DE60315330T2

DE60315330T2 - Bicistronischer vektor der ein vegf und ein fgf einkodiert, verwendung davon

Info

Publication number: DE60315330T2
Application number: DE60315330T
Authority: DE
Inventors: Maciej Malecki; Przemyslaw Janik; Malgorzata Przybyszewska; Irena Mostowska-Was
Original assignee: Zaklady Farmaceutyczne Polpharma SA
Current assignee: Zaklady Farmaceutyczne Polpharma SA
Priority date: 2002-08-05
Filing date: 2003-08-05
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2023-08-06
Also published as: EP1556494A2; PL195457B1; WO2004012775A3; PL355354A1; DE60315330D1; AU2003272159A8; AU2003272159A1; WO2004012775A2; EP1556494B1; ATE368745T1; DK1556494T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Expressionsbox, einen bicistronischen Plasmidvektor, ein Arzneimittel und die Verwendung davon in der angiogenen Gentherapie.
Hintergrund der Erfindung
Die therapeutische Verwendung von angiogenen Wachstumsfaktoren wurde erstmals durch Folkman et al. (Folkman, N. Engl. J. Med. 285 (1971), 1182-1186) beschrieben. Spätere Studien haben den Nutzen von rekombinanten angiogenen Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise der Fibroblastenwachstumsfaktor-Familie (FGF) (Yanagisawa-Miwa et al., Science 257 (1992), 1401-1403; und Baffour et al., J. Vasc. Surg. 16 (1992), 181-191), des endothelialen Zellwachstumsfaktors (ECGF) (Pu et al., J. Surg. Res. 54 (1993), 575-583) sowie des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF), bei der Förderung der Entwicklung und Reifung von neuen Blutgefäßen in einem Tiermodell für Ischämie, insbesondere im Herzmuskel, bestätigt (Takeshita et al., Circulation 90 (1994), 228-234; und Takeshita et al., J. Clin. Invest. 93 (1994), 662-670). In den erwähnten Studien wurden rekombinante Proteine intramuskulär verabreicht. Die maßgebliche Begrenzung dieser Form der Therapie besteht in der Schwierigkeit, die geeignete Konzentration der Wachstumsfaktoren an der Behandlungsstelle aufrechtzuerhalten.
Ein alternatives Verfahren für eine rekombinante Proteinbehandlung ist die Anwendung der Gentherapie, wobei die Gentherapie die Einführung einer DNA, welche die betreffenden Faktoren codiert, an der betroffenen Stelle umfasst. Viele Versuche sind unternommen worden, um Sequenzen, die angiogene Wachstumsfaktoren codieren bei einer Therapie zu verwenden.
Die Patentanmeldung WO 97/14307 betrifft ein Verfahren zur Behandlung einer Ischämie in einem Säugetier, wobei das Verfahren die Injektion einer wirksamen Menge einer Nucleinsäure, welche zur Expression des angiogenen Proteins befähigt ist, in das Gewebe umfasst. Das Verfahren der angeführten Erfindung kann bei der Behandlung eines ischämischen Gewebes, das heißt, eines Gewebes, das als Folge einer Ischämie eine unzureichende Blutversorgung aufweist, angewendet werden. Beispiele dieser Gewebe sind Muskeln (einschließlich des Herzmuskels), das Gehirn, die Nieren und die Lunge. Es ist ein Plasmid beschrieben worden, das die cDNA des menschlichen VEGF-165 unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthält. Auf Seite 9, Absatz 3, ist festgestellt worden, dass "ein nützliches angiogenes Protein eine sekretorische Signalsequenz enthält, welche die Sekretion des Proteins ermöglicht. Ebenfalls vorteilhaft sind angiogene Proteine, die native Signalsequenzen aufweisen, d.h. VEGF. Angiogene Proteine ohne eine native Signalsequenz, d.h. bFGF, können durch bekannte Verfahren modifiziert werden, so dass sie eine solche Sequenz enthalten können (...)". Bei dem auf diese Weise angesprochenen Problem wird nicht die Möglichkeit berücksichtigt, dass die native sekretorische Sequenz von VEGF-165 durch eine andere bekannte Sequenz ersetzt werden kann, um auf diese Weise die Sekretion zu verbessern, wobei davon ausgegangen wird, dass die am meisten geeigneten Sequenzen diejenigen Sequenzen sind, welche natürlicherweise in der Sequenz eines bestimmten Proteins vorkommen.
