DE60126624T2

DE60126624T2 - Zyklische peptide als agonisten für den melanocortin-4-rezeptor

Info

Publication number: DE60126624T2
Application number: DE60126624T
Authority: DE
Inventors: Li Westfield CHEN; Wai-Hing Adrian Glen Rock CHEUNG; Xin-Jie Livingston CHU; Waleed Wayne DANHO; Joseph Nutley SWISTOK; Yao Edison WANG; Alan Keith Hohokus YAGALOFF
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-08-30
Filing date: 2001-08-21
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2021-08-22
Also published as: PL366630A1; JO2454B1; NZ523989A; EP1315750B1; WO2002018437A2; HUP0303078A2; PA8527201A1; TWI248941B; PE20020483A1; AR030504A1; NO20030916D0; YU15603A; CZ2003584A3; AR061422A2; IL154575A; EP1315750A2; ECSP034503A; IL154575A0; ES2280393T3; CN1451017A

Description

Fettleibigkeit ist allgemein als ein ernsthaftes Gesundheitsproblem für die Entwicklungsländer anerkannt und hat in den USA Epidemiestatus erreicht. Mehr als 50% der US-Bevölkerung sind übergewichtig, wobei bei > 25% klinische Fettleibigkeit und beträchtliches Risiko für Herzkrankheiten, nicht insulinpflichtigen Diabetes mellitus (NIDDM), Hypertension und bestimmte Krebserkrankungen diagnostiziert wird. Diese Epidemie stellt eine signifikante Belastung für das Gesundheitssystem dar, da voraussichtliche Kosten für die Behandlung von Fettleibigkeit von mehr als $ 70 Milliarden jährlich allein in den USA erwartet werden. Strategien zum Behandeln von Fettleibigkeit umfassen die Verringerung der Nahrungsaufnahme oder die Erhöhung des Energieverbrauchs.
Es ist gezeigt worden, daß bei der Injizierung eines cyclischen Heptapeptidanalogons eines α-Melanocyten-stimulierenden Hormons (αMSH) mit Melanocortin-4-Rezeptor-Agonistenaktivität (MC4-R-Agonistenaktivität) in das dritte Hirnventrikel oder intraperitoneal eine langanhaltende Inhibierung der Nahrungsaufnahme bei Mäusen verursacht wurde. Diese Wirkung war bei der Coverabreichung mit einem MC4-R-Antagonisten reversibel (Fan, et al., Nature (1997) 385: 165-168). Deshalb würden Agonisten mit MC4-R-Aktivität beim Behandeln oder Vorbeugen von Fettleibigkeit nützlich sein.
Es gibt fünf bekannte Melanocortin-Rezeptoren, basierend auf der Sequenzhomologie, die zwischen 35 und 60% Homologie zwischen Familienmitgliedern liegt (Cone, et al., Rec. Prog. Hormon Res. (1996) 51: 287-318), aber diese Rezeptoren unterscheiden sich in ihren Funktionen. Beispielsweise ist das MC1-R ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor, der die Pigmentierung in Reaktion auf das α-MSH reguliert, das ein wirksamer Agonist von MC1-R ist. (Cone, et al., ibid.). Der Agonismus des MC1-R-Rezeptors führt zur Stimulation der Melanocyten, die Eumelanin verursachen und das Risiko für Hautkrebs erhöhen. Der Agonismus von MC1-R kann ebenso neurologische Wirkungen aufweisen. Die Stimulation der MC2-R-Aktivität kann zu Karzinom des Nebennierengewebes führen. Die Wirkungen des Agonismus des MC3-R und MC5-R sind noch nicht bekannt. Alle der Melanocortin-Rezeptoren reagieren auf die Peptidhormonklasse der Melanocyten-stimulierenden Hormone (MSH). Diese Peptide werden von Pro-opiomelanocortin (POMC), einem Prohormon von 131 Aminosäuren, aus dem drei Klassen von Hormonen aufgebaut werden; die Melanocortine (α, β und γ), Adrenocorticotropinhormon (ACTH) und verschiedene Endorphine (z. B. Lipotropin) (Cone, et al., ibid.), abgeleitet. Aufgrund ihrer verschiedenen Funktionen weist der gleichzeitige Agonismus der Aktivitäten verschiedener Melanocortin-Rezeptoren das Potential auf, unerwünschte Nebenwirkungen zu verursachen. Deshalb ist es wünschenswert, daß ein MC4-R-Agonist für den MC4-R selektiver ist als für einen oder mehrere der anderen Melanocortin-Rezeptoren.
Haskell-Luevano, et al. (Peptides (1996) 17 (6): 995-1002) offenbaren Peptide, die das Tripeptid (D)Phe-Arg-Trp enthalten und melanotrope Aktivität (Hautdunkelfärbung) in dem Frosch-(Rana pipiens)-Hautbioassay zeigen. Haskell-Luevano, et al. (ibid.) offenbaren keine Verbindung der nachstehend beschriebenen Formel I oder II.
Bednarek, et al. (Peptides (1999) 20: 401-409) und Bednarek, et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. (1999) 261: 209-213) offenbaren Analoga des cyclischen Peptids MT-II. Sie offenbaren keine der nachstehend beschriebenen Verbindungen der Formel I oder II.
Diese Erfindung stellt eine Verbindung der Formel:
wobei in den Verbindungen der Formel I R¹ und R¹² zusammen mit X und Y einen Phenylring bilden und X C ist und Y C ist, oder
R¹ Wasserstoff,
ist und R¹² Wasserstoff ist, wobei X und Y jeweils C sind und die Bindung zwischen X und Y eine Doppelbindung ist, oder X und Y jeweils CH sind und die Bindung zwischen X und Y eine Einzelbindung ist; R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen oder Alkinyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; R¹⁴ Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist und n 0 oder 1 ist;
Q
ist,
worin
R³, R⁴ und R⁵ unabhängig Wasserstoff, Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Hydroxy oder Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, worin, wenn R⁴ nicht Wasserstoff ist, R³ und R⁵ beide Wasserstoff sind; R⁶ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Phenoxy oder Halogen ist, und R¹¹ und R¹³ jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 3 oder 4 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen sind, oder R¹¹ und R¹³ beide Pheny1 sind; R⁷ O oder NH ist; R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist;
R⁹
ist;
R¹⁰ Wasserstoff oder Methyl ist; p 0 oder 1 ist; m 0, 1, 2 oder 3 ist;
Z
oder -S-S- ist und
R¹⁷ Wasserstoff oder Niederalkyl, bevorzugt Methyl, ist,
und pharmazeutisch akzeptable Salze davon bereit.
Die gestrichelte Bindung in der Verbindung der Formel I ist hydriert, wenn X und Y jeweils -CH- sind. Andererseits bilden, wenn die gestrichelte Bindung vorliegt, Y und X zusammen mit R¹ und R¹² keinen Phenylring, und X und Y sind beide vierwertige C-Atome.
Diese Erfindung stellt ebenso eine Verbindung der Formel:
wobei in den Verbindungen der Formel II
R¹ Wasserstoff,
ist;
R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen oder Alkinyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; R¹⁴ Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist und n 0 oder 1 ist; einer von R³, R⁴, R⁵ und R⁶ Wasserstoff, Halogen, Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist und die restlichen Wasserstoff sind; R⁷ O oder NH ist; R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist;
R⁹
ist;
R¹⁰ Wasserstoff oder Methyl ist; p 0 oder 1 ist; m 0, 1, 2 oder 3 ist;
Z
oder -S-S- ist;
R¹⁷ Wasserstoff oder Niederalkyl ist,
und pharmazeutisch akzeptable Salze davon bereit.
Die Verbindungen der Formeln I und II sowie Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH₂ und Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2S,3S)-beta-methyl-Trp-Lys-NH₂ sind Agonisten des MC4-R. Es ist bekannt, daß Agonisten mit MC4-R-Aktivität die Verringerung der Nahrungsaufnahme in einem Mausmodell menschlicher Fettleibigkeit verursachen. Deshalb sind diese Verbindungen bei der Behandlung oder Vorbeugung von Fettleibigkeit nützlich.
Alle diese Verbindungen der Formeln I und II, die nachstehend veranschaulicht sind, sowie Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH₂ und Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2S,3S)-beta-methyl-Trp-Lys-NH₂ wurden hinsichtlich der MC4-R-Agonistenaktivität und MC1-R-Agonistenaktivität in dem in-vitro-Assay, der nachstehend in dem Beispiel A für die biologische Aktivität beschrieben ist, getestet. Alle diese getesteten Verbindungen haben einen EC50 für die MC4-R-Agonistenaktivität von weniger als 500 nM, und alle zeigten mindestens 10fach größere MC4-R-Agonistenaktivität als MC1-R-Agonistenaktivität. Im Gegensatz dazu zeigte die Verbindung Ac-Nle-Cyclo(Asp-Lys)-Asp-His-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ etwa gleiche MC1-R- und MC4-R-Agonistenaktivität.
Nomenklatur und Abkürzungen
Der Ausdruck „Alkyl" bedeutet eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe und der Ausdruck „Niederalkyl" bedeutet eine Alkylgruppe, enthaltend 1 bis 6 Kohlenstoffatome. Der Ausdruck „Alkenyl" bedeutet eine geradkettige oder verzweigte Alkenylgruppe. Der Ausdruck „Alkinyl" bezieht sich auf eine geradkettige oder verzweigte Alkinylgruppe.
Der Ausdruck „Alkoxy" bedeutet eine Gruppe der Formel Alkyl-O-, in welcher Alkyl wie oben definiert ist. Der Ausdruck „Phenoxy" bedeutet eine Gruppe der Formel Phenyl-O-. Sofern nicht anders angegeben, bezieht sich „Phenyl" auf einen unsubstituierten Phenylring und bezieht sich „Phenoxy" auf eine unsubstituierte Phenoxygruppe.
Der Ausdruck „Halogen" bedeutet eine Gruppe, ausgewählt aus Fluor, Chlor, Brom und Iod.
Der Ausdruck „pharmazeutisch akzeptables Salz" bezieht sich auf die Salze, die die biologische Wirksamkeit und Eigenschaften der freien Basen oder freien Säuren behalten, die nicht biologisch oder anderweitig unerwünscht sind. Die Salze werden mit anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und dergleichen, und organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Pyruvinsäure, Oxasäure, Maleinsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure, N-Acetylcystein und dergleichen, gebildet. Außerdem können diese Salze durch die Zugabe einer anorganischen Base oder einer organischen Base zu der freien Säure hergestellt werden. Salze, abgeleitet von einer anorganischen Base, umfassen die Natrium-, Kalium-, Lithium-, Ammonium-, Calcium-, Magnesiumsalze und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt. Salze, abgeleitet von organischen Basen, umfassen Salze von primären, sekundären und tertiären Aminen, substituierten Aminen, einschließlich natürlich vorkommenden substituierten Aminen, cyclischen Aminen und basischen Ionenaustauschharzen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Tripropylamin, Ethanolamin, Lysin, Arginin, N-Ethylpiperidin, Piperidin, Polyaminharze und dergleichen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Verbindungen der Formel IA sind wie Folgendes:
worin R¹, R³, R⁴, R⁵, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰, R¹², X, Y, Z, m und wie oben sind und durch pharmazeutisch akzeptable Salze davon dargestellt.
In den Verbindungen der Formel IA bilden R¹ und R¹² zusammen mit X und Y einen Phenylring oder
ist R¹ Wasserstoff,
und ist R¹² Wasserstoff, wobei X und Y jeweils C sind und die Bindung zwischen X und Y eine Doppelbindung ist, oder X und Y jeweils CH sind und die Bindung zwischen X und Y eine Einzelbindung ist; ist R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen oder Alkinyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen; ist R¹⁴ Alkyl mit 1. bis 5 Kohlenstoffatomen und ist n 0 oder 1; sind R³, R⁴ und R⁵ unabhängig Wasserstoff, Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Hydroxy oder Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, worin, wenn R⁴ nicht Wasserstoff ist, R³ und R⁵ beide Wasserstoff sind; ist R⁷ O oder NH; ist R⁸ Wasserstoff oder Methyl,
ist R⁹
ist R¹⁰ Wasserstoff oder Methyl; ist p 0 oder 1; ist m 0, 1, 2 oder 3;
ist Z
oder -S-S- und
ist R¹⁷ Wasserstoff oder Niederalkyl, bevorzugt Methyl.
Die gestrichelte Bindung in Formel IA kann hydriert sein. Wenn die gestrichelte Linie hydriert ist, sind X und Y beide -CH-. Andererseits bilden, wenn die gestrichelte Bindung vorliegt, Y und X zusammen mit R¹ und R¹² keinen Phenylring, X und Y sind beide vierwertige C-Atome.
In einer Ausführungsform der Verbindung der Formel IA sind X und Y jeweils CH und die Bindung zwischen X und Y wird zu einer Einzelbindung hydriert; Z ist
R⁷ ist O;
R¹ ist
R² ist Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen und R¹⁰ und R¹² sind beide Wasserstoff. Beispiele solcher Verbindungen umfassen
Penta-cydo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Verbindung der Formel IA ist Z
ist R⁷ NH;
ist R¹ Wasserstoff,
ist R² Alkyl und sind R¹⁰ und R¹² beide Wasserstoff.
In einer anderen Ausführungsform der Verbindung der Formel IA ist Z
ist R⁷ NH;
ist R¹
ist R² Alkyl und sind R¹⁰ und R¹² beide Wasserstoff.
In einer spezielleren Ausführungsform sind X und Y jeweils CH und die Bindung zwischen X und Y wird zu einer Einzelbindung hydriert; ist n 0 und ist R⁹
Beispiele solcher Verbindungen umfassen:
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Lys-NH₂ und
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-N-methyl(2)Nal-Lys-NH₂.
In einer anderen spezielleren Ausführungsform der Verbindung der Formel IA
ist Z
ist R⁷ NH;
ist R¹
ist R² Alkyl und sind R¹⁰ und R¹² beide Wasserstoff und
ist R⁹
und ist R¹⁰ Wasserstoff oder Niederalkyl, bevorzugt Methyl.
Diese Verbindungen umfassen die, worin X und Y jeweils CH sind und die Bindung zwischen X und Y eine Einzelbindung ist; und einer von R³, R⁴ und R⁵ Wasserstoff, Halogen oder Alkyl ist und die restlichen Wasserstoff sind, beispielsweise
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂,
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂,
Penta-cyclo(Glu-Lys)-Glu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂,
Penta-cyclo(Asp-Orn)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Orn-NH₂,
Penta-cyclo(Asp-Dbr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dbr-NH₂,
Penta-cyclo(Asp-Dpr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂ und
Ac-cyclo(Asp-Dpr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂.
Eine andere spezielle Ausführungsform der Verbindungen der Formel IA sind die Verbindungen, worin X und Y jeweils CH sind und die Bindung zwischen X und Y eine Einzelbindung ist
und R¹
ist;
einer von R³, R⁴ und R⁵ Alkoxy ist und die restlichen. Wasserstoff sind und n 0 ist, beispielsweise
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-9-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂,
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-EtOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂,
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-iPrOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂,
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-3-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂,
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-OHApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ und Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-9-ClApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.
Ausführungsformen der Verbindungen der Formel IA umfassen die Verbindungen, worin jeder von R¹, R³, R⁴, R⁵, R⁸ und R¹⁰ Wasserstoff ist; R⁷ NH ist;
R⁹
ist
und R¹⁷ Wasserstoff oder Niederalkyl, bevorzugt Methyl, ist und
p 0 ist, beispielsweise
Cyclo(Bernsteinsäure-Lys)-Bernsteinsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂,
Cyclo(Maleinsäure-Lys)-Maleinsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂,
Cyclo(Bernsteinsäure-Dpr)-Bernsteinsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂,
Cyclo(Maleinsäure-Dpr)-Maleinsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂.
In einer anderen Ausführungsform der Verbindung der Formel IA bilden R¹ und R¹² zusammen mit X und Y einen Phenylring. Beispiele solcher Verbindungen umfassen
Cyclo(Phthalsäure-Lys)-Phthalsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂;
Cyclo(Phthalsäure-Dpr)-Phthalsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂ und
Ac-Nle-cyclo(Cys-Cys)-Cys-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂.
Verbindungen der Formel IB werden durch die Formel:
wobei in den Verbindungen der Formel IB
R¹ Wasserstoff,
ist,
R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen oder Alkinyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; R¹⁴ Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; n 0 oder 1 ist; R⁶ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffen, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffen, Phenoxy oder Halogen ist; R⁷ O oder NH ist; R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist;
R⁹
ist;
R¹⁰ Wasserstoff oder Methyl ist; p 0 oder 1 ist; m 0, 1, 2 oder 3 ist;
Z
oder -S-S- ist und
R¹⁷ Wasserstoff oder Niederalkyl, bevorzugt Methyl, ist,
und pharmazeutisch akzeptable Salze davon darstellt.
In einer Ausführungsform der Verbindungen der Formel IB, d. h. Verbindungen der Formel IB1, ist Z
ist R⁷ NH;
ist R¹
ist R² Alkyl; sind R⁸ und R¹⁰ jeweils Wasserstoff und ist R⁹
und ist R¹⁷ wie oben.
In einer spezielleren Ausführungsform solcher Verbindungen der Formel IB1 ist R⁶ Wasserstoff oder Alkyl. Beispiele solcher Verbindungen umfassen:
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂,
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-2-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂,
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-2-iPiAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂,
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-3-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ und
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.
In einer anderen speziellen Ausführungsform solcher Verbindungen der Formel IB1 ist R⁶ Halogen. Ein Beispiel einer solchen Verbindung ist
Penta-cydo(Asp-Lys)-Asp-9-ClAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.
In einer anderen spezielleren Ausführungsform solcher Verbindungen der Formel IB1 ist R⁶ Alkoxy oder Phenoxy. Beispiele solcher Verbindungen umfassen:
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-PhOAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, und
Penta-(Asp-Lys)-Asp-3-MeO-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.
Verbindungen der Formel IC sind wie Folgendes:
wobei in den Verbindungen der Formel IC R¹ Wasserstoff oder
ist;
R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen oder Alkinyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; R¹⁴ Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; n 0 oder 1 ist; R¹¹ und R¹³ jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 3 oder 4 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen sind oder R¹¹ und R¹³ beide Phenyl sind; R⁷ O oder NH ist; R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist;
R⁹
ist;
R¹⁰ Wasserstoff oder Methyl ist; p 0 oder 1 ist; m 0, 1, 2 oder 3 ist und
Z
oder -S-S ist und
R¹⁷ Wasserstoff oder Niederalkyl, bevorzugt Methyl, ist
und durch pharmazeutisch akzeptable Salze davon dargestellt.
In einer Ausführungsform der Verbindung der Formel IC, der Verbindung der Formel IC1, ist
Z
ist R⁷ NH;
ist R¹
ist R² Alkyl; sind R⁸ und R¹⁰ jeweils Wasserstoff und
ist R⁹
In einer spezielleren Ausführungsform solcher Verbindungen der Formel IC1 ist einer von R¹¹ und R¹³ Alkyl oder Cycloalkyl und ist der andere Wasserstoff. Beispiele solcher Ansprüche
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Achc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ und
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Abc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.
In einer anderen spezielleren Ausführungsform solcher Verbindungen der Formel IC1 ist einer von R¹¹ und R¹³ Phenyl und der andere ist Wasserstoff oder Phenyl. Ein Beispiel einer solchen Verbindung ist
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-Adpc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.
In einer Ausführungsform der Verbindung der Formel II, der Verbindung der Formel IIA, ist
Z
ist R¹
ist R² Alkyl;
sind R³, R⁴, R⁵, R⁸ und R¹⁰ jeweils Wasserstoff;
ist R⁶ Wasserstoff, Halogen, Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen;
ist R⁹
und ist R¹⁷ wie oben.
In einer Ausführungsform der Verbindungen der Formel II-A, wie in dem vorausgehenden Absatz beschrieben, ist R⁷ NH. In einer spezielleren Ausführungsform ist R⁷ NH und ist R⁶ Wasserstoff oder Alkyl. Beispiele solcher Verbindungen umfassen:
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-(D,L)-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂;
Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-Me-(D,L)Atc-(D)Pbe-Arg-Trp-Lys-NH₂;
Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-Et-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ und
Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-iPr-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.
In einer anderen speziellen Ausführungsform der Verbindung der Formel II-A ist R⁷ NH und ist R⁶ Halogen. Beispiele solcher Verbindungen umfassen:
Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ und
Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.
In einer anderen speziellen Ausführungsform der Verbindung der Formel II-A ist R⁷ NH und ist R⁶ Alkoxy.
Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-MeO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂;
Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-EtO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂;
Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-iPrO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-7rp-Lys-NH₂.
Eine andere Ausführungsform der Verbindungen der Formel II sind die Verbindungen der Formel II, worin Z, R¹ bis R⁵ und R⁸ bis R¹⁰ wie oben beschrieben sind, R⁷ O ist und R⁶ Halogen ist. Beispiele solcher Verbindungen umfassen:
Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂ und
Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂.
In einer anderen Ausführungsform der Verbindung der Formel II sind die Verbindungen der Formel II-B die Verbindungen, worin Z -S-S- ist;
R¹
ist;
R³, R⁴, R⁵, R⁸ und R¹⁰ jeweils Wasserstoff sind; R⁶ Wasserstoff oder Halogen ist; R⁷ NH ist und
R⁹
ist
und R¹⁰ wie oben ist.
Beispiele solcher Verbindungen der Formel II-B umfassen:
Ac-Nle-cyclo(Cys-Cys)-Cys-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH_z und
Penta-cyclo(Cys-Cys)-Cys-5-Br(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂.
Diese Erfindung stellt ebenso die folgenden Verbindungen bereit:
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH₂ und
Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2S,3S)betamethyl-Trp-Lys-NH₂.
Die Nomenklatur, die verwendet wird, um die Peptide zu definieren, ist die, die typischerweise in der Technik verwendet wird, worin die Aminogruppe an dem N-Terminus links erscheint und die Carboxylgruppe an dem C-Terminus rechts erscheint. Unter natürlichen Ami nosäuren ist eine der natürlich vorkommenden Aminosäuren zu verstehen, die in Proteinen gefunden werden, d. h. Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp und His. Wo die Aminosäure isomere Formen aufweist, ist es die L-Form der Aminosäure, die dargestellt wird, wenn nicht anders explizit angegeben.

Die folgenden Abkürzungen oder Symbole werden verwendet, um Aminosäuren, Schutzgruppen, Lösungsmittel, Reagenzien und dergleichen darzustellen.

Symbol	Bedeutung
β-Ala	beta-Alanin
(2)-Nal	(2)-Naphthylalanin
Atc	2-Aminotetralin-2-carbonsäure
5-BrAtc	5-Brom-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-ClAtc	5-Chlor-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-MeOAtc	5-Methoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-EtOAtc	5-Ethoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-iPrOAtc	5-Isopropoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-MeAtc	5-Methyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-EtAtc	5-Ethyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-iPrAtc	5-Isopropyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure
5-DmaAtc	5-Dimethylamino-2-aminotetralin-2-carbonsäure
DBr	D-2,4-Diaminobutansäure
DPr	D-2,3-Diaminopropionsäure
Sar	Sarcosin (N-Methylglycin)
Cit	Citrullin
Apc	1-Amino-4-phenylcyclohexan-1-carbonsäure
4-HOApc	1-Amino-4-(4-hydroxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure
4-MeOApc	1-Amino-4-(4-methoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure
3-MeOApc	1-Amino-4-(3-methoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure
4-EtOApc	1-Amino-4-(4-ethoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure
4-iPrOApc	1-Amino-4-(4-isopropoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure
4-MeApc	1-Amino-4-(4-methylphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure
4-ClApc	1-Amino-4-(4-chlorphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure
Appc	4-Amino-1-phenylpiperidin-4-carbonsäure
2-MeAppc	4-Amino-1-(2-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure
2-iProAppc	4-Amino-1-(2-isopropoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure
3-MeAppc	4-Amino-1-(3-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure
3-MeOAppc	4-Amino-1-(3-methoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure
4-MeAppc	4-Amino-1-(4-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure
4-ClAppc	4-Amino-1-(4-chlorphenyl)piperidin-4-carbonsäure
4-PhOAppc	4-Amino-1-(4-phenoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure
Achc	1-Amino-4-clohexylcyclohexan-1-carbonsäure
Adpc	1-Amino-4-diphenylcyclohexan-1-carbonsäure
Abc	1-Amino-4-tert-butylcyclohexan-1-carbonsäure
3-Amb	3 Aminomethylbenzoesäure
4-Amb	4-Aminomethylbenzoesäure
2-Aba	2-Aminobenzoesäure
Bu	Butyl
Penta	Pentanoyl
Fmoc	9-Fluorenylmethoxycarbonyl
Pmc	2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl
Trt	Trityl (Triphenylmethyl)
CH₂Cl₂	Methylenchlorid
CH₃CN	Acetonitril
DMF	Dimethylformamid
DIPEA	N,N-Diisopropylethylamin
TFA	Trifluoressigsäure
HOBT	N-Hydroxybenzotriazol
DIC	N,N'-Diisopropylcarbodiimid
BOP	Benzotriazol-1-yloxy-tris-(dimethylamino)phosphoniumhexafluor
	phosphat
PyBroP	Brom-tris-pyrrolidino-phosphonium-hexafluorphosphat
HBTU	2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat
FAB-MS	Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie
ES-MS	Elektrospray-Massenspektrometrie

