FI94351C

FI94351C - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidijohdannaisten valmistamiseksi

Info

Publication number: FI94351C
Application number: FI893002A
Authority: FI
Inventors: Stephen Henderson Buck; John Leonard Krstenansky; Iii Chester Fred Hassmann; James Ray Mccarthy; Scott Lee Harbeson
Original assignee: Merrell Dow Pharma
Priority date: 1988-06-20
Filing date: 1989-06-19
Publication date: 1995-08-25
Also published as: IL90637A; ES2057024T3; FI893002A; NZ229552A; HU204850B; FI94351B; IE61362B1; ZA894533B; FI893002A0; DK174964B1; EP0347802A3; DK301889A; AU619857B2; HUT50196A; AR246085A1; CN1039597A; CN1030703C; NO176105B; DE68916113D1; JP2711720B2

Description

94351

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidijohdannaisten valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää uusien terapeutti-5 sesti käyttökelpoisten peptidi johdannaisten valmistamiseksi. Yhdisteet ovat neurokiniini A:n antagonisteja.

Substanssi P ja sille sukua olevat takykiniinit, neurokiniini A ja neurokiniini B, ovat ryhmä luonnossa esiintyviä peptidejä, joiden on osoitettu olevan laajalle 10 levinneitä kehon kudoksissa ja joilla on paljon erilaisia biologisia vaikutuksia. Samalla kun substanssi P:n ja neurokiniini B:n agonistit ja antagonistit tunnetaan ja samalla kun myös neurokiniini A:n agonistit tunnetaan, neurokiniini A:n antagonisteja ei ole vielä raportoitu. Nyt 15 on keksitty ryhmä neurokiniini A:n antagonisteja. Sellaiset yhdisteet eivät ole mielenkiintoisia vain biokemialliselta kannalta katsottuna vaan sellaisilla yhdisteillä on myös arvokkaita farmakologisia ja lääkinnällisiä käyttömahdollisuuksia .

20 Keksinnön mukaisesti valmistetaan terapeuttisesti käyttökelpoisia peptidijohdannaisia, joilla on kaava

X-A)-A2-A3-A4-A5-A6-Y

·· 25 jossa X on vety, 1-6 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä tai 2-10 hiiliatomia sisältävä asyyliryhmä, A] on sidos tai ryhmä, joka koostuu 1-4 neurokiniini A:n aminohaposta, 20 A2 on sidos, Asp tai Glu, : A3 on ei-aromaattinen, ei-hapan aminohappo, joka on

Ala, Ser, Gly, Gin, Asn, Sar, Thr, Cys, Lys, Arg, Met, Vai, Leu, Ile, A4 on Phe, Trp tai N-Me-Phe, 35 A5 on Ile, Vai tai Leu, 2 94351 Ä6 on Gly tai Sar, ja Y on kaavan f1 f2 5 NH-1- CH2~N-1-R3

H RH

mukainen ryhmä, jossa kaavassa R on vetyatomi tai 1-5 hiiliatomia sisältävä al-10 kyyliryhmä, isovaleryyli, tai se on fenyy1ialkyleeniryhmä, jossa alkyleeniosa on suora tai haaroittunut ja siinä on 1-6 hiiliatomia ja jossa fenyyliosa on substituoimaton tai monosubstituoitu CM-alkyyli-, C,^-alkoksi-, hydroksi-, tai halogeeniryhmällä, 15 Ri ja R2 ovat kumpikin toisistaan riippumattomasti valittu isopropyyli-, isobutyyli-, sek-butyyli-, n-butyy-li-, bentsyyli- ja 2-(metyylitio)etyyliryhmistä, ja R3 on -CONH, tai näiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi.

20 Nämä uudet peptidijohannaiset ovat neurokiniini A:n antagonisteja ja ovat siten käyttökelpoisia astman, tulehduksen ja niveltulehduksen vastaisia aineita.

Keksinnön mukaisesti saatavat peptidit sisältävät keksinnön mukaisena piirteenä modifioidun amidisidoksen, * 25 jota ei esiinny tekniikan tasoon kuuluvissa yhdisteissä.

Artikkelissa Chem. Pharm. Bull. 35 (8) , 3442-3446 (1987), Hashimoto, kuvataan neurokiniini 3-analogeja. Julkaisun mukaan antagonistista aktiivisuutta NKA:ta vastaan osoitti ainoastaan [Arg3, D-Trp6,8, Gly7]-NKB(3-10) . Keksin-30 nön mukaisesti saatavat peptidit poikkeavat amidisidoksen * lisäksi aminohapposekvenssiltään em. julkaisusta tunnetusta NKA-antagonistista.

Artikkelissa Eur. J. of Pharm. 118, 25-36 (1985), Mizrahi, kuvataan kaksi NKA-antagonistista aktiivisuutta 25 omaavaa peptidiä. Nämä ovat [DPro4, Lys6, D-Trp7·9·10, Phen]SP- « 94351 3 (4-11) ja [D-Tyr4, D-Trp7,9, Nle"]SP-(4-11) . Nämäkin peptidit poikkeavat primaarirakenteensa osalta keksinnön mukaisesti saatavista peptideistä, minkä lisäksi ne eivät sisällä modifioitua amidisidosta.

5 Tässä hakemuksessa on käytetty seuraavia yleisiä lyhennyksiä aminohapoista ja amino- ja karboksipään ryhmistä :

Gly (tai G) - glysiini Ala (tai A) - alaniini 10 Vai (tai V) - väliini

Leu (tai L) - leusiini Ile (tai I) - isoleusiini Fum - fumaryyli Orn - ornitiini 15 Pro (tai P) - proliini

Phe (tai F) - fenyylialaniini Trp (tai W) - tryptofaani Met (tai M) - metioniini Ser (tai S) - seriini 20 Thr (tai T) - treoniini

Cys (tai C) - kysteiini Tyr (tai Y) - tyrosiini Asn (tai N) - asparagiini Gin (tai Q) - glutamiini • 25 Asp (tai D) - asparagiinihappo

Glu (tai E) - glutamiinihappo Lys (tai K) - lysiini Arg (tai R) - arginiini His (tai H) - histidiini 30 Nle - norleusiini : Hyp - hydroksiprOliini

Glt - glutaryyli Mal - maleyyli Npa - ö-(2-naftyyli)alaniini 35 3,4-dehydroPro - 3,4-dehydroproliini 4 94351

Pgl - fenyyliglysiini NMePgl - N-metyylifenyyliglysiini Sar - sarkosiini (N-metyyliglysiini) pSubPhe - parasubstituoitu fenyylialaniini 5 SubPhe - orto-, meta- tai para-, mono- tai disubs- tituoitu fenyylialaniini DAla (tai a) - D-alaniini Ac - asetyyli Sue - sukkinyyli 10 pCIPhe - para-klorofenyylialaniini pN02Phe - para-nitrofenyylialaniini NMeVal - N-metyylivaliini.

Alkyyliryhmän ja alkoksiryhmän alkyyliosan tarkoitetaan sisältävän suorat, haaroittuneet tai sykliset al-15 kyyliryhmät, esimerkiksi metyylin, etyylin, propyylin, isopropyylin, butyylin, isobutyylin, tert-butyylin, pen-tyylin, isopentyylin, sek-pentyylin, syklopentyylin, hek-syylin, isoheksyylin, sykloheksyylin ja syklopentyylime-tyylin. Tämän keksinnön puitteissa fenyylialkyleeniryhmien 20 alkyleeniosa voi sisältää 1-4 hiiliatomia ja voi olla suora tai haaroittunut, esimerkiksi metyleeni, etyleeni, propyleeni, butyleeni, isopropylideeni ja sek-butylideeni. Fenyylialkyleeniryhmien fenyyliosa voi olla substituoima-ton tai voi olla monosubstituoitu orto-, meta- tai mie-• 25 luummin parakohdista. Substituoimattomia fenyylejä tai parahydroksifenyylejä pidetään parempina. 2-10 hiiliatomia sisältävän asyyliryhmän tarkoitetaan sisältävän suorat, haaroittuneet, sykliset, tyydyttyneet ja tyydyttymät-tömät asyyliryhmät, joilla on 1 tai 2 karbonyyliosaa ryh-. 30 mässä, esimerkiksi asetyylin, bentsoyylisukkinyylin, ma-1 leyylin ja glutaryylin. Halogeeniryhmä on fluori-, kloo ri-, bromi-tai jodiryhmä. X-ryhmissä vety-, alkyyli-tai aryyliosa on kiinnittynyt aminopään aminohapon a-aminoryh-mään. Niiden peptidien, joissa aminopään aminohapon amino-35 ryhmä on substituoitu kahdella alkyyli- tai asyyliryhmäl- 5 94351 lä, katsotaan myös kuuluvan tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen peptidien piiriin.