Es wurden Tiertests (mit Kaninchen und Kälbern) beschrieben, die qualitative und quantitative Beweise für die Erreichung des gewünschten physiologischen Effekts anführen. Es gibt keine Daten, welche über eine Therapie beim Menschen berichten.
Die Patentanmeldung WO 97/12519 betrifft ein Verfahren zur Reendothelisierung von geschädigten Blutgefäßen durch eine Gentherapie, wobei ein Plasmid verwendet wurde, welches die cDNA des menschlichen VEGF-165 unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthält. Die Expressionsbox wurde von phVEGF-165 abgeleitet, welches in WO 97/14307 (vorstehend) beschrieben ist. Die Beschreibung enthält auch dieselben Aussagen im Hinblick auf die sekretorische Sequenz.
Es wurden Tierversuche (mit Kaninchen und Kälbern) beschrieben, die qualitative und quantitative Beweise für die Erreichung des gewünschten physiologischen Effekts liefern. Es gibt keine Daten, welche über eine Therapie beim Menschen berichten.
Die Patentanmeldung WO 00/24412 betrifft Produkte und Verfahren zur Vorbeugung einer Konstriktion oder Rekonstriktion von Gefäßen unter Verwendung der VEGF-C- und/oder VEGF-D-Gene und -Proteine.
Auf Seite 7 der Beschreibung (Zeilen 8-19) veranschaulichen die Autoren mögliche Veränderungen der verwendeten VEGF-C-Sequenz, wobei sie gleichzeitig die Wichtigkeit der sekretorischen Sequenz für die geeignete Sekretion der gewünschten Proteine unterstreichen. Sie empfehlen die Verwendung einer sekretorischen Sequenz von VEGF-C zusammen mit den beschriebenen Derivaten dieses Proteins. Es wird auch vorgeschlagen, die native sekretorische Sequenz durch eine andere sekretorische Sequenz zu ersetzen.
Die Patentanmeldung WO 01/34208 betrifft die Behandlung von Patienten mit Kreislaufstörungen einschließlich Herzerkrankungen und Störungen des peripheren Kreislaufsystems. Die Verfahren der Erfindung schließen die in-vivo-Verabreichung von Genen, welche angiogene Peptide oder Proteine codieren, in den Herzmuskel oder in ein peripheres Gewebe mit einer unzureichenden Durchblutung durch die Einführung eines Vektors, welcher ein Gen enthält, in die Blutgefäße, welche das Herz versorgen, oder in das ischämische Gewebe ein. Beispiel 7 offenbart die Ergebnisse eines Experiments, dessen Ziel es war, den Spiegel des angiogenen Proteins FGF-2 zu erhöhen, welches keine native Expressionssequenz aufweist. Der gewünschte Effekt (eine Verbesserung der Stimulation der Angiogenese) wurde durch eine Verknüpfung mit der sekretorischen Sequenz von FGF-4 erreicht. Es wurde empfohlen, dass die hinzugefügte Sequenz von einem Protein stammen sollte, das in den Herzmuskelzellen exprimiert wird. Es wurde ebenfalls vorgeschlagen, dass es auch vorteilhaft sein kann, die FGF-4- und VEGF-145-Gene nebeneinander zu verwenden, was gemäß den Autoren einen synergistischen Effekt zur Folge haben kann. Jedoch wurden keine Beweise angeführt, um diese Hypothese zu unterstützen. Es wurden lediglich Tierversuche beschrieben. Es gibt keine Daten, welche die Therapie bei Menschen beschreiben.
