DE60307262T2

DE60307262T2 - Verfahren zur aufreinigung von albumin

Info

Publication number: DE60307262T2
Application number: DE60307262T
Authority: DE
Inventors: Makonnen Amersham Biosciences AB BELEW; Yan North China Pharmaceutical Group Mei LI; Wei North China Pharmaceutical Group ZHANG
Original assignee: North China Pharmaceutical Group; NORTH CHINA PHARMACEUTICAL GROUP CORP; GE Healthcare Bio Sciences AB
Current assignee: North China Pharmaceutical Group; NORTH CHINA PHARMACEUTICAL GROUP CORP; Cytiva Sweden AB
Priority date: 2002-05-15
Filing date: 2003-05-09
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2023-05-10
Also published as: US7351801B2; EP1504031A1; BR0309992A; JP2006512283A; EP1504031B1; SE0201518D0; US20050214902A1; CN100463921C; AU2003228193B2; AU2003228193A1; EP1504032A1; JP4559216B2; WO2003097692A1; ATE335006T1; CA2483616A1; CA2483612A1; BRPI0309992B1; US20050215765A1; US7423124B2; ES2268362T3

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Proteinreinigung, und insbesondere auf die Reinigung von Humanserumalbumin. Das Verfahren nutzt eine Reihe von Chromatographieschritten, was zu einer effizienten Reinigung führt, die zur Verwendung in Betriebsarten im großen Maßstab geeignet ist.
Hintergrund
Humanserumalbumin (HSA) ist das Protein, das im Blutplasma am reichlichsten vorhanden ist, wobei seine Rolle ist, zur Beibehaltung des osmotischen Drucks und zum Binden von Nährstoffen und Metaboliten beizutragen, um dadurch deren Transport zu ermöglichen. Es gibt ein großes pharmazeutisches und wissenschaftliches Interesse in Bezug auf HSA, z. B. als ein Arzneimittel zum Behandeln der Hypoalbuminämie, die durch einen Verlust von Albumin oder eine Verringerung in der Albuminsynthese verursacht wird, im hemorrhagischen Schock etc. In den frühesten verfügbaren Verfahren wurde das HSA aus Blut gereinigt. Jedoch führten derartige Verfahren Probleme herbei, z. B. eine sporadische Lieferung von Blut, ökonomische Nachteile und eine Kontamination mit unerwünschten Substanzen, wie ein Hepatitisvirus oder nicht zuletzt der AIDS-Virus. Um diese Probleme zu vermeiden, wurden kürzlich alternative Verfahren basierend auf rekombinanten DNA-Techniken entwickelt, um rekombinantes HSA (rHSA) zu erzeugen. Sogar obwohl eine Anzahl von rekombinanten Verfahren vorgeschlagen wurde, wurde gezeigt, dass die Reinigung des rHSA aus der Fermentationsnährlösung ein kritischer Schritt ist und es eine fortdauernde Notwendigkeit für Verbesserungen zu diesem Zweck gibt.
EP 0 612 761 offenbart ein Verfahren zum Herstellen von rekombinantem Humanserumalbumin hoher Reinheit, das keine freien nicht-antigenen Kontaminanten enthält. Das Verfahren nutzt hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC) unter spezifizierten Bedingungen, kombiniert mit anderen Schritten, wie Ionenaustauschchromatographie, Behandlung mit Borsäure oder einem Salz davon, gefolgt von Ultrafiltration und Wärmebehandlung. Jedoch wird eine Reihe von so vielen Schritten noch zu komplex und demgemäss zu kostenintensiv für eine zufriedenstellende Verwendung in Betriebsarten im großen Maßstab in der Industrie sein.
EP 0 570 916 offenbart auch ein Verfahren zum Herstellen rekombinanten Humanserumalbumins durch Genmanipulationstechniken, wobei die Reinigung durch eine Kombination von Schritten erfolgt, in denen ein Kulturüberstand Ultrafiltration, Wärmebehandlung, Säurebehandlung und einer anderen Ultrafiltration unterzogen wird, gefolgt von nachfolgenden Behandlungen mit Kationenaustauscher, einem hydrophoben Chromatographieträger und einem Anionenaustauscher und durch Aussalzen. Jedoch ist, ähnlich dem oben erwähnten Patent, dieses Reinigungsschema zu komplex, zeitaufwendig und demgemäss zu kostenintensiv, um eine effiziente Prozedur zur Verwendung in Betriebsarten im großen Maßstab bereitzustellen.
EP 0 699 687 offenbart ein Verfahren zur Reinigung von rHSA, wobei das Kulturmedium wärmebehandelt wird, um Proteasen zu inaktivieren, und dann in Kontakt gebracht wird mit einem Fließbett von Kationenaustauschteilchen. Der Eluent kann nachfolgend Ultrafiltration, HIC und Anionenaustauschchromatographie unterzogen werden. Jedoch wird die Verwendung eines Fließbettes eine Ausrüstung erfordern, die verschieden ist von dem herkömmlichen Packed Bed-Chromatographieschritt. Demgemäss gibt es noch eine Notwendigkeit für effizientere und ökonomisch attraktive Prozeduren zur Reinigung von rHSA aus einer Kulturnährlösung.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Reinigung einer rekombinanten HSA bereitzustellen, das einfach auf Betriebsarten in hohem Maßstab angepasst ist. Dies wird erreicht durch ein Verfahren, welches das Unterziehen eines Zellkultur-Überstandes (CCS), der rHSA umfasst, den folgenden Schritten umfasst:

(a) Kationenaustauschchromatographie auf einer bimodalen stark Salztoleranten Matrix, wobei jeder Ligand zwei Gruppen umfasst, die zum Wechselwirken mit der zu isolierenden Substanz fähig sind;
(b) hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC); und
(c) Anionenaustauschchromatographie.

