DE60133585T2

DE60133585T2 - Membran penetrierende peptide und deren anwendungen

Info

Publication number: DE60133585T2
Application number: DE60133585T
Authority: DE
Inventors: Yong Fresh Meadows GUO; Clarence C. Asbury MORSE; Zhengbin Sugar Land YAO; George A. Hillsborough KEESLER
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2001-08-23
Publication date: 2009-06-04
Anticipated expiration: 2021-08-24
Also published as: ZA200301476B; BRPI0113477B8; KR20030034156A; US20030229202A1; IL154589A; BR0113477A; JP2004512275A; US20060100134A1; US7754678B2; DE60133585D1; BRPI0113477B1; KR100810927B1; JP4896356B2; GB0103110D0; AR033834A1; TWI317737B

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft membranpenetrierende Peptide, die sich als In-vitro-Zuführungsvorrichtungen für die intrazelluläre Zuführung einer interessierenden Verbindung an Zellen in vitro eignen, diese enthaltende Zusammensetzungen sowie Verfahren zu deren Verwendung. Ebenso beinhaltet die Erfindung die Identifizierung zusätzlicher membranpenetrierender Peptide, die sich als Zuführungsvorrichtungen für die intrazelluläre Zuführung einer interessierenden Verbindung an Zellen in vitro eignen.
STAND DER TECHNIK
Die Zuführung kleiner Moleküle, Oligonukleotide und Proteine durch biologische Membranen stellt eine große Herausforderung für Therapie- und Validierungsparadigmen dar. Kürzlich konnte ermittelt werden, daß aus Antennapedia, TAT-HIV und VP22 stammende Transduktionspeptide biologische Membranen penetrieren können, als Frachtvehikel fungieren und spezifische subzelluläre Kompartimente ansteuern. So wird beispielsweise von Phelan et al.: „Intercellular Delivery of Functional p53 by the Herpesvirus Protein VP22" Nature Biotechnology, Bd. 16, 1998, Seite 440–443, die Zuführung von p53 unter Verwendung von Fusionen mit dem membranpenetrierenden VP22 beschrieben. Aus der WO 99/49060 (Isaksson Olle, Sandstedt Jonas (SE), Toernell Jan (SE), Graichen R.) ist ein Fusionsprotein zwischen dem Wachstumshormonbindungsprotein und einer Kernlokalisierungssequenz (NLS-GHBP) bekannt. Futaki Shiroh et al.: "Arginine-rich Peptides: an abundant source of membrane-permeable Peptides having potential as carriers for intracellular Protein delivery" Journal of Biological Chemistry, Bd. 276, Nr. 8, 17. November 2000, Seiten 5836–5840, XP002210171 ISSN: 0021-9258, befaßt sich mit Peptiden mit um 8 Argininen, die die Fähigkeit zur Internalisierung aufweisen.
Vorliegend wird die Identifizierung einer Kernlokalisierungssequenz (NLS [Nuclear Localization Sequence]) im Uhrenprotein („Zirkadian Protein") hPER1 (Human Period 1) gezeigt, die als Transduktionspeptid fungiert. Dabei wurden, was noch wichtiger ist, mittels einer Datenbankrecherche zusätzliche Transduktionspeptide, die in den NLS anderer Proteine eingebettet sind, entdeckt, womit sich die Anzahl gencodierter Transduktionspeptide von 3 auf 14 erhöhte. Unsere Daten lassen darauf schließen, daß Transduktionspeptide in NLS-Sequenzen vorkommen und im gesamten Genom stark verbreitet in verschiedenartiger Form verteilt sind. Es ist allgemein bekannt, daß bestimmte extrazelluläre und intrazelluläre Proteine auf spezifische Organellen in einer Zelle gerichtet sind, transmembran vorliegen oder von der Zelle sezerniert werden. Die biologischen Mechanismen, mit denen die intrazelluläre Proteinzielsteuerung erfolgt, werden noch weiter charakterisiert, doch wird dabei allgemein anerkannt, daß ein Mechanismus für die Lokalisierung aufgrund einer spezifischen, im interessierenden Protein enthaltenen Leitsequenz bzw. Intraproteinsequenz erfolgt. Die Lokalisierung von Proteinen in ausgewählten Zellorganellen wird durch spezifische Zielsteuerungssequenzen unterstützt. Eine Reihe von Kernlokalisierungssequenzen (NLS) wurde in Proteinen identifiziert, die den Transport des Proteins oder anderweitige Passage vom Zytoplasma in die Zellkernmembran gestatten.
Fusionsproteine, die die Zielsteuerungssequenz und ein weiteres, ansonsten nicht als Ziel dienendes Protein enthalten, sind je nach der ausgewählten Zielsteuerungssequenz in der ausgewählten Zellorganelle lokalisiert. So ist beispielsweise aus Ferullo, J. M. und Paget, E. FR 279695 die selektive Kompartimentali sierung einer Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD), die an eine Signalsequenz fusioniert ist, welche das Enzym zu einem anderen Zellkompartiment als dem Zytosol, z. B. einer Vacuole, leitet, offenbart. In ähnlicher Weise wird in der WO 0147950 (Wehrle-Haller, Bernhard M.; Imhof, Beat A) eine neue Determinante identifiziert, die für die basolaterale Zielsteuerung und die verlängerte Exposition von Zelloberflächen verankerten Wachstumsfaktoren an Zelloberflächen verantwortlich ist. Bei dem Signal handelt es sich um ein monoleucin-abhängiges basolaterales Sortierungssignal, das aus der Aminosäuresequenz X1h2X3h4Lp5p6 besteht, wobei X1 einen polaren Aminosäurerest oder Alanin, h2 einen beliebigen hydrophoben Aminosäurerest, X3 einen beliebigen Aminosäurerest, h4 einen beliebigen hydrophoben Aminosäurerest mit Ausnahme von Leucin und Isoleucin, L einen Leucinrest, p5 einen beliebigen polaren Aminosäurerest und p6 eine beliebige polare Aminosäure repräsentiert. Von Richardson, A. E., et al., Plant J. (2001), 25(6), 641–649 wird die Manipulation des Enzyms Aspergillus-Phytase, so daß dieses die Signalpeptidsequenz aus dem Karotte-Extensin-Gen enthält, beschrieben. Das erhaltene Fusionsprotein war nur dann wirksam, wenn es als extrazelluläres Enzym in den umgebenden Erdboden sezerniert wurde, und führte zu einem 20fachen Anstieg der Phytase-Gesamtaktivität in der Wurzel bei transgenen Linien und anschließender verbesserter Versorgung mit Phosphor, so daß das Wachstum und der Phosphorgehalt der Pflanzen mit anorganischem Phosphat versorgten Kontrollpflanzen gleichwertig waren. Aus der WO 0132894 (Lok, S.) ist die Verwendung der Signalankerdomänensequenzen von Typ-II-Zelloberflächenproteinen zur Verankerung rekombinanter Proteine in die Oberfläche transfizierter Zellen bekannt. Ein charakteristisches Merkmal der Typ-II-Zelloberflächenproteine besteht darin, daß sie durch eine einzige hydrophobe Transmembrandomäne in der Zellmembran gehalten werden und mit ihrem C-Terminus außerhalb der Zelle orientiert sind.
Vor kurzem wurden einige Proteine identifiziert, die die Zellmembran passieren können, ohne daß sie aktive Transportmechanismen oder „Poren" benötigen. Es konnte kürzlich ermittelt werden, daß aus Antennapedia, TAT und VP22 stammende membranpenetrierende Peptide (MPP, auch als Proteintransduktionsdomäne, „PTD", bekannt) biologische Membranen penetrieren können und spezifische subzelluläre Kompartimente ansteuern. Keines dieser bereits bekannten Proteine leitet sich von Säugerproteinen ab. Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Entdeckung, daß von Säuger- oder Hefeprotein-Kernlokalisierungssequenzen (NLS) abgeleitete oder mit NLS überlappende Polypeptide als MPP wirken können, sowie auf die Identifizierung einer spezifischen Polypeptidsequenz, die Zellmembranen penetrieren kann, selbst in Konjugation mit großen Proteinen wie etwa biologisch aktiven Proteinen, oder anderen organischen Verbindungen.
Der Zellkerntransport ist für eine Reihe logischer Vorgänge, einschließlich Genexpression und Zellteilung, ebenso wie für die Virusreplikation, Tumoriginese und Tumorzellproliferation essentiell. Der Mechanismus des Zellkerntransports konnte erst kürzlich ausführlich charakterisiert werden, wobei gezeigt wurde, daß daran eine Reihe diskreter Schritte beteiligt sind. Proteine, die dafür vorgesehen sind, in dem Zellkern transportiert zu werden, enthalten in ihrer Aminosäuresequenz einen kurzen Abschnitt von Aminosäuren, der als Kernlokalisierungssequenz („NLS") bezeichnet wird. Diese Sequenzen können an beliebiger Stelle in der Aminosäuresequenz auftreten und bestehen typischerweise aus vier bis etwa acht Aminosäuren. Diese Sequenzen sind im allgemeinen basisch (d. h. positiv geladen), doch konnte bislang noch keine Konsensussequenz identifiziert werden. Somit gibt es eine große Vielfalt dieser Sequenzen, die für bestimmte Proteine spezifisch zu sein scheinen.
Innerhalb der Zelle können diese NLS durch zusätzliche Proteine oder durch Konfirmationsänderungen im NLS-haltigen Protein maskiert oder demaskiert werden. Dabei kann eine NLS maskiert sein, weil sie im Kern des Proteins verborgen und nicht an der Oberfläche des Proteins exponiert ist. Die Demaskierung von NLS sowie die Translokation zytoplasmatischer Proteine in dem Zellkern kann durch Phosphorylierung, Dephosphorylierung, proteolytische Verdauung, Untereinheitsassoziation oder Dissoziation einer inhibitorischen Untereinheit oder dergleichen ausgelöst werden. Dementsprechend wird durch das Maskieren und Demaskieren von NLS ein Mechanismus bereitgestellt, mit dem der Transport dieser zytoplasmatischen Proteine in dem Zellkern reguliert werden kann. So enthält beispielsweise der Transkriptionsfaktor NF-AT Kernlokalisierungssequenzen, die die Translokation von NF-AT in den Zellkern in Gegenwart von intrazellulärem Calcium gestatten, die jedoch in Abwesenheit von Calcium durch die Ausbildung intramolekularer Assoziation mit anderen Domänen im NF-AT-Polypeptid abgeschirmt sind.
Von Lee, H. C. und Bernstein, H. D. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2001), 98(6), 3471–3476 wurde der beteiligte Mechanismus für präsekretorische Proteine, wie etwa Maltosebindungsprotein (MBP) und Protein A der äußeren Membran (OmpA), die über das molekulare Chaperon SecB zur inneren Membran von E. coli gesteuert werden, im Gegensatz zum Ansteuern integraler Membranproteine über das Signalerkennungspartikel (SRP [Signal Recognition Particle]), untersucht. Dabei stellten die Autoren fest, daß ein Austausch des MBO- bzw. MPa-Signalpeptids gegen das erste Transmembransegment von AcrB die Abhängigkeit von SecB hinsichtlich des Transports beseitigte und beide Proteine in den SRP-Zielsteuerungsweg umgeleitet wurden.
Einige Proteine enthalten zytoplasmatische Lokalisierungssequenzen (CLS) oder Kernexportsequenzen, die sicherstellen, daß das Protein vorwiegend im Zytoplasma verbleibt. So wird beispielsweise von Hamilton, M. H. et al., J. Biol. Chem. (2001), 276(28), 26324–26331 gezeigt, daß die Ubiquitin-Protein-Ligase (E3), hRPF1/Nedd4, eine Komponente des Ubiquitin-Proteasom-Wegs, die für Substraterkennung und -spezifität verantwortlich ist, in der Lage ist, in den Zellkern einzudringen, jedoch das Vorhandensein einer funktionellen Rev-ähnlichen Kernexportsequenz in hRPF1/Nedd4 eine vorwiegend zytoplasmatische Lokalisierung sicherstellt. Die zytoplasmatischen Domänen für Membranproteine enthalten Sortierungssignale, die deren Endozytose von der Plasmamembran vermittelt.
Von Heineman, T. C. und Hall, S. L. Virology (2001), 285(1), 42–49 wurden drei Konsensus-Internalisierungsmotive in der zytoplasmatischen Domäne von VZV gB untersucht, wobei festgestellt wurde, daß die Internalisierung von VZV gB und seine anschließende Lokalisierung in den Golgi-Apparat von zwei Sequenzmotiven auf Tyrosinbasis in seiner zytoplasmatischen Domäne vermittelt wird. In Sängerzellen und Hefen spielen Aminosäurenmotive in den zytoplasmatischen Endstücken von Transmembranproteinen eine prominente Rolle bei der Proteinzielsteuerung im frühen sekretorischen Weg, indem sie die Lokalisierung zum oder den schnellen Export aus dem endoplasmatischen Reticulum (ER) vermitteln. Hoppe, H. C. und Joner, K. A. Cell. Microbiol. (2000), 2(6), 569–578.
Die Säuger-Endopeptidase Furin wird im Steady-State-Zustand zum Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) lokalisiert. Die Lokalisierung von Furin zu diesem Kompartiment scheint das Ergebnis eines dynamischen Vorgangs zu sein, bei dem das Protein zwischen den TGN und der Plasmamembran zirkuliert wird. Sowohl die Lokalisierung als auch die Internalisierung von TGN von der Plasmamenbran werden durch Zielsteuerungsinformationen vermittelt, die in der zytoplasmatischen Domäne von Furin enthalten sind. Von Voorhees, P., et al., EMBO J. (1995), 14(20), 4961–75 wird berichtet, daß es wenigstens zwei zytoplasmatische Determinanten gibt, die einen Beitrag zur Steady-State-Lokalisierung und zur Transportierung („Trafficking") von Furin leisten. Die erste Determinante entspricht einem kanonischen Motiv auf Tyrosinbasis, YKGL (Reste 758–761), das hauptsächlich als Internalisierungssignal fungiert. Die zweite Determinante besteht aus einer stark hydrophilen Sequenz (Reste 766–783), die einen großen Cluster saurer Reste (E und D) enthält und die keine Motive auf Tyrosinbasis oder Dileucinbasis aufweist. Diese zweite Determinante ist in der Lage, Lokalisierung zum TGN zu übertragen ebenso wie die Internalisierung von der Plasmamembran zu vermitteln.
Das Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) spielt eine zentrale Rolle bei der Proteinsortierung/-ansteuerung, wobei die Sequenz SXYQRL für sich allein eine signifikante TGN-Lokalisierung übermitteln kann. Von Wong, S. H. und Hong, W. J. Biol. Chem. (1993), 268(30), 22853–62 wird über eine ausführliche Mutagenese der aus 32 Resten bestehenden Sequenz von TGN38, einem hauptsächlich auf das TNG beschränkten integralen Membranprotein, berichtet, wobei festgestellt wurde, daß die Reste Ser, Tyr und Leu in Position 23, 25 bzw. 28 für die TGN-Lokalisierung essentiell sind. Wurde die 32 Reste lange zytoplasmatische Sequenz von TGN38 an die Ecto- und Transmembrandomänen von Glycophorin A (einem Oberflächenprotein) fusioniert, so wurde das erhaltene chimärische Protein zum TGN lokalisiert.
Es wird allgemein anerkannt, daß bestimmte Proteine entweder nur in einer spezifischen Organelle aktiv sind oder in der Lage sind, je nach ihrer Lokalisierung unterschiedliche Funktionen auszuüben. So ist beispielsweise für die Regulation der NF-κB-Funktion eine entsprechende subzelluläre Lokalisierung entscheidend. Von Huang, T. T., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2000), 97(3), 1014–1019, wird gezeigt, daß latente NF-κB-Komplexe im Vorinduktionszustand in den Zellkern eindringen und diesen verlassen können, wobei mit den Resten 45–54 von IκBα eine zuvor nicht charakterisierte Kernexportsequenz identifiziert wurde, die für die zytoplasmatische Lokalisierung inaktiver Komplexe benötigt wurde. Es scheint, daß NF-κB/IκBα-Komplexe zwischen dem Zytoplasma und dem Zellkern über einen von einem Kernlokalisierungssignal abhängigen Kernimport und einem CRM1-abhängigen Kernexport hin und her transportiert werden und daß der gegenüber dem Kernimport dominierende Kernexport zur weitgehend zytoplasmatischen Lokalisierung der inaktiven Komplexe beiträgt, so daß eine effiziente NF-κB-Akivierung durch extrazelluläre Signale erreicht wird.