Ziel der Erfindung
Angesichts des gegenwärtigen Kenntnisstandes besteht noch immer ein Bedarf an therapeutischen Mitteln, welche bei der Gentherapie von Kreislaufstörungen bei Menschen verwendet werden könnten. Die Probleme, welche dabei gelöst werden müssen, schließen die Wirksamkeit der verabreichten Arzneimittel ein, zum Beispiel durch die Erhöhung des Sekretionsspiegels der exprimierten angiogenen Faktoren. Andere Probleme, welche gelöst werden müssen, sind die Beschaffenheit und Dauerhaftigkeit der induzierten Gefäße, welche eine vollständige Ausreifung zeigen sollten, um den therapeutischen Effekt zu verbessern. Es wäre außerdem vorteilhaft, die potentielle Toxizität von Injektionsgemischen, welche die therapeutische DNA enthalten, zu verringern, sowie deren Kosten zu senken. Die angeführten Probleme wurden in der vorliegenden Erfindung gelöst.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Expressionsbox, bestehend aus einem CMV-Promotor und der SV40-Polyadenylierungssignalsequenz, bereit, welche funktionell mit einem Genkomplex verbunden ist, welcher enthält:

(a) eine Sequenz, welche ein Hybridprotein codiert, wobei die Sequenz eine von einem Immunglobulin stammende sekretorische Sequenz enthält, welche mit der Sequenz des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors 165 (VEGF₁₆₅), worin die native sekretorische Sequenz entfernt wurde, verbunden ist,
(b) eine Sequenz, welche das Hybridprotein codiert, wobei die Sequenz eine von einem Immunglobulin stammende sekretorische Sequenz enthält, welche mit der Sequenz des Fibroblastenwachstumsfaktors b (bFGF) verbunden ist,
(c) eine Sequenz einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES), welche zwischen den erwähnten Sequenzen, welche Hybridproteine codieren, lokalisiert ist,

Gegebenenfalls ist die Sequenz, welche das in (a) erwähnte Hybridprotein codiert, die codierende Sequenz wie in 5 gezeigt oder die Sequenz wie in SEQ ID NO: 1 dargestellt; und ist die Sequenz, welche das in (b) erwähnte Hybridprotein codiert, die Sequenz wie in 2 gezeigt oder die Sequenz wie in SEQ ID NO: 3 dargestellt; und ist die in (c) erwähnte IRES-Sequenz die Sequenz wie in 4 gezeigt oder die Nucleotide 1348 bis 1953 von SEQ ID NO: 6. Vorzugsweise enthält die Expressionsbox im Einklang mit der Erfindung mindestens die Nucleotide 695 bis 2538 der in SEQ ID NO: 5 gezeigten Sequenz.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen bicistronischen Plasmidvektor, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine Expressionsbox im Einklang mit der Erfindung enthält. Gegebenenfalls ist hierin dieser Plasmidvektor pVIF.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung der Expressionsbox im Einklang mit der Erfindung zur Herstellung eines Expressionsvektors für die Gentherapie von Kreislaufstörungen bei Menschen. Insbesondere umfasst der Gegenstand der Erfindung die Verwendung des Plasmids pVIF bei der Herstellung eines Arzneimittels für Kreislaufstörungen bei Menschen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Arzneimittel für die Behandlung von Kreislaufstörungen bei Menschen, welches einen Wirkstoff und ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff einen bicistronischen Plasmidvektor enthält, der eine Expressionsbox im Einklang mit der Erfindung umfasst. Hierin ist der Wirkstoff das Plasmid pVIF.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft auch die Verwendung der Expressionsbox oder des Expressionsvektors im Einklang mit der Erfindung, wie oben definiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung von ischämischen Störungen oder Krankheiten des Menschen. Ein solches Arzneimittel kann entweder in das ischämische Gewebe oder in die Nähe des ischämischen Gewebes verabreicht werden. Hierin ist das ischämische Gewebe ein ischämisches Myokard.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft auch die Verwendung der Expressionsbox oder des Expressionsvektors im Einklang mit der Erfindung, wie oben definiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Revaskularisierung eines ischämischen Gewebes oder zur Verbesserung des vaskulären Flusses in einem ischämischen Gewebe. Ein solches Arzneimittel kann entweder in das ischämische Gewebe oder in die Nähe des ischämischen Gewebes verabreicht werden. Hierin ist das ischämische Gewebe ein ischämisches Myokard.
Die Arzneimittel im Einklang mit der Erfindung können intramuskulär oder intravenös verabreicht werden. Zum Beispiel ist im Falle einer Herzmuskelischämie eine intramuskuläre Verabreichung möglich, wie auch die Verabreichung in das richtige Areal der Herzkapillaren.