Das Verfahren gemäß der Erfindung umfasst weniger Prozessschritte als die oben diskutierten Verfahren. Zusätzlich ermöglicht die in Schritt (a) verwendete bimodale stark Salz-tolerante Kationenaustauschmatrix die Verwendung eines Zellkultur-Überstandes ohne irgendeine weitere Verdünnung, die ein vorteilhaftes Merkmal ist, da sie stark das Gesamtvolumen und daher die Kosten im Vergleich zu den Verfahren des Standes der Technik verringert.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, die Adsorptionskapazität der chromatographischen Schritte, die beim Reinigen von rHSA verwendet werden, zu verbessern. Dies kann erreicht werden durch das oben beschriebene Verfahren, wobei ein Kationenaustauscher, umfassend Liganden, die als Hoch-Salz-Liganden (HSL) bekannt sind, im Schritt (a) verwendet wird. Die Liganden sind bimodal in dem Sinne, dass sie mindestens zwei Stellen umfassen, die mit der zu isolierenden Substanz Wechselwirken, eine, die eine geladene Wechselwirkung bereitstellt, und eine, die eine Wechselwirkung bereitstellt, die auf Wasserstoffbrückenbindungen und/oder einer hydrophoben Wechselwirkung basieren.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, den Farbgehalt weiter zu verringern und spezieller weiter die Reinheit des Endproduktes zu vergrößern. Dies kann erreicht werden durch die Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens, wobei ein schwacher Anionenaustauscher verwendet wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A–D veranschaulicht mögliche Matrixmaterialien, die zur Verwendung in den verschiedenen Schritten der Kationenaustausch-, hydrophoben Wechselwirkungs- und Anionenaustauschchromatographie gemäß der Erfindung geeignet sind.
2 zeigt die Ergebnisse der Kationenaustauschchromatographie eines unverdünnten Zellkultur-Überstandes (CCS) gemäß Schritt (a) des Verfahrens gemäß der Erfindung. Die Fraktion 2B enthält das rHSA.
3 zeigt die Ergebnisse der HIC der Fraktion 2B der 2. Das rHSA wird in Fraktion 3A eluiert.
4 zeigt die Ergebnisse der Anionenaustauschchromatographie der Fraktion 3A aus 3. Das gereinigte rHSA wird in Fraktion 4B eluiert.
5 zeigt Elektrophoreseanalysen der Hauptfraktionen, die unter Verwenden des 3-Schritt-Reinigungs-Protokolls gemäß der Erfindung erhalten wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Reinigen rekombinanten Humanserumalbumins (rHSA) aus einer Lösung, wobei das Verfahren umfasst das Unterziehen eines Zellkultur-Überstandes (CCS), der rHSA umfasst, den folgenden chromatographischen Schritten:

(a) Kationenaustausch einer bimodalen stark Salz-toleranten Matrix;
(b) hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC); und
(c) Anionenaustausch.

In einer spezifischen Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens beträgt die Leitfähigkeit des CCS über ungefähr 10 mS/cm, wie über ungefähr 15 und bevorzugt über ungefähr 20, z. B. ungefähr 25–50, oder spezieller 25–30 mS/cm, wenn er auf Schritt (a) angewandt wird, was möglich ist aufgrund der Art des verwendeten Kationenaustauschers, der Liganden des als Hoch-Salz-Liganden (HSL) bekannten Typs umfasst. Demgemäss ist ein wichtiger Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass sie die Notwendigkeit vermeidet, den CCS zu verdünnen, und dadurch die Verwendung von sehr verringerten Volumina der Probe während des Kationenaustauschschrittes im Vergleich zu den zuvor beschriebenen Verfahren zur Reinigung von rHSA ermöglicht.
Der CCS kann eine beliebige Fermentationsnährlösung sein, aus der Zellen bevorzugt z.B. durch Zentrifugation entfernt worden sind. Demgemäss kann der Ursprung des rHSA, das gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert ist, ein beliebiger geeigneter Wirt sein, wie mikrobielle Zellen, wie Escherishia coli, Bacillus subtilis etc., Hefezellen, wie Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris etc., oder Tierzelllinien. In einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Wirtszelle Pichia pastoris. Verfahren des Herstellens einer rekombinanten Wirtszelle und Bedingungen für die Expression eines Proteins, wie rHSA, daraus sind gut bekannt, siehe z. B. die oben diskutierte EP 0 612 761 für eine Bezugnahme auf verschiedene Patentanmeldungen innerhalb dieses Gebietes.
Der Hauptzweck des Schrittes (a) ist es, gefärbte Substanzen niedrigen Molekulargewichts, wie Pigmente, die negativ geladen sind, zu eliminieren. So nutzt Schritt (a) einen Kationenaustauscher, der Liganden des als Hoch-Salz-Liganden (HSL) bekannten Typs umfasst. In diesem Kontext bezieht sich „Hoch-Salz" auf die oben erwähnte Eigenschaft einer Toleranz gegenüber hohen Salzkonzentrationen, die für diese Klasse von Ionenaustauschern charakteristisch ist. Diese Eigenschaft wird bereitgestellt durch die Natur der Liganden, die bimodal in dem Sinne ist, dass jeder Ligand zwei Gruppen umfasst, die zum Wechselwirken mit der zu isolierenden Substanz fähig sind, im vorliegenden Fall rHSA. Der primäre Bindungsmodus wird bereitgestellt durch eine geladene Bindungsgruppe, d.h. eine Ionen austauschende Gruppe, und daher der Klassifikation des HSL-Typs von Matrizen als Ionenaustauscher. Ein zweiter Bindungsmodus wird bereitgestellt durch eine zweite Bindungsgruppe, die eine zusätzliche Wechselwirkung mit der zu isolierenden Substanz bereitstellt. Üblicherweise stellt die zweite Bindungsgruppe eine Wasserstoffbrückenbindung oder eine hydrophobe Wechselwirkung bereit, aber andere Wechselwirkungen können in Betracht gezogen werden, wie detaillierter unten diskutiert werden wird. In diesem Kontext ist anzumerken, dass der Begriff „bimodal" hier verwendet wird, um zu definieren, dass zwei oder mehr Bindungsmodi involviert sind, und er ist deshalb nicht beschränkt auf nur zwei Bindungsmodi. In der vorliegenden Anmeldung werden Kationenaustauscher des HSL-Typs genutzt und derartige Kationenaustauscher wurden im Detail offenbart, siehe z. B. PCT/EP01/08203 (Amersham Pharmacia Biotech AB). Jedoch wird eine allgemeine Beschreibung davon unten folgen.
Die geladene Bindungsgruppe, die auf einem kationischen Hoch-Salz-Liganden (HSL) vorhanden ist, kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die besteht aus Sulfonat (-SO₃ ^–/-SO₃H), Sulfat (-OSO₃ ^–/-OSO₃H), Carboxylat (-COO^–/-COOH), Phosphat (-OPO₃ ^2–/-OPO₃H^–/-OPO₃H₂) und Phosphonat (-PO₃ ^2–/-PO₃ ^–H/-PO₃H₂). In einer vorteilhaften Ausführungsform ist der HSL-Typ des Kationenaustauschers ein schwacher Kationenaustauscher, d.h. Kationenaustauscher, die einen pKa über 3 besitzen. In einer alternativen Ausführungsform gibt es starke Kationenaustauscher, die einen pKa unter 3 besitzen. Typische Beispiele derartiger schwacher Kationenaustauscher sind Carboxylat (-COO^–/-COOH), Phosphat (-OPO₃ ^2–/-OPO₃H^–/-OPO₃H₂) und Phosphonat (-PO₃ ^2–/-PO₃H^–/-PO₃H₂).
Die zweite Bindungsgruppe umfasst mindestens ein Wasserstoffbrückenbindungs-Atom, das in einer Entfernung von 1 bis 7 Atomen von der Kationen austauschenden Gruppe angeordnet ist. Ein Wasserstoffbrückenbindungs-Atom ist ein Atom, das fähig ist, an der Wasserstoffbrückenbindung (mit Ausnahme von Wasserstoff) teilzunehmen, siehe Karger et al., An introduction into Separation Science, John Wiley & Sons (1973), Seite 42. Das Wasserstoffbrückenbindungs-Atom kann ausgewählt sein aus der Gruppe, die besteht aus Heteroatomen, wie Sauerstoffen (Carbonylsauerstoff, Ethersauerstoff, Estersauerstoff, Hydroxysauerstoff, Sulfonsauerstoff, Sulfonamidsauerstoff, Sulfoxidsauerstoff, Sauerstoff in aromatischen Ringen etc.), Stickstoffen (Amidstickstoff, Stickstoff in aromatischen Ringen etc.), Schwefeln (Thioetherschwefel, Schwefel in aromatischen Ringen etc.); und sp- und sp²-hybridisierten Kohlenstoffatomen; und Halogruppen, wie Fluoro, Chloro, Bromo oder Iodo, bevorzugt Fluoro. Die zweite Bindungsgruppe enthält typischerweise kein geladenes Atom oder ein Atom, das durch eine pH-Änderung ladbar ist.
Die Stabilität der Kationenaustauschliganden, die in Schritt (a) verwendet werden, kann in allgemeinen Begriffen als die Kapazität definiert werden, um 0,1 oder 1 M NaOH in Wasser für mindestens 40 Stunden zu widerstehen. Für veranschaulichende Beispiele geeigneter chemischer Ligandenstrukturen der Kationenaustauscher, die in Schritt (a) des vorliegenden Verfahrens nützlich sind, siehe oben erwähnte PCT/EP01/08203. In einer spezifischen Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens nutzt Schritt (a) den HSL-Kationenaustauschliganden, der in 1A der vorliegenden Beschreibung veranschaulicht ist.
In funktionellen Begriffen definiert ist der Kationenaustauscher, der in Schritt (a) des vorliegenden Verfahrens verwendet wird, fähig zum

