CZ2003584A3 - Selektivní cyklické peptidy - Google Patents

Description

Oblast techniky

Obezita je ve vyspělých zemích všeobecně považována za závažný zdravotní problém a ve Spojených státech amerických dosáhla epidemických rozměrů. Usuzuje se, že více než 50 % obyvatel USA je postiženo nadváhou, přičemž více než 25 % obyvatelstva bylo diagnostikováno jako klinicky obézní. Riziko nemocí srdce, na inzulinu nezávislého diabetes mellitus (NIDDM), hypertenze a určitých typů nádorových onemocnění je u této části populace velmi vysoké. Tato epidemie představuje pro zdravotnictví nemalou zátěž, neboť se odhaduje, že v samotných USA přesahují prostředky každoročně vynaložené na boj s obezitou částku 70 mld USD. Strategie pro léčení obezity zahrnují snižování příjmu potravy a podporování výdeje energie u postižených osob.

Bylo prokázáno, že po vstříknutí cyklického heptapeptidového analogu amelanocytového stimulačního hormonu (oMSH), vykazujícího agonistický účinek na melanokortin-4-receptor (MC4-R), do třetí mozkové komory nebo po jeho intraperitoneálním podání dochází u myší k dlouhodobé inhibicí přijímání potravy. Tento účinek byl reverzibilní při současném podání s MC4-R antagonistou. (Fan, a kol., „Nátuře“, 1997, 386: str. 165-168). Použití sloučenin s agonistickým účinkem na MC4-R by tudíž bylo výhodné při léčení nebo prevenci obezity.

Je známo 5 příbuzných melanokortinových receptorů. Sekvenční homologie mezi jednotlivými členy je v rozmezí od 35 do 60 % (Cone, a kol. „Rec.Prog.Hormone Res.“, 1996, 51: str. 287-318), ale tyto receptory se liší ve své funkci. Například MC1-R je G-proteinový zdvojený receptor regulující pigmentaci v odezvě na ceMSH, což je silný agonista MC1-R (Cone, a kol., ibiď). Agonismus MC1-R receptoru vede ke stimulaci melanocytů způsobenou . . . ..··· ·· · • ······· ·· ··· · ·· · ···· ···

.. · ........

eumelaninem, a zvyšuje riziko rakoviny kůže. Agonismus MC1-R může mít také neurologické účinky. Stimulace MC2-R aktivity může vést ke karcinomu tkáně nadledvin. Agonistické účinky MC3-R a MC5-R nejsou doposud známy. Všechny melanokortinové receptory reagují na skupinu peptidových melanocytových stimulačních hormonů (MSH). Tyto peptidy jsou odvozeny od pro-opiomelanokortinu (POMC), prohormonu 131 aminokyselin, který je součástí tří skupin hormonů; melanokortinů (a, β, a γ), adrenokortikotropního hormonu (ACTH), a různých endorfmů (např. lipotropinu) (Cone, a kol., ibid.). Kvůli jejich rozdílným funkcím může vést simultánní agonismus účinků složených melanokortinových receptorů ke vzniku nežádoucích vedlejších účinků. Je proto žádoucí, aby byl agonista MC4-R selektivnější pro MC4-R než pro jeden nebo více jiných melanokortinových receptorů.

Dosavadní stav techniky

Haskell-Luevano, a kol. („Peptides“, 1996, 17(6), str. 995-1002) popisují peptidy obsahující tripeptid (D)Phe-Arg-Trp a vykazující melanotropní (pokožku ztmavující) účinek při biologické zkoušce na kůži žab (Rana pipiens). Haskell-Luevano akol. však nepopisují žádnou z níže uvedených sloučenin obecného vzorce I nebo II.

Bednarek, akol. („Peptides“, 1999, 20, str. 401-409) a Bednarek, a kol. („Biochem.Biophys.Res.Comm.“, 1999, 261, str. 209-213) popisují analogy cyklického peptidů MT-II. Nepopisují však žádnou z níže uvedených sloučenin obecného vzorce I nebo II.

• · · · · « • · « • « · • · « • · · «

Podstata vynálezu

Vynález se týká sloučenin obecného vzorce I

a jejich farmaceuticky přijatelných solí. pfa NH₂

Ve sloučeninách obecného vzorce I tvoří R¹ a R¹² společně s X a Y fenylový kruh a X je atom uhlíku a Y je atom uhlíku; nebo

R¹ je atom vodíku, skupina nebo

R2-(NH)_n-C-NHO skupina ϊ Γ

R2-C-NH-CHΪ

-C-NH

R¹² je atom vodíku; přičemž X a Y jsou buď atomy uhlíku a mezi X a Y je dvojná vazba, nebo X a Y jsou oba CH a mezi X a Y je jednoduchá vazba; R je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku nebo alkinylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku; R¹⁴ je alkylová skupina obsahující 1 až \ z

nebo atomů uhlíku; a n je 0 nebo 1, Q je

R11 R13 • » • · · · přičemž R³, R⁴ a R⁵ jsou nezávisle atom vodíku, atom halogenu, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupina nebo alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž jestliže R⁴ není atom vodíku, R³ a R⁵ jsou oba atomy vodíku; R⁶ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, alkoxyskupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, fenoxyskupina nebo atom halogenu; a R¹¹ a R¹³ jsou každý nezávisle atom vodíku, alkylová skupina obsahující 3· nebo 4 atomy uhlíku nebo cykloalkylová skupina obsahující 5 nebo 6 atomů uhlíku nebo R¹¹ a R¹³ jsou oba fenylová skupina; R⁷ je atom kyslíku nebo skupina NH; R⁸ je atom vodíku nebo methylová skupina; R⁹je

R¹⁰je atom vodíku nebo methylová skupina; p je 0 nebo 1; m je 0, 1,2 nebo 3; Z je

O

I —C—NH- ^nebo -s-S- ;a

17* r

R je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina, výhodně methylová skupina.

Vazba, znázorněná u sloučeniny obecného vzorce I přerušovanou čarou, je hydrogenovaná v případě, že X a Y jsou každý -CH-. Jestliže je však tato vazba přítomna, Y a X společně s R¹ a R¹² tvoří fenylový kruh a X a Y jsou oba čtyřvazné atomy uhlíku.

• · • · · · • ·

Vynález se dále týká sloučenin obecného vzorce II

a jejich farmaceuticky přijatelných solí.

Ve sloučeninách obecného vzorce IIR¹ je atom vodíku, skupina _R2-(NH)_n-Q-NHR¹⁴ nebo skupina R²-—c-NH-CH-C-N

R je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku nebo alkinylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku; R¹⁴ je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku; a n je 0 nebo 1, jeden zR³, R⁴, R⁵ a R⁶ je atom vodíku, atom halogenu, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku nebo alkoxyskupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku a zbývající jsou atomy vodíku. R⁷ je atom kyslíku nebo NH. R⁸ je atom vodíku nebo methylová skupina. R⁹ je

R¹⁰je atom vodíku nebo methylová skupina; p je 0 nebo 1; m je 0, 1,2 nebo 3;

• * • ·

nebo -S-S• · · · · · • ··· · · · · · • ······· · · • · · · · · • · · · » · ·

Z je o

I —c— NH

R je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina, výhodně methylová skupina.

Sloučeniny obecného vzorce I a II, stejně tak jako penta-cyklo(Asp-Lys)Asp-Asp-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH₂ a penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-Asp-(D)PheArg-(2S,3S)-betamethyl-Trp-Lys-NH₂, jsou agonisty MC4-R. Je známo, že agonisté MC4-R účinku způsobují při simulaci lidské obezity na myších snížení příjmu potravy. Tyto sloučeniny jsou tudíž účinné při léčbě a prevenci obezity.

Všechny sloučeniny obecných vzorců I a II, stejně tak jako pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-Asp-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH₂ a penta-cyklo(Asp-Lys)Asp-Asp-(D)Phe-Arg-(2S,3S)-betamethyl-Trp-Lys-NH₂, byly testovány z hlediska agonistického účinku na MC4-R a MC1-R při testu in vitro, který je popsán níže v příkladu A - Biologická účinnost. Všechny testované sloučeniny vykazovaly při testu agonistického účinku na MC4-R hodnotu EC50 nižší než 500 nM a všechny vykazovaly nejméně desetkrát vyšší agonistický účinek na MC4-R než na MC1-R. Naopak sloučenina Ac-Nle-cyklo(Asp-Lys)-Asp-His(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ vykazovala zhruba shodné agonistické účinky na MCl-RaMC4-R.

Použitá nomenklatura a zkratky

Výraz „alkylová skupina“ znamená alkylovou skupinu s přímým nebo rozvětveným řetězcem a výraz „nižší alkylová skupina“ znamená alkylovou skupinu obsahující 1 až 6 atomů uhlíku. Výraz „alkenylová skupina“ znamená • · « · · · ·· · • φφφ · φφφ· · · · • «φφφφφφ φ φ φφφ · · ·· φ φφφφ φφφ·

..... ·· ·· ·· alkenylovou skupinu s přímým nebo rozvětveným řetězcem. Výraz „alkinylová skupina“ znamená alkinylovou skupinu s přímým nebo rozvětveným řetězcem.

Výraz „alkoxyskupina“ znamená skupinu alkylová skupina-O, ve které má alkylová skupina výše definovaný význam. Výraz „fenoxyskupina“ znamená skupinu fenylová skupina-O. Pokud není uvedeno jinak, znamená výraz „fenylová skupina“ nesubstituovaný fenylový kruh a výraz „fenoxyskupina“ znamená nesubtituovanou fenoxyskupinu.

Výraz „atom halogenu“ znamená atom fluoru, atom chlóru, atom bromu nebo atom jódu.

Výraz „farmaceuticky přijatelná sůl“ se vztahuje k takovým solím, které si zachovávají biologickou účinnost a vlastnosti volných bází nebo volných kyselin, které nejsou z biologického nebo jiného hlediska nežádoucí. Soli jsou tvořeny anorganickými kyselinami, např. kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou bromovodíkovou, kyselinou sírovou, kyselinou dusičnou, kyselinou fosforečnou, apod., a organickými kyselinami, např. kyselinou octovou, kyselinou propionovou, kyselinou glykolovou, kyselinou pyrobroznovou, kyselinou oxylovou, kyselinou maleinovou, kyselinou malonovou, kyselinou jantarovou, kyselinou fumarovou, kyselinou tartarovou, kyselinou citrónovou, kyselinou benzoovou, kyselinou skořicovou, kyselinou mandlovou, kyselinou methansulfonovou, kyselinou ethansulfonovou, kyselinou p-toluensulfonovou, kyselinou salicylovou, N-acetylcystein, apod. Tyto soli mohou být navíc připraveny přidáním anorganické báze nebo organické báze k volné kyselině. Soli odvozené od anorganické báze zahrnují soli sodné, draselné, lithné, amonné, vápenaté, horečnaté, apod. Soli odvozené od organických bází zahrnují primární, sekundární a terciární aminy, substituované aminy včetně přirozeně se vyskytujících substituovaných aminů, cyklické aminy a bazické iontově výměnné pryskyřice, např. isopropylamin, trimethylamín, diethylamin, triethylamin, tripropylamin, ethanolamin, lysin, arginin, N-ethylpiperidin, piperidin, polyminové pryskyřice, apod.

• ·

Vynález zahrnuje sloučeniny obecného vzorce IA • · · · · · ··· · · * · · · ·····»· ·· · · · • · · · · · · • · · · ·

uvedený význam, a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Ve sloučeninách obecného vzorce IA tvoří R¹ a R¹² společně s X a Y fenylový kruh; nebo R¹ je atom vodíku, skupina

R2-(NH)_n-jj-NHO

O R¹⁴ nebo skupina R2_

-NH-CH-C-NH-’ ^a

R¹² je atom vodíku, přičemž jsou buďto oba X a Y atom uhlíku a vazba mezi X a Y je dvojná, nebo jsou oba X a Y skupina CH a vazba mezi X a Y je jednoduchá; R je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku, alkenylová skupina Obsahující 2 až 5 atomů uhlíku nebo alkinylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku; R¹⁴je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku; a n je 0 nebo 1. R³, R⁴ a R⁵ jsou nezávisle atom vodíku, atom halogenu, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupina nebo alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku; přičemž když R⁴ není atom vodíku, R³ a R⁵ jsou oba atom vodíku. R⁷ je atom kyslíku nebo NH. R⁸ je atom vodíku nebo methylová skupina. R⁹ je • · • · · · • · • · · · · • · · · • · · ···· · ·

R¹⁰je atom halogenu nebo methylová skupina; p je 0 nebo 1; m je 0, 1,2 nebo 3; Z je

O ¹¹ —c— NH- ^nebo -S-s- ^;a

R je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina, výhodně methylová skupina.

Vazba, znázorněná u sloučeniny obecného vzorce I přerušovanou čarou, je hydrogenovaná v případě, že X a Y jsou každý -CH-. Jestliže je však tato

17 vazba přítomna, Y a X společně s R a R tvoří fenylový kruh a X a Y jsou oba čtyřvazné atomy uhlíku.

V jednom provedení podle vynalezu představují X a Y ve sloučenině obecného vzorce IA každý skupinu CH a vazba mezi X a Y je hydrogeno vána na jednoduchou vazbu; Z je skupina

O

I —C—NH7 * 1

R je atom kyslíku; R je skupina q

II

R2—c—NH-»

R² je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku; a R¹⁰ a R¹² jsou oba atomy uhlíku. Příkladem takové sloučeniny je penta-cyklo(Asp-Lys)-AspApc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂.

• · • · • · • · · · • ·

V dalším výhodném provedení podle vynálezu představuje Z ve sloučenině obecného vzorce IA skupinu o

II —C—NHR⁷ je skupina NH; R¹ je atom vodíku, skupina

R2-(NH)_n-J-NHo

O R¹⁴ Q

K v, · N 1 nebo skupina R²—c-NH-CH—c-nh—;

R² je alkylová skupina; a R¹⁰ a R¹² jsou oba atomy vodíku.

V dalším provedení podle vynálezu představuje Z ve sloučenině obecného vzorce IA skupinu θ — O—NHR⁷ je skupina NH; R¹ je skupina

O R14

II I „

R²-C-NH-CH-C-NH^-

R² je alkylová skupina; a R¹⁰ a R¹² jsou oba atomy vodíku.

V dalším provedení podle vynálezu jsou X a Y každý -CH- a vazba mezi X a Y je hydrogenovaná na jednoduchou vazbu; n je 0; a R⁹ je skupina

Příkladem takových sloučenin je penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)PheArg-(2)Nal-Lys-NH₂ a penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Nethyl(2)Nal-Lys-NH₂.

V dalším výhodném provedení podle vynálezu představuje ve sloučenině obecného vzorce IA Z skupinu

O — o—NHR⁷ je skupina NH; R¹ je skupina

R² (NH)_n ;-NH-;

O

R² je alkylová skupina; a R¹⁰ a R¹² jsou oba atomy vodíku; a R⁹ je skupina

a R¹⁷ je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina, výhodně methylová skupina.

Mezi takové sloučeniny patří takové, ve kterých X a Y jsou oba CH a vazba mezi X a Y je jednoduchá; a jeden z R³, R⁴ a R⁵ je atom vodíku, atom halogenu nebo alkylová skupina a ostatní jsou atomy vodíku, např. pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; penta-cyklo(Asp-Lys)Asp-4-MeApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; penta-cyklo(Glu-Lys)-Glu-Apc(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; penta-cyklo(Asp-Om)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-TrpOm-NH₂; penta-cyklo(Asp-Dbr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dbr-NH₂; pentacyklo(Asp-Dpr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂; a Ac-cyklo(Asp-Dpr)Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂.

Dalším specifickým provedením sloučenin obecného vzorce IA jsou sloučeniny, ve kterých X a Y jsou oba skupina CH a vazba mezi X a Y je jednoduchá; a R¹ je skupina

R2-(NH)_n--NH-;

O jeden z R³, R⁴ a R⁵ je alkoxyskupina a ostatní jsou atomy vodíku; a n je 0, např. penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-4-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-4-EtOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; penta-cyklo(AspLys)-Asp-4-iPrOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-3MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-4-OHApc(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; a penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-4-ClApc-(D)Phe-ArgTrp-Lys-NH₂;

Provedení sloučenin obecného vzorce IA zahrnují takové sloučeniny, ve kterých každý z R¹, R³, R⁴, R⁵, R⁸ a R¹⁰ je atom vodíku; R⁷ je skupina NH; R⁹ je skupina

a R je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina, výhodně methylová skupina; a p je 0, např. cyklo(kys.jantarová-Lys)-kys.jantarová-Apc-(D)Phe-Arg-TrpLys-NH₂, cyklo(kys.maleinová-Lys)-kys.maleinová-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-LysNH₂, cyklo(ky s.j antarová-Dpr)-kys.j antarová-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂, cyklo(kys.maleinová-Dpr)-kys.maleinová-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂.

V dalším provedení podle vynálezu tvoří R1 a R12 ve sloučenině obecného vzorce IA společně s X a Y fenylový kruh. Příklady takovýchj sloučenin zahrnují cyklo(kys.ftalová-Lys)-kys.ftalová-Apc-(D)Phe-Arg-TrpLys-NH₂; cyklo(kys.ftalová-Dpr)-kys.ftalová-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂; a

Ac-Nle-cyklo(Cys-Cys)-Cys-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂.

R je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku nebo alkinylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku; R¹⁴ je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku; nje 0 nebo 1; R⁶ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, alkoxyskupina obsahujcí 1 až 3 atomy uhlíku, fenoxyskupina nebo atom halogenu; R⁷ je atom kyslíku nebo skupina NH; R⁸ je atom vodíku nebo methylová skupina; R⁹ je skupina

• ·

• tt ·

R¹⁰ je atom vodíku nebo methylová skupina; p je 0 nebo 1; m je 0, 1, 2 nebo 3; Z je skupina

O —C—NHnebo -S-S— ; a

R je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina, výhodně methylová skupina.

Při jednom provedení sloučenin obecného vzorce IB, tj. sloučenin obecného vzorce IB 1, j e Z skupina —c— NH— ;

, °

R je skupina NH; R je skupina |

R²—C—NH-,

R² je alkylová skupina; R⁸ a R¹⁰ jsou každý atom vodíku; a R⁹ je skupina

CH-R¹⁷

Λ / V a R má výše uvedený význam.

Při jednom provedení podle vynálezu je ve sloučeninách obecného vzorce IB1 R⁶ atom vodíku nebo alkylová skupina. Příklady takových sloučenin zahrnují: penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-2-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; penta-cyklo(AspLys)-Asp-2-iPrAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-3MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; a penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-4-MeAppc(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.

Při dalším provedení podle vynálezu je ve sloučeninách obecného vzorce z

IB1 R atom halogenu. Příkladem takové sloučeniny je např. penta-cyklo(AspLys)-Asp-4-ClAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.

Při dalším provedení podle vynálezu je ve sloučeninách obecného vzorce IB1 R⁶ alkoxyskupina nebo fenoxyskupina. Příkladem takové sloučeniny je např. penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-4-PhOAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2 nebo penta-(Asp-Lys)-Asp-3-MeO-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.

Vynález dále zahrnuje sloučeniny obecného vzorce IC

R11 R13

IC a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Ve sloučeninách obecného vzorce IC je R¹ atom vodíku nebo skupina O R¹⁴ s

C-NHR2-C-NH-CH2 · r

R je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku nebo alkinylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku; R¹⁴ je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku; n je 0 nebo 1; R a R jsou každý nezávisle atom vodíku, alkylová skupina obsahuj cí 3 nebo 4

4 4 4 · 4

4 ·

4*4

4 · « · « >

4 ·4 atomy uhlíku, cykloalkylové skupina obsahující 5 nebo 6 atomů uhlíku nebo R¹¹

-2 *7 o a R jsou oba fenylová skupina; R je atom kyslíku nebo skupina NH; R je atom vodíku nebo methylová skupina; R⁹ je

4 4 • 9 4 4

4 4·· • « ·

4» *

4« 44 · * * a * · ♦

4 · 4

4 « ·

CHs \

nebo C

R¹⁰ je atom vodíku nebo methylová skupina; p je 0 nebo 1; m je 0,1,2 nebo 3; a Z je skupina

O —C—NH- nebo -S-S-; a

R je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina, výhodně methylová skupina.

V jednom provedení podle vynálezu je Z ve sloučenině obecného vzorce IC1 skupina q

-Lnh7*1 (J

R je skupina NH; R je skupina

R²—C—NHR² je alkylová skupina; R⁸ a R¹⁰ jsou každý nezávisle atom vodíku; a R⁹ je skupina |

CH₂

4· ···· ·· · • * • 9 * · • · »··· φ · · ·

·« ·· t 9 9 • 9 99· • 99 ·

9 9 9

9 99

Při dalším výhodném provedení podle vynálezu je ve sloučeninách obecného vzorce IC1 jeden zR¹¹ a R¹³ alkylová skupina nebo cykloalkylová skupina a ten druhý je atom vodíku. Příkladem takových sloučenin je pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-Achc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2 a penta-cyklo(Asp-Lys)Asp-Abc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.

Při dalším výhodném porvedení podle vynálezu je ve sloučeninách obecného vzorce IC1 jeden zR¹¹ a R¹³ fenylová skupina a ten druhý je atom vodíku nebo fenylová skupina. Příkladem takových sloučenin je pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-4-Adc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.

Při jednom porvedení podle vynálezu je Zve sloučeninách obecného vzorce IIA skupina O —O—NH- ;

O

R^!je R²—C—NHR² je alkylová skupina;

R³, R⁴, R⁵, R⁸ a R¹⁰ jsou každý atom vodíku;

R⁶ je atom vodíku, atom halogenu, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku nebo alkoxyskupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku;

R⁹ je skupina j

CH-R¹⁷

a R má výše uvedený význam.

Při jednom provedení sloučenin obecného vzorce, popsaných v předešlém odstavci, je R7 skupina NH. Při jednom výhodném provedení je R7 skupina NH a R⁶ je atom vodíku nebo alkylová skupina. Příklady takových sloučenin zahrnují penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-(D,L)-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂;

• · · · penta-(Asp-Lys)-Asp-5-Me-(D,L)-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; penta-(AspLys)-Asp-5-Et-(D,L)-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; a penta-(Asp-Lys)-Asp-5iPr-(D,L)-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.

Při dalším výhodném provedení podle vynálezu je R⁷ ve sloučeninách obecného vzorce II-A skupina NH a R⁶ je atom halogenu. Příklady takových sloučenin zahrnují penta-(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ a penta-(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.

Při dalším výhodném provedení podle vynálezu je R⁷ ve sloučeninách obecného vzorce II-A skupina NH a R⁶ je alkoxyskupina. Příklady takových sloučenin zahrnují penta-(Asp-Lys)-Asp-5-MeO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-TrpLys-NH₂; penta-(Asp-Lys)-Asp-5-EtO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂; a penta-(Asp-Lys)-Asp-5-iPrO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.

Dalším provedením podle vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce II, ve kterých Z, R¹ až R⁵ a R⁸ až R¹⁰ mají výše uvedený význam, R⁷ je atom kyslíku a R⁶ je atom halogenu. Příklady takových sloučenin zahrnují penta(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂; a penta-(Asp-Lys)-Asp-5ClAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂.

Při dalším provedení sloučenin obecného vzorce II podle vynálezu je Z ve sloučenině obecného vzorce II-B skupina -S-S-; R¹ je skupina

O lp O nebo skupina R²-C-NH-CH-C-NH

R³, R⁴, R⁵, R⁸ a R¹⁰ jsou každý atom vodíku; R⁶ je atom vodíku nebo atom halogenu; R⁷je skupina NH; a R⁹ je skupina

CH-R17

C a R¹⁷ má výše uvedený význam.

Příklady takových sloučenin obecného vzorce II-B zahrnují Ac-Nlecyklo(Cys-Cys)-Cys-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂; a penta-cyklo(CysCys)-Cys-5-Br(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂.

Vynalez rovněž zahrnuje následující sloučeniny: penta-cyklo(Asp-Lys)Asp-Apc-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH₂; a penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)PheArg-(2S,3S)-betamethyl-Trp-Lys-NH₂.

Názvosloví užité k definování peptidů je běžně používaným názvoslovím, přičemž aminoskupina je umístěna na N-konci vlevo a karboxyl na C-konci vpravo. Přirozenými aminokyselinami jsou míněny aminokyseliny přirozeně se vyskytující v bílkovinách, tj. Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gin, Cys, Met, Phe, Tyr, Pro, Trp a His. Pokud není výslovně uvedeno jinak, mají chirální aminokyseliny L-konfiguraci.

Pro aminokyseliny, ochranné skupiny, rozpouštědla, činidla, apod. jsou použity následující zkratky nebo symboly:

Symbol Význam β-Ala beta-alanin (2)-Nal

Atc

5-BrAtc

5-ClAtc

5-MeOAtc

5-EtOAc

5-iPrOAtc

5-MeAtc

5-EtAtc

5-iPrAtc (2)-naftylalanin kyselina 2-aminotetralin-2-karboxylová kyselina 5-brom-2-aminotetralin-2-karboxylová kyselina 5-chlor-2-aminotetralin-2-karboxylová kyselina 5 -methoxy-2-aminotetralin-2-karboxylová kyselina 5 -ethoxy-2-aminotetralin-2-karboxylová kyselina 5 -isopropoxy-2-aminotetralin-2-karboxylová kyselina 5-methyl-2-aminotetralin-2-karboxylová kyselina 5 -ethyl-2-aminotetralin-2-karboxylová kyselina 5-isopropyl-2-aminotetralin-2-karboxylová ··· · ····

5-DmaAtc	kyselina 5 -dimethylamino-2-aminotetralin-2-karboxylová
DBr	kyselina D-2,4-diaminobutanová
DPr	kyselina D-2,3-diaminopropionová
Sar	sarkosin (N-methylglycin)
Cit	citrulin
Apc 4-HOApc	kyselina 1 -amino-4-fenylcyklohexan-1 -karboxylová kyselina 1 -amino-4-(4-hydroxyfenyl)cyklohexan-1 -
4-MeOApc	karboxylová kyselina 1 -amino-4-(4-methoxyfenyl)cyklohexan-1 -
3-MeOApc	karboxylová kyselina 1 -amino-4-(3 -methoxyfenyl)cyklohexan-1 karboxylová
4-EtOApc	kyselina 1 -amino-4-(4-ethoxyfenyl)cyklohexan-1 -
4-iPrOAc	karboxylová kyselina 1 -amino-4-(4-isopropoxyfenyl)cyklohexan-l -
4-MeApc	karboxylová kyselina 1 -amino-4-(4-methylfenyl)cyklohexan-1 karboxylová
4-ClApc Appc 2-MeAppc 2-iProAppc	kyselina 1 -amino-4-(4-chlorfenyl)cyklohexan-1 -karboxylová kyselina 4-amino-l -fenylpiperidin-4-karboxylová kyselina 4-amino-l-(2-methylfenyl)piperidin-4-karboxylová kyselina 4-amino-1 -(2-isopropoxyfenyl)piperidin-4-
3-MeAppc 3-MeOAppc	karboxylová kyselina 4-amino-1 -(3-methylfenyl)piperidin-4-karboxylová kyselina 4-amino-1 -(3-methoxyfenyl)piperidin-4karboxylová
4-MeAppc 4-ClAppc 4-PhOAppc	kyselina 4-amino-1 -(4-methylfenyl)piperidin-4-karboxylová kyselina 4-amino-l-(4-chlorfenyl)piperidin-4-karboxylová kyselina 4-amino-1 -(4-fenoxyfenyl)piperidin-4-karboxylová

• · ·· ·· ···· • · · · · ·

	···· ····· ·· · • ······· ·· ··· · · ·· · ···· ···· • · · ·· ·· ·· ·· 21
Achc	kyselina 1 -amino-4-cyklohexylcyklohexan-1 -karboxylová
Adpc Abc	kyselina 1 -amino-4-difenylcyklohexan-1 -karboxylová kyselina 1 -amino-4-terc .butylcyklohexan-1 -karboxylová
3-Amb	kyselina 3-aminomethylbenzoová
4-Amb	kyselina 4-aminomethylbenzoová
2-Aba	kyselina 2-aminobenzoová
Bu	butylová skupina
Penta	pentanoylová skupina
Fmoc	9-fluorenylmethoxykarbonylová skupina
Pmc	2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonylová skupina
Trt	trityl(trifenylmethyl)ová skupina
CH2C12	methylenchlorid
ch3cn	acetonitril
DMF	dimethylformamid
DIPEA	N,N-diisopropylethylamin
TFA	kyselina trifluoroctová
HOBT	N-hydroxybenzotriazol
DIC	N,N '-diisopropylkarbodiimid
BOP	benzotriazol-1 -yloxy-tris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát
PyBroP HBTU	brom-tris-pyrrolidinfosfoniumhexafluorfosfát 2-( 1 H-benzotriazol-1 -yl)-1,1,3,3tetramethyluroniumhexafluorfosfát
FAB-MS	hmotnostní spektrometrie, bombardování rychlými atomy
ES-MS	hmotnostní spektrometrie, elektrosprej

Uvedení substituované aminokyseliny v závorkách indikuje analogy sekvence peptidů. Derivování N- konce aminoskupiny je označeno nalevo od substituce N • ·· · · · ♦· · • ··· · · · · · · · · • ······· ·· ··· · · ·· · ···· · · · ·

...........

