DE68916113T2

DE68916113T2 - Neurokinin-A-Antagonisten.

Info

Publication number: DE68916113T2
Application number: DE68916113T
Authority: DE
Inventors: Stephen H Buck; Scott L Harbeson; John L Krstenansky; James R Mccarthy
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1988-06-20
Filing date: 1989-06-19
Publication date: 1994-09-22
Anticipated expiration: 2009-06-20
Also published as: IL90637A; ES2057024T3; FI893002A; NZ229552A; HU204850B; FI94351B; IE61362B1; ZA894533B; FI893002A0; DK174964B1; EP0347802A3; DK301889A; AU619857B2; HUT50196A; AR246085A1; CN1039597A; CN1030703C; NO176105B; DE68916113D1; JP2711720B2

Description

Diese Erfindung betrifft neue Peptidderivate, die Neurokinin-A-Antagonisten sind.
Die Substanz P und verwandte Tachykinine, Neurokinin A und Neurokinin B, sind eine Gruppe natürlich vorkommender Peptide, von denen bekannt ist, daß sie innerhalb des Körpergewebes weit verteilt sind und eine große Anzahl von biologischen Wirkungen aufweisen. Während Agonisten und Antagonisten der Substanz P und Neurokinin B bekannt sind, und während Neurokinin-A-Agonisten ebenfalls bekannt sind, wurde über Neurokinin-A-Antagonisten noch nicht berichtet. Die Anmelder entdeckten nun eine Klasse von Neurokinin-A-Antagonisten. Diese Verbindungen sind nicht nur vom biochemischen Gesichtspunkt aus von Interesse, sondern diese Verbindungen weisen auch eine n wertvollen pharmakologischen und medizinischen Nutzen auf.
Die Peptidderivate der folgenden Struktur 1 sind Neurokinin-A-Antagonisten:
X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-A&sub6;-Y 1
in der
X ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Acylrest mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet,
A&sub1; eine Bindung oder eine Gruppe aus 1 bis 4 Aminosäuren bedeutet,
A&sub2; eine Bindung oder Asp oder Glu darstellt,
A&sub3; eine beliebige Aminosäure bedeutet,
A&sub4; Phe oder N-Me-Phe darstellt,
A&sub5; Ile, Val, Leu, Phe, Ala, Tyr, Nle, Met oder N-Me-Val bedeutet,
A&sub6; Gly oder Sar bedeutet, und
Y einen Rest der Formel
darstellt, wobei B einen Rest mit einer der folgenden Formeln darstellt
-CH&sub2;- -, -CH&sub2;-S-, -CH&sub2;-O-, -CH=CH-,
- -CH&sub2;-, -CH(OH)CH&sub2; und -NH- -
und wobei R ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Phenylalkylenrest darstellt, wobei die Alkyleneinheit geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, und wobei die Phenyleinheit unsubstituiert ist oder mit einem C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylrest, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxyrest, einer Hydroxylgruppe oder einem Halogenatom monosubstituiert ist,
R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Isopropyl-, Isobutyl-, sek.-Butyl-, n-Butyl- und 2-(Methylthio)- ethylgruppen,
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon. Diese neuen Peptidderivate sind Neurokinin-A-Antagonisten und sind somit als antiasthmatische, entzündungshemmende und antiarthritische Mittel verwendbar.
Die folgenden allgemeinen Abkürzungen der Aminosäuren und der amino- und carboxyterminalen Gruppen werden durchweg in dieser Patentbeschreibung verwendet:
Gly (oder G) - Glycin
Ala (oder A) - Alanin
Val (oder V) - Valin
Leu (oder L) - Leucin
Ile (oder I) - Isoleucin
Fum - Fumaryl
Orn - Ornithin
Pro (oder P) - Prolin
Phe (oder F) - Phenylalanin
Trp (oder W) - Tryptophan
Met (oder M) - Methionin
Ser (oder S) - Serin
Thr (oder T) - Threonin
Cys (oder C) - Cystein
Tyr (oder Y) - Tyrosin
Asn (oder N) - Asparagin
Gln (oder Q) - Glutamin
Asp (oder D) - Asparaginsäure
Glu (oder E) - Glutaminsäure
Lys (oder K) - Lysin
Arg (oder R) - Arginin
His (oder H) - Histidin
Nle - Norleucin
Hyp - Hydroxyprolin
Glt - Glutaryl
Mal - Maleinyl
Npa - β-(2-Naphthyl)alanin
3,4-DehydroPro - 3,4-Dehydroprolin
Pgl - Phenylglycin
NMePgl - N-Methylphenylglycin
Sar - Sarcosin (N-Methylglycin)
pSubPhe - para-substituiertes Phenylalanin
SubPhe - ortho-, meta- oder para-, mono- oder disubstituiertes Phenylalanin
DAla (oder a) - D-Alanin
Ac - Acetyl
Suc - Succinyl
pClPhe - para-Chlorphenylalanin
pNO&sub2;Phe - para-Nitrophenylalanin
NMeVal - N-Methylvalin
Ein Alkylrest und der Alkylteil eines Alkoxyrestes umfassen geradkettige, verzweigte oder cyclische Alkylreste, zum Beispiel Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyl-, tert.-Butyl-, Pentyl-, Isopentyl-, sek.-Pentyl-, Cyclopentyl-, Hexyl-, Isohexyl-, Cyclohexyl- und Cyclopentylmethylgruppen. Die Alkyleneinheit der Phenylalkylenreste dieser Erfindung kann 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten und kann geradkettig oder verzweigt sein, zum Beispiel eine Methylen-, Ethylen-, Propylen-, Butylen-, Isopropyliden- und sek.-Butylidengruppe. Die Phenyleinheit der Phenylalkylenreste dieser Erfindung kann unsubstituiert sein oder kann an den ortho-, meta- oder bevorzugt para-Stellungen monosubstituiert sein. Unsubstituierte Phenyl- oder para-Hydroxyphenylgruppen sind bevorzugt. Ein Acylrest mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen umfaßt geradkettige, verzweigte, cyclische, gesättigte und ungesättigte Acylreste mit 1 oder 2 Carbonyleinheiten pro Rest, zum Beispiel Acetyl-, Benzoyl-, Succinyl-, Maleinyl- und Glutarylgruppen. Ein Halogenatom ist ein Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iodatom. In den Gruppen X dieser Erfindung ist das Wasserstoffatom, der Alkyl- oder Acylrest an die α-Aminogruppe der aminoterminalen Aminosäure gebunden. Die Peptide, in denen die Aminogruppe der aminoterminalen Aminosäure mit zwei Alkyl- oder Acylresten substituiert ist, sollen ebenfalls innerhalb des Bereiches der Peptide dieser Erfindung liegen.
Es sollte offensichtlich sein, daß die Peptidderivate dieser Erfindung Peptide umfassen, in denen die normale Peptid-Amidbindung der zwei carboxyterminalen Aminosäuren des natürlich vorkommenden Neurokinins A modifiziert wurde, und diese zwei modifizierten Aminosäuren sind hier chemisch als die Gruppe Y dargestellt. Unter Verwendung einer herkömmlichen, von Peptidchemikern verwendeten Nomenklatur kann die Gruppe Y, die zwei Reste Leu umfaßt (d.h. in der R&sub1; und R&sub2; jeweils eine sek.-Butylgruppe bedeuten), deren Amidbindung durch die Reduktion der Carbonylgruppe zu einer Methylengruppe modifiziert ist, als LeuΨ[CH&sub2;NH]Leu bezeichnet werden. Diese Bezeichnung zeigt, daß die Carbonylgruppe des Amids des vorletzten Leu zu einer Methylengruppe reduziert ist. Andere zur Beschreibung der Peptidderivate dieser Erfindung verwendete Nomenklaturbezeichnungen sind Ψ[CH&sub2;S], Ψ[CH&sub2;O], Ψ[CH=CH] Ψ[C(O)CH&sub2;], Ψ[CH(OH)CH&sub2;] und Ψ[NHC(O)].