(a) Binden von rHSA durch Kationenaustausch in einer wässrigen Referenzflüssigkeit bei einer Ionenstärke, die 0,3 M NaCl entspricht, und
(b) Ermöglichen einer Durchbruchskapazität für die Substanz ≥ 200%, wie ≥ 300% oder ≥ 500% oder ≥ 1000% der Durchbruchskapazität der Substanz für einen Referenzkationenaustauscher, der Sulfopropylgruppen -CH₂CH₂CH₂SO₃ ^– bei den oben gezeigten Ionenstärken enthält.

PCT/EP01/08203 beschreibt einen derartigen Referenzionenaustauscher detaillierter. Der Gehalt von Ionenaustauschliganden in den Kationenaustauschern, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, wird üblicherweise im Intervall von 1–4000 μmol/ml Matrix ausgewählt, wie 2–500 μmol/ml Matrix, mit einer Präferenz für 5–300 μmol/ml Matrix. Mögliche und bevorzugte Bereiche sind u.a. bestimmt durch die Natur der Matrix, des Liganden etc. Daher wird der Gehalt der Kationenaustauschliganden innerhalb des Bereiches von 10–300 für Agarosebasierende Matrizen liegen. Für Dextran-basierende Matrizen beträgt das Intervall typischerweise 10–600 μmol/ml Matrix.
Die oben erwähnte PCT/EP01/08203 umfasst auch eine ausführliche Diskussion von Matrixmaterialien, die mit Kationenaustauschern des HSL-Typs nützlich sind. Kurz gesagt können derartige Matrizen auf organischem oder anorganischem Material basieren. Sie ist bevorzugt hydrophil und in der Form eines Polymers, das unlöslich und mehr oder weniger quellfähig in Wasser ist. Hydrophobe Polymere, die derivatisiert worden sind, um hydrophil zu werden, sind in dieser Definition eingeschlossen. Geeignete Polymere sind Polyhydroxypolymere, z. B. die auf Polysacchariden basieren, wie Agarose, Dextran, Zellulose, Stärke, Pullulan, etc., und vollständig synthetische Polymere, wie Polyacrylamid, Polymethacrylamid, Poly(hydroxyalkylvinylether), Poly(hydroxyalkylacrylate) und Polymethacrylate (z. B. Polyglycidylmethacrylat), Polyvinylalkohole und Polymere, die auf Styrolen und Divinylbenzolen basieren, und Co-Polymere, in denen zwei oder mehr der Monomere, die den oben erwähnten Polymeren entsprechen, eingeschlossen sind. Polymere, die in Wasser löslich sind, können derivatisiert werden, um unlöslich zu werden, z. B. durch Vernetzen und durch Koppeln an einen unlöslichen Körper über Adsorption oder kovalente Bindung. Hydrophile Gruppen können eingeführt werden auf hydrophoben Polymeren (z. B. auf Co-Polymeren von Monovinyl- und Divinylbenzolen) durch Polymerisation von Monomeren, die Gruppen zeigen, die zu OH umgewandelt werden können, oder durch Hydrophilisation des schließlichen Polymers, z. B. durch Adsorption von geeigneten Verbindungen, wie hydrophilen Polymeren. Ein veranschaulichendes Beispiel einer geeigneten Matrix ist die kommerziell erhältliche kugelförmige Sepharose, die auf Agarose basiert und von Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden, erhältlich ist. Geeignete anorganische Materialien, die als Trägermatrizen verwendet werden sollen, sind Silica, Zirconiumoxid, Graphit, Tantaloxid etc.
Die oben erwähnte PCT/EP01/08203 umfasst eine ausführliche Offenbarung der Herstellung von Kationenaustauschern des HSL-Typs. Auch ist ein Überblick über Verfahren zum Immobilisieren Liganden-bildender Verbindungen an Oberflächen gegeben in Hermanson, G.T., Mallia, A.K. & Smith, P.K., (Hg.), Immobilisation Affinity Ligand Techniques, Academic Press, INC, 1992.
Wie oben erwähnt, ist einer der Nutzen des HSL-Typs von Ionenaustauschern, dass es möglich ist, eine Adsorption auf der Säule durchzuführen, d.h. ein Binden des rHSA an den Liganden bei erhöhten Ionenstärken im Vergleich zu dem, was norma lerweise für herkömmliche Kationenaustauscher ausgeführt wurde, z. B. den Referenz-Sulfopropyl-Kationenaustauscher, der oben diskutiert wurde. Die genaue Ionenstärke, die während des Bindens verwendet werden soll, hängt von der Natur des Proteins und dem Typ und der Konzentration des Liganden auf der Matrix ab. Nützlich Ionenstärken entsprechen oft NaCl-Konzentrationen (reines Wasser) ≥ 0,1 M, wie ≥ 0,3 M oder sogar ≥ 0,5 M. Eine Desorption kann ausgeführt werden z. B. durch Vergrößern der Ionenstärke und/oder durch Ändern des pH. Typische Salze, die zum Ändern der Ionenstärke verwendet werden sollen, sind ausgewählt aus löslichen Ammonium- oder Metallsalzen von Phosphaten, Sulfaten, etc., insbesondere Alkalimetall- und/oder Erdalkalimetallsalzen. Dieselben Salze können auch in den Adsorptionsschritten verwendet werden, aber dann oft in geringeren Konzentrationen.
In einer Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens beträgt die Menge der Kationenaustauschmatrix, die in Schritt (a) verwendet wird, ungefähr die Hälfte der Menge der HIC-Matrix, die in Schritt (b) verwendet wird. Demgemäss ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung die herausragende Bindungskapazität der bimodalen Kationenaustauschmatrix, die eine Reduktion im Volumen und deshalb der Betriebskosten im Vergleich zu herkömmlichen Kationenaustauschern ermöglicht. Bei Vorhandensein einer hohen Salzkonzentration, wie einer Leitfähigkeit von ungefähr 25–30 mS/cm, beträgt die Adsorption von kommerziell erhältlicher SP-Sepharose für rHSA ungefähr 2–4 mg/ml gepacktes Gel, während das des Hoch-Salz-Liganden-Prototyps (1A) als mindestens 50 mg/ml gezeigt worden ist. Demgemäss vereinfacht die Verwendung des bimodalen Hoch-Salz-Liganden (HSL) klar und verbessert den Reinigungsschritt beträchtlich und verringert die Kosten des Betriebs in einem großen Maßstab.