Der Import von Proteinen mit klassischer Kernlokalisierungssequenz in den Zellkern beinhaltet den Zusammenbau eines Importkomplexes auf der zytoplasmatischen Seite des Kernporenkomplexes (NPC [Nuclear Pore Complex]) mit anschließender Wanderung dieses Komplexes durch den NPC und Freisetzung des Importsubstrats in das Zellkerninnere. Man nimmt an, daß zusammen mit Ran zwei weitere lösliche Faktoren zur Vermittlung des Kernimports eines Proteins mit einer klassischen NLS oder NLS-Basissequenz in den Zellkern absolut erforderlich sind. Bei dem ersten Faktor handelt es sich um Karyopherin/Importin α (Kap α), der eine klassische NLS bindet und anschließend einen Komplex mit Karyopherin/Importin β1 (Kapβ1) bildet. Adam, S. A. und Gerace, L. (1991) Cell 66, 837–847; Görlich, D. et al. (1994) Cell 79, 767–778; Moroinanu, J., et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 2008–2011; Radu, A., et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 1769–1773; Görlich, D., et al. (1995) Curr. Biol. 5, 383–392; Chi, N. C., et al. (1995) J. Cell Biol. 130, 265–274. Kapβ1 wechselwirkt mit Proteinen des Kernporenkomplexes (NPC) und scheint die Wanderung des Importkomplexes durch den NPC über diese Wechselwirkungen zu vermitteln. Rexach, M., und Blobel, G. (1995) Cell 83, 683–692; Radu, A., Blobel, Gl, und Moore, M. S. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 1769–1773; Iovine, M. K., Watkins, J. L. und Wente, S. R. (1995) J. Cell Biol. 131, 1699–1713; Radu, A., Moore, M. S. und Blobel, G. (1995) Cell 81, 215–222. Ein weiteres Protein, p10/NTF2, wurde ebenso mit dem Kernimport in Verbindung gebracht, doch könnte seine Funktion lediglich darin bestehen, Ran in den Zellkern zu bringen, wo letzteres anschließend zum Auseinanderbauen eines eingetroffenen Importkomplexes benötigt wird. Moore, M. S. und Blobel, G. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 10212–10216; Paschal, B. M. und Gerace, L. (1995) J. Cell Biol. 129, 925–937; Ribbeck, K., Lipowsky, G., Kent, H. M., Stewart, M. und Görlich, D. (1998) EMBO J. 17, 6587–6598; Smith, A., Brownawell, A. und Macara, I. G. (1998) Curr. Biol. 8, 1403–1406.
Zwar gibt es lediglich ein Homolog zu Kap α in der Hefe (SRP1 bzw. Kap60), doch enthalten Vertebratenzellen eine Reihe von Proteinen, die eine klassische NLS binden können und eine Sequenzhomologie teilen (siehe Nachury, M. V., Ryder, U. W., Lamond, A. I. und Weis, K. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 582–587, und darin zitierte Literaturstellen). Diese Proteine besitzen unterschiedliche Namen, lassen sich jedoch in drei Hauptfamilien gruppieren. Die Kap α1-Familie enthält das menschliche Protein NPI-1/Importin α1/Karyopherin α1/Rch2/hSRP1 sowie ein zweites verwandtes Protein, Importin α6, und darüber hinaus das S2-Protein aus der Maus. Moroianu, J., et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 2008–2011; Cortes, P., et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7633–7637; O'Neill, R. E., et al., (1995) J. Biol. Chem. 270, 22701–22704; Kohler, M., et al., (1997) FERS Lett. 417, 104–108; Tsuji, L., et al., (1997) FERS Lett. 416, 30–34. Die zweite Familie, Kapα2, enthält Rch1/hSRP1/Importin α2/Karyopherin α2 aus dem Menschen sowie das Mausprotein Pendulin/PTAC 58. Görlich, D., Prehn, S., Laskey, R. A. und Hartmann, E. (1994) Cell 79, 767–778; Cuomo, C. A., Kirch, S. A., Gyuris, J., Brent, R. und Oettinger, M. A. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 6156–6160; Kussel, P. und Frasch, M. (1995) Mol. Gen. Genet. 248, 351–363; Imamoto, N., Shimamoto, T., Takao, T., Tachibana, T., Kose, S., Matsubae, M., Sekimoto, T., Shimonishi, Y. und Yoneda, Y. (1995) EMBO J. 14, 3617–3626; K., Mattaj, I. W. und Lamond, A. I. (1995) Science 268, 1049–53. Die dritte Familie, Kapα3, besteht aus den beiden menschlichen Proteinen QIP-1/Importin α3 und KPNA3/hSPR1 γ/hSRP4, sowie den Mausproteinen Q1 und Q2. Nachury, M. V., et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 582–587; Kohler, M., et al., (1997) FERS Lett. 417, 104–108; Tsuji, L., et al., (1997) FERS Lett. 416, 30–34; Takeda, S., et al, (1997) Zytogenet. Cell Genet. 76, 87–93; Seki, T., et al., (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 48–53; Miyamoto, Y., et al., (1997) J. Biol. Chem. 272, 26375–26381. Diese Klassen teilen jeweils etwa 50% Homologie miteinander und mit dem Hefe-SRP1, wobei gezeigt werden konnte, daß diese Säugerproteine jeweils in der Lage sind, den Import eines oder mehrerer Proteine mit klassischer NLS zu vermitteln. Nachury, M. V., et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 582–587; Sekimoto, T., et al., (1997) EMBO J. 16, 7067–7077; Nadler, S. G., et al., (1997) J. Biol. Chem. 272, 4310–4315; Prieve, M. G., et al., (1998) Mol. Cell. Biol. 18, 4819–4832.
Der Import von Stat-1 wird von Kapα1/NPI-1, jedoch nicht von Kapα2/Rch1 vermittelt, doch scheint aktiviertes Stat-1 an einen COOH-terminalen Bereich von Kapα1 zu binden, der sich von den NLS-bindenden Armadiollo Repeats unterscheidet. Die beobachteten Unterschiede in der Bindung der unterschiedlichen Kapαs an RCC1 scheinen allein auf die NLS auf RCC1 und damit wahrscheinlich auf den NLS-Bindungsbereich von Kapα3 zurückzuführen zu sein. Von Sekimoto, T., et al., (1997) EMBO J. 16, 7067–7077. Kamei, Y., et al., (1999) J. Histochem. Zytochem. 47, 363–372 wurde gezeigt, daß das Kapα3-Homalog in Mäusen in vielen Geweben exprimiert wird, wobei die Theorie aufgestellt wurde, daß Kapα3 eine Rolle beim Importieren „einer begrenzten Anzahl einmaliger karyophiler Proteine, wie etwa Helicase Q1", spielen kann. Die von Talcott, B. und Moore, M. S., 2000 J. Biol. Chem., 275(14) 10099–10104 präsentierten Ergebnisse lassen darauf schließen, daß RCC1 in die Gruppe von Proteinen, die Kapα3 zur Vermittlung ihres Imports in den Zellkern verwenden, einbezogen werden sollte.
Die USP 6,191,269 lehrt die Existenz einer Kernlokalisierungssequenz, die in der cDNA-Sequenz des N-terminalen „Propiece" von IL-1-alpha enthalten ist, T76-NGKVLKKRRL, die die Eigenschaften einer Kernlokalisierungssequenz (NLS) aufwies und die Kernlokalisierung des Propiece vermitteln konnte (Stevenson et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 508–13). Die Einführung der fur das N-terminale Propiece von Il-alpha codierenden cDNA in kultivierte Mesangialzellen führte zur Anreicherung im Zellkern (Stevenson et al. id).
Die USP 5,877,282 lehrt, daß es sich bei dem Antennapedia-Homeodomänensignalsequenzpeptid um die Aminosäuresequenz RQIKIWFQNRRMKWKK, bei dem Signalsequenzpeptid des Fibroblastenwachstumsfaktors um AAVALLPAVLLALLA sowie bei dem Signalsequenzpeptid von HIV-Tat um die Aminosäuresequenz CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQGSQTH handelt.
Von Schwartze, S. R., et al., Science 285: 1569–1572 (1999) wird die Zuführung eines ip-injizierten Reporterproteins, der 116 kD großen beta-Galactosidase, als TAT-Fusionsprotein in Gewebe und über die Blut-Hirn-Schranke hinweg berichtet. Von Schwartze wurde dabei eine aus dem HIV-Tat-Protein stammende Proteintransduktionsdomäne (PTD) von 11 Aminosäuren mit einem N-terminalen Fluoreszeinisothiocyanat (FITC)-Gly-Gly-Gly-Gly-Motiv verwendet. Von den Autoren wird berichtet, daß frühere Versuche zur Transduktion von mit der TAT-PTD chemisch quervernetzter beta-Gal zu sporadischer und schwacher beta-Gal-Aktivität in einer begrenzten Anzahl von Geweben führten. Sie vermuten, daß die verbesserte Transduktion an der In-Frame-Fusion sowie der verwendeten Aufreinigungsstrategie lag.
Die Kernlokalisierung von IFNγ wird durch eine polybasische NLS innerhalb seines C-Terminus vermittelt, die für die volle Expression biologischer Aktivität von IFNγ sowohl extrazellulär als auch intrazellulär benötigt wird. Subramaniam, Prem S., et al., J. Cell Sci. (2000), 113(15), 2771–2781. Man nimmt an, daß diese NLS eine integrale intrazelluläre Rolle bei der Kerntranslokation des durch IFNγ aktivierten Transkriptionsfaktors STA1α spielt, da durch Behandlung von IFNγ mit Antikörpern gegen den die NLS enthaltenden C-terminalen Bereich (95–133) die Induktion der Kerntranslokation von STAT1α blockiert wurde, doch hatten diese Antikörper keinen Effekt auf die Kerntranslokation von STAT1α in mit IFNα behandelten Zellen. Eine Deletionsmutante von menschlichem IFNγ, IFNγ(1-123), der der C-terminale NLS-Bereich fehlt, war zwar biologisch inaktiv, jedoch immer noch in der Lage, an den IFNγ-Rezeptorkomplex auf Zellen mit einem ähnlichen K_d-Wert wie das Wildtyp-Protein zu binden. Durch die Deletion der NLS wurde spezifisch die Fähigkeit von IFNγ(1-123) beseitigt, die Kerntranslokation von STAT1α, das für die biologischen Aktivitäten von IFNγ nach Bindung an den IFNγ-Rezeptorkomplex benötigt wird, zu initiieren. Ein C-terminales Peptid von Maus-IFNγ, IFNγ(95-133), das das NLS-Motiv enthält, induzierte die Kerntranslokation von STAT1α, wenn es intrazellulär von einer Maus-Makrophagenzellinie aufgenommen wurde. Die Deletion des NLS-Motifs beseitigte spezifisch die Fähigkeit dieses intrazellulären Peptids zur Herbeiführung der Kerntranslokation von STAT1α. Bei mit IFNγ aktivierten Zellen stellte sich heraus, daß IFNγ einen Teil eines Komplexes darstellt, der STAT1α sowie das Importin-α-Analog Npi-1, das den STAT1α-Kernimport vermittelt, enthielt. Die Tyrosinphosphorylierung von STAT1α, die Bildung des Komplexes IFNγ/Npi-1STAT1α-Komplex sowie die anschließende Kerntranslokation von STAT1α Ware jeweils abhängig von dem Vorhandensein der IFNγ-NLS.
Das die Aminosäuren 95-132 von IFN-γ (IFN-γ(95-132)) repräsentierende Peptid, das die polybasische Sequenz ¹²⁶RKRKRSR¹³² enthielt, war in der Lage, die Aufnahme des Autofluoreszenzproteins APC in energieabhängiger Weise zu spezifizieren, wobei sowohl ATP als auch GTP benötigt wurde. Wurde die obige polybasische Sequenz deletiert, so fand kein Kernimport mehr statt. Subramaniam, P., et al., 1999 J. Biol. Chem. 274(1) 403–407. Ein Peptid mit der prototypischen polybasischen NLS-Sequenz des großen SV40-T-Antigens war ebenso in der Lage, den von IFN-γ(95–132) vermittelten Kerntransport zu hemmen, was darauf schließen läßt, daß die NLS in IFN-γ über die Komponenten des von der SV40-T-NLS benutzten Ran/Importin-Wegs fungieren kann. Intaktes IFN-γ war bei Kopplung an APC ebenso in der Lage, dessen Kernimport zu vermitteln, wobei dieser Kernimport durch das Peptid IFN-γ(95-132) und das SV40-T-NLS-Peptid blockiert wurde, was darauf schließen läßt, daß intaktes IFN-y ebenso über den Ran/Importin-Weg in den Zellkern transportiert wurde.
Zellkernproteine werden in den Zellkern über wäßrige Kanäle importiert, die die Kernhülle überbrücken und Kernporenkomplexe (Nuclear Pore Complexes, NPCs) genannt werden. Zwar können Ionen sowie Moleküle mit weniger als ~20–40 Da passiv durch die Kernporenkomplexe hindurch diffundieren, doch werden größere Proteine über sättigbare Wege transportiert, die sowohl energie- als auch signalabhängig sind. Bei den Signalen, die den Kernproteinimport spezifizieren (NLS)1, handelt es sich üblicherweise um kurze Abschnitte von Aminosäuren, die reich an basischen Aminosäureresten sind, obwohl kürzlich andere NLS-Klassen beschrieben wurden. Der erste Schritt beim Import von Proteinen, die NLS vom basischen Aminosäuretyp enthalten, findet in Zytosol statt, wo die NLS-haltigen Proteine an einen Rezeptor (abwechselnd NLS-Rezeptor, Importin α und Karyopherin genannt (13)) gebunden werden. Der Substrat-Rezeptor-Komplex lagert sich dann an die zytoplasmatische Seite der Kernporenkomplexe an und wird unter Beteiligung anderer zytosolischer Faktoren durch einen gesteuerten Kanal in den Kernporenkomplexen in das Zellkerninnere transportiert. Die In-vivo-Ereignisse des NLS-vermittelten Kernimports lassen sich in einem In-vitro-System unter Verwendung von Digitonin-permeabilisierten Zellen, supplementiert mit zytosolischen Extrakten und ATP, nachmachen (14). Dabei wird der Transport in diesem In-vitro-Test von den gleichen Inhibitoren blockiert, die den In-vivo-Import blockieren, ist dabei schnell und ist leicht zu quantifizieren.
Es wurde vorgeschlagen, daß die NLS der Sequenz NYKKPKL im N-Terminus des Fibroblastenwachstumsfaktors (Fibroblast Growth Factor, FGF)-1, dem Vorläufer für sauren FGF, die Langzeitaktivitäten von FGF-1 über ihre Funktion als Kerntranslokationssignal oder ihre Rolle bei der Stabilisierung der für die Aufrechterhaltung der Bindung und Aktivierung der Transmembranrezeptorkinase benötigten Struktur beeinflußt. Luo, Y., et al., J. Biol. Chem. (1996), 271(43), 26876–26883. So führte beispielsweise eine sequentielle Deletion von Resten in der NYKKPKL-Sequenz in FGF-1 gleichzeitig mit einer deutlichen Erhöhung der Abhängigkeit von exogenem Hiparin für optimale Aktivität zu einem fortschreitenden Verlust der Temperaturstabilität, Resistenz gegen Protease, Mitogenaktivität und Affinität für den Transmembranrezeptor. Die größte Änderung ergab sich bei Deletion der gesamten Sequenz vom Lysin- bis zum Leucinrest. In Gegenwart ausreichend hoher Konzentrationen an Heparin zeigten die Deletionsmutanten eine ähnliche Mitogenaktivität wie Wildtyp-FGF-1.
Obwohl FGF-1 eine NTS enthält, benötigt die Kerntranslokation einen exogenen und nicht einen endogenen Weg. Die NTS von FGF-1, NYKKPKL, ist in der Lage, die Expression des bakteriele1n β-Galactosidase(βgal)-Gens zum Zellkern transfizierter NIH-3T3-Zellen zu leiten, doch ist diese NTS weder im Stande, FGF-1 selbst noch ein FGF-1-βgal-Fusionsprotein in den Zellkern als Ziel zu steuern, was darauf schließen läßt, daß FGF-1 eine zusätzliche Sequenz enthalten könnte, die endogen exprimierten FGF-1 daran hindert, in den Zellkern translokalisiert zu werden. Zhan, X., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992), 188(3), 982–91.