Die Bezeichnung "eine Bindung" soll bei der Verwendung hinsichtlich der Definition von A&sub1; bedeuten, daß die Gruppe X direkt an die Gruppe A&sub2; gebunden ist, oder, daß in den Fällen, in denen A&sub2; ebenfalls eine Bindung ist, X dann direkt an die Gruppe A&sub3; gebunden ist. Ebenfalls soll die Bezeichnung "eine Bindung" bei der Verwendung hinsichtlich der Definition von A&sub2; bedeuten, daß A&sub1; direkt an die Gruppe A&sub3; gebunden ist, oder, daß in den Fällen, in denen A&sub1; ebenfalls eine Bindung ist, X dann direkt an die Gruppe A&sub3; gebunden ist.
Die hier verwendete Bezeichnung "eine beliebige Aminosäure" umfaßt die natürlich vorkommenden Aminosäuren sowie andere "nicht-Protein"-α-Aminosäuren, die von den Peptidchemie-Fachleuten bei der Herstellung synthetischer Analoga natürlich vorkommender Peptide gewöhnlich verwendet werden. Die natürlich vorkommenden Aminosäuren sind Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Methionin, Threonin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Cystein, Prolin, Histidin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Arginin, Ornithin und Lysin. Beispiele von "nicht Protein"-α-Aminosäuren sind Norleucin, Norvalin, Alloisoleucin, Homoarginin, Thiaprolin, Dehydroprolin, Hydroxyprolin (Hyp), Homoserin, Cyclohexylglycin (Chg), α-Amino- n-Buttersäure (Aba), Cyclohexylalanin (Cha), Aminophenylbuttersäure (Pba), an der ortho-, meta- oder para-Stellung der Phenyleinheit mit einem oder zwei des folgenden, einem (C&sub1;-C&sub4;)-Alkylrest, (C&sub1;-C&sub4;)-Alkoxyrest, Halogenatom oder einer Nitrogruppe substituierte Phenylalanine oder mit einer Methylendioxygruppe substituierte Phenylalanine, β-2- und -3-Thienylalanin, β-2- und -3-Furanylalanin, β-2-, -3- und -4-Pyridylalanin, β-(Benzothienyl-2- und -3-yl)alanin, β-(1- und 2-Naphthyl)alanin, O-alkylierte Derivate des Serins, Threonins oder Tyrosins, S-alkyliertes Cystein, die O-Sulfatester des Tyrosins, 3,5-Diiodtyrosin und die D-Isomere der natürlich vorkommenden Aminosäuren.
Mit Ausnahme des Glycins enthalten die natürlichen Aminosäuren ein chirales Kohlenstoffatom. Wenn nicht anders besonders angegeben, weisen die hier beschriebenen optisch aktiven Aminosäuren die L-Konfiguration auf. Üblicherweise ist die Struktur der hier dargestellten Peptide derart, daß sich das aminoterminale Ende auf der linken Seite der Kette befindet und das carboxyterminale Ende auf der rechten Seite der Kette ist. In Übereinstimmung damit und mit der herkömmlichen Verwendung sind die Gruppen B derart gezeichnet, daß die offene Valenz auf der linken Seite an das Kohlenstoffatom der Gruppe Y gebunden ist, die ein "H", den Rest "R&sub1;" und eine Gruppe "NH" trägt, und daß die offene Valenz auf der rechten Seite der Gruppe B an das Kohlenstoffatom der Gruppe Y gebunden ist, die ein "H", den Rest "R&sub2;" und eine Gruppe "CONH&sub2;" trägt.
Die Polypeptide der Formel 1 können pharmazeutisch verträgliche Salze mit einer beliebigen nicht-toxischen, organischen oder anorganischen Säure bilden. Beispielhafte anorganische Säuren, die geeignete Salze bilden, umfassen Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel- und Phosphorsäure und saure Metallsalze, wie Natriummonohydrogenorthophosphat und Kaliumhydrogensulfat. Beispielhafte organische Säuren, die geeignete Salze bilden, umfassen die Mono-, Di- und Tricarbonsäuren. Beispielhaft für diese Säuren sind zum Beispiel Essig-, Glykol-, Milch-, Brenztrauben-, Malon-, Bernstein-, Glutar-, Fumar-, Äpfel-, Wein-, Citronen-, Ascorbin-, Malein-, Hydroxymalein-, Benzoe-, Hydroxybenzoe-, Phenylessig-, Zimt-, Salicyl- und 2-Phenoxybenzoesäure und Sulfonsäuren, wie Methansulfonsäure und 2-Hydroxyethansulfonsäure. Die Salze der carboxyterminalen Aminosäureeinheit umfassen die mit beliebigen geeigneten anorganischen oder organischen Basen gebildeten nicht-toxischen Carbonsäuresalze. Beispielhaft umfassen diese Salze die der Alkalimetalle, zum Beispiel Natrium und Kalium, der Erdalkalimetalle, wie Calcium und Magnesium, der Leichtmetalle der Gruppe IIIA, umfassend Aluminium, und organischer primärer, sekundärer und tertiärer Amine, wie zum Beispiel Trialkylamine, umfassend Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, 1-Ethenamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin, Dihydrodiethylamin, N-(Niederalkyl)piperidin und ein beliebiges anderes geeignetes Amin.
Wie bei einer beliebigen allgemeinen Gruppe chemischer Verbindungen sind bestimmte Gruppen bevorzugt. Die Anmelder bevorzugen die Peptidderivate der Formel 1, in der X ein Wasserstoffatom bedeutet, und in der A&sub1; eine Bindung ist, die Anmelder bevorzugen die Peptidderivate der Formel 1, in der X Glt, Mal, Fum und im besonderen Suc ist. Die Anmelder bevorzugen auch die Peptidderivate der Formel 1, in der A&sub1; His- Lys-Thr, Lys-Thr, Thr, Asp-Val-Pro-Lys-Ser, Val-Pro-Lys-Ser, Pro- Lys-Ser, Lys-Ser, Ser, pGlu-Pro-Ser-Lys, Pro-Ser-Lys, Ser-Lys oder Lys ist. Die Anmelder bevorzugen im besonderen die Peptidderivate der Formel 1, in der A&sub1; His-Lys-Thr, Lys-Thr oder Thr ist. Die Anmelder bevorzugen die Peptidderivate der Formel 1, in der A&sub2; Asp ist. Die Anmelder bevorzugen auch die Peptidderivate der Formel 1, in der A&sub3; Gly, Gln, Asn, Sar und im besonderen Ala oder Ser ist. Die Anmelder bevorzugen ferner die Peptidderivate der Formel 1, in der A&sub4; Phe ist, sowie die Peptidderivate der Formel 1, in der A&sub5; Val ist, und in der A&sub6; Gly ist. Die Anmelder bevorzugen die Peptidderivate der Formel 1, in der B -CH&sub2;NH- ist, sowie die, in der R&sub1; eine Isobutylgruppe, das heißt eine 2-Methylpropylgruppe ist, und in der R&sub2; eine 2-Methylthioethyl-, Isobutyl- oder n-Butylgruppe ist. Die Anmelder bevorzugen im besonderen die Verbindungen, in denen R&sub1; und R&sub2; jeweils eine Isobutylgruppe bedeuten. Die am meisten bevorzugten Peptidderivate der Formel 1 sind H- Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;NR]-Leu-NH&sub2;, in denen R ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeutet.
Die Proteine dieser Erfindung können durch eine Reihe von Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten in dem Gebiet ohne weiteres bekannt sind. Diese Verfahren umfassen das Festphasensequentialverfahren, das unter Verwendung etablierter, vollautomatisierter Verfahren, wie durch die Verwendung eines automatisierten Peptidsynthesizers, durchgeführt werden kann. Zur Herstellung der Peptidderivate dieser Erfindung wird ein modifiziertes Dipeptid, entsprechend dem carboxyterminalen Dipeptid, das die modifizierte Peptidbindung aufweist, oder seine Vorstufe an einen Harzträger gebunden. Verfahren, die zur Herstellung jeder der modifizierten Peptidbindungen verwendet werden, sind in dem Fachgebiet allgemein bekannt und können von erfahrenen Peptidchemikern ohne weiteres durchgeführt werden. Das Verfahren zur Herstellung der Peptidderivate der Formel 1, in der B eine Gruppe -NHCO- darstellt, das heißt die Verbindungen Ψ[NHCO], ist von Chorev und Goodman, Int. J. Pept. Protein Res., 21(3), 258-68 (1983) bekannt. Das Verfahren zur Herstellung der Peptidderivate der Formel 1, in der B eine Gruppe -COCH&sub2;- oder -CH(OH)CH&sub2;- bedeutet, das heißt die Verbindungen Ψ[COCH&sub2;] beziehungsweise Ψ[CH(OH)CH&sub2;], ist von Holladay und Rich, Tetrahedron Letters, 24(41), 4401-04 (1983) bekannt. Das Verfahren zur Herstellung der Peptidderivate der Formel 1, in der B eine Gruppe -CH&sub2;NH- ist, das heißt die Verbindungen Ψ[CH&sub2;NH], ist von Sasaki und Coy, Peptides, Bd. 8, S. 119-121, 1987 bekannt und ist nachstehend ausführlicher beschrieben. Das Verfahren zur Herstellung der Peptidderivate der Formel 1, in der B eine Gruppe -CH&sub2;S- darstellt, das heißt die Verbindungen Ψ[CH&sub2;S], ist von Spatola und Darlak, Tetrahedron Letters, 44(3), 821-33 (1988) bekannt. Das Verfahren zur Herstellung der Peptidderivate der Formel 1, in der B eine Gruppe -CH&sub2;O- bedeutet, das heißt die Verbindungen Ψ[CH&sub2;O], ist von TenBrink, J. Org. Chem., 1987, 52, 418-22 bekannt.
