NO176105B

NO176105B - Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive peptidderivater

Info

Publication number: NO176105B
Application number: NO892542A
Authority: NO
Inventors: Stephen Henderson Buck; John Leonard Krstenansky; Chester Fred Hassmann Iii; James Ray Mccarthy; Scott Lee Harbeson
Original assignee: Merrell Dow Pharma
Priority date: 1988-06-20
Filing date: 1989-06-19
Publication date: 1994-10-24
Also published as: IL90637A; ES2057024T3; FI893002A; NZ229552A; HU204850B; FI94351B; IE61362B1; ZA894533B; FI893002A0; DK174964B1; EP0347802A3; DK301889A; AU619857B2; HUT50196A; AR246085A1; CN1039597A; CN1030703C; DE68916113D1; JP2711720B2; KR910000791A

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av nye peptidderivater som er antagonister av neurokinin A.

Substans P og beslektede takykininer, neurokinin A og neurokinin B er en gruppe naturlig forekommende peptider som har vist seg å ha en utbredt fordeling i kroppsvev og et vidt antall av biologiske effekter. Selv om agonister og antagonister av substans P og neurokinin B er kjente, og selv om agonister av neurokinin A også er kjente, er antagonister av neurokinin A hittil ikke blitt rapportert. Det er nå funnet en klasse av neurokinin A-antagonister. Slike forbindelser er ikke bare interessante ut fra et biokjemisk synspunkt, men slike forbindelser har også verdifulle farmakologiske og medisinske anvendelsesområder.

Oppfinnelsen angår således en analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive peptidderivater av formel

X—A1-A2-A3—A4-A5-Ag-Y

hvori

X er hydrogen;

Ax er en binding;

A2 er en binding eller er Asp;

A3 er Ser;

A4 er Phe;

A5 er Val;

A6 er Gly; og

Y er en gruppe av formel

Ri R2 — NH — B CONH2 H H

hvori

B er en gruppe av formel

-CH2-N-

R

og hvori

R er et hydrogenatom eller en alkylgruppe med fra 1-4

carbonatomer;

Rx og R2 er Leu-sidekjede,

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav. . De etterfølgende vanlige forkortelser for aminosyrene og amino- og carboxyterminale grupper anvendes i foreliggende beskrivelse:

Gly (eller G) - glycin

Ala (eller A) - alanin

Val (eller V) - valin

Leu (eller L) - leucin

Ile (eller I) - isoleucin

Fum - fumaryl

Orn - ornithin

Pro (eller P) - prolin

Phe (eller F) - fenylalanin

Trp (eller W) - tryptofan

Met (eller M) methionin

Ser (eller S) - serin

Thr (eller T) - threonin

Cys (eller C) - cystein

Tyr (eller Y) - tyrosin

Asn (eller N) - asparagin

Gin (eller Q) - glutamin

Asp (eller D) - asparaginsyre

Glu (eller E) - glutaminsyre

Lys (eller K) - lysin

Arg (eller R) - arginin

His (eller H) - histidin

Nie - norleucin

Hyp - hydroxyprolin

Glt - glutaryl

Mal - maleyl - Npa-6-(2-nafthyl)alanin 3,4-dehydroPro - 3,4-dehydroprolin Pgl - fenylglycin

NMePgl - N-methyl-fenylglycin

Sar - sarcosin (N-methylglycin) pSubPhe - parasubstituert fenylalanin SubPhe - ortho-, meta- eller para-, mono- eller di-substituert fenylalanin

DAla (eller a) - D-alanin

Ac - acetyl

Suc - succinyl

pCIPhe - para-klor-fenylalanin

pN02Phe - para-nitro-fenylalanin

NMeVal - N-methyl-valin.

Det vil være innlysende at peptidderivatene fremstilt ifølge oppfinnelsen innbefatter peptider hvori den normale peptidamidbinding av de to carbonterminale aminosyrer av naturlig forekommende neurokinin A er blitt modifisert, og disse to modifiserte aminosyrer er kjemisk avbildet her som -gruppen Y. Uttrykket "en binding" som anvendt i relasjon til definisjonen av Ax, er beregnet på å angi at X-gruppen er direkte bundet til A2-gruppen eller i de tilfeller hvori A2 også er en binding, er X da direkte bundet til A3-gruppen. Likeledes er uttrykket "en binding" anvendt i relasjon til definisjonen av A2 beregnet på å angi at Ax er direkte bundet til A3-gruppen eller i de tilfeller hvori A1 også er en binding, er X da direkte bundet til A3-gruppen.

De naturlige aminosyrer med unntak av glycin innehol-der et chiralt carbonatom. Med mindre annet spesifikt er angitt, er de optisk aktive aminosyrer som det her er henvist til av L-konfigurasjon. Som vanlig er strukturen av peptidene skrevet ut her, slik at den aminoterminale ende er på venstre side av kjeden og den carboxyterminale ende på høyre side av kjeden. I overensstemmelse med dette og med vanlig bruk er B-gruppene trukket opp, slik at den åpne valens på venstre side er bundet til carbonatomet av Y-gruppen som bærer en "H", "R1"-gruppen og en "NH"-gruppe, og den åpne valens på høyre side av B-gruppen er bundet til carbønatomet av- Y-gruppen som bærer en "H", "R2"-gruppen og en "CONH2".