Eine Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens umfasst die Wärmebehandlung des CCS vor dem Schritt (a). Das Erwärmen kann direkt ausgeführt werden, d.h. während die Wirtszellen noch vorhanden sind oder nach deren Entfernung, wie durch Zentrifugation, Ultrafiltration oder ein beliebiges anderes geeignetes Verfahren. Das Erwärmen kann ausgeführt werden bei 50–100°C während einer Zeitdauer von einer Minute bis zu mehreren Stunden, bevorzugt bei 60–75°C für 20 Minuten bis 3 Stunden, und am meisten bevorzugt bei ungefähr 68°C für ungefähr 30 min. Das Erwärmen wird günstigerweise ausgeführt in einem Wasserbad, das mit einem Thermostaten ausgerüstet ist. In einer Ausführungsform wird ein Stabilisator vor dem Erwärmen zugegeben, wie Natriumcaprylat bei einem pH von ungefähr 6,0. Andere Stabilisatoren können verwendet werden, wie Acetyltryptophan, organische Carbonsäuren etc. Nach dem Erwärmen wird der pH des CCS bevorzugt auf einen niedrigeren Wert eingestellt, der für die nachfolgende Adsorption auf einem Kationenaustauscher geeignet ist, wie pH 4,5.
In einer anderen Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens wird das Produkt des Schritts (a), d.h. die Fraktion, die an die Säule gebunden ist, die die HSL-Typ-Matrix umfasst, vor dem Schritt (b) wärmebehandelt. Bevorzugt wird ein Reduktionsmittel, wie Cystein, zugegeben. Andere Beispiele nützlicher Reduktionsmittel sind Mercaptoethanol, reduziertes Glutathion etc. Der Zweck davon ist es, die Entfernung von gefärbten Substanzen während des Schritts (b) zu vereinfachen. Diese Wärmebehandlung wird im allgemeinen ausgeführt, wie oben beschrieben, obwohl sogar in der bevorzugten Ausführungsform eine leicht geringere Temperatur wie ungefähr 60°C für eine leicht längere Zeitdauer, wie ungefähr 60 min, verwendet wird.
Wie oben erwähnt, nutzt der Schritt (b) der vorliegenden Erfindung eine hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC). Der Hauptzweck des Schritts (b) ist es, proteolytische Abbauprodukte von rHSA zu entfernen, wobei die Produkte üblicherweise von einer Größe von ungefähr 10–50 kDa sind. HIC ist ein gut bekanntes Prinzip in der Technik der Chromatographie und stellt ein vielseitiges Werkzeug für die Trennung basierend auf Unterschieden in der Oberflächenhydrophobizität bereit. Es wurde gezeigt, dass viele Biomoleküle, die als hydrophil betrachtet werden, noch ausreichend hydrophobe Gruppen zeigen, um eine Wechselwirkung mit den hydrophoben Liganden, die an die chromatographische Matrix gebunden sind, zu ermöglichen. HIC wurde schon für die Reinigung von rHSA vorgeschlagen, siehe z.B. EP 0 699 687 . Verglichen mit einem anderen gut bekannten Trennprinzip, nämlich Umkehrphasenchromatographie, nutzt HIC eine viel geringere Dichte des Liganden auf der Matrix. Dieses Merkmal fordert einen höheren Grad an Selektivität, während milde Elutionsbedingungen ermöglicht werden, um zu helfen, die biologische Aktivität des Proteins von Interesse aufrechtzuerhalten. Im vorliegenden Kontext wird der HIC-Schritt verwendet, um die oben erwähnten proteolytischen Abbauprodukte von rHSA zu adsorbieren, während das rHSA voller Länge in der ungebundenen Fraktion eluiert wird. Die hydrophobe Wechselwirkung zwischen dem rHSA und dem immobilisierten Liganden auf der Matrix wird vergrößert durch einen kleinen Anstieg in der Ionenstärke der verwendeten Puffer. Es gibt viele Trennmaterialien, die für HIC heute kommerziell erhältlich sind und die vorliegende Erfindung ist nicht beschränkt auf irgendeine(n) spezifische(n) Matrix und/oder Liganden. So kann in allgemeinen Begriffen die in Schritt (b) verwendete Matrix auf einem organischen oder anorganischen Material basieren. Im Falle von organischen Materialien kann sie z.B. ein natives Polymer sein, wie Agarose, Dextran, Zellulose, Stärke etc., oder ein synthetisches Polymer, wie Divinylbenzol, Styrol etc. Im Falle von anorganischen Matrixmaterialien ist Silica ein gut bekanntes und allgemein verwendetes Material. In einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Matrix vernetzte Agarose, die kommerziell erhältlich ist von einer Anzahl von einer Anzahl von Firmen, wie Sepharose^TM von Amersham Biosciences (Uppsala, Schweden). In einer Ausführungsform zeigt die in Schritt (b) verwendete HIC-Matrix einen oder mehrere hydrophobe Liganden, die zur Wechselwirkung mit rHSA fähig sind, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Phenyl, Butyl, wie n-Butyl, Octyl, wie n-Octyl, etc., bevorzugt auf einer Agarosematrix. Alternativ sind hydrophobe Liganden, wie Ether, Isopropyl oder Phenyl auf einer Divinylbenzolmatrix vorhanden, wie Source^TM von Amersham Biosciences (Uppsala, Schweden). In der am meisten bevorzugten Ausführungsform werden Phenylliganden auf einer vernetzten Agarosematrix für Schritt (b) verwendet. Die Matrix besteht bevorzugt aus porösen Kugeln, die einen Wassergehalt von oberhalb ungefähr 90%, bevorzugt oberhalb 94%, besitzen können. Die durchschnittliche Teilchengröße kann z.B. zwischen 10 und 150 μm, wie gemessen auf einer nassen Kugel, betragen, bevorzugt unter 100, wie ungefähr 90 μm. Die Ligandendichte auf der Matrix kann z.B. zwischen 20 und 60 liegen, wie ungefähr 40 μmol/ml Gel. Als ein spezifisches Beispiel ist die verwendete Matrix Phenyl-Sepharose^TM 6 Fast Flow von Amersham Biosciences (Uppsala, Schweden). In diesem spezifischen Fall wird die Bezeichnung Fast Flow verwendet für eine Matrix, deren Vernetzung optimiert worden ist, um Prozessangepasste Fließeigenschaften mit typischen Fließgeschwindigkeiten von 300–400 cm/h durch eine 15 cm-Bett-Höhe bei einem Druck von 1 bar zu ergeben. Jedoch kann der Fachmann auf diesem Gebiet derartige Prozessarameter abhängig von dem Maßstab des Betriebs einfach anpassen. Dieser Schritt kann bei einem pH von ungefähr 4–8, wie 6,5–7, und einer Salzkonzentration von ungefähr 0,01 bis 0,5 M, wie 0,05 bis 0,2 M ausgeführt werden.