Im besonderen werden die Verbindungen dieser Erfindung, in denen B eine Gruppe CH&sub2;N(R) ist, durch die Reduktion des N-Methoxy-N-methylamids der Formel 2 hergestellt, wobei der Aldehyd der Formel 3 hergestellt wird. Die Reduktion kann auf beliebige, allgemein bekannte Art und von Fachleuten in dem Gebiet ohne weiteres durchgeführt werden, wie durch die Verwendung von Lithiumaluminiumhydrid (LAH). Diese Reduktion kann geeigneterweise durch die Zugabe von etwa einem molaren Äquivalent LAH zu einer typischerweise auf etwa 0ºC gekühlten Lösung einer Verbindung der Formel 2 in einem nicht-reaktiven Lösungsmittel, wie einem etherischen Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran (THF) oder Diethylether, durchgeführt werden. Nachdem die Umsetzung weitgehend beendet ist, typischerweise nach etwa 30 Minuten, wird das Reaktionsgemisch durch die Zugabe von zum Beispiel 10 %igem Kalium- oder Natriumhydrogensulfat und anschließend Wasser gestoppt. Das Produkt kann dann zum Beispiel durch die Extraktion des wäßrigen Gemisches mit einem Lösungsmittel wie Diethylether, Waschen der Etherphase mit kalter, verdünnter wäßriger Chlorwasserstoffsäure, Trocknen und Entfernen des Lösungsmittels isoliert werden. Das Rohprodukt kann zum Beispiel durch Säulenchromatographie, wie durch Eluieren einer Silicagelsäule mit 55 %igem Ethylacetat/Hexan, gereinigt werden.
Der Aldehyd der Formel 3 wird anschließend mit einer harzgebundenen Aminosäure der Formel 6 umgesetzt
in der R und R&sub2; wie für Formel 1 definiert sind, und in der das Harz bedeutet. Das zuerst gebildete Schiffsche Base- Addukt wird, zum Beispiel unter Verwendung von Natriumcyanoborhydrid, in situ reduziert, wobei sich ein harzgebundenes, modifiziertes Dipeptid der Formel 7 ergibt,
in der R, R&sub1; und R&sub2; wie für Formel 1 definiert sind, und in der das Harz bedeutet.
Die Aminosäuren A&sub6; bis A&sub1; können auf übliche Art und Weise der Reihe nach zu dem harzgebundenen, modifizierten Dipeptid gegeben werden.
Die N-Methoxy-N-methylamide der Formel 2 werden aus der entsprechenden N-Boc-geschützten Säure auf übliche Art und Weise hergestellt. Carbonyldiimidazol wird zu einer getrockneten Lösung der N-Boc-geschützten Aminosäure in einem etherischen Lösungsmittel, wie Diethylether, gegeben. Man läßt das Reaktionsgemisch 10 Minuten bis 1 Stunde lang, typischerweise etwa 15-20 Minuten lang, rühren. N,O-Dimethylhydroxylamin HCl in DMF und ein sterisch gehindertes Amin, wie Diisopropylethylamin, werden zugegeben, und man läßt das Gemisch etwa 6 Stunden bis etwa 24 Stunden lang bei Raumtemperatur rühren. Die erwünschte Verbindung wird anschließend durch die Verdampfung des Lösungsmittels isoliert, und die Reinigung des Rohprodukts kann zum Beispiel durch Flashchromatographie auf Silicagel und Eluieren mit Methylenchlorid erreicht werden.
Der verwendete Harzträger kann ein beliebiges geeignetes, herkömmlicherweise in dem Fachgebiet für die Festphasenherstellung von Polypeptiden verwendetes Harz sein, bevorzugt Polystyrol, das mit 0,5 bis etwa 3 Prozent Divinylbenzol vernetzt wurde, das entweder chlormethyliert oder hydroxymethyliert wurde, um Stellen für die Esterbildung mit der anfänglich eingeführten α-aminogeschützten Aminosäure bereitzustellen.
Ein Beispiel eines Hydroxymethylharzes ist von Bodanszky et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597-98 (1966) beschrieben. Ein chlormethyliertes Harz ist von Bio Rad Laboratories, Richmond, California im Handel erhältlich, und die Herstellung dieses Harzes ist von Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco 1969), Kapitel 1, S. 1-6 beschrieben. Die geschützte Aminosäure kann durch das Verfahren von Gisin, Helv. Chem. Acta, 56, 1476 (1973) an das Harz gebunden werden. Viele an ein Harz gebundene, geschützte Aminosäuren sind im Handel erhältlich. Beispielsweise kann zur Herstellung eines Polypeptids dieser Erfindung, in dem das carboxyterminale Ende ein Thr-Rest ist, ein an ein benzyliertes, hydroxymethyliertes Phenylacetamidomethylharz (PAM) gebundenes tert.-Butyloxycarbonyl-geschütztes (Boc) Thr verwendet werden, das im Handel erhältlich ist.
Im Anschluß an die Kopplung der α-aminogeschützten Aminosäure an den Harzträger wird die Schutzgruppe unter Verwendung eines beliebigen, geeigneten Verfahrens, wie unter Verwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder HCl in Dioxan, abgespalten. Die Abspaltung der Schutzgruppe wird bei einer Temperatur zwischen 0ºC und Raumtemperatur durchgeführt. Andere Standardabspaltungsreagenzien und -bedingungen für die Entfernung spezifischer α- Amino-Schutzgruppen können verwendet werden. Nach der Entfernung der α-Amino-Schutzgruppe werden die anderen aminogeschützten Aminosäuren in der erwünschten Reihenfolge schrittweise gekoppelt. In einer anderen Ausführungsform können mehrere Aminosäuregruppen vor der Kopplung mit der auf das Harz aufgetragenen Aminosäuresequenz durch das Lösungsverfahren gekoppelt werden.
Die mit jeder Aminosäure, die in die Polypeptidsequenz eingeführt wurde, verwendete α-Amino-Schutzgruppe kann eine beliebige in dem Fachgebiet bekannte Schutzgruppe sein. Zu den Klassen der möglichen α-Amino-Schutzgruppen gehören (1) Schutzgruppen des Acyltyps, wie eine Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthalyl-, Toluolsulfonyl- (Tosyl-), Benzolsulfonyl-, Nitrophenylsulfenyl-, Tritylsulfenyl-, o-Nitrophenoxyacetyl- und eine α- Chlorbutyrylgruppe; (2) Schutzgruppen des aromatischen Urethantyps, wie eine Benzyloxycarbonyl- und eine substituierte Benzyloxycarbonylgruppe, wie eine p-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p- Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, 1-(p-Biphenylyl)-1-methylethoxycarbonyl-, α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl- und eine Benzhydryloxycarbonylgruppe; (3) aliphatische Urethanschutzgruppen, wie eine tert.-Butyloxycarbonyl- (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl-, Isopropyloxycarbonyl-, Ethoxycarbonyl- und eine Allyloxycarbonylgruppe; (4) Schutzgruppen des Cycloalkyl-Urethantyps, wie eine Cyclopentyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- und eine Cyclohexyloxycarbonylgruppe; (5) Schutzgruppen des Thiourethantyps, wie eine Phenylthiocarbonylgruppe; (6) Schutzgruppen des Alkyltyps, wie eine Triphenylmethyl- (Trityl-) und eine Benzylgruppe; (7) Trialkylsilangruppen, wie eine Trimethylsilangruppe. Die bevorzugte α-Amino-Schutzgruppe ist eine tert.- Butyloxycarbonylgruppe.