Polypeptidene av formel 1 kan danne farmasøytisk akseptable salter med en hvilken som helst ikke-toksisk, organisk eller uorganisk syre. Eksempler på uorganiske syrer som danner egnede salter, innbefatter saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre og fosforsyre, og sure metallsalter slik som nat-riummonohydrogen-orthofosfat og kaliumhydrogensulfat. Eksempler på organiske syrer som danner egnede salter, innbefatter mono-, di- og tricarboxylsyrer. Eksempler på slike syrer er f.eks. eddiksyre, glycolsyre, melkesyre, pyruvsyre, malonsyre, ravsyre, glutarsyre, fumarsyre, eplesyre, vin-syre, sitronsyre, ascorbinsyre, maleinsyre, hydroxymaleinsyre, benzosyre, hydroxybenzosyre, fenyleddiksyre, kanelsyre, sali-sylsyre, 2-fenoxybenzosyre, og sulfonsyrer, slik som methan-sulfonsyre og 2-hydroxyethansulfonsyre. Salter av den carboxyterminale aminodel innbefatter de ikke-toksiske carboxyl-syresalter dannet med en hvilken som helst egnet uorganisk eller organisk base. Eksempelvis innbefatter disse salter de av alkalimetaller, slik som f.eks. natrium og kalium; jord-alkalimetaller, slik som kalsium og magnesium; lette metaller av gruppe HIA innbefattende aluminium; og organiske primære, sekundære og tertiære aminer, slik som f.eks. trialkylaminer, innbefattende triethylamin, procain, dibenzylamin, 1-ethen-amin, N, N'-dibenzylethylendiamin, dihydroabiethylamin, N-(lavere)alkylpiperidin og et hvilket som helst annet egnet amin.

Analogifremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjenne-tegnet ved at det til en harpiks-bundet forbindelse av formel

hvori Rr,. R2 og B er som ovenfor definert, og hvori Boe er en butyloxycarbonylbeskyttende gruppe," øg R med ring rundt betegner harpiksen, bindes de alfa-aminobeskyttede aminosyrer i rekkefølge fra A6 til A1 til den terminale aminogruppe av den voksende peptidkjede som i mellomtiden er blitt utsatt for fjerning av dens aminobeskyttende gruppe.

For å fremstilles peptidderivatene bindes et modifisert dipeptid svarende til det carbonterminale dipeptid som har den modifiserte peptidbinding eller dens forløper til en harpiksbærer. Prosedyrer for anvendelse for fremstilling av hver av de modifiserte peptidbindinger er vel kjent innen faget og kan lett utføres av fagmannen.

. Spesifikt fremstilles forbindelsene ifølge oppfinnelsen, hvori B er en -CH2N(R)-gruppe, ved reduksjon av N-methoxy-N-methylamid av formel 2 under dannelse av aldehydet av formel 3. Reduksjonen kan utføres på en hvilken som helst kjent måte, slik som ved anvendelse av lithiumaluminiumhydrid (LAH). Denne reduksjon kan hensiktsmessig utføres ved tilsetning av ca. 1 molarekvivalent av LAH til en avkjølt, typisk rundt 0°C, løs-ning av en forbindelse av formel 2 i et ikke-reaktivt løs-ningsmiddel, slik som et etherisk løsningsmiddel slik som tetrahydrofuran (THF) eller diethylether. Etter at reaksjonen -hovedsakelig er fullført, typisk etter ca. 30 min., stanses reaksjonen ved tilsetning av f.eks. 10 % kalium- eller nat-riumhydrogensulfat og deretter vann. Produktet kan deretter isoleres, eksempelvis ved ekstraksjon av den vandige blanding med et løsningsmiddel, slik som diethylether, vasking av etherfasen med kald, fortynnet, vandig saltsyre, tørking og fjerning av løsningsmidlet. Det urene produkt kan renses ved f.eks. kolonnekromatografi, slik som en silicagelkolonné som elueres med 55 % ethylacetat/hexan. 0<0 >BocNH \ Jv BocNH. \T/ \ OH ►N —OCH3 Ri <Rl> CH3 LAH/THF ▼ o ?)BocNH^JL~n ° BocNHI CHj /T) ^ ^BQCNH I [ NH II <*> ^A H 5 II 2)NaCNBH3 Ri Ri <5>4

Aldehydet av formel 3 omsettes deretter med en <0> harpiksbundet aminosyre av formel 6 I 3 6 R2

hvori R og R2 er som definert for formel 1 og hvori

betegner harpiksen. Det først dannede Schiff-baseaddukt <3> reduseres in situ under anvendelse av f.eks. natriumcyan-borhydrid, under dannelse av et harpiksbundet modifisert dipeptid av formel 7 R Hi 0 ' i } An Boc-NH A C1_,2 V V?J 7 R2

<3> hvori R, R| og R2 er som definert for formel 1, og hvori betegner harpiksen.

Aminosyrene Ag-A^ kan deretter sekvensvis adderes til

det harpiksbundne modifiserte dipeptid på vanlig måte.

N-methoxy-N-methylamidene av formel 2 fremstilles fra ' den tilsvarende N-Boc-beskyttede syre på vanlig måte. Carbonyldiimidazol tilsettes en tørket løsning av den N-Boc-beskyttede aminosyre i et etherisk løsningsmiddel, slik som diethylether. Reaksjonsblandingen tillates å omrøres i fra 10 min. til 1 time, typisk 15-20 min. N,0-dimethyl-hydroxyl-amin-HCl i DMF og et sterisk hindret amin, slik som diisopropylethylamin, tilsettes, og blandingen omrøres i fra

6 timer til 24 timer ved romtemperatur. Den ønskede forbin-

<5> deise isoleres deretter ved løsningsmiddelfordamping og rensing av det urene materiale ved f.eks. flashkromatografi på silicagel og eluering med methylenklorid.

