DE60204967T2

DE60204967T2 - Verwendung von übersulfatierten polysacchariden als hiv-hemmer

Info

Publication number: DE60204967T2
Application number: DE60204967T
Authority: DE
Inventors: Giorgio Zoppetti; Anna Pasqua ORESTE; Guido Poli; Elisa Vicenzi
Original assignee: SAN RAFFAELE CENTRO FOND; Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor; Glycores 2000 Srl
Current assignee: GLYCORES 2000 S.R.L., MILAN, IT; Fondazione Centro San Raffaele del Monte Tabor
Priority date: 2001-07-27
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2022-07-27
Also published as: ITMI20011633A0; ITMI20011633A1; EP1411956B8; EP1411956B1; DK1411956T3; DE60204967D1; ES2246406T3; US20050009780A1; EP1411956A1; ATE299027T1; CA2454945A1; US7268122B2; PT1411956E; JP2005519860A; WO2003011307A1

Description

Gegenstand der Erfindung
Das erworbene Immunschwächesyndrom (Acquired Immuno Deficiency Syndrome, AIDS) ist zu einer globalen Pandemie geworden, selbst wenn die Todesfälle durch HIV-Infektionen in den Ländern mit einer stabilen Marktwirtschaft beträchtlich zurückgegangen sind, wo Mischungen aus spezifischen Inhibitoren der inversen Transkriptase (RT) und Protease von Virenenzymen in der klinischen Praxis Einzug gehalten haben. Etwa ein Dutzend dieser Arzneimittel sind heutzutage auf dem Markt. Die Behandlung mit diesen Arzneimitteln wird jedoch von schweren Nebenwirkungen begleitet. Außerdem entstehen und verbreiten sich immer mehr HIV-Varianten, die gegenüber den verwendeten Arzneimitteln resistent sind. Da gegenwärtig eine retrovirale Therapie die Virusreplikation vorübergehend stoppt, aber nicht in der Lage ist, das HIV-Virus aus den chronisch infizierten Zellen und damit in den seropositiven Personen auszurotten, ist es von großer Wichtigkeit, neue Klassen von antiviralen Arzneimitteln aufzuspüren, die die derzeit verwendeten Arzneimittel ergänzen und möglicherweise (bei pharmakologischer Resistenz) ersetzen können.
Verschiedene Schritte des Replikationszyklus des HIV-Virus sind potentiell empfindlich gegenüber spezifischen Inhibitoren. Diese können konventionell eingeteilt werden in:

– Aspezifische Bindung des viralen Partikels (Virions) an die Zelloberfläche, gefolgt von der spezifischen Bindung an die CD4+-Zellen durch die Interaktion des Glycoproteins der Virenhülle (gp120 Env), das an der Oberfläche des Virions freiliegt. Die Bindung zwischen gp120 Env und CD4+ ermöglicht durch eine Konformationsänderung die nachfolgende Bindung des gp120 Env mit den Korezeptoren CCR5 und CXCR4 sowie das Einfügen der fuso gen wirkenden Komponente der Virenhülle (gp41 Env) in die Membran der Zielzelle.
– Frühe Ereignisse nach Eintreten des Virus, schematisch unterteilbar in Migration des als Präintegrationskomplex bezeichneten Komplexes vom Cytoplasma zum Kern zeitlich zusammenfallend mit dem Retrotranskriptionsprozess des Virengenoms von der RNA zur DNA und schließlich die Integration der Viren-DNA in die Chromosomen der infizierten Zelle (Provirus).
– Späte Entwicklungen im Lebenszyklus des HIV-Virus, zu denen die Transkription der Virengene bis zur Synthese von neuen Virusproteinen gehört, deren Einbau in die Innenfläche der Zelle sowie die Knospenbildung von neuen Virionen, die sich von der infizierten Zelle ablösen, um einen neuen Infektionszyklus zu beginnen.