Die Darstellung der substituierten Aminosäure in Klammern gibt Analoga der Peptidsequenz an. Die Derivatisierung der N-terminalen Aminogruppe wird auf der linken Seite der N-terminalen Substitution angegeben, getrennt durch einen Bindestrich. Das heißt, beispielsweise gibt Ac-His-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz an, worin an dem N-Terminus Wasserstoff durch eine Acetylgruppe ersetzt worden ist. Die Suffixe „-OH" und „-NH₂" nach dem Bindestrich oder den Klammern beziehen sich auf die freie Säure- bzw. Amidform des Polypeptids.
Die linearen Peptide, die als die Präkursoren für die vorliegenden repräsentativen Verbindungen verwendet werden, können ohne weiteres durch jedes bekannte konventionelle Verfahren zur Bildung einer Peptidverknüpfung zwischen Aminosäuren synthetisiert werden. Diese konventionellen Verfahren umfassen beispielsweise ein Lösungsphasenverfahren, welches eine Kondensation zwischen der freien alpha-Aminogruppe einer Aminosäure oder einem Rest davon mit seiner Carboxylgruppe oder anderen reaktiven geschützten Gruppen und der freien primären Carboxylgruppe einer anderen Aminosäure oder einem Rest davon mit seiner Aminogruppe oder anderen reaktiven geschützten Gruppen erlaubt.
Das Verfahren zum Synthetisieren der linearen Peptide kann mittels eines Verfahrens, wobei jede Aminosäure in der erwünschten Sequenz sequentiell eine nach der anderen Aminosäure oder einem Rest davon zugegeben wird, oder mittels eines Verfahrens, wobei Peptidfragmente mit der erwünschten Aminosäuresequenz zunächst konventionell synthetisiert und dann kondensiert werden, um das gewünschte Peptid bereitzustellen, durchgeführt werden.
Diese konventionellen Verfahren zum Synthetisieren der linearen Präkursorpeptide umfassen beispielsweise jedes Festphasenpeptidsyntheseverfahren. Bei einem solchen Verfahren kann die Synthese der neuen Verbindungen mittels aufeinanderfolgender Einführung der gewünschten Aminosäurereste auf einmal in die wachsende Peptidkette gemäß der allgemeinen Prinzipien der Festphasenverfahren durchgeführt werden [Merrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154; Barany et al. The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Bd. 2, Gross, E. and Meienhofer, J., Hrsg. Academic Press 1-284 (1980)].
Für die chemischen Synthesen von Peptiden ist die Schützung der reaktiven Seitenkettengruppen der verschiedenen Aminosäurekomponenten mit geeigneten Schutzgruppen üblich, welche das Auftreten einer chemischen Reaktion an der Stelle verhindern, bis die Schutzgruppe schließlich entfernt wird. Ebenso ist normalerweise die Schützung der alpha-Aminogruppe einer Aminosäure oder eines Fragments üblich, während die Einheit an der Carboxylgruppe reagiert, gefolgt von der selektiven Entfernung der alpha-Aminoschutzgruppe und eine anschließende Reaktion an dieser Stelle ermöglicht wird. Während spezielle Schutzgruppen in bezug auf das Festphasensyntheseverfahren offenbart worden sind, sollte angemerkt werden, daß jede Aminosäure durch eine Schutzgruppe geschützt werden kann, die konventionell für die jeweilige Aminosäure in Lösungsphasensynthese verwendet wird.
Alpha-Aminogruppen können durch eine geeignete Schutzgruppe geschützt werden, ausgewählt aus aromatischen Schutzgruppen vom Urethantyp, wie Benzyloxycarbonyl (Z) und substituiertes Benzyloxycarbonyl, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, p-Biphenyl-isopropoxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) und p-Methoxybenzyloxycarbonyl (Moz); aliphatischen Schutzgruppen vom Urethantyp, wie t-Butyloxycarbonyl (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl und Allyloxycarbonyl. Hierin ist Fmoc für die alpha-Aminoschützung am stärksten bevorzugt.
Guanidinogruppen können durch eine geeignete Schutzgruppe geschützt werden, ausgewählt aus Nitro, p-Toluolsulfonyl (Tos), Z, Pentamethylchromansulfonyl (Pmc), Adamantyloxycarbonyl und Boc. Pmc ist für Arginin (Arg) am stärksten bevorzugt.
Alle Lösungsmittel, Isopropanol (iPrOH), Methylenchlorid (CH₂Cl₂), Dimethylformamid (DMF) und N-Methylpyrrolidinon (NMP) wurden von Fisher oder Burdick & Jackson bezogen und wurden ohne zusätzlich Destillation verwendet. Trifluoressigsäure wurde von Halocarbon oder Fluka bezogen und wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Diisopropylcarbodiimid (DIC) und Diisopropylethylamin (DIPEA) wurden von Fluka oder Aldrich bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet. Hydroxybenzotriazol (HOBT), Dimethylsulfid (DMS) und 1,2-Ethandithiol (EDT) wurden von Sigma Chemical Co. bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet. Geschützte Aminosäuren waren im allgemeinen von der L-Konfiguration und wurden kommerziell von Bachem, Advanced ChemTech oder Neosystem erhalten. Die Reinheit dieser Reagenzien wurde durch Dünnschichtchromatographie, NMR und Schmelzpunkt vor der Verwendung bestätigt. Benzhydrylaminharz (BHA) war ein Copolymer von Styrol-1% Divinylbenzol (100-200 oder 200-400 Mesh), erhalten von Bachem oder Advanced Chemtech. Der Gesamtstickstoffgehalt dieser Harze lag im allgemeinen zwischen 0,3 und 1,2 mÄqu./g.
Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) wurde auf einer LDC-Vorrichtung durchgeführt, bestehend aus Constametric I- und III-Pumpen, einem Gradient-Master-Lösungsmittelprogrammierer und Mischer und einem Spectromonitor III-UV-Detektor variabler Wellenlänge. Analytische HPLC wurde in Umkehrphasenweise unter Verwendung von Vydac-C₁₈-Säulen (0,4 × 30 cm) durchgeführt. Präparative HPLC-Trennungen liefen auf Vydac-Säulen (2 × 25 cm).
Die linearen Peptide wurden bevorzugt unter Verwendung von Festphasensynthese durch das Verfahren hergestellt, das von Merrifield beschrieben ist [J. Amer. Chem. Soc., 1963, 85, 2149], obwohl andere äquivalente chemische Synthesen, die in der Technik bekannt sind, verwendet werden könnten, wie zuvor erwähnt. Die Festphasensynthese beginnt am C-terminalen Ende des Peptids durch Verknüpfung einer geschützten alpha-Aminosäure mit einem geeigneten Harz. Ein solches Ausgangsmaterial kann durch Anlagern einer alpha-Amino-geschützten Aminosäure durch eine Esterverknüpfung mit einem p-Benzyloxybenzylalkoholharz (Wang) oder durch eine Amidbindung zwischen einem Fmoc-Linker wie p-[(R,S)-α-[1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxyformamido]-2,4-dimethyloxybenzyl]-phenoxyessigsäure (Rink-Linker) an ein Benzhydrylaminharz (BHA) hergestellt werden. Die Herstellung des Hydroxymethylharzes ist in der Technik allgemein bekannt. Fmoc-Linker-BHA-Harzträger sind kommerziell erhältlich und werden im allgemeinen verwendet, wenn das gewünschte Peptid, das synthetisiert wird, ein unsubstituiertes Amid an dem C-Terminus aufweist.
Da die Verbindungen der vorliegenden Erfindung cyclische Peptide sind, hergestellt durch die Bildung eines Lactams oder einer Disulfidbindung, werden die linearen Präkursorpeptide so vereinigt, um geeignete Aminosäuren oder Nachahmungen, die entsprechende Seitenkettenreste tragen, in Stellungen in den linearen Peptiden zu bringen, die schließlich eine intramolekulare Amidbindungs- oder Disulfidbindungsbildung induzieren können. Die Lactame werden durch die Verknüpfung einer Seitenkettenaminofunktionalität eines C-terminalen Aminosäurerests mit einem distalen Carbonsäurerest gebildet, während die Disulfidbindung durch die oxidative Verknüpfung von zwei Cysteinresten gebildet wird, die entsprechend an dem C-Ende und an oder nahe dem N-Ende des linearen Präkursorpeptids eingefüht werden. Beispielsweise kann bei der Herstellung der Lactampeptide in den linearen Präkursorpentapeptiden die N-Kappe als eine Matrize verwendet werden, um einen Carboxylrest einzuführen, z. B. Struktur X, oder in dem Fall von Hexapeptiden wird das Peptid so konstruiert, daß der N-terminale Aminosäurerest aus einer der Aminosäuren ausgewählt ist, enthaltend eine geeignet geschützte Seitenkettencarbonsäuregruppe, z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure. Bei den linearen Heptapeptiden werden entweder Asparaginsäure oder Glutaminsäure als der vorletzte Rest von dem N-Terminus eingeführt. Bei allen linearen Präkursorpeptiden, d. h. den Hepta- Hexa- und Pentapeptiden, ist der C-terminale Rest aus natürlicher oder unnatürlicher Aminosäure ausgewählt, die einen geeignet geschützten basischen Seitenkettenrest trägt, der eine Amidbindung bilden kann, wenn ungeschützt, beispielsweise Lysin, Ornithin, 2,3-Diaminopropionsäure, 2,4-Diaminobutansäure. Um ein cyclisches Peptid zu bilden, das eine Disulfidbindung enthält, wo der Präkursor ein lineares Hexapeptid ist, ist das Peptid so gestaltet, daß ein entsprechend S-geschützter Cysteinrest als sowohl der C- als auch N-terminale Rest eingeführt wird, während, wenn der Präkursor ein lineares Heptapeptid ist, die entsprechend S-geschützten Cysteinreste als sowohl der C-terminale Rest als auch der vorletzte N-terminale Rest wie in beispielsweise X eingeführt werden.
Im allgemeinen werden, um die linearen Peptide herzustellen, die Aminosäuren oder Nachahmungen mit dem Fmoc-Linker-BHA-Harz unter Verwendung der Fmoc-geschützten Form von Aminosäure oder Nachahmung mit 2 bis 5 Äquivalenten von Aminosäure und einem geeigneten Verknüpfungsreagens verknüpft. Nach den Verknüpfungen kann das Harz gewaschen und unter Vakuum getrocknet werden. Die Beladung der Aminosäure auf dem Harz kann durch Aminosäureanalyse eines aliquoten Teils von Fmoc-Aminosäureharz oder durch Bestimmung von Fmoc-Gruppen durch UV-Analyse bestimmt werden. Jede nicht umgesetzte Aminogruppen kann durch Umsetzen des Harzes mit Essigsäureanhydrid und Diisopropylethylamin in Methylenchlorid überkappt werden.
Die Harze werden durch mehrere wiederholte Zyklen geführt, um nacheinander Aminosäuren hinzuzufügen. Die alpha-Amino-Fmoc-Schutzgruppen werden unter basischen Bedingungen entfernt. Piperidin, Piperazin oder Morpholin (20 bis 40 Vol.-%) in DMF kann für diesen Zweck verwendet werden. Bevorzugt werden 40% Piperidin in DMF verwendet.
Nach der Entfernung der alpha-Aminoschutzgruppe werden die folgenden geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge verknüpft, um ein intermediäres, geschütztes Peptid-Harz zu erhalten. Die Aktivierungsreagenzien, die für die Verknüpfung der Aminosäuren in der Festphasensynthese der Peptide verwendet werden, sind in der Technik allgemein bekannt. Beispielsweise sind entsprechende Reagenzien für diese Synthesen Benzotriazol-1-yloxy-tri-(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP), Brom-tris-pyrrolidino-phosphonium-hexafluorphosphat (PyBroP), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und Diisopropylcarbodiimid (DIC). Bevorzugt sind hier HBTU und DIC. Andere Aktivierungsmittel, wie von Barany und Merrifield beschrieben [The Peptides, Bd. 2, J. Meienhofer, Hrsg., Academic Press, 1979, S. 1-284], können verwendet werden. Verschiedene Reagenzien, wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT), N-Hydroxysuccinimid (HOSu) und 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin (HOOBT) können zu den Verknüpfungsgemischen zugegeben. werden, um die. synthetischen Zyklen zu optimieren. Bevorzugt ist hier HOBT.
Das Protokoll für einen typischen synthetischen Zyklus ist folgendermaßen: Protokoll 1
Lösungsmittel für alle Waschungen und Verknüpfungen wurden auf Volumen von 10 bis 20 ml/g Harzen abgemessen. Die Verknüpfungsreaktionen während der ganzen Synthese wurden durch den Kaiser-Ninhydrin-Test überwacht, um das Ausmaß der Beendigung zu bestimmen [Kaiser et al. Anal. Biochem. 1970, 34, 595-598]. Langsame Reaktionskinetiken wurden für Fmoc-Arg (Pmc) und für Verknüpfungen mit sekundären Aminen durch sterisch gehinderte Säuren beobachtet. Jegliche unvollständige Verknüpfungsreaktionen wurden entweder erneut mit frisch hergestellter aktivierter Aminosäure verknüpft oder durch Behandeln des Peptidharzes mit Essigsäureanhydrid überkappt, wie oben beschrieben. Die vollständig vereinigten Peptidharze wurden für mehrere Stunden im Vakuum getrocknet.
Für jede Verbindung wurden die Blockierungsgruppen entfernt und das lineare Peptid von dem Harz durch folgendes Verfahren getrennt. Im allgemeinen werden die Peptidharze mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 300 μl Anisol und 9,5 ml Trifluoressigsäure pro Gramm Harz bei Raumtemperatur für 120 min behandelt. Das Harz wird abfiltriert und die Filtrate fallen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge werden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wird mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und erneut zentrifugiert. Wenn erwünscht, werden die linearen Rohpeptide durch präparative HPLC gereinigt. Die Peptide werden auf die Säulen in einem minimalen Volumen von entweder AcOH/H₂O oder 0,1% TFA/H₂O aufgebracht. Die Gradientenelution begann im allgemeinen bei 10% B-Puffer, 10% bis 60% B in 90 Minuten (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min. Die UV-Detektion wird bei 280 nm durchgeführt. Die Fraktionen wurden bei 1,0 bis 2,5 Minutenintervallen gesammelt und durch analytische HPLC untersucht. Die mit hoher Reinheit beurteilten Fraktionen wurden zusammengefaßt und lyophilisiert.
Um die Lactame herzustellen, wird das entsprechend ungereinigte lineare Peptid in einem geeigneten inerten Lösungsmittel, beispielsweise N-Methylpyrrolidon oder DMF, bevorzugt DMF, gelöst und auf einen scheinbaren pH von 8,0 durch die Zugabe einer tertiären Aminbase, beispielsweise N-Methylmorpholin, eingestellt, und dann mit einem Amidbindungbildenden Reagens, bevorzugt BOP, behandelt. Die Reaktion wird günstigerweise bei einer Temperatur zwischen 40°C und 0°C, bevorzugt bei etwa Raumtemperatur, durchgeführt. Die Reinigung der rohen cyclischen Peptide wird mittels präparativer HPLC durchgeführt. Die Gradientenelution begann im allgemeinen bei 20% B-Puffer, 20% bis 60% B in 90 Minuten (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min. Die UV-Detektion wird bei 280 nm durchgeführt. Die Fraktionen wurden gesammelt und durch analytische HPLC überwacht. Die mit hoher Reinheit beurteilten Fraktionen wurden zusammengefaßt und lyophilisiert.
Um die cyclischen Disulfidpeptide herzustellen, wird das HPLC-gereinigte lineare Peptid, enthaltend zwei entsprechend positionierte Cysteinreste, bei einem ziemlich hohen Verdünnungsgrad in einem geeigneten inerten Lösungsmittelgemisch, beispielsweise wässerigem DMSO, gelöst und die Lösung wird auf pH 8,0 durch die vorsichtige Zugabe von Ammoniumhydroxid eingestellt. Sauerstoff wird dann durch die gerührte Lösung hindurchgeperlt. Die Reaktion wird günstigerweise bei einer Temperatur zwischen 40°C und 0°C, bevorzugt bei etwa Raumtemperatur, durchgeführt, und der Verlauf der Cyclisierung wird durch analytische HPLC überwacht. Nachdem die Reaktion als beendet beurteilt wurde, wird die Lösung lyophilisiert und das rohe cyclische Peptid wird durch präparative HPLC gereinigt. Die Gradientenelution begann im allgemeinen bei 20% B-Puffer, 20% bis 60% B in 90 Minuten (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min. Die UV-Detektion wird bei 280 nm durchgeführt. Die Fraktionen wurden gesammelt und durch analytische HPLC überwacht. Die mit hoher Reinheit beurteilten Fraktionen wurden zusammengefaßt und lyophilisiert.
Die Reinigung der rohen Peptide wird mittels präparativer HPLC durchgeführt. Die Peptide wurden auf die Säulen in einem minimalen Volumen von entweder AcOH/H₂O oder 0,1% TFA/H₂O aufgebracht. Die Gradientenelution begann im allgemeinen bei 10% B-Puffer, 10% bis 60% B in 90 Minuten (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min. Die UV-Detektion wird bei 280 nm durchgeführt. Die Fraktionen wurden bei 1,0 bis 2,5 Minutenintervallen gesammelt und durch analytische HPLC untersucht. Die mit hoher Reinheit beurteilten Fraktionen wurden zusammengefaßt und lyophilisiert.
Die Reinheit der Endprodukte wird durch analytische HPLC auf einer Umkehrphasensäule untersucht, wie oben angemerkt. Die Reinheit von allen Produkten wird auf ungefähr 95 bis 99% bewertet. Alle Endprodukte wurden ebenso der Fast-Atom-Bombardment-Massen spektrometrie (FAB-MS) oder Elektrospray-Massenspektrometrie (ES-MS) unterzogen. Alle Produkte ergeben die erwarteten Stamm-M + H-Ionen innerhalb akzeptabler Grenzen.
Das Verfahren zum Synthetisieren der repräsentativen Verbindungen kann mittels einer Verfahrensweise, wobei jede Aminosäure in der erwünschten Sequenz sequentiell eine nach der anderen zu einer Aminosäure oder einem Rest davon zugegeben wird, oder mittels eines Verfahrens, wobei Peptidfragmente mit der erwünschten Aminosäuresequenz zunächst konventionell synthetisiert und dann kondensiert werden, um das gewünschte Peptid bereitzustellen, durchgeführt werden.
Diese konventionellen Verfahren zum Synthetisieren neuer Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen beispielsweise jedes Festphasenpeptidsyntheseverfahren. Bei einem solchen Verfahren kann die Synthese neuer Verbindungen mittels aufeinanderfolgender Einführung der gewünschten Aminosäurereste auf einmal in die wachsende Peptidkette gemäß der allgemeinen Prinzipien der Festphasenverfahren durchgeführt werden [Merrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154; Barany et al. The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Bd. 2, Gross, E. und Meienhofer, J., Hrsg. Academic Press 1-284 (1980)].
Üblich für die chemische Synthese von Peptiden ist die Schützung der reaktiven Seitenkettengruppen der verschiedenen Aminosäurekomponenten mit geeigneten Schutzgruppen, die das Auftreten einer chemischen Reaktion an der Stelle verhindern, bis die Schutzgruppe schließlich entfernt wird. Normalerweise ist ebenso die Schützung der alpha-Aminogruppe einer Aminosäure oder eines Fragments üblich, während die Einheit an der Carboxylgruppe reagiert, gefolgt von der selektiven Entfernung der alpha-Aminoschutzgruppe und eine anschließende Reaktion an dieser Stelle ermöglicht wird. Während spezielle Schutzgruppen in bezug auf das Festphasensyntheseverfahren offenbart worden sind, sollte angemerkt werden, daß jede Aminosäure durch eine Schutzgruppe, die konventionell für die jeweilige Aminosäure in der Lösungsphasensynthese verwendet wird, geschützt werden kann.
Alpha-Aminogruppen können durch eine geeignete Schutzgruppe geschützt werden, ausgewählt aus aromatischen Schutzgruppen vom Urethantyp, wie Benzyloxycarbonyl (Z) und substituiertes Benzyloxycarbonyl, wie p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, p-Biphenyl-isopropoxycarbonyl, 9-Fluorenylmeth oxycarbonyl (Fmoc) und p-Methoxybenzyloxycarbnnyl (Moz); aliphatischen Schutzgruppen vom Urethantyp, wie t-Butyloxycarbonyl (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropoxycarbonyl und Allyloxycarbonyl. Hier ist Fmoc für die alpha-Aminoschützung am stärksten bevorzugt.
Guanidinogruppen können durch eine geeignete Schutzgruppe geschützt werden, ausgewählt aus Nitro, p-Toluolsulfonyl (Tos), Z, Pentamethylchromansulfonyl (Pmc), Adamantyloxycarbonyl und Boc. Pmc ist für Arginin (Arg) am stärksten bevorzugt.
Alle Lösungsmittel, Isopropanol (iPrOH), Methylenchlorid (CH₂Cl₂), Dimethylformamid (DMF) und N-Methylpyrrolidinon (NMP) wurden von Fisher oder Burdick & Jackson bezogen und wurden ohne zusätzliche Destillation verwendet. Trifluoressigsäure wurde von Halocarbon oder Fluka bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet. Diisopropylcarbodiimid (DIC) und Diisopropylethylamin (DIPEA) wurden von Fluka oder Aldrich bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet. Hydroxybenzotriazol (HOBT), Dimethylsulfid (DMS) und 1,2-Ethandithiol (EDT) wurden von Sigma Chemical Co. bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet. Geschützte Aminosäuren waren im allgemeinen von der L-Konfiguration und wurden kommerziell von Bachem, Advanced ChemTech oder Neosystem erhalten. Die Reinheit dieser Reagenzien wurde durch Dünnschichtchromatographie, NMR und Schmelzpunkt vor der Verwendung bestätigt. Benzhydrylaminharz (BHA) war ein Copolymer von Styrol-1% Divinylbenzol (100-200 oder 200-400 Mesh), erhalten von Bachem oder Advanced Chemtech. Der Gesamtstickstoffgehalt dieser Harze lag im allgemeinen zwischen 0,3 und 1,2 mÄqu./g.
Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) wurde auf einer LDC-Vorrichtung durchgeführt, bestehend aus Constametric I- und III-Pumpen, einem Gradient-Master-Lösungsmittelprogrammierer und Mischer und einem Spectromonitor III-UV-Detektor variabler Wellenlänge. Analytische HPLC wurde in Umkehrphasenweise unter Verwendung von Vydac-C₁₈-Säulen (0,4 × 30 cm) durchgeführt. Präparative HPLC-Trennungen liefen auf Vydac-Säulen (2 × 25 cm).
Peptide wurden bevorzugt unter Verwendung von Festphasensynthese durch das Verfahren hergestellt, das im allgemeinen von Merrifield beschrieben ist [J. Amer. Chem. Soc., 1963, 85, 2149], obwohl andere äquivalente chemische Synthesen, die in der Technik bekannt ist, verwendet werden könnte, wie zuvor erwähnt. Die Festphasensynthese begann an dem C-terminalen Ende des Peptids durch Verknüpfen einer geschützten alpha-Aminosäure mit einem geeigneten Harz. Ein solches Ausgangsmaterial kann durch Anlagern einer alpha-Amino-geschützten Aminosäure durch eine Esterverknüpfung mit einem p-Benzyloxybenzylalkoholharz (Wang) oder durch eine Amidbindung zwischen einem Fmoc-Linker wie p-[(R,S)-α-[1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxyformamido]-2,4-dimethyloxybenzyl]-phenoxyessigsäure (Rink-Linker) an einem Benzhydrylaminharz (BHA) hergestellt werden. Die Herstellung des Hydroxymethylharzes ist in der Technik allgemein bekannt. Fmoc-Linker-BHA-Harzträger sind kommerziell erhältlich und werden im allgemeinen verwendet, wenn das gewünschte Peptid, das synthetisiert wird, ein unsubstituiertes Amid am C-Ende aufweist.
Im allgemeinen werden die Aminosäuren oder Nachahmungen mit dem Fmoc-Linker-BHA-Harz unter Verwendung der Fmoc-geschützten. Form der Aminosäure oder Nachahmung mit 2 bis 5 Äquivalenten von Aminosäure und einem geeigneten Verknüpfungsreagens verknüpft. Nach den Verknüpfungen kann das Harz gewaschen und im Vakuum getrocknet werden. Die Beladung der Aminosäure auf dem Harz kann durch Aminosäureanalyse eines aliquoten Teils von Fmoc-Aminosäureharz oder durch Bestimmung der Fmoc-Gruppen durch UV-Analyse bestimmt werden. Jegliche nicht umgesetzte Aminogruppen können durch Umsetzen des Harzes mit einem Essigsäureanhydrid und Diisopropylethylamin in Methylenchlorid überkappt werden.
Die Harze werden durch mehrere wiederholte Zyklen geführt, um Aminosäuren nacheinander hinzuzufügen. Die alpha-Amino-Fmoc-Schutzgruppen werden unter basischen Bedingungen entfernt. Piperidin, Piperazin oder Morpholin (20-40 Vol.-%) in DMF kann für diesen Zweck verwendet werden. Bevorzugt werden 40% Piperidin in DMF verwendet.
Nach der Entfernung der alpha-Aminoschutzgruppe werden die folgenden geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge verknüpft, um ein intermediäres, geschütztes Peptidharz zu erhalten. Die Aktivierungsreagenzien, die zum Verknüpfen der Aminosäuren in der Festphasensynthese der Peptide verwendet werden, sind in der Technik allgemein bekannt. Beispielsweise sind entsprechende Reagenzien für diese Synthesen Benzotriazol-1-yloxy-tri-(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP), Brom-tris- pyrrolidino-phosphoniumhexafluorphosphat (PyBroP), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) und Diisopropylcarbodiimid (DIC). Bevorzugt sind hier HBTU und DIC: Andere Aktivierungsmittel, wie von Barany und Merrifield. beschrieben [The Peptides, Bd. 2, J. Meienhofer, Hrsg., Academic Press, 1979, S. 1-284] können verwendet werden. Verschiedene Reagenzien, wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT), N-Hydroxysuccinimid (HOSu) und 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin (HOOBT), können zu den Verknüpfungsgemischen zugegeben werden, um die synthetischen Zyklen zu optimieren. Bevorzugt ist hier HOBT.
Das Protokoll für einen typischen synthetischen Zyklus ist folgendermaßen: Protokoll 1
Lösungsmittel für alle Waschungen und Verknüpfungen wurden auf Volumen von 10 bis 20 ml/g Harzen abgemessen. Die Verknüpfungsreaktionen während der ganzen Synthese wurden durch den Kaiser-Ninhydrin-Test überwacht, um das Ausmaß der Beendigung zu bestimmen [Kaiser et al. Anal. Biochem. 1970, 34, 595-598]. Langsame Reaktionskinetiken wurden für Fmoc-Arg (Pmc) und für Verknüpfungen mit sekundären Aminen durch sterisch gehinderte Säuren beobachtet. Jegliche unvollständige Verknüpfungsreaktionen wurden entweder erneut mit frisch hergestellter aktivierter Aminosäure verknüpft oder durch Behandeln des Peptidharzes mit Essigsäureanhydrid überkappt, wie oben beschrieben. Die des Peptidharzes mit Essigsäureanhydrid überkappt, wie oben beschrieben. Die vollständig vereinigten Peptidharze wurden für mehrere Stunden im Vakuum getrocknet.
Für jede Verbindung wurden die Blockierungsgruppen entfernt und das Peptid von dem Harz durch folgendes Verfahren getrennt. Die Peptidharze wurden mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 300 μl Anisol und 9,5 ml Trifluoressigsäure pro Gramm Harz bei Raumtemperatur für 120 min behandelt. Das Harz wird abfiltriert und die Filtrate fallen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge werden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wird mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und erneut zentrifugiert. Die Rohprodukte werden unter Vakuum getrocknet.
Reinigung von rohen Peptidpräparaten
Die Reinigung der rohen Peptide wurde durch präparative HPLC durchgeführt. Die Peptide. wurden auf die Säulen in einem minimalen Volumen von entweder AcOH/H₂O oder 0,1% TFA/H₂O aufgebracht. Die Gradientenelution wurde im allgemeinen bei 10% B-Puffer, 10% bis 60% B in 90 Minuten (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min begonnen. Die UV-Detektion wurde bei 280 mit durchgeführt. Die Fraktionen wurden bei 1,0 bis 2,5 Minutenintervallen gesammelt und durch analytische I-IPLC untersucht. Die mit hoher Reinheit beurteilten Fraktionen wurden zusammengefaßt und lyophilisiert.
Die Reinheit der Endprodukte wurde durch analytische HPLC auf einer Umkehrphasensäule untersucht, wie oben angemerkt. Die Reinheit aller Produkte wurde auf ungefähr 95 bis 99 beurteilt. Alle Endprodukte wurden ebenso der Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie (FAB-MS) oder Elektrospray-Massenspekrometrie (ES-MS) unterzogen. Alle Produkte ergaben die erwarteten Stamm-M + H-Ionen innerhalb akzeptabler Grenzen.
Unter der Verwendung der oben beschriebenen Techniken können die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß den folgenden Reaktionsschemen synthetisiert werden.
Reaktionsschema A
Reaktionsschema B
Reaktionsschema C
Reaktionsschema D
Reaktionsschema F
Reaktionsschema G
Reaktionsschema H
Reaktionsschema I
Reaktionsschema J
Reaktionsschema K
Reaktionsschema L
Reaktionsschema M
Reaktionsschema N
Reaktionsschema O
Reaktionsschema Q
Reaktionsschema R
Reaktionsschema S
Reaktionsschema T
Reaktionsschema U
Reaktionsschema V
Die linearen Peptide, die hierin als die vorletzten Zwischenprodukte bei den Synthesen der cyclischen Peptide der vorliegenden Erfindung (Struktur 1) verwendet werden, werden unter Verwendung konventioneller Festphasenpeptidsynthesemethodologie, die in dem vorhergehenden Abschnitt erläutert wird, hergestellt. Jeder Zyklus besteht aus zwei Verfahren; die anfängliche Spaltung der Fmoc-Schutzgruppe von dem terminalen Stickstoff in der harzgebundenen Kette, gefolgt von Acylierung der Aminfunktion mit einer Fmoc-geschützten Aminosäure. Der Zyklus wird im allgemeinen gemäß der schrittweisen Verfahren, die in Proto koll 1 dargestellt sind, durchgeführt werden. Die Entschützung wird unter Verwendung einer organischen Base, beispielsweise Piperazin, Morpholin oder Piperidin, bevorzugt Piperidin, in einem geeigneten inerten Lösungsmittel, beispielsweise N,N-Dimethylformamid (DMF) oder N-Methylpyrrolidon (NMP), erreicht. Die Verknüpfungsreaktion kann durch eine der vielen Bedingungen, die für die Amidbindungsbildung entwickelt wurden, beispielsweise Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluronium-hexafluorphosphat (HBTU), in Gegenwart einer organischen Base, beispielsweise Diisopropylethylamin (DIPEA), in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise DMF, durchgeführt werden. Alternativ kann in dem vorliegenden Fall die Amidgruppe unter Verwendung eines Carbodiimids, beispielsweise Diisopropylcarbodiimid (DIC), zusammen mit einem. Aktivierungsmittel, wie 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT), in einem geeigneten inerten Lösungsmittel, wie DMF, gebildet werden.
In Reaktionsschema A wird in dem ersten Zyklus zur Herstellung der linearen Polypeptidpräkursoren für die cyclischen Peptide von Struktur 1, wobei Z NHCO ist, das Fmoc-Linker-BHA-Harz, dargestellt durch Struktur 2, entschützt und mit Fmoc-Aminosäuren der Struktur 3 kondensiert, wodurch die harzgebundenen Verbindungen von 4 erhalten wurden. Bei diesen Synthesen der cyclischen Peptide ist es erforderlich, daß die Fmoc-Aminosäure 3 ein Schlüsselstrukturerfordernis enthält, die eine geeignet geschützte basische Seitenkette ist, die, wenn entschützt, an der Bildung der intramolekularen Amidbindung beteiligt sein kann. Um die wachsende Peptidkette zu verlängern, umfaßt ein zweiter Zyklus die Fmoc-Aminosäuren 5, wodurch die Verbindungen der Struktur 6 erhalten wurden. In dem dritten Zyklus liefert die Behandlung des harzverknüpften Peptids 6 die Zwischenprodukte der Struktur 7a, wo R⁸ Wasserstoff ist. Die Zwischenprodukte der Struktur 7b wobei R⁸ Methyl ist, werden synthetisiert, wie in Schema C gezeigt.
Die Zwischenprodukte der Struktur 7b werden aus den Verbindungen der Struktur 7a hergestellt, wie in Schema C gezeigt. Bei dieser Verfahrensweise werden die Verbindungen der Struktur 7a, hergestellt durch Behandeln der Verbindungen der Struktur 6, wie in den Schritten 1 bis 5 von Protokoll 1 beschrieben, mit einem Arylsulfonylchlorid, bevorzugt 2-Nitrobenzolsulfonylchlorid 23, umgesetzt, wodurch die Verbindungen der Struktur 24 hergestellt wurden. Diese Reaktion wird in Gegenwart eines Protonenakzeptors, beispielsweise Pyridin, Triethylamin (TEA) oder DIPEA, bevorzugt DIPEA, in einem geeigneten inerten Lösungsmittel, bevorzugt DMF, durchgeführt. Die N-Methylierung der gebildeten Sulfonamidgruppe in den gewaschenen harzgebundenen Verbindungen der Struktur 24 wird. unter Mitsunobu-Bedingungen erreicht, wodurch die Verbindung der Struktur 25 hergestellt wurde. Bei der Durchführung dieser Reaktion werden die Sulfonamide der Struktur 24 mit Methanol in Gegenwart von Diethylazodicarboxylat (DEAD) und Triphenylphosphin unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel umgesetzt. Nachdem die Reaktion beendet war, wurde das harzgebundene N-Methylsulfonamid der Struktur 25 frei von restlichen Reagenzien und Nebenprodukten gewaschen.
In den nächsten Schritten, wie in Reaktionsschema A dargestellt, wird der 2-Nitrobenzolsulfonylrest von der Struktur 25 durch Umsetzen von 25 mit 2-Mercaptoethanol und der starken organischen Base 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) in einem geeigneten Lösungsmittel, bevorzugt DMF, entfernt, wodurch das harzgebundene Zwischenprodukt der Struktur 7b erhalten wurde. Der dritte Zyklus von Reaktionsschema A wird durch Verknüpfen von Verbindungen von entweder den Strukturen 7a und 7b mit Fmoc-Arg(Pmc)-OH (8) oder Fmoc-Cit-OH (9) beendet, wodurch die harzgebundenen Verbindungen der Struktur 10 erhalten wurden.
Die nächsten zwei Zyklen, die in Reaktionsschema B gezeigt werden, werden durch erstes Umsetzen der Peptide der Struktur 10 mit der Aminosäure Fmoc-(D)-Phe-OH, um die Verbindung der Struktur 11 herzustellen, und dann Umsetzen diese Verbindung der Struktur 11 mit entweder einer der Aminosäurenachahmungen der Struktur 12 oder 13 durchgeführt, um diese Aminosäuren in das harzgebundene Peptid einzuführen, wodurch die harzgebundenen Pentapeptide von entweder Struktur 14 oder 15 erhalten wurden, in Abhängigkeit dessen, welche Aminosäurenachahmungen verwendet werden. Die Einführung der zusätzlichen Aminosäure, die Carbonsäureseitenketten enthält, in die linearen Pentapeptide, die schließlich geeignet an der Bildung der cyclischen Peptide dieser Erfindung beteiligt sind, wird in zwei Wegen erreicht:

a. Wie aus Reaktionsschema B hervorgeht, wird eine Fmoc-Aminosäure mit einer entsprechend geschützten Säureseitenkette in die harzgebundenen Pentapeptide 14 und 15 eingeführt. Daher wird in Zyklus 6 (Reaktionsschema B) Fmoc-Asp(OtBu)-OH (16) oder Fmoc-Glu(OtBu)-OH (17) in die wachsende Peptidkette eingeführt, wodurch die harzgebundenen Hexapeptide der Strukturen 18 bzw. 19 erhalten wurden, oder alternativ
b. Die harzgebundenen Pentapeptide 14 und 15 sind mit einem cyclischen Anhydrid der Struktur 28' (Reaktionsschema F), beispielsweise Maleinsäureanhydrid oder Phthalsäureanhydrid, N-geschützt, wodurch die Verbindungen der Struktur 29 und 30 erhalten wurden, oder alternativ
c. Wie aus Reaktionsschema B hervorgeht, können die harzgebundenen Hexapeptide 18 und 19 weiter mit einer zusätzlichen Aminosäure unter Bildung eines Heptapeptids vor der N-Schützung umgesetzt werden. Dies wird durch die Einführung eines Aminosäurerests, bevorzugt Fmoc-Nle-OH, in der üblichen Weise erreicht, um 21 und 22 zu liefern.

Die N-Schützung von Heptapeptid oder Hexapeptid erzeugt die terminale Amidfunktionsgruppe der Verbindung 1. In dieser Weise werden die Substituenten X, Y, R¹² und R¹ hergestellt. Um die harzgebundenen Hexapeptide (18, 19) oder Heptapeptide (21, 22) N-zu schützen, wird das Polypeptid zunächst mit Piperidin in DMF behandelt, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen, und dann mit einem Acylierungsmittel umgesetzt. Wie in Reaktionsschema D gezeigt, um die Verbindung der Struktur 1 vor der Bildung von Z herzustellen, worin X und Y CH sind und R¹
wird das harzgebundene Polypeptid der Struktur 18 entschützt und N-acyliert, um das harzgebundene Amid der Struktur 27 zu erhalten, oder wird nach der Entschützung mit einem Isocyanat umgesetzt, um die Harnstoffe der Struktur 28 zu bilden. Die N-Acylierung wird unter einer Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, durchgeführt.
Unter den verwendeten Verfahren sind:

(i) Umsetzung der terminalen Aminofunktionalität mit einer Carbonsäure R²-CO₂H in einem geeigneten Lösungsmittel, wie DMF, in Gegenwart von HBTU und einer organischen Base, bevorzugt DIPEA;
(ii) Umsetzung der terminalen Aminofunktionalität mit einem Carbonsäurechlorid R₂-COCl in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dichlormethan, in Gegenwart einer organischen Base, wie Pyridin, TEA und DIPEA, bevorzugt DIPEA; oder
(iii) Umsetzung der terminalen Aminofunktionalität mit einem Carbonsäuxeanhydrid der Struktur 28', wie in Reaktionsschema T gezeigt. Diese Reaktion wird in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dichlormethan oder DMF, in Gegenwart einer organischen Base, bevorzugt DIPEA, durchgeführt.