Den anvendte harpiksbærer kan være hvilken som helst egnet harpiks som vanligvis anvendes innen faget for fast <0> fase-fremstilling av polypeptider, fortrinnsvis polystyren som er blitt tverrbundet med fra 0,5-3 % divinylbenzen, som enten er blitt klormethylert eller hydroxymethylert for å danne steder for esterdannelse med den opprinnelig innførte a-aminobeskyttede aminosyre.

<5> Et eksempel på en hydroxymethylharpiks er beskrevet av Bodanszky et al., Chem. Ind. ( London) 38, 1597-98 (1966). En klormethylert harpiks er kommersielt tilgjengelig fra Bio Rad Laboratories, Richmond, California, og fremstillingen av en slik harpiks er beskrevet av Stewart et al., "Solid Phase <0> Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco, 1969), kap. 1, s. 1-6. Den beskyttede aminosyre kan bindes til harpiksen ved prosedyren ifølge Gisin, Heiv. Chem. Acta, 56, 1476 (1973). Mange harpiksbundne, beskyttede aminosyrer er kommersielt tilgjengelig. For å fremstille et polypeptid <5> ifølge oppfinnelsen, hvori den carboxyterminale ende er en Thr-rest, kan eksempelvis en tert.-butyloxycarbonyl (Boc)-beskyttet Thr bundet til en benzylert, hydroxymethylert fenylacetamidomethyl (PAM)-harpiks anvendes, og denne er kommersielt tilgjengelig.

<0> Etter koblingen av den a-aminobeskyttede aminosyre til harpiksbæreren fjernes den beskyttende gruppe under anvendelse av en hvilken som helst egnet prosedyre, slik som ved anvendelse av trifluoreddiksyre i methylenklorid, trifluoreddiksyre alene eller HC1 i dioxan. Avbeskyttelsen utføres

<5> ved en temperatur på mellom 0°C og romtemperatur. Andre standard spaltingsreagenser og betingelser for fjerning av spesifikke a-aminobeskyttende grupper kan anvendes. Etter fjerning av den a-aminobeskyttende gruppe kobles de andre aminobeskyttede aminosyrer trinnvis i den ønskede rekke-følge. Alternativt kan multiple aminosyregrupper kobles ved oppløsningsmetoden før kobling med den harpiksopplagrede

aminosyresekvens.

' Den a-aminobeskyttende gruppe anvendt med hver aminosyre innført i polypeptidsekvensen, kan være en hvilken som helst slik beskyttende gruppe vel kjent innen faget. Blant klassene av a-aminobeskyttende grupper som tas i betrakt-ning, er (1) beskyttende grupper av acyltype, slik som formyl, trifluoracetyl, fthalyl, toluensulfonyl (tosyl),

benzensulfonyl, nitro-fenylsulfenyl, tritylsulfenyl, o-nitro-fenoxyacetyl og a-klorbutyryl; (2) beskyttende grupper av aromatisk urethantype, slik som benzyloxycarbonyl og substituert benzyloxycarbonyl, slik som p-klorbenzyloxy-carbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, p-brombenzyloxycarbonyl, p-methoxybenzyloxycarbonyl, 1-(p-bifenylyl)-1-methylethoxy-carbonyl, a,a-dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl og benzhydryloxycarbonyl; (3) alifatiske urethanbeskyttende grupper, slik som tert.-butyloxycarbonyl (Boe), diisopropylmethoxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, ethoxycarbonyl og allyloxycarbonyl; (4) beskyttende grupper av cykloalkyl-urethantype, slik som cyklopentyloxycarbonyl, adamantyloxy-carbonyl og cykloyhexyloxycarbonyl; (5) beskyttende grupper av thiourethantype, slik som fenylthiocarbonyl; (6) beskyttende grupper' av alkyltype, slik som trifenylmethyl (trityl) og benzyl; og (7) trialkylsilangrupper, slik som trimethyl-silan. Den foretrukne a-aminobeskyttende gruppe er tert.-butyloxycarbonyl.

Valget av et egnet koblingsreagens hører til fagmannens kunnskap. Et særlig egnet koblingsreagens hvori den aminosyre som skal adderes er Gin, Asn eller Arg, er N,N'-diisopropylcarbodiimid og 1-hydroxybenzotriazol. Anvendelse av disse reagenser forhindrer nitril- og lactamdannelse. Andre koblingsmidler er (1) carbodiimider (f.eks. N,N'-di-cyklohexylcarbodiimid og N-ethyl-N'-(ydimethylaminopropyl-carbodiimid); (2) cyanamider (f.eks. N,N-dibenzylcyanamid);

(3) keteniminer; (4) isoxazoliumsalter (f.eks. N-ethyl-5-fenyl-isoxazolium-3'-sulfonat; (5) monocykliske nitrogenholdige heterocykliske amider av aromatisk karakter inneholdende 1-4 nitrogenatomer i ringen, slik som imidazolider, pyrazolider og 1,2,4-triazolider. Spesifikke heterocykliske amider som er anvendbare, innbefatter N,N'-carbonyldiimid-5 azol og N,N-carbonyl-di-l,2,4-triazol; (6) alkoxylert acetylén (f.eks. ethoxyacetylen); (7) reagenser som danner et blandet anhydrid med carboxyIdelen av aminosyren (f.eks. ethylklorformiat og isobutylklorformiat) eller det symmetriske anhydrid av aminosyren som skal kobles (f.eks. Boc-3 Ala-O-Ala-Boc), og (8) nitrogenholdige heterocykliske forbindelser som har en hydroxygruppe på et ringnitrogen (f.eks. N-hydroxyfthalimid, N-hydroxysuccinimid og 1-hydroxybenzotriazol). Andre aktiverende reagenser og deres anvendelse ved peptidkobling er beskrevet av Kapoor, J_i_ » Pharm. Sei., 59, s. 1-27 (1970). Det foretrekkes å anvende det symmetriske anhydrid som et koblingsreagens for alle aminosyrer bortsett fra Arg, Asn og Gin.