Die früheste Phase des Infektionsvorgangs ist das Anhaften des Virions an der Zellmembran, das unabhängig von der Interaktion von gp120 Env mit den spezifischen Rezeptoren der Wirtszelle erfolgt. Von den verschiedenen vorgeschlagenen Mechanismen beinhaltet die zuverlässigste Methode die Assoziierung von positiv aufgeladenen gp120 Env-Bereichen mit den negativ geladenen Membran-Heparansulfaten (Proteoglycane). Tatsächlich binden die Polyanionen das gp120 Env-Molekül vieler Virusisolate wirksam und zeigen damit in vitro eine große antivirale Wirkung und stellen dadurch potentielle therapeutische Mittel dar.
Stand der Technik
Es ist bekannt, dass das Kapselpolysaccharid K5, das aus einem E.coli-Stamm isoliert (nachstehend einfach als „K5" bezeichnet) und von W. F. Vann et al. (1981) in Eur. J. Biochem. 116, 359–364 beschrieben wurde, die gleiche Sequenz aufweist wie die biosynthetische Vorstufe von Heparin und Heparansulfat (N-Acetylheparosan) und chemisch aus repetitiven Disaccharideinheiten aufgebaut ist, die aus α (1–4) miteinander verknüpfter D-Glucuronsäure und N-Acetyl glucosamin gebildet werden, während die Disaccharideinheiten D-Glucuronyl-N-Acetylglucosamin β(1–4)- verknüpft sind. Der einzige Unterschied zwischen der Heparinvorstufe N-Acetylheparosan und dem K5-Polysaccharid, der für die biologischen Aktivitäten von K5 und seinen Derivaten irrelevant ist, besteht im Vorhandensein einer Doppelbindung in der Position 4(5) am nicht-reduzierenden Ende einiger Ketten des K5-Polymers, wie es zum Beispiel in der EP 489 647 und der EP 544592 beschrieben wurde, die nachstehend erwähnt werden.
Nach dieser ersten Veröffentlichung haben andere Schriften und Patentanmeldungen die Herstellung des E.coli K5-Polysaccharids mit einem Molekulargewicht beschrieben, das zwischen wenigen Tausend und vielen Hunderttausend Dalton lag und von chemisch oder enzymatisch modifizierten K5-Polysacchariden, um zum Beispiel N- und/oder O-sulfatierte Erzeugnisse oder möglicherweise N,O sulfatierte und in Position 5 der Glucuronsäure epimerisierte Erzeugnisse herzustellen, um Heparin ähnliche Produkte zu erzeugen. Es werden beispielsweise die EP 333 243 , IT 1 230 785 , EP 489 647 , EP 544 592 , WO 92/17507, WO 96/14425, WO 97/43317, WO 98/34958, WO 98/42754, WO 01/02597, WO 02/068477, die Schrift von M. Manzoni et al. (1996, Journal Bioactive Compatible Polymers, 11, 301–311 und die Schrift von D. Leali et al. (2001), Journal of Biological Chemistry, 276 (41), 37900–37908 zitiert.
Von diesen Dokumenten beschreibt insbesondere die EP 333 243 O-sulfatierte K5-Präparate, die möglicherweise für die Behandlung von pathologischen Befunden aufgrund von Viren mit einer Hülle wie der Herpes-simplex-Virus, der Vesikular Stomatitis-Virus, der Typ 1 HIV-Virus (HIV-1) und der Typ 2 HIV-Virus (HIV-2) geeignet sind. Dieses Dokument beschreibt O-sulfatierte K5-Polysaccharide, die höchstens 1,25 Sulfatgruppen pro Saccharideinheit aufweisen (entsprechend 2,5 Sulfatgruppen pro Disaccharid), ein Tetrasaccharid, ein Hexasaccharid und ein Oktosaccharid, die 3,4, 3,2 bzw. 1,5 Sulfatgruppen pro Disaccharideinheit enthalten.
Darüber hinaus beschreibt die WO 98/34958 O-sulfatierte Derivate von K5-Polysacchariden mit einem Verhältnis von Sulfat/Carboxyl zwischen 0,5 und 4 mit antimetastatischer und antiviraler Wirksamkeit, insbesondere O-sulfatiertes K5 mit einem Sulfatierungsgrad von 2,5 bis 4. Gemäß diesem Dokument zeigen die am höchsten sulfatierten Verbindungen (Sulfat/Disaccharid > 2,5) eine interessante Anti-HIV-Wirksamkeit.
Die N,O-sulfatierten Derivate von K5, die in diesen Unterlagen beschrieben werden, insbesondere in der EP 489 647 , EP 544 592 und WO 98/09636, weisen einen Sulfatierungsgrad von 1,6 bis 3,1 auf, während der Sulfatierungsgrad von O-sulfatiertem K5 den Wert 4 erreichen kann. Die WO-02/068477 offenbart N,O-übersulfatiertes K5 mit einem Sulfatierungsgrad von mehr als 3,2 mit einer Wirksamkeit gegen freie Radikale sowie dessen Herstellung. Leali et al. (2001), Journal of Biological Chemistry, 276 (41), 37900–37908, beschreibt hoch N,O-sulfatierte K5 Polysaccharide mit einem Verhältnis Sulfat/Carboxyl von 3,84 mit angiostatischer Wirksamkeit und niedriger antikoagulierender Wirksamkeit. Andererseits wurde die anti-HIV-Wirksamkeit der bekannten N,O sulfatierten K5-Derivate niemals beschrieben.
Casu et al. (1994), Carbohydrate Research, 263, 271–284 beschreiben die N-Deacetylierung von K5, die N-Sulfatierung und drei Verfahren zur O-Sulfatierung, die als B, C und AC bezeichnet werden. Gemäß Verfahren C, bei dem die Sulfatierung des N-Sulfat-K5 unter Verwendung von 10 Moläquivalent Sulfatierungsmittel pro freie Hydroxylgruppe bei einer Temperatur von 25–55°C für einen Zeitraum zwischen 1 und 24 Stunden durchgeführt wird, entstehen polysulfatierte Verbindungen nach einer weiteren N-Sulfatierung mit einem maximalen Sulfat/Carboxyl-Verhältnis von 3,1.
Nachstehend werden die K5-Derivate auch wie folgt bezeichnet: „N-deacetyliertes K5" steht für N-deacetyliertes K5-Polysaccharid, „N-sulfatiertes K5" für N-deacetyliertes-N-sulfatiertes K5-Polysaccharid, „N,O-sulfatiertes K5" für N-deacetyliertes-N,O-sulfatiertes K5-Polysaccharid und „N,O-übersulfatiertes K5" für N-deacetyliertes-N,O-sulfatiertes K5-Polysaccharid mit einem hohen Sulfatierungsgrad, das mit dem Verfahren C der vorgenannten Schrift von Casu et al. herstellbar ist.
Der Ausdruck „O-Übersulfatierungsbedingungen" bezeichnet die Bedingungen für eine erschöpfende O-Sulfatierung, wie die des vorgenannten Verfahrens C. Mit „Sulfatierungsgrad" wird die Anzahl der Sulfatgruppen pro Disaccharideinheit bezeichnet, ausgedrückt als Verhältnis Sulfat/Carboxyl (SO₃ ^–/COO^–).
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung basiert auf der Hypothese, dass durch Erhöhen der Anionenaktivität der N,O-sulfatierten Polysaccharide von K5 N,O-übersulfatierte K5-Derivate mit einer hohen anti-HIV-Wirksamkeit hergestellt werden können, und somit für die Behandlung des als AIDS bekannten erworbenen Immunschwächesyndroms geeignet ist. Eine solche Hypothese trifft jedoch auf das Problem, dass die N,O-Sulfatierung des vorher N-deacetylierten K5 nur schwer abläuft.
Man hat herausgefunden, dass durch Reinigen des durch Fermentation gewonnenen K5 mittels einer Behandlung mit Isopropanol in einer hochsalzigen Lösung ein reines K5-Polysaccharid hergestellt wird, das im wesentlichen frei von lipophilen Substanzen ist und dass durch N-Deacetylierung, N-Sulfatierung, O-Sulfatierung unter O-Übersulfatierungsbedingungen und optional einer weiteren N-Sulfatierung des genannten, von lipophilen Substanzen befreiten K5 N,O-übersulfatierte K5-Derivate mit einem Sulfatierungsgrad von mehr als 3,2 erzeugt werden. Diese N,O-übersulfatierten K5-Derivate zeigen eine interessante Wirksamkeit bei der Hemmung des Eindringens und der Replikation des HIV-Virus bei einem günstigen Verhältnis hinsichtlich der antikoagulierenden Gesamtwirksamkeit und können somit für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Behandlung von HIV-Infektionen verwendet werden, insbesondere nützlich, um das erworbene Immunschwächesyndrom mit Dosierungen zu bekämpfen, durch die das Risiko von hämorrhagischen Nebenwirkungen stark reduziert wird.
Insbesondere haben wir bewiesen, dass N,O-übersulfatierte K5-Derivate mit einem Sulfatierungsgrad von mehr als 3,2 eine hohe Hemmwirkung auf dualtrope Virusstämme haben, die sowohl den CCR5- als auch den CXCR4-Korezeptor (R5X4-Stämme) nutzen und die während der späten Phasen der HIV-Infektion entstehen.
Die genannten Stämme entstehen in 50 % der seropositiven Personen in den späten Phasen der Infektion und es wurde nachgewiesen, dass sie ein beschleunigtes Fortschreiten der Erkrankung verursachen können.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von N,O-übersulfatierten K5-Derivaten mit einem Sulfatierungsgrad von mehr als 3,2 oder von ihren pharmazeutisch akzeptablen Salzen zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Bekämpfung der HIV-Infektion und der daraus folgenden AIDS-Erkrankung, die die genannte HIV-Infektion als alleinige Ursache hat.
Die N,O-übersulfatierten K5-Derivate der vorliegenden Erfindung zeigen eine ausgeprägte Wirksamkeit bei der Unterdrückung der Replikation von verschiedenen HIV-1-Stämmen in primären CD4+-Zellen, die aus peripherem Venenblut von gesunden seronegativen Erwachsenen stammen und durch Ficoll-Gradient-Separation hergestellt wurden, von dem Ring, von dem die Fraktion von mononuklearen Zellen gewonnen wurde (PBMC), die dann mit Phytohämagglutinin (PHA) für 3 Tage stimuliert und nachfolgend in einem Medium gehalten wurden, das mit Interleukin-2 (IL-2) angereichert war (PHA-Blasten). Eine zweite Fraktion von PBMC wird einem zweiten Percoll-Gradienten-Verfahren unterworfen, um die Monozyten zu isolieren, die für 5–7 Tage in Adhärenz ausgesät werden, um in vitro gewonnene Makrophagen (MDM) herzustellen, die empfindlich gegenüber der HIV-Infektion sind.
Insbesondere haben die N,O-übersulfatierten K5-Derivaten mit einem Sulfatierungsgrad von mehr als 3,2 eine hohe Hemmwirkung auf die dualtropen Stämme R5X4, die während der späten Phasen der HIV-Erkrankung erzeugt werden. Diese Hemmwirkung ist auch größer als die von den O-sulfatierten K5-Derivaten mit dem gleichen Sulfatierungsgrad ausgeübte, wie sie in der WO 98/34958 beschrieben ist.
Vorteilhafterweise hat das N,O übersulfatierte K5, das für eine solche Anwendung eingesetzt wird, einen Sulfatierungsgrad von 3,2 bis 4, besser noch von 3,5 bis 4, vorzugsweise von 3,7 bis 4.
Von den Salzen des genannten N,O übersulfatierten K5 werden die Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium- und Zinksalze bevorzugt.
Die N,O-übersulfatierten K5-Derivate der Erfindung weisen vorzugsweise durchschnittliche Molekulargewichte im Bereich zwischen 2.000 und 65.000, günstigerweise zwischen 2.500 und 20.000 Dalton (D) auf. Es ist beabsichtigt, dass alle hier nachstehend angegebenen Molekulargewichte in Dalton zu verstehen sind und gemäss Harenberg et al., Journal Chromatography (1983), 261, 287–292 berechnet wurden.
Die N,O-übersulfatierten K5-Derivate der vorliegenden Erfindung werden durch ein Verfahren hergestellt, das folgende Schritte umfasst:

(a) Behandeln eines durch Fermentation gewonnenes K5 mit Isopropanol in einer stark salzhaltigen Lösung;
(b) Durchführung einer N-Deacetylierung durch alkalische Hydrolyse und einer nachgeschalteten N-Sulfatierung mit einem N-Sulfatierungsmittel an dem derart gereinigten K5;
(c) Behandeln eines Ammoniumsalzes des derart hergestellten N-Sulfat-K5 mit einem O-Sulfatierungsmittel unter O-Übersulfatierungsbedingungen;
(d) sofern erforderlich, Durchführung einer N-Sulfatierung an dem so entstandenen Produkt und Isolieren des N,O-übersulfatierten K5 als Natriumsalz, das wenn notwendig, in ein anderes Salz umgewandelt wird.

In Schritt (a) kann das K5-Ausgangsmaterial eines der Produkte sein, die durch Fermentation von wilden oder geklonten Escherichia coli-Stämmen zur Herstel lung von K5 gewonnen wurden. Insbesondere das in der Literatur, wie sie oben zitiert wird, beschriebene K5 kann verwendet werden, günstigerweise das von M. Manzoni et al. in Journal Bioactive and Compatible polymers, 1996, 11, 301–311 beschriebene und das hier nachstehend in HERSTELLUNG I dargestellte.
Noch günstiger ist es, wenn das K5-Ausgangsmaterial ein niedriges Molekulargewicht hat, insbesondere bei einer Molekulargewichtsverteilung von 1.500 bis 15.000, von vorzugsweise zwischen 2.000 bis 9.000, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5.000, oder ein höheres durchschnittliches Molekulargewicht, insbesondere bei einer Verteilung von 10.000 bis 50.000, von vorzugsweise 20.000 bis 40.000, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 30.000. Das K5-Ausgangsmaterial hat vorzugsweise eine Molekulargewichtsverteilung von 1.500 bis 50.000 mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20.000 bis 25.000.
Es ist beabsichtigt, das Molekulargewicht von K5 und der hier beschriebenen Derivate als unter Verwendung von Heparinfraktionen mit bekanntem Molekulargewicht als Standards berechnet zu betrachten.
Das Ausgangsprodukt kann ein zuvor gereinigtes K5 sein, aus dem zum Beispiel die Endotoxine, die Pyrogene oder andere Verunreinigungen durch bekannte Verfahren entfernt wurden.
Sofern das am Ende von Schritt (a) gewonnene K5 für pharmazeutische Zwecke oder für die Herstellung von N,O-sulfatiertem K5 für die pharmazeutische Verwendung eingesetzt wird, ist es wahrscheinlich, dass es von Endotoxinen und Pyrogenen gereinigt werden kann.
In der Praxis wird das Ausgangs-K5 in 2–5 M Salzlösung, vorzugsweise von Natriumchlorid, bei einer Konzentration von 0,5 bis 10% gelöst, wobei die so entstandene Lösung, die durch weiteren Zusatz von Salz, vorzugsweise Natriumchlorid, auf 2–4 M eingestellt wird, mit 1–3 Volumen Isopropanol bei einer Temperatur von 0–8°C behandelt wird.
Nach 1–18 Stunden bei derselben Temperatur fällt das Produkt von Schritt (a) vollständig aus und wird durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt. Falls die Reinheit des Produkts noch nicht zufriedenstellend ist, wird der Vorgang von Schritt (a) wiederholt. Das auf diese Weise entstandene Feststoffprodukt wird wieder in Wasser aufgelöst und durch Ultrafiltration auf einer Membran zurückgewonnen.
Am Ende von Schritt (a) liegt ein K5 vor, das die gleichen Eigenschaften aufweist wie das Ausgangsmaterial, das aber im wesentlichen frei von lipophilen Substanzen ist.
In der Praxis kann das von lipophilen Substanzen befreite K5 durch ein Verfahren gewonnen werden, umfassend die Schritte: (a1) Behandeln eines durch Fermentation hergestellten K5, das in einer 4 M Lösung aus Natriumchlorid bei 4°C gelöst ist, mit 1 Volumen Isopropanol, (a2) Einstellen der Salzlösung auf 3 M durch Zugabe der berechneten Menge einer gesättigten Natriumchloridlösung, (a3) Halten der Lösung bei 4°C über Nacht und (a4) Isolieren des Produkts durch Zentrifugieren und Entfernen der Salze durch Ultrafiltration.
Durch die Reinigung mit Isopropanol ist es deshalb möglich, ein von lipophilen Substanzen befreites K5 mit einer Reinheit von mehr als 99% zu gewinnen. Dieses K5 ermöglicht eine hohe O-Sulfatierung im nächsten Schritt (c).
In Schritt (b) wird die N-Deacetylierung gemäss den bekannten Verfahren der alkalischen Hydrolyse durchgeführt, zum Beispiel mit Hydrazinsulfat in Hydrazin oder mit einer Base wie beispielsweise ein basisches Hydroxid, zum Beispiel Natrium- oder Kaliumhydroxid, in Wasser. Vorzugsweise wird die Reaktion in einer wässrigen Lösung von Natriumhydroxid bei einer Temperatur von 40–80°C durchgeführt, indem der Verlauf der Reaktion gesteuert wird. In der Regel ist die N-Deacetylierung nach höchstens 30 Stunden, in der Praxis jedoch nach 12–24 abgeschlossen und die Basizität des Mediums wird durch die Behandlung mit einer Säure, vorzugsweise Salzsäure, neutralisiert.
Die K5 und die Salze enthaltende Lösung wird anschliessend mit einem N-Sulfatierungsmittel behandelt, wie z.B. dem Addukt einer tertiären organischen Base mit Schwefelanhydrid (Schwefeltrioxid), wie z.B. Pyridin-Schwefeltrioxid (C₅H₅N.SO₃) oder einem Trialkylamin-Schwefeltrioxid, wie z.B. Trimethylamin-Schwefeltrioxid in Gegenwart eines Alkalicarbonats wie beispielsweise Natriumcarbonat. Die Reaktion kann bei Raumtemperatur (20–30°C) durchgeführt werden, es ist jedoch auch möglich, bei höheren Temperaturen zu arbeiten (bis zu 65°C), um die Reaktionsdauer zu verkürzen. Die Zugabe des Alkalicarbonats und des Sulfatierungsmittels kann gleichzeitig erfolgen, oder das Alkalicarbonat wird auf einmal zugesetzt und das Sulfatierungsmittel anschließend stufenweise zugefügt, in einer Zeitspanne, die von 5 Minuten bis 12 Stunden reichen kann. Am Ende der Reaktion wird die Mischung bei Raumtemperatur mit Hilfe einer Säure, vorzugsweise Salzsäure, auf einen pH von 7,5–8 gebracht, und die Salze werden, zum Beispiel durch Diafiltration, entfernt. Die so gewonnene Lösung, die N-Sulfat-K5 in Form eines Alkalisalzes enthält, kann zum nachfolgenden Schritt (c) weitergeleitet oder aufkonzentriert werden, wobei das N-Sulfat-K5 als Natriumsalz durch konventionelle Verfahren isoliert werden kann. Das so gewonnene N-Sulfat-K5 ist zu 90–100% sulfatiert.
In Schritt (c) wird eine Lösung, die das alkalische N-Sulfat-K5 enthält, wie in Schritt (b) hergestellt, auf ein kationisches Austauscherharz geleitet, wie z.B. IR 120 H+, bis ein saurer pH-Wert erreicht ist. Die so gewonnene Säurelösung wird mit einer tertiären oder quaternären organischen Base, zum Beispiel mit einem Trialkylamin wie Tributylamin, oder mit einem Tetralkylammoniumhydroxid, vorzugsweise Tetrabutylammoniumhydroxid behandelt, auf das Mindestvolumen reduziert und gefriergetrocknet. Das so isolierte Ammoniumsalz des N-Sulfat-K5 wird in einer polaren aprotischen Lösung suspendiert, wie zum Beispiel Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid, und mit einem O-Sulfatierungsmittel behandelt, zum Beispiel mit dem Addukt C₅H₅N.SO₃. Das Addukt C₅H₅N.SO₃ kann entweder im festen Zustand oder in Lösung in der gleichen polaren aprotischen Lösung verwendet werden. Die Sulfatierung wird während einer Zeitdauer von 2 bis 24 Stunden bei einer Temperatur durchgeführt, die von der Raumtemperatur (20-30°C) bis 70°C, vorzugsweise von 40 bis 60°C variieren kann.