Die N-Schützungsreaktion in Reaktionsschema D, wo Verbindungen der Struktur 18 zu Harnstoffen der Struktur 28 umgewandelt werden, wird mittels Umsetzen der terminalen Aminogruppe in den Verbindungen der Struktur 28 mit einem Isocyanat R₂-NCO durchgeführt. Diese Umsetzung wird in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dichlormethan oder DMF, in Gegenwart einer organischen Base, bevorzugt DIPEA, durchgeführt. Wenn die Acylierung und Harnstoffbildungsreaktionen beendet sind, werden die harzgebundenen Produkte 27 und 28 frei von restlichen Reagenzien und Nebenprodukten gewaschen. Unter Verwendung ähnlicher Bedingungen wird die N-Schützung der harzgebundenen Polypeptide der Struktur 19 21 und 22 durch die Bildung der N-acylierten Verbindungen der Strukturen 33 35, 37 und der Harnstoffe der Struktur 34, 36 und 38 (Reaktionsschema E) durchgeführt. Jedoch kann das Reaktionsschema E modifiziert werden, um andere R¹⁴-Grupppen als die bereitzustellen, die von Nle abgeleitet sind, unter Verwendung bekannter anderer Aminosäuren als die Verbindung der Struktur 20 in Reaktionsschema B, um Verbindungen der Strukturen 21 und 22 herzustellen.
Die Reaktionsschemen G und H veranschaulichen die Spaltung der restlichen Schutzgruppen in den N-geschützten Polypeptiden 29, 30, 33 bis 38 und die begleitende Spaltung der Peptide von dem festen Träger. Diese Reaktion wird unter Verwendung einer starken organischen Säure, bevorzugt Trifluoressigsäure, gegebenenfalls in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels wie Dichlormethan und einer Spur (1%) von Wasser und gegebenenfalls in Gegenwart von einem oder mehreren Carbokationenfängern, beispielsweise Ethandithiol, Dimethylsulfid, Triethylsilan und Anisol, durchgeführt. Die Polypeptidspaltungslösung wird frei von festem Träger filtriert, dann mit einem geeigneten Lösungsmittel, bevorzugt Diethylether, verdünnt und die gebildeten Feststoffe durch Filtration gesammelt. Die festen Polypeptide der Strukturen 39 bis 44, hergestellt in Reaktionsschema H, können durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer präparativen C18-Säule gereinigt werden.
Mit den entsprechenden Funktionalitäten, die nun so erhältlich sind, um die intramolekulare Amidbindung zu bilden, werden die N-geschützten linearen Polypeptide den Amidbildungsreaktionsbedingungen, die in der Technik allgemein bekannt sind, unterzogen. Folglich wird wiederum jedes der linearen Peptide 31, 32 (Reaktionsschema G) und 39 bis 44 (Reaktionsschema I) in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise DMSO, gelöst, und durch die Zugabe einer tertiären Aminbase, beispielsweise N-Methylmorpholin, wird die Lösung auf einen scheinbaren pH von 8 vor der Zugabe eines Amid-bildenden Reagens, beispielsweise BOP, eingestellt. Die Reaktion wird günstigerweise bei einer Temperatur zwischen 0°C und 40°C, bevorzugt bei etwa Raumtemperatur, durchgeführt. Die Reaktion konnte verlaufen, bis sie als beendet beurteilt wurde. Übliche Verfahren, die vom Fachmann verwendet werden, um den Verlauf einer Reaktion zu überwachen, sind beispielsweise DC oder analytische HPLC. Nach der Entfernung der Reaktionslösungsmittel im Vakuum können. die rohen cyclischen Peptide der Struktur I, wo Z NHCO ist, wie in Reaktionsschema I gezeigt, durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer präparativen C18-Säule gereinigt werden. In dieser Weise wird die Verbindung der Struktur 1 hergestellt, wobei Z eine NHCO-Brücke ist.
Die cyclischen Disulfidpeptide der Struktur 1, wo Z S-S ist, werden hergestellt durch Methodologien, die in den Reaktionsschemen dargestellt sind, ähnlich denen, die oben in den Reaktionsschemens A bis H für die Herstellung der Lactame der Struktur 1, wo Z NHCO ist, beschrieben sind. Die vorletzten linearen Polypeptide werden in ähnlicher Weise vereinigt, mit der Ausnahme, daß Aminosäuren, die geschützte Thiolseitenkettenreste, beispielsweise Fmoc-Cys(Trt)-OH, enthalten, an den entsprechenden Stellungen des wachsenden harzgebundenen Polypeptids, bevorzugt in Zyklus 1 und 6, eingeführt werden. Diese Herstellung der harzgebundenen linearen Polypeptide wird in den Reaktionsschemen J und K veranschaulicht. Wie zuvor beschrieben und in Schema L gezeigt, kann das harzgebundene lineare Hexapeptid 52 nach der Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe entweder durch Acylierung, um 56 zu erhalten, oder durch Umsetzung mit einem Isocyanat, um den Harnstoff 57 zu bilden, N-geschützt werden. In derselben Weise werden das harzgebundene Hexapeptid 53 und die harzgebundenen Heptapeptide 54 und 55 zu den entsprechenden N-acylierten Derivaten 58, 60 und 62 und den Harnstoffderivaten 59, 61 und 63 (Reaktionsschema M) umgewandelt.
In Reaktionsschema N wird das N-geschützte harzgebundene lineare Hexapeptid 56 mit einer starken Säure, bevorzugt Trifluoressigsäure, gegebenenfalls in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels, wie Dichlormethan, und gegebenenfalls in Gegenwart eines oder mehrerer Carbokationenfänger, beispielsweise Ethandithiol, Drimethylsulfid, Triethylsilan und Anisol, behandelt. Dies verursacht die Spaltung aller Seitenkettenschutzgruppen sowie die Trennung des linearen Peptids von dem festen Träger. Die Reaktion wird günstigerweise bei einer Temperatur zwischen 0°C und 35°C, bevorzugt bei Raumtemperatur, durchgeführt. Die Polypeptidspaltungslösung wird frei von dem festen Träger filtriert, dann mit einem geeigneten Lösungsmittel, bevorzugt Diethylether, gelöst und die gebildeten Feststoffe werden durch Filtration gesammelt. Das so hergestellte feste Polypeptid der Struktur 64 kann gegebenenfalls durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer präparativen C18-Säule gereinigt werden. Das lineare Hexapeptid 64 wird dann unter oxidativen Bedingungen, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, behandelt, die Thiole unter Bildung einer Disulfidbindung induzieren können. Folglich wird eine verdünnte wässerige Lösung aus 64 auf pH 8,0 unter Verwendung einer mäßig schwachen anorganischen Base, bevorzugt Ammoniumhydroxid, eingestellt, und dann wurde Sauerstoff durch die Lösung hindurchgeperlt, bis die Cyclisierung als beendet betrachtet wurde, unter Verwendung von Standardverfahren, beispielsweise DC oder HPLC. Nach der Entfernung der Reaktionslösungsmittel durch Lyophilisierung kann das rohe cyclische Peptid (I; Z = S-S), das in dieser Weise hergestellt und isoliert wurde, durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer präparativen C18-Säule gereinigt werden.
Unter ähnlichen Bedingungen wie denen, die hierin zuvor in Verbindung mit den Reaktionsschemen H und I beschrieben wurden, werden die harzgebundenen linearen Polypeptide 58 bis 63, wie in den Reaktionsschemen O und P gezeigt, entschützt und von dem festen Träger getrennt, um die linearen Peptide 65 bis 70 (Reaktionsschema O) zu erhalten, die dann oxidativ cyclisiert werden, wie oben beschrieben, um die entsprechenden Verbindungen der Struktur 1 (Reaktionsschema P) zu erhalten.
Die Fmoc-Aminosäuren, die bei der Herstellung der oben beschriebenen Peptide verwendet werden, sowie die Acylierungsmittel und Isocyanate, die verwendet werden, um die Polypeptide N-zu schützen, sind bekannte Verbindungen, die kommerziell erhältlich sind. Die Fmoc- Aminosäuren 12, einschließlich ihrer Spezies, die Verbindung der Struktur 13, die in Reaktionsschema B verwendet wird, werden, wie hierin beschrieben, durch Verfahren hergestellt, die dem Fachmann in der Praxis der organischen Chemie allgemein bekannt sind. In Schema Q wird die Herstellung der Fmoc-Aminosäurespezies der Verbindung der Struktur 12 aus cyclischen Ketonen dargestellt. Diese Spezies, die die Struktur 12 und Struktur 13, 79 und 80 sind, werden in derselben Weise wie die Spezies der Struktur 75, wie in der Verfahrensweise von Schema Q dargestellt, hergestellt. Die 4-Phenylcyclohexanone der Struktur 71 werden zu den Hydantoinen der Struktur 72 durch Behandlung mit Ammoniumcarbonat und Kaliumcyanid umgewandelt. Die Reaktion wird günstigerweise in einem wässerigem Ethanolgemisch bei einer Temperatur von 50°C bis 90°C, bevorzugt zwischen 80°C und 90°C, durchgeführt. Die direkte Hydrolyse der Hydantoine zu den Aminosäuren der Struktur 73 erfordert eine verlängerte Behandlung mit einer starken Base, beispielsweise mit 6 N Natriumhydroxidlösung oder mit Bariumhydroxid, bei Rückflußtemperatur. Alternativ können Verbindungen der Struktur 72 zu den Bis-Boc-Derivaten der Struktur 74 umgewandelt werden. Die Reaktion wird mittels tert-Butyldicarbonat [(Boc)₂O] in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt Tetrahydrofuran (THF), in Gegenwart einer organischen Aminbase, bevorzugt TEA, und einem Katalysator, 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur, bevorzugt bei Raumtemperatur, durchgeführt. Die Bis-Boc-hydantoine der Struktur 74 werden ohne weiteres zu den Aminosäuren der Struktur 73 umgewandelt. Die Reaktion wird unter Verwendung von 1 N Natriumhydroxid in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt Dimethoxyethan (DME), bei 0°C bis 50°C, bevorzugt bei etwa Raumtemperatur, erreicht. Die Schützung der Aminofunktionalität mit einer Fmoc-Gruppe in einer Verbindung der Struktur 73 wird unter eine Vielzahl von Reaktionsbedingungen durchgeführt, um die Verbindung der Struktur 75 zu erhalten, die die Fmoc-Aminosäurespezies der Verbindung der Struktur 12 ist. Die Reaktion kann günstigerweise durch die Behandlung einer Lösung der Aminosäure 73 in einem Gemisch aus THF oder Dioxan, bevorzugt Dioxan, und wässerigem Natriumcarbonat mit 9-Fluorenylmethoxychlorformiat (FmocCl) bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur, bevorzugt bei Raumtemperatur, durchgeführt werden. Alternativ wird N-(9-Fluorenylmethoxycarbonyloxy)succinimid (FmocOSu) zu einer Lösung aus Aminosäure 73 in wässerigem Acetonitril, enthaltend eine organische tertiäre Aminbase, bevorzugt TEA, zugegeben. Die Reaktion verläuft bei 0°C bis Raumtemperatur, bevorzugt bei Raumtemperatur. In einer anderen Variante der Verfahrensweise wird DME aus dem Hydrolysegemisch bei der Umwandlung von 74 zu 73 verdampft, und die Reaktion wird auf pH ~ 11 eingestellt. Die resultierende Lösung aus dem Natriumsalz von 73 wird dann in situ mit FmocOSu oder FmocCl in Dioxan bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur, bevorzugt bei Raumtemperatur, behandelt. In derselben Weise, wie in Reaktionsschema Q, können die Tetralone 76, die N-Aryl-4-ketopiperidine 77 und die Cyclohexanonderivate 78 zu den entsprechenden Fmoc-Aminosäuren der Strukturen 13, 79 und 80 umgewandelt werden, wobei alle zusammen mit 73 Untergattungen der Struktur 12 bilden, die in Reaktionsschema B verwendet werden.
In Reaktionsschema Q können die Verbindungen der Struktur 73, wo R⁴ ein lineares oder verzweigtes Niederalkoxy darstellt und sowohl R² als auch R³ Wasserstoff in der Untergattung der Struktur 82 sind, durch O-Alkylierung der Verbindung der Struktur 81 hergestellt werden, wie in Reaktionsschema R gezeigt. Wo R¹⁶ eine unverzweigte Niederalkylkomponente darstellt, wird die Alkylierung unter Verwendung eines primären Alkylhalogenids der Struktur R¹⁶ Halogenid in Gegenwart eines Alkalimetallcarbonats, beispielsweise Natrium- oder Kaliumcarbonat, durchgeführt. Das Alkylhalogen kann ein Chlor-, Brom- oder Iodderivat, bevorzugt ein Alkyliodid, sein. Die Reaktion kann günstigerweise in einem inerten Lösungsmittel, das die SN₂-Verschiebungsreaktionen beschleunigt, beispielsweise Aceton, 2-Butanon oder N,N-Dimethylformamid, bevorzugt Aceton, bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis Rückflußtemperatur der Lösung, bevorzugt der Rückflußtemperatur, durchgeführt werden. Wenn R¹⁶ eine verzweigte Niederalkylgruppe darstellt, z. B. 2-Propyl, wird die Alkylierung der Verbindung der Struktur 81, um die Verbindung der Struktur 82 herzustellen, unter Verwendung eines sekundären Alkylhalogenids der Struktur R¹⁶ Halogenid in Gegenwart eines Alkalimetallcarbonats, z. B. Kaliumcarbonat, durchgeführt. Das sekundäre Alkylhalogenid ist bevorzugt ein sekundäres Alkyliodid, beispielsweise 2-Iodpropan. Die Reaktion kann günstigerweise in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt N,N-Dimethylformamid, bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis Rückflußtemperatur der Lösung, bevorzugt bei etwa 100°C, durchgeführt werden.
Die 4-Arylcyelohexanone der Struktur 71, die die Ausgangsmaterialien in Reaktionsschema Q sind, können durch Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann in der Praxis der organischen Chemie allgemein bekannt sind. Wie in Schema S dargestellt, führt die Behandlung der Arylhalogenide der Struktur 83, wo X¹ Brom oder Iod mit einem Alkylmetallreagens, bevorzugt t-Butyllithium, darstellt, zu einer Transmetallierungsreaktion, um das ent sprechende Aryllithium der Struktur 84 zu erhalten. Die Reaktion wird günstigerweise bei –78°C unter Zugabe einer Lösung des Alkyllithiums zu einer Lösung aus einer Verbindung der Struktur 83 in einem inerten wasserfreien Lösungsmittel, wie Diethylether oder Tetrahydrofuran, bevorzugt Tetrahydrofuran, durchgeführt werden. Das Aryllithium der Struktur 84, hergestellt in dieser Weise, wird dann in situ mit einer Lösung aus dem. Monoketal von Cyclohexan-1,4-dion (85) in einem geeigneten inerten Lösungsmittel, beispielsweise Tetrahydrofuran, umgesetzt, während die Reaktionstemperatur unter –60°C, bevorzugt bei etwa –78°C, gehalten wird, um die Carbinole der Struktur 86 zu erhalten. Die Verbindungen der Struktur 87 werden durch die Dehydrierung der Carbinole der Struktur 86 erhalten. Die Reaktion. wird günstigerweise unter Verwendung eines starken organischen Säurekatalysators, bevorzugt p-Toluolsulfonsäure, in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise Benzol oder Toluol, bevorzugt Benzol, bei der Rückflußtemperatur des Lösungsmittels durchgeführt. Das gebildete Wasser wird aus dem Reaktionsgemisch mittels einer Dean-Stark-Vorrichtung entfernt, damit die Reaktion beendet werden kann. Die Verbindungen der Struktur 88 werden durch Hydrierung der Olefine der Struktur 87 hergestellt. Die Reaktion wird günstigerweise unter Verwendung eines Edelmetallkatalysators, beispielsweise Palladium auf Kohlenstoff, in einer Wasserstoffatmosphäre, in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise Ethanol oder Ethylacetat, durchgeführt. Die Hydrierung wird normalerweise bei Raumtemperatur und 40 psi Wasserstoff durchgeführt, jedoch wird, wenn der Arylring in Struktur 87 eine Gruppe enthält, die zur Hydrogenolyse neigt, z. B. wenn R³, R⁴ oder R⁵ Chlor darstellen, der Reaktionsdruck bei etwa 5 psi gehalten. Die Verbindungen der Struktur 88 können ebenso direkt aus Carbinolen der Struktur 86 durch reduktive Eliminierung der Hydroxylgruppe erhalten werden. Bei dieser Reaktion wird eine Lösung der Verbindung der Struktur 86 (R³ = R⁴ = H und R⁵ = OMe) in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise Dichlormethan, mit einer Lewis-Säure, wie Bortrifluoridetherat, und einem Reduktionsmittel, beispielsweise Triethylsilan, bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur behandelt. Die Entfernung der Ketalschutzgruppe in Verbindungen der Struktur 88 ergibt das Keton der Formel 71, welches das Ausgangsmaterial für Reaktionsschema Q zur Herstellung der Fmoc-Aminosäurespezies der Struktur 75 der Verbindung der Struktur 12 ist. Die Reaktion wird günstigerweise in Aceton oder 2-Butanon, bevorzugt Aceton, unter Säurekatalyse, beispielsweise 4 N Salzsäure oder p-Toluolsulfonsäure, bei Raumtemperatur bis Rückflußtemperatur des Reaktionsgemisches, bevorzugt bei der Rückflußtemperatur, durchgeführt.
5-Substituierte beta-Tetralone der Struktur 76, in Reaktionsschema Q gezeigt, welche das Ausgangsmaterial für die Herstellung der Verbindung der Struktur 13 sind, sind bekannte Verbindungen, oder wenn sie nicht bekannt sind, können sie durch Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann in dem Bereich der organischen Chemie allgemein bekannt sind. In dem vorliegenden Fall werden die Verbindungen der Struktur 76 im wesentlichen durch zwei Verfahren hergestellt, die in den Reaktionsschemen T und U dargestellt sind. Wie in Schema T gezeigt, wird eine 2-substituierte Hydrozimtsäure der Struktur 90 zu dem entsprechenden Carbonsäurechlorid der Struktur 91 umgewandelt. Diese Umwandlung kann durch mehrere Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise durch die Behandlung der Hydrozimtsäure mit Oxalylchlorid, gegebenenfalls in Gegenwart einer katalytischen Menge N,N-Dimethylformamid, in einem inerten Lösungsmittel, wie Benzol oder Dichlormethan, bevorzugt Dichlormethan. Die Reaktion kann günstigerweise bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur, bevorzugt bei Raumtemperatur, durchgeführt werden. Alternativ reagiert die Verbindung der Struktur 90 mit einem Acylchlorid-bildenden Reagens, wie Sulfurylchlorid, in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise Benzol oder Toluol, bevorzugt Toluol, bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und Rückflußtemperatur der Lösung, bevorzugt bei Rückflußtemperatur. Das Diazoketon der Struktur 92 wird durch die Behandlung des so gebildeten Acylhalogenids der Struktur 91. in einem inerten Lösungsmittel, z. B. Dichlormethan, mit einem Überschuß einer frisch hergestellten Etherallösung aus Diazomethan hergestellt. Die Kombination von Reagenzien wird günstigerweise bei Eisbadtemperatur durchgeführt und die Reaktion verlief dann bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur, bevorzugt bei Raumtemperatur. Wie in Reaktionsschema T gezeigt, wird die Cyclisierung des Diazoketons der Struktur 92, um das Tetralon der Struktur 76 zu liefern, durch Rhodium(II)acetatdimer in einem inerten Lösungsmittel, z. B. Dichlormethan, beschleunigt. Die Reaktion wird normalerweise bei Raumtemperatur bis Rückflußtemperatur der Lösung, bevorzugt bei Rückflußtemperatur, durchgeführt.
Die Verbindungen der Struktur 76, welche ein Ausgangsmaterial in Reaktionsschema Q ist, worin R⁶ eine lineare oder verzweigte Niederalkoxygruppe darstellt, können, wie in Reaktionsschema U gezeigt, aus Verbindungen der Struktur 93 hergestellt werden. In Reaktionsschema U werden die Verbindungen der Struktur 94, wo R^15' eine unverzweigte Niederalkylkomponente ist, durch Per-O-alkylierung des Naphthalindiols der Struktur 93 mit einem primären Alkyliodid oder -bromid, bevorzugt einem -iodid, in Gegenwart einer Base, wie einem Alkalimetallcarbonat, beispielsweise Natrium- oder Kaliumcarbonat, hergestellt. Die Alkalimetallcarbonat, beispielsweise Natrium- oder Kaliumcarbonat, hergestellt. Die Reaktion kann in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt N,N-Dimethylformamid, bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis 100°C, bevorzugt bei 35°C, durchgeführt werden. Die Verbindungen der Struktur 97, wo R^15' ein verzweigtes Niederalkyl ist, werden in zwei Schritten aus dem 2-Tetralon der Struktur 94 hergestellt. Das Tetralon der Struktur 95 wird der Dehydrierung in Gegenwart eines Edelmetallkatalysators, wie Palladiummetall (10% auf Kohlenstoff) in einem geeignet hochsiedenden Lösungsmittel, wie p-Cymen, unterzogen, um die aromatisierte Verbindung der Struktur 96 zu erhalten. Das Naphthol der Struktur 96 wird dann mit einem sekundären Alkyliodid in Gegenwart einer Base, wie einem Alkalimetallcarbonat, bevorzugt Caesiumcarbonat, O-alkyliert, um die Verbindung der Struktur 97 zu liefern. Die Reaktion kann günstigerweise in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt N,N-Dimethylformamid, bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis 100°C, bevorzugt bei etwa 40°C, durchgeführt werden.
Die Tetralone der Strukturen 76 werden durch Reduktion der Verbindungen der Strukturen 94 und 97 unter Lösungsmetallbedingungen hergestellt, gefolgt von der säurekatalysierten Hydrolyse der intermediären Enolether. Die Umwandlung wird günstigerweise durch die portionsweise Zugabe eines großen Überschusses eines Alkalimetalls, wie Natrium oder Kalium, bevorzugt Natrium, zu einer siedenden Lösung des Substrats in einem niederen Alkohol, bevorzugt Ethanol, durchgeführt, bis das Ausgangsmaterial verbraucht ist. Die Tetralone der Strukturen 76 werden durch die Behandlung einer Lösung der isolierten intermediären Enolether mit einem starken Säurekatalysator, bevorzugt p-Toluolsulfonsäure, erhalten. Die Hydrolyse kann günstigerweise in einem Gemisch aus einem niederen Alkohol, bevorzugt Ethanol, und Wasser bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und der Rückflußtemperatur der Lösung, bevorzugt bei der Rückflußtemperatur, durchgeführt werden.
Bei der Herstellung der Verbindungen der Struktur 77, die in Reaktionsschema Q als Ausgangsmaterialien beim Herstellen der Verbindungen der Formel 79 verwendet werden, die die Fmoc-Aminosäure-Spezies der Verbindung der Struktur 12 sind, wird die Verbindung der Struktur 98 als ein Ausgangsmaterial verwendet. Dieses wird in Reaktionsschema V gezeigt. In Reaktionsschema V können die Verbindungen der Struktur 100 durch Reaktionen hergestellt werden, die per se bekannt sind. Beispielsweise können sie durch Verknüpfen des sekundären Amins der Struktur 98 mit einem Arylbromid oder -iodid, bevorzugt einem Aryl iodid der Struktur 99 (Reaktionsschema V) hergestellt werden. Die Verknüpfungsreaktion wird durch einen Edelmetallkatalysator, bevorzugt Tri(dibenzylidenaceton)dipalladium, in Gegenwart eines chelatbildenden Phosphinliganden, bevorzugt Tri-o-tolylphosphin, und einer gehinderten Alkoxidbase, wie Natrium-tert-butoxid, katalysiert. Die Reaktion wird günstigerweise in einer inerten Atmosphäre unter Verwendung eines wasserfreien Lösungsmitteis, wie Dioxan oder Toluol, bevorzugt Dioxan, bei einer Temperatur von 60°C bis Rückflußtemperatur, bevorzugt bei 90°C, durchgeführt. Die Entfernung der Carbonylschutzgruppe in Verbindung 100, um die Verbindungen der Struktur 77 zu erhalten, kann durch eine Vielzahl von Verfahren, die auf dem Gebiet der organischen Chemie allgemein bekannt sind, durchgeführt werden. Beispielsweise kann die Entschützung durch die Behandlung einer Lösung aus Verbindung 100 in einem niedrigsiedenden Keton, wie Aceton oder 2-Butanon, mit einer wässerigen Mineralsäuxelösung, beispielsweise 6 N Salzsäure, bei einer Temperatur von Raumtemperatur bis Rückflußtemperatur des Gemisches, bevorzugt bei der Rückflußtemperatur, erreicht werden. Die Verbindung der Struktur 100, wenn in dieser Weise mit einer wässerigen Mineralsäure behandelt, bildet in Reaktionsschema V die Verbindung der Struktur 77. Die Verbindung der Struktur 77, wie in der Erläuterung von Reaktionsschema Q dargestellt, ist das Zwischenprodukt für die Verbindung der Struktur 79, die die Säurespezies der Struktur 12 ist, worin Q
ist.
In Reaktionsschema A sind die Aminosäuren der Struktur 5 bekannte Verbindungen, worin R⁹
ist.
Andererseits werden Aminosäuren der Struktur 5, worin R¹⁷ in R⁹ Niederalkyl ist, d. h. wo R⁹
ist, aus einer Verbindung der Formel 101 über Reaktionsschema V folgendermaßen hergestellt: Reaktionsschema W
Wie in Reaktionsschema W gezeigt, wurde β-Methyl(Nin-Mes)tryptophan 109 durch die Verwendung des Verfahrens, das zuvor von Boteju, L. W., Wenger K. und Hruby, V. J. Tet. Lett., 33, 7491 (1992) beschrieben wurde, hergestellt. In dem ersten Schritt wird der Stickstoff in trans-Indol-3-acrylsäure 101 durch die Umwandlung zu dem entsprechenden Mesitylensulfonamid 102 geschützt. Die Umsetzung wird mittels Behandeln der Indolsäure 101 mit einem Überschuß (> 2 Äquiv.) einer Lösung eines Alkyl- oder Aryllithiumreagens, beispielsweise Phenyllithium oder n-Butyllithium, bevorzugt n-Butyllithium, in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt Tetrahydrofuran, bei einer Temperatur von –40°C bis etwa –100°C, am günstigsten bei –78°C, durchgeführt. Während die Reaktion bei etwa –78°C gehalten wird, wird die gebildete dilithiierte Spezies dann mit Mesitylensulfonylchlorid umgesetzt, wodurch das Mesitylensulfonamid 102 geliefert wurde. Die N-geschützte Indolacrylsäure 102 wird dann mit dem chiralen Zusatzstoff (R)-4-Phenyl-2-oxazolidinon (Herstellung siehe Nicolas et al., J. Org Chem. 1993, 58, 766-770) als seine N-lithiierte Spezies 104 verknüpft, wodurch das chirale Acrylamid 105 erhalten wurde. Die Verknüpfung wurde über ein gemischtes Anhydrid, das aus 102 gebildet wurde, erreicht. Um das gemischte Anhydrid 103 zu bilden, wurde die N-geschützte Indolacrylsäure 102 mit einem geeigneten Acylchlorid, beispielsweise t-Butylchlorformiat, 2,4,6-Trichlorbenzoylchlorid oder Pivaloylchlorid, bevorzugt Pivaloylchlorid, in Gegenwart einer tertiären Aminbase, beispielsweise Triethylamin oder Diisopropylethylamin, bevorzugt Triethylamin, umgesetzt. Die Kriterien, die die Wahl eines geeigneten Acylchlorids möglich machen, um das Anhydrid 103 zu bilden, sind gut etabliert und dem Fachmann für organische Chemie bekannt. Die Anhydridbildung verläuft in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise Tetrahydrofuran, bei einer anfänglichen Temperatur zwischen –100°C und 0°C, bevorzugt bei etwa –78°C. Die Reaktion kann bei einer Temperatur zwischen –78°C und 0°C, bevorzugt bei etwa 0°C zum Abschluß kommen. Das so gemischte Anhydrid 103 wurde dann in situ mit einer Lösung aus N-lithiiertem (R)-Phenyl-2-oxazolidinon 104, das zuvor durch Behandeln einer Lösung aus (R)-4-Phenyl-2-oxazolidinon in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise Tetrahydrofuran, mit einer äquimolaren Menge einer Lösung aus einem Alkyl- oder Aryllithiumreagens, beispielsweise Phenyllithium oder n-Butyllithium, bevorzugt n-Butyllithium, hergestellt wurde, in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise Hexan, bei einer Temperatur zwischen 100°C und 0°C, bevorzugt bei etwa –78°C, umgesetzt. Die Verknüpfungsreaktion, die das chirale Acrylamid 105 ergibt, wird bei einer anfänglichen Temperatur zwischen –100°C und 0°C, bevorzugt bei etwa –78°C, durchgeführt, und nachdem alle Reagenzien vereinigt wurden, kann die Reaktion bei einer Temperatur zwischen –78°C und Raumtemperatur, bevorzugt bei etwa Raumtemperatur, verlaufen.
Das Highlight der Umwandlung des chiralen Acrylamids 105 in 106 ist die kontrollierte Erzeugung der zwei neuen benachbarten Chiralitätszentren, die in 106 vorliegen. Die Reaktion umfaßt die stereoselektive 1,4-Konjugataddition (Michael-Addition) eines Methylcuprats, gebildet in situ aus dem Kupfer(I)-bromid-Dimethylsulfid-Komplex und Methylmagnesiumbromid, an den Michael-Akzeptor, das α,β-ungesättigte Carbonylsystem, das in 105 vorliegt. Das resultierende Metallchelatenolat wird dann direkt mit einem Halogenierungsmittel, bevorzugt N-Bromsuccinimid, halogeniert, wodurch 106 erhalten wurde. Erneut ist, wie in dem Fall der Michael-Addition, die Einführung des Bromatoms stereoselektiv, kontrolliert durch die voluminöse Phenylgruppe an dem chiralen Zusatzstoff, der effektiv die si-Seite von sowohl dem α,β-ungesättigten Acyloxazolidinonsystem als auch. dem intermediären Metallchelatenolat vor dem Angriff von ankommenden Reagenzien schützt. Um das Methylcuprat herzustellen, wird eine Lösung aus Methylmagnesiumbromid in Diethylether zu einer Lösung aus Kupfer(I)-bromid-Dimethylsulfid-Komplex (1 : 1) in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise Dimethylsulfid oder Tetrahydrofuran, bevorzugt einemn Gemisch davon, zugegeben. Die Reaktion verläuft bei einer Temperatur zwischen –78°C und Raumtemperatur, bevorzugt bei –4°C. Anstelle von Methylmagnesiumbromid kann jedes Niederalkylbromid zugegeben werden, um R¹⁷ zu bilden, wobei R¹⁷ eine andere Niederalkylgruppe als Methyl ist. Zu dieser gebildeten Lösung aus Methylcuprat wird in situ eine Lösung aus dem α,β-ungesättigten Acyloxazolidinon 105 in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt Tetrahydrofuran, zugegeben. Die Methylcuprataddition verläuft anfänglich bei einer Temperatur zwischen –30°C und Raumtemperatur, bevorzugt bei –4°C, und kann dann bei Raumtemperatur verlaufen. Wenn beurteilt wird, daß die Reaktion beendet ist (z. B. Analyse durch DC oder HPLC), wird sie dann auf eine Temperatur zwischen –100°C und –40°C, bevorzugt auf etwa –78°C, abgekühlt, woraufhin eine Lösung aus einem Halogenierungsmittel, bevorzugt N-Bromsuccinimid, in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise Tetrahydrofuran, zugegeben wird. Die Reaktion kann dann bei einer Temperatur zwischen 0°C und Raumtemperatur, bevorzugt bei etwa Raumtemperatur, verlaufen, wodurch nach der Isolation das Bromid 106 erhalten wurde. Das Bromid wird dann durch ein Azidion unter einer begleitenden Umkehrung der Konfiguration verschoben. Diese Umwandlung wird durch die Umsetzung des Bromids 106 mit Tetrabutylammoniumazid in Gegenwart eines Überschusses Natriumazid in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise Acetonitril, erreicht, wodurch das Azid 107 erhalten wurde. Die Reaktion verläuft günstigerweise bei einer Temperatur zwischen 80°C und Raumtemperatur, bevorzugt bei etwa Raumtemperatur. Die Behandlung von 107 und einem Alkalimetallhydroxid, beispielsweise Natrium-, Kalium- oder Lithiumhydroxid, bevorzugt Lithiumhydroxid, in Gegenwart von Wasserstoffperoxid führte zur Hydrolyse des chiralen Zusatzstoffes, wodurch die Azidosäure 108 erhalten wurde. Die Hydrolysereaktion verläuft in einem inerten Lösungsmittel, bevorzugt Wasser, bei einer Temperatur zwischen 0°C und Raumtemperatur, bevorzugt bei etwa 0°C. Die Hydrierung der α-Azidosäure 108 ergibt das β-Methyl(Nin-Mes)tryptophan, das direkt zu dem entsprechenden N(α)-Fmoc-β-Methyl(Nin-Mes)tryptophan 109 umgewandelt wird. Die Hydrierung von 108 wird über einem Edelmetallkatalysator, bevorzugt 10% Pd/C, in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise einem niederen Alkanol, bevorzugt Methanol, bei niedrigem Druck (< 2 Atm.) und bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Entfernung des Katalysators durch Filtration werden die flüchtigen Bestandteile entfernt und das Produkt wird in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise Tetrahydrofuran oder Wasser, bevorzugt einem Gemisch daraus, gelöst und mit einer milden anorganischen Base, beispielsweise einem Alkalimetallbicarbonat, bevorzugt Natriumbicarbonat, und einem Fmoc-N-Schutzgruppe-bildenden Reagens, beispielsweise 9-Fluorenylmethylchlorformiat (Fmoc-Cl) oder 9-Fluorenylmethyl-N-succinimidylcarbonat (Fmoc-OSu), bevorzugt Fmoc-Osu, behandelt, wodurch 109 geliefert wurde. Die Reaktion verläuft günstigerweise bei einer Temperatur zwischen 0°C und Raumtemperatur, bevorzugt bei Raumtemperatur. Die Verbindung der Formel 109 ist eine Aminosäurespezies der Struktur 5 in Reaktionsschema A.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenso auf ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel:
worin R¹ bis R¹², m, p, Q, X, Y und Z wie oben definiert sind, durch Bildung einer Lactambindung oder einer Disulfidbindung an der Z-Stellung der linearen Präkursorpeptide.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenso auf pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend Verbindungen, wie oben definiert, und einen therapeutisch inerten Träger.
Die Verbindungen der Formeln I und II sowie Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH₂ und Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2S,3S)betamethyl-Trp-Lys-NH₂, hergestellt gemäß dieser Erfindung, können in pharmazeutischen Zusammensetzungen hergestellt werden, die zur Verabreichung oder Inhalation mit einem geeigneten Träger oder Vehikel durch in der Technik bekannte Verfahren geeignet sind.
Die Verbindungen, wie oben beschrieben, können als Medikamente verwendet werden, z. B. in Form von pharmazeutischen Präparaten, z. B. zur parenteralen Verabreichung. Sie können beispielsweise parenteral, z. B. in Form von Injektionslösungen oder Infusionslösungen, verabreicht werden.
Die Herstellung der pharmazeutischen Präparate kann in einer Weise, die dem Fachmann bekann sein wird, durch Bringen der Verbindungen, wie oben beschrieben, gegebenenfalls in Kombination mit anderen therapeutisch wertvollen Substanzen, in eine Verabreichungsform zusammen mit geeigneten nicht-toxischen, inerten, therapeutisch verträglichen festen oder flüssigen Trägermaterialien und, wenn gewünscht, üblichen pharmazeutischen Hilfsmitteln bewirkt werden.
Geeignete Trägermaterialien sind nicht nur anorganische Trägermaterialien, sondern ebenso organische Trägermaterialien.
Übliche Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Benetzungsmittel und Emulgatoren, Konsistenz-verbessernde Mittel, Aroma-verbessernde Mittel, Salze zum Verändern des osmotischen Drucks, Puffersubstanzen, Lösungsvermittler, Farbmittel und Maskierungsmittel und Antioxidationsmittel kommen als pharmazeutische Hilfsmittel in Betracht.
Die Dosierung der Verbindungen, wie oben beschrieben, kann innerhalb breiter Grenzen in Abhängigkeit der zu bekämpfenden Krankheit, des Alters und des individuellen Zustands des Patienten und der Verabreichungsweise variieren, und. wird natürlich an die einzelnen Erfordernisse in jedem speziellen Fall angepaßt. Für erwachsene Patienten kommt eine täglich Dosis von etwa 1 mg bis etwa 1000 mg, insbesondere etwa 10 mg bis etwa 500 mg, in Betracht. In Abhängigkeit der Dosis ist es günstig, die tägliche Dosis in mehreren Dosierungseinheiten zu verabreichen.
Die pharmazeutischen Präparate enthalten günstigerweise etwa 1 bis 500 mg, bevorzugt 5 bis 200 mg, einer Verbindung, wie oben beschrieben.
Behandlung von Fettleibigkeit
Die Verbindungen, hergestellt gemäß dieser Erfindung, zeigten selektive MC-4-Rezeptoragonistenaktivität in vitro. Es ist bekannt, daß Agonisten der MC4-R-Aktivität die Reduktion der Nahrungsaufnahme in einem Mausmodell menschlicher Fettleibigkeit hervorrufen. Deshalb agonisiert die Verabreichung dieser Verbindungen die MC4-R-Aktivität, die bei der Regulierung des Körpergewichts wichtig ist. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die Verbindungen dieser Erfindung enthalten, können bei einer Wirkungsstärke formuliert werden, die für die Verabreichung durch verschiedene Mittel an einen menschlichen oder tierischen Patienten, der unerwünscht erhöhtes Körpergewicht erfährt, wirksam ist, entweder allein oder als Teil eines nachteiligen medizinischen Zustandes oder Krankheit, wie Diabetes mellitus Typ II. Eine Vielzahl von Verabreichungstechniken kann verwendet werden. Durch schnittliche Mengen der aktiven Verbindung können variieren und sollten insbesondere auf den Empfehlungen und dem Rezept eines qualifizierten Arztes oder Tierarztes basieren.
Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung ebenso auf die Verwendung von Verbindungen, wie oben definiert, zur Herstellung von Medikamenten für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit der Melanocortin-4-Rezeptoraktivität verbunden sind. Die Verbindungen sind für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Fettleibigkeit besonders nützlich. Die Erfindung bezieht sich ebenso auf eine Verbindung, wie oben definiert, wenn durch ein Verfahren, wie oben beschrieben, hergestellt. Außerdem bezieht sich die Erfindung auf Verbindungen, wie oben definiert, zur Verwendung als therapeutisch aktive Substanzen, insbesondere als therapeutisch aktive Substanzen, für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit dem Melanocortin-4-Rezeptor verbunden sind, z. B. Fettleibigkeit.
Diese Erfindung wird in bezug auf die folgenden Beispiele besser verstanden, die die hierin beschriebene Erfindung darstellen, aber nicht einschränken. In den Strukturen von speziellen Verbindungen, die in dem Abschnitt der Beispiele auftreten, sind die Wasserstoffe im allgemeinen aus Bequemlichkeit weggelassen worden.
BEISPIELE BEISPIEL 1 Herstellung von Fmoc-1-Amino-4-phenylcyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-Apc) Schritt 1:
Zu einer Lösung aus 4-Phenylcyclohexanon (10,0 g, 57,5 mmol) in Ethanol (100 ml) und Wasser (33 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (33 g, 344 mmol, 6 Äquiv.) und Kaliumcyanid (5,6 g, 86,2 mmol, 1,5 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C für 24 h erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch. wurde zu Eiswasser zugegeben (400 ml) und für 30 min kräftig gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde saug filtriert, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch das Hydantoin A als ein weißer Feststoff (14,0 g, 100% Ausbeute) erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 8,63 (s, 1H), 7,23-7,36 (m, 4), 7,15 (m, 1), 2,50 (m, 1H), 2,10 (m, 1H), 1,85 (d, 1H) und 1,55-1,80 (m, 6H).
Schritt 2:
Das Hydantoin A (10,0 g) wurde in wässerigem NaOH (6 N, 350 ml) suspendiert und bei 130°C für 2 bis 3 Tage erhitzt. Nach Beendigung der Hydrolyse wurde das Reaktionsgemisch mit konz. HCl neutralisiert, bis es schwach sauer war (pH ~ 6). Die resultierende Aufschlämmung wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch 1-Amino-4-phenylcyclohexancarbonsäure (APC) als ein weißer Feststoff (25 g, > 100% Ausbeute, verunreinigt mit anorganischem Salz) erhalten wurde, der direkt für den nächsten Schritt verwendet wurde. Ein kleiner Teil des Rohproduktes wurde durch HPLC gereinigt. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,23-7,35 (m, 2), 7,10-7,19 (m, 3H), 2,45 (in, 1H), 1,92-2,18 (m, 3H), 1,56-1,78 (m, 4H) und 1,20 (m, 1H); LRMS (Elektrospray) m/e 220 (M + 1)⁺, Ber. für C₁₃H₁₇NO₂, 219.
Schritt 3:
Die rohe 1-Amino-4-phenylcyclohexancarbonsäure (APC) aus dem letzten Schritt (25 g) wurde in Dioxan (300 ml) und wässerigem 10%igem Na₂CO₃ (150 ml) suspendiert und über Nacht kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Entfernung von Dioxan konzentriert, mit 6 N HCl neutralisiert, bis es schwach sauer war (pH 5-6), und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, das dann durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc bis CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt wurde, wodurch reines Fmoc-cis-APC (18,2 g, 72% Gesamtausbeute für zwei Schritte) und Fmoc-trans-APC (2,1 g, 8%) erhalten wurden. Fmoc-cis-APC, ¹H-NMR (CD₃OD), 7,79 (d, 2H), 7,72 (d, 2H), 7,37 (t, 2), 7,24-7,32 (m, 4), 7,14-7,23 (m, 3), 4,37 (d, 2H), 4,24 (t, 1H), 2,55 (m, 1H), 2,28 (m, 2H), 1,84-1,96 (m, 2H) und 1,64-1,73 (m, 4H).
BEISPIEL 2 Herstellung von Fmoc-1-Amino-4-(4-methoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-4-MeOApc-OH) Schritt 1:
Eine Lösung aus 4-(4-Hydroxyphenyl)cyclohexanon (5,0 g, 26,3 mmol) in Aceton (100 ml) wurde mit K₂CO₃ (14,5 g, 105 mmol, 4 Äquiv.) und. Iodmethan (4,9 ml, 11,2 g, 78,6 mmol, 3 Äquiv.) behandelt. Die Reaktion wurde bei 65°C über Nacht erhitzt. Nachdem das Lösungsmittel entfernt war, wurde der Rest mit H₂O behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt und mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, wodurch das spektroskopisch reine 4-(4-Methoxyphenyl)cyclohexanon (5,34 g, 100%) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) 7,16 (dt, 2H), 6,87 (dt, 2H), 3,78 (s, 3H), 2,99 (tt, 1H), 2,47-2,53 (m, 4H), 2,20 (m, 2H) und 1,83-1,98 (m, 2H); MS (Elektrospray) m/e, 205 (M + 1)⁺, Ber. für C₁₃H₁₆O₂, 204.
Schritt 2:
Zu einer Lösung aus 4-(4-Methoxyphenyl)-cyclohexanon (3,86 g, 18,9 mmol) in Ethanol (50 ml) und Wasser (15 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (14,5 g, 151 mmol, 8 Äquiv.) und Kaliumcyanid (2,0 g, 30,7 mmol, 1,6 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C für 24 h erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde zu Eiswasser (300 ml) zugegeben und für 30 min kräftig gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde saugfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch das Hydanto in B als ein weißer Feststoff (4,75 g, 91% Ausbeute) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 273 (M – H), Ber. für C₁₅H₁₈N₂O₃, 274.
Schritt 3:
Zu einer Suspension aus dem Hydantoin B (18,7 g, 68,25 mmol) in trockenem THF (450 ml) wurden Di-tert-butyldicarbonat (37,2 g, 170,5 mmol, 2,5 Äquiv.), Triethylamin (10,5 ml, 7,59 g, 75,0 mmol, 1,1 Äquiv.) und DMAP (460 mg, 3,65 mmol) nacheinander zugegeben. Etwa 15 Minuten nach der Zugabe färbte sich die Reaktion zu einer klaren gelben Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch ein Feststoff erhalten wurde, der dann in EtOAc (800 ml) aufgenommen, mit 1 N HCl (3 × 50 ml), gesättigtem wässerigerem Na₂CO₃ (2 × 50 ml) und Salzlösung (2 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das rohe hellgelbe Produkt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 70/30) gereinigt, wodurch das reine Bis-Boc-hydantoin C als ein weißer Feststoff (27,6 g_; 87%) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,28 (dt, 2H), 6,88 (dt, 2H), 3,79 (s, 3H), 2,14-2,24 (m, 2H), 1,59 (s, 9H) und 1,38 (s, 9H); MS (Elektrospray) m/e 538 (M + MeCN + Na)⁺, Ber. für C₂₅H₃₄N₂O₇, 474.
Schritt 4:
Das Bis-Boc-hydantoin C (15,08 g, 31,78 mmol) wurde in DME (500 ml) gelöst, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Zu dieser Lösung wurde 1 N NaOH (290 ml, 290 mmol) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, wodurch ein leicht trübes Gemisch erhalten wurde. HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, und mit Et₂O extrahiert. Ohne Reinigung wurde die resultierende wässerige Schicht, enthaltend 1-Amino-4-(4-methoxyphenyl)cyclohexancarbonsäure (4-MeOAPC), mit 6 N HCl behandelt, um den pH auf 11 bis 12 einzustellen. Zu dieser Lösung (~ 300 ml) wunden DME (300 ml) und eine Lösung aus Fmoc-OSu (16,7 g, 49,42 mmol) in DME (200 ml) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, mit 3 N HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (CH₂Cl₂/MeOH, 98/2 → 90/10) gereinigt, wodurch das reine Produkt Fmoc-4-MeOAPC als ein weißer Feststoff (12,4 g, 83% Ausbeute aus dem Bis-Boc-hydantoin C) erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆), 7,88 (d, 2H), 7,76 (d, 2H), 7,40 (t, 2H), 7,30 (t, 2H), 7,11 (d, 2H), 6,85 (d, 2H), 3,71 (s, 3H); MS (Elektrospray) m/e 470 (M – H), Ber. für C₂₉H₂₉NO₅, 471.
BEISPIEL 3 Herstellung von Fmoc-1-Amino-4-(4-ethoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure Fmoc-4-EtOApc-OH) Schritt 1:
Eine Lösung aus 4-(4-Hydroxyphenyl)cyclohexanon (5,0 g, 26,3 mmol) in Aceton (100 ml) wurde mit K₂CO₃ (14,5 g, 105 mmol, 4 Äquiv.) und Iodethan (10,5 ml, 20,5 g, 131 mmol, 5 Äquiv.) behandelt. Die Reaktion wurde bei 65°C über Nacht erhitzt. Nachdem das Lösungsmittel entfernt war, wurde der Rest mit H₂O behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt und mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, wodurch das spektroskopisch reine 4-(4-Ethoxyphenyl)cyclohexanon (5,74 g, 100%) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) 7,15 (dt, 2H), 6,86 (dt, 2H), 4,02 (q, 2H), 2,99 (tt, 1H), 2,46-2,54 (m, 4H), 2,16-2,24 (m, 2H), 1,83-2,00 (m, 2H) und 1,41 (t, 3H); MS (Elektrospray) m/e, 219 (M + 1)⁺, Ber. für C₁₄H₁₈O₂, 218.
Schritt 2:
Zu einer Lösung aus dem 4-(4-Ethoxyphenyl)-cyclohexanon (4,15 g, 19,01 mmol) in Ethanol (50 ml) und Wasser (15 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (14,5 g, 151 mmol, 8 Äquiv.) und Kaliumcyanid (2,05 g, 31,42 mmol, 1,6 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C für 19 h erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde zu Eiswasser (300 ml) zugegeben und für 30 min kräftig gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde saugfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch das Hydantoin D als ein weißer Feststoff (5,17 g, 94% Ausbeute) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 287 (M – H), Ber. für C₁₆H₂₀N₂O₃, 288.
Schritt 3:
Zu einer Suspension des Hydantoins D (4,22 g, 14,65 mmol) in trockenem THF (100 ml) wurden Di-tert-butyldicarbonat (7,98 g, 36,60 mmol, 2,5 Äquiv.), Triethylamin (2,3 ml, 1,63 g, 16,11 mmol, 1,1 Äquiv.) und DMAP (89,4 mg, 0,73 mmol) nacheinander zugegeben. Etwa 15 Minuten nach der Zugabe färbte sich die Reaktion zu einer klaren gelben Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch ein Feststoff erhalten wurde, der dann in EtOAc (300 ml) aufgenommen, mit 1 N HCl (3 × 20 ml), gesättigtem wässerigem Na₂CO₃ (2 × 20 ml) und Salzlösung (2 × 20 ml) gewaschen; über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das rohe hellgelbe Produkt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 70/30) gereinigt, wodurch das reine Bis-Boc-hydantoin E als ein weißer Feststoff (7,01 g, 98%) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,27 (dt, 2H), 6,87 (dt, 2H), 4,02 (q, 2H), 1,59 (s, 9H), 1,43 (t, 3H) und 1,38 (s, 9H); MS (Elektrospray) m/e 999 (2M + Na)⁺, Ber. für C₂₆H₃₆N₂O₇, 488.
Schritt 4:
Das Bis-Boc-hydantoin E (6,58 g, 13,46 mmol) wurde in DME (200 ml) gelöst, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Zu dieser Lösung wurde 1 N NaOH (121 ml, 121 mmol) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, was ein leicht trübes Gemisch ergab. HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, und mit Et₂O extrahiert. Ohne Reinigung wurde die resultierende wässerige Schicht, enthaltend 1-Amino-4-(4-ethoxyphenyl)cyclohexancarbonsäure (4-EtOAPC), mit 6 N HCl behandelt, um den pH auf 11 bis 12 einzustellen. Zu dieser Lösung (~ 130 ml) wurden DME (100 ml) und eine Lösung aus Fmoc-OSu (6,83 g, 20,24 mmol) in DME (30 ml) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, mit 3 N HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (CH₂Cl₂/MeOH, 98/2 → 90/10) gereinigt, wodurch das reine Produkt Fmoc-4-EtOAPC als ein weißer Feststoff (5,56 g, 85% Ausbeute aus dem Bis-Boc-hydantoin E) erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆), 7,88 (d, 2H), 7,74 (d, 2H), 7,40 (td, 2H), 7,30 (td, 2H), 7,11 (d, 2H), 6,84 (d, 2H), 3,97 (q, 2H) und 1,29 (t, 3H); MS (Elektrospray) m/e 484 (M – H), Ber. für C₃₀H₃₁NO₅, 485.
BEISPIEL 4 Herstellung von Fmoc-1-Amino-4-(4-hydroxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure Fmoc-4-HOApc-OH) Schritt 1:
Zu einer Lösung aus 4-(4-Hydroxyphenyl)cyclohexanon. (2,00 g, 10,52 mmol.) in Ethanol (30 ml) und Wasser (10 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (6,17 g, 64,2 mmol, 6 Äquiv.) und Kaliumcyanid (1,07 g, 15,8 mmol, 1,5 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C über Nacht erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde zu Eiswasser (200 ml) zugegeben und für 30 min kräftig gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde saugfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch das Hydantoin F als ein weißer Feststoff (2,56 g, 94% Ausbeute) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 261 (M + H)⁺, Ber. für C₁₄H₁₆N₂O₃, 260.
Schritt 2:
Das Hydantoin F (2,10 g, 8,06 mmol) wurde in wässerigem NaOH (6 N, 100 ml) suspendiert und bei 130°C für 2 bis 3 Tage erhitzt. Nach Beendigung der Hydrolyse wurde das Reaktionsgemisch mit konz. HCl neutralisiert, bis es schwach sauer war (pH ~ 6). Die resultierende Aufschlämmung wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch 1-Amino-4-(4-hydroxyphenyl)cyclohexancarbonsäure (4-HOAPC) als ein weißer Feststoff (3,1 g, > 100% Ausbeute, verunreinigt mit anorganischem Salz) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 236 (M + H)⁺, Ber. für C₁₃H₁₇NO₃, 235.
Schritt 3:
Die rohe 1-Amino-4-(4-hydroxyphenyl)cyclohexancarbonsäure (4-HOAPC) aus dem letzten Schritt (3,1 g) wurde in Dioxan (100 ml) und wässerigem 10%igem Na₂CO₃ (50 ml) suspendiert und über Nacht kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch Dioxan entfernt wurde, mit 6 N HCl neutralisiert, bis es schwach sauer war (pH 5 bis 6), und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc bis CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt wurde, wodurch reines Fmoc-4-HOAPC (2,76 g, 75% Gesamtausbeute für zwei Schritte) erhalten wurde. ¹H-NMR (CD₃OD), 7,78 (d, 2H), 7,72 (d, 2H), 7,38 (t, 2H), 7,30 (td, 2H), 7,04 (d, 2H), 6,72 (dt, 2H), 4,38 (d, 2H), 4,25 (t, 1H), 2,46 (m, 1H), 2,24-2,34 (m, 2H) und 1,81-1,92 (m, 6H); MS (Elektrospray) m/e 456 (M – H), Ber. für C₂₈H₂₇NO₅, 457.
BEISPIEL 5 Herstellung von Fmoc-1-Amino-4-(4-isopropoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-4-iPrOApc-OH) Schritt 1:
Eine Lösung aus 4-(4-Hydroxyphenyl)cyclohexanon (6,0 g, 31,6 mmol) in DMF (90 ml) wurde mit K₂CO₃ (21 g, 158 mmol, 5 Äquiv.) und 2-Iodpropan (15 ml, 26,8 g, 158 mmol, 5 Äquiv.) behandelt. Die Reaktion wurde bei 100°C über Nacht erhitzt. Nachdem das Lösungsmittel entfernt war, wurde der Rest mit H₂O behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt und mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert, wodurch das spektroskopisch reine 4-(4-Isopropoxyphenyl)cyclohexanon (7,02 g, 95%) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,14 (dt, 2H), 6,84 (dt, 2H), 4,3 (Septett, 1H), 2,97 (tt, 1H), 2,46-2,52 (m, 4H), 2,16-2,24 (m, 2H), 1,83-1,98 (m, 2H) und 1,33 (d, 6H).
Schritt 2:
Zu einer Lösung des 4-(4-Isopropoxyphenyl)cyclohexanons (5,1 g, 21,98 mmol) in Ethanol (90 ml) und Wasser (30 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (12,6 g, 131 mmol, 6 Äquiv.) und Kaliumcyanid (2,14 g, 32,9 mmol, 1,5 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C für 24 h erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde zu Eiswasser (400 ml) zugegeben und für 30 min kräftig gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde saugfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch Hydantoin G als ein weißer Feststoff (6,60 g, 99% Ausbeute) erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 10,60 (s, 1H), 8,65 (s, 1H), 7,18 (d, 2H), 6,80 (d, 2H), 4,52 (Septett, 1H), 2,43 (m, 1H), 1,85-2,15 (m, 2H), 1,56-1,80 (m, 6H) und 1,22 (d, 6H); MS (Elektrospray) m/e 301 (M – H), Ber. für C₁₇H₂₂N₂O₃, 302.
Schritt 3:
Zu einer Suspension des Hydantoins G (5,8 g, 19,20 mmol) in trockenem THF (180 ml) wurden Di-tert-butyldicarbonat (10,46 g, 48,0 mmol, 2,5 Äquiv.), Triethylamin (2,9 ml, 2,13 g, 21,12 mmol, 1,1 Äquiv.) und DMAP (140 mg, 1,15 mmol) nacheinander zugegeben. Etwa 15 Minuten nach der Zugabe färbte sich die Reaktion zu einer klaren gelben Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch ein Feststoff erhalten wurde, der dann in EtOAc (600 ml) aufgenommen, mit 1 N HCl (3 × 40 ml), gesättigtem wässerigem Na₂CO₃ (2 × 40 ml) und Salzlösung (2 × 40 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das rohe hellgelbe Produkt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 80/20) gereinigt, wodurch das reine Bis-Boc-hydantoin H als ein weißer Feststoff (9,4 g, 98%) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,27 (dt, 2H), 6,87 (dt, 2H), 4,02 (q, 2H), 2,98 (t, 1H), 2,26-2,56 (m, 4H), 2,14-2,24 (m, 2H), 1,76-1,86 (m, 2H), 1,59 (s, 9H), 1,43 (t, 3H) und 1,38 (s, 9H); MS (Elektrospray) m/e 999 (2M + Na)⁺, Ber. für C₂₆H₃₆N₂O₇, 488.
Schritt 4:
Das Bis-Boc-hydantoin H (4,34 g, 8,64 mmol) wurde in DME (100 ml) gelöst, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Zu dieser Lösung wurde 1 N NaOH (78 ml, 78 mmol) zugege ben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, was ein ziemlich klares Gemisch ergab. HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, und mit Et₂O extrahiert. Ohne Reinigung wurde die resultierende wässerige Schicht, enthaltend 1-Amino-4-(4-isopropoxyphenyl)cyclohexancarbonsäure (4-iPrOAPC), mit 6 N HCl behandelt, um den pH auf 11 bis 12 einzustellen. Zu dieser Lösung (~ 90 ml) wurden DME (120 ml) und eine Lösung aus Fmoc-OSu (3,49 g, 10,34 mmol, 1,2 Äquiv.) in DME (20 ml) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert; wodurch DME entfernt wurde, mit 3 N HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc → CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt, wodurch das reine Produkt Fmoc-4-iPrOAPC als ein weißer Feststoff (3,23 g, 75% Ausbeute aus Bis-Boc-hydantoin H) erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆), 7,76 (d, 2H), 7,60 (d, 2H), 7,39 (t, 2H), 7,31 (t, 2H), 7,08 (d, 2H), 6,84 (d, 2H), 4,24 (m, 1H) und 1,34 (d, 6H); MS (Elektrospray) m/e 498 (M – H), Ber. für C₃₁H₃₃NO₅, 499.
BEISPIEL 6 Herstellung von Fmoc-1-Amino-4-(4-methylphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-4-MeApc-OH) Schritt 1:
Zu einer Lösung aus 4-Iodtoluol (10,9 g, 50,0 mmol) in trockenem THF (180 ml) wurde bei –78°C eine Lösung aus n-BuLi (1,6 M, 31,0 ml, 50 mmol) in Hexan über 20 min zugegeben. Die Reaktion wurde für weitere 20 min gerührt, bevor eine Lösung aus 1,4-Cyclohexandion-mono-ethylenketal (6,0 g, 38,46 mmol) in trockenem THF (100 ml) tropfenweise zugegeben wurde. Nach dem Rühren für 2 h bei –78°C wurde die Reaktion mit wässerigem NH₄Cl gequencht und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlö sung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, im Vakuum konzentriert, wodurch das spektroskopisch reine Produkt I als ein weißer Feststoff (9,34 g, 98% Ausbeute) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,41 (m, 2H), 7,16 (d, 2H), 3,98 (m, 4H), 2,34 (s, 3H); MS (EI) m/e 248 (M⁺), Ber. für C₁₅H₂₀O₃, 248.
Schritt 2:
Zu einer Lösung aus dem Alkohol I (9,10 g, 36,65 mmol) in trockenem Benzol (200 ml) in einem Kolben, ausgestattet mit einem Dean-Stark-Sammelgefäß, wurde p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (650 mg) zugegeben und die Reaktion wurde bei 100°C für 3 h erhitzt. Die Reaktion wurde auf RT abgekühlt, mit EtOAc (500 ml) verdünnt und mit wässerigem Na₂CO₃ (50 ml), Salzlösung (3 × 50 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch das spektroskopisch reine Produkt J (8,36 g, 100% Ausbeute) erhalten wurde, das ohne Reinigung für den nächsten Schritt verwendet wurde. MS (EI) m/e 230 (M⁺), 190 (M-OCH₂CH₂O), Ber. für C₁₅H₁₈O₂, 230.
Schritt 3:
Zu einer Lösung aus dem Olefin J (7,49 g) in EtOAc (180 ml) wurde Pd/C (5 Gew.-% auf Kohlenstoff, 800 mg) zugegeben. und die Reaktion verlief unter 40 psi Wasserstoff für 3 h bei Raumtemperatur. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat wurde konzentriert, wodurch das spektroskopisch reine Produkt K als ein farbloses Öl (7,40 g, 100% Ausbeute) erhalten wurde. MS (EI) m/e 232 (M⁺), 188 (M-OCH₂CH₂), Ber. für C₁₅H₂₀O₂, 232.
Schritt 4:
Eine Lösung aus dem Ketal K (6,90 g) in Aceton (140 ml) wurde mit 4 N HCl (60 ml) behandelt und bei 65°C für 4 h erhitzt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rest wurde mit EtOAc verdünnt und mit 4 N HCl neutralisiert. Die wässerige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, getrocknet und konzentriert. Das resultierende rohe 4-(4-Methylphenyl)cyclohexanon wurde ohne Reinigung für den nächsten Schritt verwendet (5,57 g, quantitative Ausbeute). MS (EI) m/e 188 (M⁺), Ber. für C₁₃H₁₆O, 188.
Schritt 5:
Zu einer Lösung aus 4-(4-Methylphenyl)cyclohexanon (5,32 g, 28,3 mmol) in Ethanol (90 ml) und Wasser (30 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (16,3 g, 169,8 mmol, 6 Äquiv.) und Kaliumcyanid (3,68 g, 56,5 mmol, 2 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C über Nacht erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde zu Eiswasser (400 ml) zugegeben und für 30 min kräftig gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde saugfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch das Hydantoin L als ein weißer Feststoff (6,3 g, 86% Ausbeute) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 517 (2M + H), Ber. für C₁₅H₁₈ClN₂O₂, 258.
Schritt 6:
Zu einer Suspension aus dem Hydantoin L (5,82 g, 22,55 mmol) in trockenem THF (250 ml) wurden Di-tert-butyldicarbonat (12,3 g, 56,4 mmol, 2,5 Äquiv.), Triethylamin (3,5 ml, 2,5 g, 24,7 mmol, 1,1 Äquiv.) und DMAP (275 mg, 2,25 mmol) nacheinander zugegeben. Die Reaktion färbte sich zu einer klaren gelben Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch ein Feststoff erhalten wurde, der dann in EtOAc (500 ml) aufgenommen, mit 1 N HCl (3 × 50 ml), gesättigtem wässerigem Na₂CO₃ (2 × 50 ml) und Salzlösung (2 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das rohe hellgelbe Produkt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 70/30) gereinigt, wodurch das reine Bis-Boc-hydantoin M als ein weißer Feststoff (10,03 g, 100% Ausbeute) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,26 (d, 2H), 6,87 (d, 2H), 3,00 (m, 1H), 2,32 (s, 3H), 1,59 (s, 9H) und 1,37 (s, 9H).
Schritt 7:
Das Bis-Boc-hydantoin M (6,40 g, 13,97 mmol) wurde in DME (200 ml) gelöst, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Zu dieser Lösung wurde 1 N NaOH (120 ml, 120 mmol) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, was ein leicht trübes Gemisch ergab. HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, und mit Rt₂O extrahiert. Ohne Reinigung wurde die resultierende wässerige Schicht, enthaltend 1-Amino-4-(4-methylphenyl)cyclohexancarbonsäure (4-MeAPC), mit 6 N HCl behandelt, um den pH auf 11 bis 12 einzustellen. Zu dieser Lösung (~ 1.40 ml) wurden DME (240 ml) und eine Lösung aus Fmoc-OSu (5,10 g, 15,13 mmol, 1,1 Äquiv.) in DME (40 ml) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, mit 3 N HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (CH₂Cl₂/MeOH, 98/2 → 90/10) gereinigt, wodurch das reine Produkt Fmoc-4-MeAPC als ein weißer Feststoff (4,35 g, 69% Ausbeute aus Bis-Boc-hydantoin M) erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,88 (d, 2H), 7,75 (d, 2H), 7,24-7,43 (m, 4H), 7,02-7,14 (m, 4H), 4,25 (m, 3H), 2,24 (s, 3H).
BEISPIEL 7 Herstellung von Fmoc-1-Amino-4-(4-chlorphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-4-ClApc-OH) Schritt 1:
Eine Lösung aus 4-Chlorphenylbromid (7,5 g, 39,2 mmol) in trockenem THF (180 ml) wurde auf –78°C abgekühlt und tropfenweise mit einer Lösung aus n-BuLi (1,6 M, 25 ml, 40 mmol) in Hexan über 20 min behandelt. Die Reaktion wurde für weitere 30 min gerührt, bevor eine Lösung aus 1,4-Cyclohexandion-mono-ethylenketal (6,0 g, 38,46 mmol) in trockenem THF (100 ml) tropfenweise zugegeben wurde. Nach dem Rühren für 1 h bei –78°C wurde die Reaktion mit wässerigem NH₄Cl gequencht und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, im Vakuum konzentriert, wodurch das spektroskopisch reine Produkt N als ein weißer Feststoff (9,40 g, 91% Ausbeute) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,45 (m, 2H), 7,31 (m, 2H), 3,99 (m, 4H), 2,02-2,20 (m, 4H), 1,75-1,82 (m, 2H), 1,66-1,73 (m, 2H), 1,54 (s, 1H); MS (EI) m/e 268 (M⁺), 251 (M– OH), 250 (M – H₂O), Ber. für C₁₄H₁₇ClO₃, 268.
Schritt 2:
Zu einer Lösung aus dem Alkohol N (6,78 g, 25,30 mmol) in trockenem Benzol (120 ml) in einem Kolben, ausgestattet mit einem Dean-Stark-Sammelgefäß, wurde p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (960 mg) zugegeben und die Reaktion wurde unter Rückfluß für 3 h erhitzt. Die Reaktion wurde auf RT abgekühlt, mit EtOAc (500 ml) verdünnt und mit wässerigem Na₂CO₃ (50 ml), Salzlösung (3 × 50 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und unter redu ziertem Druck konzentriert, wodurch das spektroskopisch reine Produkt O (6,30 g, 100% Ausbeute) erhalten wurde, das ohne Reingung für den nächsten Schritt verwendet wurde. MS (EI) m/e 250 (M⁺), 190 (M-OCH₂CH₂O), Ber. für C₁₄H₁₅ClO₂, 250.
Schritt 3:
Zu einer Lösung aus dem Olefin O (6,11 g) in EtOAc (120 ml) wurde Pd/C (5 Gew.-% auf Kohlenstoff, 600 mg) zugegeben und die Reaktion verlief unter 5 psi Wasserstoff für 3 h bei Raumtemperatur. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat wurde konzentriert, wodurch das spektroskopisch reine Produkt P als ein farbloses Öl (6,10 g, 100% Ausbeute) erhalten wurde. MS (EI) m/e 252 (M⁺), Ber. für C₁₄H₁₇ClO₂, 252.
Schritt 4:
Eine Lösung aus dem Ketal P (5,81 g, 23,06 mmol) in Aceton (200 ml) wurde mit p-Toluol-sulfonsäuremonohydrat (876 mg) behandelt und bei 60°C über Nacht erhitzt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rest wurde in EtOAc aufgenommen, mit wässeriger Na₂CO₃-Lösung, Salzlösung gewaschen, getrocknet und konzentriert, wodurch das Rohprodukt als ein gelbes Öl (5,38 g, > 100% Ausbeute) erhalten wurde. Die Reinigung durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 80/20 → 60/40) stellte 4-(4-Chlorphenyl)cyclohexanon als ein hellgelbes Öl (4,54 g, 95% Ausbeute) bereit. MS (EI) m/e 208 (M⁺), Ber. für C₁₂H₁₃ClO₂, 208.
Schritt 5:
Zu einer Lösung aus 4-(4-Chlorphenyl)cyclohexanon (4,26 g, 20,48 mmol) in Ethanol (90 ml) und Wasser (30 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (13,8 g, 144 mmol, 7 Äquiv.) und Kaliumcyanid (3,56 g, 54,77 mmol, 2,5 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C über Nacht erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde zu Eiswasser (400 ml) zugegeben und für 30 min kräftig gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde saugfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch das Hydantoin Q als ein weißer Feststoff (5,58 g, 98% Ausbeute) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 277 (M – H), Ber. für C₁₄H₁₅ClN₂O₂, 278.
Schritt 6:
Zu einer Suspension aus dem Hydantoin Q (5,15 g, 18,5 mmol) in trockenem THF (250 ml) wurden Di-tert-butyldicarbonat (10,1 g, 46,3 mmol, 2,5 Äquiv.), Triethylamin (2,8 ml, 2,07 g, 20,45 mmol, 1,1 Äquiv.) und DMAP (226 mg, 1,85 mmol) nacheinander zugegeben. Die Reaktion färbte sich zu einer klaren gelben Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentiert, wodurch ein Feststoff erhalten wurde, der dann in EtOAc (500 ml) aufgenommen, mit 1 N HCl (3 × 50 ml), gesättigtem wässerigem Na₂CO₃ (2 × 50 ml) und Salzlösung (2 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das rohe hellgelbe Produkt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 70/30) gereinigt, wodurch das reine Bis-Boc-hydantoin R als ein weißer Feststoff (8,05 g, 91% Ausbeute) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 542 (M + Ma + MeCN), Ber. für C₂₄H₃₁ClN₂O₆, 478.
Schritt 7:
Das Bis-Boc-hydantoin R (6,41 g, 13,97 mmol) wurde in DME (200 ml) gelöst, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Zu dieser Lösung wurde 1 N NaOH (120 ml, 120 mmol) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, was ein leicht trübes Gemisch ergab. HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, und mit Et₂O extrahiert. Ohne Reinigung wurde die resultierende wässerige Schicht, enthaltend 1-Amino-4-(4-chlorphenyl)cyclohexancarbonsäure (4-ClAPC), mit 6 N HCl behandelt, um den pH auf 11 bis 12 einzustellen. Zu dieser Lösung (~ 180 ml) wurden DME (240 ml) und eine Lösung aus Fmoc-OSu (5,31 g, 15,74 mmol, 1,1 Äquiv.) in DME (30 ml) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, mit 3 N HCl angesäuert, mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (CH₂Cl₂/MeOH, 98/2 → 90/10) gereinigt, wodurch das reine Produkt Fmoc-4-ClAPC als ein weißer Feststoff (5,04 g, 76% Ausbeute aus dem Bis-Boc-hydantoin) erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆), 7,88 (d, 2H), 7,74 (d, 2H), 7,19-7,42 (m, 8H), 4,20-4,31 (m, 3H); MS (Elektrospray) m/e 474 (M – H), Ber. für C₂₈H₂₆ClNO₄, 475.
BEISPIEL 8 Herstellung von Fmoc-1-Amino-4-(3-methoxyphenyl)cyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-3-MeOApc-OH) Schritt 1:
Zu einer Lösung aus 3-Iodanisol (11,7 g, 50,0 mmol, 1,3 Äquiv.) in trockenem THF (180 ml) bei –78°C wurde eine Lösung aus n-BuLi (1,6 M, 31,0 ml, 50 mmol, 1,3 Äquiv.) in Hexan über 25 min zugegeben. Die Reaktion wurde für weitere 30 min gerührt, bevor eine Lösung aus 1,4 Cyclohexandion-mono-ethylenketal (6,0 g, 38,46 mmol) in trockenem THF (100 ml) tropfenweise zugegeben wurde. Nach dem Rühren für 2 h bei –78°C wurde die Reaktion mit wässerigem NH₄Cl gequencht und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, im Vakuum konzentriert, wodurch das spektroskopisch reine Produkt S als ein weißer Feststoff (9,34 g, 98% Ausbeute) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,26 (dd, 1H), 7,06-7,1 l (m, 2H), 6,79 (dd, 1H), 3,98 (m, 4H), 3,81 (s, 3H).
Schritt 2:
Zu einer gerührten Lösung aus dem Alkohol S (5,6 g, 21,21 mmol) in trockenem CH₂Cl₂ (200 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre bei Salz-Eisbad-Temperatur wurden nacheinander Triethylsilan (10,2 ml, 7,4 g, 63,63 mmol, 3 Äquiv.) und Bortrifluoridetherat (21,5 ml, 24,1 g, 169,7 mmnol, 8 Äquiv.) zugegeben. Das Reaktionsgemisch konnte sich auf Raumtemperatur erwärmen und wurde für 3 h gerührt, bevor es mit 10%iger wässeriger K₂CO₃-Lösung und H₂O gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und im Vakuum konzentriert wurde, wodurch die Desoxidationsverbindung als ein Öl (4,91 g) erhalten wurde, das für die direkte Verwendung ausreichend rein war. Dieses rohe Zwischenprodukt wurde in Aceton (130 ml) gelöst und mit 4 N HCl (60 ml) behandelt und bei 65°C für 4 h erhitzt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt und der Rest wurde mit EtOAc verdünnt und mit 4 N NaOH-Lösung neutralisiert. Die wässerige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, getrocknet und konzentriert. Der resultierende Rest wurde durch Flashchromatographie auf Kieselgel (80/20 → 60/40) gereinigt, wodurch 4-(3-Methoxyphenyl)cyclohexanon (3,67 g, 85% Gesamtausbeute) als ein gelbes Öl erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,25 (dt, 1H), 6,75-6,86 (m, 3H), 3,81 (s, 3H), 3,00 (tt, 1H); MS (EI) m/e 204 (M+), Ber. für C₁₃H₁₆O₂, 204.
Schritt 3:
Zu einer Lösung aus 4-(3-Methoxyphenyl)cyclohexanon (3,10 g, 15,20 mmol) in Ethanol (60 ml) und Wasser (20 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (8,75 g, 91,20 mmol, 6 Äquiv.) und Kaliumcyanid (1,98 g, 30,40 mmol, 2 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C über Nacht erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde zu Eiswasser (300 ml) zugegeben und für 30 min kräftig gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde saugfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch das Hydantoin T als ein weißer Feststoff (4,08 g, 98% Ausbeute) erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,11 (d, 1H), 6,70-6,94 (m, 3H), 3,72 (s, 3H); MS (Elektrospray) m/e 316 (M + MeCN + H), Ber. für C₁₅H₁₈N₂O₃, 274.
Schritt 4:
Zu einer Suspension aus dem Hydantoin T (5,29 g, 19,30 mmol) in trockenem THF (250 ml) wurden Di-tert-butyldicarbonat (10,5 g, 48,16 mmol, 2,5 Äquiv.), Triethylamin (3,0 ml, 2,17 g, 21,52 mmol, 1,1 Äquiv.) und DMAP (235 mg, 1,92 mmol) nacheinander zugegeben. Die Reaktion färbte sich zu einer klaren gelben Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch ein Feststoff erhalten wurde, der dann in EtOAc (500 ml) aufgenommen, mit 1 N HCl (3 × 50 ml), gesättigtem wässerigem Na₂CO₃ (2 × 50 ml) und Salzlösung (2 × 50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das rohe hellgelbe Produkt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 80/20 → 60/40) gereinigt, wodurch das reine Bis-Boc-hydantoin U als ein weißer Feststoff (8,70 g, 95% Ausbeute) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 538 (M + MeCN + Na), Ber. für C₂₅H₃₄N₂O₇, 474.
Schritt 5:
Das Bis-Boc-hydantoin U (2,30 g, 4,84 mmol) wurde in DME (80 ml) gelöst, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Zu dieser Lösung wurde 1 N NaOH (44 ml, 44 mmol) zugege ben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, was ein leicht trübes Gemisch ergab. HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, und mit Et₂O extrahiert. Ohne Reinigung wurde die resultierende wässerige Schicht, enthaltend 1-Amino-4-(3-methoxyphenyl)cyclohexancarbonsäure (3-MeOAPC), mit 6 N HCl behandelt, um den pH auf 11 bis 12 einzustellen. Zu dieser Lösung (→ 40 ml) wurden Dioxan (80 ml) und Fmoc-Cl (1,73 g, 6,76 mmol, 1,4 Äquiv.) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, mit 3 N HCl neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie auf Kieselgel (CH₂Cl₂/MeOH, 98/2 → 90/10) gereinigt, wodurch Fmoc-3-MeOAPC als ein weißer Feststoff (1,98 g, 87% Ausbeute aus Bis-Boc-hydantoin U) erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆), 7,88 (d, 2H), 7,75 (d, 2H), 7,40 (td, 2H), 7,30 (td, 2H), 7,21 (m, 1H), 6,71-6,80 (m, 3H), 3,72 (s, 3H); MS (Elektrospray) m/e 494 (M + Na), Ber. für C₂₉H₂₉NO₅, 471.
BEISPIEL 9 Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-Brom-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-Br-AtcOH) Schritt 1:
Ein Gemisch aus 3-(2-Bromphenyl)propionsäure (hergestellt in 2 Schritten aus 2-Brombenzylbromid, 2,0 g, 8,73 mmol), Oxalylchlorid (1,14 ml, 13,1 mmol) und Methylenchlorid (20 ml) wurde in einem Eisbad abgekühlt und N,N-Dimethylformamid (34 μl, 0,44 mmol) wurde tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt. Die Konzentration im Vakuum ergab 3-(2-Bromphenyl)propanoylchlorid, das in Methylenchlorid aufgenommen wurde und in dem nächsten Schritt als ein Rohprodukt verwendet wurde.
Schritt 2:
Eine Lösung aus dem obigen Säurechlorid (roh, 8,73 mmol.) in Methylenchlorid wurde langsam zu einer Lösung aus Diazomethan (erzeugt aus 5,70 g 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin) in Ether (40 ml), abgekühlt in einem Eisbad, zugegeben. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert und durch Säulenchromatographie (10 → 20% Ethylacetat/Hexane) gereinigt, wodurch 1-Diazo-4-(2-bromphenyl)butan-2-on (1,88 g, 85% über 2 Schritte) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,50 (1H, d, Phenyl), 7,24 (2H, m, Phenyl), 7,06 (1H, m, Phenyl), 5,21 (1H, breites s, Diazo), 3,05 (2H, t, Benzyl), 2,62 (2H, m).
Schritt 3:
Zu einem Gemisch aus Rhodium(II)acetatdimer (15 mg, 0,068 mmol) in Methylenchlorid (120 ml) wurde unter Rückfluß langsam eine Lösung aus 1-Diazo-4-(2-bromphenyl)butan-2-on (1,74 g, 6,85 mmol) in Methylenchlorid (30 ml) zugegeben. Nach der vollständigen Zugabe wurde das Gemisch für weitere zwanzig Minuten unter Rückfluß erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, Trifluoressigsäure (1,5 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gequencht. Die Schichten wurden abgetrennt und die Methylenchloridschicht wurde noch einmal mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die vereinigten wässerigen Schichten wurden mit Methylenchlorid rückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wodurch ein braunes Öl erhalten wurde. Die Reinigung durch Säulenchromatographie (10 → 15% Ethylacetat/Hexane) ergab 5-Brom-β-tetralon (1,18 g, 77% Ausbeute) als ein farbloses Öl. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,46 (1H, t; Phenyl), 7,05-7,09 (2H, m, Phenyl), 3,58 (2H, s, Benzyl), 3,22 (2H, t, Benzyl), 2,54 (2H, t).
Schritt 4:
Ein Gemisch aus 5-Brom-β-tetralon (1,18 g, 5,24 mmol), Kaliumcyanid (512 mg, 7,86 mmol), Ammoniumcarbonat (3,0 g, 31,22 mmol), Ethanol (25 ml) und Wasser (5 ml) in einem verschlossenen dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 80°C für 4 Tage erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die weiße Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur für ein paar Stunden gerührt. Die Filtration, gefolgt von Lufttrocknung, ergab Hydantoin V (1,31 g, 85%). ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,71 (1H, breit, NH), 8,28 (1H, breites s, NH), 7,0-7,5 (3H, m, Phenyl). LRMS (Elektrospray): C₁₂H₁₁BrN₂O₂, ber. 294; beobachtet: 293 (M – H), 295 (M – H).
Schritt 5:
Ein Gemisch aus Hydantoin V (1,287 g, 4,36 mmol), Ba(OH)₂·H₂O (4,20 g, 22,2 mmol) in Wasser (25 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Olbad von 125°C für 4 Tage erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, auf pH ~ 3 mittels 4 N Schwefelsäure angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem kochenden Wasserbad für eine Stunde gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert und die Niederschläge mit Wasser gespült. Das vereinigte Filtrat und die Waschungen wurden im Vakuum auf ~ 20 ml konzentriert. Die Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab einen weißen Niederschlag, der filtriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über Nacht getrocknet wurde, wodurch racemische 5-Brom-2-aminotetralin-2-carbonsäure (893 mg, 76% Ausbeute) erhalten wurde. LRMS (Elektrospray): C₁₁H₁₂BrNO₂, ber. 269; beobachtet: 270 (M + H), 272 (M + H), 268 (M – H), 270 (M – H).
Schritt 6:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Brom-2-aminotetralin-2-carbonsäure (882 mg, 3,27 mmol), Triethylamin (0,60 ml, 4,30 mmol), 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 1,32 g, 3,91 mmol) in Acetonitril (30 ml) und Wasser (30 ml) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. DC-Analyse der Reaktion am nächsten Tag zeigte die Anwesenheit des Ausgangsmaterials Aminosäure. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (0,25 g), Triethylamin (0,6 ml) und Acetonitril (5 ml) wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für einen weiteren Tag gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste des Acetonitrils entfernt wurde, auf pH → 3 mit 10%iger wässeriger Zitronensäurelösung angesäuert, und die weiße Emulsion zweimal mit Methylenchlorid exrtrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser, Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (eluiert mit 2 → 5 → 10% Methanol/Methylenchlorid) gereinigt wurde, wodurch die racemische Fmoc-5-Brom-2-aminotetralin-2-carbonsäure (1,09 g, 68% Ausbeute) als ein weißer Feststoff erhalten wurde. HRMS (FAB): C₂₆H₂₂BrNNaO₄ (M + Na) ber. 514,0630; beobachtet: 514,0643.
BEISPIEL 10 Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-Chlor-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-ClAtc-OH) Schritt 1:
Ein Gemisch aus 3-(2-Chlorphenyl)propionsäure (5,0 g, 27,1 mmol), Thionylchlorid (10,9 ml, 149 mmol) und Toluol (75 ml) wurde unter Rückfluß für zwei Stunden erhitzt. Die Konzentration im Vakuum ergab 3-(2-Chlorphenyl)propanoylchlorid, das in Methylenchlorid aufgenommen wurde und in dem nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
Schritt 2:
Eine Lösung aus dem obigen Säurechlorid (roh, 27,1 mmol) in Methylenchlorid wurde langsam zu einer Lösung aus Diazomethan (erzeugt aus 17,8 g 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin) in Ether (120 ml), abgekühlt in einem Eisbad, zugegeben. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert, wodurch 1-Diazo-4-(2-chlorphenyl)butan-2-on (5,87 g, > 100% über 2 Schritte) als ein hellgelbes Öl erhalten wurde. Die Verbindung wurde in dem nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,05-7,32 (4H, m, Phenyl), 5,13 (1H, breites s, Diazo), 3,00 (2H, t, Benzyl), 2,57 (2H, m).
Schritt 3:
Zu einem Gemisch aus Rhodium(II)acetatdimer (60 mg, 0,27 mmol) in Methylenchlorid (400 ml) wurde unter Rückfluß langsam eine Lösung aus rohem 1-Diazo-4-(2-bromphenyl)butan-2-on (5,87 g, 27,1 mmol, theoretisch) in Methylenchlorid (50 ml) zugegeben. Nach der vollständigen Zugabe wurde das Gemisch für weitere zwanzig Minuten unter Rückfuß erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, Trifluoressigsäure (6,0 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für zwei Stunden gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gequencht. Die Schichten wurden abgetrennt und die Methylenchloridschicht wurde noch einmal mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die vereinigten wässerigen Schichten wurden mit Methylenchlorid rückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wodurch ein braunes Öl erhalten wurde. Die Reinigung durch Säulenchromatographie (10 → 15% Ethylacetat/Hexane) ergab 5-Chlor-β-tetralon (3,32 g, 68% Ausbeute für Schritte 1 bis 3) als ein hellbraunes Öl. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,30 (1H, m, Phenyl), 7,15 (1H, t, Phenyl), 7,05 (1H, d, Phenyl), 3,60 (2H, s, Benzyl), 3,22 (2H, t, Benzyl), 2,56 (2H, t).
Schritt 4:
Ein Gemisch aus 5-Chlor-β-tetralon (880 mg, 4,87 mmol), Kaliumcyanid (500 mg, 7,67 mmol), Ammoniumcarbonat (2,85 g, 29,7 mmol), Ethanol (24 ml) und Wasser (6 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 80°C für 66 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur für ein paar Stunden gerührt. Die Filtration, gefolgt von Lufttrocknung, ergab Hydantoin W (0,92 g, 75%) als einen. hellen beigefarbenen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,70 (1H, breit; NH), 8,25 (1H, breites s, NH), 7,0-7,3 (3H, m, Phenyl). LRMS (Elektrospray): C₁₂H₁₁ClN₂O₂, ber. 250; beobachtet: 249 (M – H), 251 (M – H).
Schritt 5:
Ein Gemisch aus Hydantoin W (880 mg, 3,51 mmol), Ba(OH)₂·H₂O (3,40 g, 18,0 mmol) in Wasser (50 ml, zum Verdünnen) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 125°C für 2 Tage erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf pH ~ 3 angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem kochenden Wasserbad für zwei Stunden gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert und die Niederschläge mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschungen wurden im Vakuum auf ~ 50 ml konzentriert. Die Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab einen weißen Niederschlag, der filtriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über Nacht getrocknet wurde, wodurch die racemische 5-Chlor-2-aminotetralin-2-carbonsäure (788 mg, 99% Ausbeute) erhalten wurde. LRMS (Elektrospray): C₁₁H₁₂ClNO₂, ber. 225; beobachtet: 226 (M + H), 228 (M + H), 224 (M – H), 226 (M – H).