-konce, oddělené pomlčkou. Např. Ac-His-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH₂ označuje peptid se sekvencí aminokyselin, ve které byla acetylová skupina substituovaná vodíkem na N-konci. Přípony ,,-OET a ,,-NH₂“ následující za pomlčkou či závorkami odpovídají volné kyselině, respektive amidovým formám polypeptidu.

Lineární peptidy užívané jako prekurzory pro sloučeniny podle vynálezu mohou být snadno syntetizovány jakýmkoli známým postupem tvorby peptidových vazeb mezi aminokyselinami. Tyto běžné postupy zahrnují např.syntézu v kapalné fázi umožňující kondenzaci mezi volnou aminoskupinou aminokyseliny nebo jejího zbytku, kdy její karboxylová skupina nebo jiná reaktivní skupina je chráněna, a volnou primární karboxylovou skupinou jiné aminokyseliny či jejího zbytku, kde její aminoskupina či jiné reaktivní skupiny jsou chráněny.

Proces syntézy lineárních peptidů může být prováděn postupem, při kterém je každá aminokyselina požadované sekvence postupně přidávána k další aminokyselině či jejímu zbytku nebo postupem, při kterém jsou peptidové fragmenty s požadované sekvence aminokyselin nejprve běžným postupem syntetizovány a pak kondenzovány za vzniku požadovaného peptidu.

Tyto běžné postupy syntézy lineárních peptidů prekurzorů zahrnují např. jakoukoli metodu peptidové syntézy v pevné fázi. Při této syntéze nových sloučenin jsou požadované aminokyselinové zbytky postupně začleňovány do prodlužujícího se peptidového řetězce podle obecných pravidel syntézy v pevné fázi [Merrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc., 1963, 85, str. 2149-2154; Barany a kol., The Peptides, Anály sis, Synthesis and Biology, sv. 2, Gross, E. a Meienhofer, J., Eds. Academie Press 1-284 (1980) ].

Při chemické syntéze peptidů se běžně chrání reaktivní skupiny různých aminokyselinových zbytků na postranním řetězci vhodnými ochrannými skupinami, které zabraňují nežádoucí chemické reakci v daném místě, dokud není tato ochranná skupina odstraněna. Většinou je také chráněna • · · · · · • ··· · ···· • ······· ·· alfaaminoskupina aminokyseliny či jejího zbytku během její reakce s karboxylovou skupinou, s následným selektivním odstraněním ochranné skupiny alfaaminoskupiny, které umožňuje následnou reakci na daném místě. Přestože jsou při syntéze v pevné fázi vždy uvedeny konkrétní ochranné skupiny, může být každá aminokyselina chráněna ochrannou skupinou běžně používanou při syntéze dané aminokyseliny v kapalné fázi.

Alfaaminoskupiny mohou být chráněny vhodnou ochrannou skupinou zvolenou z množiny ochranných skupin aromatického urethanového typu, jakýmy jsou např. benzyloxykarbonylová skupina (Z) a substituovaná benzyloxykarbonylová skupina, např. p-chloro benzyloxykarbonylová skupina, p-nitro benzyloxykarbonylová skupina, p-brombenzyloxykarbonylová skupina, 7?-bifenyl-isopropoxykarbonylová skupina, 9-fluorenylmethoxykarbonylová skupina (Fmoc) a 77-methoxybenzyloxykarbonylová skupina (Moz); dále alifatického urethanového typu, jakými jaou např. t-butyloxykarbonylová skupina (Boc), diisopropylmethoxykarbonylová skupina, isopropoxykarbonylová skupina, a allyloxykarbonylová skupina. Pro ochranu alfaaminoskupin je při provedení podle vynálezu nejvýhodnější Fmoc.

Guanidinové skupiny mohou být chráněny vhodnou ochrannou skupinou zvolenou z množiny obsahující nitroskupinu, p-toluensulfonylovou skupinu (Tos), Z, pentamethylchromansulfonylovou skupinu (Pmc), adamantyloxykarbonylovou skupinu a Boc. Pro arginin (Arg) je nej výhodnější Pmc.

Všechna rozpouštědla, isopropanol (iPrOH), methylenchlorid (CH₂C1₂), dimethylformamid (DMF) a N-methylpyrolidinon (NMP), byla zakoupena od společnosti Fisher nebo Burdick & Jackson a byla použita bez další destilace. Trifluoroctová kyselina byla zakoupena od společnosti Halocarbon nebo Fluka a použita bez dalšího přečištění. Diisopropylkarbodiimid (DIC) a diisopropylethylamin (DIPEA) byly zakoupeny od společnosti Fluka nebo Aldrich a použity bez dalšího přečištění. Hydroxybenzotriazol (HOBT), • · • · · · ··· ··· ·· · • · · · · · · · · · · · • · ···· ·· · · · · · · · ·· · ···· ···· • · · ·· ·· ·· ·· dimethylsulfid (DMS) a 1,2-ethandithiol (EDT) byly zakoupeny od společnosti Sigma Chemical Co. a použity bez dalšího přečištění. Chráněné aminokyseliny měly zpravidla L konfiguraci a byly zakoupeny od společnosti Bachem, Advanced ChemTech, či Neosystem. Čistota těchto činidel byla před použitím ověřena chromatografií na tenké vrstvě, NMR a stanovením bodu tání. Benzhydrylaminová pryskyřice (BHA), kopolymer styrenu a 1% divinylbenzenu (100-200 nebo 200-400 mesh), byla zakoupena od společnosti Bachem nebo Advanced ChemTech. Celkový obsah dusíku v těchto pryskyřicích byl zpravidla mezi 0.3 - 1.2 meq/g.

Vysokorychlostní kapalinová chromatografie (HPCL) byla provedena na LDC přístroji, skládajícím se z konstametrických čerpadel I a III, programátoru a mísící jednotky Gradient Master a spektromonitoru III s UV detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou. Analytická HPLC byla provedena za použití kolon Vydac Ci₈ (0.4 x 30 cm) se zpětnou fází. Preparativní HPLC separace proběhly v kolonách Vydac (2 x 25cm).

Lineární peptidy byly výhodně připraveny syntézou v pevné fázi, obecně popsanou Memfíeldem [7. Amer. Chem. Soc., 1963, 85, str. 2149], ačkoli mohou být použity i jiné obdobné běžně známé postupy chemické syntézy, jakje uvedeno výše. Syntéza v pevné fázi začíná probíhat na koncovém uhlíku peptidú reakcí chráněné a-aminokyseliny s vhodnou pryskyřicí. Tato výchozí látka se připraví připojením aminokyseliny s chráněnou α-aminoskupinou k pbenzyloxybenzylalkoholové (Wangově) pryskyřici pomocí esterové vazby, nebo pomocí amidové vazby mezi Fmoc-linkerem, např. kyselinou p-[(R,S-o;-[l-(9Hfluoren-9-yl)-methoxyformamido]-2,4-dimethyloxybenzyl]-fenoxyoctovou (Rink linkerem) a benzhydrylaminovou pryskyřicí (BHA). Příprava hydroxymethylové pryskyřice je v oboru dobře známa. Matrice na bázi Fmoclinker-BHA je komerčně dostupná a zpravidla používána v případě, kdy má požadovaný syntetizovaný peptid nést nesubstituovaný amid na C-konci.

• · · · · · • · ·

Jelikož jsou sloučeniny podle vynálezu cyklické peptidy, připravené tvorbou laktamu nebo disulfidovou vazbou, lineární peptidy jako prekurzory jsou tvořeny tak, aby byly vyhovující aminokyseliny či jejich odvozeniny nesoucí příslušné zbytky postranních řetězců včleněny na místa lineárních peptidů, kde může nakonec dojít ke vzniku intramolekulámí amidové nebo disulfidové vazby. Laktamy jsou vytvářeny interakcí funkční aminoskupiny postranního řetězce C-koncového zbytku aminokyseliny s distálním zbytkem karboxylové kyseliny, zatímco dislufidová vazba vzniká oxidační reakcí dvou cysteinových zbytků vhodně začleněných do C-konce a na nebo blízko u Nkonce lineárních peptidů. Např. při přípravě laktamových peptidů může být v lineárních pentapeptidech jako prekurzorech N-koncová čepička použita jako templát pro začlenění karboxylového zbytku, např. struktura X, nebo v případě hexapetidů je peptid uspořádán tak, aby byl N-koncový zbytek aminokyseliny zvolen z jedné z aminokyselin obsahujících skupinu karboxylových kyselin s vhodně chráněným postranním řetězcem, např. kyselinu aspartovou, nebo glutamovou. V lineárních heptapeptidech jsou kyseliny etheraspartová či glutamová začleněny na předposlední místo od N-konce. Ve všech lineárních peptidech jako prekurzorech, tzn. hepta-, hexa- a pentapeptidech je C-koncový zbytek zvolen z přírodních či syntetických aminokyselin obsahujících vhodně chráněný zbytek základního postranního řetězce, schopný tvorby amidové vazby v momentě odstranění ochranné skupiny, např. lysinu, omithinu, kyseliny 2,3diaminopropanové a kyseliny 2,4-diaminobutanové. Pro tvorbu cyklického peptidu s disulfidovou vazbou, kde prekurzorem je lineární hexapeptid, je peptid uspořádán tak, že cysteinový zbytek s vhodně chráněným atomem síry je začleněn jako C-koncový i N-koncový zbytek. Je-li však prekurzorem lineární heptapeptid, pak jsou cysteinové zbytky s vhodně chráněným atomem síry začleněny jako C-koncový zbytek a předposlední N-koncový zbytek jako např. vX.

• · · · · · • · » ♦ · · • · · · · · tt · · · · ···· · · · • ······· ·· ··· · · ^: ’·*’··’ ’·’··’

Obecně jsou při přípravě lineárních peptidů aminokyseliny nebo jejich odvozeniny začleněny do Fmoc-Linker-BHA pryskyřice za použití Fmoc chráněné formy aminokyseliny nebo její mimetiky, za použití 2-5 ekvivalentů aminokyselin a vhodného kondenzačního činidla. Po ukončení kondenzačních reakcí může být pryskyřice promyta a vakuově vysušena. Vnášení aminokyseliny do pryskyřice se stanoví analýzou alikvotního podílu Fmocaminokyselinové pryskyřice nebo stanovením Fmoc skupin pomocí UV analýzy. Nezreagované aminokyseliny mohou být kryty reakcí pryskyřice s acetanhydridem a diisopropylethylaminem v methylenchloridu.

Pryskyřice prochází několika opakovanými cykly, přičemž se postupně prodlužuje peptidový řetězec. Ochranné skupiny α-aminoFmoc jsou odstraněny za bazických podmínek. Za tímto účelem může být použit piperidin, piperazin nebo morfolin (20-40% obj./obj.) v DMF. Výhodně se použije 40% piperidin v DMF.

Po odstranění a-amino ochranné skupiny jsou další chráněné aminokyseliny postupně připojovány v požadovaném pořadí tak, aby byly získány chráněné peptidové pryskyřice jako meziprodukty. Aktivační činidla užívaná pro slučování aminokyselin při syntéze peptidů v pevné fázi jsou v oboru dobře známa. Vhodnými činidly pro takové syntézy jsou např. benzotriazol-1 -yloxy-tri-(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát (BOP), brom-tris-pyrolhdin-fosfoniumhexafluorfosfát (PyBroP), 2-( 1 H-benzotriazol-1 yl)-1,1,3,3 -tetramethyluroniumhexafluorfosfát (HBTU) a diisopropylkarbodiimid (DIC). Výhodné jsou podle vynálezu HBTU a DIC. Mohou být rovněž použita aktivační činidla popsaná v Barany and Merrifield [The Peptides, sv. 2, J. Meienhofer a kol., Academie Press, 1979, str. 1-284]. Pro optimalizaci daných cyklů syntézy mohu být do kondenzačních směsí přidána různá činidla jako např. 1-hydroxybenztriazol (HOBT), Nhydroxysukcinimid (HOSu) a 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benztriazin (HOOBT). Výhodně se použije HOBT.

Postup typického cyklu syntézy je následující:

« « · 9 * · * • · to · » · • ·*· · «··· • «······ · · • to to · · · • · « · · « ·

Stupeň	Činidlo	Čas
1	DMF	2 x 30 sek
2	40%piperidin/DMF	lmin
3	40%piperidin/DMF	15min
4	DMF	2 x 30 sek
5	iPrOH	2 x 30 sek
6	DMF	3 x 30 sek
7	slučování	60 min - 18 hod
8	DMF	2 x 30 sek
9	iPrOH	1 x 30 sek
10	DMF	1 x 30 sek
11	CH2C12	2x 30 sek

Objem rozpouštědel pro promývání a kondenzaci je 10-20ml/g pryskyřice. Pro stanovení míry ukončení kondenzačních reakcí v průběhu syntézy se používá Kaiserův ninhydrinový test [Kaiser a kol., Anal. Biochem., 1970,34,str. 595-598]. U Fmoc-Arg(Pmc) a u interakcí mezi sekundárními aminy a stericky bráněnými kyselinami byla zjištěna pomalá reakční kinetika. Veškeré nedokončené kondenzační reakce se buď nechaly znovu proběhnout s nově připravenými aktivovanými aminokyselinami nebo byly kryty působením acetanhydridu na peptidové pryskyřice, jak bylo výše popsáno. Vytvořené peptidové pryskyřice byly po dobu několika hodin vakuově sušeny.

Ochranné skupiny se u každé ze sloučenin odstraní a lineární peptid se od pryskyřice odštěpí následujícím postupem. Peptidové pryskyřice reagují při okolní teplotě po dobu 120min se 100 μΐ ethandithiolu, 100 μΐ dimethylsulfidu, 300 μΐ anisolu a 9,5 ml kyseliny trifluoroctové na gram pryskyřice. Pryskyřice • Φ φ ·» · * φ* **·» φφφ · · · φ» » • · · · · φφφφ φ φ φ φ · φφφφ φφ «· φφφ φ · • Φ φ φφφφ φφφφ < * * φφφφ φ»·· se odfiltruje a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva se dekantuje. Zbytek se promyje dvěma nebo třemi objemovými díly Et₂O a znovu se odstředí. Pokud je to žádoucí, jsou surové lineární peptidy přečištěny preparativní HPLC. Peptidy se převedou do kolon v minimálním objemu buď AcOH/H₂O nebo 0,1% TFA/H₂O. Gradientová eluce zpravidla začíná při 10% B pufru, 10%-60% B za 90 min. (pufr A: 0,1% TFA/H₂O, pufr B: 0,1% TFA/CH₃CN) a průtokové rychlosti 8ml/min. UV detekce probíhá na 280 nm. Frakce se jímají v intervalech 1,0 -2,5 min a jsou monitorovány analytickou HPLC. Frakce vysoké čistoty se jímají do sběrné nádrže a lyofilizují.

Pro přípravu laktamů se příslušný nepřečištěný lineární peptid rozpustí ve vhodném inertním činidle, např. N-methylpyrolidonu nebo DMF, výhodně DMF a upraví na pH 8.0 přidáním terciární aminové báze, např. N-methylmorfolinu, a poté se nechá zreagovat s činidlem vytvářejícím amidovou vazbu, výhodně BOP. Reakce výhodně probíhá při teplotě mezi 40 °C a 0 °C, výhodně při okolní teplotě. Přečišťování surových cyklických peptidů se provádí preparativní HPLC. Gradientová eluce zpravidla začíná při 20% B pufru, 20% - 60% B za 90 min, (pufr A: 0.1% TFA/H₂O, pufr B: 0.1% TFA/CH₃CN) a průtokové rychlosti 8 ml/min. UV detekce probíhá na 280 nm. Frakce jsou jímány v intervalech 1,0 2,5 min a monitorovány analytickou HPLC. Frakce vysoké čistoty se jímají do sběrné nádrže a lyofilizují.

Pro přípravu cyklických disulfidických peptidů se lineární peptid, obsahující dva vhodně umístěné cysteinové zbytky a přečištěný HPLC, rozpustí ve vhodné inertní rozpouštěcí směsi při vysokém zředění, např. ve vodném roztoku DMSO a pH roztoku se upraví na hodnotu 8.0 opatrným přidáním hydroxidu amonného. Do míchaného roztoku se probublává kyslík. Reakce výhodně probíhá při teplotě mezi 40 °C a 0 °C, výhodně při okolní teplotě a postup cyklizace je sledován analytickou HPLC. Po proběhnutí reakce je roztok lyofilizován a surový cyklický peptid se přečistí preparativní HPLC.

• ·

Gradientová eluce zpravidla začíná při 20% B pufru, 20% - 60% B za 90 min., (pufr A: 0.1% TFA/H₂O, pufr B: 0.1% TFA/CH₃CN) a průtokové rychlosti 8 ml/min. UV detekce probíhá na 280 nm. Frakce jsou jímány v intervalech 1,0 2,5 min a monitorovány analytickou HPLC. Frakce vysoké čistoty se jímají do sběrné nádrže a lyofilizují.

Přečišťování surových cyklických peptidů se provádí preparativní HPLC. Peptidy se převedou do kolon v minimálním objemu buď AcOH/H₂O nebo 0,1% TFA/H₂O. Gradientová eluce zpravidla začíná při 10% B pufru, 10%-60% B za 90 min. (pufr A: 0,1% TFA/H₂O, pufr B: 0,1% TFA/CH₃CN) a průtokové rychlosti 8ml/min. UV detekce probíhá na 280 nm. Frakce jsou jímány v intervalech 1,0 - 2,5 min a monitorovány analytickou HPLC. Frakce vysoké čistoty se jímají do sběrné nádrže a lyofilizují.

v

Čistota konečných produktů reakce je kontrolována analytickou HPLC se zpětnou fází, jak je uvedeno výše. Čistota všech produktů se pohybuje v rozmezí od přibližně 95% do 99%. Složení veškerých konečných produktů se zjišťuje FAB hmotnostní spektrometrií (FAB-MS) nebo ES hmotnostní spektrometrií (ES - MS). Všechny produkty vykazují předpokládané výchozí M+H ionty v přijatelných mezích.

Proces syntézy vybraných sloučenin je prováděn postupem, pomocí něhož je ke každé aminokyselině požadované sekvence postupně přidávána další aminokyselina nebo její zbytek. Může být rovněž aplikován postup, kdy jsou peptidové fragmenty požadované aminokyselinové sekvence nejprve běžným postupem syntetizovány a poté kondenzovány za vzniku požadovaného peptidů.

Tyto běžné postupy syntézy nových sloučenin podle vynálezu zahrnují např. metodu syntézy peptidů v pevné fázi. Při této metodě je syntéza nových sloučenin prováděna postupným začleňováním požadovaných aminokyselinových zbytků do rostoucího peptidového řetězce podle obecných pravidel metod v pevné fázi [Merrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc., 1963, 85, • · • · · · • · · · · • · · · · • · · · · · • ······· · • · · · · • · · · · str. 2149 - 2154 ; Barany a kol., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, sv. 2, Gross, E. a Meienhofer, J., Eds. Academie Press 1-284 (1980)].

Při chemické syntéze peptidů se běžně chrání reaktivní skupiny různých aminokyselinových zbytků na postranním řetězci vhodnými ochrannými skupinami, které zabraňují nežádoucí chemické reakci v daném místě, dokud není tato ochranná skupina odstraněna. Většinou je také chráněna alfaaminoskupina aminokyseliny či jejího zbytku během její reakce s karboxylovou skupinou, s následným selektivním odstraněním ochranné skupiny alfaaminoskupiny, které umožňuje následnou reakci na daném místě. Přestože jsou při syntéze v pevné fázi vždy uvedeny konkrétní ochranné skupiny, může být každá aminokyselina chráněna ochrannou skupinou běžně používanou při syntéze dané aminokyseliny v kapalné fázi.

Alfaaminoskupiny mohou být chráněny vhodnou ochrannou skupinou zvolenou z množiny ochranných skupin aromatického urethanového typu, jakýmy jsou např. benzyloxykarbonylová skupina (Z) a substituovaná benzyloxykarbonylová skupina, např. p-chloro benzyloxykarbonylová skupina, p-nitro benzyloxykarbonylová skupina, p-brombenzyloxykarbonylová skupina, p-bifenyl-isopropoxykarbonylová skupina, 9-fluorenylmethoxykarbonylová skupina (Fmoc) a p-methoxybenzyloxykarbonylová skupina (Moz); dále alifatického urethanového typu, jakými jsou např. t-butyloxykarbonylová skupina (Boc), diisopropylmethoxykarbonylová skupina, isopropoxykarbonylová skupina, a allyloxykarbonylová skupina. Pro ochranu alfaaminoskupin je při provedení podle vynálezu nejvýhodnější Fmoc.

Guanidinové skupiny mohou být chráněny vhodnou ochrannou skupinou zvolenou z množiny obsahující nitroskupinu, p-toluensulfonylovou skupinu (Tos), Z, pentamethylchromansulfonylovou skupinu (Pníc), adamantyloxykarbonylovou skupinu a Boc. Pro arginin (Arg) je nej výhodnější

Pmc.

• · • · · · · · •« · · · • · · · ···· · · · · · ·· · • ······· ·· ··· · ·· · · · · · · · · ...........

Všechna rozpouštědla, isopropanol (iPrOH), methylenchlorid (CH₂C1₂), dimethylformamid (DMF) a N-methylpyrolidinon (NMP), byla zakoupena od společnosti Fisher nebo Burdick & Jackson a byla použita bez další destilace. Trifluoroctová kyselina byla zakoupena od společnosti Halocarbon nebo Fluka a použita bez dalšího přečištění. Diisopropylkarbodiimid (DIC) a diisopropylethylamin (DIPEA) byly zakoupeny od společnosti Fluka nebo Aldrich a použity bez dalšího přečištění. Hydroxybenzotriazol (HOBT), dimethylsulfíd (DMS) a 1,2-ethandithiol (EDT) byly zakoupeny od společnosti Sigma Chemical Co. a použity bez dalšího přečištění. Chráněné aminokyseliny měly zpravidla L konfiguraci a byly zakoupeny od společnosti Bachem, Advanced ChemTech, či Neosystem. Čistota těchto činidel byla před použitím ověřena chromatografií na tenké vrstvě, NMR a stanovením bodu tání. Benzhydrylaminová pryskyřice (BHA), kopolymer styrenu a 1% divinylbenzenu (100-200 nebo 200-400 mesh), byla zakoupena od společnosti Bachem nebo Advanced ChemTech. Celkový obsah dusíku v těchto pryskyřicích byl zpravidla mezi 0.3 - 1.2 meq/g.

Vysokorychlostní kapalinová chromatografie (HPCL) byla provedena na LDC přístroji, skládajícím se z konstametrických čerpadel I a III, programátoru a mísící jednotky Gradient Master a spektromonitoru III s UV detektorem s nastavitelnou vlnovou délkou. Analytická HPLC byla provedena za použití kolon Vydac Ci₈ (0.4 x 30 cm) se zpětnou fází. Preparativní HPLC separace proběhly v kolonách Vydac (2 x 25cm).

Peptidy byly výhodně připraveny syntézou v pevné fázi, obecně popsanou Merrifieldem [J. Amer. Chem. Soc., 1963, 85, str. 2149], ačkoli mohou být použity i jiné obdobné běžně známé postupy chemické syntézy, jak je uvedeno výše. Syntéza v pevné fázi začíná probíhat na koncovém uhlíku peptidu reakcí chráněné ce-aminokyseliny s vhodnou pryskyřicí. Tato výchozí látka se připraví připojením aminokyseliny s chráněnou a-aminoskupinou k pbenzyloxybenzylalkoholové (Wangově) pryskyřici pomocí esterové vazby, nebo • ··· · · · · · · • ······· ·· ··· pomocí amidové vazby mezi Fmoc-linkerem, např. kyselinou p-[(R,S-a-[l-(9Hfluoren-9-yl)-methoxyformamido]-2,4-dimethyloxybenzyl]-fenoxyoctovou (Rink linkerem) a benzhydrylaminovou pryskyřicí (BHA). Příprava hydroxymethylové pryskyřice je v oboru dobře známa. Matrice na bázi FmocLinker-BHA je komerčně dostupná a zpravidla používána v případě, kdy má požadovaný syntetizovaný peptid nést nesubstituovaný amid na C-konci.

Obecně jsou aminokyseliny nebo jejich odvozeniny začleněny do FmocLinker-BHA pryskyřice za použití Fmoc chráněné formy aminokyseliny nebo její odvozeniny, za použití 2-5 ekvivalentů aminokyselin a vhodného kondenzačního činidla. Po ukončení kondenzačních reakcí může být pryskyřice promyta a vakuově vysušena. Vnášení aminokyseliny do pryskyřice se stanoví analýzou alíkvotního podílu Fmoc-aminokyselinové pryskyřice nebo stanovením Fmoc skupin pomocí UV analýzy. Nezreagované aminokyseliny mohou být kryty reakcí pryskyřice s acetanhydridem a diisopropylethylaminem v methylenchloridu.

Pryskyřice prochází několika opakovanými cykly, přičemž se postupně prodlužuje peptidový řetězec. Ochranné skupiny α-aminoFmoc jsou odstraněny za bazických podmínek. Za tímto účelem může být použit piperidin, piperazin nebo morfolin (20-40% obj ./obj.) v DMF. Výhodně se použije 40% piperidin v DMF.

Po odstranění a-amino ochranné skupiny jsou další chráněné aminokyseliny postupně připojovány v požadovaném pořadí tak, aby byly získány chráněné peptidové pryskyřice jako meziprodukty. Aktivační činidla užívaná pro slučování aminokyselin při syntéze peptidů v pevné fázi jsou v oboru dobře známa. Vhodnými činidly pro takové syntézy jsou např. benzotriazol-1 -yloxy-tri-(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát (BOP), brom-tris-pyrollidin-fosfoniumhexafluorfosfát (PyBroP), 2-( 1 H-benzotriazol-1 yl)-l,l,3,3-tetramethyhironiumhexafluorfosfát (HBTU) a diisopropylkarbodiimid (DIC). Výhodné jsou podle vynálezu HBTU a DIC.