Am Ende der Reaktion wird die Lösung bei Raumtemperatur mit Natriumchlorid gesättigtem Aceton behandelt, bis eine vollständige Ausfällung erreicht ist. Der Niederschlag wird von der Lösung durch Filtration abgetrennt, in einer Mindestmenge entionisierten Wassers, zum Beispiel 100 ml, gelöst, wobei Natriumchlorid der Lösung zugefügt wird, bis eine 0,2 M Konzentration erreicht ist. Die Lösung wird durch 2N Natriumhydroxid auf einen pH von 7,5–8 eingestellt und mit Aceton behandelt, bis eine vollständige Fällung erreicht ist. Nach der Filtration wird der Feststoff in 100 ml entionisiertem Wasser gelöst und von den restlichen Salzen durch Ultrafiltration, wie in Schritt (b) beschrieben, gereinigt.
Wenn bei der ¹³C-NMR-Analyse einer gefriergetrockneten Probe des so gewonnenen Produkts erkennbar ist, dass eine partielle N-Desulfatierung während der Übersulfatierung stattgefunden hat, wird das Produkt dem Schritt (d) unterzogen.
In Schritt (d) wird das am Ende von Schritt (c) gewonnene Produkt mit einem N-Sulfatierungsmittel behandelt, indem unter den Bedingungen verfahren wird wie in Schritt (b), bis eine vollständige N-Sulfatierung erreicht ist, wobei der Vorgang wiederholt wird, wenn die N-Sulfatierung nicht vollständig ist.
Das so gewonnene N,O-übersulfatierte K5 wird als Natriumsalz isoliert, das durch bekannte Verfahren in ein anderes Salz, wie z.B. Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium-, Zink- oder ein Komplexsalz umgewandelt werden kann, zum Beispiel durch Ionenaustausch mit einem geeigneten Harz, durch Fällung mit Lösungsmitteln oder durch Ultrafiltration mittels Membrane.
Die Reinheit des neuen gereinigten K5 aus der Fermentation kann mit Hilfe des ¹H-NMR-Spektrums, UV-Spektrums, durch Carbazolreaktion oder durch eine Ausrüstung für die Proteinbestimmung geprüft und analysiert werden. Durch diese Analysen wurde gezeigt, dass das am Ende von Schritt (a) gewonnene K5 als wesentliches Merkmal ein ¹H-NMR-Spektrum aufweist, in welchem die Signale im Feld unterhalb von 1,5 ppm fehlen. Außerdem sind keine Nukleinsäuren nachweisbar (Absorbanz 0 bei 260 mm bei einem Standard UV-Spektrophotometer) und der Proteingehalt gemäß BioRad-Instrumenten liegt nicht über 0,5 %, günstigerweise unter 0,25%, noch besser unter 0,1 % und vorzugsweise unter 0,03%.
Das am Ende von Schritt (a) gewonnene neue reine K5 ist tatsächlich frei von lipophilen Substanzen und Nukleinsäuren. Die Verwendung von „im wesentlichen" bezogen auf das Fehlen von lipophilen Substanzen und von „nicht nachweisbar" im Zusammenhang mit den Nukleinsäuren berücksichtigt die Empfindlichkeit der verwendeten Instrumente, die das Vorhandensein der vorgenannten Verunreinigungen nicht angezeigt haben.
Somit wurde festgestellt, dass dem ¹H-NMR-Spektrum des derart hergestellten reinen K5-Polysaccharids die Signale bei < 1,5 ppm fehlen, die charakteristisch sind für die Methylgruppe von lipophilen Substanzen.
Die neuen derart gereinigten K5-Präparate, die die Herstellung von N,O-übersulfatiertem K5 mit einem hohen Sulfatierungsgrad ermöglichen, weisen vorzugsweise ein niedriges Molekulargewicht auf, insbesondere bei einer Verteilung von 1.500 bis 15.000, vorzugsweise von 2.000 bis 9.000, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 5.000, oder ein höheres Molekulargewicht, insbesondere bei einer Verteilung von 10.000 bis 50.000, vorzugsweise von 20.000 bis 40.000, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 30.000. Vorzugsweise hat das K5-Ausgangsmaterial eine Molekulargewichtsverteilung von 1.500 bis 50.000 mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20.000 bis 25.000.
Die gemäß dem vorstehenden Verfahren gewonnenen N,O-übersulfatierten K5-Derivate, speziell in ihrer pharmazeutisch akzeptablen Form, sind stark anionische Produkte, die für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen mit antiviraler Wirksamkeit nützlich und insbesondere für die Behandlung von HIV-Infektionen und AIDS, welches eine Folge davon ist, geeignet sind.
Die genannten N,O-übersulfatierten K5-Derivate weisen einen hohen Sulfatierungsgrad von mehr als 3,2, günstigerweise von 3,2 bis 4, noch besser von 3,5 bis 4 und vorzugsweise von 3,7 bis 4 auf.
In vorteilhafter Weise hat das genannte N,O-übersulfatierte K5 ein niedriges Molekulargewicht, insbesondere bei einer Verteilung von 2.000 bis 16.000, vorzugsweise von 2.500 bis 10.000, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 6.500, oder ein etwas höheres Molekulargewicht, insbesondere bei einer Verteilung von 13.000 bis 65.000, vorzugsweise von 25.000 bis 50.000, mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 40.000. Vorzugsweise weist das N,O-übersulfatierte K5-Ausgangsmaterial der Erfindung eine Molekulargewichtsverteilung von 2.000 bis 65.000 mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 25.000 bis 30.000 auf. Darüber hinaus bildet N,O-übersulfatiertes K5 mit sehr niedrigem durchschnittlichen Molekulargewicht, zum Beispiel 2.000 bis 5.000, das durch Depolymerisation gewonnen wird, sehr interessante Produkte.
Die Depolymerisation, die die Herstellung von N,O-übersulfatierten K5-Derivaten mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 2000 bis 5000 ermöglicht, kann am Ende einer der Schritte (b) bis (d) des oben dargestellten Verfahrens durchgeführt werden, vorzugsweise am Ende von Schritt (b) oder an dem am Ende entstehenden N,O übersulfatierten K5.
Die Depolymerisation kann nach irgendeinem der bekannten Verfahren für die Depolymerisation von Heparin durchgeführt werden, zum Beispiel durch salpetrige Säure und nachfolgender Reduktion mit Natriumborhydrid ( EP 37319 ), durch Perjodat ( EP 287477 ), durch freie Radikale ( EP 121067 ) oder durch β-Eliminierung ( EP 40144 ). Im Fall von N,O-übersulfatiertem K5 wird die Depolymerisation günstigerweise an einem N-Sulfat-K5, das am Ende von Schritt (b) gewonnen wird, mit salpetriger Säure und nachfolgender Reduktion mit Natriumborhydrid durchgeführt, wie in der EP 544592 im Einzelnen beschrieben wird. Am Ende der Depolymerisation und Reduktion wird das auf diese Weise gewonnene Produkt mit niedrigem Molekulargewicht den Schritten (c) und wahlweise (d) unterzogen und das N,O-übersulfatierte K5 isoliert.
Alternativ kann das gleiche Depolymerisationsverfahren auf ein N,O-übersulfatiertes K5 mit hohem Molekulargewicht angewendet werden und man erhält das entsprechende Produkt mit niedrigem Molekulargewicht.
Von den Salzen der vorgenannten N,O-übersulfatierten K5-Derivate werden die Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium- und Zinksalze bevorzugt.