Schritt 6:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Chlor-2-aminotetralin-2-carbonsäure (402 mg, 1,78 mmol), Triethylamin (0,38 ml, 2,73 mmol), 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 904 mg, 2,68 mmol) in Acetonitril (20 ml) und Wasser (20 ml) wurde bei Raumtemperatur für zwei Tage gerührt. DC-Analyse der Reaktion zeigte nach zwei Tagen die Gegenwart des Ausgangsmaterials Aminosäure. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (0,12 g) und Triethylamin (0,1 ml) wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für einen weiteren Tag gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste des Acetonitrils entfernt wurde, mit 10%iger wässeriger Zitronensäurelösung auf pH ~ 3 angesäuert und die weiße Emulsion dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser, Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (eluiert mit 3 → 6 → 8% Methanol/Methylenchlorid) gereinigt wurde, wodurch die racemische Fmoc-5-Chlor-2-aminotetralin-2-carbonsäure (540 mg, 68% Ausbeute) als ein weißer Feststoff erhalten wurde. HRMS (EI) C₂₆H₂₂ClNO₄ (M) her. 447,1237; beobachtet: 447,1234.
BEISPIEL 11 Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-Methoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)5-MeOAtc-OH) Schritt 1:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Methoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (hergestellt gemäß Obrecht, D. et. al. Helv. Chim Acta. 1992, 75, 1666) (802 mg, 3,62 mmol), Triethylamin (0,62 ml, 4,45 mmol), 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 1,47 g, 4,36 mmol) in Acetonitril (25 ml) und Wasser (25 ml) wurde bei Raumtemperatur für 30 Stunden gerührt. DC-Analyse der Reaktion zeigte die Gegenwart des Ausgangsmaterials Aminosäure. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (370 mg) und Triethylamin (0,6 ml) wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für weitere 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste des Acetonitrils entfernt wurde, mit 10%iger wässeriger Zitronensäurelösung auf pH ~ 3 angesäuert, und die weiße Emulsion wurde dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser, Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (eluiert mit 1 → 3 → 5 → 10% Methanol/Methylenchlorid) gereinigt wurde, wodurch die racemische Fmoc-5-Methoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (1,14 g, 71% Ausbeute) als ein gebrochen weißer Feststoff erhalten wurde. HRMS (FAB): C₂₇H₂₆NO₅ (M + H) ber. 444,1812; beobachtet: 444,1814.
BEISPIEL 12 Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-Ethoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-EtOAtc-OH) Schritt 1:
Ein Gemisch aus 1,6-Dihydroxynaphthalin (5,02 g, 31,3 mmol), wasserfreiem Kaliumcarbonat (52,0 g, 376 mmol), N,N-Dimethylformamid (50 ml) und Iodethan (15 ml, 188 mmol) wurde in einem Ölbad von 35°C für 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und der Feststoffrest wurde gründlich mit Ethylether gespült. Das Filtrat und die Waschungen wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste des Lösungsmittels entfernt wurde. Der braune Rest wurde zwischen Wasser und Ether geteilt und die Schichten wurden getrennt. Die Etherschicht wurde mit Wasser gewaschen. Die vereinigten wässerigen Schichten wurden mit Ether rückextrahiert. Die Etherextrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben einen rohen braunen Feststoff (6,74 g, 99% Ausbeute). Die Umkristallisierung des Rohprodukts aus heißem Methanol ergab 1,6-Diethoxynaphthalin (4,36 g, 64% Ausbeute, erstes Kristallisationsprodukt) als einen hellbraunen Feststoff. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,20 (1H, d, Phenyl), 7,06-7,36 (4H, m, Phenyl), 6,66 (1H, dd, Phenyl), 4,10-4,23 (4H, 2 Sätze q, 2CH₂), 1,45-1,56 (6H, 2 Sätze t, 2CH₃).
Schritt 2:
Zu einer unter Rückfluß erhitzten Lösung aus 1,6-Diethoxynaphthalin (4,15 g, 19,2 mmol) in absolutem Ethanol (100 ml) wurden vorsichtig kleine Stücke Natriummetall (6,8 g, 296 mmol) über 60 Minuten zugegeben. Das Gemisch wurde für weitere 90 Minuten unter Rückfuß erhitzt. DC zeigte die Gegenwart von nicht umgesetztem Ausgangsmaterial. Weiteres Natriummetall (1,0 g, 43,5 mmol) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde für weitere 60 Minuten unter Rückfuß erhitzt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Wasser gequencht und mit konzentrierter Salzsäure angesäuert. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste des Ethanols entfernt wurde. Das wässerige Gemisch wurde dreimal mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben einen braunen Feststoff, der in 1 : 1 Ethanol/Wasser (200 ml) gelöst wurde, dann wurde p-Toluolsulfonsäure (400 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde für 210 Minuten unter Rückfuß erhitzt. Weitere p-Toluolsulfonsäure (100 mg) wurde zugegeben und das Gemisch wurde für weitere 60 Minuten unter Rückfuß erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das meiste des Ethanols unter reduziertem Druck entfernt. Das wässerige Gemisch wurde dreimal mit Ether extrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser, gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein braunes Öl, welches durch Säulenchromatographie (7% Ethylacetat/Hexane) gereinigt wurde, wodurch 5-Ethoxy-β-tetralon (2,43 g, 67% Ausbeute) als ein hellgelbes Öl erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,15 (1H, t, Phenyl), 6,76 (1H, d, Phenyl), 6,72 (1H, d, Phenyl), 4,05 (2H, q, CH₂), 3,56 (2H, s, Benzyl), 3,1.0 (2H, t, Benzyl), 2,53 (2H, t), 1,44 (3H, t, CH₃).
Schritt 3:
Ein Gemisch aus 5-Ethoxy-β-tetralon (2,23 g, 11,7 mmol), Kaliumcyanid (1,20 g, 18,4 mmol), Ammoniumcarbonat (6,75 g, 70,2 mmol), Ethanol (80 ml) und Wasser (20 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem. Ölbad von 80°C für 3 Tage erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur für ein paar Stunden gerührt. Die Filtration, gefolgt von Lufttrocknung, ergab Hydantoin X (2,69 g, 88%) als einen beigefarbenen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,65 (1H, breites s, NH), 8,22 (1H, breites s, NH), 7,06 (1H, t, Phenyl), 6,75 (1H, d, Phenyl), 6,65 (1H, d, Phenyl), 3,98 (2H, q, CH₂), 1,32 (3H, t, CH₃). LRMS (Elektrospray): C₁₄H₁₆N₂O₃, ber. 259; beobachtet: 258 (M – H).
Schritt 4:
Ein Gemisch aus Hydantoin X (2,57 g, 9,87 mmol), Ba(OH)₂·H₂O (9,40 g, 49,6 mmol) in Wasser (200 ml, zum Verdünnen) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 105°C für 39 Stunden erhitzt. Weiteres Ba(OH)₂·H₂O (9,40 g, 49,6 mmol) wurde zugegeben und das Gemisch wurde in einem Ölbad von 125°C für weiter 21 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf ~ pH 3 angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem kochenden Wasserbad für eine Stunde gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert und die Niederschläge mit Wasser gespült. Die Kombination aus Filtrat und Waschungen wurde im Vakuum auf ~ 75 ml konzentriert. Die Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab einen weißen Niederschlag, der filtriert, mit Wasser gewaschen und luftgetrocknet wurde, wodurch racemische 5-Ethoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (2,34 g, quantitative Ausbeute) als ein heller beigefarbener Feststoff erhalten wurde. LRMS (Elektrospray): C₁₃H₁₇NO₃, ber. 235; beobachtet: 236 (M + H), 234 (M – H).
Schritt 5:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Ethoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (2,22 g, 9,44 mmol), Triethylamin (2,00 ml, 14,3 mmol), 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 4,81 g, 14,3 mmol) in Acetonitril (75 ml) und Wasser (75 ml) wurde bei Raumtemperatur für zwei Tage gerührt. DC-Analyse der Reaktion zeigte die Gegenwart des Ausgangsmaterials Aminosäure. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (645 mg) und Triethylamin (1,0 ml) wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für einen weiteren Tag gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste des Acetonitrils entfernt wurde, mit 10%iger wässeriger Zitronensäurelösung auf pH ~ 3 angesäuert und die weiße Emulsion dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser, Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (eluiert mit 3 → 5 → 10% Methanol/Methylenchlorid) gereinigt wurde, wodurch die racemische Fmoc-5-Ethoxy-aminotetralin-2-carbonsäure (4,66 g, > quantitative Ausbeute) als ein weißer Feststoff erhalten wurde. HRMS (FAB): C₂₈H₂₈NO₅ (M + H) ber. 458,1967; beobachtet: 458,1985.
BEISPIEL 13 Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-Isopropoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-iPrOAtc-OH) Schritt 1:
Ein Gemisch aus 6-Methoxy-1-tetralon (5,07 g, 28,8 mmol), 10% Pd/C (3,53 g, 3,32 mmol) in trockenem p-Cymen (250 ml) wurde unter Argon für 38 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, über Celite filtriert und der Rest gründlich mit p-Cymen gespült. Das Filtrat und die Waschungen wurden vereinigt und zweimal mit 1 N Natriumhydroxidlösung (2 × 70 ml) extrahiert. Die vereinigten wässerigen Extrakte wurden mit 6 N Salzsäure auf pH → 3 angesäuert und dreimal mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben rohes 5-Hydroxy-6-methoxynaphthalin (2,31 g, 46% Ausbeute) als einen hellbraunen Feststoff, der ohne weitere Reinigung in dem nächsten Schritt verwendet wurde. LRMS (Elektrospray) C₁₁H₁₀O₂, ber. 174; beobachtet: 173 (M – H).
Schritt 2:
Ein Gemisch aus 5-Hydroxy-6-methoxynaphthalin (2,10 g, 12,1 mmol), Caesiumcarbonat (19,7 g, 60,5 mmol), N,N-Dimethylformamid (12 ml) und 2-Brompropan (3,50 ml, 36,9 mmol) wurde in einem Ölbad von 40°C über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und der Feststoffrest wurde gründlich mit Ethylether gespült. Das Filtrat und die Waschungen wurden vereinigt und im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste der Lösungsmittel entfernt wurde. Der braune Rest wurde zwischen Wasser und Ether geteilt und die Schichten wurden abgetrennt. Die Etherschicht wurde mit Wasser gewaschen. Die vereinigten wässerigen Schichten wurden mit Ether rückextrahiert. Die Etherextrakte wurden ver einigt, mit Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein Rohprodukt, das durch Säulenchromatographie (2,5 → 5% Ethylacetat/Hexane) gereinigt wurde, wodurch 1-Isopropoxy-6-methoxynaphthalin (2,23 g, 86% Ausbeute) als ein hellbraunes Öl erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,17 (1H, d, Phenyl), 7,05-7,38 (4H, m, Phenyl), 6,72 (1H, dd, Phenyl), 4,73 (1H, m, CH von iPr), 3,92 (3H, s, OCH₃), 1,42 (6H, d, 2CH₃ von iPr).
Schritt 3:
Zu einer unter Rückfluß erhitzten Lösung aus 1-Isopropoxy-6-methoxynaphthalin (2,23 g, 10,3 mmol) in absolutem Ethanol (50 ml) wurden vorsichtig kleine Stücke Natriummetall (3,6 g, 157 mmol) über 45 Minuten zugegeben. Das Gemisch wurde für weitere 120 Minuten unter Rückfuß erhitzt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Wasser gequencht und mit konzentrierter Salzsäure angesäuert. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste des Ethanols entfernt wurde. Das wässerige Gemisch wurde dreimal mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein rötliches Öl, das in 1 : 1 Ethanol/Wasser (90 ml) gelöst wurde, dann wurde p-Toluolsulfonsäure (200 mg) zugegeben. Das Gemisch wurde für 60 Minuten unter Rückfuß erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das meiste des Ethanols unter reduziertem Druck entfernt. Das wässerige Gemisch wurde zweimal mit Ether extrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser, gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein rötliches Öl, das durch Säulenchromatographie (8 → 15% Ethylacetat/Hexane) gereinigt wurde, wodurch 5-Isopropoxy-β-tetralon (1,37 g, 65% Ausbeute) als ein farbloses Öl erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,16 (1H, t, Phenyl), 6,78 (1H, d, Phenyl), 6,71 (1H, d, Phenyl), 4,53 (1H, m, CH von iPr), 3,56 (2H, s, Benzyl), 3,08 (2H, t, Benzyl), 2,50 (2H, t), 1,37 (6H, d, 2CH₃ von iPr).
Schritt 4:
Ein Gemisch aus 5-Isopropoxy-β-tetralon (1,37 g, 6,71 mmol), Kaliumcyanid (660 mg, 10,1 mmol), Ammoniumcarbonat (3,87 g, 40,3 mmol), Ethanol (44 ml) und Wasser (9 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 80°C für 42 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur für ein paar Stunden gerührt. Die Filtration, gefolgt von Lufttrocknung, ergab Hydantoin Y (1,64 g, 89%).
Schritt 5:
Ein Gemisch aus Hydantoin Y (1,64 g, 5,98 mmol), Ba(OH)₂·H₂O (5,66 g, 29,9 mmol) in Wasser (25 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 100°C für 70 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf ~ pH 7 neutralisiert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem kochenden Wasserbad für eine Stunde gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt; mit 1 N Natriumhydroxidlösung basisch gemacht, und die weiße Suspension wurde filtriert und die Niederschläge mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschungen wurden im Vakuum auf → 75 ml konzentriert. Die Neutralisation mit konzentrierter Salzsäurelösung ergab einen weißen Niederschlag, der filtriert, mit Wasser gewaschen und luftgetrocknet wurde, wodurch racemische 5-Isopropoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (3,48 g, naß und anorganisches Salzenthaltend, > quantitative Ausbeute) erhalten wurde. LRMS (Elektrospray): C₁₄H₁₉NO₃, ber. 249; beobachtet: 248 (M – H).
Schritt 6:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Isopropoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (3,48 g, 5,98 mmol, theoretisch), Triethylamin (1,10 ml, 7,89 mmol), 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 2,62 g, 7,77 mmol) in Acetonitril (30 ml) und Wasser (30 ml) wurde bei Raumtemperatur für einen Tag gerührt. DC-Analyse der Reaktion zeigte die Gegenwart des Ausgangsmaterials Aminosäure. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (500 mg) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für einen weiteren Tag gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste des Acetonitrils entfernt wurde, mit 10%iger wässeriger Zitronensäurelösung auf pH ~ 3 angesäuert und die weiße Emulsion dreimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser, Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (eluiert mit 1 → 2 5 → 8% Methanol/Methylenchlorid) gereinigt wurde, wodurch racemische Fmoc-5-Isopropoxy-2-aminotetralin-2-carbonsäure (0,50 g, 18% Ausbeute über 2 Schritte) als ein weißer Feststoff erhalten wurde. HRMS (FAB): C₂₉H₃₀NO₅ (M + H) ber. 472,2124; beobachtet: 472,2117.
BEISPIEL 14 Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-Methyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-MeAtc-OH) Schritt 1:
Ein Gemisch aus 2-Methylhydrozimtsäure (3,0 g, 18,3 mmol), Oxalylchlorid (3,19 ml, 36,6 mmol) und Methylenchlorid (30 ml) wurde in einem Eisbad abgekühlt und N,N-Dimethylformamid (0,14 ml, 1,81 mmol) wurde tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Konzentration im Vakuum ergab 3-(2-Methyl phenyl)propanoylchlorid, das in Methylenchlorid aufgenommen wurde und in dem nächsten Schritt als ein Rohprodukt verwendet wurde.
Schritt 2:
Eine Lösung aus dem obigen Säurechlorid (roh, 18,3 mmol) in Methylenchlorid wurde zu einer Lösung aus Diazomethan (erzeugt aus 11,9 g 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin) in Ether (80 ml), abgekühlt in einem Eisbad, langsam zugegeben. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert und durch Säulenchromatographie (10 → 20% Ethylacetat/Hexane) gereinigt, wodurch 1-Diazo-4-(2-methylphenyl)butan-2-on (2,08 g, 60% über 2 Schritte) als ein hellgelbes Öl erhalten wurde.
Schritt 3:
Zu einem Gemisch aus Rhodium(II)acetatdimer (24 mg, 0,109 mmol) in Methylenchlorid (200 ml) wurde unter Rückfluß langsam eine Lösung aus 1-Diazo-4-(2-methylphenyl)butan-2-on (2,08 g, 11,1 mmol) in Methylenchlorid (50 ml) über 180 Minuten zugegeben. Nach der vollständigen Zugabe wurde das Gemisch für weitere zwanzig Minuten unter Rückfuß erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, Trifluoressigsäure (2,40 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gequencht. Die Schichten wurden abgetrennt und die Methylenchloridschicht wurde noch einmal mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die vereinigten wässerigen Schichten wurden mit Methylenchlorid rückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wodurch ein rohes braunes Öl erhalten wurde. Die Reinigung durch Säulenchromatographie (15% Ethylacetat/Hexane) ergab 5-Methyl-β-tetralon (1,48 g, 84% Ausbeute) als ein hellbraunes Öl. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 6,907,20 (3H, m, Phenyl), 3,58 (2H, s, Benzyl), 3,03 (2H, t, Benzyl), 2,55 (2H, t), 2,34 (3H, s, CH₃).
Schritt 4:
Ein Gemisch aus 5-Methyl-β-tetralon (1,48 g, 9,24 mmol), Kaliumcyanid (902 mg, 1.3,9 mmol), Ammoniumcarbonat (5,33 g, 55,5 mmol), Ethanol (45 ml) und Wasser (9 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 80°C für 3 Tage erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur für ein paar Stunden gerührt. Die Filtration, gefolgt von Lufttrocknung, ergab das rohe Hydantoin Z (1,81 g, 85% Ausbeute) als einen beigefarbenen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,66 (1H, breites s, NH), 8,22 (1H, breites s, NH), 6,85-7,05 (3H, m, Phenyl), 2,17 (3H, s, CH₃).
Schritt 5:
Ein Gemisch aus Hydantoin Z (1,80 g, 7,82 mmol), Ba(OH)₂·H₂O (7,40 g, 39,1 mmol) in Wasser (28 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 125°C für 88 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf ~ pH 3 angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem kochenden Wasserbad für eine Stunde gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert und die Niederschläge mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschungen wurden im Vakuum auf ~ 50 ml konzentriert. Die Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab einen weißen Niederschlag, der filtriert, mit Wasser gewaschen und luftgetrocknet wurde, wodurch racemische 5-Methyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (1,05 g, 65% Ausbeu te) als ein beigefarbener Feststoff erhalten wurde. LRMS (Elektrospray): C₁₂H₁₅NO₂, ber. 205; beobachtet: 206 (M + H).
Schritt 6:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Methyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (1,05 g, 5,12 mmol), Triethylamin (0,93 ml, 6,67 mmol), 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 2,24 g, 6,64 mmol) in Acetonitril (30 ml) und Wasser (30 ml) wurde bei Raumtemperatur für 2 Tage gerührt. DC-Analyse der Reaktion zeigte die Gegenwart des Ausgangsmaterials Aminosäure. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (520 mg) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für weitere 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste des Acetonitrils entfernt wurde, mit 10%iger wässeriger Zitronensäurelösung auf pH ~3 angesäuert und die weiße Emulsion wurde zweimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser, Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (eluiert mit 2 → 5 → 8% Methanol/Methylenchlorid) gereinigt wurde, wodurch racemische Fmoc-5-Methyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (1,62 g, 74% Ausbeute) als ein hellbrauner Feststoff erhalten wurde. HRMS (FAB): C₂₇H₂₆NO₄ (M + H) ber. 428;1862; beobachtet: 428,1844.
BEISPIEL 15 Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-Ethyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-EtAtcOH) Schritt 1:
Ein Gemisch aus 3-(2-Ethylphenyl)propionsäure (hergestellt in 3 Schritten aus 1-Ethyl-2-iodbenzol, 4,4 g, 23,8 mmol), Thionylchlorid (9,50 ml, 130 mmol) und Toluol (100 ml) wurde für 2 Stunden unter Rückfuß erhitzt. Die Konzentration im Vakuum ergab 3-(2-Ethylphenyl)propanoylchlorid, das in Methylenchlorid aufgenommen und in dem nächsten Schritt als ein Rohprodukt verwendet wurde.
Schritt 2:
Eine Lösung aus 3-(2-Ethylphenyl)propanoylchlorid (roh, 23,8 mmol) in Methylenchlorid wurde langsam zu einer Lösung aus Diazomethan (erzeugt aus 15,6 g 1-Methyl-nitro-1-nitrosoguanidin) in Ether (100 ml), abgekühlt in einem Eisbad, zugegeben. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert und durch Säulenchromatographie (10 → 20% Ethylacetat/Hexane) gereinigt, wodurch 1-Diazo-4-(2-ethylphenyl)butan-2-on (3,47 g, 72% über 2 Schritte) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,1-7,25 (4H, m, Phenyl), 5,21 (1H, breites s, Diazo), 2,97 (2H, m, CH₂ von Ethyl), 1,20 (3H, t, CH₃).
Schritt 3:
Zu einem Gemisch aus Rhodium(II)acetatdimer (38 mg, 0,172 mmol) in Methylenchlorid (300 ml) wurde unter Rückfluß langsam eine Lösung aus 1-Diazo-4-(2-ethylphenyl)butan-2-on (3,47 g, 17,2 mmol) in Methylenchlorid (50 ml) über 90 Minuten zugegeben. Nach der vollständigen Zugabe wurde das Gemisch für weitere zwanzig Minuten unter Rückfuß erhitzt. Das Gemisch. wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, Trifluoressigsäure (3,75 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gequencht. Die Schichten wurden getrennt und die Methylenchloridschicht wurde noch einmal mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die vereinigten wässerigen Schichten wurden mit Methylenchlorid rückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wodurch rohes 5-Ethyl-β-tetralon (3,09 g, > quantitative Ausbeute) als ein rötlich-braunes Öl erhalten wurde. Die Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in dem nächsten Schritt verwendet. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 6,9-7,2 (3H, m, Phenyl), 3,58 (2H, s, Benzyl), 3,08 (2H, s, Benzyl), 2,70 (2H, q, CH₂ von Ethyl), 2,52 (2H, t, Benzyl), 1,20 (3H, t, CH₃ von Ethyl).
Schritt 4:
Ein Gemisch aus 5-Ethyl-β-tetralon (3,09 g, 17,7 mmol), Kaliumcyanid (1,73 g, 26,6 mmol), Ammoniumcarbonat (10,2 g, 106 mmol), Ethanol (80 ml) und Wasser (16 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 80°C für 48 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die weiße Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und. bei Raumtemperatur für ein paar Stunden gerührt. Die Filtration, gefolgt von Lufttrocknung, ergab Hydantoin AA (3,85 g, 92% Ausbeute über 2 Schritte) als einen hellen beigefarbenen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,67 (1H, breites s, NH), 8,26 (1H, breites s, NH), 6,8-7,1 (3H, m, Phenyl), 1,13 (3H, t, CH₃). LRMS (Elektrospray): C₁₄H₁₆N₂O₂, ber. 244; beobachtet: 243 (M – H).
Schritt 5:
Ein Gemisch aus Hydantoin AA (1,00 g, 4,09 mmol), Ba(OH)₂·H₂O (4,00 g, 21,1 mmol) in Wasser (20 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 125°C für 48 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf ~ pH 3 angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem kochenden Wasserbad für zwei Stunden gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert und die Nie derschläge mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschungen wurden im Vakuum auf ~ 50 ml konzentriert. Die Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab einen weißen Niederschlag, der filtriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über Nacht getrocknet wurde, wodurch racemische 5-Ethyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (796 mg, 89% Ausbeute) erhalten wurde. LRMS (Elektrospray): C₁₃H₁₇NO₂, ber. 219; beobachtet: 220 (M + H).
Schritt 6:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Ethyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (765 mg, 3,49 mmol), Triethylamin (1,0 ml, 7,17 mmol), 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 1,79 g, 5,31 mmol) in Acetonitril (40 ml) und Wasser (40 ml) wurde bei Raumtemperatur für 2 Tage gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste des Acetonitrils entfernt wurde, mit 10%iger wässeriger Zitronensäurelösung auf pH ~ 3 angesäuert und die weiße Emulsion zweimal mit Methylenchlorid, zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die Methylenchloridextrakte wurden mit Wasser, Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Ethylacetatextrakte wurden mit Wasser, Salzlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (eluiert mit 2 → 5 → 8% Methanol/Methylenchlorid) gereinigt wurde, wodurch racemische Fmoc-5-Ethyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (330 mg, 21% Ausbeute) als ein weißer Feststoff erhalten wurde. HRMS (FAB): C₂₈H₂₈NO₄ (M + H) ber. 442,2018; beobachtet: 442,2010.
BEISPIEL 16 Herstellung von Fmoc-(D,L)-5-Isopropyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (Fmoc-(D,L)-5-iPrAtc-OH) Schritt 1:
Ein Gemisch aus 3-(2-Isopropylphenyl)propionsäure (hergestellt in 3 Schritten aus 1-Isopropyl-2-iodbenzol, 2,01 g, 10,5 mmol), Thionylchlorid (4,30 ml, 59,0 mmol) und Toluol (40 ml) wurde für 2 Stunden unter Rückfuß erhitzt. Die Konzentration im Vakuum ergab 3-(2-Isopropylphenyl)propanoylchlorid, das in Methylenchlorid aufgenommen wurde und in dem nächsten Schritt als ein Rohprodukt verwendet wurde.
Schritt 2:
Eine Lösung aus 3-(2-Isopropylphenyl)propanoylchlorid (roh, 10,5 mmol) in Methylenchlorid wurde langsam zu einer Lösung aus Diazomethan (erzeugt aus 6,95 g 1-Methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidin) in Ether (50 ml), abgekühlt in einem Eisbad, zugegeben. Das Gemisch wurde dann auf Raumtemperatur erwärmt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum konzentriert und durch Säulenchromatographie (20% Ethylacetat/Hexane) gereinigt, wodurch 1-Diazo-4-(2-isopropylphenyl)butan-2-on (1,87 g, 82% über 2 Schritte) als ein hellgelbes Öl erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,10-7,30 (4H, m, Phenyl), 5,21 (1H, breites s, Diazo), 3,15 (1H, m, CH von iPr), 3,00 (2H, t, Benzyl), 2,57 (2H, m), 1,24 (6H, d, 2CH₃ von iPr).
Schritt 3:
Zu einem Gemisch aus Rhodium(II)acetatdimer (20 mg, 0,091 mmol) in Methylenchlorid (160 ml) wurde unter Rückfluß eine Lösung aus 1-Diazo-4-(2-bromphenyl)butan-2-on (1,87 g, 8,65 mmol) in Methylenchlorid (25 ml) über 60 Minuten langsam zugegeben. Nach der vollständigen Zugabe wurde das Gemisch für weitere fünfzehn Minuten unter Rückfuß erhitzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, Trifluoressigsäure (1,90 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 45 Minuten gerührt. Die Reaktion wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gequencht. Die Schichten wurden abgetrennt und die Methylenchloridschicht wurde noch einmal mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die vereinigten wässerigen Schichten wurden mit Methylenchlorid rückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert, wodurch ein rohes braunes Öl erhalten wurde.
Die Reinigung durch Säulenchromatographie (5% Ethylacetat/Hexane) ergab 5-Isopropyl-β-tetralon (1,57 g, 96% Ausbeute) als ein hellgelbes Öl. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 6,93-7,22 (3H, m, Phenyl), 3,59 (2H, s, Benzyl), 3,24 (1H, m, CH von iPr), 3,12 (2H, t, Benzyl), 2,52 (2H, t), 1,27 (6H, d, 2 CH₃ von iPr).
Schritt 4:
Ein Gemisch aus 5-Isopropyl-β-tetralon (1,57 g, 8,34 mmol), Kaliumcyanid (0,82 g, 12,6 mmol), Ammoniumcarbonat (4,81 g, 50,1 mmol), Ethanol (40 ml) und Wasser (10 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 80°C für 48 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die braune Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur für ein paar Stunden gerührt. Die Filtration, gefolgt von Lufttrocknung, ergab das rohe Hydantoin BB als einen beigefarbenen Feststoff, der in dem nächsten Schritt ohne weitere Reinigung verwendet wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,69 (1H, breites s, NH), 8,30 (1H, breites s, NH), 6,85-7,32 (3H, m, Phenyl), 1,15 (6H, t, CH₃). LRMS (Elektrospray): C₁₅H₁₈N₂O₂, ber. 258; beobachtet: 539 (2M + Na).
Schritt 5:
Ein Gemisch aus Hydantoin BB (roh, 8,34 mmol, theoretisch), Ba(OH)₂·H₂O (7,90 g, 41,7 mmol) in Wasser (40 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 125°C für 38 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf pH ~ 3 angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem kochenden Wasserbad für zwei Stunden gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert und die Niederschläge mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschungen wurden im Vakuum auf ~ 50 ml konzentriert. Die Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab einen weißen Niederschlag, der filtriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über Nacht getrocknet wurde, wodurch racemische 5-Isopropyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (1,23 g, 63% Ausbeute über 2 Schritte) als ein beigefarbener Feststoff erhalten wurde. LRMS (Elektrospray): C₁₄H₁₉NO₂, ber. 233; beobachtet: 232 (M – H).
Schritt 6:
Ein Gemisch aus racemischer 5-Isopropyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (250 mg, 1,07 mmol), Triethylamin (1,2 ml, 8,61 mmol), 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 2,70 g, 8,00 mmol) in Acetonitril (30 ml) und Wasser (30 ml) wurde bei Raumtemperatur für 2 Tage gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste des Acetonitrils entfernt wurde, mit 10%iger wässeriger Zitronensäurelö sung auf pH ~ 3 angesäuert, und die weiße Emulsion wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Wasser, Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (eluiert mit 2 → 5 → 8% Methanol/Methylenchlorid) gereinigt wurde, wodurch racemische Fmoc-5-Isopropyl-2-aminotetralin-2-carbonsäure (208 mg, 43% Ausbeute) als ein gebrochen weißer Schaum erhalten wurde. HRMS (FAB): C₂₉H₃₀NO₄ (M + H) ber. 456,2175; beobachtet: 456,2184.
BEISPIEL 17 Herstellung von Fmoc-4-Amino-1-phenylpiperidin-4-carbonsäure (Fmoc-Appc-OH) Schritt 1:
Zu einer Lösung aus Iodbenzol (6,37 g, 3,5 ml, 31,2 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (10,32 g, 9,3 ml, 72,2 mmol, 2,3 Äquiv.) und Natrium-tert-butoxid (8,0 g, 83,3 mmol, 2,7 Äquiv.) in trockenem Dioxan (120 ml) wurden Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (91 mg, 0,1 mmol) und Tri-o-tolylphosphin (180 mg, 0,591 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 90°C für 26 h erhitzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rest wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch ein braunes Öl erhalten wurde. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 zu 75/25) gereinigt, wodurch das reine Produkt CC als ein hellgelber Feststoff (6,08 g, 89%) bereitgestellt wurde. ¹H-NMR (CDCl₃), 7,25 (ddt, 2H), 6,95 (dd, 2H), 6,84 (t, 1H), 4,00 (s, 4H), 3,32 (t, 4H) und 1,84 (t, 4H); MS (Elektrospray) m/e 220 (M + H), Ber. für C₁₃H₁₇NO₂, 219.
Schritt 2:
Zu einer Lösung aus dem Ketal CC (3,22 g, 15,16 mmol) in Aceton (100 ml.) wurde 6 N Salzsäure (50 ml) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rest wurde in EtOAc aufgenommen und mit wässeriger 6 N NaOH-Lösung neutralisiert. Die Schichten wurden abgetrennt und die wässerige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 80/20 → 60/40) gereinigt, wodurch das Produkt DD als ein gelbes Öl (2,58 g, 97%) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 176 (M + H), Ber. für C₁₁H₁₃NO, 175.
Schritt 3:
Zu einer Lösung aus dem Keton DD (2,53 g, 14,46 mmol) in Ethanol (75 ml) und Wasser (25 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (12,9 g, 134,3 mmol, 9 Äquiv.) und Kaliumcyanid (2,1 l g, 32,5 mmol, 2 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C für 18 h erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert und der Rest wurde mit Wasser behandelt, mit EtOAc (4 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch das spektroskopisch reine Hydantoin EE als ein weißer Feststoff (3,36 g, 95% Ausbeute) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 246 (M + H), Ber. für C₁₃H₁₅N₃O₂, 245.
Schritt 4:
Das Hydantoin EE (3,36 g) wurde in wässerigem NaOH (6 N, 100 ml) suspendiert und bei 130°C für 2 bis 3 Tage erhitzt. Nach Beendigung der Hydrolyse (durch HPLC) wurde das Reaktionsgemisch mit konz. HCl neutralisiert, bis es schwach sauer war (pH ~ 6). Die resul tierende Aufschlämmung wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch 4-Amino-1-phenylpiperidin-4-carbonsäure (APPC) als ein weißer Feststoff (5,26 g, > 100% Ausbeute, naß und mit anorganischem Salz verunreinigt) erhalten wurde, der einen einzelnen Peak bei der HPLC zeigte und direkt für den nächsten Schritt verwendet wurde. MS (Elektrospray) m/e 221 (M + H), Ber. für C₁₂H₁₆N₂O₂, 220.
Schritt 5:
Die rohe 4-Amino-1-phenylpiperidin-4-carbonsäure (APPC) aus dem letzten Schritt wurde in Dioxan (80 ml) und wässerigem 10%igem Na₂CO₃ (40 ml) suspendiert, mit Fmoc-Cl (5,3 g, 20,57 mmol, 1,5 Äquiv.) behandelt und wurde kräftig über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann konzentriert, wodurch Dioxan entfernt wurde, mit 6 N HCl neutralisiert, bis es schwach sauer war (pH 6), und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc bis CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt wurde, wodurch reines Fmoc-APPC (4,91 g, 81% Gesamtausbeute für zwei Schritte) erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆), 7,88 (d, 2H), 7,74 (d, 2H), 7,19-7,42 (m, 8H), 4,20-4,31 (m, 3H); HRMS m/z 465,1788, Ber. für C₂₇H₂₆N₂O₄Na, 465,1791.
BEISPIEL 18 Herstellung von Fmoc-4-amino-1-(4-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (Fmoc-4-MeAppc-OH) Schritt 1:
Zu einer Lösung aus 4-Iodtoluol (2,12 g, 9,7 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (2,8 ml, 3,12 g, 21,82 mmol, 2,2 Äquiv.) und Natrium-tert-butoxid (2,6 g, 27,08 mmol, 2,8 Äquiv.) in trockenem Dioxan (40 ml) wurden Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (44,4 mg, 0,0485 mmol) und Tri-o-tolylphosphin (59,0 mg, 0,194 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 90°C für 26 h erhitzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rest wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch ein braunes O1 erhalten wurde. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 zu 75/25) gereinigt, wodurch das reine Produkt FF als einen hellgelber Feststoff (1,937 g, 85%) bereitgestellt wurde. ¹H-NMR (CDCl₃), 7,06 (d, 2H), 6,87 (d, 2H), 3,99 (s, 4H), 3,26 (t, 4H), 2,26 (s, 3H) und 1,85 (t, 4H).
Schritt 2:
Zu einer Lösung aus dem Ketal FF (1,58 g, 6,79 mmol) in Aceton (50 ml) wurde 6 N Salzsäure (25 ml) zugegeben. und die Reaktion wurde über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rest wurde in EtOAc aufgenommen und mit wässeriger 6 N NaOH-Lösung neutralisiert. Die Schichten wurden abgetrennt und die wässerige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 70/30) gereinigt, wodurch das Produkt GG als ein gelbes Öl (1,27 g, 98%) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 190 (M + H), Ber. für C₁₂H₁₅NO, 189.
Schritt 3:
Zu einer Lösung aus dem Keton GG (1,17 g, 6,18 mmol) in Ethanol (60 ml) und Wasser (20 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (4,74 g, 49,44 mmol, 8 Äquiv.) und Kaliumcyanid (1,01 g, 15,54 mmol, 2,5 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 90°C für 22 h erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert und der Rest wurde mit Wasser behandelt, mit EtOAc (4 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrock net und konzentriert, wodurch. das spektroskopisch reine Hydantoin HH als ein weißer Feststoff (1,554 g, 97% Ausbeute) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 260 (M + H), Ber. für C₁₄H₁₇N₃O₂, 259.
Schritt 4:
Das Hydantoin HH (1,502 g) wurde in wässerigem NaOH (6 N, 40 ml) suspendiert und bei 130°C für 4 Tage erhitzt. Nach Beendigung der Hydrolyse (durch HPLC) wurde das Reaktionsgemisch mit konz. HCl neutralisiert, bis es schwach sauer war (pH ~ 6). Die resultierende Aufschlämmung wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch 4-Amino-1-(4-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (4-MeAPPC) als ein weißer Feststoff (2,10 g, > 100% Ausbeute, naß und mit anorganischem Salz verunreinigt) erhalten wurde, der einen einzelnen Peak bei der HPLC zeigte und direkt in dem nächsten Schritt verwendet wurde. MS (Elektrospray) m/e 235 (M + H), Ber. für C₁₃H₁₈N₂O₂, 234.
Schritt 5:
Die rohe 4-Amino-1-(4-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (4-MeAPPC) aus dem letzten Schritt wurde in Dioxan (80 ml) und wässerigem 10%igem Na₂CO₃ (40 ml) suspendiert, mit Fmoc-Cl (2,2 g, 8,59 mmol, 1,5 Äquiv.) behandelt und über Nacht kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann konzentriert, wodurch Dioxan entfernt wurde, mit 6 N HCl neutralisiert, bis es schwach sauer war (pH 6), und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc bis CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt wurde, wodurch reines Fmoc-4-MeAPPC (2,16 g, 82% Gesamtausbeute für zwei Schritte) erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,88 (d, 2H), 7,72 (d, 2H), 7,39 (t, 2H), 7,30 (td, 2H), 6,99 (d, 2H), 6,82 (d, 2H), 2,18 (s, 3H); MS (Elektrospray) m/e 457 (M + H), Ber. für C₂₈H₂₈N₂O₄, 456.
BEISPIEL 19 Herstellung von Fmoc-4-amino-1-(4-chlorphenyl)piperidin-4-carbonsäure (Fmoc-4-ClAppc-OH) Schritt 1:
Zu einer Lösung aus 1-Chlor-4-iodbenzol (2,38 g, 10,0 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (3,1 ml, 3,44 g, 24,0 mmol, 2,4 Äquiv.) und Natrium-tert-butoxid (2,68 g, 28,0 mmol, 2,8 Äquiv.) in trockenem Dioxan (40 ml) wurden Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (45,5 mg, 0,0497 mmol) und Tri-o-tolyl-phosphin (61 mg, 0,20 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 90°C für 9 h erhitzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rest wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch ein braunes Öl erhalten wurde. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 zu 75/25 gereinigt), wodurch das reine Produkt II als ein hellgelber Feststoff (2,17 g, 86%) bereitgestellt wurde. ¹H-NMR (CDCl₃), 7,18 (dt, 2H), 6,85 (dt, 2H), 3,98 (s, 4H), 3,28 (t, 4H) und 1,82 (t, 4H).
Schritt 2:
Zu einer Lösung aus dem Ketal II (2,123 g, 8,39 mmol) in Aceton (75 ml) wurde 6 N Salzsäure (30 ml) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rest wurde in EtOAc aufgenommen und mit wässeriger 6 N NaOH-Lösung neutralisiert. Die Schichten wurden abgetrennt und die wässerige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 → 70/30) gereinigt, wodurch das Produkt JJ als ein gelber Feststoff (1,515 g, 86%) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 210 (M + H), Ber. für C₁₁H₁₂ClNO, 209.
Schritt 3:
Zu einer Lösung aus dem Keton JJ (1,465 g, 6,986 mmol) in Ethanol (75 ml) und Wasser (25 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (5,36 g, 55,88 mmol, 8 Äquiv.) und Kaliumcyanid (1,135 g, 17,46 mmol, 2,5 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C für 18 h erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert und der Rest wurde mit Wasser behandelt, mit EtOAc (4 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch das spektroskopisch reine Hydantoin KK als ein weißer Feststoff (1,817 g, 93% Ausbeute) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 280 (M + H), Ber. für C₁₃H₁₄ClN₃O₂, 279.
Schritt 4:
Das Hydantoin KK (1,768 g) wurde in wässerigem NaOH (6 N, 50 ml) suspendiert und bei 130°C für 4 Tage erhitzt. Nach der Beendigung der Hydrolyse (durch HPLC) wurde das Reaktionsgemisch mit konz. HCl neutralisiert, bis es leicht sauer war (pH ~ 6). Die resultierende Aufschlämmung wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch 4-Amino-1-(4-chlorphenyl)piperidin-4-carbonsäure (4-ClAPPC) als ein weißer Feststoff (2,05 g, > 100% Ausbeute, naß und mit anorganischem Salz verunreinigt), erhalten wurde, der einen einzelnen Peak bei der HPLC zeigte und direkt für den nächsten Schritt verwendet wurde. MS (Elektrospray) m/e 253 (M – H), Ber. für C₁₂H₁₅ClN₂O₂, 254.
Schritt 5:
Die rohe 4-Amino-1-(4-chlorphenyl)piperidin-4-carbonsäure (4-ClAPPC) aus dem letzten Schritt wurde in Dioxan (100 ml) und wässerigem 10%igem Na₂CO₃ (50 ml) suspendiert, mit Fmoc-Cl (2,0 g, 7,75 mmol, 1,2 Äquiv.) behandelt und wurde über Nacht kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann konzentriert, wodurch Dioxan entfernt wurde, mit 6 N HCl neutralisiert, bis es schwach sauer war (pH 6) und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc bis CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt wurde, wodurch reines Fmoc-4-ClAPPC (1,18 g, 81% Gesamtausbeute für zwei Schritte) erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆): 7,87 (d, 2H), 7,71 (d, 2H), 7,39 (td, 2H), 7,30 (td, 2H), 7,20 (d, 2H), 6,92 (d, 2H), 3,44 (d, 2H), 2,93 (t, 2H); MS (Elektrospray) m/e 477 (M + H), Ber. für C₂₇H₂₅N₂O₄, 476.
BEISPIEL 20 Herstellung von Fmoc-4-Amino-1-(4-phenoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure (Fmoc-4-PhOAppc-OH) Schritt 1:
Zu einer Lösung aus 1-Iod-4-phenoxybenzol (3,15 g, 10,6 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (3,3 ml, 3,66 g, 25,6 mmol, 2,4 Äquiv.) und Natrium-tert-butoxid (2,85 g, 29,7 mmol, 2,8 Äquiv.) in trockenem Dioxan (40 ml) wurden Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (48,5 mg, 0,053 mmol) und Tri-o-tolyl-phosphin (64 mg, 0,4 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 90°C für 9 h erhitzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rest wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch ein braunes Öl erhalten wurde. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 zu 80/20) gereinigt, wodurch das reine Produkt LL als ein hellgelber Feststoff (2,805 g, 85%) bereitgestellt wurde. ¹H-NMR (CDCl₃), 7,26-7,32 (m, 2H), 7,03 (t, 1H), 6,92-6,97 (m, 6H), 4,00 (s, 4H), 3,26 (t, 4H), 1,86 (t, 4H).
Schritt 2:
Zu einer Lösung aus dem Ketal LL (2,755 g, 8,86 mmol) in Aceton (90 ml) wurde 6 N Salzsäure (45 ml) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rest wurde mit EtOAc verdünnt und mit wässerigem 6 N NaOH neutralisiert. Die Schichten wurden abgetrennt und die wässerige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten. organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch das Rohprodukt erhalten wurde, daß durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 zu 70/30) gereinigt wurde, wodurch das Produkt MM als ein gelbes Öl (2,21 g, 93%) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 268 (M + H), Ber. für C₁₇H₁₇ClNO₂, 267.
Schritt 3:
Zu einer Lösung aus dem Keton MM (2,01 g, 7,52 mmol) in Ethanol (80 ml) und Wasser (25 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (5,78 g, 60,0 mmol, 8 Äquiv.) und Kaliumcyanid (1,22 g, 18,80 mmol, 2,5 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C für 18 h erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert und der Rest wurde mit Wasser behandelt, mit EtOAc (4 ×) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch das spektroskopisch reine Hydantoin NN als ein weißer Feststoff (2,34 g, 95% Ausbeute) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 338 (M + H), Ber. für C₁₉H₁₉N₃O₃, 337.
Schritt 4:
Das Hydantoin NN (2,28 g, 6,76 mmol) wurde in wässerigem NaOH (6 N, 60 ml) suspendiert und bei 130°C für 4 Tage erhitzt. Nach Beendigung der Hydrolyse (durch HPLC) wurde das Reaktionsgemisch mit konz. HCl neutralisiert, bis es schwach sauer war (pH – 6). Die resultierende Aufschlämmung wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch 4-Amino-1-(4-phenoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure (4-PhOAPPC) als ein weißer Feststoff (2,53 g, > 100% Ausbeute, naß und mit anorganischem Salz verunreinigt) erhalten wurde, der einen einzelnen Peak bei der HPLC zeigte und direkt für den nächsten Schritt verwendet wurde. MS (Elektrospray) m/e 313 (M + H), Ber. für C₁₈H₂₀N₂O₃, 312.
Schritt 5:
Die rohe 4-Amino-1-(4-phenoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure (4-PhOAPPC) aus dem letzten Schritt wurde in Dioxan (50 ml) und wässerigem 10%igem Na₂CO₃ (50 ml) suspendiert und über Nacht kräftig gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch Dioxan entfernt wurde, mit 6 N HCl neutralisiert, bis es schwach sauer war (pH 6), und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab das Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc bis CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt wurde, wodurch das reine Fmoc-4-PhOAPPC (2,18 g, 60% Gesamtausbeute in zwei Schritten) erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆) 7,87 (d, 2H), 7,72 (d, 2H), 7,38 (t, 2H), 7,30 (td, 4H), 7,02 (dt, 1H), 6,86-6,96 (m, 6H), 3,35 (m, 2H) 2,94 (t, 2H); MS (Elektrospray) m/e 535 (M + H), Ber. für C₃₃H₃₀N₂O₅, 534.
BEISPIEL 21 Herstellung von Fmoc-4-Amino-1-(2-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (Fmoc-2-MeAppc-OH) Schritt 1:
Zu einer Lösung aus 2-Iodtoluol (4,36 g, 2,5 ml, 20,0 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (6,88 g, 6,2 ml, 48,1 mmol, 2,4 Äquiv.) und Natrium-tert-butoxid (5,3 g, 55,2 mmol, 2,8 Äquiv.) in trockenem Dioxan (80 ml) wurden Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (91 mg, 0,1 mmol) und Tri-o-tolylphosphin (122 mg, 0,4 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 90°C für 26 h erhitzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rest wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch ein braunes Öl erhalten wurde. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 zu 75/25) gereinigt, wodurch das reine Produkt 00 als ein hellgelber Feststoff (2,66 g, 57%) bereitgestellt wurde. ¹H-NMR (CDCl₃), 7,12-7,18 (m, 2H), 6,94-7,06 (m, 2H), 4,01 (s, 4H), 2,98 (t, 4H) und 1,88 (t, 4H).
Schritt 2:
Zu einer Lösung aus dem Ketal OO (2,66 g, 11,4 mmol) in Aceton (70 ml) wurde 6 N Salzsäure (35 ml) zugegeben und die Reaktion wurde bei 85°C über Nacht erhitzt. Die resultierende Reaktion wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rest wurde mit EtOAc verdünnt und mit wässerigem NaOH (6 N) neutralisiert. Die Schichten wurden abgetrennt und die wässerige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und kon zentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 zu 70/30) gereinigt, wodurch das Produkt PP als ein gelbes Öl (2,04 g, 95%) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 190 (M + H), Ber. für C₁₂H₁₅NO, 189.
Schritt 3:
Zu einer Lösung aus dem Keton PP (1,54 g, 8,15 mmol) in Ethanol (60 ml) und Wasser (20 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (4,69 g, 48,9 mmol, 6 Äquiv.) und Kaliumcyanid (800 g, 12,2 mmol, 1,5 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C für 18 h erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde zu Eiswasser (300 ml) zugegeben und für 30 min kräftig gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde saugfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch das Hydantoin QQ als ein weißer Feststoff (2,01 g, 95% Ausbeute) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 260 (M + H), Ber. für C₁₄H₁₇N₃O₂, 259.
Schritt 4:
Zu einer Suspension aus dem Hydantoin QQ (1,07 g, 4,13 mmol) in trockenem THF (25 ml) wurden Di-tert-butyl-dicarbonat (2,25 g, 10,32 mmol, 2,5 Äquiv.), Triethylamin (0,63 ml, 460 mg, 4,54 mmol, 1,1 Äquiv.) und DMAP (36 mg, 0,29 mmol) nacheinander zugegeben. Etwa 15 Minuten nach der Zugabe färbte sich die Reaktion zu einer klaren gelben Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch ein Feststoff erhalten wurde, der dann in EtOAc (300 ml) aufgenommen, mit 1 N HCl (3 × 30 ml), gesättigtem wässerigem Na₂CO₃ (2 × 30 ml) und Salzlösung (2 × 30 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das rohe hellgelbe Produkt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 80/20) gereinigt, wodurch das reine Bis-Boc-hydanto in RR als ein weißer Feststoff (1,71 g, 90%) erhalten wurde. MS (Elektrospray) m/e 460 (M + H), Ber. für C₂₄H₃₃N₃O₆, 459.
Schritt 5:
Das Bis-Boc-hydantoin RR (1,71 g, 3,72 mmol) wurde in DME (23 ml) gelöst, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Zu dieser Lösung wurde 1 N NaOH (33 ml, 33 mmol) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, was ein ziemlich klares Gemisch ergab. HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, und mit Et₂O extrahiert. Ohne Reinigung wurde die resultierende wässerige Schicht, enthaltend 4-Amino-1-(2-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (2-MeAPPC), mit 6 N HCl behandelt, um den pH auf 11 bis 12 einzustellen. Diese Lösung (30 ml) wurde dann mit 1,4-Dioxan (30 ml) verdünnt und mit Fmoc-Cl (1,28 g, 4,96 mmol, 1,3 Äquiv.) behandelt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch Dioxan entfernt wurde, mit 1 N HCl neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc → CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt, wodurch das reine Produkt Fmoc-2-MeAPPC als ein weißer Feststoff (1,09 g, 64% Ausbeute aus dem Bis-Boc-hydantoin RR) erhalten wurde. ¹H-NMR (DMSO d₆): 7,87 (d, 2H), 7,74 (d, 2H), 7,40 (td, 2H), 7,31 (td, 2H), 7,12 (m, 2H), 6,97 (d, 1H), 6,92 (td, 1H), 2,72-2,88 (m, 4H) und 2,22 (s, 3H); MS (Elektrospray) m/e 457 (M + H), Ber. für C₂₈H₂₈N₂O₄, 456.
BEISPIEL 22 Herstellung von Fmoc-4-Amino-1-(2-isopropylphenyl)peridin-4-carbonsäure (Fmoc-2-iPrAppc-OH) Schritt 1:
Zu einer Lösung aus 1-Iod-2-iso-propylbenzol (10,0 g, 40,7 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (12,0 ml, 13,3 g, 93,0 mmol, 2,3 Äquiv.) und Natrium-tert-butoxid (10,0 g, 104,2 mmol, 2,6 Äquiv.) in trockenem Dioxan (160 ml) wurden Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (180 mg, 0,197 mmol) und Tri-o-tolyl-phosphin (244 mg, 0,80 mmol) zugegeben und die Reaktion wurde bei 90°C für 26 h erhitzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde, mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch ein braunes Öl erhalten wurde. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 → 75/25) gereinigt, wodurch das reine Produkt SS als ein hellgelber Feststoff (3,61 g, 35% Ausbeute) bereitgestellt wurde. MS m/z 262 (M + H), Ber. für C₁₆H₂₃NO₂, 261.
Schritt 2:
Zu einer Lösung aus dem Ketal SS (3,24 g, 12,4 mmol) in Aceton (90 ml) wurde 6 N Salzsäure (45 ml) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde, und der Rest wurde mit EtOAc verdünnt, mit wässerigem NaOH (6 N) neutralisiert. Die Schichten wurden abgetrennt und die wässerige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und kon zentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 70/30) gereinigt, wodurch das Produkt TT als ein gelbes Öl (2,42 g, 89%) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,27 (m, 1H), 7,04-7,19 (m, 3H), 3,58 (m, 1H), 3,20 (t, 4H), 2,60 (t, 4H) und 1,25 (d, 6H); MS m/z 218 (M + H), Ber. für C₁₄H₁₉NO, 217.
Schritt 3:
Zu einer Lösung aus dem Keton TT (2,30 g, 10,6 mmol) in Ethanol (90 ml) und Wasser (20 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (8,1 g, 84,3 mmol, 8 Äquiv.) und Kaliumcyanid (1,72 g, 26,5 mmol, 2,5 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C für 18 h erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde zu Eiswasser (400 ml) zugegeben und für 30 min kräftig gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde saugfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch das Hydantoin UU als ein weißer Feststoff (2,78 g, 91% Ausbeute) erhalten wurde. MS m/z 288 (M + H), Ber. für C₁₆H₂₁N₃O₂, 287.
Schritt 4:
Zu einer Suspension aus dem Hydantoin UU (2,74 g, 9,54 mmol) in trockenem THF (100 ml) wurden Di-tert-butyldicarbonat (5,2 g, 24,24 mmol, 2,5 Äquiv.), Triethylamin (1,5 ml, 1,07 g, 10,5 mmol, 1,1 Äquiv.) und DMAP (46 mg, 0,29 mmol) nacheinander zugegeben. Etwa 15 Minuten nach der Zugabe färbte sich die Reaktion zu einer klaren gelben Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch ein Feststoff erhalten wurde, der dann in EtOAc (300 ml) aufgenommen, mit Salzlösung (3 × 30 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das rohe hellgelbe Produkt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 80/20) gereinigt, wodurch das reine Bis-Boc-hydantoin VV als ein weißer Feststoff (4,39 g, 94% Ausbeute) erhalten wurde. MS m/z 488 (M + H), Ber. für C₂₆H₃₇N₃O₆, 487.
Schritt 5:
Das Bis-Boc-hydantoin VV (2,34 g, 4,8 mmol) wurde in DME (30 ml) gelöst, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Zu dieser Lösung wurde 1 N NaOH (45 ml, 45 mmol) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, was ein ziemlich klares Gemisch ergab. HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, und mit Et₂O extrahiert. Ohne Reinigung wurde die resultierende wässerige Schicht, enthaltend 4-Amino-1-(2-isopropylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (2-iPrAPPC), mit 6 N HCl behandelt, um den pH auf 11 bis 12 einzustellen. Diese Lösung (~ 45 ml) wurde dann mit 1,4-Dioxan (45 ml) verdünnt und mit Fmoc-Cl (1,78 g, 6,89 mmol, 1,5 Äquiv.) behandelt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch Dioxan entfernt wurde, mit 1 N HCl neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc → CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt, wodurch das reine Produkt Fmoc-2-iPrAPPC als ein weißer Feststoff (1,46 g, 63% Ausbeute aus dem Bis-Boc-hydantoin) erhalten wurde. HRMS m/z 507,2263, Ber. für C₃₀H₃₂N₂O₄Na, 507,2260.
BEISPIEL 23 Herstellug von Fmoc-4-Amino-1-(3-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (Fmoc-3-MeAppc-OH) Schritt 1:
Zu einer Lösung aus 3-Iodtoluol (4,36 g, 2,6 ml, 20,0 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (6,88 g, 6,2 ml, 48,1 mmol, 2,4 Äquiv.) und Natrium-tert-butoxid (5,3 g, 55,2 mmol, 2,8 Äquiv.) in trockenem Dioxan (80 ml) wurden Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (91 mg; 0,1 mmol) und Tri-o-tolylphosphin (122 mg, 0,4 mmol) zugegeben. Die Reaktion wurde bei 90°C für 26 h erhitzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rest wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch ein braunes Öl erhalten wurde. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 zu 75/25) gereinigt, wodurch das reine Produkt WW als ein hellgelber Feststoff (3,21 g, 69%) bereitgestellt wurde.
Schritt 2:
Zu einer Lösung aus dem Ketal WW (1,25 g, 5,36 mmol) in Aceton (20 ml) wurde 6 N Salzsäure (10 ml) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Die resultierende Reaktion wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rest wurde mit EtOAc verdünnt und mit wässerigem NaOH (6 N) neutralisiert. Die Schichten wurden abgetrennt und die wässerige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und kon zentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 zu 70/30) gereinigt, wodurch das Produkt XX als ein gelbes Öl (843 mg, 83% Ausbeute) erhalten wurde. MS m/z 190 (M + H), Ber. für C₁₂H₁₅NO, 189.
Schritt 3:
Zu einer Lösung aus dem Keton XX (763 g, 4,03 mmol) in Ethanol (45 ml) und Wasser (15 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (3,09 g, 32,21 mmol, 8 Äquiv.) und Kaliumcyanid (675 mg, 10,38 mmol, 2,5 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C für l 8 h erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde zu Eiswasser (200 ml) zugegeben und für 30 min kräftig gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde saugfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch das Hydantoin YY als ein weißer Feststoff (930 mg, 89% Ausbeute) erhalten wurde. MS m/z 260 (M + H), Ber. für C₁₄H₁₇N₃O₂, 259.
Schritt 4:
Zu einer Suspension aus dem Hydantoin YY (780 mg, 3,012 mmol) in trockenem THF (22 ml) wurden Di-tert-butyl-dicarbonat (1,64 g, 7,52 mmol, 2,5 Äquiv.), Triethylamin (0,42 ml, 305 mg, 3,01 mmol, 1,0 Äquiv.) und DMAP (20 mg, 0,164 mmol) nacheinander zugegeben. Etwa 5 Minuten nach der Zugabe färbte sich die Reaktion zu einer klaren gelben Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch ein Feststoff erhalten wurde, der dann in EtOAc (300 ml) aufgenommen, mit Salzlösung (3 × 30 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das rohe hellgelbe Produkt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 80/20) gereinigt, wodurch das reine Bis-Boc-hydantoin ZZ als ein weißer Feststoff (1,37 g, quantitativ) erhalten wurde. HRMS m/z 482,2261 (M + Na), Ber. für C₂₄H₃₃N₃O₆Na, 482,2267.
Schritt 5:
Das Bis-Boc-hydantoin ZZ (1,29 g, 2,818 mmol) wurde in DME (20 ml) gelöst, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Zu dieser Lösung wurde 1 N NaOH (25 ml, 25 mmol) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, was ein ziemlich klares Gemisch ergab. HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, und mit Et₂O extrahiert. Ohne Reinigung wurde die resultierende wässerige Schicht, enthaltend 4-Amino-1-(3-methylphenyl)piperidin-4-carbonsäure (3-MeAPPC), mit 6 N HCl behandelt, um den pH auf 11 bis 12 einzustellen. Diese Lösung (30 ml) wurde dann mit 1,4-Dioxan (30 ml) verdünnt und mit Fmoc-Cl (1,46 mg, 5,65 mmol, 2,0 Äquiv.) behandelt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch Dioxan entfernt wurde, mit 1 N HCl neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt, wodurch das reine Produkt Fmoc-3-MeAPPC als ein weißer Feststoff (1,002 g, 78% Ausbeute aus dem Bis-Boc-hydantoin) erhalten wurde. HRMS m/z 479,1940 (M + Na), Ber. für C₂₈H₂₈N₂O₄Na, 479,1947.
BEISPIEL 24 Herstellung von Fmoc-4-Amino-1-(3-methoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure (Fmoc-3-MeOAppc-OH) Schritt 1:
Zu einer Lösung aus 3-Iodanisol (4,68 g, 2,4 ml, 20,0 mmol), 1,4-Dioxa-8-azaspiro[4.5]decan (6,2 ml, 6,88 g, 48,1 mmol, 2,4 Aquiv.) und Natrium-tert-butoxid (5,3 g, 55,2 mmol, 2,8 Äquiv.) in trockenem Dioxan (80 ml) wurden Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (91. mg, 0,1 mmol) und Tri-o-tolylphosphin (122 mg, 0,4 mmol) zugegeben und die Reaktion wurde bei 90°C für 26 h erhitzt. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde, und der Rest wurde mit Wasser behandelt und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch ein braunes Öl erhalten wurde. Dieses Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 95/5 zu 75/25) gereinigt, wodurch das reine Produkt AAA als ein hellgelber Feststoff (3,10 g, 62% Ausbeute) bereitgestellt wurde. MS m/z (M + H), 250 (M + H), Ber. für C₁₄H₁₉NO₃, 249.
Schritt 2:
Zu einer Lösung aus dem Ketal AAA (3,10 g, 12,45 mmol) in Aceton (90 ml) wurde 6 N Salzsäure (45 ml) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht unter Rückfluß erhitzt. Die resultierende Reaktion wurde konzentriert, wodurch das Lösungsmittel entfernt wurde. Der Rest wurde mit EtOAc verdünnt und mit wässerigem NaOH (6 N) neutralisiert. Die Schichten wurden abgetrennt und die wässerige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und kon zentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 zu 70/30) gereinigt, wodurch das Produkt BBB als ein gelbes Öl (2,53 g, 99% Ausbeute) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,20 (m, 1H), 6,58 (d, 1H), 6,39-6,56 (in, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,59 (m, 4H) und 2,58 (m, 4H).
Schritt 3:
Zu einer Lösung aus dem Keton BBB (1,81 g, 8,82 mmol) in Ethanol (60 ml) und Wasser (20 ml) in einer Glasdruckflasche wurden Ammoniumcarbonat (6,77 g, 70,52 mmol, 8 Äquiv.) und Kaliumcyanid (1,14 g, 17,6 mmol, 2,0 Äquiv.) zugegeben. Das Gemisch wurde bei 80 bis 90°C für 18 h erhitzt. Das abgekühlte Reaktionsgemisch wurde zu Eiswasser (200 ml) zugegeben und für 30 min kräftig gerührt. Der resultierende Niederschlag wurde saugfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und getrocknet, wodurch das Hydantoin CCC als ein weißer Feststoff (2,23 g, 92% Ausbeute) erhalten wurde. MS m/z 276 (M + H), Ber. für C₁₄H₁₇N₃O₃, 275.
Schritt 4:
Zu einer Suspension aus dem Hydantoin CCC (1,10 g, 4,00 mmol) in trockenem THF (50 ml) wurden Di-tert-butyl-dicarbonat (2,18 g, 10,0 mmol, 2,5 Äquiv.), Triethylamin (0,62 ml, 445 mg, 4,4 mmol, 1,1 Äquiv.) und DMAP (20 mg, 0,164 mmol) nacheinander zugegeben. Etwa 15 Minuten nach der Zugabe färbte sich die Reaktion zu einer klaren gelben Lösung und wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch ein Feststoff erhalten wurde, der dann in EtOAc (300 ml) aufgenommen, mit Salzlösung (3 × 30 ml) gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck konzentriert wurde. Das rohe hellgelbe Produkt wur de durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc, 90/10 → 80/20) gereinigt, wodurch das reine Bis-Boc-hydantoin DDD als ein weißer Feststoff (1,90 g, quantitativ) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃): 7,16 (t, 1H), 6,57 (d, 1H), 6,24 (s, 1H), 6,19 (d, 1H), 3,77 (s, 3H), 1,58 (s, 9H), 1,42 (s, 9H); MS m/z 476 (M + H), Ber. für C₂₄H₃₃N₃O₇, 475.
Schritt 5:
Das Bis-Boc-hydantoin DDD (1,06 g, 2,23 mmol) wurde in DME (20 ml) gelöst, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Zu dieser Lösung wurde 1 N NaOH (20 ml, 20 mmol) zugegeben und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, was ein ziemlich klares Gemisch ergab. HPLC zeigte die Beendigung der Reaktion. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch DME entfernt wurde, und mit Et₂O extrahiert. Ohne Reinigung wurde die resultierende wässerige Schicht, enthaltend 4-Amino-1-(3-methoxyphenyl)piperidin-4-carbonsäure (3-MeOAPPC), mit 6 N HCl behandelt, um den pH auf 11 bis 12 einzustellen. Diese Lösung (35 ml) wurde dann mit 1,4-Dioxan (35 ml) verdünnt und mit Fmoc-Cl (755 mg, 2,93 mmol, 1,3 Äquiv.) behandelt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wodurch Dioxan entfernt wurde, mit 1 N HCl neutralisiert und mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet und konzentriert. Das Rohprodukt wurde durch Flashchromatographie (Hexan/EtOAc → CH₂Cl₂/MeOH) gereinigt, wodurch das reine Produkt Fmoc-3-MeOAPPC als ein weißer Feststoff (668 mg, 63% Ausbeute aus dem Bis-Boc-hydantoin DDD) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃); 7,83 (d, 2H), 7,72 (d, 2H), 7,41 (td, 2H), 7,34 (dt, 2H), 7,16 (t, 1H), 6,52 (d, 1H), 6,42 (s, 1H), 6,36 (d, 1H), 4,25 (m, 3H), 3,68 (s, 3H), 3,23-3,40 (m, 2H), 2,96 (t, 2H) und 1,86-2,18 (m, 4H). HRMS m/z 495,1901 (M + Na), Ber. für C₂₈H₂₈N₂O₅Na, 495,1896.
BEISPIFL 25 Herstellung von Fmoc-1-Amino-4-cyclohexylcyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-Achc-OH) Schritt 1:
Ein Gemisch aus 4-Cyclohexylcyclohexanon (3,00 g, 16,6 mmol), Kaliumcyanid (1,63 g, 25,0 miml), Ammoniumcarbonat (9,59 g, 99,8 mmol), Ethanol (75 ml) und Wasser (15 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 80°C für 15 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die weiße Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur für ein paar Stunden gerührt. Die Filtration und Lufttrocknung ergaben Hydantoin EEE (6,10 g, noch naß, > 100% Ausbeute) als einen weißen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,52 (1H, breit, NH), 8,43 (1H, breites s, NH), 0,80-1,80 (20H, m). LRMS (APCI): C₁₄H₂₂N₂O₂, ber. 250; beobachtet: 249 (M – H), 251 (M + H).
Schritt 2:
Ein Gemisch aus Hydantoin EEE (1,39 g, 5,55 mmol) und 6 N Natriumhydroxidlösung (50 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 130°C für 2 Tage erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad abgekühlt, unter Verwendung konzentrierter Salzsäure auf ~ pH 7 neutralisiert. Die weiße Aufschlämmung wurde filtriert und die Niederschläge mit Wasser gespült, wodurch rohe 1-Amino-4-cyclohexylcyclohexan-1-carbonsäure (48,3 g, naß und anorganische Salze enthaltend, > 100% Ausbeute) erhalten wurde. LRMS (Elektrospray): C₁₃H₂₃NO₂, ber. 225; beobachtet: 226 (M + H)
Schritt 3:
Ein Gemisch aus roher 1-Amino-4-cyclohexylcyclohexan-1-carbonsäure (48,3 g, 5,55 mmol, theoretisch), Triethylamin (1,0 ml, 7,17 mmol), 9-Fluorenylmethylsuccinimidyl-carbonat (Fmoc-OSu, 2,43 g, 7,20 mmol) in Acetonitril (75 ml) und Wasser (75 ml) wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste des Acetonitrils entfernt wurde, auf pH ~ 3 mit 10%iger wässeriger Zitronensäurelösung angesäuert und die weiße Emulsion dreimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser, Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie (eluiert mit 1 → 5 → 8% Methanol/Methylenchlorid) gereinigt wurde, wodurch Fmoc-1-Amino-4-trans-cyclohexylcyclohexan-1-carbonsäure (250 mg, 10% Ausbeute für zwei Schritte) erhalten wurde. HRMS (FAB): C₂₈H₃₄NO₄ (M + H) ber. 448,2488; beobachtet: 448,2497.
BEISPIEL 26 Herstellung von Fmoc-1-Amino-4,4-diphenylcyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-Adpc-OH) Schritt 1:
Ein Gemisch aus 4,4-Diphenylcyclohexanon (hergestellt durch Hydrierung von 4,4-Diphenylcyclohexanon gemäß dem Verfahren von Freeman, P. K. et al. J. Org. Chem. 1989, 54, 782-789) (1,55 g, 6,19 mmol), Kaliumcyanid (0,65 g, 9,97 mmol), Ammoniumcarbonat (3,60 g, 37,5 mmol), Ethanol (48 ml) und Wasser (12 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 80°C für 24 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die weiße Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur für ein paar Stunden. gerührt. Die Filtration und Lufttrocknung ergaben Hydantoin FFF (1,89 g, 95% Ausbeute) als einen weißen Feststoff. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,57 (1H, breit, NH), 8,59 (1H, breites s, NH), 7,00-7,50 (10H, m, Phenyl). LRMS (Elektrospray): C₂₀H₂₀N₂O₂, ber. 320; beobachtet: 319 (M – H).
Schritt 2:
Ein Gemisch aus Hydantoin FFF (1,88 g, 5,87 mmol), Bariumhydroxidmonohydrat (5,60 g, 29,6 mmol) und Wasser (100 ml, zum Verdünnen!) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 105°C für 2 Tage erhitzt. Mehr Bariumhydroxidmonohydrat (5,60 g, 29,6 mmol) wurde zugegeben und das Gemisch wurde in einem Ölbad von 105°C für weitere 24 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, auf pH ~ 3 unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem kochenden Wasserbad für zwei Stunden gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert und die Niederschläge mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschungen wurden im Vakuum auf ~ 30 ml konzentriert. Die Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab weiße Niederschläge, die filtriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über Nacht getrocknet wurden, wodurch rohe 1-Amino-4,4-diphenylcyclohexan-1-carbonsäure (0,52 g, 30% Ausbeute) als ein weißer Feststoff erhalten wurde. LRMS (Elektrospray): C₁₉H₂₁NO₂, ber. 295; beobachtet: 294 (M – H), 296 (M + H).
Schritt 3:
Ein Gemisch aus roher 1-Amino-4,4-diphenylcyclohexan-1-carbonsäure (510 mg, 1,73 mmol), Triethylamin (0,37 ml, 2,65 mmol), 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 880 mg, 2,61 mmol) in Acetonitril (25 ml) und Wasser (25 ml) wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. DC-Analyse der Reaktion zeigte die Gegenwart des Ausgangsmaterials Aminosäure. 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (200 mg) und Acetonitril (5 ml) wurden zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für weitere 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste des Acetonitrils entfernt wurde, auf pH ~ 3 mit 10%iger wässeriger Zitronensäurelösung angesäuert und die weiße Emulsion wurde dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein rohes Öl, das durch Säulenchromatographie gereinigt wurde (eluiert mit 1 → 4 → 8% Methanol/Methylenchlorid), wodurch Fmoc-1-Amino-4,4-diphenylcyclohexan-1-carbonsäure (350 mg, 39% Ausbeute) als ein weißer Feststoff erhalten wurde. HRMS (FAB): C₃₄H₃₂NO₄ (M + H) ber. 518,2331; beobachtet: 518,231.
BEISPIEL 27 Herstellung von Fmoc-1-Amino-4-trans-t-butylcyclohexan-1-carbonsäure (Fmoc-Abc-OH) Schritt 1:
Ein Gemisch aus 4-t-Butylcyclohexanon (2,00 g, 13,0 mmol), Kaliumcyanid (1,27 g, 19,5 mmol), Ammoniumcarbonat (7,48 g, 77,8 mmol), Ethanol (60 ml) und Wasser (12 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 80°C für 15 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die weiße Aufschlämmung in Eiswasser gegossen und bei Raumtemperatur für ein paar Stunden gerührt. Die Filtration ergab das Hydantoin GGG (2,78 g, 96% Ausbeute) als einen weißen Feststoff, der in dem nächsten Schritt als ein Rohprodukt verwendet wurde. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 10,52 (1H, breit, NH), 8,50 (1H, breites s, NH), 0, 81 (9H, s, t-Bu).
Schritt 2:
Ein Gemisch aus Hydantoin GGG (2,78 g, 12,4 mmol), Bariumhydroxidmonohydrat (11,74 g, 62,0 mmol) und Wasser (50 ml) in einem verschlossenen, dickwandigen Druckkolben wurde in einem Ölbad von 120°C für 2 Tage erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, unter Verwendung von 4 N Schwefelsäure auf → pH 3 angesäuert, während es kräftig gerührt wurde. Die Suspension wurde in einem kochenden Wasserbad für eine Stunde gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die weiße Suspension wurde filtriert und die Niederschläge mit Wasser gespült. Die vereinigten Filtrate und Waschungen wurden im Vakuum auf → 30 ml konzentriert. Die Neutralisation mit konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung ergab weiße Niederschläge, die filtriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum über Nacht getrocknet wurden, wodurch 1-Amino-4-trans-t-butylcyclohexan-1-carbonsäure (2,10 g, 85% Ausbeute) als ein weißer Feststoff erhalten wurde.
Schritt 3:
Ein Gemisch aus roher 1-Amino-4-trans-t-butylcyclohexyl-1-carbonsäure (2,10 g, 10,54 mmol), 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu, 6,33 g, 7,20 mmol) in Dioxan (150 ml) und 10%iger Natriumcarbonatlösung (120 ml) wurde bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum konzentriert, wodurch das meiste des Dioxans entfernt wurde, mit 3 H HCl auf pH ~ 3 angesäuert und die weiße Emulsion wurde zweimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein Rohprodukt, das durch Säulenchromatographie (eluiert mit 1 → 4 → 5% Methanol/Methylenchlorid) gereinigt wurde, wodurch Fmoc-1-Amino-4-trans-t-butylcyclohexan-1-carbonsäure (1,42 g, 32% Ausbeute) erhalten wurde. HRMS (FAB): C₂₆H₃₂NO₄ (M + H) ber. 422,2331; beobachtet: 422,23.
BEISPIEL 28 Herstellung von 3S,2S-Fmoc-(L)-beta-Methyl-(Nin-Mes)tryptophan (Fmoc-(L)-β-Me(Nin-Mes)Trp-OH) Schritt 1:
Zu einer Lösung aus trans-3-Indolarylsäure (15,0 g, 0,08 mol) in 350 ml trockenem THF bei –78°C wurden langsam 125 ml 1,6 M n-BuLi in Hexan zugegeben. Die resultierende Suspension wurde bei –78°C für 1 h gerührt. Dann wurde eine Lösung aus 2-Mesitylensulfonylchlorid (21,9 g, 0,1 mol) in 50 ml trockenem THF langsam zugegeben. Das Gemisch wurde auf RT erwärmt und über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde in eine gesättigte wässerigere NH₄Cl-Lösung gegossen. Die Schichten wurden abgetrennt und die wässerige Schicht wurde mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet. Die Entfernung der Lösungsmittel ergab 14, l. g des Rohprodukts HHH, das ohne weitere Reinigung für den nächsten Schritt verwendet wurde. ¹H-NMR-Analyse zeigte, daß es 2,8 g 2-Mesitylensulfonsäure enthielt. ¹H-NMR (CD₃OD) δ 7,57 (s, 1H), 7,42 (d, 1H), 7,15-7,30 (m, 3H), 7,02 (s, 2H), 6,54 (d, 1H), 6,36 (d, 1H), 2,52 (s, 9H), 2,30 (s, 3H).
Schritt 2:
Zu einer Lösung aus N-2-Mesitylensulfonyl-trans-3-indolarylsäure (3,26 g, 8,8 mmol) in 140 ml trockenem THF bei –78°C wurden 3,7 ml (3 Äquiv.) Triethylamin und 2,17 ml (2 Äquiv.) Me₃COOCl zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei –78°C für 15 min und bei 0°C für 1,5 h gerührt. Das Gemisch wurde auf –78°C abgekühlt, zu. welchem 5,5 ml 1,6 M n-BuLi in Hexan zugegeben wurden, dann ein Gemisch aus (R)-4-Phenyl-2-oxazolidinon und n-BuLi in THF (hergestellt durch Zugabe von 11 ml. 1,6 M n-BuLi in Hexan zu einer Lösung aus (R)-4-Phenyl-2-oxazolidinon (2,87 g, 17,6 mmol) in 70 ml trockenem THF bei –78°C) durch eine Kanüle zugegeben wurde. Das resultierende Gemisch wurde bei –78°C für 2 h und bei RT über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde durch wässerige NH₄Cl-Lösung (100 ml) gequencht. Nach der Entfernung der organischen Lösungsmittel im Vakuum wurde der wässerige Rest mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (EtOAc/Hexan, 1 : 4) gereinigt wurde, wodurch das Produkt III als ein hellbrauner Gummi in 63%iger Ausbeute (2,86 g) erhalten wurde. LR-Elektrospray: C₂₉H₂₆N₂O₅S, ber.: 514 beobachtet: m/z 515 (M + H).
Schritt 3:
Zu einem Gemisch aus CuBr·Me₂S (0,84 g, 4,08 mmol) und 5 ml Dimethylsulfid in 10 ml trockenem THF bei –4°C wurden 1,36 ml 3 M CH₃MgBr in Ether zugegeben. Nach dem Rühren für 10 nun wurde das obige Produkt (1,4 g, 2,72 mmol) in 8 ml trockenem THF zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei –4°C für 1 h und bei RT für 6 h gerührt. Nach dem Abkühlen auf –78°C wurden zu dem Gemisch 1,45 g (8,16 mmol) N-Bromsuccinimid in 15 ml trockenem THF zugegeben. Das Gemisch wurde bei –78°C für 30 min und bei RT über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde in 100 ml Salzlösung gegossen und mit EtOAc (2 × 100 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (EtOAc/Hexan, 1 : 4) gereinigt wurde, wodurch das Produkt JJJ als ein hellbrauner Gummi in 46%iger Ausbeute (0,77 g) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,63 (d, 1H), 7,47 (s, 1H), 7,20-7,37 (m, 8H), 6,98 (s, 2H), 6,16 (d, 1H), 5,13 (dd, 1H), 4,49 (t, 1H), 4,17 (dd, 1H), 3,75 (dt, 1H), 2,54 (s, 9H), 2,31 (s, 3H), 1,59 (d, 3H).
Schritt 4:
Das obige Bromid JJJ (0,72 g, 1,18 mmol) wurde mit Tetra-n-butylammoniumazid (1,68 g, 5,9 mmol) und Natriumazid (77 mg, 1,18 mmol) in 10 ml Acetonitril gemischt und bei RT für 6 h gerührt. Das Gemisch wurde in 100 ml wässerige NH₄Cl-Lösung gegossen und mit EtOAc (2 × 100 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet. Die Filtration und Konzentration ergaben ein Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (EtOAc/CH₂Cl₂/Hexan, 1 : 2 : 5) gereinigt wurde, wodurch das Produkt KKK als ein hellbrauner Gummi in 82%iger Ausbeute (0,55 g) erhalten wurde. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,65 (d, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,18-7,29 (m, 8H), 6,90 (s, 2H), 5,54 (d, 1H), 5,50 (dd, 1H), 4,78 (t, 1H), 4,35 (dd, 1H), 3,62 (Quintett, 1H), 2,43 (s, 9H), 2,28 (s, 3H), 1,28 (d, 3H).
Schritt 5:
Zu einem Gemisch aus dem obigen Azid KKK (0,55 g, 0,96 mmol), Wasser (4 ml) und THF (12 ml) bei 0°C wurden 0,65 ml 30%iges H₂O₂ zugegeben, dann 48 mg (2 Äquiv.) LiOH in 1 ml Wasser zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei 0°C für 2 h gerührt. Die Reaktion wurde mit Na₂SO₃ (1 g) in 6 ml Wasser gequencht. Das Gemisch wurde bei RT für weitere 30 min gerührt. Nach dem Entfernen des organischen Lösungsmittels wurde die wässerige Lösung mit 10 ml gesättigter NaHCO₃-Lösung verdünnt und mit EtOAc (2 × 30 ml) extrahiert. Die Filtration und Konzentration ergaben ein Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (HOAc/MeOH/EtOAc, 1 : 10 : 100) gereinigt wurde, wodurch das Produkt LLL als gebrochen weißer Feststoff in 83%iger Ausbeute (0,34 g) erhalten wurde. LR-Elektrospray: C₂₁H₂₂NaO₄S, ber: 426, beobachtet: m/z 425 (M – H).
Schritt 6:
Die obige Azidosäure LLL (0,34 g, 0,8 mmol) wurde in 20 ml Methanol gelöst. Zu der Lösung wurden 170 mg 10% Pd auf Kohlenstoff zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei RT unter H₂ (Ballon) für 3 h gerührt. Nach der Filtration und Konzentration wurde das Rohprodukt in einem gemischten Lösungsmittel aus THF (12 ml) und Wasser (4 ml) gelöst. Zu dem Gemisch wurden NaHCO₃ (254 mg, 3 mmol) und Fmoc-OSu (540 mg, 1,6 mmol) zugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei RT für 18 h gerührt, mit 30 ml gesättigter NH₄Cl-Lösung verdünnt und mit EtOAc (2 × 30 ml) extrahiert. Die Filtration und Konzentration ergaben ein Rohprodukt, das durch Flashchromatographie (HOAc/MeOH/EtOAc, 1 : 10 : 100) gereinigt wurde, wodurch das Produkt 3S,2S-Fmoc-(L)-beta-Methy(Nin-Mes)tryptophan als gebrochen weißer Feststoff in 50%iger Ausbeute (0,25 g) erhalten wurde. LR-Elektrospray: C₃₆H₃₄N₂O₆S, ber.: 622, beobachtet: m/z 621 (M – H).
BEISPIEL 29
Herstellung von Fmoc-Linker-BHA-Harz
Benzhydrylamincopolystyrol-1%-Divinylbenzol-vernetztes Harz (10,0 g, 9,3 mÄquiv., 100-200 ASTM Mesh, Advanced ChemTech) wurde in 100 ml CH₂Cl₂ gequollen, filtriert und nacheinander mit jeweils 100 ml CH₂Cl₂, 6% DIPEA/CH₂Cl₂ (zweimal), CH₂Cl₂ (zweimal) gewaschen. Das Harz wurde mit p-[(R,S)-α-[1-(9H-Fluoren-9-yl)-methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyl]-phenoxyessigsäure (Fmoc-Linker) (7,01 g, 13,0 mmol), N-Hydroxybenzotriazol (2,16 g, 16,0 mmol) und Diisopropylcarbodiimid (2,04 ml, 13,0 mmol) in 1.00 ml. 25% DMF/CH₂Cl₂ für 24 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 100 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol (zweimal), DMF und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Eine Kaiser-Ninhydrin-Analyse war negativ. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 16,12 g Fmoc-Linker-BHA-Harz erhalten wurden. Ein Teil dieses Harzes (3,5 mg) wurde der Fmoc-Entschützung unterzogen und die quantitative UV-Analyse zeigte eine Beladung von 0,56 mmol/g.
BEISPIEL 30 Herstellung von Ac-Nle-Cyclo(Asp-Lys)-Asp-His-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sieben Verknüpfurgszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-His-(Trt) (600 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Nle (430 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Essigsäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Ac-Heptapeptidharz erhalten wur den. Das Ac-Heptapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulid d, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 250 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
250 mg der linearen Rohpeptide wurden in 250 ml DMF gelöst, 600 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 300 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 60 mg (15%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₀H₆₉N₁₅O₉ ber.: 1024, beobachtet: m/z (1025 M + H).
BEISPIEL 31 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Ar-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,0 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 220 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen. 220 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 53 mg (13%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₄H₇₂N₁₂O₈ ber.: 1017, beobachtet: m/z (1018 M + H).