Interferon-γ(IFN-γ), ein Protein, das den Jak-Stat-Weg für die Signaltransduktion verwendet, translokalisiert schnell zum Zellkern in extrazellulär mit dem Zytokin behandelten Zellen. Im C-Terminus von IFN-γ von Mensch und Maus wurde eine NLS identifiziert und charakterisiert. Von Larkin, J., et al., J. Interferon Zytokine Res. (2001), 21(6), 341–348 wird berichtet, dass menschliches IFN-γ (HuIFN-γ) eine zweite NLS an einer stromaufwärts liegenden Stelle enthält. Die Primärsequenz, die analog zur in Maus-IFN-γ identifizierten NLS-Sequenz ist und die Aminosäuren 122–132 von HuIFN-y repräsentiert, war in der Lage, den Kernimport des Autofluorezenzproteins Allophycocyanin (APC) in energieabhängiger Weise zu vermitteln. Die zweite Sequenz, die die Aminosäuren 78-92 von HuIFN-γ repräsentiert, war ebenso in der Lage, den Kernimport von APC in energieabhängiger Weise zu vermitteln, allerdings in stark reduziertem Ausmaß. Der Kernimport beider an APC konjugierter Sequenzen wurde durch Kompetition mit nicht konjugiertem HuIFN-γ(122-132) stark blockiert.
Kompetition durch die Sequenz HuIFN-γ(78-92) blockierte in wirksamer Weise den Import von APC-konjugiertem HuIFN-γ(78-92), war jedoch in der gleichen Konzentration nicht in der Lage, den Kernimport von APC-konjugiertem HuIFN-γ(122-132) zu hemmen, was darauf schließen läßt, daß HuIFN-γ(78-92) eine weniger wirksame NLS darstellte als HuIFN-γ(122-132). Dies ist mit einem Verlust von > 90% der antiviralen Aktivität von HuIFN-γ, dem die stromabwärts liegende NLS bei 122-132 fehlt, vereinbar. Der Kernimport von APC-konjugierten HuIFN-γ(122-132) wurde von einem Peptid, das die prototypische polybasische NLS der SV40-T-NLS enthält, gehemmt, was darauf schließen läßt, daß in beiden Fallen die gleiche Ran/Importin-Zellmaschinerie verwendet wird.
Es scheint eine starke Konservierung des NLS-Motivs als Mechanismus für die Kernlokalisierung vorzuliegen. In der Evolution scheint bei der Kompartimentalisierung von DNA-bindenden Proteinen in den Zellkern ein Teil des existierenden DNA-Bindungsmechanismus verwendet worden zu sein. Von Cokol, M., et al., EMBO Rep. (2000), 1(5), 411–415 wird geschätzt, daß mehr als 17% aller eukaryontischen Proteine in den Zellkern importiert werden dürften, wobei ein Satz von 91 experimentell verifizierten NLS aus der Literatur analysiert und dieser Satz über iterierte „in-Silico-Mutagenese" auf 214 potentielle NLS erweitert wurde. Dieser endgültige Satz paßte bei 43% aller bekannten Zellkernproteine und bei keinem bekannten nicht im Zellkern vorhandenen Protein. Von Cokel et al. wurde eine Überlappung zwischen der NLS und dem DNA-bindenden Bereich bei 90% der Proteine, bei denen sowohl die NLS als auch die DNA-bindenden Bereiche bekannt waren, festgestellt, doch überlappten nur 56 der 214 NLS-Motive mit DNA-bindenden Bereichen. Diese 56 NLS ermöglichten eine de-novo-Vorhersage partieller DNA-bindender Bereiche für ungefähr 800 Proteine in Mensch, Fliege, Wurm und Hefe.
Vor kurzem wurde berichtet, daß das NLS-Signalpeptid Strukturänderungen der DNA induzieren kann. Das Pflanzenenzym Glutaminyl-tRNA-Synthetase (GlnRS) aus Lupinus luteus enthält eine NLS am N-Terminus, ein lysinreiches Polypeptid, KPKKKKEK. Krzyzaniak, A., et al., Mol. Biol. Rep. (2000), 27(1), 51–54. Zwei synthetische Peptide (20 bzw. 8 Aminosäuren lang), die von der NLS-Sequenz von Lupine-GlnRS abgeleitet sind, Wechselwirken mit DNA. Darüber hinaus führte das kürzere, 8 Aminosäuren lange Peptid dazu, daß die DNA ihre Konformation von der B- zur Z-Form änderte. Diese Beobachtung läßt eindeutig darauf schließen, daß das Vorliegen des NLS-Polypeptids in einer Leitsequenz von GlnRS nicht nur für den Proteintransport in den Zellkern, sondern auch für die Regulation einer Genexpression benötigt wird. Hierbei handelt es sich um den ersten Bericht, bei dem eine Rolle des NLS-Signalpeptids bei Strukturänderungen der DNA vorgeschlagen wird.
Typischerweise liegt eine starke Konservierung der NLS-Sequenz innerhalb von Spezies vor. So weist beispielsweise die NLS im N-terminalen Bereich des Proteins Smad 3, dem an der TGF-β-Signaltransduktion beteiligten bedeutendsten Smad-Protein, ein basisches Motiv auf, Lys⁴⁰Lys-Leu-Lys-Lys⁴⁴, das unter allen Wegspezifischen Smad-Proteinen konserviert ist und für den Smad 3-Kernimport als Antwort auf Ligand benötigt wird. Bei den Smad-Proteinen handelt es sich um intrazelluläre Vermittler des Transformationwachstumsfaktors-β (Transforming Growth Factor, TGF-β) und verwandter Zytokine. Von Xiao, Z. et al., J. Biol. Chem. (200), 275(31), 23425–23428 wurde die Rolle identifiziert, die die NLS bei der Kernlokalisierung spielt. Von den Autoren wurde gezeigt, daß die isolierte MH1-Domäne von Smad 3 eine signifikante spezifische Bindung an Importin β zeigt, die durch Mutationen in der NLS verringert oder beseitigt wird. Vollängen-Smad 3 zeigt eine schwache, jedoch spezifische Bindung an Importin β, die nach Phosphorylierung durch den TGF-β-Rezeptortyp I verstärkt wird. Im Gegensatz dazu wurde keine Wechselwirkung zwischen Importin α und Smad 3 oder dessen MH1-Domäne beobachtet, was darauf hindeutet, daß die Kerntranslokation von Smad-Proteinen über eine direkte Bindung an Importin β stattfinden könnte. Von den Autoren wird die Schlußfolgerung gezogen, daß durch Aktivierung aller Weg-spezifischen Smad-Proteine (Smads 1, 2, 3, 5, 8 und 9) das konservierte NLS-Motiv exponiert wird, was dann direkt an Importin β bindet und die Kerntranslokation auslöst.
In allen Zellen dient die Lipiddoppelschicht von Zellmembranen als selektive Grenzschicht für die Passage geladener Moleküle, wobei die Internalisiserung hydrophiler Makromoleküle über klassische Transportwege erreicht wird (Hawiger, J., Curr. Opin. Chem. Biol. 3, 89–94 (1999), Scharze, S. R., et al., Trends in Cell Biology 10, 290–295 (2000)). An diesen klassischen Mechanismen zur Internalisierung ist eine rezeptorvermittelte Endozytose oder transporterabhängige Aufnahme beteiligt (Cleves, A. E., Current Biology 7, R318–R320 (1997)). Im Gegensatz dazu wurden mehr und mehr Moleküle entdeckt, denen klassische Import- und/oder Exportsignale fehlen (Cleves, A. E., Current Biology 7, R318–R320 (1997)). Diese Moleküle erhalten direkten Zugang zu entweder zytoplasmatischen oder Zellkernkompartimenten unter Einsatz unkonventioneller Vorgänge, deren Mechanismen weitgehend unbekannt bleiben. Diese neuen Mechanismen werden allgemein als „nichtklassisch" bezeichnet, was sich darauf bezieht, daß die verwendeten Transportwege atypisch sind. Relevante Beispiele für diesen letzteren Typ finden sich in den gencodierten Proteinen HIV-1-TAT (Frankel, A. D. und Pabo, C. O. Cell 55, 1189–1193 (1988)), Herpesvirus-VP22 (Elliott, G. und O'Hare, P. Cell 88, 223–233 (1997)), und Antennapedia, Antp (Derossi, D., et al., J. Biol. Chem. 269, 10444–10450 (1994)). Es ist nun allgemein bekannt, daß die Vollängenproteine von HIV-1-TAT (Helland, D. E., et al., J Virol 65, 4547–4549 (1991)) und VP22 (Pomeranz, L. E. und Blaho, J. A., J Virol 73, 6769–6781 (1999)) schnell in die und aus den Zellmembranen translokalisieren. Tatsächlich wurden in beiden dieser Proteine bestimmte Peptidbereiche identifiziert, die zur Translokalisierung in Zellkompartimente entweder allein oder in Kombination mit chimerischen Frachtpeptiden und -proteinen in der Lage sind (Lindgren, M., et al., Trends Pharmacol. Sci. 3, 99–103 (2000), Derossi, D., et al., Trends Cell Biol., 8, 84–87 (1998), Prochiantz, A., Current Opinion in Cell Biology 12, 400–406 (2000), Steven R. Schwarze, S. R., et al., Trends in Cell Biology 10, 290–295 (2000)). Im Gegensatz dazu konnte nicht gezeigt werden, daß das Vollängen-Ante-Protein biologische Membranen durchquert; allerdings besitzt ein aus seinem codierenden Bereich abgeleitetes synthetisches Peptid von 16 Aminosäuren starke membranpenetrierende Fähigkeiten (Derossi, D., et al., Trends Cell Biol., 8, 84–87 (1998)). Die anerkannte Sichtweise des von diesen Molekülen verwendeten atypischen Transports wurde als „Transduktion" bezeichnet (Schwarze, S. R., et al., Trends in Cell Biology 10, 290–295 (2000)) und wird gegenwärtig als ein äußerst schneller Membrantransportweg definiert, der rezeptor- und energieunabhängig ist und bei 4°C in allen Zellarten stattfinden kann (Schwarze, S. R., und Dowdy, S. F., Trends Pharmacol. Sci. 21, 45–48 (2000)). Interessanterweise handelt es sich bei diesen drei Proteinen allesamt um Zellkernproteine, die an der Transkriptionsregulation beteiligt sind, wobei ihre jeweiligen transduzierenden Peptide aus Aminosäuresträngen bestehen, die reich an Arginin und Lysin sind (Lindgren, M., et al., Trends Pharmacol. Sci. 21, 45–48 (2000)). Allerdings können unabhängig von diesen Ähnlichkeiten diese transduzierenden Peptide viele unterschiedliche Eigenschaften besitzen, wie etwa Aminosäuresequenz, Länge der Sequenz, Zellokalisierung und Stärke der Membranpenetration. So konnte bislang trotz der Tatsache, daß jede transduzierende Sequenz Zellen und Gewebe penetrieren kann, noch nicht ermittelt werden, ob sie identische atypische Transportmechanismen verwenden.
Schließlich lehrt die USP 6,022,950 die Verwendung eines Hybridmoleküls eines Teils der Bindungsdomäne eines Zellbindungspolypeptidliganden, der die Bindung des Hypridproteins an eine Zelle eines Tiers bewirkt, einer Translokalisierungsdomäne eines natürlich vorkommenden Proteins, das den dritten Teil über die zytoplasmatische Membran in das Zytosol der Zelle translokalisiert, und einer in die Zelle einzuführenden chemischen Einheit. Allerdings lehrt das Patent die Translokalisierungsdomänen von Toxinen. Zu natürlich vorkommenden Proteinen, die dafür bekannt sind, daß sie eine Translokalisierungsdomäne aufweisen, gehören Diphtherietoxin und Pseudomonas-Exotoxin A und möglicherweise ebenso weitere Toxine und Nichtoxinmolekül. Die Translokalisierungsdomänen von Diphtherietoxin und Pseudomonas-Exotoxin A sind gut charakterisiert, (siehe z. B. Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1692–1696, 1985; Colombatti et al., J. Biol. Chem. 261: 3030–3035, 1986; und Deleers et al., FEBS 160: 82–86, 1983), und die Existenz und Lokalisierung einer solchen Domäne in anderen Molekülen kann mit Verfahren, wie etwa den von Hwang et al., Cell 48: 129–136, 1987 und Gray et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2645–2649, 1984, eingesetzten Verfahren, bestimmt werden.
Bei dem beträchtlichen Volumen an Literatur, die die Kontrollmechanismen der Zellokalisierung, die bei der Regulation des intrazellulären Transports beteiligten Proteine, die unterschiedlichen Eigenschaften und Kontrollmechanismen für die Plasmamembran und die Zellkernhülle lehrt, kommt es unerwartet, daß von Säugerproteinen abgeleitete Polypeptide durch die Plasmamembran hindurch unter Verwendung nicht klassischer Mechanismen transduzieren könnten und sich somit als membranpenetrierende Peptide, die als Vorrichtungen zur In-vitro-, Ex-vivo- und In-vivo-Zuführung einer interessierenden Verbindung nützlich sind, eignen könnten. Ebenso ist eine beträchtliche Menge an Literatur vorhanden, die nicht auf Proteinen beruhende Verfahren zur Zuführung einer interessierenden Verbindung in Zellen lehrt, beispielsweise Elektroporation, Membranfusion mit Liposomen, Beschuß mit DNA-beschichteten Mikroprojektilen mit hoher Geschwindigkeit, Inkubation mit Calciumphosphat-DNA-Präzipitat, DEAE-Dextranvermittelte Transfektion, Infektion mit modifizierten viralen Nukleinsäuren und direkte Mikroinjektion in einzelne Zellen, üblicherweise Eizellen, und dergleichen. Alle diese Verfahren sind jeweils relativ ineffizient, was in einem relativ geringen Prozentanteil der die zugeführte interessierende Verbindung enthaltenden Zellen resultiert. Viele der Verfahren sind für die Zellen toxisch und führen zu einer relativ hohen Apoptose. Daher besteht ein beträchtlicher Bedarf an einer einfachen und effizienteren Zuführung interessierender Verbindungen in Zellen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf von Säuger- und Hefeproteinen abgeleitete Polypeptide, die sich als Träger für die In-vitro-Zuführung einer interessierenden Verbindung eignen. Ebenso werden durch die Erfindung diese Polypeptide enthaltende Zusammensetzungen sowie Verfahren zur Zuführung einer interessierenden Verbindung in vitro bereitgestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1.(A). Schematisches Diagramm von hPER1-Fusionskonstrukten, das die Orte der PAS, die zytoplasmatische Lokalisierung und die Kernlokalisierungssequenz (NLS, jedoch als Kernlokalisierungsdomäne (NLD) in der Figur angegeben) zeigt. Der Name und die Position der Fusionskonstrukte sind auf der linken Seite aufgeführt. Die Zahl bedeutet den ersten bzw. letzten Aminosäurerest in hPER1-Protein. Die Hauptstellen für die Akkumulierung eines jeden Fusionsproteins sind auf der rechten Seite zusammengefaßt, (n) nukleär, (no) Nukleolen, (c) zytoplasmatisch, (diff) diffus. Alle Konstrukte wurden N-terminal mit dem Tag EYFP versehen. Unten ist die vergleichende Gegenüberstellung von Mensch- und Maus-PER1-NLS dargestellt.
1.(B). Zellokalisierung von hPER1-Fusionsproteinen, wie in 1A oben beschrieben, in lebenden Zellen. Cholesterin-Zellen wurden transient mit den jeweils oberhalb der Tafeln angegebenen Fusionskonstrukten transfiziert, und die subzelluläre Lokalisierung der EYFP-Reporter (grün) direkt unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops 10 h nach der Transfektion beobachtet. Der EYFP-Vektor allein wird als Kontrolle verwendet (siehe 5. EYFP-VECTOR).
2.(A). Membranpenetrationstest in Cholesterin-Zellen. N-terminale biotinylierte synthetische Peptide hPER1-PTD, Flag-hPER1-PTD, Flag-TAT-PTD (Positivkontrolle) und Flag-Flog (Negativkontrolle) wurden auf ihre Fähigkeit zur Penetration von Zellmembranen in lebenden Cholesterin-Zellen in Kultur getestet. Die subzelluläre Lokalisierung internalisierter Peptide wurde mittels eines Zwei-Farben-Anfärbeverfahrens, und zwar entweder mit Streptavidin-Alexa 594 (rot) oder Anti-Flag-mAb (grün), bestimmt. Bei der dritten Spalte handelt es sich um eine Überlagerung (gelb). Zur weiteren Bestätigung der intrazellulären und intranukleären Lokalisierung wurde konfokale Mikroskopie eingesetzt. Es wird ein Einzelausschnitt der konfokalen Abbildung gezeigt.
