤の混合液もある。本発明のためのＨＬＢ数は、式ＨＬＢ＝２０（１−Ｉｓ／Ｉａ）により算出される。Ｉｓは、前記界面活性剤に対するまたは界面活性剤の前記混合液に対するけん化価、およびＩａは酸価を示す。これらの２つの値（けん化価および酸価）は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａに記載されている方法によって決定される。
【００３６】
この種の界面活性剤の例として、６〜１４の間の全体のＨＬＢ数を有する修飾された脂肪性物質がある。前記修飾された脂肪性物質は、無機物、植物、または動物起源であってもよい。無機物起源の修飾された脂肪性物質の例として、石油に由来する修飾されたオイルがある。植物起源の修飾された脂肪性物質としては、植物油（例えば修飾された落花生類、オリーブ、ゴマ、大豆、コムギ胚芽、グレープ種子、ヒマワリ、キャスタ、亜麻仁、トウモロコシ、コプラ、掌、堅果、ハシバミまたはなたね油など）がある。動物起源の修飾された脂肪性物質としては、例えば、修飾された動物蝋オイル、または修飾された獣脂油がある。
【００３７】
前記「修飾された脂肪性物質」の表現は、一般にアルコキシル化された脂肪性物質誘導体、および詳細には前記アルコキシル化された誘導体のオイル、または前記アルコキシル化された誘導体のアルキルエステルのオイル、およびより詳細にはエトキシル化および／またはプロポキシル化された誘導体のオイル、または前記エトキシル化および／またはプロポキシル化された誘導体のメチル、エチル、プロピル、もしくは線形のもしくは枝分れしたブチル、前記オイルの線形もしくは枝分れしたエステルをいう。本発明の主題は、より詳しくは上記記載の組成物であって、前記アジュバントが、修飾された脂肪性物質、または修飾された脂肪性物質の混合液である場合、後者は、１〜６０の間のＥＯ数を有する前記エトキシル化された誘導体から、およびより詳細には、１０〜１４の間の全体のＨＬＢ数を有するとうもろこし油（とうもろこし油のアルコキシル化された誘導体の混合液）、または７〜１０の間の全体のＨＬＢ数を有するひまし油、もしくはひまし油のアルコキシル化された誘導体からから選択される。
【００３８】
５〜１５の間の全体のＨＬＢ数を有する界面活性剤、または界面活性剤の混合液が、本発明の主題である組成物中に存在する場合、それらの全体の濃度は、０．２ｍｇ／ｃｍ３〜５００のｍｇ／ｃｍ３の間であり、より詳しくはアジュバントが２ｍｇ／ｃｍ３〜５００ｍｇ／ｃｍ３の間であり、および好ましくは、液状の前記組成物が５０ｍｇ／ｃｍ３〜２００のｍｇ／ｃｍ３の間である。
【００３９】
他アジュバントとしては、脂肪酸およびポリオールのエステルのアルコキシル化された誘導体、または脂肪族アルコールおよびポリオールのエーテルのアルコキシル化された誘導体、並びに、より詳細には、アルコキシル化された脂肪酸のトリグリセライド、ポリグリセリンおよび脂肪酸のアルコキシル化されたエステル、例えばソルビトールまたはマンニトールなどのヘキソールを有する脂肪酸のアルコキシル化されたエステル、またはソルビタンもしくはマンニタンなどのヘキソール無水物を有する脂肪酸のアルコキシル化されたエステルがある。
【００４０】
特に、これらの修飾されたエステルを調製するために適切である脂肪酸として、１２〜２２個の炭素原子を含むものがある。例えば１６〜１８の炭素原子（例えばオレイン酸リシノール酸、またはイソステアリン酸など）を含む２０℃において液体である脂肪酸が都合がよい。これらの誘導体の例としては、５〜１５、および好ましくは７〜１１の間のＥＯ数を有するマンニタンオレアートのエトキシルかされた誘導体がある。
【００４１】
アジュバントの他の例としては、サポニン、レシチン、または以下の化合物を含む組成物がある：
ａ）式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉ）の化合物の混合物：
Ｒ１−Ｏ−（Ｇ）Ｘ−Ｈ （Ｉ）
Ｒ１は、飽和したかまたは不飽和の、１〜３０の炭素原子を含む線状または枝分れ炭化水素基を示し、Ｇはサッカライド残基を示し、およびｘは１〜５の間の十進数を表し、および必要に応じて
ｂ）式（ＩＩ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物の混合物：
Ｒ２−ＯＨ （ＩＩ）
Ｒ２は、Ｒ１とは独立して、飽和したかまたは不飽和の、８〜３０の炭素原子を含む線状または枝分れ炭化水素基を示す。
【００４２】
前記「サッカライドの残基」の表現は、糖分子上の一方では、その水酸基の一つから水素原子を、および他方ではアノマー水酸基を除去することによって生じる二価の置換基をＧとして表す。前記「サッカライド」の用語は、特にグルコース、またはデキストロース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、イドース、アラビノース、キシロース、リボース、グロース、リキソース、マルトース、マルトトリオース、ラクトース、セロビオース、デキストラン、タロース、アロース、ラフィノース、レボグルカン（ｌｅｖｏｇｌｕｃａｎ）、セルロースまたはデンプンを表す。前記オリゴマー構造（Ｇ）ｘは、これが光学異性体、幾何異性体、または位置異性体を含むかどうかにかかわらず、いかなる種類の異性体の形態として存在してもよい；また、それは、異性体の混合液を表していてもよい。
【００４３】
前記式（Ｉ）において、サッカライドの平均重合度を示す数ｘは、Ｉ〜３の間、特に１．０５〜２．５間、より詳しくは１．１〜２．０間であり、かつ好ましくは１．５以下である。
【００４４】
Ｇは、より詳細にはグルコース残基、またはキシロース残基を表す。
【００４５】
前記Ｒ１基は、特に、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、ウンエイコシル、ドコシル、ヘプタデセニル、エイコセニル、ウンエイコセニル、ドコシニル、ヘプタデカジエニル、またはデセニル基から選択される５〜２２の炭素原子を含む置換基を表し、前記置換基は、線状かまたは分岐している。Ｒ１は、好ましくは置換基が８〜２０の炭素原子を含む置換基を示し、前記置換基は、線状かまたは分岐している。
【００４６】
Ｒ２は、より詳細にはオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、ウンエイコシル、ヘプタデセニル、エイコセニル、ウンエイコセニル、ドコシニル、ヘプタデカジエニル、またはデセニル基から選択される８〜２２の炭素原子を含む置換基を表し、前記置換基は、線状かまたは分岐している。
【００４７】
前記混合液は上記記載の通り、少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物、および少なくとも一つの式（Ｉｌ）の化合物を含む場合、式（１）の化合物／式（ＩＩ）の化合物の重量比は、一般に特に１０／９０〜９０／１０の間であり、より詳細には１０／９０〜６０／４０の間である。
【００４８】
他のアジュバントとしては、ミネラルオイル、合成オイル、植物オイルまたは動物オイルであるかどうかに関わらず、オイル、および特にその低い毒性が既知であるオイルがある。
【００４９】
ミネラルオイルの例としては、ＭＡＲＣＯＬＴＭ ５２などのＦＤＡ ２１のＣＦＲ １７２．８７８およびＣＦＲ １７８．３６２０（ａ）規制に適合したホワイトミネラルオイルがある。このオイルは、フランスのＣＯＤＥＸまたはＤＲＡＫＥＯＬＴＭ６ＶＲの流動パラフィンの定義に対応する商用のオイルである。
【００５０】
合成オイルの例としては、ポリイソプレン、ポリイソブテン、ＰＡＲＬＥＡＭ−ＰＯＬＹＳＹＮＩＡＮＥの名称で市場に出されており、Ｍｉｃｈｅｌ ａｎｄＩｒｅｎｅ Ａｓｈ， Ｔｈｅｓａｕｒｕｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ， Ｉｎｃ．１９８６， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐａｇｅ ２１１ （ＩＳＢＮ ０７１３１ ３６０３ ０）において引用されている水素化されたポリイソブテン、ＰＨＹＴＯＳＱＵＡＬＡＮの名称で市場に出されており、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｂｙ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ＲＮ ＝ １１１−０１−３；において識別されるスクアランがあり；それは、８０％重量以上の２，６，１０，１５，１９，２５−ヘキサメチルテトラコサンを含む炭化水素の混合液である。また、スクアレン、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｂｙ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ＲＮ ＝９３６８５−８０−４において識別されるイソヘキサデカン（それは少なくとも９７％のＣ１６イソパラフィンを含んでいるＣ１２、Ｃ１８、およびＣ２０イソパラフィン類（それらの中で主要な成分が２，２，４，４，６，８，８−ヘプタメチルノナン（ＲＮ＝４３９０−０４−９）である）の混合液である）；イソドデカンもある。
【００５１】
合成による非ミネラルオイルの他の例としては、アルコールのエステル、および脂肪酸（例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸オレイル、脂肪酸エステルの、またはプロピレングリコールのモノ、ジ−、またはトリグリセライド）がある。
【００５２】
ベジタブル起源のオイルの例としては、落花生類、オリーブ、ゴマ、ダイズ、コムギ胚芽、グレープ種子、ヒマワリ、キャスタ、亜麻仁、トウモロコシ、コプラ、掌、堅果、ハシバミ、またはなたねのオイルがある。
【００５３】
油性アジュバントの例としては、フロイントアジュバントが非常に効果的である；それらは、ミネラルオイルと、マンニトール・エステル含有物、またはあるいは殺されたマイコバクテリウムの併用によって生じる。
【００５４】