• · • · • · · · • ··· · · · · · · · • ······· ·· ··· ·

Mohou být rovněž použita aktivační činidla popsaná v Barany and Merrifield [The Peptides, sv. 2, J. Meienhofer a kol., Academie Press, 1979, str. 1-284]. Pro optimalizaci daných cyklů syntézy mohu být do kondenzačních směsí přidána různá činidla jako např. 1-hydroxybenztriazol (HOBT), Nhydroxysukcinimid (HOSu) a 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-l,2,3-benztriazin (HOOBT). Výhodně se použije HOBT.

Postup typického cyklu syntézy je následující:

Stupeň	Činidlo	Čas
1	DMF	2 x 30 sek
2	40%piperidin/DMF	lmin
3	40%piperidin/DMF	15min
4	DMF	2 x 30 sek
5	iPrOH	2 x 30 sek
6	DMF	3 x 30 sek
7	slučování	60 min - 18 hod
8	DMF	2 x 30 sek
9	iPrOH	1 x 30 sek
10	DMF	1 x 30 sek
11	CH2C12	2x 30 sek

Objem rozpouštědel pro promývání a kondenzaci je 10-20ml/g pryskyřic. Pro stanovení míry ukončení kondenzačních reakcí v průběhu syntézy se používá Kaiserův ninhydrinový test [Kaiser a kol., Anal. Biochem., 1970,34,str. 595-598]. U Fmoc-Arg(Pmc) a u interakcí mezi sekundárními aminy a stericky bráněnými kyselinami byla zjištěna pomalá reakční kinetika. Veškeré nedokončené kondenzační reakce se buď nechaly znovu proběhnout · · ·· ·· ······ ··· ··· ·· · • ··· · ···· · · · • ······· ·· · · · · · *··’ ^: *··’*··’ *··”··* s nově připravenými aktivovanými aminokyselinami nebo byly kryty působením acetanhydridu na peptidové pryskyřice, jak bylo výše popsáno. Vytvořené peptidové pryskyřice byly po dobu několika hodin vakuově sušeny.

Ochranné skupiny se u každé ze sloučenin odstraní a peptid se od pryskyřice odštěpí následujícím postupem. Peptidové pryskyřice reagují při okolní teplotě po dobu 120min se 100 μΐ ethandithiolu, 100 μ.1 dimethylsulfidu,

300 μΐ anisolu a 9,5 ml kyseliny trifluoroctové na gram pryskyřice. Pryskyřice se odfiltruje a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva se dekantuje. Zbytek se promyje dvěma nebo třemi objemovými díly Et₂O a znovu se odstředí. Pokud je to žádoucí, jsou surové lineární peptidy přečištěny preparativní HPLC. Peptidy se převedou do kolon v minimálním objemu buď AcOH/H₂O nebo 0,1% TFA/H₂O. Gradientová eluce zpravidla začíná při 10% B pufru, 10%-60% B za 90 min. (pufr A: 0,1% TFA/H₂O, pufr B: 0,1% TFA/CH₃CN) a průtokové rychlosti 8ml/min. UV detekce probíhá na 280 nm. Frakce se jímají v intervalech 1,0 -2,5 min a jsou monitorovány analytickou HPLC. Frakce vysoké čistoty se jímají do sběrné nádrže a lyofilizují.

Přečišťování surových peptidových preparátů

Přečišťování surových peptidů se provádí preparativní HPLC. Peptidy se převedou do kolon v minimálním objemu buď AcOH/H₂O nebo 0,1% TFA/H₂O. Gradientová eluce zpravidla začíná při 10% B pufru, 10%-60% B za 90 min.

(pufr A: 0,1% TFA/H₂O, pufr B: 0,1% TFA/CH₃CN) a průtokové rychlosti 8ml/min. UV detekce probíhá na 280 nm. Frakce jsou jímány v intervalech 1,0 2,5 min a monitorovány analytickou HPLC. Frakce vysoké čistoty se jímají do sběrné nádrže a lyofilizují.

• · · · · · ·· · • ··· · ···· · · · • ······· · · ··· · · ·· · ···· ···· v · · ·· ·· ·· ·· v

Čistota konečných produktů reakce je kontrolována analytickou HPLC se zpětnou fází, jak je uvedeno výše. Čistota všech produktů se pohybuje v rozmezí od přibližně 95% do 99%. Složení veškerých konečných produktů se zjišťuje FAB hmotnostní spektrometrií (FAB-MS) nebo ES hmotnostní spektrometrií (ES - MS). Všechny produkty vykazují předpokládané výchozí M+H ionty v přijatelných mezích.

Využitím výše popsaných postupů mohou být sloučeniny podle vynálezu syntetizovány podle následujících reakčních schémat.

Reakční schéma A • ··· · ···· · · · • ······· ·· · · · ·

1. Piperidine, DMF

Piperidine, DMF

ÍDBU. merfcaptoethaiiol DMF

Cyklus 3

BocNH rio /(CHJm

7a(R8=H) 7b_(R⁸ = CH₃)

Fmoc-Arg(Pmc)-OH (8), HBTU. DMF _aebo Fmoc- Cit-OH (9), HBTU, DMF

FmocNH_x0L_N

L ¹ ° > R⁸

NH

R⁷

NHPG

10a (R⁷=NH, PG = Pmc) 10b (R⁷=O, PG = H)

R^s, R\ R”am mají výše uvedený význaní· • · · • · · • * ·

Reakční schéma Β

FmocNH

BocNH rs rio >CH₂)m

S ° ⁰

74..

„A

NH

NHPG

10a (R⁷=NH, PG = Pmc) 10b (R⁷=0, PG = H)

FmocNH

·) ·

BocNH

R* R^w /CHgJm

1. Piperlďin , DMF

Fmoc-(D)-Phe-OH, HBTU. DMF

Cyklus 4 o \ R ~ N._k| 'NH

^.^Á-NHPG

11a (R⁷=NH, PG = Pmc) 11b (R⁷=0, PG = H)

1. Piperidine, DMF

2. FmocNH COjH. HBTU, DMF

FmocN

m,p,Q,R³,R⁴,R^;Jť,R^saR^;C maj: výše uvedený vý znam

14a fR⁷=NH. PG = Pmc) 14b (R⁷=O. PG = H)

Cyklus 5

FmocNH,

1. Piperidine, DMF

Fmoc-Asp[OBui)-OH r16). HBTU, DMF nebo j ,, , , ,

Fmoc-Glu(OBut)-OH(17),HBTU.OMF CVK1US O

18a(R⁷=NH, PGxPmc)

18b (R⁷sQ. PG = H)

h. Piperidine. DMF £ Fmoc-Nle-OH (20), HBTU. DMF

BocNH

R· R» _z(CH)m “VMS) f O r j^H O vi. O o / ^Q flfH 'NHPG

1. Piperidine, DMF ² FmocNH CO.H, HBTU, DMF

F 13 v BocNH o zy₀ ?· r/⁰¹?™ _ρο k^A· o o

O, OlBu

V _y(CH,)p

FmocNH

Cyklus 7 'NHPG

15a (R7₌nh. PG = Pmc) 15b fR⁷=O. PG«H)

1. Piperidine. DMF

Fmoc-Asp(OBut)-OH (16), HBTU, DMFftebo Fmoc-Glo(OBut)-OH (17), HBTU, DMF

BocNH

C'= /□: Γ r)'“·VAVCkVÁ'®

O | | ⁿ O \ R· θ O

°γ°®“ .(OHjlp

19a (R⁷=NH, PG = Pmc) 19b (R⁷=O, PG = H)

1. Piperidine, DMF 2 Fmoc-Nle-OH (20), HBTU, DMF BocNH □ /°7o XX r r)^tcT^ Λ ν'®

M-i

A· °

NH

NHPG

21a (R⁷=NH, PG = Pmc) 21b(R⁷=O, PG = H)

22a ffl⁷=NH. PG = Pmc)

22b (R⁷=O. PG = H)

4 • » · * i 4 4

4 4 4 4

4 4 4 • 4 4 9

4 4 4 4 9

Reakční schéma C

44 49

Piperidine, DMF

Stupně 3 '5

R'. R “ a m tnaji výše uvedený význam

Obdobným způsobem:

· • •*4

Reakční schéma D

V» « to*

V · » · · * • ♦ ♦ · · * · · * • ····#«· ·· • * · * « · »·

18a (R⁷=NH, PG = Pmc) 18b (R⁷=0, PG = H)

1. piperídin. DMF 2 \^T-acv1ace

O niRu

p?íÁ~NHPG

27a (R⁷=NH, PG = Pmc) 27b (R⁷=O, PG = H)

18a

18b

R‘^:. R^s. R\ R^{1 2}. Qara mají výše uvedeny význam

1. . piperídin, DMF

2. R<N=C=O, DIPEA DMF nebo ClMM v

28a (R⁷=NH, PG = Pmc) 28b (R⁷=O, PG = H) • · • · · ·

Reakční schéma F

BocNH Rto

14a (R⁷=NH, PG = Pmc) 14b (R⁷=O, PG = H)

FmocNH

NH ~NHPG

15a (R⁷=NH, PG = Pmc) 15b (R⁷=O, PG = H)

1. Piperidin , DMF

2.

Reakční schéma G • · · · · • · · • · · • · · ·

29a (R⁷=NH, PG = Pmc) 29b (R⁷=O, PG = H)

30a (R⁷=NH, PG = Pmc) 30b (R⁷=O, PG = H)

31a (R⁷=NH, PG = Pmc) 31b (R⁷=0, PG = H)

BOP

V

kys .trifluoroctová v

32a (R⁷=NH, PG = Pmc) 32b (R⁷=0, PG = H)

I • · « · • · · ·

H,N • · · • · · · • · · · · · • · ·

Reakční schéma H %^0H y^OtBu /w

W ^BocNH\ _ o i f h o Arg f ív^(ChA> · . Ά _δ

ΆVXyAyVy —— - -—, o r 1 Η n =. o O 'nh 33a (R⁷=NH, PG = Pmc) ^R4 _rÝnhpg 33b(R⁷=O,PG = H)

O^OtBu (CHj)p Til

Rt Λ í ^H ů Ar o P⁹ ?'Y^(C!& O ^r ' H _.O \ o o

BocNH kys.trifiuoroctová ť H O rV; f ?Y^<C r\ = !__rs r\

Λ/ > k^{0 ó}

II Τ Y 39a(R⁷=NH) ' 39b (R⁷=O) °γ^ΟΗ /oyp ^ΗΛ « j? ί H o Af O r ipyW

Y b tAwA*' *-^ΗΗΟΓΊΗ_ο- ί_{8θ 0}

L .. γπ

S h· ° o

34a(R⁷=NH, I _NH ϋ=β v. “iw-i, PG = Pmc) -^R4 rYnkpg ^(R7=0> ^PG = ^H>

'NH 40a (R⁷=NH) _rYnH₂ 40b (R⁷=O)

O^OtBu

JCHJp

BocNH _n, H O (Jo YY _n R⁹ R’° ACHJrn

ΥΛ

Č Q ° >ř· ° ° °γ^ΟΗ /CH^p

R²

HjN

I _n R⁹ R» )(CHJm NHj ^NH 35a (R⁷=NH, PG = Pmc) _RY_Hpe35b{R⁷=O.PG = H)

HO Z η YY _Λ R⁹ R’° z<^C ’ ’QY °

R⁷

NH

Ynh, °yOtBu ,(CH₂)p

Τ χχ BocNH 1 (CH,)p Tl \

Η H O Z J o YY_n EP rio/CH.)¹ / oQ« o γ,ο o .....

kvs.trifhionxtová °γ^ΟΗ ,<CH₂)p

41a{R⁷=NH) 41b (R⁷=O)

Η,Ν_χ l⁹ R¹⁰

NHj v ° ⁰

A,_u 36a (R⁷=NH, PG = Pmc)

36b(R⁷=O, PG = H) _Rř'

N N ? ť H° Al ° P⁹ PV^<C ϊ WVmW·

Z °Q ⁰ Ύ ⁰

o. OH

42a (R7=NH) 42b (R⁷=O)

Sy⁰® (CH₂)p Til (CH,)p Ti BocNH Τ M 2 ( h ° ffi O S*⁹ p¹⁰/^^CHs^^m

Μ i í»? Y r nTT™·

V r W Y ÁA nT -->- ° f ^ofi^H o \ ± o O ° ( ^h TY rTX^J . > y? τ o V o o '^R3 t 37a (R⁷=NH, PG = Pmc) 37b (R⁷=O, PG = H) ^NHPG

O^OtBu (CH₂)p ...

rJLn ů / h ° Aí 2 F F°/^(Cr2A i^trifloopxto·

BocNH °γ^ΟΗ ,(CH₂)p

NH pZnh,

43a (R⁷=NH) 43b (R⁷=O) (Τ' riWM 5 5Ύ i

R«

NH 38a (R⁷=NH, PG = Pmc) Ynh_Pg^^(R7=⁰'^{PG = h}>

'ί Λ wýva i °ΟΛ°

B9 pio>(3H₂)m

R⁹

NH

44a (R⁷=NH) 44b(R⁷=O) r/nh,

R , R , R , R , R⁶, R⁸, R⁹, R¹⁰, Q, p a m mají výše uvedený význam • · • · · · • · · · • · · ·

Reakční schéma I °Y^0H H_SN (CHJp jQ \ °ΓΊ^Π rP \ '_R.° ° '(CHj)m •NH, % R^a fV <_NH 39a (R⁷=NH) ^{1 J} ? 39b fR7=O)

Rt>-NH₂ - ¹ » /Το X o « »./'“·>

XbVXbVXjXX·

5*^H 40b (RZ=O)

Rl A Z ti íí Ól ? ! ? / h ri _O[^H j ₂ , τ γ

NH ^R‘ rt>NH₂

.. X ^R< rtXnh.

I '(CHJm BOP (CH₂)p ^ΗΛ

S Tn<^R3 L 43a(R7=NH) / JLJL NH 43b(R7=O) ''“Π* J r^NH₂ °γ^0Η .(CHJp (CH₂)p ^z \

VXuΑΧ, OX

O = H )f>< ÍJ if = N TT f l °Γ 1 o v* o o h₂n

Fis pw}(CH_s)m BOP •NH,

R' ° X R. ° °

44a(R7=NH)

-R4 Ϊ^Η 44b(R7=O) rX~^NH2 •MsA 1 ti ? ? T ?

o h f °U\? >R· ° : d⁵

R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁸, R⁹, R¹⁰, Q, p a m mají výše uvedený význam

I • · • · • · · ·

Reakční schéma J • · · · · ·· · · · ·· · ··· · ···· · · · ······· ·· ··· · · • · ···· ···· ·· · · · · · ·· · ·

R⁸, R⁹ a R¹⁰ mají výše uvedený význam • ·

Reakční schéma K

NHPG

FmocNH

1. Piperidin DMF 2 Fmoc-Cys(Trt)OH

I 1. Piperidin DMF ., _

A 2 Fmoc-NleOH (20), HBUJ, DMF i_yklUS /

STrt

FmocNH • · · ♦ · · · • · · · ···· · · ······· ·· ··· ·

1. Piperidin DMF 2 Fmoc-Cys(Trt)OH

Cyklus 6

FmocNH

STrt

R³ rw .STrt

O li ^H O V R^s o O

53a (R⁷=NH, PG=Pmc)

NH 53b (R⁷=O, PG = H)

NHPG

1. Piperidin DMF 2 Fmoc-Nte-OH /20). HBTU, DMF

STrt n / U R9 Rto Strt 1 R³ R¹⁰ < °Q°ý° ° i °Q>Z° ° / NH / JI J NH

NH

NHPG

NH 'NHPG

54a fR⁷=NH. PG = Pmc) 54b (R⁷=0. PG = H)

55a (R⁷=NH. PG = Pmc) 55b(R⁷=O.PG = H)

R , R⁴, R⁵, R⁶, R⁸, R¹⁰, Q, p a m mají výše uvedený vyznám • · · ·

Reakční schéma L • · · · • · · · · • ····· · ·

52a (R⁷=NH, PG = Pmc) 52b (R⁷=0, PG = H)

56a (R⁷=NH, PG = Pmc) 56b (R⁷=O, PG = H)

52a

52b

1. piperidin, DMF

2. R-N=C=O, DIPEA DMF nebo CH₂C1₂ 'ř

_r7sAnhpg

57a (R⁷=NH, PG = Pmc) 57b (R⁷=O, PG = H)

R², R⁸, R⁹, R¹⁰, Q, am mají výše uvedený význam • Φ·φ

Reakční schéma Μ

53a(R⁷=NH, PG = Pmc) 53b(R⁷=O, PG = H)

(a) i. piperidin, DMF ii acylace (b) i. piperidin, DMF ii RÁN=C=O

54a (R⁷=NH, PG = Pmc) 54b (R⁷=O, PG = H)

Ay_s

STrt

>0_o R’R’«r

VAVV·®

O \ OÍ ó O

STrt

S R⁸ ^μη 60a (R⁷=NH, PG = Pmc) _R7^._NHpgSS6(R⁷=O, PG = H)

flWj, o _R7Xhpg

61a(R⁷=NH, PG = Pmc) 61b (R⁷=O, PG = H)

55a (R⁷=NH, PG = Pmc) 55b (R⁷=O, PG = H)

R‘^X'T''R* +NHPG — ^{(R7=O> PG} = ^H)

FP ^R

Reakční schéma N

·· · · · ·· ·· · ·

R10 .STrt

N

O ky s. trifluoroe tová

64a (R⁷=NH) 64b (R⁷=O)

I « · « · « S • · · φ φ φφφ · * · · · φφφφφφφ φφ « ¹ φ · · φ φ

Reakční schéma Ο

Η 9 Τ .Τ Η

N-LFj kys.trií] uorocíová

-r:

58a (R⁷=NH, PG = Pmc)

R^f ' 'R⁴ _rÝnhpg 55b (R⁷=o, pg = H) R^s /^SH Π SH ° ^H ,3° Š A® O ° ^NH 85a (R⁷=NH) R“ _rÝnh₂ 55b (R⁷=0) ,NH,

STrt

STrt

kys, trií] uorocíová

Q pfo. Γ F nY/n „ _n3° S'h®° ⁰

ΉΗ

59a (R⁷=NH, PG = Pmc) «· „>nhps sa0”-°.ro-H>

, H O // _n YY ~ R⁹ R’° J < °Q ° γ ϊ

R?.

kvs.írifluoroctová

80a (R⁷=NH, PG = Pmc) r⁷>nhpg^<^r-°-^{pg = h})

Η H O Z^SR^rt _o TO _o EP Rio 1 ik < °Cj^h ° s R» ° ° / ^Q k... 61a (R⁷=N]

NH NHPG χύΥπ ď

NH₂

1^8 O O NH 86a (R⁷=NH) _R>_NH2 66b(R⁷=O) x·. ΟΠ ° f °(j^HO\keO o / ° Sh S7a(R⁷=l kys.trifluoroctová

61a (R⁷=NH, PG = Pmc) 61b(R⁷=O,PG = H) v·® $ SrV \ kys.trifluoroctová

R⁸

62a (R⁷=NH, PG = Pmc) NH 62b (R⁷=0, PG = H) ^ANHPG

STrt .STrt ⁵ f H O ’=NH) _R7>_NH26Zb(R⁷=O)

N Π Λ ° Áfo P P’°) °Q^{H 0} γρρ ° ° _NH ^3 (R⁷=NH) - 68b (R⁷=O)

SH SH * V<A í S ϊ «V O f H ρΛ/άΥ/ϊΥ^ ^οΓΐ^Ηονΐ«ο o > R^{8 u} ζ 69a (R⁷=NH) NH69b(R7_=O) rYnH,

kys .trifluoroctová

N

R⁸

NH o o

63a (R⁷=NH, PG = Pmc) ^R4 _rZnhpg^^(R7=0-^{pg = h}) *-íj β ϊ / η β rQo f rJ * J rYr^vsV^Y¹ > w· \ _NH 70a(R⁷=NH) R‘ J? 70b (R⁷=O) φ ·φ«

Reakční schéma Q φ φ φφφ* *· Φ· • · « · · ΰ • * φφφ φφφ φφ » · «φφ φ · φφ φ φφφφ φφφφ φφ φ ·φ φ* «< φφ

mají výše uvedený význam

• ·

Reakční schéma R • · · · · · • · · · · · · • ······· ·· • · · · · · • · · · ·

HO

RÁTialogenid > _R

Na₂CO₃ nebo K₂CO₃

->- Q aceon, t.v. pod zp.chladičem nebo DMF/100°C

Reakční schéma S

R , R , R⁵ mají výše uvedený význam • ·

Reakční schéma T

R³, R⁴, R⁵, R⁶

mají výše uvedený význam

Reakční schéma U

Na, ethanol t.v.pod zp. chladičem

Na, ethanol tv.pod zp.

chladičem

OMe ^tvP°d zp. chladičem

OMe • · · ·

Reakční schéma V

R⁶ má výše uvedený význam

Lineární peptidy používané jako předposlední meziprodukty při syntézách cyklických peptidů podle vynálezu (struktura 1) se připraví běžnými postupy syntézy peptidů v pevné fázi, jak je uvedeno výše. Každý cyklus zahrnuje dva postupy; počáteční odštěpení Fmoc ochranné skupiny z koncového dusíku v řetězci pryskyřice a následnou acylaci aminové funkční skupiny Fmoc chráněnou aminokyselinou. Cyklus zpravidla probíhá v reakčním sledu, popsaném v Protokolu 1. Odstranění ochranné skupiny se docílí použitím organické báze, např. piperazinu, morfolinu nebo piperidinu, výhodně piperidinu, ve vhodném inertním rozpouštědle, např. N,N-dimethylformamidu (DNF) nebo N-methylpyrrolidonu (NMP). Kondenzační reakce se provádí jedním z mnoha postupů vytvořených pro vznik amidové vazby, např. v přítomnosti O-benzotriazol-1 -yl-N,N,N',N'tetramethyluroniumhexafluorfosfátu (HBTU) a organické báze, např. diisopropylethylaminu (DIPEA) v inertním rozpouštědle, např. DMF.

Amidová skupina může být případně vytvořena za použití karbodiimidu, např. diisopropylkarbodiimidu (DIC) společně s aktivačním činidlem, např. 1• · · ·

.......

hydroxybenzotriazolem (HOBT) ve vhodném inertním rozpouštědle, např. DMF.

V reakčním schématu A, v prvním cyklu přípravy lineárních polypeptidů jako prekurzorů pro cyklické peptidy struktury 1, kde Z je skupina NHCO, je u Fmoc-linker-BHA pryskyřice, znázorněné strukturou 2, odstraněna ochranná skupina. Tato pryskyřice je kondenzována s Fmoc aminokyselinami struktury 3 za vzniku sloučenin s pryskyřičnou vazbou, znázorněných strukturou 4. Při syntézách cyklických peptidů je žádoucí, aby Fmoc-aminokyselina 3 obsahovala klíčový strukturální požadavek,kterým je vhodně chráněný základní postranní řetězec, který se může po odstranění ochranné skupiny účastnit tvorby intramolekulámí amidové vazby. Za účelem prodloužení rostoucího peptidového řetězce začleňuje druhý cyklus Fmoc-aminokyseliny 5 za vzniku sloučenin struktury 6. Ve třetím cyklu vznikají z peptidů s pryskyřičnou vazbou 6 meziprodukty 7a, kde R je atom vodíku. Meziprodukty struktury 7b, kde R je methylová skupina, jsou syntetizovány postupem znázorněným v reakčním schématu C.

Meziprodukty struktury 7b se připraví ze sloučenin struktury 7a, jak je znázorněno v reakčním schématu C. Při tomto postupu reagují sloučeniny struktury 7a, připravené reakcí sloučenin struktury 6, jak je ve stupních 1-5 protokolu 1, s arylsulfonylchloridem, výhodně 2-nitrobenzensulfonylchloridem 23 za vzniku sloučenin struktury 24. Tato reakce se provádí za přítomnosti akceptoru protonu, např. pyridinu, triethylaminu (TEA) nebo DIPEA, výhodně DIPEA, ve vhodném inertním rozpouštědle, výhodně DMF. N-methylace vzniklé sulfonamidové skupiny vpromytých sloučeninách s pryskyřičnou vazbou struktury 24 se provádí za Mitsunobuových podmínek za vzniku sloučeniny struktury 25. Při této reakci reagují sulfonamidy struktury 24 s methanolem v přítomnosti diethylazodikarboxylátu (DEAD) a trifenylfosfinu za použití methanolu jako rozpouštědla. Po ukončení reakce se N• · · · · ·

.......

methylsulfonamid s pryskyřičnou vazbou struktury 25 promyje, čímž se odstraní zbytková činidla a vedlejší produkty.

V následujících stupních, jak je znázorněno v reakčním schématu A, se 2nitrobenzensulfonylový zbytek odstraní ze struktury 25 reakcí sloučeniny 25 s 2merkaptoethanolem a silnou organickou bází l,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7enem (DBU) ve vhodném rozpouštědle, výhodně DMF za vzniku meziproduktu s pryskyřičnou vazbou struktury 7b. Třetí cyklus reakčního schématu A je ukončen kondenzační reakcí sloučenin struktury 7a nebo 7b s Fmoc-Arg(pmc)OH (8) nebo Fmoc-Cit-OH (9) za vzniku sloučenin s pryskyřičnou vazbou struktury 10.

Následující dva cykly znázorněné vreakčním schématu B se nejprve provádějí reakcí peptidů struktury 10 s aminokyselinou Fmoc-(D)-Phe-OH za vzniku sloučeniny struktury 11 a poté reakcí této sloučeniny struktury 11 s jednou z odvozenin aminokyselin struktury 12 nebo 13. Tyto aminokyseliny se začlení do peptidu s pryskyřičnou vazbou za vzniku pentapeptidů s pryskyřičnou vazbou struktury 14 a 15 v závislosti na tom, která odvozenina aminokyseliny je užita. Začlenění dalších aminokyselin obsahujících postranní řetězce s karboxylovu kyselinou do lineárních pentapeptidů vhodných pro participaci na tvorbě cyklických peptidů podle vynálezu je uskutečněno dvěma způsoby:

a. Jak je zřejmé z reakčního schématu B je Fmoc aminokyselina s vhodně chráněným kyselinovým postranním řetězcem začleněna do pentapeptidů s pryskyřičnou vazbou struktury 14 a 15. Takto je v cyklu 6 (reakční schéma B) Fmoc-Asp(OtBu)-OH (16) nebo Fmoc-Glu(OtBu)-OH (17) začleněna do rostoucího peptidového řetězce za vzniku hexapeptidů s pryskyřičnou vazbou struktury 18, resp. 19, nebo

b. Pentapeptidy s pryskyřičnou vazbou 14 a 15 jsou přes N-koncovou čepičku spojeny s cyklickým anhydridem struktury 28' (reakční schéma • ·

.......

F), např. anhydridem kyseliny maleinové nebo ftalové, za vzniku sloučenin struktury 29 a 30, nebo

c. Jak je zřejmé z reakčního schématu B, reagují dále hexapeptidy 18 a 19 s pryskyřičnou vazbou s další aminokyselinou za vzniku heptapeptidu dříve, než dojde k reakci na N-koncové čepičce. Tato reakce se provádí běžným začleněním aminokyselinového zbytku, výhodně Fmoc-Nle-OH, za vzniku 21 a 22.