Pitäisi olla ilmeistä, että tämän keksinnön mukaisesti valmistetut peptidijohdannaiset sisältävät peptidit, 5 joissa luonnossa esiintyvän neurokiniini A:n karboksipään kahden aminohapon normaalia peptidiamidisidosta on modifioitu ja näitä kahta modifioitua aminohappoa merkitään kemiallisesti tässä ryhmällä Y. Peptidikemistien tavanomaista nimityskäytäntöä käyttäen Y-ryhmä, joka koostuu 10 kahdesta Leu-jäännöksestä (s.o., jossa R, ja R2 ovat kumpikin sek-butyyliryhmiä), joiden amidisidos on modifioitu pelkistämällä karbonyyliryhmä metyleeniryhmäksi, voidaan merkitä Leu^(CH2NH) Leu. Tämä merkintä osoittaa, että viimeistä edellisen leusiinin amidikarbonyyliryhmä on pelkis-15 tetty metyleeniryhmäksi.

Termillä "sidos” käytettäessä A,:stä määriteltäessä tarkoitetaan, että X-ryhmä on suoraan sidottu A2-ryhmään tai tapauksissa, joissa A2 on myös sidos, X on silloin suoraan sidottu Aj-ryhmään. Samalla tavalla termillä "sidos" 20 käytettäessä A2:sta määriteltäessä tarkoitetaan, että A] on suoraan sidottu A3-ryhmään tai tapauksissa, joissa Ä! on myös sidos, X on silloin suoraan sidottu A3-ryhmään.

Luonnossa esiintyvät aminohapot sisältävät kiraali-sen hiiliatomin, poikkeuksena glysiini. Jollei muuten eri-25 koisesti osoitettu, tässä viitatut optisesti aktiiviset aminohapot ovat L-muotoa. Kuten on tapana, tässä merkityt peptidien rakenteet ovat sellaisia, että aminopää on vasemmalla puolella ketjua ja karboksipää on oikealla puolella ketjua.

• 30 Kaavan 1 mukaiset polypeptidit voivat muodostaa farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja minkä tahansa ei-myrkyllisen, orgaanisen tai epäorgaanisen hapon kanssa. Kuvaavat epäorgaaniset hapot, jotka muodostavat sopivia suoloja, sisältävät suola-, bromi-, rikki- ja fosforihapon 35 ja happamat metallisuolat, kuten natriummonovetyortofos- 6 94351 faatin ja kaiiumvetysulfaatin. Kuvaavat orgaaniset hapot, jotka muodostavat sopivia suoloja, sisältävät mono-, di-ja trikarboksyylihapot. Kuvaavia sellaisista hapoista ovat esimerkiksi etikka-, glykoli-, maito-, palorypäle-, malo-5 ni-, meripihka-, glutaari-, fumaari-, omena-, tartaari-, sitruuna-, askorbiini-, maleiini-, hydromaleiini-, bent-soiini-, hydroksibentsoiini-, fenyylietikka-, kaneli-, salisyyli-, 2-fenoksibentsoiini- ja sulfonihapot, kuten metaanisulfonihappo ja 2-hydroksietaanisulfonihappo. Kar-10 boksipään aminohappo-osan suolat sisältävät ei-myrkylliset karboksyylihapposuolat, jotka ovat muodostuneet minkä tahansa sopivien epäorgaanisten tai orgaanisten emästen kanssa. Kuvaavasti, nämä suolat sisältävät alkalimetalli-suolat, esimerkiksi natrium ja kalium, alkaliset maametal-15 lisuolat, kuten kalsium ja magnesium, ryhmän IIIA kevyt-metallisuolat sisältäen alumiinin, ja orgaaniset primaariset, sekundaariset ja tertiaariset amiinisuolat, kuten esimerkiksi trialkyyliamiinit sisältäen trietyyliamiinin, prokaiinin, dibentsyyliamiinin, 1-eteeniamiinin, Ν,Ν'-di-20 bentsyylietyleenidiamiinin, dihydroabietyyliamiinin, N- (alempi)alkyylipiperidiinin ja minkä tahansa muun sopivan amiinin.

Kuten on asia minkä tahansa geneerisen kemiallisen ryhmän kanssa, tiettyjä ryhmiä pidetään parempina. Edulli-25 sinä pidetään niitä kaavan 1 mukaisia peptidijohdannaisia, joissa X on vety ja joissa A: on sidos. Edullisina pidetään myös niitä kaavan 1 mukaisia peptidijohdannaisia, joissa X on Glt, Mal, Fum ja varsinkin Sue. Edullisina pidetään myös niitä kaavan 1 mukaisia peptidijohdannaisia, joissa Ai 30 on His-Lys-Thr, Lys-Thr, Thr, Val-Pro-Lys-Ser, Pro-Lys-

Ser, Lys-Ser, Ser, pGlu-Pro-Ser-Lys, Pro-Ser-Lys, Ser-Lys tai Lys. Erityisen edullisina pidetään niitä kaavan 1 mukaisia peptidijohdannaisia, joissa A2 on His-Lys-Thr, Lys-Thr tai Thr. Edullisina pidetään niitä kaavan 1 mukaisia 35 peptidijohdannaisia, joissa A2 on Asp. Edullisina pidetään 94351 7 myös niitä kaavan 1 mukaisia peptidijohdannaisia, joissa A3 on Gly, Gin, Asn, Sar ja erikoisesti Ala tai Ser. Edullisina pidetään edelleen niitä kaavan 1 mukaisia peptidijohdannaisia, joissa A4 on Phe, kuten myös niitä kaavan 1 mu-5 kaisia peptidijohdannaisia, joissa As on Vai ja joissa A* on Gly. Edullisina pidetään niitä kaavan 1 mukaisia peptidijohdannaisia, joissa R, on isobutyyli, siis 2-metyylipro-pyyli ja joissa R2 on 2-metyylitioetyyli, isobutyyli tai n-butyyli. Erityisen edullisina pidetään niitä yhdisteitä, 10 joissa R, ja R2 ovat kumpikin isobutyyli. Edullisimmat kaavan 1 mukaiset peptidijohdannaiset ovat H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leut/’(CH2NH) -Leu-NH2, jossa R on vety tai metyyliryhmä.

Kaavan 1 mukaisia peptidijohdannaisia voidaan valmistaa monilla eri menetelmillä, jotka ovat hyvin alan 15 asiantuntijoiden tuntemia. Sellaiset menetelmät sisältävät kiinteän faasin sarjamenetelmän, joka voidaan suorittaa käyttäen valmiina olevia automatisoituja menetelmiä, kuten käyttäen automaattista peptidisyntetisaattoria. Valmistettaessa kaavan 1 mukaisia peptidijohdannaisia, modifioitu 20 dipeptidi, joka vastaa karboksipään dipeptidiä, jossa on modifioitu peptidisidos, tai sen prekursori, sidotaan hartsikantajaan. Menetelmät, joita käytetään valmistettaessa kukin modifioitu peptidisidos, ovat alalla hyvin tunnettuja ja taitavat peptidikemistit voivat suorittaa ne ' 25 helposti. Menetelmän kaavan 1 mukaisia peptidijohdannaisia vastaavien φ(NHCO)-yhdisteiden valmistamiseksi ovat kuvanneet Chorev ja Goodman, Int. J. Pept. Protein Res.. 21 f31. 258-68 (1983). Menetelmän kaavan 1 mukaisia peptidijohdannaisia vastaavien ^(COCH2)- ja φ(CH (OH) CH2) -yhdisteiden - 30 valmistamiseksi, vastaavassa järjestyksessä, ovat kuvanneet Holladay ja Rich, Tetrahedron Letters. 24(411. 4401-04 (1983). Menetelmän kaavan 1 mukaisia peptidijohdannaisia vastaavien ^ (CH2NH)-yhdisteiden valmistamiseksi ovat kuvanneet Sasaki ja Coy, Peptides. Voi. 8. 119-121, 1987 35 ja se on yksityiskohtaisemmin kuvattu alla. Menetelmän 8 94351 kaavan 1 mukaisia peptidi johdannaisia vastaavien vi' (CH2S) — yhdisteiden valmistamiseksi ovat kuvanneet Spatola ja Darlak, Tetrahedron Letters. 44(31. 821-33 (1988). Mene telmän kaavan 1 mukaisia peptidijohdannaisia vastaavien 5 φ (CH20)-yhdisteiden valmistamiseksi on kuvannut TenBrink, J. Ora. Chem.. 1987, 52, 418-22.

Erikoisesti kaavan 1 mukaiset yhdisteet, joissa on -CH2N(R)-ryhmä, valmistetaan pelkistämällä kaavan 2 mukainen N-metoksi-N-metyyliamidi kaavan 3 mukaiseksi aldehy-10 diksi. Pelkistys voidaan suorittaa millä tahansa tunnetulla ja alan asiantuntijoiden helposti suorittamalla tavalla, kuten käyttäen litiumalumiinihydridiä (LAH). Tämä pelkistys voidaan helposti suorittaa lisäämällä noin yksi mooliekvivalenssi LAH:ta jäähdytettyyn, tyypillisesti noin 15 0 °C:een, kaavan 2 mukaisen yhdisteen liuokseen ei-reagoi- vassa liuottimessa, kuten eetteripohjäisessä liuottimessa, kuten tetrahydrofuraanissa (THF) tai dietyylieetterissä. Kun reaktio on oleellisesti mennyt loppuun, tyypillisesti noin 30 minuutin kuluttua, reaktio lopetetaan lisäämällä 20 esimerkiksi 10 % kalium- tai natriumvetysulfaattia ja sitten vettä. Tuote voidaan sitten eristää esimerkiksi uuttamalla vesipohjainen seos liuottimena, kuten dietyyli-eetterillä, pesten eetterifaasi kylmällä, laimealla vesipitoisella suolahapolla, kuivattaen ja poistaen liuotin.

* 25 Raaka tuote voidaan puhdistaa esimerkiksi pylväskromato-grafialla, kuten silikageelipylväällä, eluoiden 55 % etyy-li/etikkahappo/heksaanilla.

9 94351

O

ϊ I

1 BocNH\ Js.

BocNH QH Y X N — OCHj

5 I -► I

R1 Rl ch3 2 3

LAH/THF

10 0 1 1)BocNH-^JL^\ m

BOCNH CH, J^Jr) R, BOCNH H

15 I NH 1 2)NaCNBH3 | R, ° Rl 5 4

Kaavan 3 mukaisen aldehydin annetaan sitten reagoi-20 da hartsiin sidotun kaavan 6 mukaisen aminohapon kanssa I ° hn\A® ·' 25 | «2 jossa R ja R2 ovat kuten edellä on määritelty ja jossa R edustaa hartsia. Alunperin muodostunut Schiff'in emäs pel-30 kistetään in situ käyttäen esimerkiksi natriumsyanoboro-* hydridiä saaden hartsiin sidottu modifioitu kaavan 7 mu kainen dipeptidi 94351 10

R

Ri I O

5 7

Boc-NH / CH2 f R2 jossa R, R, ja R2 ovat kuten edellä on määritelty ja ympy-10 röity R edustaa hartsia.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että α-aminosuojatut aminohapot sidotaan järjestyksessä ^ - A, kasvavan peptidiketjun terminaaliseen aminoryhmään hartsiin sidotussa yhdisteessä, jolla on kaava jolla on 15 kaava 7, joka peptidiketju on välillä altistettu poistamalla sen aminosuojausryhmä.

Aminohapot Aj - Aj voidaan lisätä järjestyksessä hartsiin sidottuun modifioituun dipeptidiin normaalilla tavalla.

20 Kaavan 2 mukaiset N-metoksi-N-metyyliamidit valmis tetaan vastaavista N-Boc-suojatusta haposta normaalilla tavalla. Karbonyylidi-imidatsolia lisätään kuivattuun N-Boc-suojattuun aminohappolluokseen eetteripohjäisessä liuottimessa, kuten dietyylieetterissä. Reaktioseoksen *' 25 annetaan sekoittua 10 minuutista 1 tuntiin, tyypillisesti noin 15 - 20 minuuttia. N,O-dimetyylihydroksyyliamiini-HCl:ää DMF:ssa ja steerisesti estettyä amiinia, kuten di-isopropyylietyyliamiinia, lisätään ja seoksen annetaan sekoittua 6 tunnista noin 24 tuntiin huoneen lämpötilassa. 30 Haluttu yhdiste eristetään sitten haihduttamalla liuotin • ja raakapuhdistus voidaan tehdä esimerkiksi nopealla kro- matografiällä silikageelissä eluoiden metyleenikloridillä.

Käytetty hartsikantaja voi olla mikä tahansa sopiva hartsi, jota tavanomaisesti käytetään alalla polypeptidien 35 kiinteätaasivalmistuksessa, mieluummin polystyreeniä, joka 94351 11 on ristisidottu 0,5 - noin 3 % divinyylibentseenin kanssa, joka divinyylibentseeni on joko klorometyloitu tai hydrok-simetyloitu, jotta saadaan kohtia aluksi tuodun a-amino-suojatun aminohapon esterin muodostukselle.

5 Esimerkin hydroksimetyylihartsista ovat kuvanneet

Bodanszky et ai., Chem. Ind. (London1 38. 1597-98 (1966). Klorometyloitua hartsia on kaupallisesti saatavissa Bio Rad Laboratories'lta, Richmond, Kalifornia, ja sellaisen resiinin valmistuksen ovat kuvanneet Stewart et ai., 10 "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Fran-sisco 1969), kappale 1, sivut 1-6. Suojattu aminohappo voidaan kiinnittää hartsiin menetelmällä, jonka on kuvannut Gisin, Helv. Chem. Acta. 56. 1476 (1973). Monia hartsiin sidottuja suojattuja aminohappoja on kaupallisesti 15 saatavana. Esimerkiksi valmistettaessa kaavan 1 mukaista polypeptidiä, jossa karboksipää on Thr-jäännös, voidaan käyttää tert-butyylioksikarbonyyli (Boc)-suojattua Thr:ia, joka on sidottu bentsyloituun hydroksimetyloituun fenyyli-asetamidometyyli (PAM) -hartsiin, jota on kaupallisesti 20 saatavissa.

Kun a-aminosuojattu aminohappo on sidottu hartsi-kantajaan, suojausryhmä poistetaan käyttäen mitä tahansa sopivaa menetelmää, kuten käyttäen trifluoroetikkahappoa metyleenikloridissa, trifluoroetikkahappoa yksinään tai ’ 25 HCl:ää dioksaanissa. Suojausryhmän poisto suoritetaan huoneen lämpötilan ja 0 °C:een välisessä lämpötilassa. Muita standardeja katkaisureagensseja ja olosuhteita voidaan käyttää spesifisten a-aminosuojausryhmien poistamiseksi. Kun α-aminosuojausryhmä on poistettu, muut aminosuojatut 30 aminohapot kiinnitetään vaiheittain halutussa järjestyk sessä. Vaihtoehtoisesti monia aminohapporyhmiä voidaan kiinnittää liuosmenetelmällä ennen kiinnittämistä hartsissa olevaan aminohapposekvenssiin.

α-aminosuojausryhmä, jota on käytetty kussakin po-35 lypeptidisekvenssiin tuodussa aminohapossa, voi olla mikä 12 94351 tahansa sellainen alalla tunnettu suojausryhmä. Harkittuihin α-aminosuojausryhmiin kuuluvat (1) asyylityyppiset suojausryhmät kuten: formyyli, trifluoroasetyyli, ftalyy-li, tolueenisulfonyyli (tosyyli), bentseenisulfonyyli, 5 nitrofenyylisulfenyyli, trityylisulfenyyli, o-nitrofenok-siasetyyli ja a-klorobutyryyli, (2) aromaattiset uretaani-tyyppiset suojausryhmät kuten bentsyylioksikarbonyyli ja substituoitu bentsyloksikarbonyyli, kuten p-klorobentsyy-lioksikarbonyyli, p-nitrobentsyylioksikarbonyyli, p-bromo-10 bentsyylioksikarbonyyli,p-metoksibentsyylioksikarbonyyli, l-(p-bifenylyyli)-l-metyletoksikarbonyyli, a,a-dimetyyli- 3,5-dimetoksibentsyylioksikarbonyyli ja bentshydryloksi-karbonyyli, (3) alifaattiset uretaanisuojausryhmät kuten tert-butyylioksikarbonyyli (Boc), di-isopropyylimetoksi-15 karbonyyli, isopropyylioksikarbonyyli, etoksikarbonyyli ja allyloksikarbonyyli, (4) sykloalkyyli uretaanityyppiset suojausryhmät kuten syklopentyylioksikarbonyyli, adaman-tyylioksikarbonyyli ja sykloheksyylioksikarbonyyli, (5) tiouretaanityyppiset suojausryhmät kuten fenyylitiokarbo-20 nyyli, (6) alkyylityyppiset suojausryhmät kuten trifenyy- limetyyli (trityyli) ja bentsyyli, ja (7) trialkyylisilaa-niryhmät kuten trimetyylisilaani. Suositeltava a-aminosuo-jausryhmä on tert-butyylioksikarbonyyli.

Sopivan kytkentäreagenssin valinta kuuluu alan tai- • 25 töihin. Erikoisen sopiva kytkentäreagenssi silloin, kun lisättävä aminohappo on Gin, Asn tai Arg, on Ν,Ν’-di-iso-propyylikarbodi-imidi ja 1-hydroksibentsotriatsoli. Näiden reagenssien käyttö estää nitriilin ja laktaamin muodostuksen. Muita kytkentäreagensseja ovat (1) karbodi-imidit 30 (esim. N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi ja N-etyyli-N'- * (dimetyyliaminopropyylikarbodi-imidi), (2) syanamidit (esim. N,N-dibentsyylisyanamidi), (3) ketenimiinit, (4) isoksatsoliumsuolat (esim. N-etyyli-5-fenyyli-isoksatso-lium-3'-sulfonaatti, (5) monosykliset typpeä sisältävät 35 aromaattisen ominaisuuden omaavat heterosykliset amidit, 94351 13 jotka sisältävät 1-4 typpeä renkaassa, kuten imidatsoli-dit, pyratsolidit ja 1,2,4-triatsolidit. Spesifiset hete-rosykliset amidit, jotka ovat käyttökelpoisia, sisältävät N,N'-karbonyylidi-imidatsolin ja N,N-karbonyylidi-l,2,4-5 triatsolin, (6) alkoksyloidun asetyleenin (esim. etoksi-asetyleenin), (7) reagenssit, jotka muodostavat seosanhyd-ridin aminohapon karboksyyliosan kanssa (esim. etyyliklo-roformaatti ja isobutyylikloroformaatti) tai kiinnitettävän aminohapon symmetrinen anhydridi (esim. Boc-Ala-O-Ala-10 Boc) ja (8) typpeä sisältävät heterosykliset yhdisteet, joilla on hydroksiryhmä yhdessä renkaan typessä (esim. N-hydroksiptalimidi, N-hydroksisukkinimidi ja 1-hydroksi-bentsotriatsoli). Muita aktivointireagensseja ja niiden käyttöä peptidikytkennässä on kuvannut Kapoor, J. Pharm. 15 Sei,, 59. sivut 1-27 (1970). Edullisena pidetään symmetrisen anhydridin käyttöä kytkentäreagenssina kaikille aminohapoille lukuunottamatta Arg:ia, Asn:ia ja Gin:ia.

Kukin suojattu aminohappo tai aminohapposekvenssi tuodaan kiinteäfaasireaktoriin noin nelinkertaisessa yli-20 määrässä ja kytkentä suoritetaan alustassa, jossa on dime-tyyliformamidia:metyleenikloridia (1:1) tai yksistään di-metyyliformamidia tai mieluummin yksistään metyleeniklo-ridia. Tapauksissa, joissa tapahtuu epätäydellinen kytkentä, kytkentämenetelmä toistetaan ennen a-aminosuojausryh- 25 män poistamista, ennen seuraavan aminohapon kytkemistä kiinteäfaasireaktorissa. Kytkentäreaktion onnistumista kussakin synteesivaiheessa valvotaan ninhydriinireaktiol-la, kuten ovat kuvanneet E. Kaiser et ai., Analvt. Bio-chem. 34. 595 (1970).

30 Kun haluttu aminohapposekvenssi on saatu, peptidi poistetaan hartsista. Tämä voidaan tehdä hydrolyysillä, kuten käsittelemällä hartsiin kiinnitettyä polypeptidiä liuoksella, jossa on dimetyylisulfidia, p-kresolia ja tio-kresolia vedettömässä hydrofluorihapossa.

14 94351

Kuten kiinteäfaasipeptidisynteesialalla tunnetaan, monet aminohapot omaavat ryhmiä, jotka vaativat suojausta ketjun valmistuksen aikana. Sopivan suojausryhmän käyttö ja valinta on alan asiantuntijoiden tuntema ja riippuu 5 suojattavasta aminohaposta ja muista peptidissä läsnäolevista suojatuista aminohappojäännöksistä. Sellaisen sivu-ketjun suojausryhmän valinta on kriittistä siksi, että sen täytyy olla sellainen, jota ei poisteta α-amino-osan suo-jausryhmää katkaistaessa. Esimerkiksi sopivia sivuketju-10 suojausryhmiä lysiinille ovat bentsyylioksikarbonyyli ja substituoitu bentsyylioksikarbonyyli, mainitun substituen-tin ollessa halogeeni (esim. kloori, bromi, fluori) tai nitro (esim. 2-klorobentsyylioksikarbonyyli, p-nitrobent-syylioksikarbonyyli, 3,4-diklorobentsyylioksikarbonyyli), 15 tosyyli, t-amyylioksikarbonyyli, t-butyylioksikarbonyyli ja di-isopropyylimetoksikarbonyyli. Treoniinin ja seriinin alkoholinen hydroksyyliryhmä voidaan suojata asetyyli-, bentsoyyli-, tert-butyyli-, trityyli-, bentsyyli-, 2,6-diklorobentsyyli-tai bentsyylioksikarbonyyliryhmällä. As-20 paragiinihapon ja glutamiinihapon karboksyylinen hydrok- siryhmä voidaan suojata bentsyyli- tai sykloheksyyliryh-mällä. Suositeltava suojausryhmä on bentsyyli.

Nämä ryhmät voidaan poistaa menetelmillä, jotka ovat hyvin tunnettuja alalla. Tyypillisesti suojausryhmän • 25 poisto tehdään sen jälkeen, kun peptidiketjun synteesi on täydellinen, mutta suojausryhmät voidaan poistaa missä tahansa muussa sopivassa ajankohdassa.

Kaavan 1 mukaisten peptidi johdannaisten kyky toimia neurokiniini A:n antagonisteina voidaan osoittaa peptidien *30 kykynä kilpailla jodeeratun neurokiniini A:n kanssa nisäk-1 kään neurokiniini A-reseptoreista (NK2) käyttäen menetel mää, jonka ovat kuvanneet Buck et ai., Science 226: 987-989, 1984, yhdisteiden kykynä stimuloida tai inhiboida neurokiniini A:n indusoimaa fosfatidyyli-inositolin hajoa-35 mistä käyttäen menetelmää, jonka ovat kuvanneet Bristow et 94351 15 ai., British J. Pharmacol. 90: 211-21, 1987, tai antagoni-soida neurokiniini A:n indusoimaa pehmeän lihaksen supistumista käyttäen menetelmää, jonka ovat kuvanneet Dion et ai., Life Sciences 41: 2269-2278, 1987.

5 Sen nojalla, että tämän keksinnön mukaisesti saa duilla peptidijohdannaisilla on kyky toimia neurokiniini A:n antagonisteina, yhdisteet ovat käyttökelpoisia immuno-suppressoijina ja niveltulehduksen, astman, kivun, tulehduksen, kasvaimen kasvun, maha-suoli-kanavan liikaliikku-10 vuuden, Huntington'in taudin, psykoosin, hermotulehduksen, hermosäryn, päänsäryn, sisältäen migreenin, kohonneen verenpaineen, virtsan pidätyskyvyn puutteen, nokkosihottuman, karsinoidisyndrooman oireiden, influenssan ja tavallisen vilustumisen hoidossa. Alan asiantuntijat voivat 15 helposti määrittää tehokkaat annokset, joko suun kautta tai parenteraalisesti annetut, ja ne ovat sellaiset annokset, jotka aiheuttavat neurokiniini A-reseptorin (NK2) antagonismin. Kaavan 1 mukaisten peptidien tehokkaat annokset voivat olla esimerkiksi noin 0,5 Mg/kg - noin 500 20 mg/kg potilaan kehon painoa kohti vuorokaudessa. Yhdisteet annetaan helpoimmin yksikköannosmuodoissa, jotka sisältävät noin 1 mg - noin 500 mg aktiivista yhdistettä ja vuorokaudessa voidaan antaa 1-4 tai useampi yksikköannos-muoto. Termi "potilas" tässä käytettynä tarkoittaa nisäk-« 25 käitä, kuten kädellisiä, sisältäen ihmiset, lampaita, hevosia, karjaa, sikoja, koiria, kissoja, rottia ja hiiriä.

Vaikka jotkin peptidijohdannaiset voivat säilyä kulkiessaan läpi suolen suun kautta annettaessa, edullisena pidetään ei suun kautta tapahtuvaa antoa, esimerkiksi "0 ihonalaista, laskimon sisäistä, lihaksen sisäistä tai vatsaontelon sisäistä antoa, antoa varastoinjektiolla, implantin valmistuksella, tai antamalla limakalvoille, kuten nenän, kurkun ja hengitysteiden limakalvoille, esimerkiksi suihkeena, jonka aerosoli voi sisältää kaavan 1 mukaista 35 peptidijohdannaista, tai kuivana jauhemuotona.

16 94351

Parenteraalista antoa varten yhdisteet voidaan antaa injektoitavina yhdisteen liuos- tai suspensioannoksina fysiologisesti hyväksyttävässä laimentimessa farmaseuttisen kantajan kanssa, joka voi olla steriiliä nestettä, 5 kuten vettä ja öljyjä, lisäten tai lisäämättä pinta-aktii-visia aineita ja muita farmaseuttisesti hyväksyttäviä ad-juvantteja. Esimerkkejä öljyistä, joita voidaan käyttää näissä valmisteissa, ovat petroli-, eläin-, kasvi- tai synteettistä alkuperää olevat öljyt, esimerkiksi maapähki-10 näöljy, soijapapuöljy ja mineraaliöljy. Yleisesti vesi, suolaliuos, vesipohjainen dekstroosi ja sen sukuiset sokeriliuokset, etanoli ja glykolit, kuten propyleeniglykoli tai polyetyleeniglykoli, ovat suositeltavia nestemäisiä kantajia, erikoisesti injektoitavissa liuoksissa.

15 Yhdisteet voidaan antaa varas toin jektiomuodossa tai implanttivalmisteen muodossa, jotka voidaan formuloida niin, että ne sallivat aktiivisen ainesosan jatkuvan vapautumisen. Aktiivinen ainesosa voidaan puristaa pelleteiksi tai pieniksi sylintereiksi ja istuttaa ihon alle 20 tai lihaksen sisään varastoinjektioiksi tai implanteiksi. Implanteissa voidaan käyttää inerttejä materiaaleja, kuten biologisesti hajoavia polymeerejä tai synteettisiä sili-koneja, esimerkiksi Silastic'ia, joka on Dow-Corning Corporationin valmistamaa silikonikumia.

25 Tätä keksintöä kuvataan seuraavilla ei-rajoittavil- la esimerkeillä.

Esimerkki 1

Neurokiniini A -reseptorin antagonismi H-Asp-Ser-Phe-Val-Glv-Leu- (CH;NH)-Leu-NH-,;lla ia H-Asp-Ser-Phe-Val-Glv-Leu-30 iHCH,N(CH,) )-Leu-NH,: 11a osoitettuna vaikutuksella fosfati-1 dwlinositolin hajoamiseen

Useiden hamsterien virtsarakot yhdistettiin, murskattiin pieniksi ja homogenisoitiin 50 mM Tris-HCl-liuok-sessa (pH 7,4), joka sisälsi 120 mM NaClria ja 5 mM KC1:-35 ia, 4 °C:ssa ja sentrifugoitiin 48000 X g 15 minuuttia.

94351 17

Pelletti suspendoitiin uudelleen 30 minuutin ajan 50 mM Tris-HCl-liuokseen (pH 7,4), joka sisälsi 10 mM EDTArta ja 300 mM KCl:ia, 4 °C:ssa. Suspensiota sentrifugoitiin kuten yllä ja pelletti pestiin kaksi kertaa pelkällä 50 mM Tris-5 HCl-liuoksella (pH 7,4) ja sentrifugoitiin samalla tavalla. Kudos suspendoitiin sitten uudelleen inkubointipusku-riin ja pieni määrä (noin 3 - 5 mg kudosta) lisättiin kuhunkin koeputkeen testin aloittamiseksi. Koeputket sisälsivät inkubointipuskurin, joka koostui 50 mM Tris-HCl-10 liuoksesta (pH 7,4), 0,02 % BSA:sta, 40 μg/ml basitrasii-nista, 4 Mg/ml kymostatiinista, 4 Aig/ml leupeptiinistä, 2 mM MnCl2:sta, 0,1 nM 125jodohistidyyli-neurokiniini A:sta (Amersham Corp.) ja otsikon yhdisteiden tai standardien konsentraatioista jotka olivat välillä 0,03 nM - 100 μΜ. 15 Testin annettiin tasapainottua 120 minuuttia huoneen lämpötilassa. Tämän ajan jälkeen kunkin putken sisällöt suodatettiin nopeasti Whatman GF/B-suodattimien läpi, joita suodattimia oli esiliotettu 0,5 % BSA:ssa, ja suodattimet pestiin nopeasti kaksi kertaa jääkylmällä pelkällä 50 mM 20 Tris-HCl-liuoksella (pH 7,4). Suodattimeen sitoutuneen radioaktiivisuuden määrä määritettiin gammalaskijalla. Spesifisen (maksimaalisen) sitoutumisen määritettiin olevan se ero sitoutumisessa, joka havaittiin, kun läsnä oli 1 μΜ leimaamatonta neurokiniini A:ta tai sitä ei ollut. 25 Testiyhdisteiden tai standardien kilpailu jodeeratun neurokiniini A:n sitoutumisen kanssa ilmoitettiin prosentteina tästä maksimikilpailusta. IC^-arvojen (konsentraatio, joka tarvittiin inhiboimaan reseptoriin sitoutuminen 50-%:isesti) havaittiin olevan 100 - 200 nM otsikon yhdis-30 teille (kuvio 1).

‘ Muidenkin synteettisten (CH2NR)-peptidien kyky anta- gonisoida sitoutumista NKA-reseptoriin osoitettiin määrittämällä testiyhdisteiden kyky korvata hamsterin virtsarakosta peräisin olevaa I125-leimattua NKA: ta (taulukon 1 35 palsta NK-2) tässä esimerkissä kuvatulla tavalla. Tulokset 18 94351 on esitetty taulukossa 1. Taulukossa annettu luku on se antagonistin pitoisuus (nanomooleina), jota tarvitaan neu-rokiniini A (NKA) -reseptorin IC50-arvon saavuttamiseksi. SKLKB82#3 edustaa kloonattua NK-2-reseptorisolulinjaa; 5 näyte valmistetaan solupelletista kuten esitettiin hamsterin virtsarakkovalmisteiden osalta. NK-1 on rotan sylkirauhasesta tehty aine P-reseptorivalmiste; reseptorit valmistetaan kuten esitettiin hamsterin virtsarakkovalmisteiden osalta.

« » 94351 r*> ιλ 5* ο ο ο

(-* ι—1 rH ' I

' C. XX X

►>4 o O O O

2 r*T rH rH > I

H Λ Λ Λ £2 Λ Μ Τ: £Γ σι ο

rn ? ΓΟ o ® rH

£ 5 +1 ο ° X

9 o M (N 2 °

η * f* CO n H

♦-I U Λ «M Ϊ e Π iti o ? r-monoo^T.ooo^ „° ° n^Sv NcinHHMHHr)22HHHOnH in ^

4J -μ * Λ ~ +1 +l +1 +l +l X X v V X X XH-H X m r- X

intj'fnX;o0r'or'r’oo1i1iooo X o h o

Ρ·Η£2[Γ1ί,ΐηΗ“10ΗΗ1{ΙίΙΗΗΗΝΗΗ H

§ £ ^ Jft rH(M(NrHAAAAAAA Λ Λ

K

ω lo^kOio^nlS^^^^^ooinSo^ g S S S ^ S " S ί > m ° π ΰ ΰ

1/1 S Λ _ _„COCMnj_,-,— —»-.rHCMCMi-li-ICM

H S (XiCOCTiCTiQQQCTiCTiCriCrtCriQQQQQo

•H

•H — ...... . " 1 —- 1 —— ——---- +j x (0 S £ Ό — Q —-

•H ^ rHCO

C ^"''ί^ϊοΪΝη^ΙίΙ ΙΟ Q =tfc

Λ r-ioj;?—-2io;ifcOo,-loHr",QrHHHQ

•r Q Ω C. E SQC.qCQCI.QQ'-'QQhJ4 —

•H '-'-kLj-'E'-'K—X'-'-'-'E'-' — TO

3 KKfaJ^TKfKfEfttKiKtcsK

Tj s2Jj(J~2l2i2.L22322a)U

o lift— SClftlftlftlia)ll*4l ft | ‘H -P3,5- 03^3,33,333.-43(1)- 3 J -)-1 ·—·<—--^,^33 I g I S I g I I 33-—·—·>.—· ft a - — 220 3j 3 j 3j 3 3 2 — — H — X <d 220u^<i)”a)7<i)T a) 0^22--^2 •h a 22222^^^^^:1,^^0¾¾¾¾ £ ~ x x X x x " 3 ' H ' H I I - K1 se* x x

•ft « u O U U U J g * O

C O 33333UUC-gr:>ddh4a)333 >, — <uajQ)<DQ)ww»uwr_,«relil-<i,q,Q, CO -^- — ·>·>(0Λμ4Η4μ4

*— I I I I I— ‘-'ΚΚΙΤηΓΙ, i, (Hl I I I

• >,>ι>,>ι>ι>ι>ιθοςΓπ2ϊ-< >i >i >i >i 0000000-^-^-¾¾^) «oooo b ι ι ι ι ι ι ι >—- -—- aa as ΖΓ /. ι ι ι ι ι X r—I r—) r—I 1—H ι—I r—t ι—I r—I r—I O O hh λι ι-I r-l ι—I i—(r-1 X rtJiOfCtOrtSrtJfÖrtJfO — —' Ä r7i (03333 3 >>>>>>>>>-ä--ä.zN">>>>>

Γ-; I I I I II I I I·—«*—'Kiri ι I l I

3 α>α)α)α)α)<ι>α)<ΐ)α)α)α>υρα>α)α)ωφ

Ό A & A & SI A A ASiAA'-'&AAAAA

E-< Q-t P4 P-i 0^ P-ι PU P-ι Q-i CC* CL· CU *ä- r, 0, O, 0, CU 0<

I I I I I I I I I I I -—> 33 I I I I I

d>QJ(D<D<l)(D(I>(l>(l)(l)(l}(U — d} <U tU (D <U

WWWWMCOWWWMWM-ä-CnMWWO I I t I I I I I I I I I ·—> I I I I I

QiiliOidiQiDiQiQiQiOiCliQiU d d d d d

• lfll/)WUlW«)t/)in(/lW(/)W3WWWWW

. <Ci<<|i<i<i<<;i<i<i<i<<CCOi<i<i<i<i< 20 94351

Esimerkki 2

Neurokiniini A-reseptorin antagonismi H-Asp-Ser-Phe-Val-Glv-Leu-\fr(Cft>NH)-Leu-NH,: 11a ia H-Asp-Ser-Phe-Val-Glv-Leu-^(CH->N(CH?n -Leu-NH->; 11a osoitettuna vaikutuksella fosfati-5 dvvlinositolin hajoamiseen

Useiden hamsterien virtsarakot yhdistettiin ja pilkottiin 350 μπι:11Η kudossilppurilla. Pilkottua kudosta in-kuboitiin sitten 37 °C:ssa Krebs-Hepes-puskurissa vaihtaen tuore puskuri 15 minuutin välein 30 minuutin ajan. Kudosta 10 inkuboitiin sitten 37 °C:ssa tässä puskurissa niin, että mukana oli 100 - 200 μΟΐ ^-inositolia. Sitten kudos pestiin ja inkuboitiin toiset 30 minuuttia Krebs-Hepes-puskurissa (sisälsi 10 mM Li+) 37 °C:ssa vaihtaen tuore puskuri joka 15 minuutti. Osa kudosmassasta (noin 10 - 20 mg per 15 koeputki) laitettiin sitten Li+-puskuriin, testiyhdiste lisättiin sitten 25 μΐιεββ ja sitten lisättiin eri konsen-traatiot neurokiniini A:ta 25 μΙχεεΆ kokonaistilavuuden ollessa 250 μΐ. Testiyhdistettä mitattiin konsentraatiois-sa, jotka vaihtelivat 1 nM - 100 μΜ ja neurokiniini A -20 konsentraatiot vaihtelivat 1 nM - 10 μΜ. Testiyhdistettä mitattiin myös yksinään osoitetuissa konsentraatioissa agonistiaktiivisuuden määrittämiseksi. Kun oli kulunut 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, fosfatidyyli-inositolin , hajoaminen lopetettiin lisäämällä 940 μΐ kloroformi:meta-25 nolia (1:2), jota seurasi 310 μΐ lisäys kloroformia, jota seurasi 310 μΐ lisäys vettä. Kutakin putkea sekoitettiin sitten 15 sekuntia ja sitten sentrifugoitiin 3000 kierrosta minuutissa 10 minuutin ajan faasien erottamiseksi. 900 μΐ yläfaasia (vesifaasia) laitettiin sitten 0,5 ml:n Bio-30 Rad AG-1X8 (formaatti) -ioninvaihtopylvääseen. 50 μΐ ala-faasia (kloroformifaasi) otettiin kustakin putkesta ja laitettiin laskuriputkeen, kuivattiin ja laskettiin tuike-nesteessä. Pylväissä oleva materiaali pestiin seuraavassa järjestyksessä: 94351 21 1) 10 ml vettä 2) 5 ml 5 ii dinatriumtetraboraatti/60 mM natrium-formaatti -liuosta 3) 10 ml 1 M ammoniumformaattia 0,1 M muurahaisha- 5 possa

Viimeinen (kolmas) pesu kerättiin ja yksi ml sekoitettiin 6 ml ACS-tuikenestettä ja laskettiin. Näiden ra-dioaktiivisuusmäärien (kaikki inositolifosfaatit) suhde vastaaviin orgaanisen faasin radioaktiivisuusmääriin las-10 kettiin sitten kullekin näytteelle. Testiyhdisteen ja/tai standardien läsnäollessa saatuja suhteita verrattiin sitten kontrolliputkien (s.o., ei stimuloivaa agonistia) suhteisiin. Sitten valmistettiin annosriippuvuuskäyrät ja testiyhdisteiden kyvyt stimuloida tai inhiboida neuroki-15 niini A -indusoitua fosfatidyyli-inositolin hajoamista määritettiin graafisella analyysillä tai tietokoneohjelman avulla ja ne on kuvattu kuvissa 2 ja 3.

Esimerkki 3

Hamsterin virtsarakon supistumispreparaatti 20 Koiraspuolisten kultaisten Syyrian hamstereiden (75 - 100 g) puolikkaat virtsarakot suspendoitiin Tyrode'n puskuriin 31 °C:ssa ja käyttäen 1 gramman lepopingotusta, kuten ovat kuvanneet Dion et ai. (Life Sciences 41: 2269-2278, 1987). Puskuriin lisättiin enkefalinaasin inhibiit-25 toria tiorfaania 10 μΜ 15 minuuttia ennen kunkin testiyhdisteen lisäystä. Kumulatiiviset NKA:n annosriippuvuuskäyrät valmistettiin ensin testiyhdisteen poissaollessa ja sitten sen läsnäollessa. Testiyhdisteet lisättiin kumulatiivisesti, jotta saatiin selville, oliko niillä itsellään 30 supistusta aiheuttavia vaikutuksia. Minkä tahansa testi-yhdisteen vaikutuksen, joka havaittiin, annettiin mennä loppuun ennenkuin seuraava kumulatiivinen konsentraatio lisättiin. Näissä olosuhteissa EC» NKA:n supistusvaikutuk-sille oli yleensä 10 nM, joka on hyvin yhtäpitävä kirjal-35 lisuuden arvojen kanssa. Supistustulokset on ilmoitettu 22 94351 pingotusgrammoina, joka kehittyi lepopingotuksen lisäksi. Kolmessa eri hamsterin virtsarakkokudoksessa kussakin, H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leuvi'(CH2NH) Leu-NH2 tai H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^iCH^CHj)) Leu-NH eivät tuottaneet mitään su-5 pistumista 10 μΜ konsentraatioihin saakka. Kuviot 4 ja 5 kuvaavat supistumisvoimaa NKA:n konsentraation funktiona testiyhdisteen poissa- ja läsnäollessa.

Esimerkki 4 I. Boc-Leu-aldehydin synteesi (Fehrentz, J.-A. ja Castro, 10 B.. Synthesis. 1983, 676-678): A. N-t-Boc-leusiini N-metoksi-N-metyyliamidi: 15,0 mmoolia Boc-leusiinihydraattia liuotettiin 30 ml kuivaa eetteriä. Liuos kuivatettiin vedettömän MgS04:n päällä ja kiinteä aine poistettiin suodattamalla. 16,5 15 mmoolia karbonyylidi-imidatsolia lisättiin suodokseen ja reaktiota sekoitettiin 20 minuuttia huoneen lämpötilassa. Syntyneeseen liuokseen lisättiin suspensio, jossa oli Ο,Ν-dimetyylihydroksyyliamiinihydrokloridia (22,5 mmoolia) 15 mlrssa dimetyyliformamidia ja 3,9 ml:ssa di-isopropyyli-20 etyyliamiinia. Reaktioseosta sekoitettiin yli yön huoneen lämpötilassa. Reaktio laimennettiin etyyliasetaattiin (75 ml) ja pestiin kylmällä 1 N HCl:lla (3 x 40 ml), kyllästetyllä NaHC03:lla (3 x 40 ml) ja kyllästetyllä NaClzlla (1 x 40 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin MgS04:lla, suodatet-25 tiin ja etyyliasetaatti poistettiin tyhjiössä. Analyyttiset tiedot: Rf (silikageeli F254): 0,51 (etyyliasetaat- ti/heksaani 3/2); Ή-NMR (CDC1}) TMS int: 5=0,95 ppm (2d, 6H, J=6,6 Hz); 1,42 (s, UH) ; 1,64-1,80 (m, 1H) ; 3,20 (s, 3H) ; 3,80 (s, 3H) ; 4,72 (m, 1H) ; 5,10 (d, 1H, J=7,5 Hz). 30 Massaspektri: M+H+: Teoreettinen: 275. Havaittu: 275.

B. Boc-leusiini-aldehydi: 2,5 mmoolia Boc-leusiini-N-metoksi-N-metyyliamidia liuotettiin kuivaan eetteriin (30 ml) . Tähän liuokseen lisättiin 3,2 mmoolia litiumalumiinihydridiä (1 M liuos tet-35 rahydrofuraanissa). Reaktiota sekoitettiin 20 minuuttia m 94351 23 huoneen lämpötilassa ja sitten reaktio varovasti lopetettiin lisäämällä NaHS04-liuosta (0,6 g) 10 ml:ssa vettä. Reaktioseos lisättiin 75 ml eetteriä ja pestiin kylmällä IN HClilla (3 x 30 ml), kyllästetyllä NaHC03:lla (3 x 30 5 ml) ja kyllästetyllä NaCl:lla (1 x 30 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin MgS04:lla, suodatettiin ja liuotin poistettiin tyhjiössä. Analyytiset tiedot: Rf (silikageeli 60 F254): 0,68 (etyyliasetaatti/heksaani 3/2). Massaspektri: M=H+: Teoreettinen: 216. Havaittu: 216.

10 II. Leu-hartsin synteesi: Käytettiin tavanomaisia kiinteäfaasisynteesimene-telmiä automatisoidulla peptidisyntetisaattorilla. Boc-Leu-hartsin (0,5 mmoolia) muodostuksen jälkeen Boc-suo-jausryhmä poistettiin ja hartsi pestiin dimetyyliformami-15 dilla, diklorometaanilla ja kuivattiin.

III. Pelkistetyn amidisidoksen muodostus [Leu\^(CH2NH) ]:

Boc-Leu-aldehydi (2 mmoolia) liuotettiin 1 % etik-kahappoon dimetyyliformamidissa (10 ml) ja tämä liuos lisättiin reaktioastiaan, joka sisälsi Leu-hartsia (0,5 20 mmoolia, katso kohta II yllä). Tähän seokseen lisättiin NaCNBH3:n (150 mg) liuosta 2 ml:ssa dimetyyliformamidia. Seosta ravisteltiin 4 tuntia, reaktioastia kuivattiin ja hartsi pestiin dimetyyliformamidilla, sitten diklorometaanilla.

25 IV. (^(CH2NH)9, Leu10)NKA4.10:n synteesi:

Peptidin synteesi vietiin loppuun automaattisessa peptidisyntetisaattorissa lisäämällä järjestyksessä jäljelläolevat aminohapot (Gly, Vai, Phe, Ser (Bzl) ja Asp (Chxl)). Peptidi irrotettiin hartsista ja kaikki suojauk-30 set poistettiin käyttäen vedetöntä HF/anisolia (10:1). Peptidi puhdistettiin käyttäen käänteisfaasi-HPLC-teknii-koita. Analyyttiset tiedot: Aminohappoanalyysi: (HC1 kat kaisu) Asp (1,03); Ser (0,93); Gly (1,01); Vai (0,96); Phe (0,74). Peptidisisältö: 53,4 %. Nopea atomipommitusmassa-35 spektrometria: M+H+. Teoreettinen: 735. Havaittu: 735.

« 94351 24 V. CH2NCH3)9, Leu,0)NKA4.,0:n synteesi: N-metyyli-Leu-hartsin (0,5 mmoolia valmistettu Boc-N-metyyli-leusiinista ylläolevan kohdan II mukaisesti) annettiin reagoida 2,0 mmoolin kanssa Boc-Leu-aldehydiä, 5 kuten on kuvattu ylläolevassa kohdassa III. Peptidisyn-teesi vietiin sitten loppuun, kuten on kuvattu ylläolevassa kohdassa IV. Analyyttiset tiedot: Aminohappoanalyysi: (HCl-katkaisu) Asp (1,01); Ser (0,89); Gly (1,02); Vai (1,00); Phe (0,98). Peptidisisältö: 53,5 %. Nopea atomi- 10 pommitusmassaspektrometria: M+H+. Teoreettinen: 749. Ha vaittu: 749.

VI. (^(CH2NCH2R)% Leu10)NKA4.10:n synteesi:

Boc-Leu [i/'(CH2NH) ]-Leu-hartsi valmistetaan ylläole-vien kohtien II ja III mukaisesti. Hartsin annetaan sitten 15 reagoida 2,5 mmoolin kanssa R-CHO:ta 10 ml:ssa 1 % HOAc:ia dimetyyliformamidissa NaCNBH3:n läsnäollessa, kuten on kuvattu ylläolevassa kohdassa III. Peptidin synteesi viedään sitten loppuun, kuten on kuvattu ylläolevassa kohdassa IV.

Kuvio 1 esittää H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^(CH2NH) -2 0 Leu-NH2: n ja H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^(CH2NCH3) Leu-NH2:n kykyä antagonisoida sitoutumista NKA-reseptoriin ilmoitettuna testiyhdisteen kykynä korvata Il25-leimattu NKA hamsterin virtsarakossa (esimerkki 1) . Abskissa (x-akseli) osoittaa logaritmisesti neurokiniini A (NKA) reseptorin 25 agonistin tai antagonistin konsentraation nanomooleina. Ordinaatta (y-akseli) osoittaa havaitun spesifisen sitoutumisen kullekin testatulle agonistille tai antagonistille mitattuna prosentteina maksimaalisesta spesifisestä sitoutumisesta.

30

-©- NKA

-·- NKA(3-10) -a- NKA (4-10) 35 -**-H-Asp-Ser-Phe-Val-Gty-LeuV(CH2NH)Leu-NH2 -B-H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu*[CH2N(CH3)]Leu*NH2 25 94351

Testatut agonistit olivat NKA ja NKA:n fragmentit, jotka sisälsivät aminohapot 3-10 (NKA(3-10)) ja aminohapot 4 -10 (NKA(4-10)). Arvot ovat 6-12 kokeen keskiarvo ± keskiarvon keskivirhe. IC^-arvot on arvioitu graafisesti 50 % 5 inhibitiokohdasta.

Kuvio 2 esittää H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^(CH2NH)-Leu-NHj: n kykyä antagonisoida NKA-reseptorisitoutumista osoitettuna vaikutuksella fosfatidyyli-inositolin (PI) hajoamiseen hamsterin virtsarakossa (esimerkki 2). Abskis-10 sa (x-akseli) osoittaa logaritmisesti NKA-reseptorin ago- nistin tai antagonistin konsentraation nanomooleina (nM) . Ordinaatta (y-akseli) osoittaa havaitun PI:n hajoamisen prosentteina kontrollista.

_,- NKA

15 -·- NKA + 10 μΜ H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leut(CH2NH)Leu-NH2 10 μΜ H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^(CH2NH)Leu-NH2:sta tuotti merkittävän oikeaan suuntaan menevän muutoksen NKA:n an-nosriippuvuuskäyrässä kompetitiivisella tavalla. Arvot 20 ovat yhden kokeen kolmen rinnakkaisen keskiarvo ± keskiarvon keskivirhe.

Kuvio 3 esittää H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^(CH2NCH3) -Leu-NH2:n (MDL 29916) kykyä antagonisoida NKA-reseptorin sitoutumista osoitettuna vaikutuksella fosfatidyyli-inosi-25 tolin (PI) hajoamiseen hamsterin virtsarakossa (esimerkki 2). Abskissa (x-akseli) osoittaa logaritmisesti NKA-reseptorin agonistin ja antagonistin konsentraation nanomooleina (nM). Ordinaatta (y-akseli) osoittaa havaitun PI:n hajoamisen prosentteina kontrollista.

30 -o- NKA

-·- H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuH>lCH2N(CH3)]Leu-NH2 -ä- H-Asp-Ser-Phe-Val*Gly-Leui[CH2NH)Leu-NH2 3 5 -- NKA + 1 μΜ H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuH»[CH2N(CH3)]Leu-NH2 -g-NKA + 10 μΜ H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu((»(CH2N(CH3)]Leu-NH2 --NKA ♦ 100 μΜ H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu*(CH2N(CH3)lLeu-NH2 94351 26 1, 10 ja 100 μΜ H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^(CH2N (CH3) ) Leu- NH2:sta tuotti merkittävän oikeaan suuntaan menevän muutoksen NKA:n annosriippuvuuskäyrässä kompetitiivisella tavalla. Näiden tulosten Schild'in käyrällä on kulmakerroin 5 -0,99 osoittaen kompetitiivista antagonismia ja pA2 on 7,66. H-Asp-Ser-Phe-Va 1-Gly-Leu^(CH2N (CH3) ) Leu-NH2:11a 100 μΜ:ίίη asti oli vain 5 % osittainen agonistiaktiivisuus ja H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^(CH2NH)Leu-NH2:11a oli vain 12 % osittainen agonistiaktiivisuus. Arvot ovat yhden kokeen 10 kolmen rinnakkaisen keskiarvo ± keskiarvon keskivirhe.

Kuvio 4 esittää H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^(CH2NH) -Leu-NH2: n antagonist iva ikutuksen NKA-välitteiseen supistus-aktiivisuuteen hamsterin virtsarakkovalmisteissa (esimerkki 3) . Abskissa (x-akseli) osoittaa logaritmisesti konsen-15 traatiot nanomooleina (nM) NKA:lie tai NKA:lie yhdessä 10 μΜ kanssa H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^(CH2NH) Leu-NH2: sta. Arvot ovat yhden kokeen kolmen rinnakkaisen keskiarvo ± keskiarvon keskivirhe.

Kuvio 5 esittää H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^(CH2NH)-20 Leu-NH2:n antagonistivaikutuksen NKA-välitteiseen supistus-aktiivisuuteen hamsterin virtsarakkovalmisteissa (esimerkki 3) . Abskissa (x-akseli) osoittaa logaritmisesti konsen-traatiot nanomooleina (nM) NKA:lie tai NKA:lie yhdessä 10 . μΜ kanssa H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^ (CH2N(CH3)) Leu-NH2: sta. 25 Arvot ovat yhden kokeen kolmen rinnakkaisen keskiarvo ± keskiarvon keskivirhe.

Claims

27 94351
1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidi johdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava 5 X-A1-A2-Aj-A4-A5-A6-Y jossa X on vety, 1-6 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä 10 tai 2-10 hiiliatomia sisältävä asyyliryhmä, Ai on sidos tai ryhmä, joka koostuu 1-4 neuroki-niini A:n aminohaposta, A2 on sidos, Asp tai Glu, A3 on ei-aromaattinen, ei-hapan aminohappo, joka on 15 Ala, Ser, Gly, Gin, Asn, Sar, Thr, Cys, Lys, Arg, Met, Vai, Leu, Ile, A4 on Phe, Trp tai N-Me-Phe, A5 on Ile, Vai tai Leu, A6 on Gly tai Sar, ja 20 Y on kaavan Rl R2 NH-- CH--N--R3 I “ I H RH 25 mukainen ryhmä, jossa kaavassa R on vetyatomi tai 1-5 hiiliatomia sisältävä alkyyliryhmä, isovaleryyli, tai se on fenyylialkyleeniryhmä, jossa alkyleeniosa on suora tai haaroittunut ja siinä on .30 1-6 hiiliatomia ja jossa fenyyliosa on substituoimaton < tai monosubstituoitu C^-alkyyli-, C^-alkoksi-, hydroksi-, tai halogeeniryhmällä, Rj ja R2 ovat kumpikin toisistaan riippumattomasti isopropyyli-, isobutyyli-, sek-butyyli-, n-butyyli-, bent-35 syyli- ja 2-(metyylitio)etyyliryhmiä, ja 28 94351 R3 on -CONH, tai näiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että α-aminosuojatut aminohapot sidotaan järjestyksessä Α$ - A, kasvavan peptidiketjun terminaaliseen aminoryhmään 5 hartsiin sidotussa yhdisteessä, jolla on kaava R Rl | O 10 boc-nh^ chi R2 jossa R, R[ ja R2 ovat kuten edellä on määritelty ja Boc on butyylioksikarbonyylisuojausryhmä ja (ympäröity R) 15 edustaa hartsia, joka peptidiketju on välillä altistettu poistamalla sen aminosuojausryhmä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan peptidijohdannainen, jolla on kaava
20 Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu (ι/' (CH2NH) )Met-NH2(ID#l) , Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu (CH2NH) ) Leu-NH2 (ID#2) , Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu (ι/' (CH2NCH3) ) Leu-NH2 (ID#3) , Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu (ι/' (CH2NCH2CH3) ) Leu-NH2 (ID#4) , Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu (ι/' (CH2N (CH2) 2CH3) ) Leu-NH2 (ID#5) ,
25 Asp-Ser-Phe-Val-B-Ala-Leu (ι/' (CH2NH) ) Leu-NH2(ID#14) , Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Phe (ψ (CH2NH) ) Leu-NH2 (ID#15) , Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu (ι/' (CH2NH) ) Phe-NH2 (ID#16) tai Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu (ι/' (CH2N (Iva) ) Leu-NH2(ID#17) . i « li 94351 29