動物起源のオイルの例としては、スクアラン、スクアレン、または動物蝋油がある。
【００５５】
本発明の主題である組成物が、液状、エマルジョンである場合、前記オイルは、一般に好ましくは薬学的に許容される一以上の非イオン性界面活性剤と併用される。
【００５６】
特に、それらはフリーの金属、または重金属であるべきであり、および非常に低い酸性であるか、または過酸化物価を有するべきである。それらがＳ．Ｓ．Ｂｅｒｌｌｉｎ（ＡｌｌｅｒｇｙのＡｎｎａｌｓ）１９６２，２０，４７３、に記載された通りのものなどの安全性をテストするための基準、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ．により記載されている異常な毒性をテストするための標準を満たすことが望ましい。
【００５７】
同じアジュバント相においてオイルと併用してもよい界面活性剤の例としては、先に記載した本質的にアジュバント性状を有するものがある。より一般的には、以下の化学ファミリーの非イオン性界面活性剤がある：
−脂肪酸のおよび糖（例えばソルビトール、マンニトール、シュークロースまたはグルコース）のエステルまたはエーテル、；
−脂肪酸のエステル、およびグリセリンまたはポリオール；
−グラフトアルコール、エーテル酸化物、カルボキシル、アミン、またはアミド基から得られるそれらのエステル類の親水性誘導体、
−レシチン、
−エトキシル化されたおよび／またはプロポキシル化された脂肪族アルコールまたは脂肪酸；
−８〜２２の炭素原子を含むこれらの界面活性剤の脂肪性連鎖。
【００５８】
−これらの界面活性剤において、好ましいものは、１４〜２０の炭素原子を含む脂肪性連鎖を有するもの、およびより詳細には、オレイン酸、レシノール酸、およびケトステアリン酸、およびその誘導体、並びに最も詳細には、オレイン酸マンニトール、および親水性基（例えばアミド、アミン、アルコール、ポリオール）、もしくはカルボキシル基、もしくはエトキシ、プロポキシ、および／もしくはブトキシ基をグラフトすることによって得られたオレイン酸マンニトール誘導体、またはオレイン酸マンニタン、またはその誘導体；それらは、マンニトールのポリヒドロキシル化された炭素連鎖を脱水することによって得られる（１−４または２−６位で環化される）。
【００５９】
−一般に、非イオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤の混合液が、そのエマルジョン化特性を発揮させるためにオイルと併用してワクチン組成物中に存在する場合、その濃度は０．０１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの間に、および好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌの間である。
【００６０】
−非イオン性界面活性剤とオイルを併用した例としては、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（Ｒ）として市場に出されている製品がある。この製品の特徴を以下の表に示す：
【表１】
本発明の第三の特定の側面に従えば、本発明の主題である組成物は、油性アジュバント相を含む。
【００６１】
この場合において、固体状態では、この油性相は、前記組成物の特に底位の相を構成する。実際に、単純に室温において手で攪拌することよって、この配位のエマルションが、より容易に得られることが観測された。
【００６２】
本発明による組成物は、Ａｖｒｉｄｉｎｅ（Ｒ）、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）誘導体（特にスレオニル−ＭＤＰ）、ミコール酸誘導体、またはリピドＡ誘導体などの免疫刺激試薬を含んでいてもよい。
【００６３】
前記アジュバントを含む相は、以下においてアジュバント相と呼ぶこととする。本発明の主題である組成物は、一以上のアジュバント相を含んでいてもよい。
【００６４】
上記記載のような組成物は、さらに少なくとも１つの抗原性相（その希釈液の特性は液状で発揮され、かつ前記組成物が固体状の場合、抗原性相およびアジュバント相とは異なっている）を一以上含んでいてもよい。
【００６５】
上記記載のような組成物は、さらに少なくとも１つの抗原性相（その希釈液の特性は液状で発揮され、かつ前記組成物が固体状の場合、抗原性相およびアジュバント相とは異なっている）を一以上含んでいてもよい。
【００６６】
発明の第四の特定の側面に従って、上記記載の組成物は、油性相を含んでいない。
【００６７】
発明の第五の特定の側面に従って、上記記載の組成物は、抗原性相および油性アジュバント相から成る。
【００６８】
発明の第六の特定の側面に従って、上記記載の組成物は、抗原性相、油性アジュバント相、および希釈液相から成る。
【００６９】
後者の二つの配置において、上記記載の組成物中において固形状の場合、好ましくは、前記油性相が最底相であり、かつ前記抗原性相が最上相である。
【００７０】
本発明の第二の側面に従って、その主題は上記記載の通りの組成物を調製するための方法であって、：
ａ）−第一の固体相を形成するために、第一のアジュバント、希釈液、または抗原性の相（それは室温で、液状である）を、その凝固点以下の温度に持っていくことと、
ｂ）−ａ）において、調製された固体相の上に、第二のその他の抗原性、アジュバント、または希釈液の液状の相を添加して、次に、前記新しい組合せを、該二相の凝固点以下の温度に持っていき、二つの異なった相を組み合わせた固体を形成させることと、
ｃ）−適切であれば、新たな抗原性、アジュバント、または希釈液の液状相を、工程ｂ）において調製した前記組み合わせた固体の上に添加して、次に、前記新しい組合せを、該三相の凝固点以下の温度に持っていき、三つの異なった相を組み合わせた固体を形成させることと、
ｄ）適切であれば、−工程ｃ）において実行された順番の操作を、前記組成物を含む前記抗原性、アジュバント、または希釈液の相の最後が凍結するまで繰り返される。
【００７１】
より具体的には、本方法において上記記載の通り、抗原性相、油性アジュバント相、および任意に抗原性相の希釈液相からなる組成物を調製するために、工程ａ）において使用された相は、前記油性アジュバント相であり、工程ｂ）において使用された相は、前記組成物が一つである場合には、前記希釈液相、または前記抗原性相のいずれかであり、および場適切であれば、工程ｃ）において使用された相が、前記抗原性相である。
【００７２】
さらに、より詳しくは、抗原性性相、および一以上のオイルと一以上の非イオン性界面活性剤の組合せを含む油性相のワクチン・エマルジョンを調製するために、前記方法は以下の主要な工程を含む：
（ａ） 前記油性相の必要とされる量を所望の一次容器内に分注し、液体窒素の超低温気相内に静置して、急速凍結することと；
（ｂ） 工程（ａ）で得られた凍結相を、低温環境から直ちに取り除いて、必要量の分注したバッファーを、前記凍結相の最上部に慎重に相状化して、二つの区別可能な相を形成し相化し：これを直ちに超低温環境に戻して、前記分注バッファーを急速凍結させることと、
（ｃ） 工程（ｂ）から得られる相状化された組合せを、しばらくして、低温環境から除去して、次に、必要な量の濃縮抗原を前記凍結相の最上部に慎重に相状化して、第三の区別可能な相を形成するか、または層化し：これを直ちに超低温環境に戻して、前記抗原濃縮液を急速凍結させることと、
を含む工程。
【００７３】
本発明の第三の側面に従って、その主題は上記記載の通り、皮下注射によって、筋肉内注射によって、または静脈内注射によって、ヒトまたは動物の体を治療する方法を実施するための組成物である。
【００７４】
より詳しくは、前記層状に、かつ低温で保存された（ＳＡＣＳ）ワクチンは、必要なときに、室温で解凍して、単にかき混ぜることによって混合して、標的宿主に投与される。
【００７５】
本発明による組成物は、予防薬、または治療用の医薬として使うことができる。前記抗原またはインビボジェネレーターに依存して、本発明による組成物は、魚、エビなどの甲殻類、鳥類、特にガチョウ、シチメンチョウ、ハト、およびニワトリに、イヌなどのイヌ類に、ネコなどのネコ類に、ブタに、霊長類に、ウシなどのウシ類に、ｏｖｉｄａｅに、およびウマに投与してもよい。
【００７６】
本発明の最後の側面にしたがって、その主題は、少なくとも一つの抗原性媒質、少なくとも一つのアジュバント、および前記抗原性媒質のための、および／または前記アジュバントのための任意の少なくとも一つの希釈液を含む組成物を凍結して保存するための方法であって、
ａ）−第一の固体相を形成するために、第一のアジュバントの、希釈液の、または抗原性の相（それは室温で、液状である）を、その凝固点以下の温度に持っていくことと、
ｂ）−ａ）において、調製された固体相の上に、第二の他の抗原性の、アジュバントの、または希釈液の液状の相を添加して、次に、前記二相の凝固点以下の温度に前記新しい組合せを持っていき、該二つの異なった相を組み合わせた固体を形成させることと、
ｃ）−適切であれば、工程ｂ）において調製された前記組み合わせた固体の上に、新規の抗原性の、アジュバントの、または希釈液の液状の相を添加して、次に、前記三相の凝固点以下の温度に前記新しい組合せを持っていき、該三つの異なった相を組み合わせた固体を形成させることと、
ｄ）−適切であれば、工程ｃ）において実行された順番の操作のを、前記組成物を含む前記抗原性の、アジュバントの、または希釈液の相の最後が凍結するまで繰り返すことと、および、
ｅ）−このように凍結された組成物が、それを構成している前記相の凝固点以下の温度で保存されることを特徴とする方法である。
【００７７】
予想外に、オイル中水型（Ｗ／Ｏ）、水中オイル型（Ｏ／Ｗ）、および水中オイル中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）エマルジョンの形態のワクチンでは、−２０℃において７ヵ月間保存した後にそれらの活性が消失するするが、上記記載の方法によって貯蔵されたものは、温度および期間が同じ条件下でも活性が残存することが観察された。
【００７８】