2.(B). Nukleäre Zielansteuerung biotinylierter Peptide hPER1-NLD (auch als hPER1-PTD bekannt) im Vergleich mit TAT-PTD und Flag-Flag (Negativkontrolle) unter Verwendung von Streptavidin-Alexa-594-Fluoreszenz (grün). Zur Anfärbung des Zellkerns wurde Höchst 33258 mit 5 ng/ml verwendet (blau, mittlere Spalte). Bei der dritten Spalte handelte es sich um eine Überlagerung der konfokalen Abbildung.
3. Alanin-Scanning von hPER1-PDTs. Biotinylierte hPER1-NPDs wurden mit einem Austausch eines einzelnen Aminosäurerests an der angegebenen Position gegen ein Alanin synthetisiert und auf Membranpenetration in CHO-Zellen getestet. Die Zellen wurden 10 Minuten bei 37°C und einer Peptidkonzentration von 10 μM inkubiert und anschließend gewaschen, fixiert und permeabilisiert und danach mit markiertem Streptavidin Alexa-594 (rot, 2 μg/ml) 15 Minuten bei RT nachgewiesen. Das Kontrollpeptid stammte von den N-terminalen Aminosäureresten 486-500 von hPER1.
4. Aktivierung des Serotonin-5HT2A-Rezeptors mit hPER1-MPP-Fusionspeptid. (A). Die Peptide hPER1-MPP und TAT-PTD wurden allein oder als Fusion entweder mit der ersten intrazellulären Schleife I1 (SLEKKLQNATN) oder der C-terminalen Transmembran-7-Domäne, TM7 (KTYRSAFSRYIQYKENKKPLQLI), aus dem 5HT2A-Rezeptor, Genebank-Zugangsnummer M86841) stammend, synthetisiert. Rezeptoraktivitäten wurden mittels FLIPR-Standardanalyse und Messen endogener und exogener Ca⁺¹- Spiegel getestet. Die Peptidbezeichnungen sind wie folgt:
T (TAT-PTD), P (hPER1-MPP), I1 (intracelular Loop 1), T-I1 (TAT-PTD-I1), P-I1 (hPER1-MPP-I1), TM7 (C-terminale Domäne), TTM7 (TAT-PTD-TM7), PTM7 (hPER1-MPP-TM7) und S (Serotonin).
4(B). Dosis-Wirkungs-Kurve der Peptide PTM7 (geschlossene Kreise) und TTM7 (geschlossene Rauten). Serotonin (Kontrolle, offenes Dreieck) wurde mit der maximalen rezeptorstimulierenden Konzentration von 10 μM eingesetzt.
5. Identifizierung zusätzlicher PTDs. Mutmaßliche PTD-Sequenzen wurden unter Verwendung eines kombinierten Bioinformatikverfahrens, unter Einschluß von SwissPro, PRF, PIR-Protein Info Resource, PDB, mit von dem mit Anmerkungen versehenen proteincodierenden Bereich translatierten Peptidsequenzen in GenBank mit „Transkriptionsfaktor" als Schlüsselwort gesucht. Zunächst wurde nach allen bekannten oder mutmaßlichen NLS gesucht. Zweitens wurde das PHI-BLAST(Pattern-Hit Initiative BLAST)-Verfahren eingesetzt, um nach dem Auftreten des degenerativen Musters [R/H/K]-[R/H/K]-[R/H/K]-[R/H/K], (X)n, wobei n für eine ganze Zahl von 4 oder höher steht und X jeweils unabhängig entweder als Arginin, Histidin oder Lysin ausgewählt ist, eingesetzt. 7374 mutmaßliche PTD-Sequenzen wurden identifiziert. Aus den zwei Suchen wurden (A) biontinylierte Peptide zu diesen Sequenzen synthetisiert oder (B) „in Frame"-Fusionsproteine mit GFP erzeugt und CHO-Zellen transfiziert. Es stellte sich heraus, daß 9 der 12 Peptide transduzieren und alle Sequenzen zum Zellkern in transfizierten Zellen lokalisieren. Die Peptide hPER1-PTD, hPER3-PTD und TAT-PTD wurden als Positivkontrollen verwendet. Sechs positive Sequenzen und 2 negative Sequenzen sind dargestellt. Die Nummern repräsentieren die Aminosäure reste innerhalb der Ausgangsproteinsequenz, wobei die GenBank-Zugangsnummern für diese Proteine wie folgt angegeben sind: (M24899, menschliches Thyroidhormon-1; L12699, menschliches Homeoboxprotein Engrailed 1 HME1; X16416, menschliche Protooncogen-Thyrosinproteinkinase ABLi;;Q02575, menschliches HEN1/NSLC1; Q02577, menschliches HEN2/NSLC2; AAA74561, Ratten-HNF-3; CAB65887, Drosophila cAMP-abhängiger Transkriptionsfaktor). Die drei negativen Peptide sind (V01512, c-Fos; AAD53184, menschliches Cyclin L ania-6a; CAB66914, Arabidopsis β-zip-Transkriptionsfaktor).
6. hPER-PTD transportiert β-Galctosidase als Fracht in Zellen: Zumindest ein Merkmal von HIV-TAT-transduzierendem Peptid besteht in seiner Fähigkeit, Proteine als Fracht in Zellen und Gewebe zu transportieren. Daher wurde versucht, zu bestimmen, ob hPER1-transduzierendes Peptid beta-Galactosidase als Fracht in Zellen transportieren könnte. Zur Durchführung dieses Experiments wurde einer Vorschrift von Frankel et al. 1989 (19): 7397–401 gefolgt, wonach hPER1-PTD oder hPER-PTD R7A chemisch mit Vollängen-β-Galactosidase verknüpft und auf die Fähigkeit dieser Konjugate und des beta-Galactosidaseproteins allein zur Transduktion in CHO-Zellen getestet wurde. Wie in 6, links, gezeigt, zeigten mit hPER-PTD-β-Galactosidase-Fusionsprotein inkubierte Zellen eine positive enzymatische Aktivität für β-Glactosidase, wie durch die blaue Farbe in den Zellen nach Zugabe von X-gal angezeigt wird. Allerdings war weder hPER-MPP-R7A-β-Galactosidase (Mitte) noch β-Galactosidaseprotein (rechts) allein in der Lage, in die Zellen einzudringen, wie durch eine Reaktivität ohne Blaufärbung nach Zugabe von X-Galactosidase angezeigt wird. Diese Daten deuten daraufhin, daß hPER1-PTD wie das TAT-Peptid ein großes (120 kD) Protein als Fracht in Zellen transportieren kann.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß das Protein hPER1 (Human Period1) eine NLS enthält, die nun auch als ein MPP identifiziert wurde und sich als eine Zuführungsvorrichtung für die intrazelluläre Zuführung einer interessierenden Verbindung eignet. hPER1 ist an der Regulation des Zirkadianrhythmus beteiligt, wobei das Vermögen von hPER1, in benachbarte Zellen zu translokalisieren, kritisch für seine biologische Gesamtfunktion bei der Regulation des Zirkadianrhythmus sein kann. Die hPER1 identifizierte NLS paßt nicht zu bereits zuvor identifizierten NLS-Sequenzen, und ihre Identifizierung führte zur Identifizierung eines Algorithmus für die Suche nach anderen NLS-Sequenzen, die auch eine Funktion als MPP haben könnten.
Period 1 (hPER1) ist ein an der Transkriptionsregulation beteiligtes Zellkernprotein. Es stellt eine essentielle Komponente im „Getriebe" der biologischen Uhr dar (Brown, S. A., und Schibler, U., Current Opinion in Genetics & Development 9, 588–594 (1999), Dunlap, J. C., Cell 96, 271–290 (199)), wobei in Untersuchungen bei Mäusen gezeigt werden konnte, daß das Eindringen von PER1 in den Zellkern für die Herunterregulierung von CLOCK/BMAL-Transkriptionskomplexen essentiell ist (Gekakis N, et al., Science 280, 1564–1569. (1998), Yagita, K., et al., Genes Dev 14, 1353–1363 (2000), Lowrey, P. L., et al., Science 288, 483–492 (2000)). Allerdings wurde bis heute die funktionelle NLS für menschliches PER1 noch nicht aufgeklärt. In der vorliegenden Erfindung wurde die NLS im hPER1 identifiziert und gezeigt, daß die 16 Aminosäuren und 13 Aminosäuren lange Sequenz, siehe 3. hPER1-NLS-Peptid, hPER1-MPP, eine starke membranpenetrierende Fähigkeit aufweist. Die vorliegende Arbeit führt zur Identifizierung von vier zusätzlichen MPPs, die auch aus Zellkernproteinen abgeleitet sind.
Bei PER1 handelt es sich um eine zentrale Komponente in der Zirkadianuhr, und sein Eintritt in den Zellkern spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Tagesschwankungen (Jin, X., et al., Cell 96, 57–68 (1999), Sengoram, A. M., et al., Neuron 21, 1101–13 (1998)). Mittels Deletions- und Fusionsproteinanalyse wurde eine NLS identifiziert, die für die Kernlokalisierung von hPER1 notwendig und hinreichend ist. Diese Funktionsanalyse war notwendig, da die NLS von hPER1 nicht den klassischen Kernlokalisierungskonsensusmotiven entspricht und daher nicht mit NLS-Standardsuchverfahren identifiziert wurde. Es wird hier gezeigt, daß eine einzige Kopie von hPER1-NLS zur Induktion der Kernlokalisierung eines Reporterproteins und von mit einem Tag versehenen hPER1-Fragmenten (P1-F2 bis P1F7) in transfizierten Zellen ausreicht. Die PER1-NLS ist zwischen den Aminosäuren (830-845) von hPER1 lokalisiert und ist in einem Strang von 13 Aminosäuren, der reich an Arginin, Histidin und Lysin (siehe Tabelle 1) ist und sich in keinen anderen PERs oder anderen Zellkernproteinen in verfügbaren Datenbanken findet, eingebettet. Daher verwenden PERs 2 und 3, obwohl es sich bei ihnen um Zellkernproteine handelt (Jin, X., et. al., Cell 96, 57–68 (1999)), anscheinend alternative Sequenzen und/oder Mechanismen für ihren Import in den Zellkern.
Es konnte gezeigt werden, daß Peptidfragmente einer begrenzten Anzahl von Zellkernproteinen, die reich an basischen Resten sind, in Zellmembranen auf eine rezeptorlose, energieunabhängige Weise penetrieren. Es wurde demonstriert, daß Sequenzen drei derartiger Proteine, TAT, Antp und VP22, die Fähigkeit zur Penetration besitzen und Fusionsmoleküle als Fracht in Zellen und Gewebe über einen noch undefinierten Mechanismus transportieren können. Siehe beispielsweise USP 5,804,604 , 6,747,641 , 5,674,980 , 5,670,617 und 5,652,122 , erteilt an Frankel et al., in denen die Verwendung eines neun Aminosäure langen, von HIV-TAT abgeleiteten Polypeptids (Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) für die intrazelluläre Zuführung von Frachtmolekülen gelehrt wird.
Die Ähnlichkeiten zwischen hPER1, der hPER1-NLS und anderen MPPs veranlaßte uns zu untersuchen, ob hPER1-MPP membranpenetrierende Fähigkeit besitzen könnte oder nicht. Die hier vorgelegten immunhistochemischen und zytologischen Daten deuten darauf hin, daß das hPER1-MPP als MPP in verschiedenen Zelltypen fungiert. hPER1-MPP zeigte eine starke Anfärbung der Foci im Zellkernplasma ebenso wie in Nukleolus, was darauf schließen läßt, daß sich die subnukleäre Adresse von hPER1-MPP von dem Protein hPER1 (P1-FL) unterscheidet, das im Zellkern diffundiert, jedoch nicht im Nukleolus konzentriert war. Die zelluläre Penetration von hPER1-MPPs wird selbst unter den Bedingungen einer Umkehrung der Sequenz (umgekehrtes hPER1-MPP), der Zugabe negativ geladener Reste oder der Vorfixierung der Zellen mit 4% PFA, unveröffentlichte Beobachtung, blockiert, wobei letzteres die Idee unterstützt, daß die Penetration rezeptor- und membranunabhängig ist. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu anderen Peptidklassen, die beschrieben wurden und die von Signalpeptidsequenzen (Hawiger, J., Curr. Opin. Immunol. 9, 189–94 (1997)), DNA-Antikörpern (Deng, S. X., et al., Int. Immunol. 12, 415–423 (2000)) und anderen Proteindomänen (Lindgren, M. et al., Trends Pharmacol. Sci. 3, 99–103 (2000)), die die Zellmembranen unter Verwendung langsamer, temperatur-, energie- und rezeptorabhängiger Mechanismen binden und durchqueren, abgeleitet sind.
Die Identifizierung anderer MPPs wurde bislang durch unser mangelndes Verständnis der für die Membranpeptidpenetration notwendigen Mechanismen und strukturellen Anforderungen beschränkt. Die Wahrscheinlichkeit, daß eine spezifische Peptidstruktur und/oder -ladung für die Membranpenetration wichtig ist, wird in den Alanin- Scanning-Experimenten demonstriert, wonach eine einzige Aminosäureänderung an Arginin 7 kritisch für das MPP-Potential zu sein scheint. Durch Vergleichen von Wildtyp-hERP-MPP mit modifiziertem P1-R7A in lebenden Zellen oder vorfixierten und permeabilisierten Zellen (Daten nicht gezeigt) weist der P1-R7A nur eine defekte Penetration, aber keine defekte nukleäre Zielansteuerung auf, sobald die Zellen permeabilisiert wurden. Dieses Ergebnis läßt darauf schließen, daß Arginin 7 eine Hauptrolle bei der auf der Struktur beruhenden Penetration besitzt und somit ein sinnvolles Modell für zukünftige Struktur-Funktionsuntersuchungen darstellt. Für das TAT-Peptid wurden keine Strukturdeterminanten beschrieben, doch führt im Fall von Antp der Austausch der beiden Tryptophanreste gegen zwei Phenylalanine zur Beseitigung der Penetration (Le Roux, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 9120–9124 (1993)). Da hPER1-MPP keine Tryptophanreste enthält, dürfte die Membranpenetration zwischen diesen beiden Peptiden über andere Mechanismen erfolgen.
Vollängen-HIV-TAT und -VP22, denen jeweils klassische sekretorische Signalsequenzen fehlen und die daher über nicht klassische Mechanismen exportiert werden, können ebenso „durch Transduktion" auf nicht klassische Weise in Zellen importiert werden (Prochiantz, A., Current Opinion in Cell Biology 12, 400–406 (2000)). Daher läßt sich interessanterweise spekulieren, daß hPER1 vielleicht Informationen über die zirkadiane Uhr an benachbarte SCN-Neuronen oder an zirkadiane Ausgabewege über „Transduktions"-Mechanismen ähnlich wie Vollängen-THT- und -VPP22-Proteine verteilt. Allerdings verleiht die Tatsache, daß im Körper eines Proteins membranpenetrierende Sequenzen vorliegen, nicht unbedingt membranpenetrierende Fähigkeiten, da Vollängen-Ante-Protein weder aus den Zellen exportiert noch in Zellen importiert wird. Somit ist es unwahrscheinlich, daß die nichtklassische Penetration der Antp-Peptide in die Zellen eine physiologische Relevanz hat, und wie bei Antp gibt es keine Hinweise dafür, die darauf schließen lassen, daß es sich bei Vollängen-hPER1 um ein zellmembranpenetrierendes Protein handelt. Jedoch ermutigten diese Ergebnisse uns, nach anderen MPP-haltigen Proteinen zu suchen. Durch das Durchsuchen von Proteindatenbanken mit einem Algorithmus, der dafür vorgesehen war, Stränge basischer Reste innerhalb von Zellkernproteinen zu identifizieren, wurden Hunderte von Proteinen entdeckt, die potentielle membranpenetrierende Peptidbereiche enthielten, sowie 4 zusätzliche MPPs aus mehreren Spezies gefunden (siehe 5). Diese und weitere tiefschürfende Datenbanksuchen lassen darauf schließen, daß MPP-ähnliche Sequenzen häufig sind und in vielen verschiedenen Proteinen vorliegen. Allerdings müssen, wie viele mutmaßliche NLS, die bei der Fusion an Reportersequenzen nicht immer eine Kernlokalisierung verleihen (Moroianu, J., J. Cell Biochem. 32–33, 76–83 (1999)), eventuelle potentielle MPPs in Experimenten funktionell bestimmt werden. Zwar scheint es klar zu sein, daß sowohl transduzierende als auch nicht transduzierende Proteine MPP-Bereiche codieren können, doch bleibt die interessante Frage bestehen, ob MPP-ähnliche Sequenzen enthaltende Proteine diese Domänen zur schnellen intrazellulären Translokalisierung in zelluläre Domänen verwenden, um normale physiologische Vorgänge zu aktivieren, oder nicht. Die mit dem Transduktionsphänomen assoziierte Effizienz könnte besonders dann nützlich sein, wenn die schnelle Zuführung intrazellulärer Informationen kritisch ist, wie es beispielsweise bei Zellsynchronisierungs-, -entwicklungs- und -differenzierungsparadigmen der Fall sein kann.