Vorteile der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ermöglicht unerwartet eine wesentliche Erhöhung der Wirksamkeit einer angiogenen Gentherapie. Unerwarteterweise wurde unter Verwendung von sekretorischen Kreuz-Spezies-Sequenzen eine Erhöhung des Sekretionsspiegels der angiogenen Faktoren erreicht. Überraschenderweise induziert der vorgestellte Vektor die Bildung von stärker ausgereiften und stabilisierten Blutgefäßen in vivo, verglichen mit einem Vektor, welcher einen einzigen Faktor codiert, d.h. nur VEGF, wobei der Vektor, wenn er in der Gentherapie (in Patientenversuchen) verwendet wird, eine wirksamere und schnellere Verbesserung des klinischen Zustandes des Patienten herbeiführt. Eine Injektion eines bicistronischen Vektors hat zur Folge, dass weniger fremde DNA sowie Endotoxine, welche die DNA-Präparation verunreinigen können, als im Falle der Verabreichung von zwei Ein-Gen-Vektoren eingebracht werden. Auf diese Weise wird auch die Gefahr einer Toxizität, welche durch das Arzneimittel hervorgerufen wird, oder anderer ernsthafter Komplikationen (Fieber, Schock und Bewußtlosigkeit) verringert. Nicht unbedeutend sind auch die niedrigeren Materialkosten, welche für die Herstellung eines bicistronischen Vektors erforderlich sind. Es ist offensichtlich, dass die Kosten für die Isolierung, die Reinigung und den Endotoxingehalt-Test geringer sind als die Kosten für zwei Ein-Gen-Vektoren. Daher kann das Verfahren für die Herstellung von Arzneimitteln mit dem gleichen Kostenaufwand effizienter sein. Dadurch wird die Verfügbarkeit des Arzneimittels verbessert.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiterhin.
Die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung angewendeten DNA-Rekombinationsverfahren sind Standardverfahren, welche den Fachleuten gut bekannt sind und welche zum Beispiel in "Molecular Cloning" (Sambrook et al., 1989) und in "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal, 1984) ausführlich beschrieben sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine schematische Darstellung der Expressionsbox des Vektors pVIF. Die folgenden Abkürzungen wurden verwendet: CMV – Cytomegalievirus-Promotor, ATG – Startcodon, TGA – Stoppcodon, IgK – Maus-Immunglobulin-Signalsequenz, VEGF – Gen, codierend den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, bFGF – Gen, codierend den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor, und IRES – interne ribosomale Eintrittsstelle.
2 zeigt die Sequenz der ATG-IgK-bFGF-Box, welche in einen pSECNEGF/IRES-Vektor cloniert wurde (NotI-ATG-IgK-bFGF-XhoI). Die verwendeten Primer sind unterstrichen, und die verwendeten Restriktionsstellen sind schraffiert.
3 zeigt die bFGF-Sequenz, welche in einen pSEC-Vektor cloniert wurde (EcoRI-bFGF-XhoI). Die verwendeten Primer sind unterstrichen.
4 zeigt die IRES-Sequenz, welche in einen pSECNEGF-Vektor cloniert wurde (EcoRI-IRES-NotI). Die Primer RBS-1 und RBS-2 sind unterstrichen, und die verwendeten Restriktionsstellen (EcoRI und NotI) sind schraffiert.
5 zeigt die Sequenz der ATG-IgK-VEGF-Box, welche in einen pSEC/VEGF-Vektor cloniert wurde. Das Startcodon und das Stoppcodon sind fett gedruckt, und die Restriktionsstellen codierenden Fragmente sind schraffiert.
Für ein besseres Verständnis der Wichtigkeit der Erfindung wird die Erfindung nachstehend durch Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1: Plasmid pVIF
Das pVIF-Konstrukt ist ein Plasmidexpressionsvektor, welcher Faktoren vom angiogenen Typ codiert. Die darin clonierte Box enthält zwei Cistrons. Sie enthält ein Gen, welches VEGF-165 codiert (PubMed X62568), die IRES-Sequenz (basierend auf einer Matrize, welche in einen pIRES-EGFP-Vektor cloniert wurde; Clontech, Kat. #6064-1), sowie eine Sequenz, welche bFGF codiert (PubMed E02544). Die IRES-Sequenz entstammt dem Enzephalomyokarditisvirus (ECMV), wobei die Sequenz die Translation der beiden clonierten Gene in eine bicistronische mRNA sicherstellt. Innerhalb der Box geht sowohl der VEGF-Sequenz als auch der FGF-Sequenz eine Signalsequenz voraus, welche die Sekretion der synthetisierten VEGF- und FGF-Proteine ermöglicht. 1 zeigt eine schematische Darstellung der Expressionsbox in dem pVIF-Vektor.