Die Auswahl eines geeigneten Kopplungsreagens liegt innerhalb der Fachkenntnis. Ein besonders geeignetes Kopplungsreagens ist N,N'-Diisopropylcarbodiimid und 1-Hydroxybenzotriazol, wenn die zuzugebende Aminosäure Gln, Asn oder Arg ist. Die Verwendung dieser Reagenzien verhindert die Nitril- und Lactambildung. Weitere Kopplungsmittel sind (1) Carbodiimide (z.B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid und N-Ethyl-N'-(γ-dimethylaminopropylcarbodiimid)); (2) Cyanamide (z.B. N,N-Dibenzylcyanamid); (3) Ketenimine; (4) Isoxazoliumsalze (z.B. N-Ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat); (5) monocyclische, Stickstoff enthaltende, heterocyclische Amide mit aromatischem Charakter, die 1 bis 4 Stickstoffatome im Ring enthalten, wie Imidazolide, Pyrazolide und 1,2,4-Triazolide. Spezielle heterocyclische Amide, die verwendbar sind, umfassen N,N'-Carbonyldiimidazol und N,N-Carbonyldi-1,2,4-triazol; (6) alkoxylierte Acetylene (z.B. Ethoxyacetylen); (7) Reagenzien, die mit der Carboxylgruppe der Aminosäure ein gemischtes Anhydrid (z.B. Ethylchlorformiat und Isobutylchlorformiat) oder das symmetrische Anhydrid der zu koppelnden Aminosäure (z.B. Boc-Ala-O-Ala-Boc) bilden, und (8) Stickstoff enthaltende, heterocyclische Verbindungen mit einer Hydroxylgruppe an einem Stickstoffatom des Ringes (z.B. N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxysuccinimid und 1-Hydroxybenzotriazol). Andere aktivierende Reagenzien und ihre Verwendung in der Peptidkopplung sind von Kapoor, J. Pharm. Sci., 59, S. 1-27 (1970) beschrieben. Die Anmelder bevorzugen die Verwendung des symmetrischen Anhydrids als Kopplungsreagens für alle Aminosäuren außer Arg, Asn und Gln.
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in einem etwa vierfachen Überschuß in den Festphasenreaktor eingeführt, und die Kopplung wird in einem Medium aus Dimethylformamid:Methylenchlorid (1:1) oder in Dimethylformamid allein oder bevorzugt in Methylenchlorid allein durchgeführt. In den Fällen, in denen eine unvollständige Kopplung eintritt, wird das Kopplungsverfahren vor der Entfernung der α-Amino- Schutzgruppe und vor der Kopplung der nächsten Aminosäure im Festphasenreaktor wiederholt. Der Erfolg der Kopplungsreaktion in jeder Synthesestufe wird durch die Ninhydrin-Reaktion, wie von E. Kaiser et al., Analyt. Biochem. 34, 595 (1970) beschrieben, überprüft.
Nachdem die erwünschte Aminosäuresequenz erhalten wurde, wird das Peptid vom Harz entfernt. Dies kann durch Hydrolyse, wie durch die Behandlung des an das Harz gebundenen Polypeptids mit einer Lösung aus Dimethylsulfid, p-Kresol und Thiokresol in wasserfreier Fluorwasserstoffsäure, erreicht werden.
Wie in dem Fachgebiet der Festphasensynthese von Peptiden bekannt ist, tragen viele der Aminosäuren funktionelle Gruppen, die während der Herstellung der Kette einen Schutz erfordern. Die Verwendung und die Auswahl der geeigneten Schutzgruppe liegt innerhalb der Fähigkeit von Fachleuten in dem Gebiet und hängt von der zu schützenden Aminosäure und von der Gegenwart anderer geschützter Aminosäurereste an dem Peptid ab. Die Auswahl dieser Schutzgruppe der Seitenkette ist insofern kritisch, daß sie eine sein muß, die während der Abspaltung der Schutzgruppe der α-Aminoeinheit nicht entfernt wird. Zum Beispiel sind geeignete Schutzgruppen der Seitenkette für Lysin eine Benzyloxycarbonyl- und eine substituierte Benzyloxycarbonylgruppe, wobei der Substituent aus einem Halogenatom (z.B. einem Chlor-, Brom- oder Fluoratom) und einer Nitrogruppe ausgewählt ist (z.B. eine 2-Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl- oder eine 3,4-Dichlorbenzyloxycarbonylgruppe), eine Tosyl-, t-Amyloxycarbonyl-, t-Butyloxycarbonyl- und eine Diisopropylmethoxycarbonylgruppe. Die alkoholische Hydroxylgruppe des Threonins und Serins kann mit einer Acetyl-, Benzoyl-, tert.-Butyl-, Trityl-, Benzyl-, 2,6-Dichlorbenzyl- oder einer Benzyloxycarbonylgruppe geschützt sein. Die carboxylische Hydroxylgruppe der Asparaginsäure und Glutaminsäure kann mit einer Benzyl- oder Cyclohexylgruppe geschützt sein. Die bevorzugte Schutzgruppe ist eine Benzylgruppe.
Diese Gruppen können durch in dem Fachgebiet allgemein bekannte Verfahren entfernt werden. Typischerweise wird die Entfernung der Schutzgruppe nach der Beendigung der Peptidkettensynthese durchgeführt, aber die Schutzgruppen können zu einem beliebigen anderen geeigneten Zeitpunkt entfernt werden.
Die Fähigkeit der Peptidderivate der Formel 1, als Neurokinin-A-Antagonisten zu wirken, kann durch die Fähigkeit dieser Peptide, mit iodiertem Neurokinin A um Neurokinin-A- Rezeptoren (NK2) von Säugern zu konkurrieren, unter Verwendung des Verfahrens von Buck et al., Science 226: 987-989, 1984, durch die Fähigkeit dieser Verbindungen, den durch Neurokinin A induzierten Umsatz von Phosphatidylinosit zu stimulieren oder zu inhibieren, unter Verwendung des Verfahrens von Bristow et al., British J. Pharmacol. 90: 211-21, 1987, oder der durch Neurokinin A induzierten Kontraktion der glatten Muskeln entgegenzuwirken, unter Verwendung des Verfahrens von Dion et al., Life Sciences 41: 2269-2278, 1987 gezeigt werden.
Auf Grund der Fähigkeit der Peptidderivate dieser Erfindung, als Neurokinin-A-Antagonisten zu wirken, sind die Verbindungen als Immunsuppressiva und in der Behandlung von Arthritis, Asthma, Schmerzen, Entzündung, Tumorwachstum, gastrointestinaler Hypermotilität, Huntington-Erkrankung, Psychose, Neuritis, Neuralgie, Kopfschmerzen, einschließlich Migräne, Hypertonie, Harninkontinenz, Urtikaria, Symptomen des Carzinoid-Syndroms, Grippe und gewöhnlicher Erkältung verwendbar. Wirksame Dosen, entweder oral oder parenteral, können durch Fachleute in dem Gebiet ohne weiteres bestimmt werden, und sind die Dosen, die einen Antagonismus des Neurokinin-A-Rezeptors (NK2) verursachen. Zum Beispiel können wirksame Dosen der Peptide dieser Erfindung etwa 0,5 ug/kg bis etwa 500 mg/kg des Körpergewichts des Patienten pro Tag betragen. Die Verbindungen werden geeigneterweise in Einheitsdosierungsformen verabreicht, die etwa 1 mg bis etwa 500 mg des Wirkstoffes enthalten, und können in 1 bis 4 oder mehr Einheitsdosierungsformen pro Tag verabreicht werden. Der hier verwendete Ausdruck "Patient" steht für Säuger, wie Primaten, umfassend Menschen, Schafe, Pferde, Rinder, Schweine, Hunde, Katzen, Ratten und Mäuse.