Die Fähigkeit von MPPs, Moleküle als Fracht zu intrazellulären Kompartimenten zu transportieren, wird zunehmend nachgewiesen (Lindgren, M., et al., Trends Pharmacol. Sci. 3, 99–103 (2000), Derossi, D., et al., Trends Cell Biol., 8, 84–87 (1998)). Ähnlich wie andere MPPs können hPER1-MPP und andere hier identifizierte MPPs interessierende Verbindungen, wie etwa große Moleküle, d. h. Peptide und Proteine, Lipide, Polysaccharide, andere organische Moleküle, schnell und effizient in Zellen einführen. Die hier vorgelegten Daten demonstrieren, daß hPER1-MPP in Fusion mit entweder von serotonergen und/oder adrenergen 7TM-Rezeptor abgeleiteten Peptiden die Effekte ligandenaktivierter Rezeptoren imitiert (siehe 4 sowie nicht gezeigte Daten), was bestätigt, daß hPER1-MPP interessierende Verbindungen zu intrazellulären Kompartimenten translokalisiert, und die Idee unterstützt, daß physiologisch relevante Signalgebung von mit interessierenden Verbindungen verknüpften MPPs initiiert werden kann. Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren kann die vorliegende Erfindung erweitert werden, um eine Zielvalidierung unter Verwendung von mit Zielen verknüpften MPPs bereitzustellen.
Zusammengenommen zeigen die hier vorgelegten Ergebnisse ein von einem Säugerprotein und insbesondere einem menschlichen Zellkernprotein codiertes MPP, dessen zelluläre Penetration membranunabhängig ist und wahrscheinlich von der Peptidstruktur abhängt. hPER1-MPP steuert spezifische subnukleäre Stellen an, besitzt jedoch das Potential zur effizienten Zuführung anderer Makromoleküle an intrazelluläre Ziele.
Mit dieser Erfindung wird, was noch wichtiger ist, auch das erste Beispiel für die Kartierung eines neuen auf einer NLS-Domäne beruhenden MPP bereitgestellt und vorgeschlagen, daß viele MPP-ähnliche Bereiche in vielen verschiedenen Proteinen enthalten sind. Die hier angegebenen Daten demonstrieren, daß ein MPP auf dem Teil einer NLS beruhen oder mit einem Teil der NLS überlappen oder als Alternative ein neuartiges Peptid darstellen kann.
Verfahren zur Identifizierung von NLS-Sequenzen sind im Fachgebiet allgemein bekannt und umfassen NLS, bei denen zuvor festgestellt wurde, daß sie die Fähigkeit des nativen Proteins, in den Zellkern einzutreten, verleihen, oder bei denen es sich um eine mutmaßliche NLS aufgrund einer weitgehenden Sequenzhomologie mit einer zuvor identifizierten NLS handelt.
Als Alternative kann die NLS über Sequenzdeletionsexperimente identifiziert werden. Siehe beispielsweise Luo JC, Shibuya M A variant of nuclear localization signal of bipartite-type is required for the nuclear translocation of hypoxia inducible factors (1alpha, 2alpha und 3alpha). Oncogene. 2001 Mar 22; 20(12): 1435–44 oder Hodel MR, Corbett AH, Hodel AE, Dissection of a nuclear Localization Signal. J Biol Chem. 2001 Jan 12; 276(2): 1317–25.
Bevorzugte membranpenetrierende Peptide (MPP, auch als Peptidtransduktionsdomäne oder „PTD" bekannt) der vorliegenden Erfindung sind kleine Polypeptide und können von einer NLS eines Säuger- oder Hefeproteins abgeleitet sein oder damit überlappen. Bevorzugte Säugerproteine sind diejenigen der Spezies Mensch, Primaten, Maus oder Ratte. Im allgemeinen ist es bevorzugt, die gleiche Spezies für das NLS-abgeleitete Protein wie die zu behandelnde Zelle zu verwenden. Menschliche Spezies sind ganz besonders als NLS-abgeleitetes Protein bevorzugt, wenn dieses zur Behandlung menschlicher Zellen verwendet wird. NLS finden sich in einer breiten Klasse von Enzymen und sind nicht auf Zellkernproteine, Transkriptionsfaktoren, Zytokine und Kinasen beschränkt. Bevorzugte MPPs stammen aus Zellkernproteinen oder Transkriptionsfaktoren. Als Alternative handelt es sich bei MPPs der vorliegenden Erfindung um kleine Polypeptide, die eine Sequenz -(X-X-X-X)_n- umfassen, wobei n für eine ganze Zahl von 1 bis 7 steht und X jeweils unabhängig aus der Gruppe, bestehend aus Arginin, Histidin oder Lysin, ausgewählt ist. Dabei ist bevorzugt, daß kleine MPPs verwendet werden, weswegen bevorzugt ist, daß n eine ganze Zahl von 1 bis 5 und noch stärker bevorzugt eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist. Ausgewählte Ausführungsformen geeigneter MPPs sind in Tabelle 1 und Beispiel 5 aufgeführt.
Das MPP und/oder die interessierende Verbindung können chemisch getrennt synthetisiert werden, beispielsweise über chemische Synthesewege und unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagentien. Als Alternative kann das MPP und/oder die interessierende Verbindung, falls es sich um ein Polypeptid handelt, mittels rekombinanter Technologie synthetisiert und nach bekannten Verfahren aufgereinigt werden. Wirtszellen, Klonierungsvektoren, Promotoren und Oligonukleotidlinker sind allgemein bekannt und kommerziell erhältlich. Methoden zur Verwendung rekombinanter Technologie sowie Aufreinigungsverfahren sind ebenso allgemein bekannt, siehe Current Protocols in Molecular Biology, 4 Bände, Wiley. Im allgemeinen ist die rekombinante Technologie bevorzugt, da sie besser an eine Produktion im Großmaßstab angepaßt werden kann und ökonomischer für die Massenproduktion ist. Als Alternative können MPPs über spezifische Proteaseabbau eines Vorläuferproteins erhalten werden.
Die interessierende Verbindung kann an das MPP gebunden oder damit verknüpft werden, und zwar über chemische Quervernetzung am N- oder C-Terminus des MPP, so daß ein Konjugat (auch als eine Fusion bezeichnet) aus MPP und interessierender Verbindung erzeugt wird, beispielsweise über Disulfid- oder Esterverknüpfungen. In einer alternativen Ausführungsform kann, falls es sich bei der interessierenden Verbindung um ein Peptid handelt, das Peptid mittels rekombinanter Technologie mit einer Wirtszelle mit einem für eine Fusion der MPP-Sequenz und der interessierenden Verbindung codierenden Expressionsvektor unter Bedingungen, die die Expression des Vektors gestatten, unter Erhalt der Fusion aus MPP und interessierender Verbindung synthetisiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform können das MPP und die interessierende Verbindung über einen chemischen Linker gebunden oder verknüpft werden. Chemische Linker sind im Fachgebiet allgemein bekannt und umfassen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N-Hydroxysuccinimid (NHS), Maleiimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS), N-Ethyloxycarbonyl-2-ethyloxy-1,2-dihydrochinolin (EEDQ), N-Isobutyloxycarbonyl-2-isobutyloxy-1,2-dihydrochinolin (IIDQ). Bevorzugte Linker können auch monomere Einheiten darstellen, wie etwa eine einzelne Aminosäure, wobei ganz besonders solche Aminosäuren mit kleinen Seitenketten bevorzugt sind, oder auch eine kleine Polypeptidkette oder polymere Einheiten aus mehreren Aminosäuren darstellen. Bevorzugte Polypeptidlinker weisen fünfzehn Aminosäuren oder weniger auf, wobei Polypeptidlinker mit zehn oder weniger Aminosäuren besonders bevorzugt sind. Noch stärker bevorzugt sind Polypetidlinker mit fünf oder weniger Aminosäuren. In einer alternativen Ausführungsform kann es sich bei dem Linker um eine für eine kleine Polypeptidkette codierende Nukleinsäure handeln; bevorzugte Linker codieren dabei für ein Polypeptid von fünfzehn Aminosäuren oder weniger. Stärker bevorzugte Linker sind Nukleinsäuren, die für eine kleine Polypeptidkette von zehn oder weniger Aminosäuren codieren. Noch stärker bevorzugte Linker sind Nukleinsäuren, die für ein kleines Polypeptid von fünf oder weniger Aminosäuren codieren, wie etwa Gly-Phe-Le-Gly, Gly-Gly, Gly-Leu oder Gly, und dergleichen.
Die rekombinante Technologie kann zur Expression einer Fusion aus MPP, Linker und interessierender Verbindung, wie oben beschrieben, verwendet werden und ist im Fachgebiet allgemein bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform kann es sich bei dem Linker um einen spaltbaren Linker handeln, was zur Spaltung des MPP und der interessierenden Verbindung führt, sobald diese dem Gewebe oder der Zelle der Wahl zugeführt wurden. In einer solchen Ausführungsform würde die Zelle bzw. das Gewebe ein endogenes Enzym (entweder natürlich vorkommendes Enzym oder zur Expression des Enzyms rekombinant konstruiert) oder exogenes Enzym (z. B. durch Injektion, Absorption oder dergleichen) aufweisen, das zur Spaltung des spaltbaren Linkers fähig ist. Zu geeigneten Enzymen für die Spaltung zählen beispielsweise die Verwendung einer KEX2-Proteaseerkennungsstelle (Lys, Arg), die zwischen Glucoamylase und dem gewünschten Polypeptid inseriert ist, um die In-vivo-Freisetzung des gewünschten Polypeptids vom Fusionsprotein als Ergebnis der Wirkung einer nativen Aspergillus KEX2-ähnlichen Protease zu gestatten (Contreras et al., 1q991; Broekhuijsen et al., 1993; Ward et al., 1995). Ein weiteres Beispiel für ein spaltbares Linkerpeptid umfaßt die Erkennungssequenz Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, wobei das Fusionsprotein durch Enterokinase spaltbar ist.
Als Alternative kann der Linker biologisch abbaubar sein, so daß die interessierende Verbindung von der Fusion aus MPP und interessierender Verbindung mittels Hydrolyse und/oder enzymatischer Spaltung innerhalb der Zellen abgetrennt wird. Beispielsweise exprimieren Tumoren häufig spezifische Proteasen und werden bei der Zuführung von Arzneimittelvorstufen zytotoxischer Agentien verwendet. Der Linker kann für lysosomale Proteasen sehr tief sein, wie etwa Cathepsin B, C oder D. Die Zuführung von Arzneistoffvorstufen und deren anschließende Aktivierung sind allgemein anerkannt, wobei ein solcher Ansatz zu signifikant weniger systemischer Toxizität aufgrund vorzeitiger Linkerhydrolyse im Blut führt und infolge dessen eine größere Menge der interessierenden Verbindung, d. h. des Arzneistoffs oder zytotoxischen Agens, der Tumorstelle zugeführt wird. Siehe beispielsweise T. Higuchi und V. Stella, die das Konzept der Arzneimittelvorstufe in Pro-Drugs as Novel Delivery Systems, Bd. 14 der A. C. S. Symposium Series, American Chemical Society (1975) ausführlich erörtern. Zu leicht spaltbaren Gruppen gehören beispielsweise Acetyl, Trimethylacetyl, Butanoyl, Methylsuccinoyl, t-Butylsuccinoyl, Ethoxycarbonyl, Methoxycarbonyl, Benzoyl, 3-Aminocyclohexylidenyl, und dergleichen.
Bei der interessierenden Verbindung kann es sich um ein beliebiges organisches Molekül handeln, einschließlich kleiner organischer Moleküle, Peptide, Lipoproteine und anderer modifizierter Proteine, Polysaccharide, Oligonukleotide, Antisens-Oligonukleotide und alle anderen Verbindungen, von denen angenommen wird, daß sie pharmazeutische, prophylaktische, diagnostische Eigenschaften und/oder Forschungsinteresse besitzen. Bei der interessierenden Verbindung kann es sich um ein kleines organisches Molekül handeln, von dem bereits bekannt ist, daß es pharmazeutische Eigenschaften besitzt. Als Alternative kann es sich bei der interessierenden Verbindung um ein neues Protein unbekannter Funktion handeln, und somit kann die vorliegende Erfindung als ein Verfahren zur Identifizierung der Funktion der interessierenden Verbindung verwendet werden. In einer weiteren Ausführungsform kann es sich bei der interessierenden Verbindung um ein Antisensmolekül handeln, und somit kann die vorliegende Erfindung als ein Verfahren zur Änderung der Transkription verwendet werden. In noch einer weiteren Ausführungsform kann es sich bei der interessierenden Verbindung um eine Arzneimittelvorstufe handeln, die beispielsweise in inaktiver Form vorliegt, jedoch in der Lage ist, aktiviert zu werden, sobald sie innerhalb der Zelle vorliegt. In einer weiteren Ausführungsform kann es sich bei der interessierenden Verbindung um ein zytotoxisches Agens handeln, und somit kann die Erfindung als ein Verfahren zur Zuführung eines zytotoxischen Agens an eine Zelle verwendet werden. Ebenso umfaßt die interessierende Verbindung nachweisbare Proteine, die sich zur Erzeugung eines Konjugats aus MPP und dem nachweisbaren Protein zur Identifizierung neuer MPPs eignen. Zu nachweisbaren Proteinen gehören GFP, beta-Galactosidase, radioaktiv markierte Proteine und biotinylierte Proteine, Proteine, die in der Lage sind, einen nachweisbaren Phänotyp in der Zelle zu verleihen.
Die vorliegende Erfindung kann zur Zuführung der interessierenden Verbindung in eine Zelle in vitro verwendet werden, beispielsweise indem das Konjugat aus MPP und interessierender Verbindung extrazellulär zu kultivierten Zellen gegeben wird.
In der vorliegenden Erfindung können alle Arten von Zellen verwendet werden. Die Zelle kann aus Säugern oder Hefen stammen oder bakteriellen oder viralen Ursprungs sein. Bei der Zelle kann es sich um eine kultivierte Zelle handeln, wie sie allgemein für das Onkologie-Screening verwendet wird. Zu kultivierten Zellen gehören beispielsweise CHO, HEK293T, HeLa und NIH3T3.
Das Konjugat aus MPP und interessierender Verbindung umfassende erfindungsgemäße Zusammensetzungen können Adjuvantien, Stabilisatoren und dergleichen enthalten, um die Handhabungs-, Stabilitäts- und Lagereigenschaften der Zusammensetzungen zu verbessern.
Verfahren zur Identifizierung neuer MPPs sind ebenso Teil der vorliegenden Erfindung. Ein Verfahren zur Identifizierung eines membranpenetrierenden Peptids besteht in der Erzeugung eines Peptidkonjugats mit der Sequenz -(X-X-X-X)_n-, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 7 ist und X jeweils unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus, Arginin, Histidin oder Lysin, mit einem nachweisbaren Protein, wie etwa GFP, beta- Galactosidase und dergleichen, der Zugabe des Peptidkonjugats zu einer Zelle und der Bestimmung, ob das konjugierte Peptid im Zytoplasma und/oder im Zellkern der Zelle lokalisiert ist. Ein weiteres Verfahren zur Identifizierung eines membranpenetrierenden Peptids besteht in der Erzeugung eines Peptidkonjugats, das ein von einer Kernlokalisierungssequenz eines Säuger- oder Hefeproteins abgeleitetes oder damit überlappendes Peptid sowie ein nachweisbares Protein, wie etwa GFP, beta-Galactosidase und dergleichen umfaßt, der Zugabe des Peptidkonjugats zu einer Zelle und der Bestimmung, ob das konjugierte Peptid im Zytoplasma und/oder im Zellkern der Zelle lokalisiert ist.
Die folgenden Abkürzungen werden für Aminosäuren verwendet:

A: steht für Ala bzw. Alanin;
C: steht für Cys bzw. Cystein;
D: steht für Asp bzw. Asparaginsäure;
E: steht für Glu bzw. Glutaminsäure;
F: steht für Phe bzw. Phenylalanin;
G: steht für Gly bzw. Glycin;
H: steht für His bzw. Histidin;
I: steht für Ile bzw. Isoleucin;
K: steht für Lys bzw. Lysin;
L: steht für Ley bzw. Leucin;
M: steht für Met bzw. Methionin;
N: steht für Asn bzw. Asparagin;
P: steht für Pro bzw. Prolin;
Q: steht für Gin bzw. Glutamin;
R: steht für Arg bzw. Arginin;
S: steht für Ser bzw. Serin;
T: steht für Thr bzw. Threonin;
V: steht für Val bzw. Valin;
W: steht für Trp bzw. Tryptophan;
Y: steht für Tyr bzw. Tyrosin.

Proteine werden mit dem N-Terminus links stehend geschrieben.
Die folgenden Abkürzungen werden verwendet: „v/v" steht für Volumen zu Volumen; „EYFP" steht für ein Peptidfragment der Sequenz Glu-Tyr-Phe-Pro; „ORF" bezieht sich auf Offenes Leseraster (Open Reading Frame); „PCR" steht für Polymerasekettenreaktion; „CHO" steht für Chinese Hamster Ovary-Zellen; „HEK293T" steht für menschliche embryonale Nierenzellen (Human Embryonic Kidney Cells), „HeLa" bezieht sich auf Epitheladenokarzinomzellen; „NIH3T3" steht für Swiss-Mausembryo-Fibroblasten; „DMSO" steht für Dimethylsulfoxid; „FCS" steht für fötales Kälberserum; „DMEM" steht für Dulbecco's Modified Eagle's Medium; „PBS" steht für phosphatgepufferte Kochsalzlösung (Phosphate Buffered Saline); „BSA" steht für Rinderserumalbumin; „C-Terminus" steht für den Carboxyterminus; „N-Terminus" steht für den Aminoterminus; „PTD" steht für Peptidtransduktionsdomäne; „GPCR" steht für G-Protein-gekoppelter Rezeptor; „TM" steht für eine Transmembrandomäne eines GPCR; „I" steht für eine intrazelluläre Schleife eines GPCR; „5HT2A" steht für Serotoninrezeptor 2A; und „mAb" steht für monoklonaler Antikörper.
BEISPIELE
Beispiel 1 Identifizierung einer NLS in hPER1 Plasmidkonstruktion
Alle hier beschriebenen hPER1-Fragmente werden als C-terminale Fusion im Leseraster mit EYFP kloniert. EYFP-hPER1-ORF, P1-N und P1-NX (1A) wird durch Insertion von mit EcoRI und XhoI verdauten Fragmenten in den Vektor EYFP-C1 (Clontech) erzeugt. Die anderen Fragmenten werden von der Vollängen hPER1-cDNA PCR-amplifiziert und in den EYFP-C1-Vektor subkloniert. Der jeweils erste und letzte Rest in den Fragmenten ist in 1A angegeben. Alle Konstrukte werden durch automatische DNA-Segenzierung verifiziert.
Zellkultur und DNA-Transfektion
CHO-, HeLa- und 293T-Zellen werden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 50 Einheiten/ml Penicillin, 50 μg Streptomycin und 4 mM L-Glutamin (nachfolgend als komplettes DMEM bezeichnet), bei 37°C mit 5% CO₂ gehalten. Die Transfektion der Zellen wird in Lab-Tek-Deckgläschen mit jeweils zwei Vertiefungen (Nunc Inc.) LIPOFECT-AMINETM^TM-Reagens (Life Technologies) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Peptide und Peptidinternalisierung
Peptide werden von einem kommerziellen Anbieter (Bio Synthesis) synthetisiert. Zur Internalisierung der Peptide werden Zellen in Lab-Tek-Deckgläschen mit jeweils zwei Vertiefungen (Nunc Inc.) bei einer Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/Vertiefung ausplattiert und über Nacht kultiviert. Die Peptide werden in bis zur angegebenen Konzentration mit PBS verdünntem DMSO gelöst. Die Zellmonolayer wurden mit der entsprechenden Peptid/PBS-Lösung mit einer Standardkonzentration von 1 μM 10 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert, falls nicht anders angegeben. Für die Experimente bei 4°C wurde die gleiche Vorschrift verwendet, mit der Ausnahme, daß alle Inkubationen bis zum Ende des Fixierungsverfahrens bei 4°C durchgeführt wurden.
Immunfluoreszenz und Mikroskopie
Für den direkten Nachweis der Expression und subzellulären Lokalisierung von EYFP-Fusionsprotein wurden transfizierte Zellen direkt ohne Fixierung bzw. nach Fixierung mit 4% (v/v) Formaldehyd in PBS (20 min bei 4°C) untersucht und mit PBS gewaschen. Zum indirekten Immunnachweis biotinylierter Peptide wurden fixierte Zellen zweimal mit PBS gewaschen und 20 min bei 4°C mit 0,3% Triton X-100 in PBS permeabilisiert und 30 min bei RT mit 2% BSA in PBS blockiert. Die Zellen wurden danach mit PBS gewaschen und mit Streptavidin-FITC^TM (Sigma) oder Alex499 (Molecular Probe), 1:400 verdünnt in 0,2% Tween 20, 2% BSA in PBS, 1 h bei RT inkubiert. Anschließend wurde 2 × 5 min mit PBS sowie einmal 20 min mit 0,3% Triton X-100 in PBS bei RT gewaschen. In einigen Experimenten wurde der Zellkern mit 50 ng/ml Hoechst 33258 (Sigma) oder 3 μg/ml Propidiumiodid in PBS gefärbt. Die subzelluläre Lokalisierung der Fluoreszenz wurde an einem Olympus-Mikroskop analysiert. Konfokale Abbildungen wurden an einem konfokalen Laserscan-Mikroskop der Firma Zeiss (CLSM Phoibos 1000) aufgenommen.
Zwar ist bekannt, daß der Eintritt von PER1 in den Zellkern für seine Funktion wichtig ist, doch konnte unter Verwendung eines Profile Scanning-Standardprogramms keine mutmaßliche NLS identifiziert werden (Shearman, L. P., et al., Neuron 19, 1261–1269 (1997), Yagita, K., et al., Genes Dev. 14, 1353–1363 (2000)). Zur Bestimmung der NLS von hPER1 im Experiment wurden drei Vollängen-hPER1 (P1-FL) konstruiert und als P1-N, P1-NM und P1-C bezeichnet (1A). Die Fähigkeit dieser Konstrukte zur Lokalisierung zum Zellkern in CHO-Zellen wurde dann analysiert. Um den Nachweis von hPER1 in lebenden Zellen zu erleichtern, wurde ein EYFP-Tag verwendet; allerdings leistete das EYEP-Tag keinen offensichtlichen Beitrag zur hPER1-Fusionsproteinlokalisierung, da mit einem N-terminalen Flag-Tag hergestellte hPER1-Konstrukte ein identisches zytologisches Verteilungsmuster zeigten (Daten nicht gezeigt). Nach transienter Transfektion wurden sowohl P1-FL- als auch P1-NM-Proteine im Zellkern transfizierter Zellen bereits 10 Stunden nach der Transfektion exprimiert, während sowohl P1-N als auch P1-C nur im Zytoplasma angereichert wurden (1B).
Die EYFP-Vektorkontrolle lag sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma diffus vor. Diese Ergebnisse demonstrieren, daß eine funktionelle NLS in hPER1 zwischen P1-N und P1-C in einem Bereich, der von uns als Bereich M bezeichnet wurde, lokalisiert ist (siehe 1A).
Zur weiteren Lokalisierung der NLS im Bereich M (Aminosäuren 481-890) wurde eine Reihe von 8 Deletionskonstrukten, P1-F1 bis P1-F8, erzeugt und die subzelluläre Verteilung einer jeden Mutante getestet, wie in 1A und B dargestellt. Sequentielle Deletion von Aminosäure 581 (P1-F2) zu Position 821 (P1-F7) des Bereichs M führte zur Kernlokalisierung. Eine weitere Deletion der Aminosäuren 821 bis 841 (P1-F8) führte zu einem diffusen Fluoreszenzmuster in den transfizierten Zellen mit einem ähnlichen Lokalisierungsmuster wie dem der EYFP-Vektorkontrolle. Diese Daten deuten darauf hin, daß eine NLS zwischen den Aminosäuren 821 und 890 existiert und am C-Terminus des Bereichs M lokalisiert ist. Diese Beobachtung wurde durch die Konstruktion eines zusätzlichen EYFP-Fusionsproteins, P1-NLS, das die hPER1-Aminosäuren 830-845 enthielt, bestätigt. Dieser Bereich enthält einen Strang basischer Reste, die als eine NLS fungieren könnten (Weis, K., Trends Biochem. Sci. 23, 185–189 (1998), Truant, R. und Cullen, B. R., Mol. Cell Biol. 19, 1210–1217 (1999)). Wie erwartet, zeigte P1-NLS eine Kernlokalisierung in 100% der transfizierten Zellen (1B). Andere Bereiche von PER1 in zusätzlichen Fusionskonstrukten waren nicht imstande, zum Zellkern zu lokalisieren (Daten nicht gezeigt). Daher ziehen wir die Schlußfolgerung, daß die NLS von hPER1 (hPER1-NLS) innerhalb der Aminosäuren 830–845 lokalisiert ist. Interessanterweise weist das Konstrukt P1-F1 ein strikt zytoplasmatisches Lokalisierungsmuster auf, unabhängig von der Tatsache, daß es die NLS enthält, was veröffentlichte Beobachtungen unterstützt, daß dieser Bereich auch eine bislang nicht identifizierte zytoplasmatische Lokalisierungsdomäne enthält (Vielhaver, E., et al., Mol. Cell Biol., 20, 4888–4899 (2000)). Eine vergleichende Sequenzgegenüberstellung zeigt, daß die hPER1-NLS zwischen PER1-Proteinen des Menschen und der Maus (1A), jedoch nicht gegenüber anderen mutmaßlichen NLS oder gegenüber anderen PERs aus Mensch, Maus oder Drosophila, konserviert ist. Nach Beendigung unserer Arbeiten wurde von Vielhaber, et al., (2000) eine längere Maus-PER1-NLS identifiziert, die unsere identifizierte 16 Aminosäuren lange Sequenz enthält (Vielhaver, E., et al., Mol. Cell Biol., 20, 4888–4899 (2000)), womit unsere Ergebnisse unterstützt wurden.
Beispiel 2 hPER1-NLS codiert ein MPP
Zwei allgemeine Merkmale der drei identifizierten gencodierten MPPs (TAT, Antp und VP22) bestehen darin, daß sie aus Zellkernproteinen stammen und daß sie aus basischen Aminosäureresten bestehen (Lindgren, M., et al., Trends Pharmacol. Sci. 3, 99–103 (2000)). Bei hPER1 handelt es sich ebenso um ein Zellkernprotein, dessen NLS reich an basischen Aminosäuren ist (SRRHHCRSKAKRSRHH, siehe 1). Diese Ähnlichkeiten veranlaßten uns, zu bestimmen, ob hPER-NLS auch als ein MPP fungieren könnte. Um diese Hypothese zu testen, wurden mehrere N-terminal biotinylierte Peptide synthetisiert: hPER1-MPP, hPER1-MPP mit Flag-Tag, TAT-PTD mit Flag-Tag, Flag-Flag allein, siehe nachfolgende Tabelle 1:
Tabelle 1
Fn 1: Ergebnisse gezeigt für ausgewählte MPPs, siehe 5
Fn 2: Ergebnisse gezeigt für ausgewählte MPPs, siehe 5
Die Peptide werden auf ihre Fähigkeit zur Penetration von Zellmembranen getestet. Die intrazelluläre Lokalisierung wird durch direktes Anfärben mit markierten Streptavidin-ALEXA-Reagentien oder durch indirekte Anfärbung mit Anti-Flag-mAb und anschließender Zugabe markierter sekundärer Antikörper getestet. Es stellt sich heraus, daß die Peptide hPER1-MPP, Flag-hPER1-MPP und Flag-TAT-PTD bei Zugabe zu den Zellen in Kultur in einer Konzentration von 10 μM schnell in 100% der Zellen penetrieren (2A und 5). Mit beiden Nachweisverfahren wird beobachtet, daß hPER1-MPP, hPER1-MPP mit Flag-Tag und TAT-PTD mit Flag-Tag diffus über das gesamte Zytoplasma verteilt sind, sich jedoch in subnukleären Domänen konzentrieren, die als deutliche Foci im Zellkernplasma und dem Nukleolus erscheinen. Im Gegensatz dazu sind die biotinylierten negativen Kontrollpeptide, Flag-Flag und mehrere zusätzliche Peptide, die von anderen hPER1-Bereichen abgeleitet sind, gerade eben von der Hintergrundfärbung unterscheidbar, wobei keine Anfärbung im Zellkern oder den Nukleolen auftritt, selbst bei hohen Konzentrationen (Daten nicht gezeigt). Konfokale Mikroskopie wird zur Bestätigung der intrazellulären und intranukleären Anfärbung von hPER1-MPP mit Flag-Tag sowie davon, daß die negativen Kontrollpeptide nicht internalisiert sind, verwendet (2A).