Hver beskyttet aminosyre eller aminosyresekvens inn-føres i fast fase-reaktoren i ca. et firedobbelt overskudd, 3 og koblingen utføres i et medium av dimethylformamid:methylenklorid (1:1) eller i dimethylformamid alene, eller fortrinnsvis methylenklorid alene. I tilfeller hvori ufull-stendig kobling finner sted, gjentas koblingsprosedyren før fjerning av den a-aminobeskyttende gruppe, før kobling av > neste aminosyre i fast fase-reaktoren. Vellykketheten av koblingsreaksjonen ved hvert trinn av syntesen overvåkes ved ninhydrinreaksjonen som beskrevet av E. Kaiser et al., Analyt. Biochem. 34, 595 (1970).

Etter at den ønskede aminosyresekvens er blitt erholdt, fjernes peptidet fra harpiksen. Dette kan foretas ved hydrolyse, slik som ved behandling av det harpiksbundne polypeptid med en løsning av dimethylsulfid, p-cresol og thiocresol i vannfri hydrofluorsyre.

Som kjent i faget med fast fa"se-peptidsyntésen bærer

» mange av aminosyrene funksjonaliteter som krever beskyttelse under kjedefremstillingen. Anvendelse og valg av den egnede beskyttende gruppe hører til fagmannens kunnskap og vil avhenge av den aminosyre som skal beskyttes og nærvær av

1U

andre beskyttede aminosyrerester på peptidet. Valget av en slik sidekjedebeskyttende gruppe er kritisk ved det at den må være en som ikke fjernes under spaltingen av den beskyttende gruppe av a-aminodelen. Eksempelvis er egnede side-<5> kjedebeskyttende grupper for lysin benzyloxycarbonyl og substituert benzyloxycarbonyl, hvilken substituent er valgt fra halogen (f.eks. klor, brom, fluor) og nitro (f.eks. 2-klorbenzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, 3,4-diklor-benzyloxycarbonyl) tosyl, t-amyloxycarbonyl, t-butyloxy-carbonyl og diisopropylmethoxycarbonyl. Den alkoholiske hydroxylgruppe av threonin og serin kan beskyttes med en acetyl-, benzoyl-, tert.-butyl-, trityl-, benzyl-, 2,6-diklorbenzyl- eller benzyloxycarbonylgruppe. Den carboxyl-iske hydroxylgruppe av asparaginsyre og glutaminsyre kan beskyttes med en benzyl- eller cyklohexylgruppe. Den foretrukne beskyttende gruppe er benzyl.

Disse grupper kan fjernes ved prosedyrer vel kjent innen faget. Fjerning av den beskyttende gruppe utføres

typisk etter at peptidkjedesyntesen er fullført, men de beskyttende, grupper kan fjernes ved et hvilket som helst annet egnet tidspunkt.

Evnen til peptidderivatene av formel 1 til å virke som antagonister av neurokinin A, kan demonstreres ved peptid-enes evne til å konkurrere med jodert neurokinin A overfor pattedyr-neur&kinin A (NK2)-reseptorer under anvendelse av metoden ifølge Buck et al., Science 226: 987-989, 1984, ved forbindelsenes evne til å stimulere eller inhibere neurokinin A-fremkalt fosfatidylinositolskiftning under anvendelse av metoden ifølge Bristow et al., British J. Pharmacol. 90: 211-21, 1987, eller til å antagonisere neurokinin A-fremkalt glattmuskelkontraksjon under anvendelse av metoden ifølge Dion et al., Life Sciences 41: 2269-2278, 1987.

I"kraft av peptidderivatenes evne til å virke som antagonister av neurokinin A, er forbindelsene anvendbare som immunoundertrykkende midler og ved behandling av arthritis, astma, smerte, inflammasjon, tumorvekst, gastro-intestinal hypermotilitet, Huntingtons sykdom, psykose, neuritis, neuralgi, hodepine innbefattende migrene, nyper-11

tensjon, urininkontinens, urticaria, carcinoid syndrom-symptomer, influensa og alminnelig forkjølelse. Effektive doser administrert enten oralt eller parenteralt kan lett bestemmes av fagmannen og er doser som forårsaker antagon-<5> isme av neurokinin A (NK2)-reseptoren. Eksempelvis vil effektive doser av peptidene ifølge oppfinnelsen være fra 0,5 jig/kg til 500 mg/kg av pasientens kroppsvekt pr. dag. Forbindelsene administreres hensiktsmessig i enhetsdoser-ingsformer inneholdende fra 1-500 mg aktiv forbindelse og <0> kan administreres i fra én til fire eller flere enhetsdoser pr. dag. Uttrykket "pasient" er beregnet på å innbefatte pattedyr slik som primater, innbefattende mennesker, sauer, hester, kveg, griser, hunder, katter, rotter og mus.