Spojením heptapeptidu nebo hexapeptidu přes N-koncovou čepičku vzniká koncová amidová funkční skupina sloučeniny 1. Tímto způsobem vznikají substituenty X, Y, R¹² a R¹. Ke spojení hexapeptidů s pryskyřičnou vazbou (18, 19) nebo heptapeptidů (21, 22) přes N-koncovou čepičku dochází po předchozím působení piperidinu v DMF na polypeptid, čímž se odstraní Fmoc ochranná skupina a poté reaguje s acylačním činidlem. Jak ukazuje schéma D, vznik sloučeniny struktury 1 před vytvořením Z, kde X a Y je skupina CH a R¹ je skupina

-HN-C-R₂ je polypeptid s pryskyřičnou vazbou struktury 18 zbaven ochranné skupiny a acylován na atomu dusíku za vzniku amidu s pryskyřičnou vazbou struktury 27, nebo po odstranění ochranné skupiny reaguje s isokyanátem za vzniku močovin struktury 28. N-acylace se provádí různými metodami známými v oboru. Mezi užívané metody patří:

(i) reakce koncové funkční aminoskupiny s karboxylovou kyselinou R²CO₂H ve vhodném rozpouštědle, např. DMF za přítomnosti HBTU, a organické báze, výhodně DIPEA;

• · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · (ii) reakce koncové funkční aminoskupiny s chloridem karboxylové fy kyseliny R -COC1 ve vhodném rozpouštědle, např. dichlormethanu v přítomnosti organické báze, např. pyridinu, TEA a DIPEA, výhodně DIPEA, nebo (iii) reakce koncové funkční aminoskupiny s anhydridem karboxylové kyseliny struktury 28', jak znázorňuje reakční schéma F. Tato reakce se provádí ve vhodném rozpouštědle, např. dichlormethanu nebo DMF v přítomnosti organické báze, výhodně DIPEA.

N-koncové reakce tvořící čepičku v reakčním schématu D, kde sloučeniny struktury 18 jsou převedeny na močoviny struktury 28, se provádí reakcí koncové aminoskupiny sloučenin struktury 28 s isokyanátem R²-NCO. Tato reakce probíhá ve vhodném rozpouštědle, dichlormethanu nebo DMF v přítomnosti organické báze, výhodně DIPEA. Po ukončení acylace a tvorby močoviny se produkty s pryskyřičnou vazbou 27 a 28 promyjí, čímž se odstraní zbývající činidla a vedlejší produkty. Spojení polypeptidů s pryskyřičnou vazbou struktury 19, 20 a 21 přes N-koncovou čepičku se za podobných podmínek provádí tvorbou N-acylovaných sloučenin struktury 33, 35 a 37 a močovin struktury 34, 36 a 38 (reakční schéma E). Reakční schéma E však může být modifikováno tak, aby poskytlo R¹⁴ skupiny jiné než odvozené od Nle využitím známých aminokyselin odlišných od sloučeniny struktury 20 v reakčním schématu B za vzniku sloučenin struktury 21 a 22.

Reakční schéma G a H znázorňuje odštěpení zbývajících ochranných skupin v polypeptidech 29, 30, 33 - 38 sN-konocovou čepičkou a současné odštěpení peptidů od pevného základu. Tato reakce se provádí za užití silné organické kyseliny, výhodně kyseliny trifluoroctové, a je možno ji provádět v inertním rozpouštědle, např. dichlormethanu a nepatrném množství vody (1%) a • · · ·

.......

případně v přítomnosti jedné či více látek zachycujících karbokation, např. ethandithiolu, dimethylsulfidu, triethylsilanu a anisolu. Roztok pomocí něhož se štěpí polypeptidový řetězec je odfiltrován od pevného základu, poté rozpuštěn ve vhodném rozpouštědle, výhodně diethyletheru, a vzniklý pevný podíl se filtračně jímá. Pevné polypeptidy struktury 39-44 vzniklé podle reakčního schématu H mohou být přečištěny chromatografií se zpětnou fází užitím preparativních kolon Cl8.

Lineární polypeptidy s N-koncovou čepičkou, obsahující vhodné funkční skupiny, které jsou v této fázi schopné tvorby intramolekulámí amidové vazby, reagují za vzniku amidů, a to za obecně známých podmínek. Každý z lineárních peptidů 31, 32 (reakční schéma G) a 39-44 (reakční schéma I) je postupně rozpuštěn v inertním rozpouštědle, např. DMSO. Před přidáním činidla vytvářejícího amid, např. BOP, se pH roztoku upraví přidáním terciární báze, např. N-methylmorfolinu, na hodnotu 8. Reakce se výhodně provádí při teplotě mezi 0°C a 40°C, výhodně při okolní teplotě. Reakce se nechá probíhat do úplného ukončení. Běžnými metodami sledování průběhu reakce jsou např., chromatografie na tenké vrstvě nebo analytická HPLC. Po odstranění reakčních činidel in vacuo se surové cyklické peptidy struktury I, kde Z je skupina NHCO jak znázorňuje reakční schéma I, přečistí chromatografií se zpětnou fází za použití kolon Cl8. Takto vznikají sloučeniny struktury 1, přičemž Z je NHCO můstek.

Cyklické disulfidické peptidy struktury 1, kde Z je disulfidový můstek, se připravují postupy znázorněnými v reakčních schématech obdobnými postupům v reakčních schématech A až H pro přípravu laktamů struktury 1, kde Z je skupina NHCO. Předposlední lineární peptidy vznikají obdobným způsobem s tím, že jsou však aminokyseliny obsahující chráněné zbytky thiolových postranních řetězců, např. Fmoc-Cys(Trt)-OH, začleněny na vhodné místo rostoucího polypeptidu s pryskyřičnou vazbou, výhodně v cyklu 1 a 6. Tato příprava lineárních polypeptidů s pryskyřičnou vazbou je znázorněna * * v reakčních schématech J a K. Jak bylo výše popsáno a znázorněno v reakčním schématu L, může být po odstranění chránící skupiny Fmoc lineární hexapeptid s pryskyřičnou vazbou 52 spojen přes N-koncovou čepičku buď acylací za vzniku sloučeniny 56, nebo reakcí s isokyanátem za vzniku močoviny 57. Stejným způsobem jsou na N-acylované deriváty 58, 60 a 62 a močovinové deriváty 59, 61 a 63 (reakční schéma M) převedeny hexapeptidy s pryskyřičnou vazbou 53 a heptapeptidy s pryskyřičnou vazbou 54 a 55.

V reakčním schématu N reaguje lineární hexapeptid obsahující pryskyřičnou vazbu 56 a N-koncovou čepičku se silnou kyselinou, výhodně kyselinou trifluoroctovou, případně v inertním rozpouštědle, např. dichlormethanu a případně v přítomnosti jedné či více látek zachycujících karbokationty, např. ethandithiolu, dimethylsulfidu, triethylsilanu a anisolu. Tato reakce způsobuje odštěpení všech chránících skupin postranního řetězce stejně jako odštěpení lineárního peptidů od pevného základu. Reakce se výhodně provádí při teplotě mezi 0°C až 35°C, výhodně při okolní teplotě. Roztok s odštěpeným polypeptidem je odfiltrován od pevného základu, poté rozpuštěn ve vhodném rozpouštědle, výhodně diethyletheru, a vzniklý pevný podíl se filtračně jímá. Takto vzniklý pevný polypeptid 64 může být přečištěn chromatografií se zpětnou fází za použití kolon Cl8. Lineární hexapeptid 64 poté reaguje za oxidačních podmínek známých v oboru, které způsobují vznik disulfidové vazby z thiolů. Obdobným způsobem se pH zředěného vodného roztoku 64 upraví na hodnotu 8 užitím slabé anorganické báze, výhodně hydroxidu amonného, a poté se roztokem probublává kyslík, dokud není proces cyklizace ukončen, jak je indikováno pomocí chromatografie na tenké vrstvě nebo HPLC. Po odstranění reakčních rozpouštědel lyofilizací mohou být daným způsobem vzniklé a izolované surové cyklické peptidy (I; Z=S-S) přečištěny chromatografií se zpětnou fází za použití kolon C18.

Za podmínek popsaných výše v reakčních schématech Hal jsou lineární polypeptidy s pryskyřičnou vazbou 58-63 z reakčních schémat O a A zbaveny «· · · » · ♦ ♦ - «« ·· ochranných skupin a odštěpeny od pevného základu za vzniku lineárních peptidů 65-70 (reakční schéma O), které jsou poté výš uvedeným postupem oxidačně cyklizovány za vzniku příslušných sloučenin struktury 1 (reakční schéma P).

Fmoc-aminokyseliny užité při přípravě výše uvedených peptidů i acylační činidla a isokyanáty užívané kN-cap polypeptidů jsou známé komerčně dostupné sloučeniny. Fmoc-aminokyseliny 12 včetně od ní odvozené sloučeniny struktury 13, užité v reakčním schématu B, se připraví v organické chemii běžně známými postupy. V reakčním schématu Q je znázorněna příprava odvozenin Fmoc-aminokyselin struktury 12 z cyklických ketonů. Tyto sloučeniny struktury 12 a struktury 13, 79 a 80 se připravují stejným způsobem jako sloučeniny struktury 75, jak znázorňuje schéma Q. 4-fenylcyklohexanony struktury 71 se převedou na hydantoiny struktury 72 reakcí s uhličitanem amonným a kyanidem draselným. Reakce se výhodně provádí ve vodné ethanolové směsi při teplotě od 50°C do 90°C, výhodně mezi 80°C a 90°C. Přímá hydrolýza hydantoinů na aminokyseliny struktury 73 vyžaduje delší působení silné báze, např. 6N roztok hydroxidu sodného nebo hydroxidu bamatého při teplotě varu pod zpětným chladičem. Sloučeniny struktury 72 mohou být případně převedeny na bis-Boc deriváty struktury 74. Reakce se provádí za přítomnosti terc.butyldikarbonátu [(Boc)₂0] v inertním rozpouštědle, výhodně tetrahydrofuranu (THF), organické aminové báze, výhodně TEA a katalyzátoru 4-dimethylaminopyridinu (DMAP) při teplotě od 0°C do okolní teploty, výhodně při okolní teplotě. Bis-Boc hydantoiny struktury 74 se snadno převedou na aminokyseliny struktury 73. Reakce probíhá v IN roztoku hydroxidu sodného v inertním rozpouštědle, výhodně dimethoxyethanu (DME) při teplotě od 0°C do 50°C, výhodně při okolní teplotě. Chránění funkční aminoskupiny pomocí Fmoc skupiny ve sloučenině struktury 73 se provádí za různých reakčních podmínek za vzniku sloučeniny struktury 75, kterou je odvozenina Fmoc-aminokyseliny struktury 12. Reakce může být výhodně prováděna reagováním roztoku aminokyseliny 73 ve směsi THF nebo dioxanu, výhodně dioxanu a vodném uhličitanu amonném, s 9-fluorenylmethoxychloroformátem (FmocCl) při teplotě od 0°C do okolní teploty, výhodně při okolní teplotě. N-(9fluorenylmethoxykarbonyloxy)sukcinimid (FmocOSu) je případně přidán do roztoku aminokyseliny 73 ve vodném roztoku acetonitrilu obsahujícím organickou terciární bázi, výhodně TEA. Reakce probíhá v rozmezí teplot od 0°C do okolní teploty, výhodně při okolní teplotě. Při jiném postupu se DME odpaří od hydrolyzační směsi při převedení 74 na 73 a pH reakce se upraví na hodnotu 11. Výsledný roztok sodné soli 73 poté reaguje in sítu s FmocOSu nebo FmocCl v dioxanu v rozmezí teplot od 0°C do okolní teploty, výhodně při okolní teplotě. Obdobným způsobem jako v reakčním schématu Q mohou být tetralony 76, N-aryl-4-ketpiperidiny 77 a deriváty cyklohexanonu 78 převedeny na příslušné Fmoc-aminokyseliny struktury 13, 79 a 80, které jsou stejně tak jako sloučenina 73 odvozeny od sloučeniny struktury 12, použité v reakčním schématu B.

Jak znázorňuje reakční schéma Q, sloučeniny struktury 73, kde R⁴ představuje lineární či rozvětvenou nižší alkoxyradikálovou skupinu a R² a R³ jsou atomy vodíku v odvozené 82, se připraví O-alkylací sloučeniny struktury 81, jak znázorňuje reakční schéma R. Tam, kde R¹⁶ představuje nerozvětvený nižší alkylový zbytek, se alkylace provádí užitím primárního alkylhalogenidu struktury halogenid-R¹⁶ v přítomnosti uhličitanu alkalického kovu, např. uhličitanu sodného nebo draselného. Alkylhalogenem může být derivát chlóru, bromu nebo jódu, výhodně alkyljodid. Reakce se výhodně provádí v inertním rozpouštědle, které podporuje S_N2 reakce, např. v acetonu, 2-butanonu nebo N,N-dimethylformamidu, výhodně acetonu, v teplotním rozmezí od okolní teploty do teploty varu pod zpětným chladičem, výhodně při teplotě varu pod zpětným chladičem. Pokud R¹⁶ představuje rozvětvenou nižší alkylovou skupinu, např. 2-propylový radikál, provádí se alkylace sloučeniny struktury 81 za vzniku sloučeniny struktury 82 užitím sekundárního alkylhalogenidu • 999

• 9 · · • · · · · · • · · · · · • · · · 9 • 9 · 9 struktury halogenid-R¹⁶ v přítomnosti uhličitanu alkalického kovu, např. uhličitanu draselného. Sekundárním alkylhalogenidem je výhodně sekundární alkyljodid, např. 2-jodpropan. Reakce výhodně probíhá v inertním rozpouštědle, výhodně Ν,Ν-dimethylformamidu v rozmezí teplot od okolní teploty do teploty varu pod zpětným chladičem, výhodně při teplotě 100°C.

4-arylcyklohexanoný struktury 71, které jsou výchozími látkami v reakčním schématu Q, se připraví běžnými postupy organické syntézy. Jak je znázorněno v reakčním schématu S reakcí arylhalogenidů struktury 83, kde X¹ představuje atom bromu nebo jódu, s činidlem obsahujícím uhlovodíkový zbatek a atom kovu, výhodně terč. butyllithiem, má za následek transmetalační reakci, při níž vzniká příslušné aryllithium struktury 84. Reakce se výhodně provádí při teplotě -78°C přidáním roztoku alkyllithia do roztoku sloučeniny 83 v inertním bezvodém rozpouštědle, např. diethyletheru nebo tetrahydrofuranu, výhodně tetrahydrofuranu. Takto vzniklé aryllithium struktury 84 poté reaguje in šitu s roztokem monoketalu cyklohexan- 1,4-dionu (85) ve vhodném inertním rozpouštědle, např. tetrahydrofuranu, přičemž reakční teplota se udržuje na hodnotě nižší než -60°C, výhodně na hodnotě asi -78°C, za vzniku karbinolu struktury 86. Sloučeniny struktury 87 se získají dehydratací karbinolu struktury 86. Reakce se výhodně provádí za přítomnosti silné organické kyseliny jako katalyzátoru, výhodně kyseliny p-toluensulfonové v inertním rozpouštědle, např. benzenu nebo toluenu, výhodně toluenu, při teplotě varu rozpouštědla pod zpětným chladičem. Vzniklá voda se z reakční směsi odstraní za použití Dean Stárková přístroje, čímž se docílí ukončení reakce. Sloučeniny struktury 78 vznikají hydrogenací olefinů struktury 87. Reakce se výhodně provádí za použití vzácných kovů jako katalyzátorů, např. palladia na uhlí, v atmosféře vodíku v inertním rozpouštědle, např. ethanolu nebo ethylacetátu. Hydrogenace se obvykle provádí při okolní teplotě a tlaku vodíku 40 psi. Obsahuje-li však arylový kruh ve struktuře 87 skupinu ochotně podstupující hydrogenolýzu, např. když R³, R⁴ nebo R⁵ představuje atom chlóru, je reakční tlak udržován na • · · · «· · · * • · · · • · · · · • ····· · · • · · ·

.....

hodnotě asi 5 psi. Sloučeniny struktury 88 mohou být rovněž získány přímo z karbinolů struktury 86 redukční eliminací hydroxylové skupiny. Při této reakci reaguje roztok sloučeniny struktury 86 (R³=R⁴=H a R⁵=OMe) v inertním rozpouštědle, např. dichlormethanu, s Lewisovou kyselinou, např. bortrifluoridetherátem, a redukčním činidlem, např. triethylsilanem, při teplotě od 0°C do okolní teploty. Odstraněním ketalové ochranné skupiny ve sloučeninách struktury 88 vzniká keton vzorce 71, který je výchozí látkou v reakčním schématu Q pro přípravu Fmoc aminokyselin struktruy 75 odvozených od sloučenin struktury 12. Reakce se výhodně provádí v acetonu nebo 2-butanonu, výhodně acetonu, za přítomnosti kyselého katalyzátoru, např. 4N kyseliny chlorovodíkové nebo kyseliny p-toluensulfonové, při okolní teplotě až při teplotě varu reakční směsi pod zpětným chladičem, výhodně při teplotě varu pod zpětným chladičem.

5-substituované-betatetralony struktury 76, znázorněné v reakčním schématu Q, které jsou výchozími látkami pro přípravu sloučenin struktury 13, jsou obecně známými sloučeninami nebo mohou být připraveny běžnými postupy organické syntézy. Sloučeniny struktury 76 jsou podle vynálezu připravovány v zásadě dvěma postupy znázorněnými v reakčních schématech T a U. Jak je znázorněno v reakčním schématu T, 2-substituovaná kyselina hydrogenskořicová struktury 90 se převede na příslušný chlorid karboxylové kyseliny struktury 91. Tato konverze může být prováděna několika postupy, např. reaakcí kyseliny hydrogenskořicové s oxalylchloridem, případně v přítomnosti katalytického množství N,N-dimethylformamidu, v inertním rozpouštědle, např. benzenu nebo dichlormethanu, výhodně dichlormethanu. Reakce se výhodně provádí při teplotě 0°C až okolní teplotě, výhodně při okolní teplotě. Sloučenina struktury 90 může případně reagovat s činidlem tvořícím acylchlorid, např. sulfurylchloridem, v inertním rozpouštědle, např. benzenu nebo toluenu, výhodně toluenu, při teplotním rozmezí od okolní teploty do teploty varu roztoku pod zpětným chladičem, výhodně při teplotě varu pod • · · · • · zpětným chladičem. Diazoketon struktury 92 se připraví reakcí takto vzniklého acylhalogenidu struktury 91 v inertním rozpouštědle, např. dichlormethanu, s nadbytkem čerstvě připraveného etherového roztoku diazomethanu. Sloučení činidel se výhodně provádí při teplotě ledové lázně a reakce se poté nechá probíhat při teplotě od 0°C do okolní teploty, výhodně při okolní teplotě. Jak je znázorněno v reakčním schématu T, cyklizace diazoketonu strutkury 92, při které vzniká tetralon struktury 76, je podporována dimerem rhodium (II) acetátu v inertním rozpouštědle, např. dichlormethanu. Reakce normálně probíhá při okolní teplotě až při teplotě varu roztoku pod zpětným chladičem, výhodně při teplotě varu pod zpětným chladičem.

Sloučeniny struktury 76, které jsou výchozí látkou v reakčním schématu Q, ve kterém R⁶ představuje přímou nebo rozvětvenou nižší alkoxyskupinu, se připraví postupem znázorněným v reakčním schématu U ze sloučenin struktury 93. V reakčním schématu U se sloučeniny struktury 94, kde R15' je nerozvětvený nižší alkylový zbytek, připraví per-O-alkylací naftalendiolu struktury 93 s primárním alkyljodidem nebo alkylbromidem, výhodně jodidem, v přítomnosti báze, např. uhličitanu alkalického kovu, např. uhličitanu sodného nebo draselného. Reakce probíhá v inertním rozpouštědle, výhodně N,Ndimethylformamidu při teplotě od okolní teploty do 100°C, výhodně při teplotě 35°C. Sloučeniny struktury 97, kde R15' je rozvětvená nižší alkylová skupina, se připraví ve dvou stuppních z 2-tetralonu strukturry 94. Tetralon struktury 95 je dehydrogenován v přítomnosti vzácného kovu jako katalyzátoru, např. palladia (10% na uhlí) ve vhodném vysokovroucím rozpouštědle, např. pcymenu za vzniku aromatické sloučeniny struktury 96. Naftol struktury 96 je následně O-alkylován sekundárním alkyljodidem v přítomnosti báze, např. uhličitanu alkalického kovu, výhodně uhličitanu česného, za vzniku sloučeniny struktury 97. Reakce výhodně probíhá v inertním, výhodně N,Ndimethylformamidu při teplotě od okolní teploty do 100°C, výhodně při teplotě asi 40°C.

• ··· · ···· · · • ······· ·· · · · · • · v · · · · · ·

Tetralony struktury 76 se připraví redukcí sloučenin struktury 94 a 97 za podmínek rozpouštění kovu a následnou kysele katalyzovanou hydrolýzou enoletherů jako meziproduktů. Transformace výhodně probíhá postupným přidáváním velkého nadbytku alkalického kovu, např. sodíku nebo draslíku, výhodně sodíku, k vroucímu roztoku substrátu v nižším alkoholu, výhodně ethanolu, dokud není výchozí materiál spotřebován. Tetralony struktury 76 se získají reakcí roztoku izolovaných enoletherů jako meziproduktů se silným kyselým katalyzátorem, výhodně kyselinou toluensulfonovou. Hydrolýza výhodně probíhá ve směsi nižšího alkoholu, výhodně ethanolu, a vody při teplotě v rozmezí od okolní teploty do teploty varu roztoku pod zpětným chladičem, výhodně při teplotě varu pod zpětným chladičem.

Při přípravě sloučenin struktury 77, použitých vreakčním schématu Q jako výchozí látky pro přípravu sloučenin obecného vzorce 79, což jsou odvozeniny Fmoc-aminokyseliny sloučeniny struktury 12, se použije jako výchozí látka sloučenina struktury 98, jak znázorňuje reakční schéma V. V reakčním schématu V se sloučeniny struktury 100 připraví reakcemi známými per se. Mohou být např. připraveny kondenzací sekundárního aminu struktury 98 s arylbromidem nebo jodidem, výhodně aryljodidem struktury 99 (reakční schéma V). Kondenzační reakce je katalyzována ušlechtilým kovem, výhodně tri(dibenzylidenaceton)dipalladiem, v přítomnosti chelátového fosfinového ligandu, výhodně tri-o-tolylfosfinu, a bráněné alkoxidové báze, např. terc.butoxidu sodného. Reakce výhodně probíhá v inertní atmosféře za použití bezvodého rozpouštědla, např. dioxanu nebo toluenu, výhodně dioxanu, při teplotě od 60°C do teploty varu pod zpětným chladičem, výhodně při teplotě 90°C. Odstranění karbonylové ochranné skupiny ve sloučenině 100 za vzniku sloučenin struktury 77 se provádí jednou z řady známých metod organické syntézy. Odchránění může být dosaženo např. reakcí roztoku sloučeniny 100 v nízkovroucím ketonu, např. acetonu nebo 2-butanonu, s vodným roztokem minerální kyseliny, např. 6N kyseliny chlorovodíkové, při teplotě od okolní • · • · · · • · · ·1 teploty do teploty varu směsi pod zpětným chladičem, výhodně při teplotě varu pod zpětným chladičem. Sloučenina struktury 100 tvoří při reakci svodným roztokem minerální kyseliny sloučeninu struktury 77, jak znázorňuje reakční schéma V. Sloučenina struktury 77 je meziproduktem pro sloučeninu struktury 79 (popis u reakčního schématu Q), která je derivátem kyseliny struktury 12, kde Q je skupina

R6

V reakčním schématu A jsou sloučeninami, ve kterých R⁹ je skupina aminokyseliny struktury 5 známými

• 17 0

Aminokyseliny struktury 5, kde R v R je nižší alkylová skupina, tj. kde R⁹ je skupina

ČH nižší alkylová skupina

se připraví ze sloučeniny obecného vzorce 101 postupem znázorněným v následujícím reakčním schématu W • · • · · ·

Reakční schéma W

BU4NN3, NaN₃ acetonitril

2.Fmoc-OSu, NaHCO₃ THF/H₂O

1.H₂,10% Pd/Q, MeOH

\

Mes

108

109 • · · • ·

Jak znázorňuje reakční schéma W, byl B-methyl(Nin-Mes)tryptofan 109 připraven postupem popsaným v Boteju, L.W., Wenger, K. a Hrubý, V.J., Tet. Lett., 33, str. 7491 (1992). V prvním stupni je atom dusíku v kyselině transindol-3-akrylové 101 chráněn konverzí na příslušný mesitylensulfonamid 102. Reakce se provádí působením indolové kyseliny 101 na nadbytek (více než 2 ekv.) roztoku alkyl nebo aryllithiového činidla, např. fenyllithium nebo nbutyllithium, výhodně n-butyllithium, v inertním rozpouštědle, výhodně tetrahydrofuranu, při teplotě od -40°C do asi -100°C, nej výhodněji při teplotě 78°C. Zatímco reakce probíhá při teplotě kolem -78°C, vytvořená dilithiovaná odvozenina poté reaguje s mesitylensulfonylchloridem za vzniku mesitylensulfonamidu 102. N-chráněná indolakrylová kyselina 102 poté reaguje s pomocným chirálním (R)-4-fenyl-2-oxazolidinonem (příprava viz Nicolas a kol., J.Org.Chem., 1993, 58, str. 766-770) jako jeho N-lithiovanou derivátem za vzniku chirálního akrylamidu 105. Reakce bylo dosaženo prostřednictvím smíšeného anhydridů vytořeného ze sloučeniny 102. Při vzniku smíšeného anhydridů 103 reaguje N-chráněná indolakrylová kyselina 102 s vhodným acylchloridem, např. terč. butylchlorformátem, 2,4,6-trichlorbenzoylchloridem nebo pivaloylchloridem, výhodně pivaloylchloridem, v přítomnosti terč. aminové báze, např. triethylaminu nebo diisopropylaminu, výhodně triethylaminu. Výběr vhodného acylchloridu nutného pro vytvoření anhydridů 103 je odborníkovi v oboru organické syntézy dobře znám. Vznik anhydridů probíhá v inertním rozpouštědle, např. tetrahydrofuranu, při počáteční teplotě mezi -100°C a 0°C, výhodně při teplotě asi -78°C. Reakce je ukončena při teplotě mezi -78°C a 0°C, výhodně při teplotě asi 0°C. Takto vzniklý anhydrid 103 poté reaguje in šitu s roztokem N-lithiovaným (R)-4-fenyl-2-oxazolidinonu 104, dříve připravenými reakcí roztoku (R)-4-fenyl-2-oxazolidinonu v inertním rozpouštědle, např. tetrahydrofuranu, s ekvimolárním množstvím roztoku alkyllithiového nebo aryllithiového činidla, např. fenyllithia nebo n-butyllithia, výhodně n-butyllithia, v inertním rozpouštědle, např. hexanu, při teplotě mezi • · · · ··· ·· ·· ·· *·· · · · ♦· • ··· · ···· · · • ······· ·· ··· · ·· · · · · · · ·

.........

-100°C a 0°C, výhodně při teplotě asi -78°C. Reakce, při které vzniká chirální akrylamid 105, probíhá při počáteční teplotě mezi -100°C a 0°C, výhodně při teplotě asi -78°C. Poté, co jsou všechna činidla sloučena, reakce pokračuje při teplotě -78°C až při okolní teplotě, výhodně při asi okolní teplotě.