Die heutzutage für die Therapie von HIV-Infektionen verwendeten Wirkstoffe greifen in zwei fundamentale Lebensphasen des Virus ein: in die Retrotranskription und die Zersetzung des Gag Polyproteins in seinen reifen Formen durch die virale Protease. Aufgrund der Entdeckung der Chemokine-Rezeptoren CCR5 und CXCR4 als für die Infizierung von Lymphozyten- und Makrophagen-CD4⁺ bereite Korezeptoren des HIV, umfasst eine potentielle neue Klasse von antiviralen Arzneimitteln Moleküle, die in der Lage sind, die Bindung des Virus an das CD4-Molekül und/oder an den Chemokine-Rezeptor zu hemmen und/oder den Fusionsvorgang der viralen und zellulären Membrane zu hemmen, der durch das Hüllenglycoprotein gp41 vermittelt wird (Moore J. P., und Stevenson M., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2000, 1:40–49). In diesem Zusammenhang hat die Entwicklung von Stoffen, die das Eindringen von dualtropen Viren R5X4 hemmen, die also in der Lage sind, die CD4+-Zellen zu infizieren, die mit CCR5 und CXCR4 wechselwirken, eine große Relevanz beim Verhindern der Evolution von HIV-1 der B-Gruppe, das in den USA, Kanada, Australien und Europa dominant ist, wobei diese Evolution mit einem beschleunigten Fortschreiten der Erkrankung verbunden ist (Koot M., et al., Ann. Intern. Med. 1993, 118:681–688). Die Anti-HIV-Wirksamkeit wurde am HIV-1-Virus sowohl an PHA-Blasten als auch an Makrophagen getestet, die von der Adhäsion von Monozyten (MDM) des peripherem Blut gewonnen wurden. Der Virusstamm HIV-1_Bal, der nur den Korezeptor CCR5 nutzt, wurde sowohl für die Infizierung der Blasten als auch der MDM verwendet, während der dualtrope Stamm, der neben dem CCR5 auch den Korezeptor CXCR4 nutzt (R5X4-Virus) und der Stamm, der nur den Korezeptor CXCR4 nutzt (XR-Stamm) nur für die Infizierung der Blasten eingesetzt wurden. Diese Stämme (R5X4 und X4) werden während der späten Phasen der Infektion erzeugt, der Virus kann sein Infektions vermögen auf Zellen ausdehnen, die neben CCR5 auch den Rezeptor CXCR4 ausprägen.
Die Viren werden einer Multiplizität der Infektion (MOI) (Anzahl der infektiösen Viruseinheiten/Anzahl der Zielzellen) von 0,1 zugefügt. Aliquote Teile des Überstands der Kulturen werden alle 48–72 Stunden entnommen und die RT-Virusaktivität, die im Überstand der Kulturen vorhanden ist, wie von Vicenzi et al. (J. Virol. 73:7517–7523, 1999) beschrieben, geprüft. Da das RT-Enzym zu 99% mit den Virionen verbunden ist, entspricht die Bestimmung seiner Aktivität der Bestimmung des Vorhandenseins von viralen Partikeln in der genannten Flüssigkeit. Die RT-Aktivität erreicht einen Höhepunkt und fällt dann aufgrund des zytopathischen Effekts des Virus auf die Zellen ab. Der RT-Spitzenwert wird dann als Index benutzt, um die Konzentration des potentiellen Antivirusmittels zu berechnen.
Das gemäß der HERSTELLUNG III gewonnene N,O-übersulfatierte K5, das die vorliegende Erfindung darstellt und das einen Sulfatierungsgrad von 3,84 aufweist und als K5 N,OS(H) bezeichnet wird, wurde mit zwei weiteren Derivaten von K5-Polysacchariden verglichen, insbesondere mit einem N,O-sulfatierten K5, das einen Sulfatierungsgrad von 1,77 aufweist und mit K5 N,OS(L) bezeichnet ist und das, wie in HERSTELLUNG V beschrieben, hergestellt wurde, sowie mit einem O-sulfatierten K5, das einen Sulfatierungsgrad von 3,77 hat, mit K5 OS(H) bezeichnet ist und das, wie in HERSTELLUNG VI beschrieben, gewonnen wurde.
Die Replikation von HIV-I in PHA-Blasten und auch in MDM wird durch die Präparate gehemmt, die in vitro bei Konzentrationen im Bereich von 1 und 100μg/ml getestet wurden. Das repräsentative Präparat der vorliegenden Erfindung, K5 N,OS(H), hemmt jedoch die dualtropen Stämme R5X4, die während der fortgeschrittenen Stadien der Infektion auftreten, bereits bei einer Konzentration von 1 μg/ml zu 99%, während die zwei Vergleichsprodukte K5-OS(H) und K5 N,OS(L) die gleichen Stämme bei einer Konzentration von 10 bzw. 100 μg/ml zu 98% hemmen. Außerdem ist das K5 N,OS(H) wie auch das K5 OS(H) bei allen anderen Stämmen aktiv, wenn es bei Konzentrationen von 1–10 μg/ml verwendet wird, was zeigt, dass sie immer aktiver sind als das K5 N,OS(L).
Für die absehbaren therapeutischen Verwendungen werden die oben genannten N,O-übersulfatierten K5-Derivate und ihre Salze gemäß konventionellen Methoden in geeigneten Verabreichungsformen zubereitet, wie z.B. sterile Lösungen, topische Dosierungsformen und allgemein in all jenen Formen, die bis heute für Polysaccharid- oder Glycosaminoglycan-Derivate vorgeschlagen wurden. Dabei werden die therapeutischen Dosen in Analogie zu den für die bekannten natürlichen Präparate bereits untersuchten Dosierungen gewählt.
Die Verabreichung des N,O-übersulfatierten K5 kann auf oralem, transdermalem oder vorzugsweise parenteralem Wege erfolgen, insbesondere subkutan, intramuskulär oder intravenös oder auf topischem Wege.
Bei Menschen ist die tägliche Dosis bei einer parenteralen Verabreichung mit 0,5-500 mg/Kg/die vorgesehen, günstigerweise 5–250 mg/Kg/die, vorzugsweise 10-150 mg/Kg/die, während die für die topische Verabreichung vorgesehene Dosis bei 1–1000 mg/Kg/die, vorteilhafterweise bei 10–500 mg/Kg/die und vorzugsweise bei 20–100 mg/Kg/die liegt.
Für ihre Verabreichung stellen die N,O-übersulfatierten K5-Derivate, die einen Sulfatierungsgrad von mehr als 3,2, günstigerweise von 3,2 bis 4, noch günstiger von 3,5 bis 4, vorzugsweise von 3,7 bis 4 aufweisen, oder ihre Salze somit aktive Bestandteile dar, die in pharmazeutischen Zusammensetzungen zubereitet sind, die für die Behandlung der HIV-Infektionen, insbesondere des erworbenen Immunschwächesyndroms, geeignet sind.
Das genannte N,O-übersulfatierte K5 kann einen der oben dargestellten Kennwerte des Sulfatierungsgrades aufweisen.
Ein Salz, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium- und Zinksalzen besteht, bildet einen geeigneten aktiven Bestandteil der Zusammensetzungen.
In den pharmazeutischen Zusammensetzungen zur oralen, subkutanen, intravenösen, transdermalen oder topischen Verabreichung werden die aktiven Inhaltsstoffe vorzugsweise in Form von Dosierungseinheiten in Beimischung mit den klassischen pharmazeutischen Arzneistoffträgern und Vehikeln verabreicht. Die Dosis kann in Abhängigkeit vom Alter, Gewicht und Gesundheitszustand des Patienten sowie von der Schwere der Infektion und vom Verabreichungsweg stark variieren. Diese Dosis umfasst die Verabreichung einer Dosierungseinheit von 1 bis 1000 mg, günstigerweise von 10 bis 750 mg, vorzugsweise von 250 bis 500 mg des aktiven Bestandteils, von ein bis drei Mal täglich auf intravenösem, subkutanem, oralem, transdermalem oder topischem Wege.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung:
HERSTELLUNG I
Herstellung des K5-Polysaccharids aus Escherichia coli
Als erstes wird eine Fermentation im Glaskolben unter Verwendung des folgenden Mediums durchgeführt:

Entfettetes Soja 2 g/l

K₂HPO₄ 9,7 g/l

KH₂PO₄ 2 g/l

MgCl₂ 0,11 g/l

Natriumcitrat 0,5 g/l

Ammoniumsulfat 1 g/l

Glucose 2 g/l

Wasser 1.000 ml

pH = 7,3
Das Medium wird bei 120°C für 20 Minuten sterilisiert. Die Glukose wird separat als Lösung hergestellt, die bei 120°C für 30 Minuten sterilisiert und steril dem Medium zugesetzt wird. Der Glaskolben wird mit einer Suspension von E.coli-Zellen Bi 8337/41 (O10:K5:H4) von einem Schrägagarröhrchen geimpft, das in Trypton- Soja-Agar gehalten und bei 37°C für 24 Stunden bei kontrolliertem Rühren (160 U/Min, 6 cm Lauflänge) inkubiert wurde. Das Bakterienwachstum wird durch Zellzählung unter einem Mikroskop gemessen. In einem weiteren Schritt wird ein Chemap-Braun-Fermenter mit einem Volumen von 14 Litern, der das gleiche Medium wie oben enthält, mit 0,1% der obigen Glaskolbenkultur geimpft und die Fermentation mit einer Belüftung von 1 vvm (vvm = Volumen Luft pro Volumen Flüssigkeit pro Minute), einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/Min und einer Temperatur von 37°C für 18 Stunden durchgeführt. Während der Fermentation werden pH, Sauerstoff, Restglukose, erzeugtes K5-Poly-Saccharid und bakterielles Wachstum gemessen. Am Ende der Fermentation wird die Temperatur auf 80°C für 10 Minuten angehoben. Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 10.000 U/Min vom Medium getrennt und der Überstand durch ein SS316 (MST)-Modul ultrafiltriert, der mit PES-Membranen mit einer nominalen Porengröße (Cut-off-Wert) von 800 und 10.000 D ausgestattet ist, um das Volumen auf 1/5 zu reduzieren. Anschließend wird das K5-Polysaccharid durch Zugabe von 4 Volumen Aceton bei 4°C ausgefällt und über Nacht bei 4°C zum Absinken stehen gelassen und schließlich bei 10.000 U/Min für 20 Minuten zentrifugiert oder filtriert. Sodann wird eine Deproteinierung unter Verwendung einer Protease des Typs II von Aspergillus Orizae in 0,1 M NaCl und 0,15 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) bei pH 8, die 0,5 % Natriumlaurylsulfat (SDS) (10 mg/l des Filtrats) enthält, bei 37°C für 90 Minuten durchgeführt. Die Lösung wird in einem SS 316-Modul mit einer Membran mit einem nominalen „Cut-Off"-Wert von 10.000 D mit 2 Extraktionen mit 1 M NaCl ultrafiltriert und anschließend mit Wasser gewaschen, bis die Absorbanz im Ultrafiltrat verschwindet. Das K5-Polysaccharid wird dann mit Aceton ausgefällt und eine Ausbeute von 850 mg/l des Fermenters erzielt. Die Reinheit des Polysaccharids wird mittels Uronsäure-Bestimmung (Carbazol-Verfahren), Proton- und Carbon-NMR-(Spektrum), UV(-Spektrum) und Proteingehalt gemessen. Die Reinheit liegt bei über 80%.
Das so gewonnene Polysaccharid besteht aus zwei Fraktionen unterschiedlichen Molekulargewichts, 30.000 bzw. 5.000 D, wie durch die HPLC-Bestimmung ermittelt wurde, bei der eine 75 HR Pharmacia-Säule und eine einzelne Fraktion mit einer Haltezeit von etwa 9 Minuten unter Verwendung von zwei Säulen des Bio-sil SEC250 in Serie (BioRad) und Na₂SO₄ als mobile Phase bei Raumtemperatur und einer Durchflußrate von 0,5 ml/Minute verwendet wurden. Die Bestimmung erfolgt im Vergleich zu einer Kurve, die mit Heparinfraktionen mit bekanntem Molekulargewicht erzeugt wurde.
Das ¹H-NMR-Spektrum des so gewonnenen K5 zeigt, dass viele Signale im Bereich unter 1,5 ppm vorhanden sind, die auf die Methylgruppen von lipophilen Substanzen zurückgeführt werden können.
HERSTELLUNG II
Herstellung eines von lipophilen Substanzen freien K5
In 100 ml einer wässrigen Lösung, die 4 M Natriumchlorid enthält und bei 4°C thermostatisch eingestellt ist, werden 5 g von dem K5 gelöst, das am Ende von HERSTELLUNG I gewonnen wurde, wobei 1 Volumen kaltes Isopropanol der so hergestellten Lösung zugesetzt wird. Die Salzkonzentration der Lösung wird durch Zugabe einer berechneten Menge einer gesättigten Natriumchloridlösung auf 3 M eingestellt und die gekühlte Lösung über Nacht bei kühler Temperatur (4°C) gehalten. Der gebildete Niederschlag wird durch 20-minütiges Zentrifugieren bei 10.000 U/Min abgetrennt und die Reinheit des Produkts durch eine Dialyse für eine Nacht und nachfolgender ¹H-NMR-Analyse kontrolliert, bei der die Signale im Bereich unter 1,5 ppm fehlen. Sofern erforderlich, wird das Auflösen in Wasser, das 4 M NaCl enthält, und die Ausfällung mit Isopropanol wiederholt. Der Niederschlag wird in Wasser gelöst und auf einer MiniPlate-Membran von Millipore mit einem „Cut-Off"-Wert von 10.000 D bis zum Verschwinden der Salze ultrafiltriert. Ein K5 (wurde hergestellt), das eine Reinheit von zumindest 99% aufweist und dessen ¹H-NMR-Spektrum keine Spuren von lipophilen Verunreinigungen im Bereich unter 1,5 ppm enthält. Der unter Verwendung von BioRad-Instrumenten berechnete Proteingehalt ist 0,02 % und die Nukleinsäuren sind nicht nachweisbar (Absorbanz 0 bei 260 mm).
HERSTELLUNG III
Herstellung eines N,O-übersulfatierten K5
(i) N-Deacetylierung
Zehn Gramm des reinen K5-Polysaccharids, hergestellt wie in HERSTELLUNG I beschrieben und gereinigt wie in HERSTELLUNG II beschrieben, werden in 1.000 ml 2N Natriumhydroxid gelöst und die so hergestellte Lösung wird bei 60°C für 24 Stunden gehalten. Die Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und dann mit 6N Salzsäure auf einen neutralen pH gebracht.
(ii) N-Sulfatierung
Zu der Lösung, die das deacetylierte K5 enthält und bei 40 °C gehalten wird, werden 16 g Natriumcarbonat und anschließend 16 g Pyridinschwefeltrioxid in 4 Stunden zugefügt. Am Ende der Reaktion nach 24 Stunden wird die Lösung auf Raumtemperatur gebracht und anschließend mit einer 5%-igen Salzsäure auf einen pH von 7,5–8 eingestellt. Das Produkt wird durch Diafiltration unter Verwendung einer Spiralmembran von 1.000 D (Prep/Scale Cartridge von Millipore) von den Salzen gereinigt. Der Vorgang ist beendet, wenn die Leitfähigkeit des Permeats unter 1.000 μS, vorzugsweise unter 100 μS liegt. Die Intradialyse wird bis zu einer Polysaccharidkonzentration von 10 % reduziert, wobei das gleiche Dialysesystem bei der Konzentrierung verwendet wird. Die konzentrierte Lösung wird gefriergetrocknet. Die Analyse des ¹³C-NMR(-Spektrums) zeigt keine N-Acetyl- oder NH₂-Rest-Gruppen.
(iii) O-Übersulfatierung