Selv om enkelte av peptidderivatene kan overleve <5> passasje gjennom tarmen etter oral administrering, foretrekkes ikke-oral administrering, f.eks. subcutan, intravenøs, intramuskulær eller intraperitoneal; administrering ved depotinjeksjon; ved implantatpreparater; eller ved påføring til slimhinner slik som de i nese, svelg og bronkialrør, <0> f.eks. i en aerosol som kan inneholde et peptidderivat ifølge oppfinnelsen i spray eller tørr pulverform.

For parenteral administrering kan forbindelsene administreres som injiserbare doser av en løsning eller suspensjon av forbindelsen i et fysiologisk akseptabelt <5> fortynningsmiddel med en farmasøytisk bærer som kan være en steril væske, slik som vann og oljer, med eller uten tilsetning av et overflateaktivt middel og andre farmasøytisk akseptable adjuvanser. Eksempler på oljer som kan anvendes i disse preparater er petroleumsoljer og de av animalsk, <3> vegetabilsk eller syntetisk opprinnelse, f.eks. peanøttolje, soyabønneolje og mineralolje. Generelt er vann, saltvann, vandig dextrose og beslektede sukkerløsninger, ethanol og glycolef, slik som propylenglycol eller polyethylenglycol, foretrukne væskeformige bærere, i særdeleshet for injiser-<3> bare løsninger.

Forbindelsene kan administreres i form av en depotinjeksjon eller implantatpreparat som kan formuleres på en slik måte at det muliggjøres en forlenget frigivelse av

1Z

aktiv bestanddel. Den aktive bestanddel kan presses til pellets eller små sylindere-og implanteres subkutant eller intramuskulært som depotinjeksjoner eller implantater. Implantater kan anvende inerte materialer, slik som bioned-<5> brytbare polymerer eller syntetiske silikoner, f.eks. Silastic, silikongummi fremstilt av Dow-Corning Corporation.

Eksempler

Oppfinnelsen illustreres ytterligere ved de etter-følgende eksempler.

Eksempel 1

Antagonisme av neurokinin A-reseptoren med H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu* [CH2NH]-Leu-NH2 og H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu-<5> * [CH2N(CH3)]-Leu-NH2 som vist ved effekten på fosfatidyl-inositolskif tning

Urinblærer fra flere hamstere ble samlet, malt og homogenisert i 50 mM tris-HCl (pH 7,4) inneholdende 120 mM NaCl og 5 mM KC1 ved 4°C og ble sentrifugert ved 48.000 x g i 15 min. Pelleten ble resuspendert i 30 min. i 50 mM tris-HCl (pH 7,4) inneholdende 10 mM EDTA og 300 mM KC1 ved 4°C. Suspensjonen ble sentrifugert som ovenfor angitt, og pelleten ble vasket to ganger i rent 50 mM tris-HCl (pH 7,4) og sentrifugert på lignende måte. Vevet ble deretter resus-<3> pendert i inkiiberingsbuf f er, og en aliguot (ca. 3-5 mg vev) ble tilsatt hvert prøverør for å starte prøven. Prøverørene inneholdt inkuberingsbuffer bestående av 50 mM tris-HCl (pH 7,4), 0,02 % BSA, 40 ug/ml bacitracin, 4 ug/ml chymostatin, 4 ug/ml leupeptin, 2 mM MnCl2, 0,1 nM jodhistidyl^-neurokinin A (Amersham Corp.) og konsentrasjoner av tittelforbin delsene eller standarder varierende fra 0,03 nM til 100 uM. Prøven forløp til likevekt i 120 min. ved romtemperatur. Etter dette tidsrom ble innholdet i hvert rør hurtig

filtrert over Whatman GF/B-filtre, på forhånd oppbløtt i 0,5 % BSA, og filtrene ble hurtig vasket to ganger med is-kaldt, rent 50 mM tris-HCl (pH 7,4). Filterbundet radioakti-vitet ble kvantifisert i en gammateller. Spesifikk binding (maksimum) ble definert som forskjellen mellom binding i

13 nærvær og fravær av 1 uM umerket neurokinin A. Konkurrering av jodert neurokinin A-binding av testforbindelsene eller standardene ble uttrykt som en prosent av den maksimale konkurranse. IC^g-verdier (konsentrasjon som var nødvendig <3> for å inhibere 50 % av reseptorbinding) ble funnet å være 100-200 nM for tittelforbindelsene (figur 1).

Eksempel 2

Antagonisme av neurokinin A-reseptoren med H-Asp-Ser-Phe-<3> Val-Gly-Leu* [CH2NH]-Leu-NH2 og H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu- * [CH2N(CH3)]-Leu-NH2- som vist ved effekten på fosfatidylinositolskiftning