BEISPIEL 32 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(2)Nal (530 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,1 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 220 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
240 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 55 mg (14%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₆H₇₃N₁₁O₈ ber.: 1028, beobachtet: m/z (1029 M + H).
BEISPIEL 33 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-N-methyl(2)Nal-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls l unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPFA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Zwei Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(2)Nal (530 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte.
Nach der Entfernung von Fmoc aus dem 2-Nal-Rest wurde das resultierende Amin in sein 2-Nitrobenzolsulfonylderivat unter Verwendung von 2-Nitrobenzolsulfonylchlorid (5 Äqu., 426 mg, 1,93 mmol) und DIPEA (5 Äqu.) als die Base in DMF umgewandelt. Die Waschungen wurden unter Verwendung von DMF (6 × 30 ml), gefolgt von CH₂Cl₂ (3 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Das erhaltene Sulfonamid wurde der Methylierung unter Verwendung von Triphenylphosphin (5 Äqu., 505 mg, 1,93 mmol), N,N-Diethylazodicarboxylat (5 Äqu., 303 μl, 1,93 mmol) und Methanol (10 Äqu., 156 μl, 3,85 mmol) in THF unterzogen. Die Waschungen wurden unter Verwendung von THF (6 × 30 ml), gefolgt von CH₂Cl₂ (5 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Die 2-Nitrobenzolsulfonylgruppe wurde dann unter Verwendung von 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (3 Äqu., 173 μl, 1,16 mmol), 2-Mercaptoethanol (5 Äqu., 135 μl, 1,93 mmol) in DMF entfernt. Die Waschungen wurden unter Verwendung von DMF (3 × 30 ml), Isopropanol (3 × 30 ml), gefolgt von Ethylether (3 × 30 ml) durchgeführt, und das Harz wurde unter Vakuum getrocknet. Der resultierende N-Me-2-Nal-Rest wurde vier Verknüpfungszyklen unterzogen, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 ml Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 235 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
235 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 43 mg (10%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₇H₇₅N₁₁O₈ ber.: 1042, beobachtet: m/z (1043 M + H).
BEISPIEL 34 Herstellung von Cyclo(bernsteinsäure-Lys)-bernsteinsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Bernsteinsäureanhydrid (600 mg, 6 mmol) in DMF mit 1,1 ml DIPEA erfolgte.
Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,0 g Pentapeptidharz erhalten wurden. Das Pentapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 220 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
220 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wur den zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 40 mg (11%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₄₉H₆₃N₁₁O₇ ber.: 918, beobachtet: m/z (919 M + H).
BEISPIEL 35 Herstellung von Cyclo(maleinsäure-Lys)-maleinsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Maleinsäureanhydrid (600 mg, 6 mmol) in DMF unter Zugabe von HOBT (800 mg, 6 mmol) ohne DIPEA erfolgte. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,0 g Pentapeptidharz erhalten wurden. Das Pentapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 230 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
230 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 38 mg (11%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₄₉H₆₁N₁₁O₇ ber.: 916, beobachtet: m/z (917 M + H).
BEISPIEL 36 Herstellung von Cyclo(phthalsäure-Lys)-phthalsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Phthalsäureanhydrid (660 mg, 6 mmol) in DMF mit 1,1 ml DIPEA erfolgte.
Das Harz wurde filtriert und nacheinander jeweils mit 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,0 g Pentapeptidharz erhalten wurden. Das Pentapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert. und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 220 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
220 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 35 mg (10%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₃H₆₃N₁₁O₇ ber.: 966, beobachtet: m/z (967 M + H).
BEISPIEL 37 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-OHApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-OHApc (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,1 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 225 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
225 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 55 mg (13%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₄H₇₂N₁₂O₉ ber.: 1033, beobachtet: m/z (1034 M + H).
BEISPIEL 38 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-MeOApc (600 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,1 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 235 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
235 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurde zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule gereinigt (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 49 mg (12%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₅H₇₄N₁₂O₉ ber.: 1047, beobachtet: m/z (1048 M + H).
BEISPIEL 39 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-EtOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-EtOApc (640 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 235 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
235 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurde zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch. analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 60 mg (14%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₆H₇₆N₁₂O₉ ber.: 1061, beobachtet: m/z (1062 M + H).
BEISPIEL 40 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-iPrOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-iPrOApc (660 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 260 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
260 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurde zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurde zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. l 0 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 63 mg (15%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₇H₁₈N₁₂O₉ ber.: 1075, beobachtet: m/z (1076 M + H).
BEISPIEL 41 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-3-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-3-MeOApc (600 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,1 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit gewaschen ~ 2 ml TFA und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 235 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
235 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMP gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule gereinigt (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 49 mg (12%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₅H₇₄N₁₂O₉ ber.: 1047, beobachtet: m/z (1048 M + H).
BEISPIEL 42 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-ClApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-ClApc (560 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,0 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurde.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 230 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
230 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurde zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch. wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min; einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 49 mg (12%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₄H₇₄N₁₂O₈Cl; ber.: 1051, beobachtet: m/z (1052 M + H).
BEISPIEL 43 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol); Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-MeApc (590 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 240 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung oline Reinigung unterzogen.
240 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurde zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 55 mg (14%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₅H₇₄N₁₂O₈ ber.: 1031, beobachtet: m/z (1032 M + H).
BEISPIEL 44 Herstellung von Penta-cyclo(Glu-Lys)-Glu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Glu-(OBut) (510 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,1 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 255 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
255 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TPA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 60 mg (15%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch. die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₅H₇₄N₁₂O₈ ber.: 1031, beobachtet: m/z (1032 M + H).
BEISPIEL 45 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Orn)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Orn-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Orn-(Boc) (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,15 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 240 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
240 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurde zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 53 mg (13%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₃H₇₀N₁₂O₈ ber.: 1003, beobachtet: m/z (1004 M + H).
BEISPIEL 46 Herstellung von Penta-cyco(Asp-Dbr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dbr-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Dbr-(Boc) (540 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit. jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,10 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 220 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
220 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1.% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch. 35 mg (9%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₂H₆₈N₁₂O₈ ber.: 989, beobachtet: m/z (990 M + H).
BEISPIEL 47 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Dpr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Dpr-(Boc) (530 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,0 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 200 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
200 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule gereinigt (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 30 mg (8%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₁H₆₆N₁₂O₈ ber.: 975, beobachtet: m/z (976 M + H).
BEISPIEL 48 Herstellung von Ac-cyclo(Asp-Dpr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Dpr-(Boc) (530 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Essigsäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,1 g Acetylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Acetylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 200 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid. wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
210 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde. DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 28 mg (8%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₄₈H₆₀N₁₂O₈ ber.: 933, beobachtet: m/z (934 M + H).
BEISPIEL 49 Herstellung von Cyclo(phthalsäure-Dpr)-phthalsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Dpr-(Boc) (530 mg, 1,2 mmol) und. HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Phthalsäureanhydrid (660 mg, 6 mmol) in DMF mit 1,1 ml DIPEA erfolgte. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,0 g Pentapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 220 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
220 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 30 mg (8%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₀H₅₇N₁₁O₇ ber.: 924, beobachtet: m/z (925 M + H).
BEISPIEL 50 Herstellung von Cyclo(bernsteinsäure-Dpr)-bernsteinsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Dpr-(Boc) (530 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Bernsteinsäureanhydrid (600 mg, 6 mmol) in DMF mit 1,1 ml DIPEA erfolgte. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,0 g Pentapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 220 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
220 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion. gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 31 mg (8%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₄₆H₅₇N₁₁O₇ ber.: 876, beobachtet: m/z (877 M + H).
BEISPIEL 51 Herstellung von Cyclo(maleinsäure-Dpr)-maleinsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurden der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Dpr-(Boc) (530 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Maleinsäureanhydrid (600 mg, 6 mmol) in DMF unter Zugabe von HOBT (800 mg, 6 mmol) ohne DIPFA erfolgte. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,0 g Pentapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 230 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
230 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 28 mg (8%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₄₆H₅₅N₁₁O₇ ber.: 874, beobachtet: m/z (875 M + H).
BEISPIEL 52 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Cit (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,3 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 300 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
300 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl. N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule gereinigt (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 80 mg (20%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₄H₇₁N₁₁O₉ ber.: 1018, beobachtet: m/z (1019 M + H).
BEISPIEL 53 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Ala (380 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,4 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 330 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
330 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule gereinigt (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 87 mg (20%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₁H₆₅N₉O₈ ber.: 932, beobachtet: m/z (933 M + H).
BEISPIEL 54 Herstellung von Ac-Nle-cyolo(Cys-Cys)-Cys-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sieben Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Cys-(Trt) (710 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (460 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Cys-(Trt) (710 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Nle (430 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. und mit 1 ml Essigsäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Ac-Heptapeptidharz erhalten wurden.
Das Ac-Heptapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohpro dukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 250 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden.
Dieses lineare Rohpeptide wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 45 mg gereinigte lineares Peptid erhalten wurden.
Das gereinigte lineare Peptid wurde in 2 ml DMSO gelöst, mit 500 ml Wasser verdünnt und der pH wurde mit NH₄OH auf 8,0 eingestellt. O₂ wurde durch die Lösung hindurchgeperlt und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 24 bis 48 Stunden beendet. Die Lösung wurde lyophilisiert und das Material in CH₃COOH gelöst und präparativer HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) unterzogen und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 20 mg (4,7%) gereinigtes cyclisches Peptid erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₃H₇₀N₁₂O₈S₂ ber.: 1067, beobachtet: m/z (1068 M + H).
BEISPIEL 55 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-(D,L)-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D,L)-Atc (510 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,15 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 245 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
250 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 55 mg (14%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₂H₆₈N₁₂O₈ ber.: 989, beobachtet: m/z (990 M + H).
BEISPIEL 56 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ (Peak 1)
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (120 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Br-(D,L)Atc (620 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,1 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 240 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 240 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
240 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch. HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der erste Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 26 mg (6%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₂H₆₇N₁₂O₈Br ber.: 1068, beobachtet: m/z (1069 M + H).
BEISPIEL 57 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ (Peak 2)
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Br-(D,L)Atc (620 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg; 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,1 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 240 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 240 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
240 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der zweite Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 20 mg (5%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₂H₆₇N₁₂O₈Br ber.: 1068, beobachtet: m/z (1069 M + H).
BEISPIEL 58 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ (Peak 1)
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Cl(D,L)Atc (560 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 250 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
250 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der erste Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 24 mg (6%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₂₂H₆₇N₁₂O₈Cl ber.: 1024, beobachtet: m/z (1025 M + H).
BEISPIEL 59 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ (Peak 2)
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Cl-(D,L)Atc (560 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden. Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 250 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
250 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der zweite Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 20 mg (4%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₂H₆₇N₁₂O₈Cl ber.: 1024, beobachtet: m/z (1025 M + H).
BEISPIEL 60 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-MeO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-MeO-(D,L)Atc (600 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 1.00 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 250 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten. wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
250 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 55 mg (13%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₃H₇₀N₁₂O₉ ber.: 1019, beobachtet: m/z (1020 M + H).
BEISPIEL 61 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-EtO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-EtO-(D,L)Atc (620 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,3 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 260 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
260 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 58 mg (13%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₄H₇₂N₁₂O₉ ber.: 1033, beobachtet: m/z (1034 M + H).
BEISPIEL 62 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-iPrO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-iPrO-(D,L)Atc (620 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 250 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
250 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 58 mg (13%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₅H₇₄N₁₂O₉ ber. 1047, beobachtet: m/z (1048 M + H).
BEISPIEL 63 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-Me-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Me-(D,L)Atc (590 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 260 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
260 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 62 mg (13%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₃H₇₀N₁₂O₈ ber.: 1003, beobachtet: m/z (1004 N + H).
BEISPIEL 64 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-Et-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfun gen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Et-(D,L)Atc (600 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,3 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 245 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
245 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 55 mg (12%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₄H₇₂N₁₂O₈ ber.: 1017, beobachtet: m/z (1018 M + H).
BEISPIEL 65 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-iPr-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-iPr-(D,L)Atc (600 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgt. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus.
Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 245 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
245 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und. das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 54 mg (13%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₅H₄₄N₁₂O₈ ber.: 1031, beobachtet: m/z (1032 M + H).
BEISPIEL 66 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂ (Peak 1)
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfun gen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Cit (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Br-(D,L)Atc (620 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll. 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 240 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 260 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
240 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der erste Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 24 mg (5,6%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₂H₆₆N₁₁O₉Br ber.: 1069, beobachtet: m/z (1070 M + H).
BEISPIEL 67 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂ (Peak 2)
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Cit (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Br-(D,L)Atc (620 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,1 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 240 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 240 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
240 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden. zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule gereinigt (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der zweite Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 22 mg (4,8%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₂H₆₆N₁₁O₉Br ber.: 1069, beobachtet: m/z (1070 M + H).
BEISPIEL 68 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂ (Peak 1)
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Cit (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Cl-(D,L)Atc (560 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 245 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
245 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der erste Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 22 mg (5,8%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₂H₆₆N₁₁O₉Cl ber.: 1024, beobachtet: m/z (1025 M + H).
BEISPIEL 69 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂ (Peak 2)
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Cit (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Cl-(D,L)Atc (560 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohpro dukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 250 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
250 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgesehwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der zweite Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 20 mg (5,4%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₂H₆₆N₁₁O₉Cl ber.: 1024, beobachtet: m/z (1025 M + H).
BEISPIEL 70 Herstellung von Ac-Nle-cyclo(Cys-Cys)-Cys-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sieben Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Cys-(Trt) (710 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D,L)Atc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Cys-(Trt) (710 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Nle (430 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Essigsäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,0 g Ac-Heptapeptidharz erhalten wurden.
Das Acetylheptapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen, und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 240 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden.
Dieses lineare Rohpeptid wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 55 mg gereinigtes lineares Peptid erhalten wurden.
Das gereinigte lineare Peptid wurde in 2 ml DMSO gelöst, mit 500 ml Wasser verdünnt und der pH wurde mit NH₄OH auf pH 8,0 eingestellt. 0₂ wurde durch die Lösung hindurchgeperlt und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 24 bis 48 Stunden beendet. Die Lösung wurde lyophilisiert und das Material in CH₃COOH gelöst und wurde präparativer HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) unterzogen und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 20 mg (5,0%) gereinigtes cyclisches Peptid erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₁H₆₆N₁₂O₈S₂ ber.: 1039, beobachtet: m/z (1040 M + H).
BEISPIEL 71 Herstellung von Penta-cyclo(Cys-Cys)-Cys-5-Br(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sieben Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Cys-(Trt) (710 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und. HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-BrAtc (620 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Cys-(Trt) (710 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 1 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,1 g Ac-Heptapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 240 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden.
Dieses lineare Rohpeptid wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von. 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 50 mg gereinigtes lineares Peptid erhalten wurden.
Das gereinigte lineare Peptid wurde in 2 ml DMSO gelöst, mit 500 ml Wasser verdünnt und der pH wurde mit NH₄OH auf pH 8,0 eingestellt. 0₂ wurde durch die Lösung hindurchgeperlt und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 24 bis 48 Stunden beendet. Die Lösung wurde lyophilisiert und das Material in CH₃COOH gelöst und wurde präparativer HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) unterzogen und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 22 mg (5,2%) gereinigtes cyclisches Peptid erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₄₈H₆₀N₁₁O₇S₂Br ber.: 1047, beobachtet: m/z (1048 M + H).
BEISPIEL 72 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Appc (550 mg 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohpro dukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 245 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
245 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 57 mg (14%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₃H₇₁N₁₃O₃ ber.: 1018, beobachtet: m/z (1019 M + H).
BEISPIEL 73 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-2-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BRA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-2-MeAppc (570 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 250 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
250 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 61 mg (15%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₄H₇₃N₁₃O₈ ber.: 1032, beobachtet: m/z (1033 M + H).
BEISPIEL 74 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-2-iPrAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 g, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-2-iPrAppc (600 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohpro dukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 245 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
245 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurde zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 52 mg (14%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₆H₇₇N₁₃O₈ ber.: 1060, beobachtet: m/z (1061 M + H).
BEISPIEL 75 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-3-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-3-MeAppc (570 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 248 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
248 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 55 mg (14%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₄H₇₃N₁₃O₈ ber.: 1032, beobachtet: m/z (1033 M + H).
BEISPIEL 76 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-MeAppc (570 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 254 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
254 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 57 mg (14%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₄H₇₃N₁₃O₈ ber.: 1032, beobachtet: m/z (1033 M + H).
BEISPIEL 77 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-ClAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-ClAppc (580 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll l. geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 250 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
250 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 55 mg (14%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₃H₇₀N₁₃O₈Cl ber.: 1032, beobachtet: m/z (1033 M + H).
BEISPIEL 78 Herstellung von Penta-cycl(Asp-Lys)-Asp-4-PhOAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-PhOAppc (650 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 270 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
270 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 58 mg (13%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₉H₇₅N₁₃O₉ ber.: 1110, beobachtet: m/z (1111 M + H).
BEISPIEL 79 Herstellung von Penta-(Asp-Lys)-Asp-3-MeO-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-3-MeOAppc (580 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,2 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 250 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
250 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 54 mg (13%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₄H₇₃N₁₃O₉ ber.: 1048, beobachtet: m/z (1049 M + H).
BEISPIEL 80 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-Adpc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Adpc (620 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,1 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 1 O ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 242 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
242 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch. analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 48 mg (11%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₆₀H₇₆N₁₂O₈ ber.: 1093, beobachtet: m/z (1094 M + H).
BEISPIEL 81 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Achc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Achc (560 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,1 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 250 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
250 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 52 mg (13%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray: C₅₄H₇₈N₁₂O₈ ber.: 1023, beobachtet: m/z (1024 M + H).
BEISPIEL 82 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Abc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Abc (530 mg, 1,2 mmol) und HBTU (45 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 13 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur für 180 min behandelt. Das Harz wurde abfiltriert, mit ~ 2 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 255 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
255 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 58 mg (14%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₂H₇₆N₁₂O₈ ber.: 997, beobachtet: m/z (998 M + H).
BEISPIEL 83 Herstellung von Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2S,3S)beta-methyl-Trp-Lys-NH₂
Das Fmoc-Linker-BHA-Harz (720 mg, 0,4 mmol) aus Beispiel 29 wurde der Festphasensynthese unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls 1 unterzogen. Alle Verknüpfungen wurden unter Verwendung von HBTU in DMF als Verknüpfungsmittel und DIPEA (3 Äquiv.) als Base durchgeführt. Sechs Verknüpfungszyklen wurden durchgeführt, wobei jeweils ein Zyklus mit Fmoc-Lys-(Boc) (565 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(2S,3S)beta-Methyl-(rMes)Trp (616 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg-(Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp-(OBut) (500 mg, 1,2 mmol) und HBTU (452 mg, 1,2 mmol) erfolgte. Das Peptidharz wurde durch die Schritte 1 bis 5 von Protokoll 1 geführt, mit CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen und mit 2 ml Valeriansäureanhydrid in 6% DIPEA/CH₂Cl₂ für 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde filtriert und nacheinander mit jeweils 50 ml CH₂Cl₂ (zweimal), Isopropanol und CH₂Cl₂ (dreimal) gewaschen. Das Harz wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 1,0 g Pentylhexapeptidharz erhalten wurden.
Das Pentylhexapeptidharz wurde mit 100 μl Ethandithiol, 100 μl Dimethylsulfid, 250 μl Anisol und 10 ml HF bei 0°C für 60 min behandelt. HF wurde eingedampft und das Harz wurde mit Ethylacetat gewaschen, abfiltriert, mit ~ 5 ml TFA gewaschen und die Filtrate fielen in abgekühltem Ethylether aus. Die Niederschläge wurden zentrifugiert und die Etherschicht dekantiert. Der Rest wurde mit zwei oder drei Volumen Et₂O gewaschen und wieder zentrifugiert und das lineare Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet, wodurch 180 mg eines gebrochen weißen Feststoffes erhalten wurden. Das Rohpeptid wurde der Cyclisierung ohne Reinigung unterzogen.
180 mg der linearen Rohpeptide wurden in 220 ml DMF gelöst, 500 μl N-Methylmorpholin wurden zugegeben, wodurch ein scheinbarer pH von 8,0 erhalten wurde. 280 mg BOP wurden zugegeben und die Cyclisierung wurde durch HPLC überwacht. Typischerweise wurde die Cyclisierung innerhalb von 18 bis 24 Stunden beendet. 10 ml Wasser wurden zugegeben, wodurch die Reaktion gestoppt wurde, DMF wurde im Vakuum eingedampft und das resultierende Reaktionsgemisch wurde durch HPLC gereinigt.
Dieses rohe cyclische Material wurde durch präparative HPLC auf einer Vydac-C18-Säule (2,5 × 20 cm) gereinigt und mit einem linearen Gradienten von 20 bis 60% B (Puffer A: 0,1% TFA/H₂O, Puffer B: 0,1% TFA/CH₃CN) in 90 min, einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min, einer Detektion von 280 nm eluiert. Der Hauptpeak wurde durch analytische HPLC-Analyse der gesammelten Fraktionen abgetrennt, zusammengefaßt und lyophilisiert, wodurch 40 mg (10%) eines weißen, amorphen Pulvers erhalten wurden. Diese Verbindung war durch die HPLC homogen. LR-Elektrospray C₅₅H₇₄N₁₂O₈ ber.: 1031, beobachtet: m/z (1032 M + H).
Beispiele der biologischen Aktivität:
Beispiel A: Agonistenassay
Verfahren
Beschreibung: HEK-293-Zellen, transfektiert mit entweder dem MC-4-Rezeptor oder MC-1-Rezeptor, wuchsen in 96-Lochplatten heran. Die Zellen wurden mit entweder 100 nM NDP-αMSH oder Screening-Verbindungen stimuliert. Cyclisches AMP wurde aus den Zellen extrahiert, und Konzentrationen wurden unter Verwendung eines Biotrak-cAMP-SPA-Assays bestimmt. Agonisten wurden als die Verbindungen identifiziert, die eine Erhöhung an cAMP hervorrufen.
Zellkultur: HEK-293-Zellen, transfektiert mit entweder dem MC-4-Rezeptor oder MC-1-Rezeptor, wurden in 75-cm²-Kolben in D-MEM, ergänzt mit 10% FKS und 500 μg/ml G418, kultiviert. Die Zellen wurden trypsinisiert und 1 : 3 in flachen, Gewebekultur-behandelten 96-Lochplatten aufgeteilt. Die Zellen. wurden bei Konfluenz (Tag 2-4) stimuliert.
cAMP-Reaktion: Verbindungen, nacheinander verdünnt in 100% DMSO, wurden weiter 1 : 200 (2,5 μl Verbindungsverdünnung + 500 μl Medien) in D-MEM, enthaltend 10% FBS und 0,1 mM IBMX, verdünnt. Für nicht stimulierte Zellen wurden 2,5 μl DMSO zu 500 μl Medien zugegeben. Für NDP-αMSH-stimulierte Zellen wurden 2,5 μ1 20 μM NDP-αMSH in 100% DMSO zu 500 μl Medien (Endkonz. 100 nM) zugegeben. Die Endkonzentration von DMSO in allen Löchern betrug 0,5%.
Anmerkung: Jede Probe wurde in zweifacher Ausfertigung auf separaten Platten durchgeführt.
Kulturmedium wurde aus konfluenten 96-Lockkulturplatten entfernt und durch 200 μl der obigen Verdünnungen in den entsprechenden Löchern ersetzt. Die Platten wurden 1 h bei RT inkubiert. Die Medien wurden entfernt und die Platten wurden 1 × mit 200 μl/Loch von PBS gewaschen. cAMP wurde durch Zugabe von 60 μl 70%igem Ethanol (gelagert im Kühlschrank) extrahiert. Nach einem Extraktionszeitraum von 30 min wurden 10 μl Ethanolextrakt zu der cAMP-Assayplatte überführt oder die Proben wurden bei –20°C gelagert, bis der cAMP-Assay durchgeführt wurde.
cAMP-Assay: Die extrahierten Proben und alle in dem Kit enthaltenen Reagenzien wurden auf Raumtemperatur gebracht. Zu einer 96-Loch-OptiPlate wurden 10 μl Ethanolextrakt, 40 μl Assaypuffer, 50 μl [125I]cAMP, 50 μl Antiserum und 50 μl SPA-Kügelchen zugegeben. Das gesamte Lochvolumen nach der Zugabe betrug 200 μl. Die Platten wurden versiegelt und für 15 bis 20 h bei Raumtemperatur inkubiert. [125I]cAMP-Bindung an die SPA-Kügelchen wurde durch Impulszählung jeder Platte für 2 Minuten auf einem Packard Top-Count^TM bestimmt.
Anmerkung: Jede Platte enthielt Proben der Kontrolle für nicht stimulierte Zellen und NDP-αMSH für stimulierte Zellen.
Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle I gezeigt.
Tabelle I
Beispiel B:
Injektionslösungen können die folgende Zusammensetzung haben:

Verbindung der Formel I 3,0 mg

Gelatine 150,0 mg

Phenol 4,7 mg

Wasser für Injektionslösungen ad 1,0 ml

Claims

Verbindung der Formel:
worin R¹ und R¹² zusammen mit X und Y einen Phenylring bilden und X C ist und Y C ist, oder R¹ Wasserstoff,
ist und R¹² Wasserstoff ist, wobei X und Y jeweils C sind und die Bindung zwischen X und Y eine Doppelbindung ist, oder X und Y jeweils CH sind und die Bindung zwischen X und Y eine Einzelbindung ist; R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen oder Alkinyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; R¹⁴ Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; n 0 oder 1 ist; und Q
ist, worin R³, R⁴ und R⁵ unabhängig Wasserstoff, Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Hydroxy oder Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, worin, wenn R⁴ nicht Wasserstoff ist, R³ und R⁵ beide Wasserstoff sind; und R⁶ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, Phenoxy oder Halogen ist; R¹¹ und R¹³ jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 3 oder 4 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen sind, oder R¹¹ und R¹³ beide Phenyl sind; R⁷ O oder NH ist; R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; R⁹
ist; R¹⁰ Wasserstoff oder Methyl ist; p 0 oder 1 ist; m 0, 1, 2 oder 3 ist; und Z
oder -S-S- ist und R¹⁷ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, und pharmazeutisch akzeptable Salze davon.
Verbindung der Formel:
worin R¹ und R¹² zusammen mit X und Y einen Phenylring bilden und X C ist und Y C ist, oder R¹ Wasserstoff,
ist und R¹² Wasserstoff ist, wobei X und Y jeweils C sind und die Bindung zwischen X und Y eine Doppelbindung ist, oder X und Y jeweils CH sind und die Bindung zwischen X und Y eine Einzelbindung ist; R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen oder Alkinyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; R¹⁴ Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; n 0 oder 1 ist; R³, R⁴ und R⁵ unabhängig Wasserstoff, Halogen, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Hydroxy oder Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind, worin, wenn R⁴ nicht Wasserstoff ist, R³ und R⁵ beide Wasserstoff sind; R⁷ O oder NH ist; R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; R⁹
ist; R¹⁰ Wasserstoff oder Methyl ist; p 0 oder 1 ist; m 0, 1, 2 oder 3 ist; und Z
oder -S-S- ist und R¹⁷ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, und pharmazeutisch akzeptable Salze davon.
Verbindung nach Anspruch 2, worin X und Y jeweils CH sind und die Bindung zwischen X und Y eine Einzelbindung ist; Z
ist; R⁷ O ist; R¹
ist, R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; und R¹⁰ und R¹² beide Wasserstoff sind.
Verbindung nach Anspruch 3, wobei die Verbindung Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 2, worin Z
ist; R⁷ NH ist; R¹ Wasserstoff,
ist und R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; und R¹⁰ und R¹² beide Wasserstoff sind und n und R¹⁴ wie in Anspruch 2 definiert sind.
Verbindung nach Anspruch 5, worin X und Y jeweils CH sind und die Bindung zwischen X und Y eine Einzelbindung ist; n 0 ist; und R⁹
ist.
Verbindung nach Anspruch 6, wobei die Verbindung Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Lys-NH₂ oder Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-N-methyl(2)Nal-Lys-NH₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 5, worin Z
ist; R⁷ NH ist; R¹
ist; R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist und R¹⁰ und R¹² beide Wasserstoff sind; R⁹
ist und R¹⁷ wie in Anspruch 2 definiert ist.
Verbindung nach Anspruch 5, worin X und Y jeweils CH sind und die Bindung zwischen X und Y eine Einzelbindung ist; und einer von R³, R⁴ und R⁵ Wasserstoff, Halogen oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist und die restlichen Wasserstoff sind.
Verbindung nach Anspruch 9, wobei die Verbindung Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Penta-cyclo(Glu-Lys)-Glu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Penta-cyclo(Asp-Orn)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Orn-NH₂, Penta-cyclo(Asp-Dbr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dbr-NH₂, Renta-cyclo(Asp-Dpr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂ oder Ac-cyclo(Asp-Dpr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 8, worin X und Y jeweils CH sind und die Bindung zwischen X und Y eine Einzelbindung ist und
ist; einer von R³, R⁴ und R⁵ Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist und die restlichen Wasserstoff sind und n 0 ist.
Verbindung nach Anspruch 11, wobei die Verbindung Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-EtOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-iPrOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-3-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-OHApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ oder Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-ClApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 8, worin jeder von R¹, R³, R⁴, R⁵, R⁸ und R¹⁰ Wasserstoff ist; R⁷ NH ist; R⁹
ist; p 0 ist und R¹⁷ wie in Anspruch 2 definiert ist.
Verbindung nach Anspruch 13, wobei die Verbindung Cyclo(Bernsteinsäure-Lys)-Bernsteinsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Cyclo(Maleinsäure-Lys)-Maleinsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Cyclo(Bernsteinsäure-Dpr)-Bernsteinsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂ oder Cyclo(Maleinsäure-Dpr)-Maleinsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 2, worin R¹ und R¹² zusammen mit X und Y einen Phenylring bilden.
Verbindung nach Anspruch 15, wobei die Verbindung Cyclo(Phthalsäure-Lys)-Phthalsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ oder Cyclo(Phthalsäure-Dpr)-Phthalsäure-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂ oder Ac-Nle-cyclo(Cys-Cys)-Cys-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂ ist.
Verbindung der Formel
worin R¹ Wasserstoff,
ist; R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen oder Alkinyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; R¹⁴ Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; n 0 oder 1 ist; R⁶ Wasserstoff, Alkyl mit l bis 3 Kohlenstoffen, Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffen, Phenoxy oder Halogen ist; R⁷ O oder NH ist; R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; R⁹
ist; R¹⁰ Wasserstoff oder Methyl ist; p 0 oder 1 ist; m 0, 1, 2 oder 3 ist; und Z
oder -S-S ist und R¹⁷ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist und pharmazeutisch akzeptable Salze davon.
Verbindung nach Anspruch 17, worin Z
ist; R⁷ NH ist; R¹
ist; R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; R⁸ und R¹⁰ jeweils Wasserstoff sind und R⁹
ist und R17 wie in Anspruch 2 definiert ist.
Verbindung nach Anspruch 18, worin R⁶ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoff atomen ist.
Verbindung nach Anspruch 19, wobei die Verbindung Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-2-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-2-iPrAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Penta-cycto(Asp-Lys)-Asp-3-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ oder Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 17, worin R⁶ Halogen ist.
Verbindung nach Anspruch 21, wobei die Verbindung Penta-cydo(Asp-Lys)-Asp-4-ClAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 20, worin R⁶ Alkoxy oder Phenoxy ist.
Verbindung nach Anspruch 23, wobei die Verbindung Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-PhOAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ oder Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-3-MeO-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ ist.
Verbindung der Formel:
worin R¹ Wasserstoff,
ist; R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen oder Alkinyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; R¹⁴ Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; n 0 oder 1 ist; R¹¹ und R¹³ jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl mit 3 oder 4 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen ist, oder R¹¹ und R¹³ beide Phenyl sind; R⁷ O oder NH ist; R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; R⁹
ist; R¹⁰ Wasserstoff oder Methyl ist; p 0 oder 1 ist; m 0, 1, 2 oder 3 ist; und
oder -S-S- ist; und R¹⁷ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist und pharmazeutisch akzeptable Salze davon.
Verbindung nach Anspruch 25, worin Z
ist; R⁷ NH ist; R¹
ist; R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; R⁸ und R¹⁰ jeweils Wasserstoff sind und R⁹
ist und R¹⁷ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.
Verbindung nach Anspruch 26, worin einer von R¹¹ und R¹³ Alkyl mit 3 oder 4 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen ist und der andere Wasserstoff ist.
Verbindung nach Anspruch 27, wobei die Verbindung Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Achc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ oder Renta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Abc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 26, worin einer von R¹¹ und R¹³ Phenyl ist und der andere Wasserstoff oder Phenyl ist.
Verbindung nach Anspruch 29, wobei die Verbindung Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-4-Adpc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ ist.
Verbindung der Formel:
worin R¹ Wasserstoff,
ist; R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Alkenyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen oder Alkinyl mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; R¹⁴ Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; n 0 oder 1 ist; einer von R³, R⁴, R⁵ und R⁶ Wasserstoff, Halogen, Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist und die restlichen Wasserstoff sind; R⁷ O oder NH ist; R⁸ Wasserstoff oder Methyl ist; R⁹
ist; R¹⁰ Wasserstoff oder Methyl ist; p 0 oder 1 ist; m 0, 1 2 oder 3 ist und
oder -S-S- ist; R¹⁷ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist und pharmazeutisch akzeptable Salze davon.
Verbindung nach Anspruch 31, worin Z
ist; R¹
ist; R² Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen ist; R³, R⁴, R⁵, R⁸ und R¹⁰ jeweils Wasserstoff sind; R⁶ Wasserstoff, Halogen, Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist und R⁹
ist; und R¹⁷ wie in Anspruch 31 definiert ist.
Verbindung nach Anspruch 32, worin R⁷ NH ist.
Verbindung nach Anspruch 32, worin R⁶ Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist.
Verbindung nach Anspruch 34, wobei die Verbindung Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-(D,L)-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-5-Me-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-5-Et-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ oder Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-5-iPr-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ ist.
Verbindung nach den Ansprüchen 31 bis 33, worin R⁶ Halogen ist.
Verbindung nach Anspruch 36, wobei die Verbindung Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ oder Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ ist.
Verbindung nach den Ansprüchen 31 bis 33, worin R⁶ Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist.
Verbindung nach Anspruch 38, wobei die Verbindung Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-5-MeO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-5-EtO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ oder Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-5-iPrO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ ist.
Verbindung nach den Ansprüchen 31 oder 32, worin R⁷ O ist und R⁶ Halogen ist.
Verbindung nach Anspruch 40, wobei die Verbindung Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂ oder Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂ ist.
Verbindung nach Anspruch 31, worin Z -S-S- ist; R¹
ist; R³, R⁴; R⁵, R⁸ und R¹⁰ Wasserstoff sind; R⁶ Wasserstoff oder Halogen ist; R⁷ NH ist; R⁹
ist; worin R¹⁷ wie oben ist.
Verbindung nach Anspruch 42, wobei die Verbindung Ac-Nle-cyclo(Cys-Cys)-Cys-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂, Penta-cyclo(Cys-Cys)-Cys-5-Br(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂, Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH₂ oder Penta-cyclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2S,3S)-beta-methyl-Trp-Lys-NH₂ ist.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel:
worin R¹ bis R¹², m, p, Q, X, Y und Z wie in den Ansprüchen 1 bis 43 definiert sind, durch die Bildung einer Lactambindung oder einer Disulfidbindung an der Z-Stellung der linearen Präkursorpeptide.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 43 und einen therapeutisch inerten Träger.
Verwendung von Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 43 zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit der Melanocortin-4-Rezeptoraktivität verbunden sind.
Verwendung nach Anspruch 46, worin die Krankheit Fettleibigkeit ist.
Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 43 zur Verwendung als therapeutische Wirkstoffe, insbesondere als therapeutische Wirkstoffe zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit dem Melanocortin-4-Rezeptor verbunden sind.