Beispiel 2: Herstellung des pVIF-Vektors
Die Clonierung erfolgte über klebrige Enden in das ATG-Triplett im Einklang mit dem Leseraster, wobei Reagenzien von Amersham verwendet wurden, und der Vektor wurde in E. coli-Bakterien des Stammes DHα5 vermehrt. Die Isolierung wurde unter Verwendung des 'EndoFree Plasmid Mega Kit's' von Qiagen durchgeführt.
Um den pVIF-Vektor zu erhalten, wurden zwei zusätzliche Vektoren, ein pSEC/VEGF-Vektor sowie ein leerer pSEC-Vektor, verwendet. Der pSEC/VEGF-Vektor wurde gemäß der Beschreibung, welche in der Polnischen Patentanmeldung P.339326 enthalten ist, bereits cloniert, und ist ein Plasmidexpressionsvektor, der die VEGF-165-Isoform codiert. Er enthält eine Signalsequenz, welche die Sekretion des VEGF-Proteins außerhalb der Zelle ermöglicht. Das Verfahren umfasste drei Schritte:
(a) die Subclonierung der IRES-Sequenz aus dem pMIG/IRES-Vektor in einen pSEC/VEGF-Vektor, (b) die Clonierung der bFGF-Sequenz in einen pSEC-Vektor, und (c) die Subclonierung der ATG-IgK-bFGF-Box aus dem pSEC/bFGF-Vektor in den pSEC/VEGF/IRES-Vektor.
A. Subclonierung der IRES-Sequenz aus dem pMIG/IRES-Vektor in einen pSEC/VEGF-Vektor
Die IRES-Sequenz wurde unter Verwendung einer Matrizensequenz, die in einen pMIG-Vektor cloniert wurde, mittels PCR amplifiziert. Die PCR-Primer wurden derart konstruiert, dass sie die Restriktionsstellen für EcoRI und NotI enthalten:
RBS-1: 5'-AAGAATTCCAATTCCGCCCCTCTCCCT-3'
RBS-2: 5'-AAGCGGCCGCTTGTGGCAAGCTTATCATC-3'
Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des 'Clean-Up Kit's' (DNA-Gdańsk) gereinigt, mit EcoRI und NotI für eine Stunde bei einer Temperatur von 37°C gespalten und unter Verwendung des 'QIAquick Gel Extraction Kit's' von Qiagen aus einem Agarosegel isoliert. Der pSEC/VEGF-Vektor wurde ebenfalls mit EcoRI und NotI gespalten, elektrophoretisch aufgetrennt und aus dem Gel isoliert. Die Ligation wurde unter Verwendung einer T4-Ligase (Amersham) über einen Zeitraum von 16 h bei 16°C durchgeführt. Die Ligationsprodukte wurden in E. coli-Bakterien eingeschleust, und anschließend wurde eine Clonselektion auf Agarschalen mit Ampicillin durchgeführt. Die gewachsenen Clone wurden auf ein LB-Flüssigmedium mit Ampicillin übertragen. Sie wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Plasmide in den Clonen wurden isoliert und anschließend einer Restriktionsanalyse unterzogen. Auf diese Weise wurde der pSECNEGF/IRES-Vektor erhalten.