Urinblærer fra flere hamstere ble samlet og oppdelt til 350 um med en vevoppkutter. Det oppkuttede vev ble der-<3> etter inkubert i 37°C Krebs-Hepes-buffer med frisk bufferforandring hvert 15. min. i 30 min. Vevet ble deretter inkubert i denne buffer inneholdende 100-200 y.Ci 3H-inositol ved 37°C. Vevet ble deretter vasket og inkubert i ytterligere 30 min. i Krebs-Hepes (inneholdende 10 mM Li+) ved <3> 37°C med frisk bufferforandring hvert 15. min. Porsjoner av vevsmasse (ca. 10-20 mg pr. prøverør) ble deretter anbrakt i Li+-buffer, testforbindelsen ble deretter tilsatt i 25 ul, og forskjellige konsentrasjoner av neurokinin A ble tilsatt i 25 ul i et sluttvolum på 250 ul. Testforbindelsen ble <3> evaluert ved konsentrasjoner varierende fra 1 nM til 100 uM, og neurokinin A-konsentrasjonen varierte fra 1 nM til 10 uM. Testforbindelsen ble også vurdert alene ved de indikerte konsentrasjoner for å teste agonistaktivitet. Etter 30 min. ved romtemperatur ble fosfatidylinositolskiftning avsluttet <0> ved tilsetning av 940 ul kloroform:methanol (1:2), etterfulgt av 310 ul kloroform, etterfulgt av 310 ul vann. Hvert rør ble deretter ristet i 15 sek. og deretter sentrifugert ved 3000 opm i 10 min. for å separere fasene. 900 ul av toppfasen (vandig) ble deretter fylt på en 0,5 ml Biorad <5> AG-1X8 (formiat) ionebytterkolonne. 50 ul av bunnfasen (kloroform) ble trukket ut fra hvert rør og anbrakt i en telleampulle, ble tørket og tellet i en scintillasjonsvæske. Materialet på kolonnene ble vasket i rekkefølge med: 14

1) 10 ml vann

2) 5 ml 5 mM dinatri-umtetraborat/60 mM natriumformiat

3) 10 ml 1 M ammoniumformiat i 0,1 M maursyre.

Den sluttelige (tredje) vaskeløsning ble oppsamlet, og 1 ml ble blandet med 6 ml ACS-scintillasjonsvæske og tellet.

Forholdet mellom disse tellinger (totale inositolfosfater) og de tilsvarende tellinger i organisk fase ble deretter beregnet for hver prøve. Forholdene i nærvær av testforbindelse og/eller standarder ble deretter sammenlignet med forholdene for kontrollrør (dvs. ikke noe stimulerende agonist). Doseresponskurver ble konstruert, og testforbindel-senes evne til å stimulere eller inhibere neurokinin A-fremkalt fosfatidylinositolskiftning ble bestemt ved grafisk

analyse eller ved hjelp av et dataprogram og er illustrert i figurene 2 og 3.

Eksempel 3

Hamsterurinblære- kontraksjonspreparering

Halvremser av urinblærer fra gylne syriske hann-hamstere (75-100 g) ble suspendert i Tyrodes buffer ved 31°C

og med 1 g hvilestrekk som beskrevet av Dion et al. (Life Sciences 41: 2269-2278, 1987). Enkefalinaseinhibitoren thiorpan ble tilsatt bufferen til 10 jiM 15 min. før tilsetning av hver testforbindelse. Kumulative NKA-doseresponskurver ble ko'nsentrert først i fravær og deretter i nærvær av testforbindelsen. Testforbindelsene ble tilsatt kumula-tivt for å fastslå hvorvidt eller ikke de hadde noen kontraktiv effekt i seg selv. Enhver effekt av testforbindelsen som ble observert, fikk anta toppverdi før neste kumulative konsentrasjon ble tilsatt. Under disse betingelser var EC50 for NKA-kontraktilkrefter generelt 10 nM, i god overensstemmelse med litteraturverdier. Kontraktildata er uttrykt som gram strekk utviklet_oyer hvilestrekket. I tre separate hamsterblærevevsforsøk gav H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu *[CH2NH]Leu-NH2 eller H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leuf [CH2N-(CH3)]Leu-NH opptil konsentrasjoner på 10 uM ingen kontrak-sjon. Figurene 4 og 5 illustrerer kontraktilkraften som en funksjon av NKA-konsentrasjonen i fravær og nærvær av test-

15

forbindelsen.

Eksempel 4

I. Boc- Leu- aldehydsyntese ( Fehrentz, J.- A. og Castro, B., <5> Synthesis, 1983, 676- 678)

A. N-t-Boc-leucin-N-methoxy-N-methylamid:

15,0 mmol Boc-leucinhydrat ble oppløst i 30 ml tørr ether. Løsningen ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat, og det faste materiale ble fjernet ved filtrering. 16,5 mmol <10> carbonyldiimidazol ble tilsatt filtratet, og reaksjonsblandingen ble omrørt i 20 min. ved romtemperatur. Til den resul-terende løsning ble tilsatt en suspensjon av 22,5 mmol 0,N-dimethylhydroxylamin-hydroklorid i 15 ml dimethylformamid og 3,9 ml diisopropylethylamin. Reaksjonsblandingen ble omrørt <15> over natten ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble fortynnet i 75 ml ethylacetat og ble vasket med 3 x 40 ml kaldt 1 N HC1, 3 x 40 ml mettet NaHC03 og 1 x 40 ml mettet NaCl. Den organiske fase ble tørket med MgS04, ble filtrert, og ethylacetatet ble fjernet i vakuum. Analytiske data: Rf <20> (silicagel F254): 0,51 (ethylacetat/hexan 3/2); 'H-NMR (CDC13) TMS int): 6 = 0,95 ppm (2.d, 6 H, J = 6,6 Hz); 1,42 (S, 11 H); 1,64-1,80 (m, 1 H); 3,20 (s, 3 H); 3,80 (s, 3 H) ; 4,72 (m, 1 H); 5,10 (d, 1 H, J = 7,5 Hz). Massespektrum: M + H+: teoretisk: 275, observert: 275.