Nejdůležitější součástí transformace chirálního akrylamidu 105 na 106 je kontrolovaný vznik dvou nových přilehlých chirálních center přítomných ve 106. Reakce zahrnuje stereoselektivní 1,4-konjugační adici (Michaelovu adici) měďnatanu methylnatého, vzniklého in šitu z měďnatého bromiddimethylsulfidového komplexu a methylmagnesiumbromidu, na Michaelův akceptor, α,β-nenasycený karbonylový systém přítomný ve sloučenině 105. Vzniklý kovem chelatovaný enolát je poté přímo halogenován halogenačním činidlem, výhodně N-bromsukcinimidem, za vzniku sloučeniny 106. Jako v případě Michaelovy adice, je i zde začlenění atomu bromu stereoselektivní, řízené objemnou fenylovou skupinou na pomocném chirálním centru, které účinně chrání si stranu jak α,β-nenasyceného acyloxazolidinového systému, tak kovem chelatovaného enolátu před napadením vstupujících činidel. Při přípravě měďnatanu methylnatého se roztok methylmagnesiumbromidu v diethyletheru přidá k roztoku měďnatého bromid-dimethylsulfidového (1:1) komplexu v inertním rozpouštědle, např. dimethylsulfidu nebo tetrahydrofuranu, výhodně v jejich směsi. Reakce probíhá při teplotě mezi -78°C a okolní teplotě, výhodně při -4°C. Místo methylmagnesiumbromidu může být přidán jakýkoli nižší alkylbromid za vzniku R¹⁷, kde R¹⁷ je nižší alkylová skupina jiná než methylová skupina. K takto vzniklému roztoku měďnatanu methylnatého je in šitu přidán roztok α,β-nenasyceného acyloxazolidinonu 105 v inertním rozpouštědle, výhodně tetrahydrofuranu. Adice měďnatanu methylnatého probíhá při počíteční teplotě mezi -30°C a okolní teplotou, výhodně při teplotě -4°C, a poté při okolní teplotě. Po ukončení reakce (indikace TLC nebo HPLC) se reakční směs ochladí na teplotu mezi -100°C a -40°C, výhodně na -78°C, kdy je přidán roztok halogenačního činidla, výhodně N-bromsukcinimidu v inertním • · · · rozpouštědle, např. tetrahydrofuranu. Reakce následně probíhá při teplotě 0°C až okolní teplotě, výhodně při asi okolní teplotě, přičemž se izoluje bromid 106. Bromid se vytěsní azidovým iontem při současné změně konfigurace. Tato transformace se provede reakcí bromidu 106 s tetrabutylammoniumazidem v přítomnosti nadbytku azidu sodného v inertním rozpouštědle, např. acetonitrilu, za vzniku azidu 107. Reakce výhodně probíhá při teplotě mezi 80°C a okolní teplotou, výhodně při asi okolní teplotě. Reakcí sloučeniny 107 a hydroxidu alkalického kovu, např. hydroxidu sodného, draselného nebo lithného, výhodně hydroxidu lithného, v přítomnosti peroxidu vodíku, dochází khydrolýze pomocného chirálního centra za vzniku azidové kyseliny 108. Hydrolyzační reakce probíhá v inertním rozpouštědle, výhodně vodě, při teplotě mezi 0°C a okolní teplotou, výhodně při teplotě 0°C. Hydrogenací aazidokyseliny 108 vzniká B-methyl(Nin-Mes)tryptofan, který je ihned převeden na příslušný N(a)-Fmoc-B-methyl(Nin-Mes)tryptofan 109. Hydrogenace slůoučeniny 108 se katalyzuje vzácným kovem, výhodně 10% palladiem na uhlí, v inertním rozpouštědle, např. nižším alkanolu, výhodně methanolu, při nízkém tlaku (menší než 2atm) a při okolní teplotě. Po filtračním odstranění katalyzátoru se odstraní těkavé složky a produkt se rozpustí v inertním rozpouštědle, např. tetrahydrofuranu nebo vodě, výhodně v jejich směsi, a reaguje se slabou anorganickou bází, např. hydrogenuhličitanem alkalického kovu, výhodně hydrogenuhličitanem sodným, a činidlem tvořícím Fmoc-N-chránicí skupinu, např. 9-fluorenylmethylchlorformátem (Fmoc-Cl) nebo 9-fluorenylmethyl-Nsukcinimidylkarbonátem (Fmoc-Osu), výhodně Fmoc-Osu, za vzniku sloučeniny 109. Reakce výhodně probíhá při teplotě mezi 0°C a okolní teplotou, výhodně při asi okolní teplotě. Sloučenina obecného vzorce 109 je derivátem aminokyseliny struktury 5 v reakčním schématu A.

· · · • 9 9 9 · ···· • ······· · ·

Vynález se rovněž týká způsobu přípravy sloučenin obecného vzorce I

r 1 i T ve kterém R až R , m, p, Q, X, Y a Z mají výše uvedený význam, a to vznikem laktamové nebo disulfidové vazby v poloze Z lineárních peptidů jako prekurzorů.

Farmaceutické kompozice

Vynález dále zahrnuje farmaceutické kompozice obsahující výše uvedené sloučeniny a terapeuticky inertní nosič.

Sloučeniny obecných vzorců I a II, stejně tak jako penta-cyklo(Asp-Lys)Asp-Apc-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH₂ a penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)PheArg-(2S,3S)betamethyl-Trp-Lys-NH₂ připravené postupem podle vynálezu, mohou být připraveny ve farmaceutických kompozicích vhodných pro podání nebo inhalaci společně s vhodným nosičem nebo vehikulem, a to v oboru známými postupy.

Výše popsané sloučeniny mohou být použity jako léčiva, např. ve formě farmaceutických přípravků, např. pro parenterální podání. Mohou být podávány například parenterálně, např. ve formě injekčních nebo infuzních roztoků.

Výroba farmaceutických přípravků probíhá odborníkovi v oboru známým způsobem převedením výše uvedených sloučenin, případně v kombinaci s dalšími terapeuticky vhodnými látkami, do dávkové formy, a to společně s vhodnými, netoxickými, inertními, terapeuticky nekontraindikovanými • · · · · · » · · · · · • · · · · • · · · · ··· • · · · · · · • · · · · pevnými nebo kapalnými nosiči a, je-li to žádoucí, obvyklými farmaceutickými adjuvans.

Vhodné sloučeniny s nosičem jsou nejen anorganické, ale i organické povahy.

Jako farmaceutické přísady přicházejí v úvahu obvyklé stabilizátory, konzervační prostředky, smáčedla a emulgátory, činidla podporující soudržnost, aromatizační prostředky, soli ovlivňující osmotický tlak, pufry, solubilizátory, barviva, maskující činidla a antioxidanty.

Dávkování výše popsaných sloučenin je velmi různé a závisí na léčeném onemocnění, věku, individuálním stavu pacienta a medikaci. Dávkování se určí podle individuálních požadavků daného pacienta. Pro dospělé pacienty připadá v úvahu dávkování od asi 1 mg do přibližně 1000 mg, zejména od asi 10 mg do přibližně 500 mg. V závislosti na dávkování je výhodné podávat denní dávku léku v několika dílčích dávkách.

Farmaceutické přípravky obsahují okolo 1-500 mg, výhodně 5-200 mg, výše popsané sloučeniny.

Léčení obezity

Sloučeniny připravené podle vynálezu vykazují selektivní agonistický účinek in vitro na MC-4 receptor. Je známo, že agonisté účinnosti MC4-R způsobují při simulaci lidské obezity u myší snížení příjmu potravy. Proto podávání těchto sloučenin agonizuje účinnost MC4-R důležitou pro regulaci tělesné hmotnosti. Farmaceutické kompozice obsahující sloučeniny podle vynálezu mohou být připraveny v koncentracích účinných pro léčbu lidí i zvířat s nežádoucí nadměrnou tělesnou hmotností, a to jako samostatným onemocněním nebo jako průvodním jevem závažného onemocnění, např. diabetes mellitus typu II. Mohou být užity různé způsoby podání léku. Průměrná • · • · « · · · množství účinné sloučeniny se mohou lišit, ale vždy by měla být v souladu s doporučením a předpisem kvalifikovaného lékaře či veterináře.

Tento vynález se také vztahuje k použití výše definovaných sloučenin pro přípravu léků na léčbu a/nebo profylaxi onemocnění, které souvisejí s účinností melanokortin-4-receptoru. Dále se vynález vztahuje ke způsobu léčby a/nebo profylaxe onemocnění souvisejících s účinností melanokortin-4-receptoru, který zahrnuje podávání výše uvedené sloučeniny člověku nebo zvířeti.

Sloučeniny jsou obzvláště účinné při léčbě a/nebo profylaxi obezity. Tento vynález se také vztahuje kvýše definované sloučenině vyráběné výše popsaným způsobem. Dále se vynález vztahuje kvýše definovaným sloučeninám užívaným jako terapeuticky účinné látky, zejména jako terapeuticky účinné látky pro léčbu a/nebo profylaxi onemocnění, která souvisejí s účinností melanokortin-4-receptoru, např. obezity.

Vynález bude v následující části blíže popsán pomocí příkladů jeho provedení, které mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují jeho rozsah, který je jednoznačně vymezen formulací patentových nároků. Ve vzorcích specifických sloučenin, které jsou zobrazeny v následujících příkladech, nejsou obvykle atomy vodíku znázorněny.

• · • ♦ • · • · · · • · · • · « » · ♦

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava kyseliny Fmoc-l-amino-4-fenylcyklohexan-l-karboxylové (FmocApc)

Stupeň 1:

K roztoku 4-fenylcyklohexanonu (10,0 g, 57,5 mmol) v ethanolu (100 ml) a vodě (33 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (33 g, 344 mmol, 6 ekv.) a kyanid draselný (5,6 g, 86,2 mmol, 1,5 ekv.). Směs se po dobu 24 hodin zahřívá na teplotu 80 - 90°C. Ochlazená reakční směs se přidá k ledové vodě (400 ml) a intenzivně se míchá po dobu 30 minut. Vzniklá sraženina se vakuově přefiltruje, důkladně promyje vodou a vysuší za vzniku hydantoinu A ve formě bílého pevného produktu (14,0 g, 100% výtěžek).

'li - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

8,63 (s, 1H)

7,23 - 7,36 (m, 4)

7,15 (m,l)

2,50 (m, 1H)

2,10 (m, 1H)

1,85 (d, 1H)

1,55- 1,80 (m, 6H).

• ·

Stupeň 2:

Hydantoin A (10,0 g) se suspenduje ve vodném roztoku NaOH (6N, 350 ml) a zahřívá se po dobu 2- 3 dní na teplotu 130°C. Po ukončení hydrolýzy se reakční směs neutralizuje koncentrovanou HCl na mírně kyselé pH (~6). Vzniklá suspenze se přefiltruje, promyje vodou a vysuší za vzniku kyseliny 1amino-4-fenylcyklohexankarboxylové (APC) ve formě bílého pevného produktu (25 g, výtěžek >100 %, kontaminace anorganickou solí), která se použije přímo v následujícím stupni. Malá část surového produktu se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

’Η - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

7,23-7,35 (m, 2) 1,92-2,18 (m, 3H)

7,10-7,19 (m, 3H) 1,56-1,78 (m, 4H)

2,45 (m, 1H) 1,20 (m, 1H)

LR - hmotnostní spektrometrie (m/é) pro C13H17NO2 vypočteno: 219 naměřeno: 220 (M+l)⁺

Stupeň 3:

/>H₂ ^ο₂η

FmocCI dioxane, H₂O

NHFmoc ^ČO₂H • · φ · φφφ· • ·

Surová kyselina l-amino-4-fenylcyklohexankarboxylová (APC) z předchozího stupně (25 g) se suspenduje v dioxanu (300 ml) a v 10% vodném roztoku Na₂CO₃ (150 ml) a přes noc intenzivně míchá. Reakční směs se za účelem odstranění dioxanu zahustí, neutralizuje 6N HCl na mírně kyselé pH (56) a extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad síranem sodným. Po odstranění rozpouštědla vzniká surový produkt, který se poté přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát, dichlormethan/methanol) za vzniku čisté Fmoc-czs-APC (18,2 g, celkový výtěžek ve dvou stupních 72 %) a Fmoc-íra/zs-APC (2,1 g, 8 %).

*H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (Fmoc-czs-APC) (CD₃OD, hodnoty δ)

7,79 (d, 2H)

7,72 (d, 2H)

7.37 (t, 2)

7,24-7,32 (m, 4) 7,14-7,23 (m, 3)

4.37 (d, 2H)

4,24 (t, IH)

2,55 (m, IH)

2,28 (m, 2H) 1,84-1,96 (m, 2H) 1,64-1,73 (m, 4H).

Příklad 2

Příprava kyseliny Fmoc-1 -amino-4-(4-methoxyfenvl)cyklohexan-1 -karboxýlové (Fmoc-4-MeOApc-OH)

Stupeň 1:

HO-O

Mel, Na₂CO₃

O --—Men—(/ v aceton , reflux'

toto··

• to toto • ·· • · · · · « «· • ·· • toto • « * to • to ··

Roztok 4-(4-hydroxyfenyl)cyklohexanonu (5,0 g, 26,3 mmol) v acetonu (100 ml) reaguje s K₂CO₃ (14,5 g, 105 mmol, 4 ekv.) a jodmethanem (4,9 ml,

11,2 g, 78,6 mmol, 3 ekv.). Reakční směs se přes noc zahřívá na teplotu 65°C. Po odstranění rozpouštědla reaguje pevný podíl s vodou a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí ve vakuu za vzniku spektroskopicky čistého 4-(4methoxyfenyl)cyklohexanonu (5,34g, 100 %).

'Η - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDCI3, hodnoty δ)

7,16 (dt, 2H) 2,47-2,53 (m, 4H)

6,87 (dt, 2H) 2,20 (m, 2H)

3,78 (s,3H) 1,83-1,98 (m,2H).

2,99 (tt, 1H) hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro Ci₃Hi₆O₂ vypočteno: 204 naměřeno: 205 (M+l)⁺

Kroztoku 4-(4-methoxyfenyl)cyklohexanonu (3,86 g, 18,9 mmol) v ethanolu (50 ml) a vodě (15 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (14,5 g, 151 mmol, 8 ekv.) a kyanid draselný (2,0 g, 30,7 mmol, 1,6 ekv.). Směs se po dobu 24 hodin zahřívá na teplotu 80 - 90°C. Ochlazená reakční směs se přidá k ledové vodě (300 ml) a intenzivně se míchá po dobu 30 minut. Vzniklá sraženina se vakuově přefiltruje, důkladně promyje vodou a ·· »··· * » 9 to * · · · • « · · · · ·»· · » • ···«··· · · >·· · ·· · 9*99 · · »· » ·· »· 99 vysuší za vzniku hydantoinu B ve formě bílého pevného produktu (4,75 g, 91% výtěžek).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C15H18N2O3 vypočteno: 274 naměřeno: 273 (M-H).

Stupeň 3:

K suspenzi hydantoinu B (18,7 g, 68,25 mmol) v suchém THF (450 ml) se postupně přidá di-řerc-butyldikarbonát (37,2 g, 170,5 mmol, 2,5 ekv.), triethylamin (10,5 ml, 7,59 g, 75,0 mmol, 1,1 ekv.) a DMAP (460 mg, 3,65 mmol). Po 15 minutách se reakční směs změní na světležlutý roztok, který se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí za vzniku pevného produktu, který se absorbuje v ethylacetátu (800 ml), promyje IN HCl (3x50 ml), nasyceným vodným roztokem Na₂CO₃ (2x50 ml) a solankou (2x50 ml), vysuší nad bezvodým síranem sodným a za sníženého tlaku se zahustí. Surový světležlutý produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 90:10-» 70:30) za vzniku čistého bis-Boc hydantoinu C ve formě bílého pevného produktu (27,6 g, 87 %).

^]H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDCls, hodnoty δ)

7,28 (dt, 2H)

6,88 (dt, 2H)

2,14-2,24 (m, 2H)

1,59 (s, 9H)

9999 < 9 · · • ···· • 9 »9 • · * 9 9 » · 999 9 · · • 9 · * 9 9 9 · 9

9 9 9999 9999

9· * 99 99 99 >9

3,79 (s,3H) 1,38 (1,9Η).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C25H34N2O7 vypočteno: 474 naměřeno: 538 (M+MeCN+Na)⁺

NHFmoc

Bis-Boc hydantoin C (15,08 g, 31,78 mmol) se rozpustí v DME (500 ml) za vzniku čirého roztoku. K vzniklému roztoku se přidá IN NaOH (290 ml, 290 mmol) a reakční směs se přes noc míchá při okolní teplotě, přičemž vzniká mírně zakalená směs. Ukončení reakce se prokáže vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, a extrahuje Et₂O. Bez dalšího přečištění vzniklá vodná vrstva, obsahující kyselinu l-amino-4-(4-methoxyfenyl)cyklohexankarboxylovou (4MeOAPC), reaguje s 6N HCl, čímž se docílí hodnoty pH 11-12. K vzniklému roztoku (~ 300 ml) se přidá DME (300 ml) a roztok Fmoc-Osu (16,7 g, 49,42 mmol) v DME (200 ml) a reakční směs se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, okyselí se přídavkem 3N HCl, a extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí. Surový produkt se poté přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: dichlormethan/methanol, 98:2 90:10) za vzniku čistého Fmoc-4-MeOAPC ve formě bílého pevného produktu (12,4 g, 83% výtěžek z bis-Boc hydantoinu C).

• ·

7,11 (d, 2H)

6,85 (d, 2H)

3,71 (s, 3H).

^!H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-dň, hodnoty δ)

7,88 (d, 2H)

7,76 (d, 2H)

7,40 (t, 2H)

7,30 (t, 2H) hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C29H29NO5 vypočteno: 471 naměřeno: 470 (M-H)

Příklad 3

Příprava kyseliny Fmoc-1 -amino-4-(4-ethoxyfenyl)cvklohexan-1 -karboxylové (Fmoc-4-EtOApc-OH)

Stupeň 1:

HO7/ %

Et(

Roztok 4-(4-hydroxyfenyl)cyklohexanonu (5,0 g, 26,3 mmol) v acetonu (100 ml) reaguje s K₂CO₃ (14,5 g, 105 mmol, 4 ekv.) a jodmethanem (10,5 ml,

20,5 g, 131 mmol, 5 ekv.). Reakční směs se přes noc zahřívána teplotu 65°C. Po odstranění rozpouštědla reaguje pevný podíl s vodou a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší nad

• · ·« • » • ·

síranem sodným a zahustí ve vakuu za vzniku spektroskopicky čistého 4-(4ethoxyfenyl)cyklohexanonu (5,74g, 100 %).

'H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDCI3, hodnoty δ)

7,15 (dt, 2H)

6,86 (dt, 2H) 4,02 (q, 2H)

2,99 (tt, IH)

2,46-2,54 (m, 4H) 2,16-2,24 (m, 2H) 1,83-2,00 (m, 2H)

1,41 (t, 3H) hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro Ci₄Hi₈O₂ vypočteno: 218 naměřeno: 219 (M+1)⁺

Stupeň 2:

K roztoku 4-(4-ethoxyfenyl)cyklohexanonu (4,15 g, 19,01 mmol) v ethanolu (50 ml) a vodě (15 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (14,5 g, 151 mmol, 8 ekv.) a kyanid draselný (2,05 g, 31,42 mmol, 1,6 ekv.). Směs se po dobu 19 hodin zahřívá na teplotu 80 - 90°C. Ochlazená reakční směs se přidá k ledové vodě (300 ml) a intenzivně se míchá po dobu 30 minut. Vzniklá sraženina se přefiltruje přes Buchnerovu nálevku, důkladně promyje vodou a vysuší za vzniku hydantoinu D ve formě bílého pevného produktu (5,17 g, 94% výtěžek).

• 9 hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro Ci₆H₂oN₂03 vypočteno: 288 naměřeno: 287 (M-H).

Stupeň 3:

K suspenzi hydantoinu D (4,22 g, 14,65 mmol) v suchém THF (100 ml) se postupně přidá di-terc-butyldikarbonát (7,98 g, 36,60 mmol, 2,5 ekv.), triethylamin (2,3 ml, 1,63 g, 16,11 mmol, 1,1 ekv.) a DMAP (89,4 mg, 0,73 mmol). Po 15 minutách se reakční směs změní na světležlutý roztok, který se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí za vzniku pevného produktu, který se absorbuje v ethylacetátu (300 ml), promyje IN HCl (3x20 ml), nasyceným vodným roztokem Na₂CO₃ (2x20 ml) a solankou (2x20 ml), vysuší nad bezvodým síranem sodným a za sníženého tlaku se zahustí. Surový světležlutý produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 90:10^*70:30) za vzniku čistého bis-Boc hydantoinu E ve formě bílého pevného produktu (7,01 g, 98 %).

^!H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,27 (dt, 2H)

6,87 (dt, 2H)

4,02 (q, 2H)

1,59 (s, 9H) 1,43 (t, 3H) 1,38 (s, 9H).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C26H36N2O7 vypočteno: 488 naměřeno: 999 (2M+Na)⁺

EtO

NHFmoc ^O₂H

Bis-Boc hydantoin E (6,58 g, 13,46 mmol) se rozpustí v DME (200 ml) za vzniku čirého roztoku. K vzniklému roztoku se přidá IN NaOH (121 ml, 121 mmol) a reakční směs se přes noc míchá při okolní teplotě, přičemž vzniká mírně zakalená směs. Ukončení reakce se prokáže vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, a extrahuje Et₂O. Bez dalšího přečištění vzniklá vodná vrstva, obsahující kyselinu l-amino-4-(4-ethoxyfenyl)cyklohexankarboxylovou (4EtOAPC), reaguje s 6N HCl, čímž se docílí hodnoty pH 11-12. K vzniklému roztoku (~ 130 ml) se přidá DME (100 ml) a roztok Fmoc-Osu (6,83 g, 20,24 mmol) v DME (30 ml) a reakční směs se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, okyselí se přídavkem 3N HCl, a extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí. Surový produkt se poté přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: dichlormethan/methanol, 98:2 -> 90:10) za vzniku čistého Fmoc-4-EtOAPC ve formě bílého pevného produktu (5,56g, 85% výtěžek z bis-Boc hydantoinu E).

'Η - Nukleární magnetickorezonanční spektrum • · • · • ·

7,11 (d, 2H)

6,84 (d, 2H)

3,97 (q, 2H).

1,29 (t, 3H) (DMSO-cU, hodnoty δ)

7,88 (d, 2H)

7,74 (d, 2H)

7,40 (td, 2H)

7,30 (td, 2H) hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C₃oH₃iN0₅ vypočteno: 485 naměřeno: 484 (M-H)

Příklad 4

Příprava kyseliny Fmoc-1 -amino-4-(4-hydroxyfenyl)cyklohexan-1 -karboxylové (Fmoc-4-HOApc-OH)

Stupeň 1:

HO-

K roztoku 4-(4-hydroxyfenyl)cyklohexanonu (2,00 g, 10,52 mmol) v ethanolu (30 ml) a vodě (10 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (6,17 g, 64,2 mmol, 6 ekv.) a kyanid draselný (1,07 g, 15,8 mmol, 1,5 ekv.). Směs se přes noc zahřívá na teplotu 80 - 90°C. Ochlazená reakční směs se přidá k ledové vodě (200 ml) a intenzivně se míchá po dobu 30 minut. Vzniklá sraženina se přefiltruje přes Buchnerovu nálevku, důkladně promyje vodou a vysuší za vzniku hydantoinu F ve formě bílého pevného produktu (2,56 g, 94% výtěžek).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro Ci4H₁₆N2O₃ • · · · · · • · · ·· ·· ► · · » · · « · • · · • * · ·· ·· , · · ’ ·· ·· vypočteno: 260 naměřeno: 261 (M+H)⁺.

Stupeň 2:

Hydantoin F (2,10 g, 8,06 mmol)) se suspenduje ve vodném roztoku

NaOH (6N, 100 ml) a zahřívá se po dobu 2- 3 dní na teplotu 130°C. Po ukončení hydrolýzy se reakční směs neutralizuje koncentr. HCl na mírně kyselé pH (~6). Vzniklá suspenze se přefiltruje, promyje vodou a vysuší za vzniku kyseliny 1amino-4-(4-hydroxyfenyl)cyklohexankarboxylové (4-HOAPC) ve formě bílého pevného produktu (3,1 g, výtěžek >100 %, kontaminován anorganickou solí).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C13H17NO3 vypočteno: 235 naměřeno: 236 (M+H)⁺

Stupeň 3:

NHFmoc **C0₂H • · • · • ·

Surová kyselina l-amino-4-(4-hydroxyfenyl)cyklohexankarboxylová (4HOAPC) z posledního stupně (3,1 g) se suspenduje v dioxanu (100 ml) a v 10% vodném roztoku Na₂CO3 (50 ml) a přes noc se intenzivně míchá. Reakční směs se za účelem odstranění dioxanu zahustí, neutralizuje 6N HCl na mírně kyselé pH (5-6) a extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad síranem sodným. Po odstranění rozpouštědla vzniká surový produkt, který se poté přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát, dichlormethan/methanol) za vzniku čisté Fmoc-4-HOAPC (2,76 g, celkový výtěžek ve dvou stupních 75 % ).

^!H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CD₃OD, hodnoty δ)

7,78 (d, 2H)	4,38 (d, 2H)
7,72 (d, 2H)	4,25 (t, 1H)
7,38 (t, 2H)	2,46 (m, 1H)
7,30 (td, 2H)	2,24-2,34 (m, 2H)
7,04 (d, 2H)	1,81-1,92 (m,6H).
6,72 (dt, 2H)

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C₂₈H₂₇NO5 vypočteno: 457 naměřeno: 456 (M-H).

Příklad 5

Příprava kyseliny Fmoc-l-amino-4-(4-isopropoxyfenyl)cyklohexan-lkarboxylové (Fmoc-4-iPrOApc-OH) • ·· · • ·

Stupeň 1:

O

Roztok 4-(4-hydroxyfenyl)cyklohexanonu (6,0 g, 31,6 mmol) v DMF (90 ml) reaguje s K2CO3 (21 g, 158 mmol, 5 ekv.) a 2-jodpropanem (15 ml, 26,8 g, 158 mmol, 5 ekv.). Reakční směs se přes noc zahřívá na teplotu 100°C. Po odstranění rozpouštědla reaguje pevný podíl s vodou a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí ve vakuu za vzniku spektroskopicky čistého 4-(4isopropoxyfenyl)cyklohexanonu (7,02g, 95 %).

- Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDCI3, hodnoty δ)

7,14 (dt, 2H) 6,84 (dt, 2H)

4,3 (septet, IH) 2,97 (tt, IH)

2,46-2,52 (m, 4H) 2,16-2,24 (m, 2H) 1,83-1,98 (m, 2H). 1,33 (d, 6H).

Stupeň 2:

• · · · • ·

K roztoku 4-(4-isopropoxyfenyl)cyklohexanonu (5,1 g, 21,98 mmol) v ethanolu (90 ml) a vodě (30 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (12,6 g, 131 mmol, 6 ekv.) a kyanid draselný (2,14 g, 32,9 mmol, 1,5 ekv.). Směs se po dobu 24 hodin zahřívá na teplotu 80 - 90°C. Ochlazená reakční směs se přidá k ledové vodě (400 ml) a intenzivně se míchá po dobu 30 minut. Vzniklá sraženina se přefiltruje přes Buchnerovu nálevku, důkladně promyje vodou a vysuší za vzniku hydantoinu G ve formě bílého pevného produktu (6,60 g, 99% výtěžek).

Ή - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

10,60 (s, 1H)

8,65 (s, 1H)

7,18 (d,2H)

6,80 (d, 2H)

4,52 (septet, 1H)

2,43 (m, 1H) 1,85-2,15 (m, 2H) 1,56-1,80 (m, 6H) 1,22 (d, 6H).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C17H22N2O3 vypočteno: 302 naměřeno: 301 (M-H).

Stupeň 3:

G

H to to · ·

K suspenzi hydantoinu G (5,8 g, 19,20 mmol) v suchém THF (180 ml) se postupně přidá di-řerc-butyldikarbonát (10,46 g, 48,0 mmol, 2,5 ekv.), triethylamin (2,9 ml, 2,13 g, 21,12 mmol, 1,1 ekv.) a DMAP (140 mg, 1,15 mmol). Po 15 minutách se reakční směs změní na světležlutý roztok, který se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí za vzniku pevného produktu, který se absorbuje v ethylacetátu (600 ml), promyje IN HCl (3x40 ml), nasyceným vodným roztokem Na₂CO₃ (2x40 ml) a solankou (2x40 ml), vysuší nad bezvodým síranem sodným a za sníženého tlaku se zahustí. Surový světležlutý produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 90:10-^80:20) za vzniku čistého bis-Boc hydantoinu H ve formě bílého pevného produktu (9,4 g, 98 %).