Wie auch oben erwähnt ist, nutzt Schritt (c) des vorliegenden Verfahrens einen Anionenaustauscher, bevorzugt einen schwachen Anionenaustauscher, zum Entfernen kleinerer Verunreinigungen aus Schritt (b), und insbesondere zum Entfernen unerwünschter Verbindungen, wie Pigmente niedrigen Molekulargewichts. Die Erfindung ist nicht beschränkt auf die Verwendung irgendwelchen spezifischen Anionenaustauschermaterials, so lange es eine ausreichende Menge von Liganden zeigt, die zum Binden von Verbindungen negativer Ladungen fähig sind, die im schließlichen rHSA-Produkt unerwünscht sind. Der Anionenaustauschchromatographie-Schritt kann z.B. ausgeführt werden bei einem pH von ungefähr 5,0 bis 8,0 und einer Salzkonzentration von 0,01 bis 0,2 M zur Entfernung der Verunreinigungen. Was das Matrixmaterial betrifft, kann es von einem beliebigen organischen oder anorganischen Material sein, wie oben diskutiert. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Matrix aus porösen Kugeln aus vernetzter Agarose, wie Sepharose^TM von Amersham Biosciences (Uppsala, Schweden). Die daran gebundenen Liganden sind schwache Anionenaustauscher, deren Bindungsgruppe z.B. ein primäres oder sekundäres Amin ist. Eine derartige Bindungsgruppe kann an die Matrix z.B. über eine Alkylkette mit einer E thergruppe als nächste zur Matrix gebunden werden. Die Literatur beschreibt viele Wege des Bindens einer Bindungsgruppe an eine Matrix über Spacer, Arme etc., und wie oben erwähnt ist die vorliegende Erfindung nicht auf eine beliebige spezifische Struktur beschränkt. In einer beispielhaften Ausführungsform wird eine Agarosekugel mit Liganden gemäß der folgenden Formel -O-CH₂CH₂-N⁺(C₂H₅)₂H, z.B. DEAE Sepharose^TM von Amersham Biosciences verwendet. Diese Ausführungsform wird zu rHSA in sowohl der gebundenen als auch der ungebundenen Fraktion, die aus der Säule eluiert wird, führen, was für einige Anwendungen zufriedenstellend ist.
Jedoch ist eine alternative Ausführungsform, die vorteilhafter ist, soweit die Reinheit des Endprodukts betroffen ist, das Verwenden einer Agarosekugel mit Liganden, die zwei Estergruppen umfassen, und bevorzugt auch zwei Hydroxylgruppen. Die Bindungsgruppe ist dann bevorzugt ein primäres Amin. Der Vorteil mit dieser Ausführungsform ist, dass das rHSA nur in der Fraktion vorhanden sein wird, die moderat an die Matrix gebunden ist, was zu einer stark verbesserten Reinheit und Einfachheit im Betrieb führt. Eine beispielhafte allgemeine Formel für diese zuletzt erwähnte Ausführungsform ist in 1 gezeigt, jedoch soll verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren umfasst, bei dem ähnliche Strukturen in Schritt (c) verwendet werden.
Jedoch soll verstanden werden, dass die vorliegende Erfindung die Verwendung auch von Matrizen ähnlich zu den obigen umfasst, die auf derselben allgemeinen Ligandenstruktur basieren. Ferner wird die Bezeichnung „Gel" in der Formel 1A verstanden als eine Matrix enthaltend, wie oben in Bezug auf Schritt (b) diskutiert. Ein kommerziell erhältliches Beispiel einer Matrix, die den oben beschriebenen Liganden umfasst, ist ButylSepharose^TM (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden). In den unten dargelegten Experimenten wurde eine Ligandendichte von 160 μmol/ml verwendet. Demgemäß erscheint es, dass speziell vorteilhafte Ergebnisse erreicht werden können durch Optimieren der Ligandendichte der Matrix. Es erscheint auch, dass, wenn die zuerst erwähnte Art von Anionenaustauscher verwen det wird, d.h. die DEAE-Art von Matrizen, ein größeres Volumen erforderlich ist, wie ungefähr dreimal das Volumen im Vergleich zu den zuletzt erwähnten Butyl-Sepharose-Medien. Demgemäß nutzt die bevorzugte Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens ein sekundäres Amin als die Anionen austauschende Gruppe während des Schritts (c) und eine Ligandendichte von mindestens ungefähr 100 μmol/ml.
In einer spezifischen Ausführungsform liegt die Ligandendichte des Anionenaustauschers im Bereich von 50 bis 300, wie 100 bis 200, und bevorzugt ungefähr 160 μmol/ml. Ein Vorteil ist, dass das gereinigte rHSA dann nur von der gebundenen Fraktion aus Schritt (c) wiedergewonnen werden kann, im Vergleich zu z.B. DEAE, wenn es sowohl in gebundenen als auch ungebundenen Fraktionen vorhanden sein kann.
Detaillierte Beschreibung der Zeichnungen
1A–D veranschaulicht mögliche Ligandenstrukturen, die zur Verwendung im vorliegenden Verfahren geeignet sind. Spezieller zeigt 1A einen Kationenaustauscher eines Hoch-Salz-Liganden (HSL)-Typs, 1B zeigt eine hydrophobe Wechselwirkungschromatographie-Matrix, nämlich Phenyl-Sepharose, und 1C und 1D zeigen zwei alternative Anionenaustauscher, nämlich eine generalisierte Formel, umfassend die Struktur der kommerziell erhältlichen DEAE-Sepharose (1C, wenn n = 0) und die modifizierte Butyl-Sepharose, die eine vergrößerte Ligandendichte, wie oben beschrieben, umfasst.
2 zeigt die Ergebnisse aus Schritt (a), d.h. eine Kationenaustauschchromatographie von 147 ml unverdünntem Zellkultur-Überstand (CCS) auf einer 20 ml-Säule, umfassend eine Kationenaustauschmatrix mit der in 1A veranschaulichten Ligandenstruktur. Fraktion 1B enthält das rHSA, das klar von den durch Fraktion 2A repräsentierten Verunreinigungen getrennt ist.
3 zeigt die Ergebnisse aus Schritt (b), d.h. hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC) der Fraktion 2B aus 2 auf einer 40 ml-Säule, umfassend Phenyl-Sepharose, wie in 1B veranschaulicht. Fraktion A repräsentiert die rHSA.