B. Boc-leucinaldehyd:

2,5 mmol Boc-leucin-N-methoxy-N-methylamid ble oppløst i 30 ml tørr ether. Til denne løsning ble tilsatt 3,2 mmol lithiumaluminiumhydrid (1 M-løsning i tetrahydrofuran). <50> Reaksjonsblandingen ble omrørt i 20 min. ved romtemperatur og ble deretter forsiktig tilsatt en løsning av 0,6 g NaHS04 i 10 ml vann. Reaksjonsblandingen ble tilsatt 75 ml ether og ble vas"ket med 3 x 30 ml kaldt 1_N.HC1, 3 x 30 ml mettet Na-HCO3 og 1 x 30 ml mettet NaCl. Den organiske fase ble tørket <S5> med MgS04, ble filtrert, og løsningsmidlet ble fjernet i vakuum. Analytiske data: Rf (silicagel 60, F254): 0,68 (ethylacetat/hexan 3/2). Massespektrum: M = H+: teoretisk:

216, observert: 216.

16

II. Syntese av Leu- harpiks

Standard fast-fasepeptidsynteseteknikker på en auto-matisert peptidsyntetisator ble anvendt. Etter dannelse av Boc-Leu-harpiks (0,5 mmol) ble den Boe-beskyttende gruppe fjernet og harpiksen vasket med dimethylformamid, diklormethan og ble tørket.

III. Dannelse av redusert amidbinding ( Leu [ CH2 NH])

2 mmol Boc-Leu-aldehyd ble oppløst i 1 % eddiksyre i 10 ml dimethylformamid, og denne løsning ble tilsatt reaksjonskaret inneholdende Leu-harpiksen (0,5 mmol, se II ovenfor). Til denne blanding ble tilsatt en løsning av 150 mg NaCNBH3 i 2 ml dimethylformamid. Blandingen ble ristet i 4 timer, reaksjonskaret ble drenert og harpiksen vasket med dimethylformamid og deretter diklormethan.

IV. Syntese av [ 4>[ CH2NHj9, Leu10] NKA4- 10

Syntesen av peptidet ble fullført på den automatiserte peptidsyntetisator ved sekvensvis tilsetning av de gjen-værende aminosyrer (Gly, Val, Phe, Ser (Bzl) og Asp (Chxl)). Peptidet ble spaltet fra harpiksen og globalt avbeskyttet under anvendelse av vannfritt HF/anisol (10:1). Peptidet ble renset under anvendelse av omvendt fase-HPLC-teknikker. Analytiske data: aminosyreanalyse: (HCl-oppslutning) Asp (1,03); Ser (0,93); Gly (1,01); Val (0,96); Phe (0,74). Peptidinnhold: 53,4 %. Massespektrometri med hurtig atombombardement: M + H+, teoretisk: 735, observert: 735.

V. Syntese av [ ^ i CH2NCH3 ] 9, Leu10 ] NKA4- 10

0,5 mmol N-methyl-Leu-harpiks (fremstilt fra Boc-N-methyl-leucin i henhold til II ovenfor) ble omsatt med 2,0 mmol Boc-Leu-aldehyd som beskrevet i III ovenfor. Peptidsyntesen ble deretter fullført som beskrevet i IV ovenfor. Analytiske data: aminosyreanalyse: (HCl-oppslutning) Asp (1,01); Ser (0,89); Gly (1,02); Val (1,00); Phe (0,98). Peptidinnhold: 53,5 %. Massespektrometri med hurtig atombombardement: M + H+, teoretisk: 749, observert: 749.

17

VI. Syntese av [ fr [ CH2NCH2R ] 9 , Leu10 ] NKA4. 10

Boc-Leu[* (CH2NH)]-Leu-harpiks ble fremstilt i henhold til trinn II og III ovenfor. Harpiksen ble deretter omsatt

med 2,5 mmol R-CHO i 10 ml 1 % HOAc i dimethylformamid i

<5> nærvær av NaCNBH3 som beskrevet i III ovenfor. Syntesen av peptidet ble deretter fullført som beskrevet i IV ovenfor.

Forklaring av figurer

Figur 1 illustrerer evnen av H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-

<0> Leu *[CH2NH]Leu-NH2 og H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu-f [CH2-NCH3]Leu-NH2 til å antagonisere bindingen ved NKA-reseptoren som vist ved testforbindelsens evne til å fortrenge I]_25-merket NKA fra hamsterurinblære (eksempel 1). Abscissen (x-aksen) indikerer logaritmisk konsentrasjonen i nanomol av <5> agonist eller antagonist av neurokinin A (NKA)-reseptoren. Ordinaten (y-aksen) indikerer den observerte spesifikke binding for hver testede agonist eller antagonist målt som en prosent av maksimal spesifikk binding.

,0 G NKA

• NKA(3-10)

a NKA (4-10)

a H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^[CH2NH)Leu-NH2

B H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^[CH2N(CH3)]Leu-NH2

Testede agonister var NKA og fragmenter av NKA bestående av den tredje til tiende (NKA(3-10)) aminosyre og <i0> den fjerde til tiende (NKA(4-10)) aminosyre. Verdiene er middelverdier ± standardavvik av 6-12 forsøk. IC5g-verdiene ble beregnet grafisk fra 50 %-inhiberingspunktet.