B. Clonierung der bFGF-Sequenz in den pSEC-Vektor
Die bFGF codierende Sequenz wurde unter Verwendung einer cDNA-Matrize aus Zellen der HUVEC-Linie (humane urolimbicale Venenendothelzellen) amplifiziert. Die PCR-Primer wurden derart konstruiert, dass sie die Restriktionsstellen für EcoRI und XhoI enthalten:
HbF-1: 5'-ATGAATTCGCCAGCATTGCCCGAGGAT-3'
HbF-2: 5'-TTCTCGAGATTCAGCTCTTAGCAGACAT-3'
Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des 'Clean-Up Kit's' (DNA-Gdańsk) gereinigt, mit EcoRI und XhoI für eine Stunde bei einer Temperatur von 37°C gespalten und unter Verwendung des 'QIAquick Gel Extraction Kit's' von Qiagen aus einem Agarosegel isoliert. Der pSEC-Vektor wurde ebenfalls mit EcoRI und XhoI gespalten, elektrophoretisch aufgetrennt und aus dem Gel isoliert. Die Ligation wurde unter Verwendung einer T4-Ligase (Amersham) über einen Zeitraum von 16 h bei 16°C durchgeführt. Die Ligationsprodukte wurden in E. coli-Bakterien eingeschleust, und anschließend wurde eine Clonselektion auf Agarschalen mit Ampicillin durchgeführt. Die gewachsenen Clone wurden auf ein LB-Flüssigmedium mit Ampicillin übertragen. Sie wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Plasmide in den Clonen wurden isoliert und anschließend einer Restriktionsanalyse unterzogen. Auf diese Weise wurde der pSEC/FGF-Vektor erhalten.
C. Subclonierung der ATG-Igk-bFGF-Box aus dem pSEC/bFGF-Vektor in den pSEC/VEGF/IRES-Vektor
Die ATG-Igk-FGF-Box wurde aus dem pSEC/FGF-Vektor in den pSEC/VEGF/IRES-Vektor cloniert. Dieses Fragment wurde mittels PCR amplifiziert, wobei ein neuer Primer konstruiert wurde, der eine NotI-Restriktionsstelle einführt, und wobei auch der HbF-2-Primer verwendet wurde. Die Sequenz des Sense-Primers war wie folgt:
Not_IgK: 5'-AAGCGGCCGCACCATGGAGACAGACACA-3'
Von da an wurde das Verfahren wie vorhergehend durchgeführt: Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des 'Clean-Up Kit's' (DNA-Gdańsk) gereinigt, mit NotI und XhoI für eine Stunde bei einer Temperatur von 37°C gespalten und unter Verwendung des 'QIAquick Gel Extraction Kit's' von Qiagen aus einem Agarosegel isoliert. Der pSEC/VEGF/IRES-Vektor wurde ebenfalls mit NotI und XhoI gespalten, elektrophoretisch aufgetrennt und aus dem Gel isoliert. Die Ligation wurde unter Verwendung einer T4-Ligase (Amersham) über einen Zeitraum von 16 h bei 16°C durchgeführt. Die Ligationsprodukte wurden in E. coli-Bakterien eingeschleust, und anschließend wurde eine Clonselektion auf Agarschalen mit Ampicillin durchgeführt. Die gewachsenen Clone wurden auf ein LB-Flüssigmedium mit Ampicillin übertragen. Sie wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Plasmide in den Clonen wurden isoliert und anschließend einer Restriktionsanalyse unterzogen. Auf diese Weise wurde der pSEC/VEGF/IRES/FGF-Vektor (pVIF) erhalten.
Das erhaltene Konstrukt wurde einer eingehenden Restriktionsanalyse unterzogen. Es wurden verschiedene Kombinationen von Restriktasen verwendet, wie auch mehrere PCRs unter Verwendung von verschiedenen Primern. Das Konstrukt wurde auch sequenziert. Alle Analysen bestätigten die korrekte Clonierung. Es wurde ein Vektor mit einer bicistronischen VEGF/IRES/FGF-Expressionsbox erhalten.
Beispiel 3: In-vitro-Tests
Der konstruierte pVIF-Vektor wurde in Tumorzellen (LI-Linie – murines Sarkom) und Nicht-Tumorzellen (HCV-29-Linie – humanes Harnblasenepithel) inseriert, welche jeweils eine geringe Expression der VEGF- und FGF-Wachstumsfaktoren zeigen. Mit Hilfe des Western-Blot-Verfahrens unter Verwendung von spezifischen monoclonalen Anti-VEGF- und Anti-FGF-Antikörpern untersuchten die Erfinder das Medium, welche die transfizierten Zellen umgibt, auf die Anwesenheit dieser Proteine. Die Analyse bestätigte die Expression der durch den pVIF-Vektor übertragenen Gene in den transfizierten Zellen, und dass die synthetisierten VEGF- und FGF-Proteine außerhalb der Zelle sezerniert werden.