Das am Ende von Schritt (ii) gewonnene lyophilisierte Produkt wird in 100 ml entionisiertem Wasser gelöst und die Lösung wird mittels eines Kühlbades auf 10°C eingestellt und anschließend auf ein kationisches Austauscherharz IR 120H+ (100 ml) geleitet. Sowohl die Säule als auch das Reservoir werden bei 10°C gehalten. Nach dem Durchleiten der die Probe enthaltenden Lösung wird das Harz mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der pH des Permeats höher als 6 ist (etwa 3 Volumen entionisiertes Wasser). Die saure Lösung wird mit Tetrabutylammoniumhydroxid (15%-ige wässrige Lösung) neutralisiert (pH 7), dann auf das Mindestvolumen reduziert und gefriergetrocknet. Das Tetrabutylammoniumsalz wird in 400 ml Dimethylformamid gelöst und diesem werden 35 g C₅H₅N.SO₃ in fester Form zugesetzt. Die Lösung wird bei 50°C für 24 Stunden gehalten. Am Ende der Reaktion wird die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt, 3 Volumen mit Natriumchlorid gesättigtes Aceton zugefügt und auf 4°C abgekühlt, bis eine vollständige Ausfällung (12 Stunden) erfolgt ist. Der Niederschlag wird durch Filtration vom Lösungsmittel getrennt, mit der Mindestmenge an entionisiertem Wasser (etwa 100 ml) aufgelöst, wobei der Lösung Natriumchlorid zugefügt wird, bis eine 0,2 M Konzentration erreicht ist. Die Lösung wird mit 2N Natriumhydroxid auf einen pH von 7,5–8 eingestellt und mit 2 Volumen Aceton behandelt, bis eine vollständige Ausfällung erfolgt ist. Der gewonnene Feststoff wird mit 100 ml entionisiertem Wasser aufgelöst und von den Restsalzen, wie in Schritt (ii) beschrieben, unter Verwendung einer Spiralmembran von 1.000 D (Prep/Scale-Modul von Millipore) durch Ultrafiltration gereinigt.
(iv) N-Sulfatierung
Die so gewonnene Lösung, die das O-sulfatierte Produkt enthält, wird wie zuvor in Schritt (ii) für die N-Sulfatierung beschrieben, behandelt. Das Produkt weist ein mittleres Molekulargewicht von 15.000 D und ein Verhältnis Sulfat/Carboxyl von 3,84 auf. Die Verteilung der Sulfatgruppen, wie sie durch die ¹³C-NMR bestimmt wurde, ist wir folgt: Die Glucosamineinheit des konstitutiven Disaccharids ist zu 100% N-sulfatiert und 6-O-sulfatiert, während von den Glucuronsäure-Einheiten 30 % mono-O-sulfatiert und 70% O-disulfatiert sind.
HERSTELLUNG IV
Herstellung eines N,O-übersulfatierten K5
Durch die Vorgehensweise wie in HERSTELLUNG III beschrieben und ausgehend von einem K5, das, wie von M. Manzoni et al. (1996) beschrieben, hergestellt und charakterisiert ist, gereinigt wie in HERSTELLUNG II beschrieben, wird ein N,O-übersulfatiertes K5 gewonnen, das mit K5-N,OS(H1) bezeichnet wird und ein mittleres Molekulargewicht von 13.000 und ein Sulfat/Carboxyl-Verhältnis von 3,54 aufweist.
HERSTELLUNG V
Herstellung eines N,O-sulfatierten K5
Durch die Vorgehensweise wie in HERSTELLUNG III beschrieben, aber unter Verwendung von 7 g des Addukts C₅H₅N.SO₃ in Schritt (iii) wird ein N,O-sulfatiertes K5 mit der Bezeichnung K5-N,OS(L) hergestellt, das ein mittleres Molekulargewicht von 14.000 und ein Sulfat/Carboxyl-Verhältnis von 1,7 aufweist.
HERSTELLUNG VI
Herstellung eines O-sulfatierten K5
Durch die Vorgehensweise wie in Schritt (iii) der HERSTELLUNG III beschrieben, wird aus einem K5, das, wie in HERSTELLUNG I beschrieben, gewonnen und, wie in HERSTELLUNG II beschrieben, gereinigt wurde, ein O-übersulfatiertes K5 hergestellt, das als K5-OS(H) bezeichnet wird und ein mittleres Molekulargewicht von 18.000 und ein Sulfat/Carboxyl-Verhältnis von 3,77 aufweist.
Beispiel 1
Die anti-HIV-Aktivität wurde an PHA-Blasten unter Verwendung des Virenstamms HIV-1_Bla getestet, der nur den Korezeptor CCR5 (monotroper Virus R5) nutzen kann.
Ein die vorliegende Erfindung repräsentierendes N,O-übersulfatiertes K5, das gemäß HERSTELLUNG III gewonnene K5 N,OS(H) mit einem Sulfatierungsgrad von 3,84, wurde mit zwei anderen Derivaten des K5-Polysaccharids verglichen, insbesondere mit einem N,O-sulfatierten K5, das einen Sulfatierungsgrad von 1,77 aufweist und mit K5 N,OS(L) bezeichnet ist und das, wie in HERSTELLUNG V beschrieben, gewonnen wurde, sowie mit einem O-sulfatierten K5, das einen Sulfatierungsgrad von 3,77 hat, mit K5 OS(H) bezeichnet ist und das, wie in HERSTELLUNG VI beschrieben, hergestellt wurde. Die Resultate der Wirkungen der drei K5-Derivate auf die Infektion von Zellen, die von einem einzelnen Spender stammen und dreifach für jede Derivatkonzentration getestet wurden und die repräsentativ für jene Resultate sind, die in isolierten Zellen von drei unabhängigen Spendern gewonnen wurden, werden in Tabelle 1 dargestellt. Alle drei getesteten Proben erreichen eine Maximalhemmung der RT bei einer Konzentration von 10μg/ml.
TABELLE 1
Beispiel 2
Die zu untersuchenden Produkte wurden an PHA-Blasten unter Verwendung des Virenstamms HIV-1_LAV/IIIB getestet, der nur den Korezeptor CXCR4 nutzt (monotroper Virus X4).
Der Stamm X4 kann, wenn auch selten, während der späten Phasen der Infektion vor der Evolution des krankhaften Befunds zu klarem Aids auftreten.
Die in Tabelle 2 dargestellten Resultate zeigen, dass bei der Konzentration von 10 μg/ml sowohl K5 OS(H) und K5 N,OS(H) fast vollständig die RT-Aktivität hemmen. Bei einer Konzentration von 1 μg/ml hemmt das K5 OS(H) fast vollständig die RT-Aktivität, während K5 N,O(H) sie zu 55% hemmt.
TABELLE 2
Beispiel 3
Die zu untersuchenden Produkte wurden an Blasten unter Verwendung des Virenstamms HIV-1 89.6 getestet, der beide Korezeptoren CCR5 und CXCR4 (dualtrope Viren R5X4) nutzt. Die dualtropen Stämme R5X4 können während der späten Phasen der Infektion in etwa 50 % der mit dem HIV-1 der B-Gruppe infizierten Personen auftreten, diese Stämme können sowohl von einer Mischung von monotropen Spezies R5 und X4 stammen als auch von Viren, die in der Lage sind gleichzeitig beide Korezeptoren zu nutzen (S. Ghezzi et al. Virology, 280:253–261, 2001).
Die Resultate sind in Tabelle 3 dargestellt, die zeigt, wie K5 N,OS(H) fast vollständig die RT-Aktivität bei einer Konzentration von 1 μg/ml hemmt. Während K5 OS(H) bei dieser Konzentration eine sehr geringe Aktivität aufweist, zumindest eine geringere als K5 N,OS(L).
TABELLE 3
Beispiel 4
Die anti-HIV-Aktivität wurde an dem HIV-1-Virus an Makrophagen getestet, die von Monozyten aus peripherem Blut (MDM) stammen und mit dem Virusstamm HIV-1_Bal infiziert waren, der nur den Korezeptor CCR5 (monotroper Virus R5) nutzt.
Die Resultate der RT-Hemmung sind in Tabelle 4 dargestellt, wobei K5 OS(H) und K5 N,OS(H) im wesentlichen gleich stark sind, während K5 N,OS(L) eine sehr geringe Aktivität entfaltet.
TABELLE 4