より詳しくは、本方法において上記記載の通り、抗原性相、油性アジュバント相、および任意に抗原性相の希釈液相からなる組成物を調製するために、工程ａ）において使用された相は、前記油性アジュバント相であり、工程ｂ）において使用された相は、前記組成物が一つである場合には、前記希釈液相、または前記抗原性相のいずれかであり、および場合適切であれば、工程ｃ）において使用された相が、前記抗原性相である。
【００７９】
以下の例は、本発明を例示するが、それに限定しない。
【００８０】
【実施例】
１．第一番目の実施
Ａ．本発明による組成物の調製
口蹄疫を治療するためのワクチンの５ミリリットル（ｍｌ）用量を以下の方法で調製する：
１−約２．１５ｍｌの接種可能なミネラルオイルと、０．３５ｍｌのオレイン酸マンニタンおよびＰＥＧ ５００の混合液の組合せからなる２．５ｍｌのＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（Ｒ）ＩＳＡ２０６を約−１８℃において凍結する；
２−凍結した後、前記サンプルをフリーザから取り出して、直ちに２．４５ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を補充して凍結させる；
３−もう一度、前記サンプルをフリーザから取り出して、直ちに１０ｍｇ／ｍｌの口蹄疫抗原を含む０．０５ｍｌの濃縮物を補充して、凍結してワクチン組成物Ａｉを形成する。
【００８１】
Ｂ．従来技術による組成物の調製
羊の口蹄疫を治療するためのワクチンの５ｍｌ用量は、２．５ｍｌの油性アジュバント、約２．２５ｍｌの接種可能なミネラルオイルと０．２５ｍｌのオレイン酸マンニタンの混合物の組合せからなるＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（Ｒ）ＩＳＡ２０６（組み合わせた混合物は、国際公開ＷＯ９１／００１０６に記載されている方法に従ってエマルジョン化される）を、０．５ｍｇの口蹄病抗原を含む２．５ｍｌのＰＢＳ溶液中で混合することによって調製して、水−オイル−水エマルジョンの形態のワクチン組成物を形成する（組成物Ｂｊ）。
【００８２】
Ｃ．ワクチンの効能の比較研究
本発明によるワクチンの効能は、２．５ｍｌのＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（Ｒ）ＩＳＡ２０６、および２．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液を含む５ｍｌのプラセボ用量（組成物Ｐｋ）、および従来技術によるものの効能をそれらの効能と比較して研究する。
【００８３】
試験１
組成物Ａｉを使用して（接種直前にエマルジョンを形成させるために、解凍して、任意にＰＢＳで希釈して、手で攪拌した後に直ちに使用する）、１ｍｌのさまざまな濃度の抗原を５匹のモルモットのグループに接種する。同様の手順をプラセボ組成物において行った。
【００８４】
２８日目にブースターを接種した後、体液性免疫応答を測定するためにはＩＧ１の、細胞性免疫応答を測定するためにはＩＧ２ａのＥＬＩＳＡアッセイによって前記ワクチンの活性を測定する。
【００８５】
モルモット５匹のそれぞれのグループにおいて、最初のワクチン接種の９０日後に保護された動物の数を計測した。
【００８６】
前記結果は、保護された動物の％として表し、以下の表に示した：
【表２】
試験２
−２０℃において７月保存された組成物Ａ４を使用して（接種直前にエマルジョンを形成させるために、解凍して、任意にＰＢＳで希釈して、手で攪拌した後に直ちに使用する）、１ｍｌのさまざまな濃度の抗原を５匹のモルモットのグループに接種する。同様の手順を−２０℃において７月保存したプラセボ組成物Ｐ４、およびＷ／Ｏ／Ｗエマルション（組成物Ｂ４）において行った。
【００８７】
２８日目にブースターを接種した後、体液性免疫応答を測定するためにはＩＧ１の、細胞性免疫応答を測定するためにはＩＧ２ａのＥＬＩＳＡアッセイによって前記ワクチンの活性を測定する。
【００８８】
モルモット５匹のそれぞれのグループにおいて、最初のワクチン接種の９０日後に保護された動物の数を計測して、ＰＤ５０指数（５０％未満が保護されている希釈の程度を表す）を測定した。
【００８９】
前記結果は、保護された動物の％として表し、以下の表に示した：
【表３】
組成物Ａ４における推定から、前記組成物の約１／１００希釈に一致するＰＤ５０指数と等しい１０６．５が推論され、かつ組成物Ｂ４における推定から、組成物の約１／５０希釈と一致するＰＤ５０指数と等しい４６．７１が推論される。
【００９０】
この試験は、−２０℃において７月保存した後に使用した場合、互いに異なった（前記「異なった」の用語は、本記載における定義がなされると理解される）抗原性相およびアジュバント相を含む固体状のワクチン組成物は、さまざまな相のエマルジョン（凍結された）形態中に同じ成分（しかし、同じ期間および同じ温度で保存されている）を含むワクチン組成物より効果的であることを示す。
【００９１】
試験３
本発明によるワクチン組成物（−２０℃において７月保存して、解凍して、＋４℃（液状）において４月間（組成物Ａ５）、または７月間（組成物Ａ６）保存し、かつ様々な任意の小腔において、ＰＢＳ中で使用した）を使用して、１ｍｌのさまざまな濃度の抗原を５匹のモルモットのグループに接種する。同様の手順を−２０℃において７月保存されたプラセボ組成物Ｐ５、およびＰ６において行った。
【００９２】
２８日目にブースターを接種した後、体液性免疫応答を測定するためにはＩＧ１の、細胞性免疫応答を測定するためにはＩＧ２ａのＥＬＩＳＡアッセイによって前記ワクチンの活性を測定する。
【００９３】
モルモット５匹のそれぞれのグループにおいて、最初のワクチン接種の９０日後に保護された動物の数を計測して、ＰＤ５０指数（５０％未満が保護されている希釈の程度を表す）を測定した。
【００９４】
前記結果は、保護された動物の％として表し、以下の表に示した：
【表４】
本試験において、前記凍結時間の場合では、その後の液状ワクチン組成物の貯蔵に対して、有害な影響を及ぼさないことが示された。
【００９５】
従って、緊急の処置の場合において、本発明による凍結された組成物を、従来技術と同じ冷蔵条件下（＋４℃）で、それを使用する場所に輸送することができる。
【００９６】
２．第２番目の実験
Ａ．ワクチンの調製
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（Ｒ） ＩＳＡ ２０６を有する水中オイル中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）エマルジョンとして、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（Ｒ） ＩＳＡ ２５を有する水中オイル型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンのいずれかとしてＦＭＤＶ Ｏ１ローザンヌ不活性化抗原を取り込んでいるワクチン製剤は、従来のように（Ｂａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．． Ｖａｃｃｉｎｅ １４ （１３）， ｐａｇｅｓ１１８７−１１９８ ； １９９６）、または抗原濃縮物（国際ワクチンバンク（ＩＶＢ）によって、ウシ用量あたりのＰＤ５０値を４１として液体窒素中に維持されている）を使用する新規方法によって調製した。
【００９７】
前記製造されたワクチンは、２ｍ１のウシ用量につき５．６２ｐｇの１４６Ｓ抗原を含んだ。
【００９８】
前記新規製剤方法は、次のような４つの主な行程を含んだ：
１．必要な体積の油性アジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０６、または２５を所望の一次容器に分注して、液体窒素の超低温気相に静置して、急速凍結した。
【００９９】
２．次に、しばらくして前記凍結されたオイルアジュバントを低温環境から取り除き、必要量の分注したバッファーを前記凍結相の最上部に慎重に層状化して、二つの区別可能な相を形成し層化する。これを直ちに超低温環境に戻して、前記分注バッファーを急速凍結させる。
【０１００】
３．しばらくして、凍結された油性アジュバントおよび分注バッファーを低温環境から除去して、次に、必要な量の濃縮抗原を前記凍結相の最上部に慎重に層状化する。これを直ちに超低温環境に戻して、前記抗原濃縮液を急速凍結させる。
【０１０１】
４．前記層状に、かつ低温で保存された（ＳＡＣＳ）ワクチンは、必要なときに、室温で解凍して、単にかき混ぜることによって混合して、標的宿主に投与される。
【０１０２】
比較する目的で、従来のように製造されたＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０６および２５をアジュバントとして有するワクチンを、液体窒素の超低温気相に静置することによって急速凍結した。
【０１０３】
Ｂ．インビボにおける力価試験
メスのダンカン−ハートレイ・モルモット（ほぼ重量の４００−５００のｇｍ）で、ワクチン製剤のテストを行った。
【０１０４】
５匹の動物のそれぞれのグループに、１ｍｌ、０．３３ｍｌ、または０．１１ｍｌのいずれかの特定量のワクチンを皮下投与した。
【０１０５】
３×１０３ＩＤ５０の相同モルモット適合ウイルス（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ａｄａｐｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）でワクチン接種した後、２８日目に移植機を介した注射によって動物にチャレンジした。７−１０日間、全ての動物を厳密にモニターして、前記ウイルスがチャレンジ部位を越えて一般化できなかった場合に、免疫されたモルモットが保護されたと見なした。
【０１０６】