Obwohl einige der Peptidderivate die Passage durch den Darm im Anschluß an eine orale Verabreichung überleben können, bevorzugen die Anmelder die nicht-orale Verabreichung, zum Beispiel subkutan, intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal, die Verabreichung durch eine Depotinjektion, durch eine Implantatzubereitung oder durch die Anwendung auf den mukösen Membranen, wie die der Nase, des Rachens und der Bronchien, zum Beispiel in einem Aerosol, das ein Peptidderivat dieser Erfindung in Form eines Sprays oder trockenen Pulvers enthält.
Für die parenterale Verabreichung können die Verbindungen als injizierbare Dosierungen einer Lösung oder einer Suspension der Verbindung in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht werden, der eine sterile Flüssigkeit, wie Wasser und Öle sein kann, mit oder ohne den Zusatz eines Netzmittels und anderer pharmazeutisch verträglicher Adjuvantien. Beispielhafte Öle, die in diesen Zubereitungen verwendet werden können, sind die aus Petroleum, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, zum Beispiel Erdnußöl, Sojabohnenöl und Mineralöl. Im allgemeinen sind Wasser, Salzlösung, wäßrige Dextrose und Lösungen verwandter Zucker, Ethanol und Glykole, wie Propylenglykol oder Polyethylenglykol, bevorzugte flüssige Träger, besonders für injizierbare Lösungen.
Die Verbindungen können in Form einer Depotinjektion oder einer Implantat-Zubereitung verabreicht werden, die auf solche Art und Weise formuliert werden kann, so daß eine verzögerte Freisetzung des Wirkstoffes ermöglicht wird. Der Wirkstoff kann zu Pellets oder kleinen Zylindern gepreßt werden und subkutan oder intramuskulär als Depotinjektionen oder Implantate implantiert werden. Implantate können inerte Substanzen, wie biologisch abbaubare Polymere oder synthetische Silikone, zum Beispiel Silastic, einen von Dow-Corning Corporation hergestellten Silikonkautschuk, verwenden.
Die Abbildungen zeigen:
ABBILDUNG 1 veranschaulicht die Fähigkeit von H-Asp-Ser-Phe- Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;NH]Leu-NH&sub2; und H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;- NCH&sub3;]Leu-NH&sub2;, der Bindung an den NKA-Rezeptor entgegenzuwirken, wie durch die Fähigkeit der Testverbindung, mit ¹²&sup5;I markiertes NKA aus der Harnblase von Hamstern zu ersetzen, gezeigt wurde (Beispiel 1). Die Abszisse (x-Achse) zeigt die Konzentration des Agonisten oder Antagonisten des Neurokinin-A- Rezeptors (NKA) logarithmisch in Nanomolen. Die Ordinate (y-Achse) zeigt die beobachtete spezifische Bindung für jeden untersuchten Agonisten oder Antagonisten, die als Prozentsatz der maximalen spezifischen Bindung gemessen wurde.
NKA
NKA(3-10)
NKA(4-10)
H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;NH]Leu-NH&sub2;
H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;N(CH&sub3;)]Leu-NH&sub2;
Untersuchte Agonisten waren NKA und NKA-Fragmente, bestehend aus der dritten bis zur zehnten Aminosäure (NKA(3-10)) und aus der vierten bis zur zehnten Aminosäure (NKA(4-10)). Die Werte sind Mittelwerte ± S.E.M. aus 6-12 Experimenten. Die IC&sub5;&sub0;- Werte sind aus dem Punkt der 50 %igen Inhibierung graphisch abgeschätzt.
ABBILDUNG 2 veranschaulicht die Fähigkeit von H-Asp-Ser-Phe- Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;NH]Leu-NH&sub2;, der Bindung an den NKA-Rezeptor entgegenzuwirken, wie durch die Wirkung auf den Phosphatidylinosit-Umsatz (PI) in der Harnblase von Hamstern ge zeigt wurde (Beispiel 2). Die Abszisse (x-Achse) zeigt die Konzentration des Agonisten oder Antagonisten des NKA-Rezeptors logarithmisch nanomolar (nM). Die Ordinate (y-Achse) zeigt den beobachteten PI-Umsatz als Prozentsatz der Kontrolle.
NKA
NKA + 10 uM H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;NH]Leu-NH&sub2;
10 uM H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;NH]Leu-NH&sub2; erzeugte eine deutliche Verschiebung der Dosis-Antwort-Kurve des NKA in kompetitiver Art und Weise nach rechts. Die Werte sind Mittelwerte ± S.E.M. aus einer Dreifachbestimmung.
ABBILDUNG 3 veranschaulicht die Fähigkeit von H-Asp-Ser-Phe- Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;NCH&sub3;]Leu-NH&sub2; (MDL 29916), der Bindung an den NKA-Rezeptor entgegenzuwirken, wie durch die Wirkung auf den Phosphatidylinosit-Umsatz (PI) in der Harnblase von Hamstern gezeigt wurde (Beispiel 2). Die Abszisse (x-Achse) zeigt die Konzentration des Agonisten oder Antagonisten des NKA-Rezeptors logarithmisch nanomolar (nM). Die Ordinate (y-Achse) zeigt den beobachteten Pl-Umsatz als Prozentsatz der Kontrolle.
NKA
H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;N(CH&sub3;)]Leu-NH&sub2;
H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;NH]Leu-NH&sub2;
NKA + 1 uM H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;N(CH&sub3;)]Leu-NH&sub2;
NKA + 10 uM H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;N(CH&sub3;)]Leu-NH&sub2;
NKA + 100 uM H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;N(CH&sub3;)]Leu-NH&sub2;
1, 10 und 100 uM H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;N(CH&sub3;)]Leu-NH&sub2; erzeugten eine deutliche Verschiebung der Dosis-Antwort-Kurve des NKA in kompetitiver Art und Weise nach rechts. Das Schild- Diagramm dieser Daten hatte eine Steigung von -0,99, was einen kompetitiven Antagonismus anzeigte, und einen pA2-Wert von 7,66. H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;N(CH&sub3;)]Leu-NH&sub2; wies bis zu 100 uM nur eine 5 %ige teilweise Agonist-Wirksamkeit auf, und H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;NH]Leu-NH&sub2; wies nur eine 12 %ige teilweise Agonist-Wirksamkeit auf. Die Werte sind Mittelwerte ± S.E.M. aus einer Dreifachbestimmung.
ABBILDUNG 4 veranschaulicht die antagonistische Wirkung von H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;NH]Leu-NH&sub2; auf die durch NKA vermittelte, kontraktile Wirksamkeit in Harnblasenpräparaten von Hamstern (Beispiel 3). Die Abszisse (x-Achse) zeigt die Konzentration von NKA oder NKA mit 10 uM H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;NH]Leu-NH&sub2; logarithmisch nanomolar (nM). Die Werte sind Mittelwerte ± S.E.M. aus einer Dreifachbestimmung.
ABBILDUNG 5 veranschaulicht die antagonistische Wirkung von H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;N(CH&sub3;)]Leu-NH&sub2; auf die durch NKA vermittelte, kontraktile Wirksamkeit in Harnblasenpräparaten von Hamstern (Beispiel 3). Die Abszisse (x-Achse) zeigt die Konzentration von NKA oder NKA mit 10 uM H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly- LeuΨ[CH&sub2;N(CH&sub3;)]Leu-NH&sub2; logarithmisch nanomolar (nM). Die Werte sind Mittelwerte ± S.E.M. aus einer Dreifachbestimmung.