4 zeigt die Ergebnisse aus Schritt (c), d.h. Anionenchromatographie der Fraktion 3A aus 3 auf einer 40 ml-Säule, umfassend die modifizierte Butyl-Sepharose, wie im experimentellen Teil unten beschrieben. Das gereinigte rHSA ist in Fraktion 4B.
5 zeigt native PAGE(8-25%)- und SDS-PAGE(10–15%)-Analysen der Hauptfraktionen, die unter Verwenden des 3-Schritt-Verfahrens gemäß der Erfindung erhalten sind. Für native PAGE, sichtbar gemacht durch Anfärben mit Silber (5A), wurden ungefähr 3,3 μg pro Spot aufgebracht. Für SDS-PAGE, sichtbar gemacht durch Anfärben mit Silber (5B), wurden ungefähr 2 μg Protein pro Spot aufgebracht. Für SDS-PAGE, sichtbar gemacht durch Coomassie-Anfärben (5C), wurden ungefähr 10 μg Protein pro Spot aufgebracht. 1: CCS; 2: HSL Cat. Ex. (ungebunden); 3: HSL Cat. Ex. (gebunden); 4: Phenyl (ungebunden); 5: Phenyl (gebunden); 6: HiSub. Butyl (gebunden); 7: HiSub. Butyl (gebunden); 8: HSA (Kontrolle). Die Pfeile zeigen die Positionen des rHSA.
EXPERIMENTELLER TEIL
Materialien und Verfahren
Der Zellkultur-Überstand (CCS), der rHSA enthielt, wurde durch Fermentieren von genetisch modifizierten P. pastoris-Zellen zwei Wochen lang oder länger hergestellt, gefolgt von einer Trennung der Zellen durch Filtration. Der CCS, der in der Farbe Grün war, wurde in aliquote Mengen von ungefähr 200 ml unterteilt und bei –20C° bis zur Verwendung gelagert. Die Qualität des CCS wurde bestimmt durch Gelfiltration auf einer analytischen Säule von Superdex^TM 200 HR 10/30 (Amersham Bios ciences, Uppsala, Schweden). Diese Analyse ergab die relativen Mengen von Verunreinigungen hohen Molekulargewichts (HMW) und niedrigen Molekulargewichts (LMW) in dem CCS, wie auch den angenäherten Gehalt der monomeren Form von rHSA.
Natriumcaprylat (Oktansäure, Na-Salz) und L-Cystein wurden von SIGMA Chemical Co. gekauft. Chromatographisch gereinigte HSA aus menschlichem Plasma wurde freundlicherweise von I. Andersson bei der Plasmaverarbeitungseinheit von Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden bereitgestellt. Die Konzentration des Proteins in verschiedenen Proben wurde bestimmt unter Verwenden des Bio-Rad Protein Assay-Kit (bekannt als das Bradford-Verfahren). Rinderserumalbumin (BSA) wurde verwendet, um die Standardkurve zu konstruieren. UV/Vis-Absorptionsmessungen wurden durchgeführt unter Verwenden eines Shimadzu UV-160A-Aufnahmespektrophotometers (Shimadzu Corporation, Japan). Alle anderen verwendeten Chemikalien waren von einer analytischen oder Reagenz-Reinheit.
Analytische Elektrophorese wurde ausgeführt unter Verwenden eines Phastgel-Elektrophoresesystems und geeigneten Phastgel-Medien und -Puffer-Strips (alle von Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden). Die elektrophoretischen Analysen wurden ausgeführt unter Verwenden von nativen PAGE(8–25%)- oder SDS-PAGE (nicht reduziert, 10–15%)-Gels, gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Die Menge der aufgebrachten Probe pro Spot war wie folgt: ungefähr 3,3 μg für native Proben und 2 μg für die SDS-behandelten Proben, von denen beide mit Silver Staining Kit (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) angefärbt waren. 10 μg für die SDS-behandelten Proben, die mit Coomassie Brilliant Blue (CBB) angefärbt waren.
Massenspektrometrische Analysen (abgezielt auf Bestimmen der Masse des gereinigten rHSA und des aus dem Plasma erhaltenen HSA) wurden ausgeführt von Dr. J. Flensburg bei Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden, unter Verwenden eines MALDI-TOF-Instruments. Peptid-Mapping des tryptischen Verdaus der nativen und rekombinanten HSA wurde auch unter Verwenden dieses Instruments ausgeführt. Die von der letzteren Analyse erhaltenen Ergebnisse dienen zum Etablieren der am meisten wahrscheinlichen primären Sequenz des rHSA mit Bezug auf die bekannten Sequenzen der tryptischen Peptide, die aus gereinigter HSA erzeugt sind.
Matrizen und Chromatographie-System
Die chromatographischen Experimente wurden ausgeführt bei Raumtemperatur (ungefähr 23C°) unter Verwenden eines AKTA^TM Explorer 100-Systems, kontrolliert von UNICORN^TM (Version 3.1) Software (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden). Die für Schritt (b) verwendete Trennmatrix ist Phenyl-Sepharose^TM 6 Fast Flow (high sub), ein reguläres Produkt von Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden. Für Schritt (c) wurde entweder kommerzell erhältliche DEAE-Sepharose^TM Fast Flow (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) oder eine modifizierte Matrix verwendet: Butyl-Sepharose^TM 6 Fast Flow (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) wurde hergestellt mit einer vergrößerten Ligandendichte (Charge U238025:160 μmol/ml) im Vergleich zum kommerziellen Produkt (20–40 μmol/ml Gel). Diese modifizierte Matrix wird hier bezeichnet als „modifizierte Butyl-Sepharose". Außerdem nutzte Schritt (a) eine Prototyp-Matrix des HSL-Typs, Kationenaustauscher, siehe 1A. Dieses Medium wurde in einer XK26/20-Glassäule als eine dicke Suspension in 20% Ethanol gepackt, um ein Bettvolumen von 40 ml zu erhalten. Eine lineare Fließgeschwindigkeit von 300 cm/h wurde verwendet. Die gepackte Säule wurde mit ungefähr 2 Bettvolumina entionisiertem Wasser gewaschen, um das meiste des Ethanols zu eluieren und dann mit der geeigneten Pufferlösung vor der Probenaufbringung ins Gleichgewicht gebracht. Die Menge des für jeden der chromatographischen Schritte verwendeten Puffers, die die verschiedenen Medien nutzen, ist in Tabelle 1 unten gezeigt.
Puffer
Puffer A: 25 mM Natriumacetat, pH 4,5