hPER1-MPP pentetrierte schnell die Zellmembranen und lokalisierte in Zellkernbereichen mit ähnlichen Effizienzen wie das TAT-PTD-Peptid (2B). Identische Ergebnisse werden unter Verwendung von CHO, HEK293T, HeLa, NIH3T3 und kultivierten primären corticalen Neuronen der Ratte (Daten nicht gezeigt) erhalten, was auf eine zelltypunabhängige Penetration hindeutet.
Die hPER1-MPP-Internalisierung erfolgt schnell (innerhalb von 5 min) mit ähnlichen Stärken bei 4°C und 37°C und selbst nach Zellmembranfixierung (Daten nicht gezeigt). Somit fungiert die Aminosäuresequenz 830-845 von hPER1 sowohl als ein nukleäres/nukleoläres Proteinlokalisierungssignal im Fusionsprotein als auch als ein MPP, wobei diese Membranpenetration unabhängig von traditionellen rezeptorvermittelten endocytischen Mechanismen ist.
Beispiel 3 Arginin 7 ist für die hPER1-MPP-Aktivität essentiell
Bis heute wurden weder die Mechanismen noch die strukturelle Basis, mit denen MPPs Zellmembranen durchqueren, aufgeklärt. Daher wurde hier versucht, zu bestimmen, ob es Schlüsselreste im hPER1-MPP gab, die für die Aufrechterhaltung dieser für sein membranpenetrierendes Potential essentiellen Eigenschaften wichtig waren. Dabei wurde jede Aminosäure in hPER1-MPP jeweils separat gegen Alanin ausgetauscht (Tabelle 2), und diese mutierten Peptide wurden dann auf ihre Fähigkeit zur Penetration lebender Zellen relativ zum Wildtyp-hPER1-MPP getestet.
Alanin-Scanning
Wie in 3 dargestellt, hatten die meisten Einzelalaninaustausche einen sehr kleinen Effekt auf die membranpenetrierenden Fähigkeiten im Vergleich mit dem Wildtyppeptid. Allerdings reduzierte eine Änderung von Arginin 7 zu einem Alanin (R7A) das nachweisbare zytologische Signal auf das bei den negativen Kontrollpeptiden beobachtete Signal. Somit reduzierte die Mutation von Arganin 7 zu Alanin in signifikanter Weise die membranpenetrierenden Eigenschaften von hPER1-MPP. Dieselben Beobachtungen wurden nach einer Änderung von Arginin 7 zu Glutaminsäure (R7E) beobachtet (Daten nicht gezeigt). Weiterhin hatte die gleichzeitige Deletion des N-terminalen Serins und der beiden C-terminalen Histidine von hPER1-MPP (hPER1-MPP13) nur einen geringen Gesamteffekt auf das positive membranpenetrierende Potential des Peptids (3).
Der Rest Arginin 7 spielt eine kritische Rolle bei der zellpenetrierenden Fähigkeit des hPER1-NPP. Daher wurde versucht, zu bestimmen, ob die R7A-Mutation die Kerntranslokalisierung eines Fusionsproteins P1-NLS beeinflußte. Mit dem Fusionsprotein P1-R7A (Arginin 7 mutierte zu Alanin) transfizierte CHO-Zellen weisen eine starke Zellkernfärbung ähnlich wie der Wildtyp, P1-NLS, auf (Daten nicht gezeigt). Die Kerntranslokalisierung scheint im Mutantenfusionsprotein P1-R7A normal zu sein, doch ist die subnukleäre Steuerung auf die Nukleolen als Ziel unterbrochen (Daten nicht gezeigt). Diese Daten deuten darauf hin, daß Membranpenetration und Nukleolenzielsteuerung von dem einzelnen R7-Aminosäurerest beeinflußt werden und daß die Kerntranslokalisierung von hPER1-NLS separate und eigenständige Determinanten aufweist.
Beispiel 4 hPER1-MPP-Zuführung funktionsfähiger Moleküle
Eines der Merkmale von MPPs ist deren Fähigkeit, Proteine und Peptide als Fracht in Zellen zu transportieren. Von uns wurde hPER1-MPP erfolgreich an B-Galactosidase gekoppelt und das Fusionsprotein in Zellen in Kultur eingeführt (Daten nicht gezeigt), wie von Fawells et al., 1994 (Fawell, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 664–668 (1994)) beschrieben wurde. Um jedoch den funktionellen Nutzen von MPPs zu erweitern, wurde hier hPER1-MPP in Fusion mit einem physiologisch relevanten und biologisch aktiven Peptid getestet. Von Wess und Mitarbeitern (1993) wurde eine funktionelle Rolle für das konservierte Transmembransegment 7 (TM7) der Superfamilie G-Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR) gezeigt. Zusammen mit TM7 spielt die dritte intrazelluläre Schleife (I3) eine signifikante Rolle bei der GPCR-Calciumsignalgebung (Wess, J. M., et al., EMBO J. 12, 331–338 (1993)), während die intrazellulären Schleifen 1 und 2 (I1 und I2) nicht wichtig zu sein scheinen. Unter Verwendung des Serotoninrezeptors, 5HT2A, wurde im Experiment die Fähigkeit von hPER1-MPP und TAT-PTD in Fusion mit von den Domen I1 und TM7 konstruierten Peptiden zur Aktivierung des Rezeptors getestet. Die biotinylierten Peptide herp1-MPP, TAT-PTD TM7, hPER1-MPP I1, TAT-PTD I1, hPER-MPP, TAT-PTD, TM7 oder I1 wurden in einer Konzentration von 10 μM mit einer stabilen 5HT2A-Rezeptor-CHO-Zellinie inkubiert. Die Peptidmembranpenetration wurde unter Verwendung von Streptavidin-Alexa 594 wie oben beschrieben getestet. Wie in 4A gezeigt, wird die Rezeptorsignalgebung durch die Zugabe von exogenem Serotonin, hPER1-MPP TM7 und TAT-PTD TM7 aktiviert, wie über das Niveau der Calciumantwort gemessen wurde. Allerdings waren weder TM7 allein noch eines der anderen Peptide in der Lage, eine Calciumantwort zu erzeugen. Die Aktivierung des Rezeptors durch hPER1-MPP-TM7 und TAT-PTD-TM7 ist weiterhin peptidkonzentrationsabhängig, 4B. Die Zugabe steigender Konzentrationen des aktivierenden Peptids, TM7, in Fusion mit hPER1-MPP oder TAT-PTD führt zu einer Calciumantwort in einer dosisabhängigen Weise. TAT-PTD-TM7 scheint ein stärkerer 5HT2A-Rezeptor-Aktivator zu sein als hPER1-MPP-TM7. Eine einfache Erklärung für dieses Ergebnis ist die Tatsache, daß TAT-PTD-TM7 eher zytoplasmatisch lokalisiert ist oder größere zellpenetrierende Fähigkeiten als hPER1-MPP-TM7 aufweist, obwohl dieser Fall von uns nicht beobachtet wurde. Ähnliche Ergebnisse wurden in diesem Labor auch unter Verwendung von hPER1-MPP in Fusion mit β-adrenergen aktivierenden Peptiden erhalten (unveröffentlichte Daten). Diese Daten unterstützen frühere Ergebnisse, daß hPER1-MPP nicht nur Zellmembranen penetriert, sondern auch zeigt, daß es in der Lage ist, Peptide als Fracht zu intrazellulären Kompartimenten zu transportieren, um biologisch relevante Signaltransduktionsereignisse zu initiieren.
Beispiel 5 Identifizierung weiterer gencodierter MPPs
Da es sich bei hPER1 um ein Zellkernprotein handelt, das nach einem Vorschlag an der Transkriptionsregulation beteiligt ist, und da es sich bislang bei allen aus natürlich vorkommenden Proteinen stammenden PTDs um Transkriptionsfaktoren handelt (TAT, Antp und VP22) wurde versucht, zu bestimmen, ob weitere PTD-Sequenzen im Genom existierten. Hierzu wurden zwei Ansätze benutzt; erstens wurde die nicht redundante NCBI-Proteindatenbank nach allen bekannten und mutmaßlichen NLS durchsucht (Tabelle 1, 10–17). Den NLS-Aminosäuresequenzen entsprechende Peptide wurden synthetisiert und auf Peptidtransduktion getestet. Wie in Tabelle 1 sowie 5 dargestellt, wiesen 6 der 7 synthetisierten Peptide ähnliche membranpenetrierende Eigenschaften wie hPER-PTD und TAT-PTD auf. Diese Proteine umfassen menschliche Proteine des Thyroidhormonrezeptors Alpha-1, Homeobox-Protein HME1 sowie Protooncogenprotein ABL-1. Weiterhin (Tabelle 1 und 5) verliehen bei der Erzeugung von in-Frame-Fusionsproteinen zwischen diesen Peptidsequenzen und GFP und anschließender Transfektion in CHO- oder HEK 293T-Zellen alle Sequenzen die Kernlokalisierung des Fusionsproteins.
Unser zweiter Ansatz zur Identifizierung von PTDs beinhaltete das Durchsuchen der nichtredundanten NCBI- Proteindatenbanksammlung mit einem degenerativen Algorithmus (siehe 5, Legende). Unter Verwendung dieser Suchparameter wurden 533 291 Sequenzen gefunden, wobei in 129 169 Fällen (24%) die Bedingungen für den Algorithmus erfüllt waren.
Durch Beschränken unserer Suche unter Einschluß von entweder „Transkriptionsfaktoren, Zytokinen oder Tyrosinkinasen" wurden 8280 Transkriptionsfaktorproteinsequenzen identifiziert, bei denen das Algorithmusmuster 7374 mal (89%) auftrat; in 2333 Zytokinproteinsequenzen trat das Muster 450 mal (19%) und in 2513 Tyrosinkinaseproteinsequenzen 843 mal (36%) auf. Da der Algorithmus am häufigsten in Zellkernproteinen auftrat, wurden Peptide zu mutmaßlichen PTDs für 6 der „Transkriptionsfaktor"-Sequenzen synthetisiert und auf ihre Fähigkeit zur Penetration in Zellen getestet. Wie die Ergebnisse in Zeilen 18–23 in Tabelle 1 und in 3A zeigen, wiesen 4 der 6 getesteten Peptide ähnliche membranpenetrierende Eigenschaften wie hPER1-PTD und TAT-PTD auf. Zu diesen Proteinen gehörten zwei menschliche Proteine, HEN1/NSLC-1 und HEN2/NSLC-2, von denen berichtet wird, daß sie an neuronaler Differenzierung und Entwicklung beteiligt sind (Uittenbogaard, M., Peavy, D. R. und Chiaramello, A., 1999. Expression of the bHLH Gene NSCL-1 suggests a Role in Regulation of cerebellar Granule Cell Growth and Differentiation. J. Neurosci. Res. 57: 770–781, Lipkowitz, S. et al. 1992. A comparative structural Characterization of the human NSCL-1 and NSCL-2 Genes. Two basic Helix-Loop-Helix Genes expressed in the developing nervous System. J. Biol. Chem. 267: 21065–21071), HNF-3 der Ratte (17) sowie ein cAMP-abhängiger Transkriptionsfaktor aus Drosohpila (18). Weiterhin wurde (Tabelle 1 und 5) bei Erzeugung von in-Frame-Fusionsproteinen zwischen diesen Peptiden und GFP und Transfektion in CHO- oder HEK-293T-Zellen die Kernlokalisierung des Fusionsproteins von allen Sequenzen vermittelt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß PTD-Sequenzen in NLS-Sequenzen angetroffen werden oder mit diesen überlappen können. Allerdings sind nicht alle NLS PTDs, wie man an den NLS von SV40, hPER2, C-FOS, Cyclin L ania-6 und beta-Zip-Transkriptionsfaktor sieht (Tabelle 1). Diese Ergebnisse lassen auch darauf schließen, daß PTD-Sequenzen im gesamten Genom und insbesondere in Zellkernproteinen vorkommen.
Beispiel 6. hPER-PTD mit β-Galactosidase
Wenigstens ein Merkmal des HIV-TAT-transduzierenden Peptids besteht in seiner Fähigkeit, Proteine als Fracht in Zellen und Gewebe zu transportieren. Daher wurde versucht, zu bestimmen, ob hPER1-transduzierendes Peptid beta-Galactosidase als Fracht in Zellen transportieren könnte. Zur Durchführung dieses Experiments wurde einer Vorschrift von Frankel et al., PNAS 1989 (19): 7397–401 gefolgt, wonach hPER1-PTD oder hPER-PTD R7A (mit Austausch von Arg⁷ gegen Ala) mit Vollängen-β-Galactosidase chemisch verknüpft. und auf die Fähigkeit dieser Konjugate und des beta-Galactosidaseproteins allein zur Transduktion in CHO-Zellen getestet wurde. Wie in 6, Tafel 1 gezeigt, zeigten mit der hPER-PTD-β-Galactosidase-Fusion inkubierte Zellen positive enzymatische Aktivität für β-Galactosidase, wie durch die blaue Farbe in den Zellen nach Zugabe von X-gal angedeutet wird. Allerdings war weder hPER-MPP-R7A-β-Galactosidase noch das β-Galactosidaseprotein allein in der Lage, in die Zellen einzudringen, wie durch eine Reaktivität ohne Blaufärbung nach Zugabe von X-gal angezeigt wird, Tafeln 2 und 3. Diese Daten deuten darauf hin, daß hPER1-PTD wie das TAT-Peptid ein großes (120 kD) Protein als Fracht in Zellen transportieren kann.
Schlüssel zu den Figuren
1A