Beispiel 4: In-vivo-Studien

Die Studien wurden mit Mäusen vom BALG/c-Stamm (Männchen) durchgeführt. Es wurde ein Haut-Angiogenese-Test durchgeführt. Der Vektor wurde den Mäusen in einer Dosis von 10 μg pro Stelle subkutan verabreicht. Nach 3 bzw. 13 Tagen im Anschluss an die Injektion wurden die neuen Blutgefäße gezählt. Daraus wurde gefolgert, dass der pVIF-Vektor offensichtlich die Bildung von Blutgefäßen induziert. Die Ergebnisse wurden in Tabelle 1 zusammengestellt. Tabelle 1: Vergleich der Effekte

In-vivo-Angiogenese (Mäuse) – Anzahl der neuen Blutgefäße nach einer subkutanen Einführung der Vektoren
	pVIF	pVEGF	pFGF
3 Tage	21,33 ± 3,77 n = 15	14,50 ± 2,26 n = 14	12,13 ± 1,96 n = 15
13 Tage	26,10 ± 8,60 n = 17	18,20 ± 4,5 n = 15	–

Beispiel 5: Histochemische Analyse
Hierbei wurden die Mäuse verwendet, welche in dem Haut-Angiogenese-Test verwendet wurden. Es wurden Proben von subkutanem Gewebe mit den neuen Blutgefäßen entnommen. Der Zweck davon war, die histologischen Eigenschaften der Blutgefäße, die sich nach der subkutanen Injektion der pVIF- und pSEC/VEGF-Vektoren bildeten, zu beurteilen und zu vergleichen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass der pVIF-Vektor die Bildung von stärker ausgereiften und größeren Blutgefäßen als der pSEC/VEGF-Vektor induzierte.
Beispiel 6: Verwendung des pVIF-Vektors, um eine Angiogenese im Herzmuskelgewebe eines Patienten mit einer koronaren Herzerkrankung zu induzieren
Das Plasmid wurde bei einem 52 Jahre alten Patienten verwendet. Der Patient litt an einer instabilen Form einer Koronarerkrankung der Klasse III/IV gemäß der CCS ohne einen Herzinfarkt, mit einer arteriellen Hypertonie, einer Hypercholesterinämie und einer Atherosklerose der unteren Extremitäten.
Während des Belastungstests vor der Operation erreichte er ein METS-Ergebnis von 5,5. Der Test wurde aufgrund von starken Veränderungen in der ST-Region in den ableitenden Gefäßen der Vorderseite und der unteren Wänden abgebrochen. Die Testergebnisse wurden für sich allein als positiv beschrieben.
Bei der echokardiographischen Analyse betrug die Abflussfraktion 65% (%EF = 65). Eine Koronargraphie zeigte eine multivaskuläre Koronarerkrankung mit einer blockierten Kranzarterie (C_x) und einer blockierten rechten Koronararterie (RCA) auf, folglich war es nur möglich, die absteigende linke vordere Arterie (LAD) zu überbrücken.
Während der Operation wurde die linke innere Myokardarterie in die absteigende linke vordere Arterie (LIMA in LAD) am schlagenden Herzen transplantiert, ohne den Blutfluss extern umzuleiten. Im Anschluss an die Überbrückung des Koronargefäßes wurde eine Lösung des pVIF-Plasmids in die Unterseite und die Seitenwände des Herzens injiziert. Das Herzmuskelgewebe wurde durch eine Injektion mit einer 0,33 mm-Nadel direkt transfiziert.
Es wurden keine Komplikationen beobachtet, welche aus der Gentransfektion resultieren, weder zum Zeitpunkt der Operation, noch während des postoperativen Zeitraums. Der Patient befand sich während des Zeitraums der Operation in einem stabilen Zustand.