*H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,27 (dt, 2H)

6,87 (dt, 2H)

4,02 (q, 2H)

2,98 (t, 1H) 2,26-2,56 (m, 4H)

2,14-2,24 (m, 2H) 1,76-1,86 (m, 2H) 1,59 (s, 9H)

1,43 (t, 3H)

1,38 (s, 9H) hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C₂6H₃₆N₂O7 vypočteno: 488 naměřeno: 999 (2M+Na)⁺

H • · · · • ·

Bis-Boc hydantoin H (4,34 g, 8,64 mmol) se rozpustí v DME (100 ml) za vzniku čirého roztoku. K vzniklému roztoku se přidá IN NaOH (78 ml, 78 mmol) a reakční směs se přes noc míchá při okolní teplotě, přičemž vzniká téměř čilá směs. Ukončení reakce se prokáže vysokorychlostní kapalinovou chromatografíí. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, a extrahuje Et₂O. Bez dalšího přečištění vzniklá vodná vrstva, obsahující kyselinu 1 -amino-4-(4-isopropoxyfenyl)cyklohexankarboxylovou (4-iPrOAPC), reaguje s 6N HCl, čímž se docílí hodnoty pH 11-12. K vzniklému roztoku (~ 90 ml) se přidá DME (120 ml) a roztok Fmoc-Osu (3,49 g, 10,34 mmol, 1,2 ekv.) v DME (20 ml) a reakční směs se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, okyselí se přídavkem 3N HCl, a extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí. Surový produkt se poté přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát-» dichlormethan/methanol) za vzniku čistého Fmoc-4iPrOAPC ve formě bílého pevného produktu (3,23 g, 75% výtěžek z bis-Boc hydantoinu H).

^!H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

7,76 (d, 2H) 7,60 (d, 2H) 7,39 (t, 2H) 7,31 (t, 2H)

7,08 (d, 2H)

6,84 (d, 2H)

4,24 (m, 1H) 1,34 (d, 6H).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C31H33NO5 vypočteno: 499 naměřeno: 498 (M-H).

• · · · • ·

• · • φ * φφφ·’

Příklad 6

Příprava kyseliny Fmoc-1 -amino-4-(4-methylfenvl)cyklohexan-1 -karboxylové (Fmoc-4-MeApc-OH)

Stupeň 1:

K roztoku 4-jodtoluenu (10,9 g, 50,0 mmol) v suchém THF (180 ml) se při teplotě -78°C po dobu 20 minut přidává roztok m-buli (1,6M, 31,0 ml, 50 mmol) v hexanu. Reakční směs se po dobu dalších 20 minut míchá, načež se po kapkách přidá roztok 1,4-cyklohexandion-znono-ethylenketalu (6,0 g, 38,46 mmol) v suchém THF (100 ml). Poté co se reakční směs po dobu 2 hodin míchá při teplotě -78°C, načež se přidá vodný roztok chloridu amonného a směs se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a vakuově zahustí za vzniku spektroskopicky čistého bílého pevného produktu I (9,34 g, 98 %).

’H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,41 (m, 2H) 3,98 (m, 4H)

7,16 (d,2H) 2,34 (s,3H).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C15H20O3 vypočteno: 248 naměřeno: 248 (M⁺).

• · • ·· · • ·· · ···· * · ! .· ··

Stupeň 2:

K roztoku alkoholu I (9,10 g, 36,65 mmol) v suchém benzenu (200 ml) v baňce vybavené Dean-Starkovým odlučovačem se přidá monohydrát kyseliny p-toluensulfonové (650 mg), načež se reakční směs po dobu 3 hodin zahřívá na teplotu 100°C. Reakční směs se ochladí na okolní teplotu, zředí ethylacetátem (500 ml), promyje vodným roztokem uhličitanu sodného (50 ml), solankou (3x50 ml), vysuší nad síranem sodným a za sníženého tlaku zahustí za vzniku spektroskopicky čistého produktu J (8,36 g, 100 %) který se použije v následujícím stupni bez dalšího přečištění.

hmotnostní spektrum (El, m/e) pro Ci₅H₁₈O₂ vypočteno: 230 naměřeno: 230 (M⁺), 190 (M-OCH₂CH₂O).

Stupeň 3:

K roztoku olefinu J (7,49 g) v ethylacetátu (180 ml) se přidá 5% palladium na uhlí (800 mg) a reakce po dobu 3 hodin probíhá při okolní teplotě • · • · · · ¹ v atmosféře vodíku (40 psi). Katalyzátor se odfiltruje a filtrát zahustí za vzniku spektroskopicky čistého bezbarvého olejovitého produktu K (7,40 g, 100%).

hmotnostní spektrum (El, m/e) pro C15H20O2 vypočteno: 232 naměřeno: 188 (M-OCH₂CH₂).

Stupeň 4:

K

Roztok ketalu K (6,90 g) v acetonu (140 ml) reaguje s 4N HCl (60 ml) a směs se po dobu 4 hodin zahřívá na teplotu 65 °C. Rozpouštědlo se odstraní a pevný podíl zředí ethylacetátem a neutralizuje 4N HCl. Vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší a zahustí. Vzniklý surový 4-(4-methylfenyl)cyklohexanon se použije v následujícím stupni bez dalšího přečištění (5,57 g, kvant.).

Hmotnostní spektrum (El, m/e) pro C^H^O vypočteno: 188 naměřeno: 188 (M⁺).

Stupeň 5:

O

L

9«

9

K roztoku 4-(4-methylfenyl)cyklohexanonu (5,32 g, 28,3 mmol) v ethanolu (90 ml) a vodě (30 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (16,3 g, 169,8 mmol, 6 ekv.) a kyanid draselný (3,68 g, 56,5 mmol, 2 ekv.). Směs se přes noc zahřívá na teplotu 80-90°C. Ochlazená reakční směs se přidá k ledové vodě (400 ml) a po dobu 30 minut intenzivně míchá. Vzniklá sraženina se přefiltruje přes Buchnerovu nálevku, důkladně promyje vodou a vysuší za vzniku hydantoinu L ve formě bílého pevného produktu (6,3 g, 86 %).

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro Ci₅Hi₈C1N₂O₂ vypočteno: 258 naměřeno: 517 (2M+H).

Stupeň 6:

K suspenzi hydantoinu L (5,82 g, 22,55 mmol) v suchém THF (250 ml) se postupně přidá di-ferobutyldikarbonát (12,3 g, 56,4 mmol, 2,5 ekv.), triethylamin (3,5 ml, 2,5 g, 24,7 mmol, 1,1 ekv.) a DMAP (275 mg, 2,25 mmol). Reakční směs se změní na světležlutý roztok a přes noc se míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí za vzniku pevného produktu, který se absorbuje v ethylacetátu (500 ml), promyje IN HCl (3x50 ml), nasyceným vodným roztokem Na₂CO₃ (2x50 ml) a solankou (2x50 ml), vysuší nad bezvodým síranem sodným a za sníženého tlaku se zahustí. Surový světležlutý produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava:

• · hexan/ethylacetát 90:10^70:30) za vzniku čistého bis-Boc hydantoinu M ve formě bílého pevného produktu (10,03 g, 100 %).

^JH - Nukleární magnetickorezonanční spektrum

(CDC13, hodnoty δ)
7,26 (d, 2H)	2,32 (s, 3H)
6,87 (d, 2H)	1,59 (s, 9H)
3,00 (m, ÍH)	1,37 (s, 9H)

Stupeň 7:

Bis-Boc hydantoin M (6,40 g, 13,97 mmol) se rozpustí v DME (200 ml) za vzniku čirého roztoku. K vzniklému roztoku se přidá IN NaOH (120 ml, 120 mmol) a reakční směs se přes noc míchá při okolní teplotě, přičemž vzniká mírně zakalená směs. Ukončení reakce se prokáže vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, a extrahuje Et₂O. Bez dalšího přečištění vzniklá vodná vrstva, obsahující kyselinu l-amino-4-(4-methylfenyl)cyklohexankarboxylovou (4MeAPC), reaguje s6N HCl, čímž se docílí hodnoty pH 11-12. K vzniklému roztoku (~ 140 ml) se přidá DME (240 ml) a roztok Fmoc-Osu (5,10 g, 15,13 mmol, 1,1 ekv.) v DME (40 ml) a reakční směs se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, okyselí se přídavkem 3N HCl, a extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí.

• · · « • · · ·

Surový produkt se poté přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava:

dichlormethan/methanol, 98:2-^90:10) za vzniku čistého Fmoc-4-MeAPC ve formě bílého pevného produktu (4,35 g, 69% výtěžek z bis-Boc hydantoinů M).

Ή - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

7,88 (d, 2H)

7,75 (d, 2H)

7,24-7,43 (m, 4H)

7,02-7,14 (m, 4H) 4,25 (m, 3H)

2,24 (s, 3H)

Příklad 7

Příprava kyseliny Fmoc-1 -amino-4-(4-chlorfenvl)cyklohexan-1 -karboxylové (Fmoc-4-ClApc-OH)

Stupeň 1:

Roztok 4-chlorfenylbromidu (7,5 g, 39,2 mmol) v suchém THF (180 ml) se ochladí na teplotu -78°C po dobu 20 minut se po kapkách přidává roztok nbuli (1,6M, 25 ml, 40 mmol) v hexanu. Reakční směs se po dobu 30 minut dále míchá, načež se přidá roztok 1,4-cyklohexandion-wozio-ethylenketalu (6,0 g, 38,46 mmol) v suchém THF (100 ml). Poté co se reakční směs po dobu 1 hodiny míchá při teplotě -78°C, načež se přidá vodný roztok chloridu amonného a směs se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a vakuově zahustí za vzniku spektroskopicky • · * • « • <

• · čistého bílého pevného produktu N (9,40 g, 91 %).

Ή - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDCfi, hodnoty δ)

7,45 (m, 2H)

7,31 (m, 2H)

3,99 (m, 4H)

2,02-2,20 (m, 4H)

1,75-1,82 (m, 2H) 1,66-1,73 (m, 2H) 1,54 (s, IH).

hmotnostní spektrum (El, m/e) pro C₁₄H₁₇C1O₃ vypočteno: 268 naměřeno: 268 (M⁺), 251 (M-OH), 250 (M-H₂O).

Stupeň 2:

K roztoku alkoholu N (6,78 g, 25,30 mmol) v suchém benzenu (120 ml) v baňce vybavené Dean-Starkovým odlučovačem se přidá monohydrát kyseliny p-toluensulfonové (960 mg), načež se reakční směs zpětným prouděním zahřívá po dobu 3 hodin. Reakční směs se ochladí na okolní teplotu, zředí ethylacetátem (500 ml), promyje vodným roztokem uhličitanu sodného (50 ml), solankou (3x50 ml), vysuší nad síranem sodným a za sníženého tlaku zahustí za vzniku spektroskopicky čistého produktu O (6,30 g, 100 %) který se použije v následujícím stupni bez dalšího přečištění.

«*·· hmotnostní spektrum (El, m/e) pro C14H15CIO2 vypočteno: 250 naměřeno: 250 (M⁺), 190 (M-OCH₂CH₂O).

Stupeň 3:

K roztoku olefinu O (6,11 g) v ethylacetátu (120 ml) se přidá 5% palladium na uhlí (600 mg) a reakce po dobu 3 hodin probíhá při okolní teplotě v atmosféře vodíku (5 psi). Katalyzátor se odfiltruje a filtrát zahustí za vzniku spektroskopicky čistého bezbarvého olejovitého produktu P (6,10 g, 100%).

hmotnostní spektrum (El, m/e) pro Ci₄Hi₇C1O₂ vypočteno: 252 naměřeno: 252 (M⁺).

Stupeň 4:

P

Roztok ketalu P (5,81 g, 23,06 mmol) v acetonu (200 ml) reaguje s monohydrátem kyseliny p-toluensulfonové (876 mg) a směs se přes noc ·· ·«»· zahřívá na teplotu 60°C. Rozpouštědlo se odstraní a pevný podíl absorbuje v ethylacetátu, promyje nasyceným vodným roztokem uhličitanu sodného, solankou, vysuší a zahustí za vzniku surového žlutého olejovitého produktu (5,38 g, >100 %). Surový produkt se poté přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát, 80:20-> 60:40) za vzniku 4-(4chlorfenyl)cyklohexanon ve formě světležlutého olejovitého produktu (4,54 g, 95 %).

hmotnostní spektrum (El, m/e) pro Ci₂Hi₃C1O₂ vypočteno: 208 naměřeno: 208 (M⁺).

Stupeň 5:

K roztoku 4-(4-chlorfenyl)cyklohexanonu (4,26 g, 20,48 mmol) v ethanolu (90 ml) a vodě (30 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (13,8 g, 144 mmol, 7 ekv.) a kyanid draselný (3,56 g, 54,77mmol, 2,5 ekv.). Směs se přes noc zahřívá na teplotu 80-90°C. Ochlazená reakční směs se přidá k ledové vodě (400 ml) a po dobu 30 minut intenzivně míchá. Vzniklá sraženina se přefiltruje přes Biichnerovu nálevku, důkladně promyje vodou a vysuší za vzniku hydantoinu Q ve formě bílého pevného produktu (5,58 g, 98

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro Ci₄Hi₅C1N₂O₂ vypočteno: 278 naměřeno: 277 (M-H).

100 ·· * • · · • · «* ·· • · * • · · ·· : : ··:· ·: :: :

: ·· ·· ·· ···· ♦ · · • · · • · · t • ♦ · «· ··

K suspenzi hydantoinu Q (5,15 g, 18,5 mmol) v suchém THF (250 ml) se postupně přidá di-ferc-butyldikarbonát (10,1 g, 46,3 mmol, 2,5 ekv.), triethylamin (2,8 ml, 2,07 g, 20,45 mmol, 1,1 ekv.) a DMAP (226 mg, 1,85 mmol). Reakční směs se změní na světležlutý roztok a přes noc se míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí za vzniku pevného produktu, který se absorbuje v ethylacetátu (500 ml), promyje IN HCl (3x50 ml), nasyceným vodným roztokem Na₂CO₃ (2x50 ml) a solankou (2x50 ml), vysuší nad bezvodým síranem sodným a za sníženého tlaku se zahustí. Surový světležlutý produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 90:10—> 70:30) za vzniku čistého bis-Boc hydantoinu R ve formě bílého pevného produktu (8,05 g, 91 %).

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro C₂4H₃iC1N₂O₆ vypočteno: 478 naměřeno: 542 (M+Ma+MeCN).

Stupeň 7:

R

101

Bis-Boc hydantoin R (6,41 g, 13,97 mmol) se rozpustí v DME (200 ml) za vzniku čirého roztoku. K vzniklému roztoku se přidá IN NaOH (120 ml, 120

mírně zakalená směs. Ukončení reakce se prokáže vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, a extrahuje Et₂O. Bez dalšího přečištění vzniklá vodná vrstva, obsahující kyselinu l-amino-4-(4-chlorfenyl)cyklohexankarboxylovou (4C1APC), reaguje s 6N HCl, čímž se docílí hodnoty pH 11-12. K vzniklému roztoku (~ 180 ml) se přidá DME (240 ml) a roztok Fmoc-Osu (5,31 g, 15,74 mmol, 1,1 ekv.) v DME (30 ml) a reakční směs se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, okyselí se přídavkem 3N HCl, a extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí. Surový produkt se poté přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: dichlormethan/methanol, 98:2-» 90:10) za vzniku čistého Fmoc-4-ClAPC ve formě bílého pevného produktu (5,04 g, 76% výtěžek z bis-Boc hydantoinu).

*H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

7,88 (d, 2H) 7,74 (d, 2H)

7.19- 7,42 (m, 8H)

4.20- 4,31 (m, 3H) hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro C28H26CINO4 vypočteno: 475 naměřeno: 474 (M-H).

• · · · · · • · · • · • · · · • ·

102

Příklad 8

Příprava kyseliny Fmoc-1 -amino-4-(3-methoxyfenvl)cyklohexan-1 -karboxylové (Fmoc-3-MeQApc-OH)

Stupeň 1:

O:

K roztoku 3-jodanisolu (11,7 g, 50,0 mmol, 1,3 ekv.) v suchém THF (180 ml) se při teplotě -78°C po dobu 25 minut přidává roztok n-buli (1,6M, 31,0 ml, 50 mmol) v hexanu. Reakční směs se po dobu dalších 30 minut míchá, načež se po kapkách přidá roztok l,4-cyklohexandion-zwo«o-ethylenketalu (6,0 g, 38,46 mmol) v suchém THF (100 ml). Poté co se reakční směs po dobu 2 hodin míchá při teplotě -78°C, načež se přidá vodný roztok chloridu amonného a směs se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a vakuově zahustí za vzniku spektroskopicky čistého bílého pevného produktu S (9,34 g, 98 %).

’H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,26 (dd 1H)

7,06-7,11 (m,2H)

6,79 (dd, 1H)

3,98 (m, 4H) 3,81 (s, 3H).

• · · · • · • · • · • · · • · · · • · · • · · · ·

Stupeň 2:

\ // .OMe

K míchanému roztoku alkoholu S (5,6 g, 21,21 mmol) v suchém dichlormethanu (200 ml) pod atmosférou dusíku při teplotě solné lázně postupně přidá triethylsilan (10,2 ml, 7,4 g, 63,63 mmol, 3 ekv.) borontrifluoritetherát (21,5 ml, 24,1 g, 169,7 mmol, 8 ekv.). Reakční směs se poté nechá ochladit na okolní teplotu, míchá se po dobu 3 hodin, načež se promyje 10% vodným roztokem uhličitanu draselného a vodou, vysuší nad síranem sodným a vakuově zahustí za vzniku deoxygenační sloučeniny ve formě oleje (4,91 g), který je dostatečně čistý pro přímé použití. Tento surový meziprodukt se rozpustí v acetonu (130 ml) a reaguje s4N HCl (60 ml), načež se po dobu 4 hodin zahřívá na teplotu 65 °C. Rozpouštědlo se za sníženého tlaku odstraní, pevný podíl zředí ethylacetátem a neutralizuje 4N roztokem NaOH. Vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem a sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší a zahustí. Vzniklý pevný podíl se přečistí mžikovou chromatografií na silikagelu (80/20-> 60/40) za vzniku 4-(3-methoxyfenyl)cyklohexanonu (3,67 g, celkový výtěžek 85 %) ve formě žlutého olejovitého produktu.

*H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,25 (dt 1H)

6,75-6,86 (m, 3H) hmotnostní spektrum (El, m/e) pro Ci₃Hi₆O2 vypočteno: 204 naměřeno: 204 (M+).

3,81 (s, 3H) 3,00 (tt, 1H).

• · • · • · · · • · <

• · 4 » · ·

• · · ·

Stupeň 3:

K roztoku 4-(3-methoxyfenyl)cyklohexanonu (3,10 g, 15,20 mmol) v ethanolu (60 ml) a vodě (20 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (8,75 g, 91,20 mmol, 6 ekv.) a kyanid draselný (1,98 g, 30,40 mmol, 2 ekv.). Směs se přes noc zahřívá na teplotu 80-90°C. Ochlazená reakční směs se přidá k ledové vodě (300 ml) a po dobu 30 minut intenzivně míchá. Vzniklá sraženina se přefiltruje přes Buchnerovu nálevku, důkladně promyje vodou a vysuší za vzniku hydantoinu T ve formě bílého pevného produktu (4,08 g, 98 %).

*H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d_g, hodnoty δ)

7,11 (d, IH) 3,72 (s,3H).

6,70-6,94 (m, 3H) hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro C15H18N2O3 vypočteno: 274 naměřeno: 316 (M+MeCN+H).

Stupeň 4:

• · • · • · · • · · · · • · · ·

105

K suspenzi hydantoinu T (5,29 g, 19,30 mmol) v suchém THF (250 ml) se postupně přidá di-/erc-butyldikarbonát (10,5 g, 48,16 mmol, 2,5 ekv.), triethylamin (3,0 ml, 2,17 g, 21,52 mmol, 1,1 ekv.) a DMAP (235 mg, 1,92 mmol). Reakční směs se změní na světležlutý roztok a přes noc se míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí za vzniku pevného produktu, který se absorbuje v ethylacetátu (500 ml), promyje IN HCl (3x50 ml), nasyceným vodným roztokem Na₂CO3 (2x50 ml) a solankou (2x50 ml), vysuší nad bezvodým síranem sodným a za sníženého tlaku se zahustí. Surový světležlutý produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 80:20-> 60:40) za vzniku čistého bis-Boc hydantoinu U ve formě bílého pevného produktu (8,70 g, 95 %).

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro C₂₅H34N₂O₇ vypočteno: 474 naměřeno: 538 (M+MeCN+Na).

Stupeň 5:

Bis-Boc hydantoin U (2,30 g, 4,84 mmol) se rozpustí v DME (80 ml) za vniku čirého roztoku. K tomuto roztoku se přidá IN NaOH (44 ml, 44 mmol) a reakční směs se při okolní teplotě přes noc míchá, přičemž vzniká mírně zakalená směs. Ukončení reakce se prokáže vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, a extrahuje Et₂O. Bez dalšího přečištění vzniklá vodná vrstva, • · · · · ·

106 obsahující kyselinu l-amino-4-(3-methoxyfenyl)cyklohexankarboxylovou (3MeOAPC), reaguje s 6N HCl, čímž se docílí hodnoty pH 11-12. K vzniklému roztoku (~ 40 ml) se přidá dioxan (80 ml) a roztok Fmoc-Cl (1,73 g, 6,76 mmol,

1,4 ekv.) a reakční směs se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, okyselí se přídavkem 3N HCl, a extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí. Surový produkt se poté přečistí mžikovou chromatografií na silikagelu (eluční soustava: dichlormethan/methanol, 98:2-> 90:10) za vzniku Fmoc-3-MeOAPC ve formě bílého pevného produktu (1,98 g, 87% výtěžek z bis-Boc hydantoinu U).

'Η - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

7,88 (d, 2H)

7,75 (d, 2H)

7,40 (td, 2H)

7,30 (td, 2H)

7,21 (m, 1H) 6,71-6,80 (m, 3H) 3,72 (s, 3H).

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro C29H29NO5 vypočteno: 471 naměřeno: 494 (M+Na).

Příklad 9

Příprava kyseliny Fmoc-(D,L)-5-brom-2-aminotetralin-2-karboxylové (Fmoc(D,L)5-Br-Atc-OH)

Stupeň 1:

co₂h

Cl

Ό • · · ·

107

Směs kyseliny 3-(2-bromfenyl)propanové (připravené ve 2 stupních z 2brombenzylbromidu, 2,0 g, 8,73 mmol), oxalylchloridu (1,14 ml, 13,1 mmol) a methylenchloridu (20 ml) se ochladí v ledové lázni a po kapkách se přidá N,Ndimethylformamid (34/zL, 0,44 mmol). Směs se po dobu 3 hodin míchá při okolní teplotě. Po zahuštění ve vakuu vzniká 3-(2-bromfenyl)propanoylchlorid, který se absorbuje v methylenchloridu a použije v následujícím stupni bez dalšího přečištění.

Stupeň 2:

Br

Roztok výše uvedeného chloridu kyseliny (8,73 mmol) v methylenchloridu se pomalu přidává k roztoku diazomethanu (připravený z 5,70 g l-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidinu) v etheru (40 ml) se ochladí na ledové lázni. Reakční směs se poté zahřeje na okolní teplotu a přes noc se míchá. Směs se vakuově zahustí, přečistí sloupcovou chromatografií (10-20 % ethylacetát/hexany) za vzniku l-diazo-4-(2-bromfenyl)butan-2-onu (1,88 g, 85 % ve dvou stupních).

^!H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,50 (1H, d, fenyl)

7,24 (2H, m, fenyl)

7,06 (1H, m, fenyl)

5,21 (1H, br s, diazo)

3,05 (2H, t, benzylová sk.)

2,62 (2H, m) • · · · • · · ·

Ke směsi dimeru rhodium(II)acetátu (15 mg, 0,068 mmol) v methylenchloridu (120 ml), zahřívané na teplotu varu pod zpětným chladičem, se pomalu přidává roztok l-diazo-4-(2-bromfenyl)butan-2-onu (1,74 g, 6,85 mmol) v methylenchloridu (30 ml). Vzniklá směs se poté zahřívá 20 minut na teplotu varu pod zpětným chladičem. Směs se ochladí na okolní teplotu, přidá se kyselina trifluoroctová (1,5 ml) a směs se po dobu 1 hodiny míchá při okolní teplotě, načež se k ní přidá nasycený roztok uhličitanu sodného. Vrstvy se oddělí a methylenchloridová vrstva se ještě jednou promyje nasyceným roztokem uhličitanu sodného. Sloučené vodné vrstvy se zpětně extrahují methylenchloridem. Sloučené organické vrstvy se vysuší nad síranem hořečnatým, přefiltrují a vakuově zahustí za vzniku hnědého olejovitého produktu. Po přečištění sloupcovou chromatografií (10-15 % ethylacetát/hexany) vzniká 5-brom-/3-tetralon (1,18 g, 77 %) ve formě bezbarvého olejovitého produktu.

^!H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,46 (1H, t, fenyl)

7,05-7,09 (2H, m, fenyl)

3,58 (2H, s, benzylová sk.)

3,22 (2H, t, benzylová sk.) 2,54 (2H, t).

Stupeň 4:

• · · ·

Směs 5-brom-/3-tetralonu (1,18 g, 5,24 mmol), kyanidu draselného (512 mg, 7,86 mmol), uhličitanu amonného (3,0 g, 31,22 mmol), ethanolu (25 ml) a vody (5 ml) v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi se po dobu 4 dnů zahřívá v olejové lázni o teplotě 80°C. Po ochlazení na okolní teplotu se bílá suspenze převede do ledové vody a míchá se několik hodin při okolní teplotě. Po přefiltrování a vysušení vzduchem vzniká hydantoin V (1,31 g, 85 %).

^!H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

10,71 (IH, br, NH)

8,28 (lH,brs,NH)

7,0-7,5 (3H, m, fenyl).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C^HnEhŤbCh vypočteno: 294 naměřeno: 293 (M-H), 295 (M-H).

Stupeň 5:

v • · >·« ·»· ···· ····· ·· · • ······· ·· · · · ·

·..· : ·..··..* *..· ··

110

Směs hydantoinu V (1,287 g, 4,36 mmol), Ba(OH)₂'H₂O (4,20 g, 22,2 mmol) ve vodě (25 ml) se v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi zahřívá po dobu 4 dnů v olejové lázni o teplotě 125°C. Reakční směs se ochladí na okolní teplotu,a při intenzivním míchání se okyselí na pH ~3 za použití 4N kyseliny sírové. Suspenze se míchá po dobu 1 hodiny na lázni s vařící vodou načež se zchladí na okolní teplotu. Bílá suspenze se přefiltruje a sraženiny propláchnou vodou. Sloučený filtrát a zbytky po promývání se vakuově zahustí na ~20 ml. Po neutralizaci koncentrovaným roztokem hydroxidu amonného vzniká bílá sraženina, která se přefiltruje, promyje vodou a přes noc vakuově zahustí za vzniku racemické kyseliny 5-brom-2-aminotetrahn-2-karboxylové (893 mg, 76 %).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro CnHi₂BrNO₂ vypočteno: 269 naměřeno: 270 (M+H), 272 (M+H), 268 (M-H), 270 (M-H).