BEISPIELE

Diese Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkend en Beispiele veranschaulicht.

BEISPIEL 1

ANTAGONISMUS DES NEUROKININ-A-REZEPTORS DURCH H-ASP-SER-PHE-VAL-GLY-LEUΨ[CH&sub2;NH]LEU-NH&sub2; UND H-ASP-SER-PHE-VAL-GLY-LEUΨ[CH&sub2;N(CH&sub3;)]LEU-NH&sub2;, GEZEIGT DURCH IHRE FÄHIGKEIT, ¹²&sup5;I MARKIERTES NKA ZU VERDRÄNGEN

Die Harnblasen aus mehreren Hamstern wurden vereinigt, in kleine Stücke geschnitten und in 50 mM TRIS-HCl (pH 7,4) mit 120 mM NaCl und 5 mM KCl bei 4ºC homogenisiert und 15 Minuten lang bei 48 000 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 50 mM TRIS-HCl (pH 7,4) mit 10 mM EDTA und 300 mM KCl 30 Minuten lang bei 4ºC resuspendiert. Die Suspension wurde wie vorstehend zentrifugiert, und das Pellet wurde zweimal in 50 mM TRIS-HCl (pH 7,4) ohne Zusatz gewaschen und jeweils zentrifugiert. Das Gewebe wurde anschließend in einem Inkubationspuffer resuspendiert, und ein Aliquot (etwa 3-5 mg Gewebe) wurde zur Einleitung des Testverfahrens zu jedem Teströhrchen gegeben. Die Teströhrchen enthielten Inkubationspuffer, bestehend aus 50 mM TRIS-HCl (pH 7,4), 0,02 % BSA, 40 ug/ml Bacitracin, 4 ug/ml Chymostatin, 4 ug/ml Leupeptin, 2 mM MnCl&sub2;, 0,1 nM ¹²&sup5;Iodhistidyl-Neurokinin A (Amersham Corp.), und Konzentrationen der Titelverbindungen oder der Standards im Bereich von 0,03 nM bis 100 uM. Man ließ den Test 120 Min. lang bei Raumtemperatur bis zum Gleichgewicht ablaufen. Nach dieser Zeit wurden der Inhalt jedes Röhrchens durch in 0,5 %igem BSA vorgetränkte Whatman GF/B Filter schnell filtriert, und die Filter wurden zweimal mit eiskaltem 50 mM TRIS-HCl (pH 7,4) ohne Zusatz schnell gewaschen. Die an das Filter gebundene Radioaktivität wurde in einem Gammazähler quantitativ bestimmt. Die spezifische Bindung (Maximum) wurde als der Unterschied zwischen der Bindung in Gegenwart und Abwesenheit von 1 uM unmarkiertem Neurokinin A definiert. Die Konkurrenzreaktion von iodiertem Neurokinin A mit den Testverbindungen oder Standards um die Bindung wurde als Prozentsatz dieser maximalen Konkurrenzreaktion ausgedrückt. Die IC&sub5;&sub0;-Werte (die zur Inhibierung von 50 % der Rezeptorbindung erforderliche Konzentration) betrugen für die Titelverbindung 100-200 nM (Abbildung 1).

BEISPIEL 2

DURCH DIE WIRKUNG AUF DEN PHOSPHATIDYLINOSIT-UMSATZ GEZEIGTER ANTAGONISMUS DES NEUROKININ-A-REZEPTORS DURCH H-ASP-SER-PHE-VAL-GLY-LEUΨ[CH&sub2;NH]LEU-NH&sub2; UND H-ASP-SER-PHE-VAL-GLY-LEUΨ[CH&sub2;N(CH&sub3;)]LEU-NH&sub2;

Die Harnblasen aus mehreren Hamstern wurden vereinigt und mit einem Gewebezerkleinerer auf 350 um zerkleinert. Das zerkleinerte Gewebe wurde anschließend in einem Krebs-Hepes- Puffer bei 37ºC 30 Minuten lang inkubiert, wobei alle 15 Minuten Wechsel mit frischem Puffer erfolgten. Das Gewebe wurde anschließend in diesem Puffer mit 100-200 uCi ³H-Inosit bei 37ºC inkubiert. Das Gewebe wurde dann gewaschen und weitere 30 Minuten lang in Krebs-Hepes (mit 10 mM Li&spplus;) bei 37ºC inkubiert, wobei alle 15 Minuten ein Wechsel mit frischem Puffer erfolgte. Teile der Gewebemasse (etwa 10-20 mg pro Teströhrchen) wurden anschließend in Li&spplus;-Puffer gegeben, die Testverbindung wurde dann in 25 ul zugegeben, und anschließend wurden verschiedene Konzentrationen an Neurokinin A in 25 ul bis zu einem Endvolumen von 250 ul zugegeben. Die Testverbindung wurde bei Konzentrationen im Bereich von 1 nM bis 100 uM untersucht, und die Konzentrationen an Neurokinin A lagen im Bereich von 1 nM bis 10 uM. Zur Überprüfung der Agonist-Wirksamkeit wurde die Testverbindung bei den gezeigten Konzentrationen auch allein untersucht. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde der Phosphatidylinosit-Umsatz durch die Zugabe von 940 ul Chloroform:Methanol (1:2), dann durch 310 ul Chloroform und anschließend durch 310 ul Wasser beendet. Jedes Röhrchen wurde dann 15 Sekunden lang verwirbelt und anschließend zur Trennung der Phasen bei 3000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert. Eine 0,5 ml Ionenaustauschersäule Biorad AG-1X8 (Formiat) wurde anschließend mit 900 ul der oberen (wäßrigen) Phase beladen. 50 ul der unteren Phase (Chloroform) wurden aus jedem Röhrchen entnommen und in ein Zählfläschchen gegeben, getrocknet und in Szintillationsflüssigkeit gezählt. Das Material auf den Säulen wurde der Reihe nach mit:
1) 10 ml Wasser
2) 5 ml 5 mM Dinatriumtetraborat/60 mM Natriumformiat
3) 10 ml 1 M Ammoniumformiat in 0,1 M Ameisensäure gewaschen. Die letzte (dritte) Waschlösung wurde aufgenommen und 1 ml wurde mit 6 ml ACS-Szintillationsflüssigkeit vermischt und gezählt. Anschließend wurde fuhr jede Probe das Verhältnis dieser Zählungen (gesamte Inositphosphate) zu den entsprechenden Zählungen der organischen Phase berechnet. Die Verhältnisse in Gegenwart der Testverbindung und/oder der Standards wurden dann mit den Verhältnissen für die Kontrollröhrchen (d.h. kein stimulierender Agonist) verglichen. Die Dosis-Antwort-Kurven wurden aufgestellt, und die Fähigkeiten der Testverbindungen, den durch Neurokinin-A induzierten Phosphatidylinosit-Umsatz zu stimulieren oder zu inhibieren, wurden durch eine graphische Analyse oder mit Hilfe eines Computerprogrammes bestimmt und sind in den Abbildungen 2 und 3 veranschaulicht.