後の実験では、以前に記載した用量を減少させる代わりに、ワクチンの希釈を取り入れた。前記抗原は希釈されたけれども前記アジュバントは希釈されなかったので、同様に製造された抗原成分を含まないワクチンによって、本質的にワクチンが希釈された。使用した希釈範囲は、きっちりと三倍〜１／８１までであった。再び、３×１０３ＩＤ５０の相同モルモット適合ウイルスでワクチン接種した後、２８日目に移植機を介した注射によって動物にチャレンジした。７−１０日間、全ての動物を厳密にモニターし、上記したようにモニターした。
【０１０７】
Ｋａｒｂｅｒの方法（Ｋａｒｂｅｒ．（Ａｒｃｈ．）ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｋｏｌ、１９３１，１６２、４８０）によって、この希釈範囲におけるワクチンの作用強度（ＰＤ５０）を算出することができた。
【０１０８】
結果
第１の試験において、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（Ｒ） ＩＳＡ ２０６またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（Ｒ） ＩＳＡ ２５のいずれかに基づくＳＡＣＳワクチンにおいて、７ヵ月以上の期間にわたり、超低温におけるそれらの安定性を調査した。
【０１０９】
分割用量療法を使用した結果では、ワクチン作用強度にいかなる減少もない場合、前記方法がいずれのアジュバント化された製剤に対しても有害ではないことを示し、助長していた（表１）。
【０１１０】
【表５】
第２の試験において、Ｍｏｒｌｔａｎｉｄｅ（Ｒ） ＩＳＡ ２０６、またはＩＳＡ ２５に基づくＳＡＣＳワクチンにおいて、同様に処理された抗原成分を含まないワクチンを希釈して従来のように製造したワクチンのＰＤ５０値と比較した（表２）。
【０１１１】
【表６】
さらなる研究において、二種のワクチンアジュバントを使用したＳＡＣＳワクチンのサンプルでは、解凍して、混合して、その後に４℃において保存されたときでも、７ヵ月後の作用強度が残存していた（表３）。これは、同様のアジュバントを含む従来のように製造された緊急ワクチンにおける以前の観測とよく一致している（Ｂａｒｎｅｔｔｅｔほか、Ｖａｃｃｉｎｅ １４（１３）、ページ１１８７−１１９８；１９９６）。
【０１１２】
【表７】
面白いことに、従来のように製造されたオイルエマルジョンを急速凍結すると、異なった結果を生じ、および使用したオイルアジュバントに依存していた。ＩＳＡ ２５で製造された従来のワクチンは、作用強度にかなりの損失を示したが、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（Ｒ） ＩＳＡ２０６ベースのワクチンは、液体窒素気相中における急速凍結の影響を受けないように見えた（表４）。これは、−２０℃および−７０℃においてこの種のワクチンを貯蔵した場合には、以前に観察されたものとは逆であり、かつ前記相状化することによる新しい製造方法は、いくつかの「容易に製造できる」オイルアジュバントにとって、他のものよりも有益であることを示唆している。
【０１１３】
【表８】
さらにこれを検討するために、従来のように製造されたＩＳＡ ２０６ワクチン（急速凍結されている）の作用強度を、急速凍結していないが＋４℃で一晩放置した同様のバッチと比較した（表６）。
【０１１４】
これらの結果は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０６によって製造されたワクチンを急速凍結方法によって、かつ非常に低温で提供して、凍結貯蔵できることを示唆する。
【０１１５】
【表９】
本発明は、少なくとも一つの抗原、特にウイルス、細菌、または寄生虫起源の抗原を含む新しいワクチン製剤、およびそれを調製するための方法に関する。
【０００２】
現在、慣習的ワクチンは、それらがオイルベース、または水性であるかどうかにかかわらず、貯蔵期間は４℃において１８〜２４月を上回らない。
【０００３】
英国の動物健康研究所（ＩＡＨ）において行われた試験では、−２０℃、および−７０℃で凍結させたオイル−ベースのワクチンは、その活性を失うことが示された。したがって、この国では、商用のワクチンには、「凍らせないように」のラベルがつけられている。
【０００４】
抗原は、濃縮物の形で、ごく低温において最高１５年の長期間貯蔵することができるであろう。この場合、ワクチンが緊急に必要とされるときに、時間の損失を避けるために、それらの貯蔵地域の近くにワクチンを製造するための手段を有することが必須である。
【０００５】
これらの事情により、数年間貯蔵することができ、かつ解凍後にすぐに使用できるるワクチンの開発を目的とする研究を支持する気を出願人におこさせた。
【０００６】
第一の側面に従って、本発明の主題は少なくとも一つの抗原性媒質、および少なくとも一つのアジュバントから成る組成物であって、
（ａ）前記組成物が固体状のとき、前記抗原性媒質、前記アジュバント相とは異なった相を構成することと、
（ｂ）前記組成物の温度が４℃より高いか、または同じとき、前記組成物が液状であること、
とによって特徴づけられる組成物である。
【０００７】
本発明の主題である組成物においては、前記「異なった相」の表現は、前記相が固体状のときに、他の相に含まれないか、溶解されないか、エマルジョンにされないか、または拡散されないことをいう。
【０００８】
本発明の第１の特定の側面に従って、固体状の組成物を構成する多様な相は、多くとも二つの異なった相と隣接している：それらは、特に前記組成物において層状に配置され、および好ましくはもう一方の上段に重ねられたものである。
【０００９】
本発明に関して、前記「抗原性媒質」の表現は、前記濃縮物が、適当な液状担体によって稀釈されていないか、または稀釈されたかどうかにかかわらず、抗原性物質の濃縮液、または抗原性物質の濃縮液の混合液を意味すると理解される。前記抗原性媒質は、以下において「抗原性相」と呼ぶこととする。
【００１０】
抗原性媒質の表現は、抗原、抗原の混合液、アミノ酸配列を含むインビボにおける化合物のジェネレーター、アミノ酸配列を含む化合物のインビボジェネレーターの混合液、またはあるいはアミノ酸配列を含む化合物の一以上のインビボジェネレーターと一以上の抗原の混合液を示す。
【００１１】
「抗原または少なくとも一つの、アミノ酸配列を含む化合物のインビボジェネレーター」の表現は、殺された微生物（例えばウイルス、バクテリア、または寄生虫）、またはこれらの微生物の精製画分、または病原性の威力が弱められた生きた微生物を示す。
【００１２】
本発明による抗原を構成し得るウイルスを通じて、狂犬病ウイルス、仮性狂犬病ウイルスなどのヘルペスウイルス、インフルエンザウイルスなどのオルトミクソウイルス、口蹄病ウイルスなどのピコルナウイルス、またはＨＩＶなどのレトロウイルスについて述べられてもよい。
【００１３】
本発明による抗原を構成し得る細菌型の微生物としては、大腸菌、およびパスツレラ、フルンケル、ビブリオ、ブドウ球菌、および連鎖球菌に属するものについて述べることができる。
【００１４】
寄生虫としては、トリパノゾーマ、プラスモディウム、およびリーシュマニアに属するものについて述べることができる。
【００１５】
また、組換え型ウイルス、特にアデノウイルス、ワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、ヘルペスウイルス、またはかん状ウイルスなどのエンベロープ化されていないウイルスベクターについても述べることができる。
【００１６】
エンベロープ化されていない生きた組換えウイルスについても述べることができる。このウイルスのゲノムには、上述されたエンベロープ化されたウイルス、または病原性微生物に対する抗体の合成および／または保護効果を誘発する抗原性サブユニットをコードしている配列を含む（好ましくは、この配列が対応するエンベロープ化されたウイルスの複製に必須ではない部分に挿入される）：
この種の抗原性サブユニットは、例えばタンパク質、グリコプロテイン、ペプチド、またはペプチド画分、および／または生きた微生物（例えば外膜ウイルス、バクテリア、または寄生虫）の感染に対する保護薬となる画分である。前記微生物に挿入される外来遺伝子は、例えば、アウエスキーウイルス、またはＨＩＶウイルスに由来する。
【００１７】
特に、微生物から、または病原ウイルスから得られる外来性ヌクレオチド配列が挿入されたヌクレオチド配列からなる組換えプラスミドについて述べることができる。そして、後者のヌクレオチド配列の役割は、アミノ酸配列を含む化合物の発現を可能にすることである。その役割は、宿主生物において免疫反応を誘導することである。
【００１８】
アミノ酸配列を含む化合物の「インビボ」ジェネレーターの表現は、前記インビボジェネレーターが導入されている宿主生物内において、前記化合物を発現することが可能な生物産物を意味する。前記アミノ酸配列を含む化合物は、タンパク質、ペプチド、またはグリコプロテインであってもよい。これらのインビボジェネレーターは、一般に、遺伝子操作に由来する方法によって得られる。より詳しくは、それらは生きた微生物（一般にヌクレオチド配列（特に外来遺伝子）が挿入された組換えベクターとして作用するウイルス）から成るであろう。これらの化合物は、本質的に公知であり、特に組換え型サブユニット・ワクチンとして使用される。この点に関しては、Ｍ． ＥＬＯＩＴらによる論文、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）７１、２９２５−２４３１、並びにＷＯ−Ａ−９１／００１０７、およびＷＯ−Ａ−９４／１６６８１番として発行された国際特許出願が、参照文献となるであろう。
【００１９】
また、本発明によるインビボジェネレーターは、宿主生物において、アミノ酸配列を含む化合物を発現することが可能な外来ヌクレオチド配列を含有する組換えプラスミドから成るであろう。
【００２０】
この種の組換えプラスミド、およびそれらの宿主生物への投与方法は、１９９０年のＬＩＮらによるＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８２：２２ １７，２２２１；ＣＯＸらのＪ．ｏｆ． Ｖｉｒｏｌ． Ｓｅｐｔ．１９９３，６７，９，５６６４−５６６７に、およびＷＯ ９５／２５５４２として発行された国際出願に記載されている。前記インビボジェネレーターに含まれるヌクレオチド配列の性質に依存して、宿主生物において発現される、アミノ酸配列を含む化合物は：