Inzwischen sind 3 Monate seit der Operation vergangen, und der Patient zeigt keine atherogene-kardiale Erkrankungen, und hat eine funktionelle Atmung und Durchblutung. Bei einer SPECT-Analyse zwei Wochen nach der Operation wurde eine Durchblutung beobachtet, welche mit der Einführung der Brücke in der LAD in Beziehung stand, und später wurde bei einer Untersuchung, die einen Monat nach der Operation durchgeführt wurde, eine Durchblutung der Segmente beobachtet, in welche das pVIF-Plasmid eingeführt wurde. Der Zustand des Patienten verbessert sich kontinuierlich. Bei weiteren Untersuchungen wurde eine Revaskularisierung des ischämischen Herzgewebes beobachtet, was sich in der Verbesserung des vaskulären Flusses in dem ischämischen Myokard zeigte.
Zusammenfassend kann daraus gefolgert werden, dass die Verwendung des pVIF-Plasmids das Risiko der Operation nicht erhöhte. Der Patient überstand die Operation sehr gut. Es wurden keine post-operativen Komplikationen beobachtet. Der Patient klagt nicht mehr über Koronarprobleme. Seine Lebensqualität hat sich zusammen mit seiner Stresstoleranz verbessert, und sein Bedarf an Nitraten hat sich verringert.
Sequenzprotokoll

Claims

Expressionsbox, welche aus einem CMV-Promotor sowie einem SV40-Polyadenylierungssignal zusammengesetzt ist, und welche funktionell mit einem Genkomplex verbunden ist, welcher enthält: (a) eine Sequenz, welche ein Hybridprotein codiert, wobei die Sequenz eine von einem Immunglobulin stammende sekretorische Sequenz enthält, welche mit der Sequenz des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors 165 (VEGF₁₆₅) verbunden ist, bei der die native sekretorische Sequenz entfernt ist, (b) eine Sequenz, welche das Hybridprotein codiert, wobei die Sequenz eine von einem Immunglobulin stammende sekretorische Sequenz enthält, welche mit der Sequenz des Fibroblastenwachstumsfaktors b (bFGF) verbunden ist, (c) eine Sequenz eines internen ribosomalen Eintrittsegments (IRES), welche zwischen den erwähnten Sequenzen, welche Hybridproteine codieren, lokalisiert ist, wobei die von einem Immunglobulin stammende sekretorische Sequenz die Aminosäurereste 1 bis 40 von SEQ ID NO: 1 umfasst.
Expressionsbox nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, welche das in (a) erwähnte Hybridprotein codiert, die codierende Sequenz wie in 5 oder die Sequenz wie in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist.
Expressionsbox nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz, welche das in (b) erwähnte Hybridprotein codiert, die codierende Sequenz wie in 2 oder die Sequenz wie in SEQ ID NO: 3 gezeigt ist.
Expressionsbox nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die in (c) erwähnte IRES-Sequenz die Sequenz wie in 4 gezeigt ist oder die Nucleotide 1348 bis 1953 von SEQ ID NO: 6.
Expressionsbox nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens die Nucleotide von 695 bis 2538 der Sequenz wie in SEQ ID NO: 5 gezeigt enthält.
Bicistronischer Plasmidvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Expressionsbox nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.
Verwendung der Expressionsbox nach einem der Ansprüche 1 bis 5 für die Herstellung eines Expressionsvektors zur Verwendung in der Gentherapie von ischämischen Zuständen in Menschen.
Arzneimittel zur Behandlung oder Vorbeugung von ischämischen Störungen oder Krankheiten des Menschen, welches einen wirksamen Bestandteil und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein Verdünnungsmittel umfasst, wobei das Arzneimittel dadurch gekennzeichnet ist, dass es als wirksamen Bestandteil einen bicistronischen Plasmidvektor enthält, welcher die Expressionsbox nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthält.
Verwendung der Expressionsbox nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder des Vektors nach Anspruch 6 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung von ischämischen Störungen oder Krankheiten des Menschen.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Arzneimittel hergestellt wird für die Verabreichung entweder in das ischämische Gewebe oder in die Nähe des ischämischen Gewebes.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das ischämische Gewebe ein ischämisches Myocard ist.
Verwendung der Expressionsbox nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder des Vektors nach Anspruch 6 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Revaskularisation von ischämischem Gewebe oder zur Verbesserung des vaskulären Flusses in ischämischem Gewebe.
Verwendung nach Anspruch 12, für die Herstellung eines Arzneimittels für die Verarbreichung entweder in das ischämische Gewebe oder in die Nähe des ischämischen Gewebes.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das ischämische Gewebe ein ischämisches Myocard ist.