Stupeň 6:

Br

NHFmoc

ČO₂H

Směs racemické kyseliny 5-brom-2-aminotetralin-2-karboxylové (882 mg, 3,27 mmol), triethylaminu (0,60 ml, 4,30 mmol), 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (Fmoc-Osu, 1,32 g, 3,91 mmol) v acetonitrilu (30 ml) a vodě (30 ml) se přes noc míchá při okolní teplotě. Analýza provedená za použití chromatografie na tenké vrstvě indikuje další den přítomnost aminokyseliny jako výchozí látky. Přidá se 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (0,25 g), triethylamin (0,6 ml) a acetonitril (5 ml) a směs se další den míchá při okolní teplotě. Reakční směs se vakuově zahustí, čímž se odstraní většina acetonitrilu, okyselí se na pH ~3 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a bílá emulze se dvakrát extrahuje • · · · •· · ·· ·· ·· ·»· ··· ·· • · · · · ···· · · • ······· ·· · · · · • · · ···· ·· ·· · ·· ·· ··

111 methylenchloridem. Sloučené organické vrstvy se promyjí vodou, solankou, vysuší nad síranem hořečnatým. Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový olej ovitý produkt, který se přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: 2-> 5^> 10% methanol/methylenchlorid) za vzniku racemické kyseliny Fmoc-5brom-2-aminotetralin-2-karboxylová (1,09 g, 68 %) ve formě bílého pevného produktu.

hmotnostní spektrum (FAB) pro C₂₆H₂₂BrNNaO4 vypočteno: 514,0630 naměřeno: 514,0643 (M+Na).

Příklad 10

Příprava kyseliny Fmoc-(D,L)-5-chlor-2-aminotetralin-2-karboxylové (Fmoc(D,L)5-ClAtc-OH)

Stupeň 1:

Cl

Směs kyseliny 3-(2-chlorfenyl)propanové ( 5,0 g, 27,1 mmol), thionylchloridu (10,9 ml, 149 mmol) a toluenu (75 ml) se zahřívá po dobu 2 hodin na teplotu varu pod zpětným chladičem. Po zahuštění ve vakuu vzniká 3(2-chlorfenyl)propanoylchlorid, který se absorbuje v methylenchloridu a použije v následujícím stupni bez dalšího přečištění.

• 99 · • 9 ··

112

Stupeň 2:

Roztok výše uvedeného chloridu kyseliny (surový, 27,1 mmol) v methylenchloridu se pomalu přidává k roztoku diazomethanu (připravený z 17,8 g 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidinu) v etheru (120 ml), ochlazovanému na ledové lázni. Reakční směs se poté zahřeje na okolní teplotu a přes noc se míchá. Směs se vakuově zahustí za vzniku l-diazo-4-(2-chlorfenyl)butan-2-onu (5,87 g, >100 % ve dvou stupních) ve formě světle žlutého olejovitého produktu. Sloučenina se použije v následujícím stupni bez dalšího přečištění.

- Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,05-7,32 (4H, m, fenyl)

5,13 (1H, br s, diazo)

3,00 (2H, t, benzylová sk.) 2,57 (2H, m).

Stupeň 3:

N,

• · · • · « « · · · » » · » ♦ · ·

113

Ke směsi dimeru rhodium(II)acetátu (60 mg, 0,27 mmol) v methylenchloridu (400 ml), zahřívané na teplotu varu pod zpětným chladičem, se pomalu přidává roztok surového l-diazo-4-(2-bromfenyl)butan-2-onu (5,87 g,

27,1 mmol (teor.)) v methylenchloridu (50 ml). Vzniklá směs se poté zahřívá 20 minut na teplotu varu pod zpětným chladičem. Směs se ochladí na okolní teplotu, přidá se kyselina trifluoroctová (6,0 ml) a směs se po dobu 2 hodin míchá při okolní teplotě, načež se k ní přidá nasycený roztok uhličitanu sodného. Vrstvy se oddělí a methylenchloridová vrstva se ještě jednou promyje nasyceným roztokem uhličitanu sodného. Sloučené vodné vrstvy se zpětně extrahují methylenchloridem. Sloučené organické vrstvy se vysuší nad síranem hořečnatým, přefiltrují a vakuově zahustí za vzniku hnědého olejovitého produktu. Po přečištění sloupcovou chromatografií (10-15 % ethylacetát/hexany) vzniká 5-chlor-/3-tetralon (3,32 g, 68% výtěžek pro stupně 1 až 3) ve formě světle hnědého olejovitého produktu.

'H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,30 (1H, m, fenyl)

7,15 (1H, t, fenyl)

7,05 (1H, d, fenyl)

3,60 (2H, s, benzylová sk.) 3,22 (2H, t, benzylová sk.) 2,56 (2H, t).

Stupeň 4:

w

114

Směs 5-chlor-/3-tetralonu (880 mg, 4,87 mmol), kyanidu draselného (500 mg, 7,67 mmol), uhličitanu amonného (2,85 g, 29,7 mmol), ethanolu (24 ml) a vody (6 ml) v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi se po dobu 66 hodin zahřívá v olejové lázni o teplotě 80°C. Po ochlazení na okolní teplotu se suspenze převede do ledové vody a míchá se několik hodin při okolní teplotě. Po přefiltrování a vysušení vzduchem vzniká hydantoin W (0,92 g, 75 %) ve formě světle béžového pevného produktu.

*H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

10,70 (1H, br, NH) 7,0-7,3 (3H, m, fenyl).

8,25 (1H, brs, NH) hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C^HuC^CU vypočteno: 250 naměřeno: 249 (M-H), 251 (M-H).

Stupeň 5:

Směs hydantoinu W (880 mg, 3,51 mmol), Ba(OH)2'H₂O (3,40 g, 18,0 mmol) ve vodě (50 ml, též zředěné) se v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi zahřívá po dobu 2 dnů v olejové lázni o teplotě 125°C. Reakční směs se ochladí • « o * · · • * » · · · ··· « · · • * ···· ·« ·· · · · e · • · · ♦»·· » · · · • 4 9 9 · * * · **

115 na okolní teplotu,a při intenzivním míchání se okyselí na pH ~3 za použití 4N kyseliny sírové. Suspenze se míchá po dobu 2 hodin na lázni s vařiči vodou načež se zchladí na okolní teplotu. Bílá suspenze se přefiltruje a sraženiny propláchnou vodou. Sloučený filtrát a zbytky po promývání se vakuově zahustí na ~50 ml. Po neutralizaci koncentrovaným roztokem hydroxidu amonného vzniká bílá sraženina, která se přefiltruje, promyje vodou a přes noc vakuově zahustí za vzniku racemické kyseliny 5-chlor-2-aminotetralin-2-karboxylové (788 mg, 99 %).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C11H12CINO2 vypočteno: 225 naměřeno: 226 (M+H), 228 (M+H), 224 (M-H), 226 (M-H).

Stupeň 6:

Směs racemické kyseliny 5-chlor-2-aminotetralin-2-karboxylové (402 mg, 1,78 mmol), triethylaminu (0,38 ml, 2,73 mmol), 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (Fmoc-Osu, 904 mg, 2,68 mmol) v acetonitrilu (20 ml) a vodě (20 ml) se po dobu 2 dní míchá při okolní teplotě. Analýza provedená za použití chromatografie na tenké vrstvě indikuje po 2 dnech přítomnost aminokyseliny jako výchozí látky. Přidá se 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (0,12 g) a triethylaminu (0,1 ml) a směs se další den míchá při okolní teplotě. Reakční směs se vakuově zahustí, čímž se • · • · · · · · · ··· · · · · · · · ······· · · · · · · • · ···· ··<

116 .........

odstraní většina acetonitrilu, okyselí se na pH ~3 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a bílá emulze se třikrát extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické vrstvy se promyjí vodou, solankou, vysuší nad síranem hořečnatým.

Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový olej ovitý produkt, který se přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: 3-» 6-» 8% methanol/methylenchlorid) za vzniku racemické kyseliny Fmoc-5-chlor-2aminotetralin-2-karboxylové (540 mg, 68 %) ve formě bílého pevného produktu.

hmotnostní spektrum (El) pro C26H22CINO4 vypočteno: 447,1237 naměřeno: 447,1234 (M).

Příklad 11

Příprava kyseliny Fmoc-(D,L)-5-methoxy-2-aminotetralin-2-karboxylové (Fmoc-(D,L)5-MeOAtc-OH)

Stupeň 1:

Směs racemické kyseliny 5-methoxy-2-aminotetralin-2-karboxylové ( příprava podle postupu popsaného v Olhrecht, D. a kol. “Helv. Chim Acta“

1992, 75, s. 1666) (802 mg, 3,62 mmol), triethylaminu (0,62 ml, 4,45 mmol), 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (Fmoc-Osu, 1,47 g, 4,36 mmol) v acetonitrilu (25 ml) a vodě (25 ml) se po dobu 30 hodin míchá při okolní • · · · • ······· ·· ··· · • · · ···· · · '

117 ········· teplotě. Analýza provedená za použití chromatografie na tenké vrstvě indikuje přítomnost aminokyseliny jako výchozí látky. Přidá se 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (370 mg) a triethylaminu (0,6 ml) a směs se po dobu 24 hodin míchá při okolní teplotě. Reakční směs se vakuově zahustí, čímž se odstraní většina acetonitrilu, okyselí se na pH ~3 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a bílá emulze se třikrát extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické vrstvy se promyjí vodou, solankou a vysuší nad síranem hořečnatým. Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový olej ovitý produkt, který se přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: l-»3-»5-»10% methanol/methylenchlorid) za vzniku racemické kyseliny Fmoc-5-methoxy-2aminotetralin-2-karboxylové (1,14 g, 71 %) ve formě šedobílého pevného produktu.

hmotnostní spektrum (FAB) pro C27H26NO5 vypočteno: 444,1812 naměřeno: 444,1814 (M+H).

Příklad 12

Příprava kyseliny Fmoc-(D,L)-5-ethoxy-2-aminotetralin-2-karboxylové (Fmoc(D,L)5-EtOAtc-OH)

Stupeň 1:

OH • ·

Směs 1,6-dihydroxynaftalenu (5,02 g, 31,3 mmol), bezvodého uhličitanu draselného (52,0 g, 376 mmol), N,N-dimethylformamidu (50 ml) a jodethanu (15 ml, 188 mmol) se po dobu 24 hodin míchá v olejové lázni o teplotě 35°C . Reakční směs se přefiltruje a pevný podíl se důkladně propláchne ethyletherem. Filtrát a zbytky po promývání se sloučí a vakuově zahustí, čímž se odstraní většina rozpouštědel. Hnědý pevný podíl se rozdělí mezi vodu a ether a vrstvy se oddělí. Etherová vrstva se promyje vodou. Sloučené vodné vrstvy se zpětně extrahují etherem. Etherové extrakty se sloučí, promyjí solankou a vysuší nad síranem hořečnatým. Filtrací a zahuštěním vzniká surový hnědý pevný produkt (6,74 g, 99 %). Rekrystalizací surového produktu z horkého methanolu vzniká

1,6-diethoxynaftalen (4,36 g, 64% výtěžek, první výnos) ve formě světle hnědého pevného produktu.

H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

8,20 (IH, d, fenyl) 7,06-7,36 (4H, m, fenyl)

6,66 (IH, dd, fenyl)

4,10-4,23 (4H, 2 sady q, 2 CH₂) 1,45-1,56 (6H, 2 sady t, 2 CH₃).

Stupeň 2:

K roztoku 1,6-diethoxynaftalenu (4,15 g, 19,2 mmol) v absolutním ethanolu (100 ml), zahřívanému na teplotu varu pod zpětným chladičem, se po • · · · dobu 60 minut opatrně přidávají malé kousky kovového sodíku (6,8 g, 296 mmol). Vzniklá směs se po dobu 90 minut zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. Chromatografie na tenké vrstvě indikuje přítomnost nezreagované výchozí látky. Přidá se další kovový sodík (1,0 g, 43,5 mmol) a reakční směs se dalších 60 minut zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem, načež se ochladí na okolní teplotu, přidá se voda a směs se okyselí přídavkem koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou. Směs se vakuově zahustí, čímž se odstraní většina ethanolu. Vodná směs se 3x extrahuje etherem. Sloučené organické vrstvy se promyjí vodou a vysuší nad síranem sodným. Po přefiltrování a zahuštění vzniká hnědý pevný produkt, který se rozpustí v 1:1 směsi ethanolu a vody (200 ml), načež se přidá kyselina p-toluensulfonová (400 mg). Směs se po dobu 210 minut zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. Přidá se další kyselina p-toluensulfonová (100 mg) a směs se po dobu dalších 60 minut zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. Po ochlazení na okolní teplotu se většina ethanolu odstraní za sníženého tlaku. Vodná směs se 3x extrahuje etherem a sloučené organické vrstvy se promyjí vodou, nasyceným roztokem chloridu sodného a vysuší nad síranem sodným. Po přefiltrování a zahuštění vzniká hnědý olej ovitý produkt, který se přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: 7% ethylacetát/hexany) za vzniku 5-ethoxy-/3-tetralonu (2,43 g, 67 %) ve formě světle žlutého olejovitého produktu.

H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,15 (1H, t, fenylová sk.) 6,76 (1H, m, fenylová sk.)

6,72 (1H, d, fenylová sk.) 4,05 (2H, q, CH₂) i

3,56 (2H, s, benzylová sk.)

3,10 (2H, t, benzylová sk.)

2,53 (2H, t)

1,44 (3H, t, CH₃).

• · · ·

Směs 5-ethoxy-jS-tetralonu (2,23 g, 11,7 mmol), kyanidu draselného (1,20 g, 18,4 mmol), uhličitanu amonného (6,75 g, 70,2 mmol), ethanolu (80 ml) a vody (20 ml) v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi se po dobu 3 dní zahřívá v olejové lázni o teplotě 80°C. Po ochlazení na okolní teplotu se suspenze převede do ledové vody a míchá se několik hodin při okolní teplotě. Po přefiltrování a vysušení vzduchem vzniká hydantoin X (2,69 g, 88 %) ve formě béžového pevného produktu.

*H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

10,65 (1H, brs, NH)

8,22 (1H, brs, NH)

7,06 (1H, t, fenyl.sk.)

6,75 (1H, d, fenylová sk.)

6,65 (1H, d, fenylová sk.) 3,98 (2H, q, CH₂)

1,32 (3H, t, CH₃).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro Ci₄H₁₆N₂O₃ vypočteno: 259 naměřeno: 258 (M-H).

Stupeň 4:

x • · · ·

121

Směs hydantoinu X (2,57 g, 9,87 mmol), Ba(OH)₂H₂O (9,40 g, 49,6 mmol) ve vodě (200 ml, též zředěné) se v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi zahřívá po dobu 39 hodin v olejové lázni o teplotě 105°C. Přidá se další Ba(OH)₂'H₂O (9,40 g, 49,6 mmol) a směs se znovu míchá a zahřívá po dobu 21 hodin v olejové lázni o teplotě 125°C. Reakční směs se ochladí na okolní teplotu,a při intenzivním míchání se okyselí na pH ~3 za použití 4N kyseliny sírové. Suspenze se míchá po dobu 1 hodiny na lázni s vařiči vodou načež se zchladí na okolní teplotu. Bílá suspenze se přefiltruje a sraženiny propláchnou vodou. Sloučený filtrát a zbytky po promývání se vakuově zahustí na ~75 ml. Po neutralizaci koncentrovaným roztokem hydroxidu amonného vzniká bílá sraženina, která se přefiltruje, promyje vodou a vysuší na vzduchu za vzniku racemické kyseliny 5-ethoxy-2-aminotetralin-2-karboxylové (2,34 g, kvant.výtěžek) ve formě světle béžového pevného produktu.

Hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C13H17NO3 vypočteno: 235 naměřeno: 236 (M+H), 234 (M-H).

Stupeň 5:

Směs racemické kyseliny 5-ethoxy-2-aminotetralin-2-karboxylové (2,22 g, 9,44 mmol), triethylaminu (2,00 ml, 14,3 mmol), 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (Fmoc-Osu, 4,81 g, 14,3 mmol) • ·

122 v acetonitrilu (75 ml) a vodě (75 ml) se po dobu 2 dní míchá při okolní teplotě. Analýza provedená za použití chromatografie na tenké vrstvě indikuje po 2 dnech přítomnost aminokyseliny jako výchozí látky. Přidá se 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (645 mg) a triethylaminu (1,0 ml) a směs se další den míchá při okolní teplotě. Reakční směs se vakuově zahustí, čímž se odstraní většina acetonitrilu, okyselí se na pH ~3 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a bílá emulze se třikrát extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické vrstvy se promyjí vodou, solankou, vysuší nad síranem hořečnatým. Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový olej ovitý produkt, který se přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: 3-> 5-> 10% methanol/methylenchlorid) za vzniku racemické kyseliny Fmoc-5-ethoxy-2aminotetralin-2-karboxylové (4,66 g,>kvant.výtěžek) ve formě bílého pevného produktu.

Hmotnostní spektrum (FAB) pro C₂8H₂8NO₅ vypočteno: 458,1967 naměřeno: 458,1985 (M+H).

Příklad 13

Příprava kyseliny Fmoc-(D,L)-5 -isopropoxy-2-aminotetralin-2-karboxylové (Fmoc-(DX)5-iPrQAtc-OH)

Stupeň 1:

• toto to * • · · ·

123

Směs 6-methoxy-l-tetralonu (5,07 g, 28,8 mmol), 10% palladia na uhlí (3,53 g, 3,32 mmol) v suchém p-cymenu (250 ml) se pod atmosférou argonu zahřívá po dobu 38 hodin na teplotu varu pod zpětným chladičem. Reakční směs se ochladí na okolní teplotu, přefiltruje přes celitovou vrstvu a pevný podíl důkladně propláchne p-cymenem. Filtrát a zbytky po promývání se sloučí a dvakrát extrahují IN roztokem hydroxidu sodného (2x 70 ml). Sloučené vodné extrakty se okyselí 6N kyselinou chlorovodíkovou na pH~3 a extrahují 3x etherem. Sloučené organické vrstvy se promyjí vodou a vysuší nad bezvodým síranem sodným. Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový 5-hydroxy-6methoxynaftalen (2,31 g, 46 %) ve formě světlehnědého pevného produktu, který se použije v následujícím stupni bez dalšího přečištění.

Hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro CnHi₀O₂ vypočteno: 174 naměřeno: 173 (M-H).

Stupeň 2:

Směs 5-hydroxy-6-methoxynaftalenu (2,10 g, 12,1 mmol), uhličitanu česného (19,7 g, 60,5 mmol), N,N-dimethylformamidu (12 ml) a 2-brompropanu (3,50 ml, 36,9 mmol) se přes noc míchá v olejové lázni o teplotě 40°C . Reakční směs se přefiltruje a pevný podíl se důkladně propláchne ethyletherem. Filtrát a zbytky po promývání se sloučí a vakuově zahustí, čímž se odstraní většina rozpouštědel. Hnědý pevný podíl se rozdělí mezi vodu a ether a vrstvy se oddělí. Etherová vrstva se promyje vodou. Sloučené vodné vrstvy se zpětně extrahují

124 .......

etherem. Etherové extrakty se sloučí, promyjí solankou a vysuší nad síranem sodným. Filtrací a zahuštěním vzniká surový produkt přečištěný sloupcovou chromatografií (eluční soustava: 2,5->5% ethylacetát/hexany) za vzniku 1isopropoxy-6-methoxynaftalen (2,23 g, 86 %) ve formě světle hnědého olejovitého produktu.

Ή - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

8,17 (1H, d, fenyl) 7,05-7,38 (4H, m, fenyl)

6,72 (1H, dd, fenyl)

4,73 (1H, m, CH z iPr) 3,92 (3H, s, OCH3)

1,42 (6H, d, 2 CH₃ z iPr).

Stupeň 3:

K roztoku l-isopropoxy-6-methoxynaftalenu (2,23 g, 10,3 mmol) v absolutním ethanolu (50 ml), zahřívanému na teplotu varu pod zpětným chladičem, se po dobu 45 minut opatrně přidávají malé kousky kovového sodíku (3,6 g, 157 mmol). Vzniklá směs se po dobu 120 minut zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. Směs se ochladí na okolní teplotu, přidá se voda a směs se okyselí přídavkem koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Směs se vakuově zahustí, čímž se odstraní většina ethanolu. Vodná směs se 3x extrahuje etherem. Sloučené organické vrstvy se promyjí vodou a vysuší nad síranem sodným. Po přefiltrování a zahuštění vzniká hnědý pevný produkt, který se rozpustí v 1:1 • · • ·· ·

125 směsi ethanolu a vody (90 ml), načež se přidá kyselina p-toluensulfonová (200 mg). Směs se po dobu 60 minut zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. Po ochlazení na okolní teplotu se většina ethanolu odstraní za sníženého tlaku. Vodná směs se 2x extrahuje etherem a sloučené organické vrstvy se promyjí vodou, nasyceným roztokem chloridu sodného a vysuší nad síranem sodným. Po přefiltrování a zahuštění vzniká načervenalý olej ovitý produkt, který se přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: 8-^-15% acetát/hexany) za vzniku 5-isopropoxy-/3-tetralonu (1,37 g, 65 %) ve formě bezbarvého olejovitého produktu.

’Η - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDCfi, hodnoty δ)

7,16 (IH, t, fenyl.sk.) 6,78 (IH, d, fenyl.sk.)

6,71 (IH, d, fenyl.sk.)

4,53 (IH, m, CH z iPr)

3,56 (2H, s, benzylová sk.) 3,08 (2H, t, benzylová sk.)

2,50 (2H, t)

1,37 (6H, d,2CH₃ziPr).

Stupeň 4:

Směs 5-isopropoxy-/3-tetralonu (1,37 g, 6,71 mmol), kyanidu draselného (660 mg, 10,1 mmol), uhličitanu amonného (3,87 g, 40,3 mmol), ethanolu (44 ml) a vody (9 ml) v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi se po dobu 42 hodin zahřívá v olejové lázni o teplotě 80°C. Po ochlazení na okolní teplotu se suspenze převede do ledové vody a míchá se několik hodin při okolní teplotě. Po přefiltrování a vysušení vzduchem vzniká hydantoin Y (1,64 g, 89 %).

• · • · · · • · • · • · *·

126

Stupeň 5:

Směs hydantoinu Y (1,64 g, 5,98 mmol), Ba(OH)₂H₂O (5,66 g, 29,9 mmol) ve vodě (25 ml) se v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi zahřívá po dobu 270 hodin v olejové lázni o teplotě 100°C. Reakční směs se ochladí na okolní teplotu,a při intenzivním míchání se neutralizuje na pH ~7 za použití 4N kyseliny sírové. Suspenze se míchá po dobu 1 hodiny na lázni s vařiči vodou načež se zchladí na okolní teplotu. pH suspenze se zvýší přídavkem hydroxidu sodného a bílá suspenze se přefiltruje a sraženiny propláchnou vodou. Sloučený filtrát a zbytky po promývání se vakuově zahustí na ~75 ml. Po neutralizaci koncentrovanou kyselinou hydrochlorovou vzniká bílá sraženina, která se přefiltruje, promyje vodou a vysuší na vzduchu za vzniku racemické kyseliny 5isopropoxy-2-aminotetralin-2-karboxylové (3,48 g, ve vlhkém stavu a obsahující anorganickou sůl,>kvant.výtěžek).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C14H19NO3 vypočteno: 249 naměřeno: 248 (M-H).

Stupeň 6:

COgH

• · • · · · • ·

127

Směs racemické kyseliny 5-isopropoxy-2-aminotetralin-2-karboxylové (3,48 g, 5,98 mmol (teoret.)), triethylaminu (1,10 ml, 7,89 mmol), 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (Fmoc-Osu, 2,62 g, 7,77 mmol) v acetonitrilu (30 ml) a vodě (30 ml) se po dobu 1 dne míchá při okolní teplotě. Analýza provedená za použití chromatografie na tenké vrstvě indikuje přítomnost aminokyseliny jako výchozí látky. Přidá se 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (500 mg) a směs se další den míchá při okolní teplotě. Reakční směs se vakuově zahustí, čímž se odstraní většina acetonitrilu, okyselí se na pH ~3 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a bílá emulze se třikrát extrahuje methylenchloridem. Sloučené organické vrstvy se promyjí vodou, solankou, vysuší nad síranem hořečnatým. Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový olej ovitý produkt, který se přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: l-> 2-> 5-» 8% methanol/methylenchlorid) za vzniku racemické kyseliny Fmoc-5-isopropoxy-2-aminotetralin-2-karboxylové (0,50 g, 18% výtěžek, 2 stupně) ve formě bílého pevného produktu.

hmotnostní spektrum (FAB) pro C29H30NO5 vypočteno: 472,2124 naměřeno: 472,2117 (M+H).

Příklad 14

Příprava kyseliny Fmoc-(D,L)-5-methyl-2-aminotetralin-2-karboxylové (Fmoc(D,L)5-MeAtc-OH)

Stupeň 1:

ch₃ co₂h ch₃

Ct· • · · · • · • · • · · • · ·

128

Směs kyseliny 2-methylhydrogenskořicové (3,0 g, 18,3 mmol), oxalylchloridu (3,19 ml, 36,6 mmol) a methylenchloridu (30 ml) se ochladí v ledové lázni a po kapkách se přidá N,N-dimethylformamid (0,14 ml, 1,81 mmol). Směs se přes noc míchá při okolní teplotě. Po zahuštění ve vakuu vzniká

3-(2-methylfenyl)propanoylchlorid, který se absorbuje v methylenchloridu a použije v následujícím stupni bez dalšího přečištění.

Stupeň 2:

n₂

Roztok výše uvedeného chloridu kyseliny (surový, 18,3 mmol) v methylenchloridu se pomalu přidává k roztoku diazomethanu (připravený z 11,9 g l-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidinu) v etheru (80 ml), ochlazovanému na ledové lázni. Reakční směs se poté zahřeje na okolní teplotu a přes noc se míchá. Směs se vakuově zahustí a přečistí sloupcovou chromatografíí (eluční soustava: 10-»20% ethylacetát/hexany) za vzniku l-diazo-4-(2methylfenyl)butan-2-onu (2,08 g, 60 % ve dvou stupních) ve formě světle žlutého olejovitého produktu.

Stupeň 3:

ch₃ ch₃ n₂ • · tttt

129 .....

Ke směsi dimeru rhodium(II)acetátu (24 mg, 0,109 mmol) v methylenchloridu (200 ml), zahřívané po dobu 180 minut na teplotu varu pod zpětným chladičem, se pomalu přidává roztok l-diazo-4-(2-methylfenyl)butan2-onu (2,08 g, 11,1 mmol) v methylenchloridu (50 ml). Vzniklá směs se poté zahřívá 20 minut na teplotu varu pod zpětným chladičem. Směs se ochladí na okolní teplotu, přidá se kyselina trifluoroctová (2,40 ml) a směs se po dobu 1 hodiny míchá při okolní teplotě, načež se k ní přidá nasycený roztok uhličitanu sodného. Vrstvy se oddělí a methylenchloridová vrstva se ještě jednou promyje nasyceným roztokem uhličitanu sodného. Sloučené vodné vrstvy se zpětně extrahují methylenchloridem. Sloučené organické vrstvy se vysuší nad síranem hořečnatým, přefiltrují a vakuově zahustí za vzniku surového hnědého olej ovitého produktu. Po přečištění sloupcovou chromatografií (15 % ethylacetát/hexany) vzniká 5-methyl-/3-tetralon (1,48 g, 84% výtěžek) ve formě světle hnědého olej ovitého produktu.

*H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

6,90-7,20 (3H, m, fenylová sk.)

3,58 (2H, s, benzylová sk.)

3,03 (2H, t, benzylová sk.)

2,55 (2H, t)

2,34 (3H, s, CH₃).