（ｉ）抗原であって、かつ免疫反応を引き起こすできることが可能であろう
（ｉｉ）疾患（宿主生物によって引き起こされる本質的な機能性の疾患）を治癒する作用を有するであろう。この場合、前記インビボジェネレーターは、宿主において遺伝子治療型の治療を可能にする。この種の治癒的な作用は、例えば、インビボジェネレーターによってインターロイキン（特にインターロイキン２）などのサイトカインが合成されることからなる。これらは、癌細胞を選択的に除去することを目的とした免疫反応を引き起こすこと、または増強することを可能にする。
【００２１】
本発明による組成物は、この抗原の性質、および治療される患者の性質に依存した抗原の濃度を含む。適切な抗原の濃度は、当業者によって、従来の方法で決定されるであろう。通常、この用量は、０．１μｇ／ｃｍ３〜１ｇ／ｃｍ３の桁であり、より一般的には．１μｇ／ｃｍ３〜１００ｍｇ／ｃｍ３の間の液状組成物である。
【００２２】
ここで再び、本発明による組成物中の前記インビボジェネレーターの濃度は、特に前記ジェネレーターの性質に、およびそれが投与される宿主に依存する。この濃度は、ルーチンの実験に基づいて、当業者が容易に決定することができる。しかし、ガイドとして、インビボジェネレーターが組換え微生物である場合、本発明による組成物中におけるその濃度は、１０２〜１０１５微生物／ｃｍ３の間で、好ましくは１０５〜１０１２微生物／ｃｍ３の間の液状組成物であり得ることが、明記されるであろう。
【００２３】
前記インビボジェネレーターが組換えプラスミドである場合、本発明による組成物中のその濃度は、一般に０．０１ｇ／ｄｍ３〜１００ｇ／ｄｍ３の間の液状組成物である。
【００２４】
前記抗原濃縮物の形態は、生物から、またはそれらを含んでいる分子から抗原を抽出した方法に、およびそれらの性質に本質的に依存する。前記抗原濃縮物は、本質的に本発明の主題ではない。それらは、抗原性物質の上清、もしくは抗原性物質の上清の濃縮物などの液体状、またはあるいは凍結乾燥物などの固体状として提供されてもよい。
【００２５】
本発明の主題である組成物は、一以上の抗原および一以上の抗原性の相を含んでいてもよい。
【００２６】
本発明の第一の特定の態様にしたがって、その主題は、上記記載の通りの組成物であって、前記抗原性媒質が抗原性物質の凍結乾燥物から成ることを特徴とする。
【００２７】
本発明の第二の特定の態様にしたがって、その主題は、上記記載の通りの組成物であって、前記抗原性媒質が抗原性物質の水性、または水性−アルコール性の相であることによって特徴づけられる。
【００２８】
例えば、前記抗原性の相を構成している溶媒は、水、ＰＢＳ緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液、またはその混合液である。
【００２９】
本発明において、前記「アジュバント」の用語は、ウイルス、細菌、寄生虫、または合成を起源とするかどうかに関わらず、それらが抗原性物質の存在下において投与された場合に、免疫系の反応を増加する産物をいう。それらによって、接種部位に塊状のマクロファージの出現を引き起こし、次に、リンパ結節、および特異的免疫グロブリン、抗体生産を増加することによって、免疫防衛機構に関係している多数の細胞を刺激する。
【００３０】
これらのアジュバントの性質は、変化する。それらは、水に可溶または不溶である無機塩、または塩の水性もしくは水性―アルコール性溶液、有機化合物、オイル、またはこれらの様々なタイプのアジュバントの混合液であってもよい。前記一以上のアジュバントを含む相は、以下においてアジュバント相と呼ぶこととする。
【００３１】
塩の形態の通常のアジュバントとして、金属塩（例えば、水酸化アルミニウム、硝酸セリウム、硫化亜鉛、コロイド状の水酸化鉄、または塩化カルシウム）もある。これらの中で、水酸化アルミニウムは最も一般的に使用される。Ｒａｊｅｓｈ Ｋ Ｇｕｐｔａらによる論文、「アジュバント、毒性とアジュバント活性の間のバランス」、Ｖａｃｃｉｎｅ、第１１巻、発行３、ページ９９３−３０６に、これらのアジュバントが記載されている。
【００３２】
水溶性の塩の例として、グリセロリン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、ピルビン酸、グルコン酸、グルクロン酸、フルクトヘプトン酸、グルコノヘプトン酸、またはグルコヘプトン酸、グルタミン酸、およびアスパラギン酸、またはメチオニンの塩など、少なくとも一つのリン酸基または一つのカルボキシル基を有している金属陽イオンの、および有機酸の塩がある。これらの金属陽イオンの塩は、さらに詳細には、マンガン、アルミニウム、カルシウムまたは亜鉛の塩（例えば、グルコン酸マンガン、グルコン酸カルシウム、亜鉛グルコナート、フルクトヘプトン酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、酢酸アルミニウム、およびサリチル酸アルミニウムなど）から選択される。
【００３３】
これらのアジュバントのいくつかは、ＷＯ ９６／３２９６４およびＷＯ ９８／１７３１１番として発行された国際特許出願に記載されている。
【００３４】
本発明の主題である組成物中に水溶性の塩が存在する場合、それら全体の濃度は、０．０２ｍｇ／ｃｍ３〜３０００ｍｇ／ｃｍ３、好ましくは０．１ｍｇ／ｃｍ３〜１０００ｍｇ／ｃｍ３、およびさらに詳細には０．１ｍｇ／ｃｍ３〜１５０ｍｇ／ｃｍ３までの間の液状の前記組成物である。
【００３５】
他アジュバントとしては、５〜１５の間の全体のＨＬＢ数有する界面活性剤、または界面活性剤の混合液もある。本発明のためのＨＬＢ数は、式ＨＬＢ＝２０（１−Ｉｓ／Ｉａ）により算出される。Ｉｓは、前記界面活性剤に対するまたは界面活性剤の前記混合液に対するけん化価、およびＩａは酸価を示す。これらの２つの値（けん化価および酸価）は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａに記載されている方法によって決定される。
【００３６】
この種の界面活性剤の例として、６〜１４の間の全体のＨＬＢ数を有する修飾された脂肪性物質がある。前記修飾された脂肪性物質は、無機物、植物、または動物起源であってもよい。無機物起源の修飾された脂肪性物質の例として、石油に由来する修飾されたオイルがある。植物起源の修飾された脂肪性物質としては、植物油（例えば修飾された落花生類、オリーブ、ゴマ、大豆、コムギ胚芽、グレープ種子、ヒマワリ、キャスタ、亜麻仁、トウモロコシ、コプラ、掌、堅果、ハシバミまたはなたね油など）がある。動物起源の修飾された脂肪性物質としては、例えば、修飾された動物蝋オイル、または修飾された獣脂油がある。
【００３７】
前記「修飾された脂肪性物質」の表現は、一般にアルコキシル化された脂肪性物質誘導体、および詳細には前記アルコキシル化された誘導体のオイル、または前記アルコキシル化された誘導体のアルキルエステルのオイル、およびより詳細にはエトキシル化および／またはプロポキシル化された誘導体のオイル、または前記エトキシル化および／またはプロポキシル化された誘導体のメチル、エチル、プロピル、もしくは線形のもしくは枝分れしたブチル、前記オイルの線形もしくは枝分れしたエステルをいう。本発明の主題は、より詳しくは上記記載の組成物であって、前記アジュバントが、修飾された脂肪性物質、または修飾された脂肪性物質の混合液である場合、後者は、１〜６０の間のＥＯ数を有する前記エトキシル化された誘導体から、およびより詳細には、１０〜１４の間の全体のＨＬＢ数を有するとうもろこし油（とうもろこし油のアルコキシル化された誘導体の混合液）、または７〜１０の間の全体のＨＬＢ数を有するひまし油、もしくはひまし油のアルコキシル化された誘導体からから選択される。
【００３８】
５〜１５の間の全体のＨＬＢ数を有する界面活性剤、または界面活性剤の混合液が、本発明の主題である組成物中に存在する場合、それらの全体の濃度は、０．２ｍｇ／ｃｍ３〜５００のｍｇ／ｃｍ３の間であり、より詳しくはアジュバントが２ｍｇ／ｃｍ３〜５００ｍｇ／ｃｍ３の間であり、および好ましくは、液状の前記組成物が５０ｍｇ／ｃｍ３〜２００のｍｇ／ｃｍ３の間である。
【００３９】
他アジュバントとしては、脂肪酸およびポリオールのエステルのアルコキシル化された誘導体、または脂肪族アルコールおよびポリオールのエーテルのアルコキシル化された誘導体、並びに、より詳細には、アルコキシル化された脂肪酸のトリグリセライド、ポリグリセリンおよび脂肪酸のアルコキシル化されたエステル、例えばソルビトールまたはマンニトールなどのヘキソールを有する脂肪酸のアルコキシル化されたエステル、またはソルビタンもしくはマンニタンなどのヘキソール無水物を有する脂肪酸のアルコキシル化されたエステルがある。
【００４０】
特に、これらの修飾されたエステルを調製するために適切である脂肪酸として、１２〜２２個の炭素原子を含むものがある。例えば１６〜１８の炭素原子（例えばオレイン酸リシノール酸、またはイソステアリン酸など）を含む２０℃において液体である脂肪酸が都合がよい。これらの誘導体の例としては、５〜１５、および好ましくは７〜１１の間のＥＯ数を有するマンニタンオレアートのエトキシルかされた誘導体がある。
【００４１】
アジュバントの他の例としては、サポニン、レシチン、または以下の化合物を含む組成物がある：
ａ）式（Ｉ）の化合物、または式（Ｉ）の化合物の混合物：
Ｒ１−Ｏ−（Ｇ）Ｘ−Ｈ （Ｉ）
Ｒ１は、飽和したかまたは不飽和の、１〜３０の炭素原子を含む線状または枝分れ炭化水素基を示し、Ｇはサッカライド残基を示し、およびｘは１〜５の間の十進数を表し、および必要に応じて
ｂ）式（ＩＩ）の化合物、または式（ＩＩ）の化合物の混合物：
Ｒ２−ＯＨ （ＩＩ）
Ｒ２は、Ｒ１とは独立して、飽和したかまたは不飽和の、８〜３０の炭素原子を含む線状または枝分れ炭化水素基を示す。
【００４２】