Figur 2 illustrerer evnen av H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu* [CH2NCH3]Leu-NH2 til å antagonisere NKA-reseptorbinding '<5> som vist ved effekten på fosfatidylinositol (PI)-skiftning i hamsterurinblære (eksempel 2). Abscissen (x-aksen) indikerer logaritmisk konsentrasjonen i nanomolar (nM) av agonist

eller antagonist av NKA-reseptoren. Ordinaten (y-aksen)

indikerer den observerte PI-skiftning som en prosent av kontrollen.

NKA

• NKA + 10 uM H-Asp-Ser-PheA/al-Gly-Leui(>[CH2NH)Leu-NH2 10 uM H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu *[CH2NH]Leu-NH2 fremkalte en signifikant høyrerettet skiftning av NKA-doseresponskurven på en konkurrerende måte. Verdiene er middelverdier standardavvik fra et forsøk in triplo.

Figur 3 illustrerer evnen av H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu* [CH2NCH3]Leu-NH2 (MDL 29916) til å antagonisere NKA-reseptorbinding som vist ved effekten på fosfatidylinositol (PI)-skiftning i hamsterurinblære (eksempel 2). Abscissen (x-aksen) indikerer logaritmisk konsentrasjonen i nanomolar (nM) av agonist eller antagonist av NKA-reseptoren. Ordinaten (y-aksen) indikerer den observerte PI-skiftning som en prosent av kontrollen.

NKA

• H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu4j[CH2N(CH3)]Leu-NH2

H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^[CH2NH)Leu-NH2

^ NKA + 1 uM H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu^[CH2N(CH3)]Leu-NH2

B NKA + 10 uM H-Asp-Ser-Phe-Va!-Gly-Leu\l)[CH2N(CH3)]Leu-NH2

■ nka + 100 uM H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu4j[CH2N(CH3)]Leu-NH2

1, 10 og 100 ]im H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu * [CH2N-(CH3)]Leu-NH2 fremkalte en signifikant høyrerettet skiftning av NKA-doseresponskurven på konkurrerende måte. Schild-kurven av disse data hadde en helling på -s-0,99, som indikerer konkurrerende antagonisme qg pA2 på 7,66. H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu *tCH2N(CH3)]Leu-NH2 opptil 100 uM hadde bare 5 % partiell agonistaktivitet, og H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu-* [CH2NH]Leu-NH2 hadde bare 12 % partiell agonistaktivitet. Verdiene er middelverdier ± standardavvik fra et forsøk in triplo. Figur 4 illustrerer den antagonistiske effekt av H-ksp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu * [CH2NH]Leu-NH2 på NKA-formidlet Kontraktil aktivitet i hamsterurinblærepreparater (eksempel 3). Abscissen (x-aksen) indikerer logaritmisk konsentrasjonen i nanomolar (nM) av NKA eller NKA med 10 uM H-Asp-3er-Phe-Val-Gly-Leu «f [CH2NH]Leu-NH2. Verdiene er middelverdier ± standardavvik fra et forsøk in triplo. Figur 5 illustrerer den antagonistiske effekt av H-^sp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu * [ CH2NH ] Leu-NH2 på NKA-formidlet kontraktil aktivitet i hamsterurinblærepreparater (eksempel 3). Abscissen (x-aksen) indikerer logaritmisk konsentrasjonen i nanomolar (nM) av NKA eller NKA med 10 uM H-Asp-3er-Phe-Val-Gly-Leu* [CH2N(CH3)]Leu-NH2. Verdiene er middelverdier ± standardavvik fra et forsøk in triplo.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk aktive peptidderivater av formel X-A1-A2-A3-A4-A5-A6-Y hvori X er hydrogen; A-l er en binding; A2 er en binding eller er Asp; A3 er Ser; A4 er Phe; A5 er Val; A6 er Gly; og Y er en gruppe av formel Ri R2 NH — B CONH2 H H

hvori B er en gruppe av formel 5 -CH2-N-R og hvori R er et hydrogenatom eller en alkylgruppe med fra 1-4 3 carbonatomer; Rx og R2 er Leu-sidekjede, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, karakterisert ved at det til en harpiks-bundet forbindelse av formel 5 R, R2 BocNH ^ B o hvori Rx, R2 og B er som ovenfor definert, og hvori Boe er en > butyloxycarbonylbeskyttende gruppe, og R med ring rundt betegner harpiksen, bindes de alfa-aminobeskyttede aminosyrer i rekkefølge fra A6 til Ax den terminale aminogruppe av den voksende peptidkjede som i mellomtiden er blitt utsatt for fjerning av dens aminobeskyttende gruppe.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av forbindelser hvori A2 er Asp, karakterisert ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes. -

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av forbindelser hvori A3 er Ser, karakterisert, ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes.

4. Fremgangsmåte xfølge krav 1 for fremstilling av forbindelser hvori A3 er Ser, karakterisert ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes.

5.. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av forbindelser hvori A4 er Phe, A5 er Val, A6 er Gly, karakterisert ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av forbindelser hvori B er -CH2N-, hvori R er H eller lavere alkyl, R karakterisert ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av forbindelser hvori X er hydrogen; A: er en binding; A2 er Asp; A3 er Ser; A4 er Phe; A5 er' Val; A6 er Gly; B er -CH2NH-; og Rx og R2 er leusin-sidekjede.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu i|r [CH2NH] Leu-NH2 eller H-Asp-Ser-Phe-Val-Gly-Leu i|r [CH2N( CH3) ] Leu-NH2, karakterisert ved at tilsvarende utgangs-materialer anvendes.