Mische 25 ml 1 M Natriumacetat und 40 ml 1 M Essigsäure und verdünne auf 1 l mit entionisiertem Wasser. Leitfähigkeit: ungefähr 2 mS/cm bei Raumtemperatur (RT).

Puffer B: 50 mM Natriumphosphat, 0,1 M NaCl, 10 mM Natriumcaprylat, pH 7,0

Mische 155 ml 0,2 M Na₂HPO₄ + 90 ml 0,2 M NaH₂PO₄ + 5,8 g NaCl + 1,66 g Natriumcaprylat und verdünne auf 1 l mit entionisiertem Wasser. Leitfähigkeit: ungefähr 16 mS/cm bei RT.

Puffer C: 50 mM Natriumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 6,0
Mische 212 ml 0,2 M Na₂HPO₄ + 38 ml 0,2 M Na₂HPO₄ + 5,8 g NaCl und verdünne auf 1 l mit entionisiertem Wasser. Leitfähigkeit: 14 mS/cm bei RT.
Puffer D: 50 mM Natriumphosphat 0,2 M NaCl, pH 6,0

Mische 212 ml 0,2 M Na₂HPO₄ + 38 ml 0,2 M Na₂HPO₄ + 11,7 g NaCl und verdünne auf 1 l mit entionisiertem Wasser. Leitfähigkeit: 22 mS/cm bei RT.

Puffer E: Cleaning-in-place (CIP)-Lösung

Löse 30% Isopropanol in 1 M NaOH-Lösung.