BEISPIEL 3

PRÄPARATION DER KONTRAKTION V0N HARNBLASEN AUS HAMSTERN

Halbstreifen von Harnblasen aus männlichen syrischen Goldhamstern (75-100 g) wurden, wie von Dion et al. (Life Sciences 41: 2269-2278, 1987) beschrieben, bei 31ºC und mit 1 g Ruhespannung in Tyrod-Puffer suspendiert. 10 uM Enkephalinase-Inhibitor Thiorphan wurden 15 Minuten vor jeder Zugabe der Testverbindung zu dem Puffer gegeben. Die kumulativen Dosis-Antwort-Kurven des NKA wurden zuerst in Abwesenheit und dann in Gegenwart der Testverbindung aufgestellt. Die Testverbindungen wurden ebenso kumulativ zugegeben, um festzustellen, ob sie selbst irgendwelche kontraktilen Wirkungen aufwiesen oder nicht. Jede beobachtete Wirkung der Testverbindung ließ man ab klingen, bevor die nächste kumulative Konzentration zugegeben wurde. Unter diesen Bedingungen betrug die EC&sub5;&sub0; für die kontraktilen Wirkungen des NKA in guter Übereinstimmung mit den Literaturwerten 10 nM. Die kontraktilen Daten sind als Spannung in Gramm ausgedrückt, die zusätzlich zu der Ruhespannung entwickelt wird. In drei getrennten Harnblasengeweben von Hamstern erzeugte jeweils H-Asp-Ser- Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;NH)Leu-NH&sub2; oder H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;N(CH&sub3;)]Leu-NH&sub2; bis zu Konzentrationen von 10 uM keine Kontraktion. Die Abbildungen 4 und 5 veranschaulichen die kontraktile Kraft als Funktion der NKA-Konzentration in Abwesenheit und in Gegenwart der Testverbindung.

BEISPIEL 4

I. Herstellung des Boc-Leu-Aldehyds (Fehrentz, J.-A. und Castro, B., Synthesis, 1983, 676-678):

A. N-t-Boc-Leucin-N-methoxy-N-methylamid:

15,0 mmol Boc-Leucinhydrat wurden in 30 ml trockenem Ether gelöst. Die Lösung wurde über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, und der Feststoff wurde durch Filtration entfernt. 16,5 mmol Carbonyldiimidazol wurden zu dem Filtrat gegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. Eine Suspension von 22,5 mmol O,N-Dimethylhydroxylaminhydrochlorid in 15 ml Dimethylformamid und 3,9 ml Diisopropylethylamin wurde zu der entstandenen Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in 75 ml Ethylacetat verdünnt und mit 3 x 40 ml kalter 1 N HCl, 3 x 40 ml gesättigtem NaHCO&sub3; und 1 x 40 ml gesättigtem NaCl gewaschen. Die organische Phase wurde mit MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und das Ethylacetat wurde unter vermindertem Druck entfernt. Analytische Daten: Rf (Silicagel F254): 0,51 (Ethylacetat/Hexan 3/2); ¹H-NMR (CDCl&sub3;) (TMS int.): δ=0,95 ppm (2d, 6H, J=6,6 Hz); 1,42 (s, 11H); 1,64-1,80 (m, 1H); 3,20 (s, 3H); 3,80 (s, 3H); 4,72 (m, 1H); 5,10 (d, 1H, J=7,5 Hz). Massenspektr.: M+H&spplus;: Theoretisch: 275. Beobachtet: 275.

B. Boc-Leucinaldehyd

2,5 mmol Boc-Leucin-N-methoxy-N-methylamid wurden in 30 ml trockenem Ether gelöst. 3,2 mmol Lithiumaluminiumhydrid (1 M Lösung in Tetrahydrofuran) wurden zu dieser Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und anschließend durch die Zugabe einer Lösung von 0,6 g NaHSO&sub4; in 10 ml Wasser sorgfältig gelöscht. Das Reaktionsgemisch wurde zu 75 ml Ether gegeben und mit 3 x 30 ml kalter 1 N HCl, 3 x 30 ml gesättigtem NaHCO&sub3; und 1 x 30 ml gesättigtem NaCl gewaschen. Die organische Phase wurde mit MgSO&sub4; getrocknet, filtriert, und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt. Analytische Daten: Rf (Silicagel 60 F254): 0,68 (Ethylacetat/Hexan 3/2). Massenspektr.: M+H&spplus;: Theoretisch: 216. Beobachtet: 216.

II. Herstellung des Leu-Harzes:

Es wurden Standardverfahren der Festphasenpeptidsynthese auf einem automatischen Peptidsynthesizer verwendet. Nach der Erzeugung von 0,5 mmol Boc-Leu-Harz wurde die Boc- Schutzgruppe entfernt, und das Harz wurde mit Dimethylformamid und Dichlormethan gewaschen und getrocknet.

III. Bildung der reduzierten Amidbindung (LeuΨ[CH&sub2;NH]):

2 mmol Boc-Leu-Aldehyd wurden in 10 ml 1 %iger Essigsäure in Dimethylformamid gelöst, und diese Lösung wurde zu dem Reaktionsgefäß mit 0,5 mmol Leu-Harz (siehe II. vorstehend) gegeben. Eine Lösung von 150 mg NaCNBH&sub3; in 2 ml Dimethylformamid wurde zu diesem Gemisch gegeben. Das Gemisch wurde 4 Stunden lang geschüttelt, das Reaktionsgefäß wurde entleert, und das Harz wurde mit Dimethylformamid und anschließend mit Dichlormethan gewaschen.

IV. Herstellung von [Ψ(CH&sub2;NH]&sup9;, Leu¹&sup0;]NKA&sub4;&submin;&sub1;&sub0;:

Die Herstellung des Peptids wurde auf dem automatischen Peptidsynthesizer durch aufeinanderfolgende Zugabe der übrigen Aminosäuren (Gly, Val, Phe, Ser (Bzl) und Asp (Chxl)) beendet. Das Peptid wurde von dem Harz abgespalten, und die Schutzgruppen wurden unter Verwendung von wasserfreiem HF/Anisol (10:1) umfassend abgespalten. Das Peptid wurde unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC-Verfahren gereinigt. Analytische Daten: Aminosäureanalyse: (HCl-Abbau) Asp (1,03); Ser (0,93); Gly (1,01); Val (0,96); Phe (0,74). Peptidgehalt: 53,4 %. Massenspektrometrie durch Beschuß mit schnellen Atomen: M+H&spplus;: Theoretisch: 735. Beobachtet: 735.