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) → ERSATZBLATT (REGEL 26)
LOCATION → ORT

1B

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) → ERSATZBLATT (REGEL 26)

2

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) → ERSATZBLATT (REGEL 26)
confocal → konfokal
Overlay → Überlagerung
Anti-FLAG mAb → Anti-FLAG-mAb

2B

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) → ERSATZBLATT (REGEL 26)
Overlay → Überlagerung
Control → Kontrolle

3

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) → ERSATZBLATT (REGEL 26)
Alanine scanning → Alanin-Scanning
Control → Kontrolle

4A

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) → ERSATZBLATT (REGEL 26)
Relative Fluorescence → Relative Fluoreszenz
Peptide Concentration → Peptidkonzentration

4B

Relative Fluorescence → Relative Fluoreszenz
Peptide Concentration → Peptidkonzentration

5

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) → ERSATZBLATT (REGEL 26)
Transduction → Transduktion
Transfection → Transfektion

5 (Fortsetzung)

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) → ERSATZBLATT (REGEL 26)
Transduction → Transduktion
Transfection → Transfektion
GFP control → GFP-Kontrolle

6

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) → ERSATZBLATT (REGEL 26)
β Galactosidase → β-Galactosidase

HNR2053.ST25 SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Fusionsprotein zur Zuführung einer interessierenden Verbindung in eine Zelle, umfassend ein membranpenetrierendes Peptid mit einem an eine interessierende Verbindung gebundenen membranpenetrierenden Peptid hPER1 (human Period 1) oder membranpenetrierenden Peptid hPER3.
Fusionsprotein gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei der interessierenden Verbindung um ein Peptid, Protein, einen chemischen Stoff, eine Nukleinsäure oder eine beliebige modifizierte Form davon handelt.
In-vitro-Verfahren zur Zuführung einer interessierenden Verbindung in eine Zelle, bei dem man eine Zelle mit einem Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 in Kontakt bringt.
Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem man eine kultivierte Zelle mit einem Fusionsprotein gemäß Anspruch 1 in Kontakt bringt.
Fusionsprotein gemäß Anspruch 1, wobei die interessierende Verbindung direkt oder über einen Linker an das membranpenetrierende Peptid gebunden ist.
Fusionsprotein nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Linker um einen Aminosäurelinker oder einen Polypeptidlinker handelt.
Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei das membranpenetrierende Protein mittels Rekombinationstechnologie, chemischer Synthese oder Abbau eines Vorläuferproteins hergestellt wird.
Verwendung eines membranpenetrierenden Peptids hPER1 zur Herstellung eines das an eine interessierende Verbindung gebundene membranpenetrierende Peptid hPER1 umfassenden Fusionsproteins.
Membranpenetrierendes Peptid hPER1 mit der Sequenz RRHHCRSKAKRSR.
Membranpenetrierendes Peptid hPER1 mit der Sequenz GRKGKHKRKKLP.