Beispiel: Reinigung von rHSA
Wärmebehandlung des Zellkultur-Überstandes (CCS)
Vor der Kationenaustauschchromatographie wurde der CCS primär wärmebehandelt, um proteolytische Enzyme zu inaktivieren, die während der Fermentation von P. pastoris erzeugt wurden. Dies wurde wie folgt ausgeführt: Die gefrorene Probe von CCS wurde aufgetaut und 10 mM Na-Caprylat wurde aufgelöst. Der pH wurde auf 6,0 eingestellt und sie wurde erwärmt für 30 min in einem Wasserbad (gehalten auf 68°C durch einen Thermostaten). Die Probe wurde auf Raumtemperatur gekühlt und ihr pH auf 4,5 eingestellt. Falls ein herkömmliches Kationenaustauschmedium, wie SP Sepharose BB, verwendet werden sollte für Schritt (a), wäre es erforderlich gewesen, den CCS 2–8 mal zu verdünnen, abhängig von der ursprünglichen Leitfähigkeit der Lösung, mit entionisiertem Wasser, um eine Leitfähigkeit von ungefähr 5 bis 10 mS/cm (annähernd 0,1 M Salzkonzentration) zu erreichen.
Jedoch ist die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete HSL-Typ-Matrix viel toleranter gegenüber erhöhten Salzkonzentrationen, und deshalb kann der wärmebehandelte CCS normalerweise in Schritt (a) ohne weitere Verdünnung angewandt werden, solange wie die Leitfähigkeit davon weniger als ungefähr 30 mS/cm beträgt.
Das teilweise gereinigte rHSA, das nach dem Kationenaustausch gemäß Schritt (a) erhalten wurde (d.h. die Fraktion, die an die HSL-Typ-Matrix gebunden ist), wurde auch vor dem Schritt (b) wie folgt wärmebehandelt: der pH der Probe wurde auf 6,0 mit 1 M NaOH eingestellt und Cystein wurde darin aufgelöst auf eine Konzentration von 5 mM, um als ein Reduktionsmittel zu dienen. Diese Lösung wurde dann 60 min lang in ein Wasserbad, das auf 60°C gehalten wurde, erwärmt. Der Hauptzweck dieses Arbeitsschrittes ist es, die Entfernung von gefärbten Substanzen durch die HIC-Matrix zu vereinfachen.
Schritt (a): Einfangen unter Verwenden von Kationenaustauschchromatographie
Das Kationenaustauschmedium wurde in eine XK 16/20-Säule (gepacktes Bett-Volumen 20 ml) gepackt und mit 2 Säulenvolumina (CV) des Puffers A für eine Gleichgewichtseinstellung gewaschen. Der wärmebehandelte CCS wurde auf die Säule über eine 150 ml-Superloop^TM (Amerscham Biosciences, Uppsala, Schweden) bei einer Fließgeschwindigkeit von 300 ml/h (150 cm/h) aufgebracht. Die Menge des aufgebrachten rHSA betrug ungefähr 1 g (d.h. 50 ml rHSA/ml gepacktes Gel). Nach der Probenaufbringung wurde das ungebundene Material mit 3 CV des Puffers A eluiert, gefolgt von einer Elution des gebundenen rHSA mit 5 CV des Puffers B. Die zwei Fraktionen wurden getrennt gesammelt und der pH der gebundenen Fraktion wurde auf 6,0 mit einer 1 M NaOH-Lösung eingestellt. Die Lösung wurde dann erwärmt wie unten beschrieben, auf Raumtemperatur gekühlt und weiter gereinigt auf einer HIC-Säule, wie unten beschrieben. Eine aliquote Menge von 1 ml von jeder gesammelten Fraktion wurde aufgehoben für analytische Zwecke (d.h. um den Proteingehalt, das A₃₅₀/A₂₈₀-Verhältnis und eine elektrophoretische Analyse zu bestimmen).
Regeneration: Die Säule wurde mit 2 CV des Puffers E gewaschen, um sehr stark gebundene Substanzen zu eluieren und die Funktion des Gels wiederherzustellen. Man ließ die Säule über Nacht in derselben Lösung stehen und wusch sie dann mit 4 CV entionisiertem Wasser, um das meiste des NaOH und des Isopropanols zu eluieren. Die regenerierte Säule wurde wieder ins Gleichgewicht gebracht mit 4 CV des Puffers A vor dem nächsten Zyklus des Adsorptions-/Desorptions-Prozesses.
Schritt (b): Reinigungsschritt unter Verwenden von HIC
Die rHSA-enthaltende Fraktion vom vorigen Schritt wurde in eine 150 ml-Superloop^TM übertragen und auf eine XK 26/20-Säule, die mit Phenyl Sepharose^TM Fast Flow (high sub) gepackt war, gepacktes Bettvolumen 40 ml, aufgebracht. Die Säule wurde vorher ins Gleichgewicht gebracht mit 3 CV des Puffers C. Nach der Probenaufbrinung wurde die Säule mit 2 CV des Puffers C gewaschen, um das ungebundene Material, das das rHSA enthält, zu eluieren. Das gebundene Material (enthaltend hauptsächlich die 45 kDa-abgebaute Form von rHSA) wurde mit 2 CV entionisiertem Wasser eluiert.
Regeneration: Dieselbe Prozedur wie oben.
Schritt (c): Glätt-Schritt unter Verwenden eines schwachen Anionenaustauschs
Die von dem vorigen HIC-Schritt erhaltenen zwei Fraktionen wurden gesammelt und aliquote Mengen von 1 ml von jeder wurden für analytische Bestimmungen aufgehoben (s. oben). Eine Säule (XK 26/20) wurde mit DEAE Sepharose^TM Fast Flow oder der oben beschriebenen modifizierten Butyl-Sepharose gepackt, um ein gepacktes Bettvolumen von 40 ml zu erhalten. Jedes der gepackten Medien wurde mit 2 CV entionisiertem Wasser gewaschen und dann mit ungefähr 5 CV des Puffers C, um sie ins Gleichgewicht zu bringen. Die ungebundene Fraktion, die aus dem HIC-Schritt erhalten wurde, wurde in eine 150 ml-Superloop übertragen und auf eine oder die andere der oben erwähnten zwei Säulen auufgebracht. Die ungebundene Fraktion wurde eluiert mit 6 CV des Puffers C (von der DEAE-Sepharose Fast Flow-Säule) oder mit 2 CV der modifizierten Butyl-Sepharose-Säule. Die gebundene Fraktion wurde mit 2 CV einer 2 M Lösung von NaCl (für die DEAE-Säule) oder mit 5 CV des Puffers D für die modifizierte Butyl-Sepharose-Säule eluiert. Die Fließgeschwindigkeit wurde durchweg auf 90 cm/h gehalten.
Regeneration: Dieselbe Prozedur wie oben.
Die Elutionsprotokolle, die gemäß der Erfindung für jedes der verwendeten Medien optimiert waren, sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Der Fachmann auf diesem Gebiet kann leicht den oben beschriebenen Prozess auf Pilot- oder Produktionsmassstab-Betriebsarten massstäblich vergrößern.
Ergebnisse
Da der 3-Schritt-Reinigungsprozeß auf einer schrittweisen Elution basiert, ist er leicht auf eine Betriebsart im großen Maßstab anpassbar. Die Verwendung einer Hoch-Liganden-Butyl-Sepharose für Schritt (c) führt zu einer effizienten Entfernung von LMW-Verunreinigungen, die als eine Gruppe in der ungebundenen Fraktion eluieren. Die Verwendung der Hoch-Liganden-Butyl-Sepharose führt auch zu einem besseren A₃₅₀/A₂₈₀-Verhältnis als die Verwendung des DEAE-Typs der Matrix für Schritt (c).

Claims

Verfahren zum Reinigen rekombinanten Humanserumalbumins (rHSA) aus einer Lösung, wobei das Verfahren umfasst Unterziehen eines Zellkultur-Überstands (CCS), der rHSA umfasst, den folgenden chromatographischen Schritten: (a) Kationenaustausch auf einer bimodalen stark Salz-toleranten Matrix, wobei jeder Ligand zwei Gruppen umfasst, die zum Wechselwirken mit der zu isolierenden Substanz fähig sind; (b) hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC); und (c) Anionenaustausch.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Leitfähigkeit des CCS oberhalb ungefähr 10, wie oberhalb ungefähr 15 und bevorzugt oberhalb ungefähr 20, z.B. ungefähr 25–50 mS/cm liegt, wenn es im Schritt (a) angewandt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die bimodale Kationenaustauschmatrix fähig ist, mit rHSA durch Ladungswechselwirkung und durch Wasserstoffbrückenbindung und/oder hydrophobe Wechselwirkung zu Wechselwirken.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, das auch umfasst eine Wärmebehandlung des CCS vor dem Schritt (a).
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, das auch eine Wärmebehandlung des CCS vor dem Schritt (b) bei Vorhandensein eines Reduktionsmittels umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem Schritt (b) eine HIC-Matrix nutzt, die Phenyl, aliphatische und/oder heterozyklische Liganden umfasst.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Menge der in Schritt (a) verwendeten Kationenaustauschmatrix ungefähr die Hälfte der in Schritt (b) verwendeten Menge der HIC-Matrix beträgt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem Schritt (c) ein Schritt eines schwachen Anionenaustausches ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Ligandendichte des schwachen Anionenaustauschers > 50 μmol/ml Gel/Matrix, bevorzugt > 100 μmol/ml Gel/Matrix und am meisten bevorzugt ungefähr 160 μmol/ml Gel/Matrix beträgt.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem das gereinigte rHSA nur von der gebundenen Fraktion von Schritt (c) wiedergewonnen wird.