前記「サッカライドの残基」の表現は、糖分子上の一方では、その水酸基の一つから水素原子を、および他方ではアノマー水酸基を除去することによって生じる二価の置換基をＧとして表す。前記「サッカライド」の用語は、特にグルコース、またはデキストロース、フラクトース、マンノース、ガラクトース、アルトロース、イドース、アラビノース、キシロース、リボース、グロース、リキソース、マルトース、マルトトリオース、ラクトース、セロビオース、デキストラン、タロース、アロース、ラフィノース、レボグルカン（ｌｅｖｏｇｌｕｃａｎ）、セルロースまたはデンプンを表す。前記オリゴマー構造（Ｇ）ｘは、これが光学異性体、幾何異性体、または位置異性体を含むかどうかにかかわらず、いかなる種類の異性体の形態として存在してもよい；また、それは、異性体の混合液を表していてもよい。
【００４３】
前記式（Ｉ）において、サッカライドの平均重合度を示す数ｘは、Ｉ〜３の間、特に１．０５〜２．５間、より詳しくは１．１〜２．０間であり、かつ好ましくは１．５以下である。
【００４４】
Ｇは、より詳細にはグルコース残基、またはキシロース残基を表す。
【００４５】
前記Ｒ１基は、特に、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、ウンエイコシル、ドコシル、ヘプタデセニル、エイコセニル、ウンエイコセニル、ドコシニル、ヘプタデカジエニル、またはデセニル基から選択される５〜２２の炭素原子を含む置換基を表し、前記置換基は、線状かまたは分岐している。Ｒ１は、好ましくは置換基が８〜２０の炭素原子を含む置換基を示し、前記置換基は、線状かまたは分岐している。
【００４６】
Ｒ２は、より詳細にはオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル、ウンエイコシル、ヘプタデセニル、エイコセニル、ウンエイコセニル、ドコシニル、ヘプタデカジエニル、またはデセニル基から選択される８〜２２の炭素原子を含む置換基を表し、前記置換基は、線状かまたは分岐している。
【００４７】
前記混合液は上記記載の通り、少なくとも一つの式（Ｉ）の化合物、および少なくとも一つの式（Ｉｌ）の化合物を含む場合、式（１）の化合物／式（ＩＩ）の化合物の重量比は、一般に特に１０／９０〜９０／１０の間であり、より詳細には１０／９０〜６０／４０の間である。
【００４８】
他のアジュバントとしては、ミネラルオイル、合成オイル、植物オイルまたは動物オイルであるかどうかに関わらず、オイル、および特にその低い毒性が既知であるオイルがある。
【００４９】
ミネラルオイルの例としては、ＭＡＲＣＯＬＴＭ ５２などのＦＤＡ ２１のＣＦＲ １７２．８７８およびＣＦＲ １７８．３６２０（ａ）規制に適合したホワイトミネラルオイルがある。このオイルは、フランスのＣＯＤＥＸまたはＤＲＡＫＥＯＬＴＭ６ＶＲの流動パラフィンの定義に対応する商用のオイルである。
【００５０】
合成オイルの例としては、ポリイソプレン、ポリイソブテン、ＰＡＲＬＥＡＭ−ＰＯＬＹＳＹＮＩＡＮＥの名称で市場に出されており、Ｍｉｃｈｅｌ ａｎｄＩｒｅｎｅ Ａｓｈ， Ｔｈｅｓａｕｒｕｓ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ， Ｉｎｃ．１９８６， Ｖｏｌｕｍｅ １， ｐａｇｅ ２１１ （ＩＳＢＮ ０７１３１ ３６０３ ０）において引用されている水素化されたポリイソブテン、ＰＨＹＴＯＳＱＵＡＬＡＮの名称で市場に出されており、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｂｙ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ＲＮ ＝ １１１−０１−３；において識別されるスクアランがあり；それは、８０％重量以上の２，６，１０，１５，１９，２５−ヘキサメチルテトラコサンを含む炭化水素の混合液である。また、スクアレン、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｂｙ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ ＲＮ ＝９３６８５−８０−４において識別されるイソヘキサデカン（それは少なくとも９７％のＣ１６イソパラフィンを含んでいるＣ１２、Ｃ１８、およびＣ２０イソパラフィン類（それらの中で主要な成分が２，２，４，４，６，８，８−ヘプタメチルノナン（ＲＮ＝４３９０−０４−９）である）の混合液である）；イソドデカンもある。
【００５１】
合成による非ミネラルオイルの他の例としては、アルコールのエステル、および脂肪酸（例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸オレイル、脂肪酸エステルの、またはプロピレングリコールのモノ、ジ−、またはトリグリセライド）がある。
【００５２】
ベジタブル起源のオイルの例としては、落花生類、オリーブ、ゴマ、ダイズ、コムギ胚芽、グレープ種子、ヒマワリ、キャスタ、亜麻仁、トウモロコシ、コプラ、掌、堅果、ハシバミ、またはなたねのオイルがある。
【００５３】
油性アジュバントの例としては、フロイントアジュバントが非常に効果的である；それらは、ミネラルオイルと、マンニトール・エステル含有物、またはあるいは殺されたマイコバクテリウムの併用によって生じる。
【００５４】
動物起源のオイルの例としては、スクアラン、スクアレン、または動物蝋油がある。
【００５５】
本発明の主題である組成物が、液状、エマルジョンである場合、前記オイルは、一般に好ましくは薬学的に許容される一以上の非イオン性界面活性剤と併用される。
【００５６】
特に、それらはフリーの金属、または重金属であるべきであり、および非常に低い酸性であるか、または過酸化物価を有するべきである。それらがＳ．Ｓ．Ｂｅｒｌｌｉｎ（ＡｌｌｅｒｇｙのＡｎｎａｌｓ）１９６２，２０，４７３、に記載された通りのものなどの安全性をテストするための基準、またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ．により記載されている異常な毒性をテストするための標準を満たすことが望ましい。
【００５７】
同じアジュバント相においてオイルと併用してもよい界面活性剤の例としては、先に記載した本質的にアジュバント性状を有するものがある。より一般的には、以下の化学ファミリーの非イオン性界面活性剤がある：
−脂肪酸のおよび糖（例えばソルビトール、マンニトール、シュークロースまたはグルコース）のエステルまたはエーテル、；
−脂肪酸のエステル、およびグリセリンまたはポリオール；
−グラフトアルコール、エーテル酸化物、カルボキシル、アミン、またはアミド基から得られるそれらのエステル類の親水性誘導体、
−レシチン、
−エトキシル化されたおよび／またはプロポキシル化された脂肪族アルコールまたは脂肪酸；
−８〜２２の炭素原子を含むこれらの界面活性剤の脂肪性連鎖。
【００５８】
−これらの界面活性剤において、好ましいものは、１４〜２０の炭素原子を含む脂肪性連鎖を有するもの、およびより詳細には、オレイン酸、レシノール酸、およびケトステアリン酸、およびその誘導体、並びに最も詳細には、オレイン酸マンニトール、および親水性基（例えばアミド、アミン、アルコール、ポリオール）、もしくはカルボキシル基、もしくはエトキシ、プロポキシ、および／もしくはブトキシ基をグラフトすることによって得られたオレイン酸マンニトール誘導体、またはオレイン酸マンニタン、またはその誘導体；それらは、マンニトールのポリヒドロキシル化された炭素連鎖を脱水することによって得られる（１−４または２−６位で環化される）。
【００５９】
−一般に、非イオン性界面活性剤、または非イオン性界面活性剤の混合液が、そのエマルジョン化特性を発揮させるためにオイルと併用してワクチン組成物中に存在する場合、その濃度は０．０１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの間に、および好ましくは０．１ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌの間である。
【００６０】
−非イオン性界面活性剤とオイルを併用した例としては、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（Ｒ）として市場に出されている製品がある。この製品の特徴を以下の表に示す：
【表１】
【００６１】
この場合において、固体状態では、この油性相は、前記組成物の特に底位の相を構成する。実際に、単純に室温において手で攪拌することよって、この配位のエマルションが、より容易に得られることが観測された。
【００６２】
本発明による組成物は、Ａｖｒｉｄｉｎｅ（Ｒ）、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）誘導体（特にスレオニル−ＭＤＰ）、ミコール酸誘導体、またはリピドＡ誘導体などの免疫刺激試薬を含んでいてもよい。
【００６３】
前記アジュバントを含む相は、以下においてアジュバント相と呼ぶこととする。本発明の主題である組成物は、一以上のアジュバント相を含んでいてもよい。
【００６４】
上記記載のような組成物は、さらに少なくとも１つの抗原性相（その希釈液の特性は液状で発揮され、かつ前記組成物が固体状の場合、抗原性相およびアジュバント相とは異なっている）を一以上含んでいてもよい。
【００６５】
上記記載のような組成物は、さらに少なくとも１つの抗原性相（その希釈液の特性は液状で発揮され、かつ前記組成物が固体状の場合、抗原性相およびアジュバント相とは異なっている）を一以上含んでいてもよい。
【００６６】
発明の第四の特定の側面に従って、上記記載の組成物は、油性相を含んでいない。
【００６７】
発明の第五の特定の側面に従って、上記記載の組成物は、抗原性相および油性アジュバント相から成る。
【００６８】
発明の第六の特定の側面に従って、上記記載の組成物は、抗原性相、油性アジュバント相、および希釈液相から成る。
【００６９】