V. Herstellung von [Ψ[CH&sub2;NCH&sub3;]&sup9;, Leu¹&sup0;]NKA&sub4;&submin;&sub1;&sub0;:

0,5 mmol N-Methyl-Leu-Harz (aus Boc-N-Methylleucin gemäß II vorstehend hergestellt) wurden mit 2,0 mmol Boc-Leu- Aldehyd, wie vorstehend in III beschrieben, umgesetzt. Die Peptidsynthese wurde anschließend, wie vorstehend in IV beschrieben, beendet. Analytische Daten: Aminosäureanalyse: (HCl-Abbau) Asp (1,01); Ser (0,89); Gly (1,02); Val (1,00); Phe (0,98). Peptidgehalt: 53,5 %. Massenspektrometrie durch Beschuß mit schnellen Atomen: M+H&spplus;: Theoretisch: 749. Beobachtet: 749.

VI. Herstellung von [Ψ[CH&sub2;NCH&sub2;R]&sup9;, Leu¹&sup0;]NKA&sub4;&submin;&sub1;&sub0;:

Das Boc-Leu[Ψ(CH&sub2;NH)]-Leu-Harz wird gemäß den vorstehenden Schritten II und III hergestellt. Das Harz wird anschließend mit 2,5 mmol R-CHO in 10 ml 1 %iger HOAc in Dimethylformamid in Gegenwart von NaCNBH&sub3; wie vorstehend in III beschrieben umgesetzt. Die Herstellung des Peptids wird anschließend wie vorstehend in IV beschrieben beendet.

Claims

1. Peptidderivat der allgemeinen Formel I

X-A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-A&sub6;-Y (I)

in der X ein Wasserstoffatom, einen Alkylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder einen Acylrest mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet,

A&sub1; eine Bindung oder His-Lys-Thr, Lys-Thr, Thr, Val-Pro- Lys-Ser, Pro-Lys-Ser, Lys-Ser, Ser, pGlu-Pro-Ser-Lys, Pro-Ser-Lys, Ser-Lys, Lys oder His bedeutet,

A&sub2; eine Bindung oder Asp oder Glu darstellt,

A&sub3; Gly, Gln, Asn, Sar, Ala oder Ser bedeutet,

A&sub4; Phe oder N-Me-Phe darstellt,

A&sub5; Ile, Val, Leu, Phe, Ala, Tyr, Nle, Met oder N-Me-Val bedeutet;

A&sub6; Gly oder Sar bedeutet, und

Y einen Rest der Formel

darstellt, wobei B einen Rest mit einer der folgenden Formeln darstellt

-CH&sub2;- -, -CH&sub2;-S-, -CH&sub2;-O-, -CH=CH-,

- -CH&sub2;-, -CH(OH)CH&sub2;-, oder -NH- -

und wobei R ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder einen Phenylalkylenrest darstellt, wobei die Alkyleneinheit geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist und wobei die Phenyleinheit unsubstituiert ist oder mit einem C&sub1;&submin;&sub4;-Alkylrest, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkoxyrest, einer Hydroxylgruppe oder einem Halogenatom monosubstituiert ist,

R&sub1; und R&sub2; jeweils unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Isopropyl-, Isobutyl-, sek. -Butyl-, n-Butyl- und 2- (Methylthio)ethylgruppen,

oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.

2. Peptidderivat nach Anspruch 1, wobei X ein Wasserstoffatom ist.

3. Peptidderivat nach Anspruch 1 oder 2, wobei A&sub1; eine Bindung und X Glt, Mal, Fum oder Suc bedeutet.

4. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei A&sub1; eine Bindung und X Suc bedeutet.

5. Peptidderivat nach Anspruch 1, wobei A&sub1; His-Lys-Thr, Lys-Thr oder Thr bedeutet.

6. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei A&sub2; Asp bedeutet.

7. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei A&sub3; Ala oder Ser bedeutet.

8. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei A&sub4; Phe bedeutet.

9. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei A&sub5; Val bedeutet.

10. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei A&sub6; Gly bedeutet.

11. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei B -CH&sub2; - bedeutet.

12. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei R&sub1; eine Isobutylgruppe ist.

13. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei R&sub2; eine 2-Methylthioethyl-, Isobutyl- oder n-Butylgruppe bedeutet.

14. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei R&sub1; und R&sub2; jeweils eine Isobutylgruppe bedeuten.

15. Peptidderivat nach Anspruch 1, wobei X ein Wasserstoffatom, Glt, Mal, Fum oder Suc bedeutet, A&sub1; eine Bindung, His-Lys-Thr, Lys-Thr, Thr, Val-Pro-Lys-Ser, Pro-Lys-Ser, Lys-Ser, Ser, pGlu-Pro-Ser-Lys, Pro-Ser-Lys, Ser-Lys oder Lys darstellt, A&sub2; eine Bindung, Asp oder Glu bedeutet, A&sub3; Gly, Gln, Asn, Sar, Ala oder Ser bedeutet, A&sub4; Phe oder N-Me-Phe bedeutet, A&sub5; Ile, Val, Leu, Phe, Ala, Tyr, Nle, Met oder N-Me-Val bedeutet, A&sub6; Gly oder Sar bedeutet, B -CH&sub2;NH- bedeutet und R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus einer Isopropyl-, Isobutyl-, sek.-Butyl-, n-Butyl- oder 2-(Methylthio)ethyl- Gruppe.

16. Peptidderivat nach Anspruch 15, wobei X ein Wasserstoffatom ist.

17. Peptidderivat nach Anspruch 15 oder 16, wobei A&sub1; eine Bindung, His-Lys-Thr, Lys-Thr oder Thr bedeutet.

18. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei A&sub2; eine Bindung oder Asp bedeutet.

19. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei X ein Wasserstoffatom darstellt, A&sub1; His-Lys-Thr, Lys-Thr oder Thr darstellt und A&sub2; Asp bedeutet.

20. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei A&sub3; Ala oder Ser bedeutet.

21. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 15 bis 20, wobei A&sub4; Phe bedeutet.

22. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 15 bis 21, wobei A&sub5; Val bedeutet.

23. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 15 bis 22, wobei A&sub6; Gly bedeutet.

24. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 15 bis 23, wobei B -CH&sub2; - bedeutet.

25. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 15 bis 24, wobei R&sub1; eine sek.-Butylgruppe ist.

26. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 15 bis 25, wobei R&sub2; eine 2-(Methylthio)ethyl-, sek.-Butyl- oder n-Butylgruppe ist.

27. Peptidderivat nach Anspruch 15, nämlich

H-Asp-ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;NH]Leu-NH&sub2; oder

H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ[CH&sub2;N(CH&sub3;)]Leu-NH&sub2;.

28. Verfahren zur Herstellung eines Peptidderivats nach einem der Ansprüche 1 bis 27 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, umfassend die Bindung an eine harzgebundene Verbindung der Formel

in der R&sub1;, R&sub2; und B die in den vorangehenden Ansprüchen angegebene Bedeutung haben und wobei Boc eine Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe ist und R (mit dem Kreis darum) das Harz darstellt, der α-aminogeschützten Aminosäuren in der Reihenfolge von A&sub6; bis zu A&sub1; an die terminale Aminogruppe der wachsenden Peptidkette, welche mittlerweile durch Entfernung ihrer Aminoschutzgruppe freigelegt wurde.

29. Peptidderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 27 oder ein Gemisch davon zur Verwendung als pharmazeutisch wirksamer Stoff.

30. Peptidderivat nach einern der Ansprüche 1 bis 27 oder ein Gemisch davon zur Verwendung als Neurokinin A-Antagonist.

31. Arzneimittel für die Behandlung von Asthma, Entzündungen und/oder Arthritis, enthaltend eine wirksame Menge eines Peptidderivats nach einem der Ansprüche 1 bis 27 oder ein Gemisch davon und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel.