PT90902B

PT90902B - Processo para a preparacao de novos derivados peptidicos com actividade antagonista da neuroquinina a

Info

Publication number: PT90902B
Application number: PT90902A
Authority: PT
Inventors: Scott Lee Harbeson; Stephen Hendersen Buck; James Ray Mccarthy; John Leonard Krstenansky
Original assignee: Merrell Dow Pharma
Priority date: 1988-06-20
Filing date: 1989-06-19
Publication date: 1994-12-30
Also published as: IL90637A; ES2057024T3; FI893002A; NZ229552A; HU204850B; FI94351B; IE61362B1; ZA894533B; FI893002A0; DK174964B1; EP0347802A3; DK301889A; AU619857B2; HUT50196A; AR246085A1; CN1039597A; CN1030703C; NO176105B; DE68916113D1; JP2711720B2

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS DERIVADOS

PEPTÍDICOS COM ACTIVIDADE ANTAGONISTA

DA NEUROQUININA A.

Çam]oo_âa_Invenção

A presente invenção refere-se a novos derivados peptídicos que são antagonistas da neuroquinina A.

A substância P e taquiquininas_relacionadas , neuroquinina A e neuroquinina B são um grupo de péptidos de ocorrência natural· exibindo uma larga distribuição nos tecidos corporais e uma grande variedade de efeitos biológicos. Enquanto que os agonistas e antagonistas da substância P e de neuroquinina B são conhecidos e enquanto os agonistas de neuroquinina A são conhecidos igualmente, os antagonistas de neuroquinina A não foram até ao presente assinalados. Os requerentes descobriram presentemente uma classe de antagonistas da neuroquinina A. Estes compostos não são somente interessantes sob o ponto de vista bioquímico mas também possuem utilidade médica e farmacológica valiosa.

Resuino_da_^nyen£ã ο

Derivados peptídicos antagonistas da neuroquinina A com a seguinte fórmula geral de estructura

X-A. -A -A -A -A -A -Y (I)

2 3 4 5 6 na qual

X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo com 1 a 6 átomos de carbono ou um grupo acilo com 2 a 10 átomos de carbono;

A^ representa uma ligação ou um grupo contendo de 1 a 4 aminoácidos;

A^ representa uma ligação, Asp ou Glu;

A^ representa aminoácido qualquer;

A^ representa Phe ou N-Me-Phe;

A^ representa Ile, Vai, Leu, Phe, Ala, Tyr, Nle, «et, N-Me-Val;

A_r representa Gly ou Sar; e

D

Y representa um grupo de fórmula geral

-NH conh₂ na qual

B representa um grupo de fórmula geral

-ch₂-n-,

R ^CH2-^S-CH=CH-,

-c-ch₂-,

-CH(OH)CH₂- e O

-NH-C-, em que

R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono ou feni1alquileno em que o grupo alquileno de cadeia linear ou ramificada comporta de 1 a 6 átomos de carbono e o grupo fenilo comporta facultativamente um substituinte escolhido entre um átomo de halogéneo ou um grupo alquilo ^“4' alcoxi C, . ou hidroxi;

1-4

R^ e R₂ representam cada um, independentemente, um grupo isopropilo, isobutilo, sec-butilo, n-butilo ou

2-(metil-tio)etilo;

e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Estes novos derivados peptídicos são antagonistas da neuroquinina A e portanto utilizáveis como agentes antiasmáticos, anti-inf1amatórios e anti-artriticos.

/ ..

I

2® ⁿ£ã o

As abreviaturas correntes comuns dos aminoácidos e grupos amino e carboxi terminais são utilizadas ao longo da presente memória descritiva.

Gly	( OU	G)	- glicina
Ala	( OU	A)	- alanina
Vai	( OU	V)	- valina
Leu	( ou	L)	- leucina
Ile	( ou	I )	- isoleucina
Fum	- f umar i1o
Orn	- ornitina
Pr o	( ou	P )	- pr olin a
Phe	( ou	F)	- fenilalanina
Trp	( ou	W)	- triptofano
Met	( ou	M )	- met ion ina
Ser	( ou	S )	- se r ina
Thr	( ou	T )	- treonina
Cy s	( ou	C )	- cisteina
Ty r	( ou	Y)	- tirosina
Asn	( ou	N )	- asparagina
Gin	( ou	Q)	- glutamina
A s p	( ou	D )	- ácido aspártico
Glu	( ou	E )	- acido glutâmico
Ly s	( ou	K)	- 1i s in a
Ar g	( ou	R )	- arginina

His (ou H) - histidina

Nle - norleucina

Hyp - hidroxiprolina

Glt - glutaril

Mal - maleilo

Npa ~β~ ( 2-naf til) alanina

3,4-dehidroPro - 3 , 4-dehidroprolina

Pgl - fenilglicina

NMePgl - N-metil-fenilglicina

Sar - sarcosina (N-metilglicina) pSubPhe - para fenilalanina substituída

SubPhe - orto, meta, ou para, mono- fenilalanina substituída

DAla (ou a) - D-alanina

Ac - aceti1

Suc - succinil pCIPhe - para-cloro-fenilalanina pNC^Phe - pa r a - n i t r o-f en i 1 a 1 an i n a

NMeVal - N-metil-valina

Considera-se que qualquer grupo alquilo ou fracção alquilica de um grupo alcoxi inclui grupos alquilo de cadeia linear, ramificada ou cíclica, por exemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, sec-pentilo, ciclo pentilo, hexilo, iso-hexilo, cic1 o-hexi1 o , e cic1opentilmeti1 . 0 radical alqui-

leno dos grupos fenilalquileno da presente invenção poder con ter de 1 a 4 átomos de carbono e ser de cadeia linear ou ramificada por exemplo metileno, etileno, propileno, butileno, isopropilideno e sec-butilideno. O radical fenilo dos grupos fenilalquileno desta invenção podem ser insubstituidos ou mono-substituidos nas posições orto, meta ou de preferência para. São preferidos os grupos fenilo ou para hidroxifenilo insubstiluidos . Considera-se que um grupo acilo com 2 a 10 átomos de carbono inclui grupos acilo de cadeia linear, ramificada ou ciclica eventualmente saturados com 1 ou 2 radicais carbonilo por grupo, por exemplo, acetilo, benzoilo, succinilo, maleilo e glutarilo. Um grupo de halogeneo é um átomo de fluoro, cloro, bromo ou iodo. Nos grupos representados por

X da presente invenção o átomo de hidrogénio, o grupo alquilo ou acilo estão ligados ao grupo o(-am ino do aminoácido ami noterminal. Aqueles peptidos em que o grupo amino do aminoácido aminotermina1 tem como substituinte dois grupos alquilo ou acilo também são considerados como abrangidos pelo âmbito dos peptidos da presente invenção.

Deverá ser evidente de que os derivados péptidicos da presente invenção abrangem os peptidos em que a ligação amido peptidica normal dos dois aminoácidos de terminal carbono, da neuroquinina A de ocorrência natural foram modificados e estes dois aminoácidos modificados são quimicamente representados ali como o grupo Y. Uti1izando-se a nomenclatura convencional adoptada pela química péptidica, o grupo representado por Y que é constituído por dois resiΊ duos de leucina, isto e, em que e representam cada um um grupo sec-butilo, tendo a sua ligação amida modificada por redução do grupo carbonilo a grupo metileno podem ser designados por Leu HUCH^NHjLeu. Esta designação indica que o grupo carbonilo da amida da penúltima leucina está reduzido para um grupo metileno. Outras designações de nomenclatura utilizadas para descrever os derivados péptidicos da presente invenção são tfíCH₂S], ^ICHO], V[CH = CH], ψ[ C ( 0 ) CH ₂ ] , ψ [CH ( OH) CH₂ ] e Ψ[ΝΗΟ(Ο)].

A designação uma ligação, quando utilizada em relação à definição de A^ entende-se significar que o grupo representado por X é ligado directamente a um grupo A₂ou nas circunstâncias em que A₂ também representa uma ligação X está directamente ligado a um grupo A^.

Do mesmo modo a designação uma ligação, quando utilizada em relação à definição de A entende-se significar que A^ etá ligado directamente ao grupo A^ ou nas circunstâncias em que o grupo A^ também representa uma ligação então X está ligado directamente ao grupo representado por A₃ .

A designação aminoácido qualquer utiliza-se para incluir os aminoácidos de ocorrência natural assim como outros -aminoácidos não proteínicos correntemente utilizados pelos técnicos na química dos péptidos de ocorrência natural. Os aminoácidos de ocorrência natural são: glicina, alamina, valina, leucina, isoleucina, serina, metionina, treonina, fenilalamina, tirosina, triptofano, cisteina, prolina, histidina, ácido aspartico, asparagina, ácido glutânico, glutamina, arginina, ormitina e lisina. Exemplos de aminoácidos não proteinicos são a morleucina, norvalina, aloisoleucina, homoarginina, tiaprolina, desidroprolina, hidroxiprolina (Hip), homo-serina, ci cl o-hex i lgl ici ne (Chg), ácido c(-amino n-butirico (Aba), ciclo-hexilalamina (Cha), ácido aminofeni1butirico (Pba) , fenilalaminas substituidas nas posições orta, meta ou para, do grupo fenilo tendo como um ou dois substituintes os átomos ou grupos seguintes:

alquilo C alcoxi C^_^, halogéneo, grupos nitro ou substituídos com um grupo metileno dioxi,/?-2- e 3-1ienilalanina, /3-2- e 3-f ur an i 1 al amina , ^-2-, e 3- e 4-p i r id i 1 a 1 an ina , /5-(benzotiani1-2 - e 3-i1)alamina , /3-(1- e 2-nafti1)alamina, derivados O-alquilados de serina, Treonina ou tirosina, S-alquilados de cisteina, O-sulfato éster de tirosina, 3-5-diiodotirosina e D-isómeros dos aminoácidos de ocorrência natural .

Os amonoácidos naturais, com excepção da glicina, contêm um átomo de carbono quirálico. A menos que especificado de um outro modo, os aminoácidos opticamente activos referidos aqui apresentam a configuração L. Como habitualmente, a estructura dos péptidos representada aqui por extenso é tal que a extremidade aminotermina 1 apresenta-se do lado esquerdo da cadeia e a extremidade carboxi-1ermina 1 do lado direito. De acordo com o exposto e com o hábito corrente ι

te.

os grupos B são desenhados de modo que a valência aberta do lado esquerdo está ligada ao átomo de carbono do grupo representado por Y que suporta um Η, o grupo R^ e o grupo NH e a valência aberta do lado direito do grupo B está ligada ao átomo de carbono do grupo ^2 ^{e um} 9^ruP° CONH^.

Os polipéptidos de fórmula geral I podem formar sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico com qualquer ácido inorgânico ou orgânico não Toxico. Ácidos inor gânicos representativos que constituem sais apropriados inclu em o ácido clorídrico, o ácido bromídrico, o ácido sulfuríco e o ácido fosfórico e sais de metal ácido tais como o mono-hidrogeno ortofosfato de sódio e o hidrogeno sulfato de potássio. Ácidos orgânicos representativos que formam sais apropriados incluem os ácidos mono, di e tricarboxί1icos. Representativos destes ácidos são, por exemplo, o ácido acético, o ácido glicólico, o ácido láctico, o ácido pirúvico, o ácido malónico, o ácido succínico, o ácido glutárico, o ácido fumárico, o ácido málico, o ácido tartárico, o ácido cítrico, o ácido ascórbico, o ácido maleico, o ácido hidroxima 1eico, o ácido benzóico, o ácido hidroxibenzoico, o ácido fenilacético, o ácido cinâmico, o ácido salicílico, os ácidos 2-fenoxibenzoico e sulfónicos tais como o ácido metanossulfónico e 2-hidroxietanossu1fónico. Os sais dos aminoácidos de terminal carboxilo incluem os sais dos ácidos carboxílicos não tóxicos formados com quaisquer bases orgânicas ou inorgânicas apropeiadas . Estes sais incluem os sais de metais alcalinos.

como por exemplo, os sais de sódio e de potássio; os sais de metais alcalinoterrosos tais como os de magnésio e cálcio; os sais de metais leves do grupo IIIA que inclui o alumínio e os sais de aminas orgânicas primárias, secundárias ou terciárias como por exemplo de trialquilaminas que incluem a trietilamina, a procaína, a dibenzilamina, a 1-atanamina, a N,N'-dibenziletilenodiamina, a di-hidroabietilamina, as N-alquilo (inferior) piperidinas e qualquer outra amina apropriada.

Como com qualquer grupo genérico de compostos químicos preferem-se certos grupos. Preferem-se os grupos de derivados péptidicos de fórmula geral I em que X representa um átomo de hidrogénio e A uma ligação, aqueles em que os derivados péptidicos de fórmula geral I na qual X representa Get, Mal, Fum e especialmente Suc. Preferem-se também aqueles derivados péptidicos de fórmula geral I em que A^ representa His-Lys-Thr, Lys-Thr, Thr, Asp-Val-Pro-Lys-Ser,

Vai-Pro-Lys-Ser, Pro-Lys-Ser, Lys-Ser, Ser, pGlu-Pro-Ser-Lys,

Pro-Ser-Lys, Ser-Lys ou Lys.

São especialmente preferidos os derivados péptidicos de fórmula geral I na qual A representa His-Lys-Thr, Lys-Thr ou Thr. Também se preferem os derivados peptídicos de fórmula geral I na qual A^ representa Asp, e ainda os derivados péptidicos de fórmula geral I na qual A^ representa Gly, Gin, Asn, Sar e especialmente Ala ou Ser. São ainda preferidos os derivados péptidicos de fórmula geral I na qual A^ representa Phe assim como aqueles derivados de fórmula geral senta Gly.

I em que A representa Vai e em que A repreo 6

Preferem-se os derivados peptídicos de fórmula geral I em que B representa um grupo -CH^NH- assim como aqueles em que representa um grupo isobutilo, isto é, 2-metilpropilo e em que R^ representa um grupo metiltio-etilo, isobutilo ou n-butilo. São especialmente preferidos os compostos em que R^ e R^ representam cada um um grupo isobutilo. Os derivados peptídicos mais preferidos de fórmula geral I são -H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu V[CH^NH ]-Leu-NH^, em que R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo.

Podem preparar-se as proteínas da presente invenção por uma diversidade de processos facilmente determinados pelos técnicos. Estes processos incluem o processo sequencial de fase sólida que pode realizar-se uti1izando-se métodos automatizados estabelecidos tais como a utilização de um sintetizador peptídico automático. Para preparar os derivados peptídicos desta invenção, liga-se a um suporte de resi na um dipeptido modificado que corresponde ao dipeptido de terminal carbono que apresenta a ligação peptídica modificada ou o seu precursor. Os processos a utilizar para preparar cada uma das ligações peptídicas modificadas são conhecidos dos técnicos e facilmente determinados por um químico desta área dos peptidos. 0 processo para preparar os derivados peptídicos de fórmula geral I em que B representa um grupo -NHCOisto é os compostos ψ[ NHCO] é conhecido de Chorev e Goodman,

Int. J. Pept . Protein Res., 21(3), 258-68 (1983).

processo para preparar os derivados peptídicos de fórmula geral I em que B representa um grupo -COCH^ou -CH(OH)CH₂- isto é os compostos *P[COCH₂] e Ψ[ΟΗ(ΟΗ)ΟΗ₂] respectivamente é descrito por Holladay e Rich, Tetrahedron Letters, 24(41 ) , 4401-0 4 ( 1983 ) . O processo para preparar os derivados peptídicos de fórmula geral I em que B representa um grupo -CH₂NH- isto é os compostos S*[CH NH] é descrito por Sasaki e Coy, Peptides, Vol. 8 pp. 119-121, 1987 e está mais completamente referido posteriormente. O processo para preparar aqueles derivados peptídicos de fórmula geral I em que B representa um grupo -CH₂S- isto é os compostos ^[CH₂S] é descrito por Spatola e Darlak, Tetrahedron Letters, 44(3) ,

2 1-3 3 ( 1 9 8 8) . O processo para preparar os derivados peptídicos de fórmula geral I em que B representa um grupo -CH₂Oisto é os compostos S^[CH₂O] está descrito por TenBrink, J. Org, Chem., 52,418-22, 1987.

Especificamente os compostos da presente invenção em que B representa um grupo de fórmula geral -CH₂N(R) preparam-se mediante redução do grupo N-metoxi-N-metilamida de fórmula 2 para se obter o aldeído de fórmula 3. A redução pode realizar-se por qualquer procedimento habitual e fácilmente determinada pelos técnicos nesta matéria, como por exemplo, mediante utilização de hidreto de alumínio e litio.

Esta redução pode realizar-se de um modo conveniente por meio de adição de cerca de um equivalente molecular de LAH a uma solução arrefecida, habitualmente a 0 C, de um composto de fórmula geral 2 no seio de um solvente não reactivo tal como um solvente etéreo, isto é, por exemplo, tetra-hidrofurano ou éter dietilico.

Apos a reacção estar essencialmente completa, normalmente decorridos 30 minutos, a mistura reaccional é diluída mediante adição de, por exemplo, hidrogeno sulfato de potássio ou de sódio a 10% e em seguida a água. Pode isolar-se depois o produto, por exemplo, por extracção da mistura aquosa com um solvente como o éter dietilico, lavagem da fase etérea arrefecida, diluição com ácido clorídrico diluído, secagem e eliminação do solvente. 0 produto impuro pode-se purificar, por exemplo, em coluna de gel de sílica e eluição com acetato de etilo a 55%/hexano.

/

O aldeído de fórmula geral 3 faz-se em seguida com o aminoácido ligado à resina de fórmula reagir geral 6

R

na qual R e R^ têm os significados como definidos para a fórmula geral 1 e em que representa a resina. A base de Schiff que se forma inicLalmente é reduzida in situ utilizando-se, por exemplo, cianoboro-hidreto de sódio, para se obter um dloeptido modificado Ligado à resina de fórmula geral 7.

na qual R, Re R^ têm os significados como definidos para a fórmula gerai 1 e © representa a resina.

Os aminoácidos representados pelos símbolos de A até A podem ser depois ligados sequêncialmente ao

1 dipeptído modificado ligado à resina da fórmula habitual.

As atiidas de N-metoxi-N-meti1o de fórmula geral 2 preparam-se por forma convencional a partir do corres15 pondente composto N-Boc protegido.

Adiciona-se carboni1-diimidazo1 à solução seca do aminoácido N-Boc protegido num solvente etéreo como o éter dietilico. A mistura reaccional permanece em agitação durante um tempo compreendido entre 10 minutos e uma hora, normalmente durante 15 a 20 minutos. Adiciona-se cloridrato de N,0-dimeti1-hidroxilamina em dimetilformamida e uma amina com impedimento entérico, tal como a diisopropiletilamina e deixa-se a mistura sob agitação durante um período de cerca de 6 até 24 horas à temperatura ambiente. 0 composto desejado é isolado de seguida por evaporação do solvente e purificação do produto impuro que se pode realizar, por exemplo, por cromatografia rápida em gel de sílica e eluição com cloreto de metilo.

suporte de resina utilizado pode ser qualquer resina convencional utilizada habitualmente na preparação de polipéptidos de fase sólida, de preferência polistireno préviamente preparado por ligação cruzada com 0,5 a cerca de 3% de divinil-benzeno, que fora clorometilado ou hidroximeti1ado para proporcionar sítios para a formação de éster com o aminoácido <%-amino protegido inicialmente introduzido .

exemplo duma resina hidroximetί1ica está descrito por Bodanszky, et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597-9 8 ( 1 9 6 6 ) . Está comercializada uma resina clorometilada por

Bio Rad Laboratoires , Richmond, Califórnia e a preparação duma resina destas está descrita por Stwart et al., Solid

Phase Peptide Synthesis (Freeman & Co., San Francisco 1969),

Capítulo 1, pp . 1 a 6. Pode ligar-se o aminoácido protegido à resina pelo processo de Gisin, Helv. Chem Acta, 56, 1476(1973).

São comercializadas muitas resinas de ligação a aminoácidos protegidos. Como por exemplo, para se preparar um polipeptido da presente invenção em que a extremidade do terminal carboxi lo consiste num resíduo Thr, pode utilizar-se um grupo terc-butiloxicarbonilo (Boc) Thr protegido ligado a uma resina benzilada, hidroximetilada, feni1acetamidometi1ica (PAM) que é comercializada.

A seguir à ligação do aminoácido o^^-aniino protegido ao suporte de resina, o grupo de protecção é eliminado uti1izando-se qualquer processo apropriado, tal como por exemplo, o ácido trif1uoroacético em cloreto de metileno, o ácido trifluoroacético apenas, ou ácido clorídrico em dioxano. Realiza-se a desprotecção a uma temperatura compreendida entre 0°C e a temperatura ambiente. Podem-se utilizar outros reagentes de separação padrão e condições para a eliminação dos grupos de protecção (X-amino específicos. Após a remoção do grupo de protecção íX-amino os outros aminoprotegidos são ligados fase a fase na ordem desejada.

Alternativamente grupos múltiplos de amino ácido podem ligar-se mediante um método de solução antes da ligação com a resina que suporta a sequência de aminoácidos.

grupo de protecção o(-amino utilizado para —-/ >

ί cada aminoácido introduzido na sequência polipeptidica pode ser qualquer grupo de protecção conhecido. Entre as classes de grupos de protecção c/amino considerados incluem-se (1) grupos de protecção tipo acilo, tais como: formilo, trif1uoro-aceti1o , ftalilo, tolueno-sulfonilo, tritil-sulfenilo, O-nitrofenoxi-acetilo e e(-clorobutirilo; (2) grupos de protecção do tipo uretano aromáticos tais como, benzi1oxicarbonilo e benziloxicarbonilo substituido tais como p-clorobenziloxicarbonilo, p-nitrobenzi1oxicarboni1o, p-bromobenziloxicar bonilo, p-metoxibenziloxicarbonilo, 1-(p-bifenilil)-1-metiletoxicarbonilo , o(, c/ -dimet i 1 - 3 , 5-dimetox ibenz i 1 ox i car bon il o e benzidriloxicarbonilo; (3) grupos de protecção uretano alifáticos , tais como: terc-butiloxi carbonilo (Boc), diisopropilmetoxicarboni1 o, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo e aliloxicarbonilo; (4) grupos de protecção tipo uretano cicloalquilico, tais como, cic1opentiloxicarboni1o , adamanti1oxicarbonilo e cicl o-hexi1oxicarboni1 o; (5) grupos de protecção tipo tio-uretano, tais como: feniltiocarbonilo; (6) grupos de protecção tipo alquilo, tais como: trifenilmeti1o {tritilo) e benzilo; e (7) grupos tria 1qui1o-si1 aηo tais como: trimetil siiano. O grupo de protecção ά-amino preferido é o grupo terc-butiloxicarbonilo .

A selecção de um reagente de ligação apropriado é da competência do prito. Um reagente de ligação particularmente apropriado, quando um aminoácido a adicionar é Gin, Asn ou Arg é a N,N'-diisopropi1carbodiimida ou 1-hidroxi benzotriazo1. A utilização destes reagentes impede a formação

Ζ de nitrilo e de lactama. Outros agentes de ligação são: (1) as carbodiimidas , por exemplo, N ,N '-diciclo-hexilcarbodiimida e N-etil-N'-X- dimeti1aminopropi1carbodiimida; (2) as cianamidas, por exemplo, N,N-dibenzi1cianamida; (3) ceteniminas;

(4) sais de isoxazolio, por exemplo, N-etil-5-fenil-isoxazolio-3'-sulfonato; (5) compostos monocíclicos azotados contendo amidas heterociclicas de carácter aromático comportando entre um a quatro átomos de azoto no núcleo, tal como os imidazolidos, pirazolidos e 1,2 , 4-triazolidos.

Amidas heterociclicas especificas que são utilizáveis incluem ο Ν,N'-carbomildiimidaζo1 e N,N-carbomil-di-1,2 , 4-triazol; (6) acetileno alcoxilado, por exemplo, etoxiacetileno; (7) reagentes que formam uma mistura anidra com o radical carbonilo do aminoácido, por exemplo, cloroformato de isobutilo ou o anidrido simétrico do aminoácido que se pretende ligar, por exemplo, Boc-Ala-O-Ala-Boc e (8) compostos heterocíclicos contendo azoto que têm um grupo hidroxi num núcleo azotado, por exemplo, N-hidroxifta 1imida, N-hidroxi-succinimida e 1-hidroxibenzotriazol. Estão descritos por Kapoor, J. Pharm. Sei., 59, pp. 1-27 (1970) outros reagentes activantes e a sua utilização na ligação peptídica. Prefere-se a utilização de anidrido simétrico como reagente de ligação para todos os aminoácidos excepto para Arg, Asn e

Gin .

Cada aminoácido ou sequência de aminoácidos protegido é introduzida no reactor de fase sólida numa quantidade qutro vezes superior à necessária e a ligação realiza-se num meio de dimetilformamida: cloreto de metileno a

1:1 ou em dimeti1formamida apenas ou de preferência apenas em cloreto de metileno. Nos casos em que ocorre ligação imcompleta, o processo de ligação repete-se antes da eliminação do grupo de protecção p(-amino, antes da ligação do aminoácido seguinte no reactor de fase sólida. 0 sucesso da reacção de ligação em cada estádio da sintese é controlado pela reacção da ninidrina como descrita por E. Kaiser et al., Analyt.

Biochem. 34 , 5 95 ( 1970 ) .

Após a obtenção da sequência de aminoácidos desejada separa-se o peptido da resina. Esta separação pode efectuar-se por hidrólise tal como mediante tratamento da resina-1igação-polipeptido com uma solução de dimetilsulfito, p-cresol e tiocresol em ácido fluorídrico anidro.

Como ó conhecido na sintese peptidica de fase solida muitos dos aminoácidos que apresentam grupos funcionais requerem protecção durante a preparação da cadeia. A utilização e selecção dos grupos de protecção apropriados é da competência do técnico nesta matéria e dependerá do aminoácido a proteger e da presença no péptido de outros resíduos de aminoácidos protegidos. A selecção de um destes grupos de protecção de cadeia lateral é critica porque deve ser um grupo que não seja eliminável durante a separação do grupo de protecção do radical e(-ainino protegido. Por exemplo grupos de protecção da cadeia lateral apropriados para a lisina são os

grupos benzi1oxícarboni1 o e benziloxicarbonilo substituídos, tendo como substituintes átomos ou grupos escolhidos entre halogêneo, por exemplo, cloro, bromo, fluoro e nitro, por exemplo, 2-clorobenziloxicarbonilo , p-nitrobenziloxicarbonilo, , 4-diclorobenzi1oxicarboni1o, tosilo, t-amiloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo e diisopropilmetoxicarbonilo. O grupo hidroxilo alcoólico da treonina e da serina podem ser protegidos com um grupo acetilo, benzoilo, terc-butilo, tritilo, benzilo, , 6-diclorobenzilo ou benziloxicarbonilo. O grupo hidroxilo carboxílico do ácido aspártico e do ácido glutâmico pode proteger-se com um grupo benzilo ou ciclo-hexilo. O grupo de protecção preferido é o grupo benzilo.

Estes grupos podem eliminar-se pelos processos correntes. Elimina-se usualmente o grupo de protecção após a síntese da cadeia peptídica estar completa mas os grupos de protecção podem eliminar-se em qualquer outro momento apropriado.

Pode demonstrar-se a capacidade dos derivados peptídicos de fórmula geral 1 para actuarem como antagonistas da neuroquínina A pela capacidade desses peptidos para competir com a neuroquínina A iodada para os receptores da neuroquínina A dos mamíferos (NK2) utilizando-se o método de Buck, et al., Science 226: 987-989, 1984, para capacidade destes compostos para estimular ou inibir a renovação de fosfatidi1inositol induzida pela neuroquínina A uti1izando-se o método de Bristow, et al., British J. Pharmacol. 90:211-21,

1987 ou para antagonizar a contacção muscular lisa induzida pela neuroquinina A utilizando-se o método de Dion, et al . ,

Life Sciences 41:2269-2278, 1987.

Devido à capacidade dos derivados peptídicos da presente invenção actuarem como antagonistas da neuroquínina A os compostos são utilizáveis como imunodepressores e no tratamento de artrite, asma, ardor, inflamação, desenvolvimento de tumor, hipermotilidade gastro-intestinal , doença de Huntingtónis , psicose, neurite, neuralgia cefaleia incluindo a enxaqueca, hipertensão, incontinência urinária, urticária, sintomas da síndrome carcinoide, influênza e resfriamento vulgar .

Os técnicos determinam facilmente doses eficazes por via oral ou parentérica podem ser determinadas facilmente pelo técnico e consistem em doses que provocam o antagonismo do receptor de neuroquinina A (NK2) . Por exemplo doses eficazes de péptidos da presente invenção podem estar compreendidos entre cerca de 0,5 ,ug/kg e cerca de 50 0 mg/kg por massa corporal do doente e por dia. Os compostos são administrados de um modo conveniente sobre a forma de doses unitárias contendo entre cerca de 1 mg a cerca de 500 mg de composto activo e podem ser administradas de uma a quatro ou mais doses unitárias por dia. 0 termo doente utilizado aqui refere-se a mamíferos, tais como os primatas, incluindo seres humanos, carneiros, cavalos, gado, porcos, cães, gatos, ratos e murganhos .

Ainda que alguns derivados peptídicos possam sobreviver à passagem através do intestino após administração oral, prefere-se a administração não oral, por exemplo subcutânea, endovenosa, intramuscular ou intraperitoneal; administração por injecção depósito, por preparação de um implante ou por aplicação às membranas mucosas, tais como à membrana do nariz, da garganta ou dos tubos brônquicos, por exemplo, sob a forma de aerossol que pode conter um derivado peptídico da presente invenção sob a forma de uma aspersão ou de um pó seco.

Para administração por via parentérica os compostos podem administrar-se como doses injectáveis de uma solução ou suspensão do composto, num solvente aceitável sob o ponto de vista fisiológico com um veículo farmacêutico que pode ser um líquido estéril tal como a agua ou óleos com ou sem adição de um agente tensioactivo ou de outros adjuvantes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Óleos representativos que podem ser utilizados nestas preparações são os provenientes da parafina, óleos animais, óleos vegetais ou óleos de origem sintética, por exemplo óleo de amendoim, óleo de soja e óleo mineral. Em geral preferem-se veículos líquidos como água, solução de cloreto de sódio, dextrose aquosa e açucares em solução relacionados com esta, etanol e glicois como o propilenoglicol ou o po1ieti1enog1ico1 , particularmente para soluções injectáveis.

Os compostos podem ser administrados sob a ser do graforma de uma injecção depósito ou de um implante que pode preparado de tal modo a permitir a libertação controlada ingrediente activo. 0 ingrediente pode ser comprimido em nulos ou em pequenos cilindros e implantado por via subcutânea ou intramuscular sob a forma de injecções depósito ou de implantes. Os implantes podem utilizar substâncias inertes tais como os polímeros biodegradáveis ou os silicones sintéticos, por exemplo, silastic, borracha de silicone preparada pela Dow-Corning Corporation.

Exemplos

A presente invenção é ilustrada através dos exemplos não limitantes seguintes.

Exem£lo_l

Antagonismo para o receptor da neuroquinina A por H-Asp-Ser-Phe-Va1-Gly-Leu-H⁷ [CH^NH]-Leu-NH e H-Asp-Ser-Phe-Gly-Leu- V[CH2N(CH ) j-Leu-NH^ como se demonstra pelo efeito sobre a reposição de fosfatidi1inositol.

Reuniram-se diversas bexigas provenientes de murganhos, cortadas e homogeneizadas em 50 mM Tris-ACl (pH 0

7,4) contendo 120 mM de NaCl e 5 mM KC1 a temperatura de 4 C e centrifugadas a 48 x g durante 15 minutos. O aglomerado sus pendeu-se durante 30 minutos em 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) con. o tendo 10 mM de EDTA e 300 mM de KC1 a temperatura de 4 C.

Centrifugou-se a suspensão como anteriormente e lavaou-se o aglomerado duas vezes em 50 mM Tris-HCl simples (pH 7,4) e centrifugou-se de um modo idêntico. Em seguida fez-se a sus2 4

pensão do tecido em tampão de incubação e adicionou-se uma aliquiota (aproximadamente 3 a 5 mg de tecido) em cada tubo de ensaio para se iniciar o ensaio. Os tubos de ensaio continham tampão de incubação constituído por 50 mM de Tris-Hcl (ph 7,4), 0,02% de BSA, 40 /ug/ml de bacitracina, 4 /ig/ml de quimostetina, a /ug/ml de leupeptina, 2 mM de MnCl^, 0,1 nM de 125 iodo-histidilo-neuroquinina A (Amersham Corp.) e concentrações dos compostos em epígrafe ou dos padrões, variando entre 0,03 nM e 100 yuM. Para se atingir o equilíbrio deixou-se o ensaio processar-se durante 120 minutos à temperatura ambiente. Após este período, os conteúdos de cada tubo foram rapidamente filtrados por filtros Whatman GF/B pré-humedecidos com BSA 0,5% e lavaram-se os filtros rapidamente duas vezes com 50 mM Tris-HCl simples arrefecido com gelo a pH 7,4.

A radioactividade ligada ao filtro foi quantificada por um contador-gama. A ligação específica (máxq ma) definiu-se com uma diferença entre a ligação na presença e na ausência de 1yuM de neuroquinina A não marcada. A competição entre a ligação de neuroquinina A iodada e os compostos em ensaio ou os padrões expressou-se sob a forma de percetagem desta competição máxima. Os valores de (concentração requerida para inibir 50% da ligação com o receptor) verificaram-se ser da ordem de 100 a 200 nM para os compostos em epígrafe (Fig. 1).

Exemjol o_2^

Antagonismo para o receptor de neuroquinina A por H-Zsp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu-Ψ[CH₂NH]-Leu-NH₂ e H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu- ψ[ CH₂N(CH^) ]-Leu-NH, como demonsrado pelo efeito sobre a reposição de fosfatidilinositol.

Reuniram-se as bexigas de diversos murganhos e fizeram-se cortes de 350 com um cortador de tecido.

O tecido cortado foi em seguida incubado em tampão de Krebs-He.pes a 37°C com mudanças de tampão recente, cada 15 minutos durante 30 minutos. Em seguida incubou-se o tecido neste tampão contendo 100 a 200 uCi de 3H-inositol à temperatura de o

C. Em seguida lavou-se o tecido e incubou-se durante mais minutos em tampão Krebs-Hepes contendo 10 mM de Li⁺, à o temperatura de 37 C com mudança para tampão recente de 15 em minutos. As porções de massa tecidular, aproximadamente 10 a 20 mg por tubo de ensaio foram depois colocadas em tampão de litio, e adicionado o composto em ensaio, 25 pl e em segui da várias concentrações de neuroquinina A, 25 pl, para um volume final de 250 pl. Avaliou-se o composto em ensaio com concentrações variando desde 1 nM até 100 pM e as concentrações de neuroquinina A variando entre 1 nM e 10 pM. Também se avaliou o composto em ensaio isoladamente nas concentrações para o teste da actividade agonista. Após 30 minutos à temperatura ambiente, determinou-se a reposição de fosfatidi1ino sitol por adição de 940 pl de cloroformio; metanol a 1:2, seguido de 310 pl de cloroformio e depois de 310 pl de água.

Em seguida cada tubo foi submetido a agitação turbilhonar durante 15 segundos e depois centrifugado a 3.000 rpm durante minutos para separação das fases. Em seguida impregnaram-se 900 pl da fase superior (aquosa) numa coluna de permuta iónica (formato) Biorad AG-1X8 de 0,5 ml. Retiraram-se 50 pl da fase inferior (cloroformio) de cada tubo e colocaram-se numa ampola de contagem, seca, e contou-se o fluido de cintilação. 0 material das colunas lavou-se na ordem seguinte:

1) 10 ml de água.

2) 5 ml de mM tetraborato dissódico/160 mM de formato de sódio.

3) 10 ml de formato de amónio 1 M em ácido fórmico

0,1 M.

Recolheu-se a lavagem final (a terceira) e misturou-se um ml com 6 ml de líquido de cintilação ACS e contou-se. A relação destas contagens (total de fosfatos de inositol) com as conta gens da fase orgânica correspondente foi calculada em seguida para cada amostra. As relações na presença do composto em ensaio e/ou dos padrões foram depois comparadas com as relações com os tubos de controlo, isto é, sem agonista estimulante. Construiram-se as curvas dose-resposta e determinaram-se as capacidades dos compostos em ensaio para estimularem ou inibirem a reposição de fosfatidi1inositol induzida por neuroquinina A mediante análise gráfica ou com auxilio de um programa computorizado; representam-se nas Figuras 2 e 3.

Exemplo_3

Preparação da contracção de bexiga de murganho

Meias tiras de bexigas provenientes de mur ganhos Syrian machos dourados (75 a 100 g) suspenderam-se em

X o tampão de Tyrode a temperatura de 31 C e com 1 g de tensão de repouso como descrito por Dion et al . (Life Sciences 41; 2269-2278, 1987). Adicionou-se ao tampão o inibidor de encefalinase, tiorfan, a 10 /jh, 15 minutos antes da adição de cada composto em ensaio. As curvas dose-resposta a NKA cumulativas construiram-se primeiro na ausência e em seguida na presença do composto em ensaio.

Adicionaram-se cumulativamente os compostos em ensaio para determinar se estes tinham ou não efeitos de contracção. Antes de se adicionar a concentração cumulativa seguinte, deixou-se aplanar qualquer efeito observado do composto em ensaio. Sob estas condições a CE^^ para os efeitos de concentração de NKA foi geralmente de 10 nM, o que está em boa concordância com os valores da bibliografia. Os resultados de contracção são expressos pelos valores da tensão desenvolvida acima ou abaixo da tensão de repouso. Em tecidos de bexiga de três murganhos separados o composto H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu Ψ [ CH ^NH ) Leu-Ν'Η ou H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu ψ [ CH 2 N (CH ) Le u-NH até concentrações de 10 /iM não produziu qualquer concentração. As figuras 4 e 5 representam a força contractil como uma função da concentração de NKA sem e com a presença do composto em ensaio.

Exemçl^ ο_£

I. Síntese de Boc-Leu-aldeido (Fehrentz, J.-A. e Castro, B.

Synthesis, 676-678, 1983);

A. N-metoxi-N-metilamida de N-t-Boc-Leucina .

Dissolveram-se 15,0 mmoles de hidrato de

Boc-Leucina em 30 ml de eter anidro. Secou-se a solução com sulfato de magnésio anidro e eliminaram-se os sólidos por fi.1 tração. Adicionaram-se 16,5 mmoles de carbonildiimidazol ao filtrado e agitou-se a reacção durante 20 minutos à temperatura ambiente. Adicionou-se à solução resultante uma suspensão de 22,5 mmoles de uma suspensão de cloridrato de O,N-dime til-hidroxilamina em 15 ml de dimetilformamida e 3,9 ml de diisopropiletilamina. Agitou-se a mistura reaccional durante a noite à temperatura ambiente. Diluiu-se a reacção com acetato de etilo 75 ml e lavou-se com 3x40 ml de ácido clorídrico IN arrefecido com gelo, 3 x 40 ml de hidrogeno carbonato de sódio saturado e 1 x 40 ml de cloreto de sódio saturado. Secou-se a fase orgânica com sulfato de magnésio, filtrou-se e eliminou-se o acetato de etilo sob vácuo.

Dados analíticos: R (silica gel F254) : 0.51 (acetato de etilo/hexano 3/2); 'H-NMR (CDCl^) TMS int) : ($=0.95 ppm (2D, 6H, J=6.6 Hz); 1.42 (s,HH); 1.64-1.80 (m,lH); 3.20 (s,3H);

3.80 (s, 3H); 4.72 (m, 1H); 5.10 (d, 1H, J=7.5 Hz). Mass.

Spec: M + H⁺: Teorico: 275. Observado: 275.

B. Aldeído de Boc-Leucina:

Dissolveram-se 2,5 mmoles de N-metoxi-W29

-metilamida de Boc-leucina em éter dietílico anidro, 30 ml. Adicionaram-se a esta solução 3,2 mmoles de hidreto de alumínio e lítio (solução 1M em tetra-hidrofurano). Agitou-se a reacção durante 20 minutos à temperatura ambiente e diluiu-se cuidadosamente por adição de uma solução de hidrogeno sulfato de sódio (0,6 g) em 10 ml de água. Adicionou-se a mistura reaccional a 75 ml de éter dietílico e lavou-se com ácido clorídrico IN arrefecido com gelo, 3 x 30 ml, solução saturada de hidrogeno carbonato de sódio, 3 x 30 ml e solução saturada de cloreto de sódio, 1 x 30 ml. Secou-se a fase orgânica com sulfato de magnésio filtrou-se e eliminou-se o solvente no vácuo.

Resultados analíticos: Rf (sílica gel 60 F 254) : 0,68 acetato de etilo/hexano 3/2. Espectro de massa: M = H⁺ : Teórico: 216. Obesrvado 216.

II: Síntese de Resina-Leu:

Utilizaram-se técnicas de síntese peptídica de fase sólida padrão num sintetizador de peptídos automático. Após a formação de Boc-Leu-resina (0,5 mmoles), eliminou-se o grupo de protecção Boc e lavou-se a resina com dimetilformamida , diclorometano e secou-se.

III. Formação de ligação amida reduzida ( Leu ψ [ CH₂N'H ] ) :

Dissolveram-se 2 mmoles de Boc-Leu aldeído em ácido acético a 1% em dimeti1formamida (10 ml) e introdu30

- / /

I * ziu-se esta solução num reactor contendo resina-Leu (0,5 mmoles, ver II, citado antes). Adicionou-se a esta mistura uma solução de NaCNBH^ (150 mg) em 2 ml de dimetilformamida. Agitou-se a mistura durante 4 horas e decantou-se o reactor, lavou-se a resina com dimetilformamida e em seguida com diclo metano.

10

IV. Síntese de [ψ[ΟΗ₂ΝΗ] , Leu ]NKA₄__1Q:

A síntese do peptido completou-se num sinte.tizador de peptidos automático por adição sequencial dos aminoácidos restantes (Gly, Vai, Phe, Ser (bzl) e Asp (Chxl) ) . O peptido separou-se da resina e desprotegeu-se globalmente utilizando-se ácido fluorídrico anidro-anisol a 10:1. Purificou-se o peptido utilizando-se técnicas de HPLC de fase inversa. Dados analíticos: Análise de aminoácidos: (Digesto de HC1) Asp (1,03); Ser (0,93); Gly (1,01); Vai (0,96); Phe (0,74). Conteúdo peptídico= 53,4%. Espectrometria de massa bombardeamento atomico rápido: M + H . Teonco: 735. Observado

3 5 .

10

V. Síntese de [V[CH NCH ] , Leu ]NKA₄__1Q:

Fez-se reagir N-meti1-Leu-resina (0,5 mmoles), (preparada a partir de Boc-N-metil leucina de acordo com o processo descrito no ponto II) com 0,2 mmoles de Boc-Leu aldeído como descrito no ponto III anterior. A síntese peptídica copletou-se em seguida como descrito no ponto IV anterior .

Dados analíticos: Análise de aminoácidos (digesto de HC1) Asp (1,01); Ser (0,89); Gly (1,02); Vai (1,00); Phe (0,98). Conteúdo peptídico+ 53,5%. Espectrometria de massa bombardeamento atómico rápido: N + H . Teórico 749. Observado 749.

VI. Síntese de [ ψ [ Ct^NCH^R ] θ , Leu^lNKA^ :

Preparou-se a resina Boc-Leu [ψ(ΟΗΝΗ)-Leu de acordo com as fases II e III anteriores. Em seguida fez-se reagir a resina com 2,5 mmoles de R-CHO em 10 ml de HOAC a 1% em dimeti1formamida na presença de NaCNBH^ como des crito no ponto III anterior. A síntese do peptido completou-se depois como descrito no ponto IV referido anteriormente.

ΕχβΑί ca.Ção_das_FÍ2ur as

A Figura 1 representa a capacidade de H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuΨ [CH₂NH ]Leu-NH₂ e H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu Ψ[CH₂NCH] Leu-NH₂ para antagonizar a ligação ao receptor de NKA demonstrado pela capacidade do composto em ensaio para deslocar NKA marcada com 1125 na bexiga urinária do murganho (Exemplo 1). A abcissa (eixo do X) indica logaritmicamente a concentração em nanomoles de agonista ou de antagonista do receptor de neuroquinina A (NKA) . A ordenada (eixo do Y) indica a ligação especifica observada para cada agonista testado ou antagonista avaliada sob a forma de percentagem de ligação especifica máxima.

-θ--NKA —e—- NKA(3-10)

-z£s- NK A ( 4 -10 )

-- H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu ψ[CH^NH)Leu-NH^

-B- H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu ψ[CH₂N(CH )]Leu-NH₂

Os agonistas ensaiados foram NKA e fragmentos de NKA constituídos por os aminoácidos de NKA do terceiro ao décimo (3-10) e os aminoácidos de NKA do quarto ao décimo (4-10) . Os valores são a média + EPM de 6 a 12 experiências. Os valores de ΟΙ^θ avaliaram-se gráficamente a partir do ponto de inibição de

50% .

A Figura 2 representa a capacidade de H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu ψ[CH₂NH ]Leu-NH₂ para antagonizar a ligação ao receptor de NKA como demonstrado pelo efeito sob a reposição de fosfatidi1inositol (PI) em bexiga de murganho (Exemplo 2) . As abcissas (eixo do X) indicam logaritmic-amente a concentração em nanomoles (nM) de agonista ou de antagonista do receptor de NKA. As ordenadas (eixo do Y) indicam a

PI observada sob a forma de percentagem do conNKA

NKA + 10 λιΜ H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu ψ [ CH₂NH )Leu-NH₂ /jM de H-As p-S er-P he-Va 1-G1 y-Leu ψ [ CH ₂ NH ) Leu-NH ₂ produziu uma variação em direcção à direita significativa da curva dose-resposta de NKA de um modo competitivo. Os valores são a média + E.P.M. de experiências em triplicado.

reposçao de trolo .

A Figura 3 representa a capacidade de H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuV[CH₂NCH ]Leu-NH₂ (MDL29916) para antagonizar a ligação ao receptor de NKA como demonstrado pelo efeito sobre a reposição de fosfatidilinositol (PI) na bexiga do murganho (Exemplo 2). As abcissas (eixo do X) indicam logaritmicamente a concentração em nanomoles (nM) de agonista ou de antagonista do receptor de NKA. As ordenadas (eixo do

Y) indicam a reposição de PI observada sob a forma de uma percentagem do controlo.

-Θ- NKA

-φ- H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu ψ [CH^N { CH^ ) iLeu-NH^

-A-- H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu ty[CH NH)Leu-NH

-aâc- NKA + 1 juM H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leuψ[ΟΗ N(CH )]Leu-NH₂

-B- NKA + 10 juM H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu y/[CH₂N(CH₃) ]Leu-NH₂

-H- NKA + 100 juM H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu V[CH N(CH₃) ]Leu-NH₂

1, 10 e 100 /iM de H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu S^[CH₂N(CH₃) ]LeuNH₂ produziram uma variação significativa para a direita da curva dose-resposta de NKA de um modo significativo. 0 plano de Schild destes dados tem uma inclinação de menos 0,99 indicando antagonismo competitivo e pH2 de 7,66. Até 100 μΜ de H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu ψ[CH₂N(CH₃)Leu-NH₂ apresentam apenas actividade agonista parcial 5% e H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-LeuV[CH₂NH ] Leu-NH apresentam apanas actividade agonista parcial de 12%. Os valores são a média + E.P.M de experiências em triplicado .

A Figura 4 representa o efeito antagonista de H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu ψ[CH^NH ] Leu-NH^ sobre a actividade contráctil mediada por NKA em preparações de bexiga de murganho (Exemplo 3). As abcissas (eixo do X) indicam logarit micamente a concentração nanomolar (nM) de NKA ou de NKA conjuntamente com 10 jiM de Η-Asp-Ser-Phe-Val-G1y-Leu ψ[CH^NH ] Leu-NH^ . Os valores são a média + E.P.M. de experiências em triplicado.

A Figura 5 representa o efeito antagonista de Η-Asp-Ser-Phe- Va 1 -G1 y-Leu \|/[ CH2NH ] Leu-NH2 sobre a actividade contráctil induzida por NKA em preparação de bexiga de murganho (Exemplo 3). As abcissas (eixo do X) indicam logaritmicamente a concentração nanomolar (nM) de NKA ou de NKA conjuntamente com 10 /iM de H - A s p - S er - P he - Va 1 -G1 y - Le u V [ C Η N (CH)]Leu-NH. Os valores são a média + E.P.M. de uma experiência em triplicado.

Claims

1.- Processo para a preparação de derivados peptídico fórmula geral x-a₁-a₂-a₃-a_1|-a₅-a₅-y I

11a qual

X representa um átomo de hidrogénio, um grupo alqui 1 a 6 átomos de carbono ou um grupo acilo com 2 a átomos de carbono;

A^ representa uma ligaçao ou um grupo contendo de 1 aminoácidos;

A^ representa uma ligação, Asp ou Glu;

A^ representa aminoácido qualquer;

A. representa Phe ou N-Me-Phe; . , de o com (

Ag representa Ile, Vai, Leu, Phe, Ala, Tyr, Nle, Met, ou N-Me-Val;

Αθ representa Gly ou Sar: e

Y representa um grupo de fórmula geral

-NH

CONH, na qual

B representa um grupo de fórmula geral -CH^-N-, ou de — ϊχ uma das formulas:

-ch₂-s-, -ch₂-0-, -CH=CH-, íl

-C-CH₂

-CH(OH)CH₂-, e

I!

-NH-C-, em que

R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo com 1 a 4 átomos de carbono ou fenilalquileno em que o grupo alquileno, de cadeia linear ou ramificada comporta de 1 a 6 átomos de carbono e o grupo fenileno compor,

BAD ORIGINAL

37facultativamente um substituinte escolhido entre um átomo de halogeneo ou um grupo alquilo C^_^, alcóxi Cq_i| ^ou hidroxi

R e R₂ representam, cada um, independentemente um grupo isopropilo, isobutilo, sêc-butilo,n-butilo ou 2-(metil-tio)etilo;

e dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, caracterizado pelo facto de se ligar ao composto ligado à resina de fórmula

BocNH

Rn na qual R^, R^ e B têm os significados definidos antes, e Boc repre senta o grupo de protecção butiloxicarbonilo e JOR (rodeado por um círculo) representa a resina, na ordem de Dara A,, aminoácidos b 1 alfa-amino-protegidos ao grupo amino-terminal da cadeia peptidica em crescimento que, entretanto, foi exposta por eliminação dos grupos amino-protectores.

2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral I, na qual X representa um ãtomo de hidrogénio, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparaBAU urtlGiNAL çao de derivados péptidicos de fórmula geral I na qual represen ta uma ligação e X representa Glt, Mal, Fum ou Sue, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de derivados péptidicos de fórmula geral I na qual representa uma ligação e X representa Suc, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de derivados péptidicos de fórmula geral I na qual A^ representa His-Lys-Thr, Lys-Thr, Thr, Asp-Val-Pro-Lys-Ser, Val-Pro-Lys-Ser,

Pro-Lys-Ser, Lys-Ser, Ser, pGlu-Pro-Ser-Lys, Pro-Ser-Lys, Ser-Lys, ou Lys, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de derivados péptidicos de fórmula geral I na qual A^ representa His-Lys-Thr, Lys-Thr ou Thr, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de derivados péptidicos de fórmula geral I na qual A? representa Asp, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos bau oniGíNAL '

...............-J ' iniciais correspondentemente substituídos.

8.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual A reO presenta Gly, Gin, Asn, Sar, Ala ou Ser, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituí dos .

9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual repre senta Ala ou Ser, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

10. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prepa ração de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual repre senta Phe, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

11. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual A^ representa Vai, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

12. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a prepa ração de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual Αθ repre senta.

bau uhiginal

-40Gly, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

13.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual S representa um grupo de fórmula geral -Q^N-, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .

14. - Processo de acordo com a reivindicação l,para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual R^ representa um grupo isobutilo, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

15. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual R? representa um grupo 2-metil-tio-etilo, isobutilo ou n-butilo, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

15.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual R e R? representam cada um, um grupo isobutilo, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .

q

BAD ORIGINAL ¹

17.- Processo de acordo com a reivindicação I, para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual X representa um átomo de hidrogénio, um grupo Glt, Mal, Fum ou Suc, A re presenta uma ligação ou His-Lys-Thr, Lys-Thr,Thr, Asp-Val-Pro-Lys-Ser, Val-Pro-Lys-Ser, Pro-Lys-Ser, Lys-Ser,Ser, pGlu-Pro-Ser-Lys, Pro-Ser— Lys, Ser-Lys, ou Lys; representa uma ligação Asp, ou

Glu; A3 representa Gly, Gin, Asn, Sar, Ala, ou Ser; A^ representa Phe ou N-Me-Phe; Ag representa Ile, Vai, Leu, Phe, Ala, Tyr, Nle, Met, ou N-Me-Val; Ag representa Gly ou Sar; B representa -CH^NH-; e e R? representam, cada um, independentemente, um grupo isopro pil, isobutilo, sec-butilo, n-butilo ou 2-(metil-tio)e.tilo, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

13.- Processo de acordo com a reivindicação 17, para a prepa ração de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual X representa um atomo de hidrogénio, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

19,- Processo de acordo com a reivindicação 17, para a prepa ração de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual A^ representa uma ligação, His-Lys-Thr, Lys-Thr ou Thr, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

bad original

4220. - Processo de acordo com a reivindicação 17, para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual A? repre senta uma ligação ou Asp, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

21. - Processo de acordo, com a reivindicação 17, para a prepa ração de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual X representa um aromo de hidrogénio, A^ representa His-Lys-Thr, Lys-Thr ou Thr, e A? representa Asp, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

22. - Processo de acordo com a reivindicação 17, para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual A^ representa Ala ou Ser, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

23. - Processo de acordo com a reivindicação 17 para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual A^ representa Phe, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

24. - Processo de acordo com a reivindicação 17, para a preparação de derivados peptídicos de fórmula geral I na qual A^ representa Vai, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

BAD ORIGINAL 1

25.- Processo de acordo com a reivindicação 17, para a preparação de derivados péptidicos de fórmula geral I na qual representa Gly, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

25.- Processo de acordo com a reivindicação 17, para a prepa ração de derivados péptidicos de fórmula geral I na qual B representa um grupo de fórmula geral caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos .

27. - Processo de acordo com a reivindicação 17, para a prepa ração de derivados péptidicos de fórmula geral I na qual R^ representa um grupo sec-butilo, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

28. - Processo de acordo com a reivindicação 17, para a preparação de derivados péptidicos de fórmula geral I na qual R^ representa um grupo 2-(metil-tio)etilo, sec-butilo ou n-butilo, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

29. - Processo de acordo com a reivindicação 17, para a preparação de derivados péptidicos de fórmulas H-Asp-Ser-Phe-Val-Glybeu-í/CH^NH/Leu-NH₂ ou H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu Y/*CH_?N-(CH₃ )7 LeuBAD ORIGINAL

-ΝΗ₂, caracterizado correspondentemente pelo facto de se utilizarem compostos iniciais substituídos,

Lisboa, 19 de Junho O Agente Oí,c jI da Propried de 1989 de Índusíríal