後者の二つの配置において、上記記載の組成物中において固形状の場合、好ましくは、前記油性相が最底相であり、かつ前記抗原性相が最上相である。
【００７０】
本発明の第二の側面に従って、その主題は上記記載の通りの組成物を調製するための方法であって、：
ａ）−第一の固体相を形成するために、第一のアジュバント、希釈液、または抗原性の相（それは室温で、液状である）を、その凝固点以下の温度に持っていくことと、
ｂ）−ａ）において、調製された固体相の上に、第二のその他の抗原性、アジュバント、または希釈液の液状の相を添加して、次に、前記新しい組合せを、該二相の凝固点以下の温度に持っていき、二つの異なった相を組み合わせた固体を形成させることと、
ｃ）−適切であれば、新たな抗原性、アジュバント、または希釈液の液状相を、工程ｂ）において調製した前記組み合わせた固体の上に添加して、次に、前記新しい組合せを、該三相の凝固点以下の温度に持っていき、三つの異なった相を組み合わせた固体を形成させることと、
ｄ）適切であれば、−工程ｃ）において実行された順番の操作を、前記組成物を含む前記抗原性、アジュバント、または希釈液の相の最後が凍結するまで繰り返される。
【００７１】
より具体的には、本方法において上記記載の通り、抗原性相、油性アジュバント相、および任意に抗原性相の希釈液相からなる組成物を調製するために、工程ａ）において使用された相は、前記油性アジュバント相であり、工程ｂ）において使用された相は、前記組成物が一つである場合には、前記希釈液相、または前記抗原性相のいずれかであり、および場適切であれば、工程ｃ）において使用された相が、前記抗原性相である。
【００７２】
さらに、より詳しくは、抗原性性相、および一以上のオイルと一以上の非イオン性界面活性剤の組合せを含む油性相のワクチン・エマルジョンを調製するために、前記方法は以下の主要な工程を含む：
（ａ） 前記油性相の必要とされる量を所望の一次容器内に分注し、液体窒素の超低温気相内に静置して、急速凍結することと；
（ｂ） 工程（ａ）で得られた凍結相を、低温環境から直ちに取り除いて、必要量の分注したバッファーを、前記凍結相の最上部に慎重に相状化して、二つの区別可能な相を形成し相化し：これを直ちに超低温環境に戻して、前記分注バッファーを急速凍結させることと、
（ｃ） 工程（ｂ）から得られる相状化された組合せを、しばらくして、低温環境から除去して、次に、必要な量の濃縮抗原を前記凍結相の最上部に慎重に相状化して、第三の区別可能な相を形成するか、または層化し：これを直ちに超低温環境に戻して、前記抗原濃縮液を急速凍結させることと、
を含む工程。
【００７３】
本発明の第三の側面に従って、その主題は上記記載の通り、皮下注射によって、筋肉内注射によって、または静脈内注射によって、ヒトまたは動物の体を治療する方法を実施するための組成物である。
【００７４】
より詳しくは、前記層状に、かつ低温で保存された（ＳＡＣＳ）ワクチンは、必要なときに、室温で解凍して、単にかき混ぜることによって混合して、標的宿主に投与される。
【００７５】
本発明による組成物は、予防薬、または治療用の医薬として使うことができる。前記抗原またはインビボジェネレーターに依存して、本発明による組成物は、魚、エビなどの甲殻類、鳥類、特にガチョウ、シチメンチョウ、ハト、およびニワトリに、イヌなどのイヌ類に、ネコなどのネコ類に、ブタに、霊長類に、ウシなどのウシ類に、ｏｖｉｄａｅに、およびウマに投与してもよい。
【００７６】
本発明の最後の側面にしたがって、その主題は、少なくとも一つの抗原性媒質、少なくとも一つのアジュバント、および前記抗原性媒質のための、および／または前記アジュバントのための任意の少なくとも一つの希釈液を含む組成物を凍結して保存するための方法であって、
ａ）−第一の固体相を形成するために、第一のアジュバントの、希釈液の、または抗原性の相（それは室温で、液状である）を、その凝固点以下の温度に持っていくことと、
ｂ）−ａ）において、調製された固体相の上に、第二の他の抗原性の、アジュバントの、または希釈液の液状の相を添加して、次に、前記二相の凝固点以下の温度に前記新しい組合せを持っていき、該二つの異なった相を組み合わせた固体を形成させることと、
ｃ）−適切であれば、工程ｂ）において調製された前記組み合わせた固体の上に、新規の抗原性の、アジュバントの、または希釈液の液状の相を添加して、次に、前記三相の凝固点以下の温度に前記新しい組合せを持っていき、該三つの異なった相を組み合わせた固体を形成させることと、
ｄ）−適切であれば、工程ｃ）において実行された順番の操作のを、前記組成物を含む前記抗原性の、アジュバントの、または希釈液の相の最後が凍結するまで繰り返すことと、および、
ｅ）−このように凍結された組成物が、それを構成している前記相の凝固点以下の温度で保存されることを特徴とする方法である。
【００７７】
予想外に、オイル中水型（Ｗ／Ｏ）、水中オイル型（Ｏ／Ｗ）、および水中オイル中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）エマルジョンの形態のワクチンでは、−２０℃において７ヵ月間保存した後にそれらの活性が消失するするが、上記記載の方法によって貯蔵されたものは、温度および期間が同じ条件下でも活性が残存することが観察された。
【００７８】
より詳しくは、本方法において上記記載の通り、抗原性相、油性アジュバント相、および任意に抗原性相の希釈液相からなる組成物を調製するために、工程ａ）において使用された相は、前記油性アジュバント相であり、工程ｂ）において使用された相は、前記組成物が一つである場合には、前記希釈液相、または前記抗原性相のいずれかであり、および場合適切であれば、工程ｃ）において使用された相が、前記抗原性相である。
【００７９】
以下の例は、本発明を例示するが、それに限定しない。
【００８０】
【実施例】
１．第一番目の実施
Ａ．本発明による組成物の調製
口蹄疫を治療するためのワクチンの５ミリリットル（ｍｌ）用量を以下の方法で調製する：
１−約２．１５ｍｌの接種可能なミネラルオイルと、０．３５ｍｌのオレイン酸マンニタンおよびＰＥＧ ５００の混合液の組合せからなる２．５ｍｌのＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（Ｒ）ＩＳＡ２０６を約−１８℃において凍結する；
２−凍結した後、前記サンプルをフリーザから取り出して、直ちに２．４５ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を補充して凍結させる；
３−もう一度、前記サンプルをフリーザから取り出して、直ちに１０ｍｇ／ｍｌの口蹄疫抗原を含む０．０５ｍｌの濃縮物を補充して、凍結してワクチン組成物Ａｉを形成する。
【００８１】
Ｂ．従来技術による組成物の調製
羊の口蹄疫を治療するためのワクチンの５ｍｌ用量は、２．５ｍｌの油性アジュバント、約２．２５ｍｌの接種可能なミネラルオイルと０．２５ｍｌのオレイン酸マンニタンの混合物の組合せからなるＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（Ｒ）ＩＳＡ２０６（組み合わせた混合物は、国際公開ＷＯ９１／００１０６に記載されている方法に従ってエマルジョン化される）を、０．５ｍｇの口蹄病抗原を含む２．５ｍｌのＰＢＳ溶液中で混合することによって調製して、水−オイル−水エマルジョンの形態のワクチン組成物を形成する（組成物Ｂｊ）。
【００８２】
Ｃ．ワクチンの効能の比較研究
本発明によるワクチンの効能は、２．５ｍｌのＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（Ｒ）ＩＳＡ２０６、および２．５ｍｌのＰＢＳ緩衝液を含む５ｍｌのプラセボ用量（組成物Ｐｋ）、および従来技術によるものの効能をそれらの効能と比較して研究する。
【００８３】
試験１
組成物Ａｉを使用して（接種直前にエマルジョンを形成させるために、解凍して、任意にＰＢＳで希釈して、手で攪拌した後に直ちに使用する）、１ｍｌのさまざまな濃度の抗原を５匹のモルモットのグループに接種する。同様の手順をプラセボ組成物において行った。
【００８４】
２８日目にブースターを接種した後、体液性免疫応答を測定するためにはＩＧ１の、細胞性免疫応答を測定するためにはＩＧ２ａのＥＬＩＳＡアッセイによって前記ワクチンの活性を測定する。
【００８５】
モルモット５匹のそれぞれのグループにおいて、最初のワクチン接種の９０日後に保護された動物の数を計測した。
【００８６】
前記結果は、保護された動物の％として表し、以下の表に示した：
【表２】
−２０℃において７月保存された組成物Ａ４を使用して（接種直前にエマルジョンを形成させるために、解凍して、任意にＰＢＳで希釈して、手で攪拌した後に直ちに使用する）、１ｍｌのさまざまな濃度の抗原を５匹のモルモットのグループに接種する。同様の手順を−２０℃において７月保存したプラセボ組成物Ｐ４、およびＷ／Ｏ／Ｗエマルション（組成物Ｂ４）において行った。
【００８７】
２８日目にブースターを接種した後、体液性免疫応答を測定するためにはＩＧ１の、細胞性免疫応答を測定するためにはＩＧ２ａのＥＬＩＳＡアッセイによって前記ワクチンの活性を測定する。
【００８８】
モルモット５匹のそれぞれのグループにおいて、最初のワクチン接種の９０日後に保護された動物の数を計測して、ＰＤ５０指数（５０％未満が保護されている希釈の程度を表す）を測定した。
【００８９】
前記結果は、保護された動物の％として表し、以下の表に示した：
【表３】
【００９０】
この試験は、−２０℃において７月保存した後に使用した場合、互いに異なった（前記「異なった」の用語は、本記載における定義がなされると理解される）抗原性相およびアジュバント相を含む固体状のワクチン組成物は、さまざまな相のエマルジョン（凍結された）形態中に同じ成分（しかし、同じ期間および同じ温度で保存されている）を含むワクチン組成物より効果的であることを示す。
【００９１】
試験３