Claims

Verwendung eines N,O-übersulfatierten K5-Polysaccharides mit einem Sulfatierungsgrad, ausgedrückt als Verhältnis Sulfat/Carboxyl, von mehr als 3,2 zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Bekämpfung von HIV-Infektionen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das besagte N,O-übersulfatierte K5 einen Sulfatierungsgrad von 3,2 bis 4 aufweist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das besagte N,O-übersulfatierte K5 einen Sulfatierungsgrad von 3,5 bis 4 aufweist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das besagte N,O-übersulfatierte K5 einen Sulfatierungsgrad von 3,7 bis 4 aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei die besagte HIV-Infektion die einzige Ursache des AIDS genannten erworbenen Immunschwächesyndromsist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1–5, wobei das besagte N,O-übersulfatierte K5 in Form eines seiner pharmazeutisch akzeptablen Salze vorliegt.
Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei das besagte pharmazeutisch akzeptable Salz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Natrium-, Kalium-, Calcium-, Magnesium-, Aluminium- und Zinksalzen.
Verwendung gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–7, wobei das besagte N,O-übersulfatierte K5 ein durchschnittliches Molekulargewicht im Bereich zwischen 2000 und 65 000 Dalton (D) besitzt.
Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei der besagte Bereich zwischen 2500 und 20 000 Dalton (D) liegt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1–7, wobei das besagte N,O-übersulfatierte K5 durch Depolymerisierung erhalten wird und ein durchschnittliches Molekulargewicht von 2000 bis 5000 Dalton (D) besitzt.