本発明によるワクチン組成物（−２０℃において７月保存して、解凍して、＋４℃（液状）において４月間（組成物Ａ５）、または７月間（組成物Ａ６）保存し、かつ様々な任意の小腔において、ＰＢＳ中で使用した）を使用して、１ｍｌのさまざまな濃度の抗原を５匹のモルモットのグループに接種する。同様の手順を−２０℃において７月保存されたプラセボ組成物Ｐ５、およびＰ６において行った。
【００９２】
２８日目にブースターを接種した後、体液性免疫応答を測定するためにはＩＧ１の、細胞性免疫応答を測定するためにはＩＧ２ａのＥＬＩＳＡアッセイによって前記ワクチンの活性を測定する。
【００９３】
モルモット５匹のそれぞれのグループにおいて、最初のワクチン接種の９０日後に保護された動物の数を計測して、ＰＤ５０指数（５０％未満が保護されている希釈の程度を表す）を測定した。
【００９４】
前記結果は、保護された動物の％として表し、以下の表に示した：
【表４】
【００９５】
従って、緊急の処置の場合において、本発明による凍結された組成物を、従来技術と同じ冷蔵条件下（＋４℃）で、それを使用する場所に輸送することができる。
【００９６】
２．第２番目の実験
Ａ．ワクチンの調製
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（Ｒ） ＩＳＡ ２０６を有する水中オイル中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）エマルジョンとして、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（Ｒ） ＩＳＡ ２５を有する水中オイル型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンのいずれかとしてＦＭＤＶ Ｏ１ローザンヌ不活性化抗原を取り込んでいるワクチン製剤は、従来のように（Ｂａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．． Ｖａｃｃｉｎｅ １４ （１３）， ｐａｇｅｓ１１８７−１１９８ ； １９９６）、または抗原濃縮物（国際ワクチンバンク（ＩＶＢ）によって、ウシ用量あたりのＰＤ５０値を４１として液体窒素中に維持されている）を使用する新規方法によって調製した。
【００９７】
前記製造されたワクチンは、２ｍ１のウシ用量につき５．６２ｐｇの１４６Ｓ抗原を含んだ。
【００９８】
前記新規製剤方法は、次のような４つの主な行程を含んだ：
１．必要な体積の油性アジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０６、または２５を所望の一次容器に分注して、液体窒素の超低温気相に静置して、急速凍結した。
【００９９】
２．次に、しばらくして前記凍結されたオイルアジュバントを低温環境から取り除き、必要量の分注したバッファーを前記凍結相の最上部に慎重に層状化して、二つの区別可能な相を形成し層化する。これを直ちに超低温環境に戻して、前記分注バッファーを急速凍結させる。
【０１００】
３．しばらくして、凍結された油性アジュバントおよび分注バッファーを低温環境から除去して、次に、必要な量の濃縮抗原を前記凍結相の最上部に慎重に層状化する。これを直ちに超低温環境に戻して、前記抗原濃縮液を急速凍結させる。
【０１０１】
４．前記層状に、かつ低温で保存された（ＳＡＣＳ）ワクチンは、必要なときに、室温で解凍して、単にかき混ぜることによって混合して、標的宿主に投与される。
【０１０２】
比較する目的で、従来のように製造されたＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０６および２５をアジュバントとして有するワクチンを、液体窒素の超低温気相に静置することによって急速凍結した。
【０１０３】
Ｂ．インビボにおける力価試験
メスのダンカン−ハートレイ・モルモット（ほぼ重量の４００−５００のｇｍ）で、ワクチン製剤のテストを行った。
【０１０４】
５匹の動物のそれぞれのグループに、１ｍｌ、０．３３ｍｌ、または０．１１ｍｌのいずれかの特定量のワクチンを皮下投与した。
【０１０５】
３×１０３ＩＤ５０の相同モルモット適合ウイルス（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ａｄａｐｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）でワクチン接種した後、２８日目に移植機を介した注射によって動物にチャレンジした。７−１０日間、全ての動物を厳密にモニターして、前記ウイルスがチャレンジ部位を越えて一般化できなかった場合に、免疫されたモルモットが保護されたと見なした。
【０１０６】
後の実験では、以前に記載した用量を減少させる代わりに、ワクチンの希釈を取り入れた。前記抗原は希釈されたけれども前記アジュバントは希釈されなかったので、同様に製造された抗原成分を含まないワクチンによって、本質的にワクチンが希釈された。使用した希釈範囲は、きっちりと三倍〜１／８１までであった。再び、３×１０３ＩＤ５０の相同モルモット適合ウイルスでワクチン接種した後、２８日目に移植機を介した注射によって動物にチャレンジした。７−１０日間、全ての動物を厳密にモニターし、上記したようにモニターした。
【０１０７】
Ｋａｒｂｅｒの方法（Ｋａｒｂｅｒ．（Ａｒｃｈ．）ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｋｏｌ、１９３１，１６２、４８０）によって、この希釈範囲におけるワクチンの作用強度（ＰＤ５０）を算出することができた。
【０１０８】
結果
第１の試験において、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（Ｒ） ＩＳＡ ２０６またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（Ｒ） ＩＳＡ ２５のいずれかに基づくＳＡＣＳワクチンにおいて、７ヵ月以上の期間にわたり、超低温におけるそれらの安定性を調査した。
【０１０９】
分割用量療法を使用した結果では、ワクチン作用強度にいかなる減少もない場合、前記方法がいずれのアジュバント化された製剤に対しても有害ではないことを示し、助長していた（表１）。
【０１１０】
【表５】
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
【表８】
【０１１４】
これらの結果は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０６によって製造されたワクチンを急速凍結方法によって、かつ非常に低温で提供して、凍結貯蔵できることを示唆する。
【０１１５】
【表９】
Claims (4)
- 少なくとも一つの抗原性媒質、少なくとも一つのアジュバントおよび任意の希釈液を含む組成物であり、
（ａ）当該組成物が固体状のとき、前記抗原性媒質は、前記アジュバント相とは異なった相を構成することと、
（ｂ）前記組成物の温度が４℃より高いか、または同じとき、前記組成物が液状であること、
とによって特徴付けられる組成物を調製するための方法であって、
ａ） 第一の固体相を形成するために、当該アジュバント、希釈液または抗原性の相（それは室温で、液状である）のうちの第１のものを、その凝固点以下の温度に持っていくことと、
ｂ） ａ）において、調製された固体相の上に、当該その他の抗原性、アジュバント、または希釈液の液状の相のうちの第２のものを添加して、次に、当該二相の凝固点以下の温度に持っていき、二つの異なった相の固体の組み合わせを形成させることと、
ｃ） 適切であれば、新たな抗原性、アジュバント、または希釈液の液状相を、工程ｂ）において調製した前記固体の組み合わせの上に添加して、次に、当該三相の凝固点以下の温度に持っていき、三つの異なった相の固体の組み合わせを形成させることと、
ｄ） 適切であれば、工程ｃ）において実行された一連の操作を、前記組成物を構成する前記抗原性、アジュバント、または希釈液の相の最後が凍結するまで繰り返されることと、
によって特徴づけられる方法。 - 請求項１に記載の方法であって、前記工程ａ）において使用された相は、油性アジュバント相であり、前記工程ｂ）において使用された相は、前記組成物が希釈液相を含む場合には、前記希釈液相または前記抗原性相のいずれかであり、および適切であれば、前記工程ｃ）において使用された相が、前記抗原性相である方法。
- 少なくとも一つの抗原性媒質、少なくとも一つのアジュバント、および前記抗原性媒質および／または前記アジュバントのための任意の少なくとも一つの希釈液を含む組成物を凍結して保存するための方法であって、
ａ） 第一の固体相を形成するために、前記少なくとも一つのアジュバント、希釈液または抗原性の相（それは室温で、液状である）のうちの第１のものを、その凝固点以下の温度に持っていくことと、
ｂ） ａ）において、調製された固体相の上に、当該他の抗原性、アジュバントまたは希釈液相のうちの第２のものを液体の状態で添加して、次に、その二相の凝固点以下の温度に持っていき、二つの異なった相の固体の組み合わせを形成させることと、
ｃ） 適切であれば、工程ｂ）において調製された前記固体組み合わせの上に、新規の抗原性、アジュバントまたは希釈液相を液体の状態で添加して、次に、その三相の凝固点以下の温度に持っていき、三つの異なった相を伴う固体組合せを形成させることと、
ｄ） 適切であれば、工程ｃ）において実行された一連の操作を、当該組成物をなす、前記抗原性、アジュバントまたは希釈液の相の最後が凍結するまで繰り返すことと、
ｅ） それにより、当該凍結された組成物を、それをなす前記相の最も低い凍結点よりも低い温度で維持することと、
によって特徴づけられる方法。 - 請求項３に記載の方法であって、前記工程ａ）において使用された相は、油性アジュバント相であり、前記工程ｂ）において使用された相は、前記組成物が希釈液相を含む場合には、当該希釈液相または前記抗原性相のいずれかであり、および適切であれば、工程ｃ）において使用された相は、前記抗原性相である方法。
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