Stupeň 4:

z * · « ·

130 • * · • · · ♦ · · · · » · ♦ * · ·♦ ·· • » · • · · · * • · 4 * • · · · • · · ·

Směs 5-methyl-/3-tetralonu (1,48 g, 9,24 mmol), kyanidu draselného (902 mg, 13,9 mmol), uhličitanu amonného (5,33 g, 55,5 mmol), ethanolu (45 ml) a vody (9 ml) v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi se po dobu 3 dní zahřívá v olejové lázni o teplotě 80°C. Po ochlazení na okolní teplotu se suspenze převede do ledové vody a míchá se několik hodin při okolní teplotě. Po přefiltrování a vysušení vzduchem vzniká surový hydantoin Z (1,81 g, 85 %) ve formě béžového pevného produktu.

'H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-dfo hodnoty δ)

10,66 (1H, brs, NH)

8,22 (1H, brs, NH)

6,85-7,05 (3H, m, fenyl.sk.) 2,17 (3H, s, CH₃).

Stupeň 5:

Směs hydantoinu Z (1,80 g, 7,82 mmol), Ba(OH)₂'H₂O (7,40 g, 39,1 mmol) ve vodě (28 ml) se v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi zahřívá po dobu 88 hodin v olejové lázni o teplotě 125°C. Reakční směs se ochladí na okolní teplotu,a při intenzivním míchání se okyselí na pH ~3 za použití 4N kyseliny sírové. Suspenze se míchá po dobu 1 hodiny na lázni s vařící vodou načež se zchladí na okolní teplotu. Bílá suspenze se přefiltruje a sraženiny propláchnou vodou. Sloučený filtrát a zbytky po promývání se vakuově zahustí na ~50 ml. Po neutralizaci koncentrovaným hydroxidem amonným vzniká bílá sraženina, která se přefiltruje, promyje vodou a vysuší na vzduchu za vzniku • · » · * 1 • ♦ · ·» · · • « « * · · ⁹ • ··· · * · · * · • ··«···* * » ··· « » · β··· »

131 ’· ’ ·’ ” racemické kyseliny 5-methyl-2-aminotetralin-2-karboxylové (1,05 g, 65 %) ve formě béžového pevného produktu.

Hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C12H15NO2 vypočteno: 205 naměřeno: 206 (M+H).

Stupeň 6:

Směs racemické kyseliny 5-methyl-2-aminotetralin-2-karboxylové (1,05 g, 5,12 mmol), triethylaminu (0,93 ml, 6,67 mmol), 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (Fmoc-Osu, 2,24 g, 6,64 mmol) v acetonitrilu (30 ml) a vodě (30 ml) se po dobu 2 dní míchá při okolní teplotě. Analýza provedená za použití chromatografie na tenké vrstvě indikuje přítomnost aminokyseliny jako výchozí látky. Přidá se 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (520 mg) a směs se dalších 24 hodin míchá při okolní teplotě. Reakční směs se vakuově zahustí, čímž se odstraní většina acetonitrilu, okyselí se na pH ~3 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a bílá emulze se dvakrát extrahuje methylenchloridem. Sloučené organické vrstvy se promyjí vodou, solankou, vysuší nad síranem hořečnatým. Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový olej ovitý produkt, který se přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: 2-> 5-> 8% methanol/methylenchlorid) za vzniku racemické kyseliny Fmoc-5-methyl-2aminotetralin-2-karboxylové (1,62 g, 74% výtěžek, 2 stupně) ve formě světle hnědého pevného produktu.

132

Hmotnostní spektrum (FAB) pro C27H26NO4 vypočteno: 428,1862 naměřeno: 428,1844 (M+H).

Příklad 15

Příprava kyseliny Fmoc-(D,L)-5-ethyl-2-aminotetralin-2-karboxylové (Fmoc(D,L)5-EtAtc-OH)

Stupeň 1

Směs kyseliny 3-(2-ethylfenyl)propanové (připravené ve 3 stupních z 1ethyl-2-jodbenzenu, 4,24 g, 23,8 mmol), thionylchloridu (9,50 ml, 130 mmol) a toluenu (100 ml) se po dobu 2 hodin zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. Po zahuštění ve vakuu vzniká 3-(2-ethylfenyl)propanoylchlorid, který se absorbuje v methylenchloridu a použije v následujícím stupni bez dalšího přečištění.

Stupeň 2

Cl' • · • · • · · · • ·· ··· ·· · • ··· · · · · · · · · • ······* · · · · · · ·

133 *·' ^: ’··”·*

Roztok 3-(2-ethylfenyl)propanoylchloridu (surový, 23,8 mmol) v methylenchloridu se pomalu přidává k roztoku diazomethanu (připravený z 15,6 g l-methyl-3-nitro-l-nitrosoguanidinu) v etheru (100 ml), ochlazovanému na ledové lázni. Reakční směs se poté zahřeje na okolní teplotu a přes noc se míchá. Směs se vakuově zahustí a přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: 10-»20% ethylacetát/hexany) za vzniku l-diazo-4-(2ethylfenyl)butan-2-onu (3,47 g, 72 % ve dvou stupních).

’Η - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,1 -7,25 (4H, m, fenyl.s.) 2,97 (2H, m, CH₂ z ethylu)

5,21 (1H, br s, diazová sk.) 1,20 (3H, t, CH₃).

Stupeň 3:

n₂

Ke směsi dimeru rhodium(II)acetátu (38 mg, 0,172 mmol) v methylenchloridu (300 ml), zahřívané po dobu 90 minut na teplotu varu pod zpětným chladičem, se pomalu přidává roztok l-diazo-4-(2-ethylfenyl)butan-2onu (3,47 g, 17,2 mmol) v methylenchloridu (50 ml). Vzniklá směs se poté zahřívá 20 minut na teplotu varu pod zpětným chladičem. Směs se ochladí na okolní teplotu, přidá se kyselina trifluoroctová (3,75 ml) a směs se po dobu 1 hodiny míchá při okolní teplotě, načež se k ní přidá nasycený roztok uhličitanu sodného. Vrstvy se oddělí a methylenchloridová vrstva se ještě jednou promyje nasyceným roztokem uhličitanu sodného. Sloučené vodné vrstvy se zpětně extrahují methylenchloridem. Sloučené organické vrstvy se vysuší nad síranem • · • · • * · ··· · · • ··· · ···· · · » ······· ·· · · · · horečnatým, přefiltrují a vakuově zahustí za vzniku surového 5-ethyl-/3-tetralon (3,09 g, > kvantitativní výtěžek) ve formě červeno hnědého olejovitého produktu, který se použije v následujícím stupni bez dalšího přečištění.

’H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

6,9-7,2 (3H, m, fenylová sk.)

3,58 (2H, s, benzylová sk.)

3,08 (2H, s, benzylová sk.)

2,70 (2H, q, CH₂ z ethylu) 2,52 (2H, t, benzylová sk.) 1,20 (3H, t, CH₃ z ethylu)

Stupeň 4:

Směs 5-ethyl-/3-tetralonu (3,09 g, 17,7 mmol), kyanidu draselného (1,73 g,

26,6 mmol), uhličitanu amonného (10,2 g, 106 mmol), ethanolu (80 ml) a vody (16 ml) v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi se po dobu 48 hodin zahřívá v olejové lázni o teplotě 80°C. Po ochlazení na okolní teplotu se bílá suspenze převede do ledové vody a míchá se několik hodin při okolní teplotě. Po přefiltrování a vysušení vzduchem vzniká surový hydantoin AA (3,85 g, 92 % výtěžek, 2 stupně) ve formě světle béžového pevného produktu.

*H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

10,67 (1H, brs, NH)

8,26 (1H, brs, NH)

6,8-7,1 (3H, m, fenyl).

1,13 (3H, t, CH₃).

• · · · · · • ···· · · · «· ·· · · · · ·

135 hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro Ci4Hi₆N₂O₂ vypočteno: 244 naměřeno: 243 (M-H).

Stupeň 5:

Směs hydantoinu AA (1,00 g, 4,09 mmol), Ba(OH)₂'H₂O (4,0 g, 21,1 mmol) ve vodě (20 ml) se v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi zahřívá po dobu 48 hodin v olejové lázni o teplotě 125°C. Reakční směs se ochladí na okolní teplotu,a při intenzivním míchání se okyselí na pH ~3 za použití 4N kyseliny sírové. Suspenze se míchá po dobu 2 hodin na lázni s vařiči vodou načež se zchladí na okolní teplotu. Bílá suspenze se přefiltruje a sraženiny propláchnou vodou. Sloučený filtrát a zbytky po promývání se vakuově zahustí na ~50 ml. Po neutralizaci koncentrovaným hydroxidem amonným vzniká bílá sraženina, která se přefiltruje, promyje vodou a vysuší přes noc ve vakuu za vzniku racemické kyseliny 5-ethyl-2-aminotetralin-2-karboxylové (796 mg, 89 %).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro Ci3Hi₇NO₂ vypočteno: 219 naměřeno: 220 (M+H).

Stupeň 6:

co₂h • · · · • · · · · · ·· • ··· · · · · · · · • ······· ·· ··· ·

136 .........

Směs racemické kyseliny 5-ethyl-2-aminotetralin-2-karboxylové (765 mg,

3,49 mmol), triethylaminu (1,0 ml, 7,17 mmol), 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (Fmoc-Osu, 1,79 g, 5,31 mmol) v acetonitrilu (40 ml) a vodě (40 ml) se po dobu 2 dní míchá při okolní teplotě. Reakční směs se vakuově zahustí, čímž se odstraní většina acetonitrilu, okyselí se na pH -3 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a bílá emulze se dvakrát extrahuje methylenchloridem a dvakrát ethylacetátem. Methylenchloridové extrakty se promyjí vodou, solankou, vysuší nad síranem hořečnatým. Ethylacetátové extrakty se promyjí vodou, solankou, vysuší nad síranem hořečnatým. Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový olejovitý produkt, který se přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: 2-* 5-> 8% methanol/methylenchlorid) za vzniku racemické kyseliny Fmoc-5-ethyl-2aminotetralin-2-karboxylové (330 mg, 21% výtěžek) ve formě bílého pevného produktu.

hmotnostní spektrum (FAB) pro C28H28NO4 vypočteno: 442,2018 naměřeno: 442,2010 (M+H).

Příklad 16

Příprava kyseliny Fmoc-(D,L)-5 -isopropyl-2-aminotetralin-2-karboxylové (Fmoc-(D,L)5-iPrAtc-OH)

Stupeň 1:

co₂h

Cl' o

137

Směs kyseliny 3-(2-isopropylfenyl)propanové (připravené ve 3 stupních z l-isopropyl-2-jodbenzenu, 2,01 g, 10,5 mmol), thionylchloridu (4,30 ml, 59,0 mmol) a toluenu (40 ml) se po dobu 2 hodin zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. Po zahuštění ve vakuu vzniká 3-(2isopropylfenyl)propanoylchlorid, který se absorbuje v methylenchloridu a použije v následujícím stupni bez dalšího přečištění.

Stupeň 2:

cr n₂

Roztok 3-(2-isopropylfenyl)propanoylchloridu (surový, 10,5 mmol) v methylenchloridu se pomalu přidává k roztoku diazomethanu (připravený z 6,95 g l-methyl-3 -nitro- 1-nitrosoguanidinu) v etheru (50 ml), ochlazovanému na ledové lázni. Reakční směs se poté zahřeje na okolní teplotu a přes noc se míchá. Směs se vakuově zahustí a přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: 20% ethylacetát/hexany) za vzniku l-diazo-4-(2-isopropylfenyl)butan2-onu (1,87 g, 82 % ve dvou stupních) ve formě světle žlutého olejovitého produktu.

'li - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,10-7,30 (4H, m, fenylová sk.)

5,21 (IH, br s, diazová sk.)

3,15 (IH, m, CHziPr)

3,00 (2H, t, benzylová sk.)

2,57 (2H, m)

1,24 (6H, d, 2CH₃ z iPr).

« ·

138

Stupeň 3:

n₂

Ke směsi dimeru rhodium(II)acetátu (20 mg, 0,091 mmol) v methylenchloridu (160 ml), zahřívané po dobu 60 minut na teplotu varu pod zpětným chladičem, se pomalu přidává roztok l-diazo-4-(2-bromfenyl)butan-2onu (1,87 g, 8,65 mmol) v methylenchloridu (25 ml). Vzniklá směs se poté zahřívá 15 minut na teplotu varu pod zpětným chladičem. Směs se ochladí na okolní teplotu, přidá se kyselina trifluoroctová (1,90 ml) a směs se po dobu 45 minut míchá při okolní teplotě, načež se k ní přidá nasycený roztok uhličitanu sodného. Vrstvy se oddělí a methylenchloridová vrstva se ještě jednou promyje nasyceným roztokem uhličitanu sodného. Sloučené vodné vrstvy se zpětně extrahují methylenchloridem. Sloučené organické vrstvy se vysuší nad síranem hořečnatým, přefiltrují a vakuově zahustí za vzniku surového hnědého olejovitého produktu. Přečištěním sloupcovou chromatografií (eluční soustava: 5% ethylacetát/hexany) vzniká 5-isopropyl-/3-tetralon (1,57 g, 96 %) ve formě světle žlutého olejovitého produktu.

'Η - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDCfi, hodnoty δ)

6,93-7,22 (3H, m, fenylová sk.)

3,59 (2H, s, benzylová sk.)

3,24 (1H, m, CHziPr)

3,12 (2H, t, benzylová sk.) 2,52 (2H, t, benzylová sk.) 1,27 (6H, d, 2CH₃ ziPr).

139

Stupeň 4:

Směs 5-isopropyl-/3-tetralonu (1,57 g, 8,34 mmol), kyanidu draselného (0,82 g, 12,6 mmol), uhličitanu amonného (4,81 g, 50,1 mmol), ethanolu (40 ml) a vody (10 ml) v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi se po dobu 48 hodin dní zahřívá v olejové lázni o teplotě 80°C. Po ochlazení na okolní teplotu se hnědá suspenze převede do ledové vody a míchá se několik hodin při okolní teplotě. Po přefiltrování a vysušení vzduchem vzniká surový hydantoin BB ve formě béžového pevného produktu, který se použije v následujícím stupni bez dalšího přečištění.

^!H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-cU, hodnoty δ)

10,69 (IH, br s, NH) 6,85-7,32 (3H, m, fenylová sk.)

8,30 (IH, br s, NH) 1,15 (6H, t, CH₃).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro Ci5Hi₈N₂O₂ vypočteno: 258 naměřeno: 539 (2M+Na).

Stupeň 5:

BB • · ···· to to • · · · • ···· · • ·· · · ·

.. ·· ·· *'

140

Směs hydantoinu BB (surový, 8,34 mmol, teoret.), Ba(OH)₂H₂O (7,90 g,

41,7 mmol) ve vodě (40 ml) se v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi zahřívá po dobu 38 hodin v olejové lázni o teplotě 125°C. Reakční směs se ochladí na okolní teplotu,a při intenzivním míchání se okyselí na pH ~3 za použití 4N kyseliny sírové. Suspenze se míchá po dobu 2 hodin na lázni s vařiči vodou načež se zchladí na okolní teplotu. Suspenze se přefiltruje a sraženiny propláchnou vodou. Sloučený filtrát a zbytky po promývání se vakuově zahustí na ~50 ml. Po neutralizaci koncentrovaným hydroxidem amonným vzniká bílá sraženina, která se přefiltruje, promyje vodou a vysuší přes noc ve vakuu za vzniku racemické kyseliny 5-isopropyl-2-aminotetralin-2-karboxylové (1,23 g, 63 % výtěžek ve 2 stupních) ve formě béžového pevného produktu.

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro Ci4Hi₉NO₂ vypočteno: 233 naměřeno: 232 (M-H).

Stupeň 6:

Směs racemické kyseliny 5-isopropyl-2-aminotetralin-2-karboxylové (250 mg, 1,07 mmol), triethylaminu (1,2 ml, 8,61 mmol), 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (Fmoc-Osu, 2,70 g, 8,00 mmol) v acetonitrilu (30 ml) a vodě (30 ml) se po dobu 2 dní míchá při okolní teplotě. Reakční směs se vakuově zahustí, čímž se odstraní většina acetonitrilu, okyselí se na pH ~3 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a bílá emulze se • · · · · · • · · • · · • · · ·

141 extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, solankou a vysuší nad síranem sodným. Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový olej ovitý produkt, který se přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: 2-> 5-» 8% methanol/methylenchlorid) za vzniku racemické kyseliny Fmoc-5isopropyl-2-aminotetralin-2-karboxylové (208 mg, 43% výtěžek) ve formě šedobílé pěny.

hmotnostní spektrum (FAB) pro C29H30NO4 vypočteno: 456,2175 naměřeno: 456,2184 (M+H).

Příklad 17

Příprava kyseliny Fmoc-4-amino-l-fenylpiperidin-4-karboxylové (Fmoc-AppcOH)

Stupeň 1:

Kroztoku jodbenzenu (6,37 g, 3,5 ml, 31,2 mmol), l,4-dioxan-8azaspiro[4.5]dekanu (10,32 g, 9,3 ml, 72,2 mmol, 2,3 ekv.) a terc.butoxidu sodného (8,0 g, 83,3 mmol, 2,7 ekv.) v suchém dioxanu (120 ml) se přidá tris(dibenzylidenaceton)dipalladíum(0) (91 mg, 0,1 mmol) a tri-o-tolylfosfín (180 mg, 0,591 mmol). Reakční směs se po dobu 26 hodin zahřívá na teplotu 90°C, načež se vakuově zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl

• · • · · · • · reaguje s vodou a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické vrstvy se sloučí, promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí za vzniku hnědého olej ovitého produktu. Tento surový produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 95:5 až 75:25) za vzniku světležlutého čistého pevného produktu CC (6,08 g, 89 %).

’H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,25 (ddt, 2H) 4,00 (s, 4H)

6,95 (dd, 2H) 3,32 (t, 4H)

6,84 (t,lH) 1,84 (t,4H).

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro C13H17NO2 vypočteno: 219 naměřeno: 220 (M+H).

142

Stupeň 2:

K roztoku ketalu CC (3,22 g, 15,16 mmol) v acetonu (100 ml) se přidá 6N kyselina chlorovodíková (50 ml) a reakční směs se přes noc zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem, vzniklá reakční směs se zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl se absorbuje v ethylacetátu a neutralizuje 6N vodným roztokem hydroxidu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší nad • · • · · • · · síranem sodným a zahustí. Surový produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 80:20 až 60:40) za vzniku žlutého olejovitého produktu DD (2,58 g, 97 %).

143 hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro CnHi₃NO vypočteno: 175 naměřeno: 176 (M+H).

Stupeň 3:

K roztoku ketonu DD (2,53 g, 14,46 mmol) v ethanolu (75 ml) a vodě (25 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (12,9 g, 134,3 mmol, 9 ekv.) a kyanid draselný (2,11 g, 32,5 mmol, 2 ekv.). Směs se po dobu 18 hodin zahřívá na teplotu 80-90°C. Ochlazená reakční směs se vakuově zahustí a pevný podíl reaguje s vodou a čtyřikrát se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí vodou, vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí za vzniku spektroskopicky čistého hydantoinu EE ve formě bílého pevného produktu (3,36 g, 95 %).

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro Ci₃Hi₅N₃O₂ vypočteno: 245 naměřeno: 246 (M+H).

144

Stupeň 4:

O

EE

Hydantoin EE (3,36 g) se suspenduje ve vodném roztoku hydroxidu sodného (6N, 100 ml) a po dobu 2 až 3 dní zahřívá na teplotu 130°C. Po ukončení hydrolýzy, indikovaném vysokorychlostní kapalinovou chromatografií, se reakční směs neutralizuje koncentrovanou HCl na mírně kyselé pH (~6). Vzniklá suspenze se přefiltruje, promyje vodou a vysuší za vzniku kyseliny 4-amino-l-fenylpiperidin-4-karboxylové (APPC) ve formě bílého pevného produktu (5,26 g, >než 100% výtěžek, vlhká a kontaminovaná anorganickou solí), která vykázala na vysokorychlostní kapalinové chromatografií jeden pík a byla použita přímo v následujícím stupni.

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro C12H16N2O2 vypočteno: 220 naměřeno: 221 (M+H).

Stupeň 5:

NHFmoc

CO₂H

Surová kyselina 4-amino-l-fenylpiperidin-4-karboxylová (APPC) z posledního stupně se suspenduje v dioxanu (80 ml) a 10% vodném roztoku uhličitanu sodného (40 ml), načež reaguje sFmoc-Cl (5,3 g, 20,57 mmol, 1,5 • « • · ··· ··· · · · • ··· · · · · · · · · • ······· · * ··· · · ekv.) a přes noc se intenzivně míchá. Reakční směs se poté zahustí, čímž se odstraní dioxan, neutralizuje se 6N HCl na slabě kyselé pH 6 a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad síranem sodným. Po odstranění rozpouštědla vzniká surový produkt, který se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát, dichlormethan/methanol) za vzniku čisté Fmoc-APPC (4,91 g, 81 %, dva stupně).

’H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

7,88 (d,2H) 7,19-7,42 (m, 8H)

7,74 (d, 2H) 4,20-4,31 (m, 3H).

hmotnostní spektrum (m/z) pro C₂7H₂6N₂O4Na vypočteno: 465,1791 naměřeno: 465,1788

Příklad 18

Příprava kyseliny Fmoc-4-amino-l -(4-methvlfenyl)piperidin-4-karboxylové (Fmoc-MeAppc-OH)

Stupeň 1:

• « • · · ♦ • ·

K roztoku 4-jodtoluenu (2,12 g, 9,7 mmol), l,4-dioxan-8azaspiro[4.5]dekanu (3,12 g, 2,8 ml, 21,82 mmol, 2,2 ekv.) a terc.butoxidu sodného (2,6 g, 27,08 mmol, 2,8 ekv.) v suchém dioxanu (40 ml) se přidá tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (44,4 mg, 0,0485 mmol) a tri-otolylfosfin (59,0 mg, 0,194 mmol). Reakční směs se po dobu 26 hodin zahřívá na teplotu 90°C, načež se vakuově zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl reaguje s vodou a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické vrstvy se sloučí, promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí za vzniku hnědého olejovitého produktu. Tento surový produkt se přečistí mžikovou chromatografíí (eluční soustava: hexan/ethylacetát 95:5 až 75:25) za vzniku světležlutého čistého pevného produktu FF (1,937 g, 85 %).

*H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,06 (d, 2H)

6,87 (d, 2H)

3,99 (s,4H)

3.26 (t, 4H)

2.26 (t, 4H) 1,85 (t, 4H).

Stupeň 2:

M-m

GG

K roztoku ketalu FF (1,58 g, 6,79 mmol) v acetonu (50 ml) se přidá 6N kyselina chlorovodíková (25 ml) a reakční směs se přes noc zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem, vzniklá reakční směs se zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl se absorbuje v ethylacetátu a neutralizuje 6N vodným ··· · · ·· · · ·«· « * · · · • · · · · · · · · · · • «······ ·· · · · «

147 ’··’ ^: *·.”·· ···· roztokem hydroxidu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí. Surový produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 90:10 až 70:30) za vzniku žlutého olejovitého produktu GG (1,27 g, 98 %).

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro C₁₂Hi₅NO vypočteno: 189 naměřeno: 190 (M+H).

Stupeň 3:

K roztoku ketonu GG (1,17 g, 6,18 mmol) v ethanolu (60 ml) a vodě (20 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (4,74 g, 49,44 mmol, 8 ekv.) a kyanid draselný (1,01 g, 15,54 mmol, 2,5 ekv.). Směs se po dobu 22 hodin zahřívá na teplotu 90°C. Ochlazená reakční směs se vakuově zahustí a pevný podíl reaguje s vodou a čtyřikrát se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí vodou, vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí za vzniku spektroskopicky čistého hydantoinu HH ve formě bílého pevného produktu (1,554 g, 97 %).

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro Ci4Hi₇N₃O₂ vypočteno: 259 naměřeno: 260 (M+H).

• · • · • 9 • * · ·

148

Stupeň 4:

NH₂ co₂h

O

HH

Hydantoin HH (1,502 g) se suspenduje ve vodném roztoku hydroxidu sodného (6N, 40 ml) a po dobu 4 dní zahřívá na teplotu 130°C. Po ukončení hydrolýzy, indikovaném vysokorychlostní kapalinovou chromatografií, se reakční směs neutralizuje koncentrovanou HCl na mírně kyselé pH (~6). Vzniklá suspenze se přefiltruje, promyje vodou a vysuší za vzniku kyseliny 4amino-l-(4-methylfenyl)piperidin-4-karboxylové (MeAPPC) ve formě bílého pevného produktu (2,10 g, >než 100% výtěžek, vlhká a kontaminovaná anorganickou solí), která vykázala na vysokorychlostní kapalinové chromatografií jeden pík a byla použita přímo v následujícím stupni.

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro C13H18N2O2 vypočteno: 234 naměřeno: 235 (M+H).

Stupeň 5:

NHFmoc

Surová kyselina 4-amino-l-(4-methylfenyl)piperidin-4-karboxylová (4MeAPPC) z posledního stupně se suspenduje v dioxanu (80 ml) a 10% vodném roztoku uhličitanu sodného (40 ml), načež reaguje s Fmoc-Cl (2,2 g, 8,59 mmol, ·· ·» · ·

149

odstraní dioxan, neutralizuje se 6N HCl na slabě kyselé pH 6 a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad síranem sodným. Po odstranění rozpouštědla vzniká surový produkt, který se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát, dichlormethan/methanol) za vzniku čisté Fmoc-4-MeAPPC (2,16 g, 82 %, dva stupně).

'Η - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

7,88 (d, 2H)

7,72 (d, 2H)

7,39 (t, 2H)

6,99 (d, 2H) 6,82 (d, 2H) 2,18 (s, 3H).

7,30 (td, 2H)

Hmotnostní spektrum (elektrosprej m/e) pro C28H28N2O4 vypočteno: 456 naměřeno: 457 (M+H).

Příklad 19

Příprava kyseliny Fmoc-4-amino-1 -(4-chlorfenyl)piperidin-4-karboxylové (Fmoc-4-ClAppc-OH)

Stupeň 1:

HN

II <·· ···· ·· · ·* ·· φφφ φ · * * · · ·«?· φ * · φ · ·· φ • · ···· · φ « φφφ · φ

Φ · Φ Φ Φ · · ΦΦΦΦ

150 ·* ’ ........

Κroztoku l-chlor-4-jodbenzenu (2,38 g, 10,0 mmol), l,4-dioxan-8azaspiro[4.5]dekanu (3,44 g, 3,1 ml, 24,0 mmol, 2,4 ekv.) a terc.butoxidu sodného (2,68 g, 28,0 mmol, 2,8 ekv.) v suchém dioxanu (40 ml) se přidá tris(dihenzylidenaceton)dipalladium(0) (45,5 mg, 0,0497 mmol) a tri-otolylfosfin (61 mg, 0,20 mmol). Reakční směs se po dobu 9 hodin zahřívá na teplotu 90°C, načež se vakuově zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl reaguje s vodou a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické vrstvy se sloučí, promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí za vzniku hnědého olejovitého produktu. Tento surový produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 95:5 až 75:25) za vzniku světležlutého čistého pevného produktu II (2,17 g, 86 %).

- Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,18 (dt, 2H) 3,28 (t,4H)

6,85 (dt, 2H) l,82(t,4H).

3,98 (s,4H)

K roztoku ketalu II (2,123 g, 8,39 mmol) v acetonu (75 ml) se přidá 6N kyselina chlorovodíková (30 ml) a reakční směs se přes noc zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem, vzniklá reakční směs se zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl se absorbuje v ethylacetátu a neutralizuje 6N vodným roztokem hydroxidu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje • · • · ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí. Surový produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 95:5 až 70:30) za vzniku žlutého pevného produktu JJ (1,515 g, 86 %).

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro CnH^ClNO vypočteno: 209 naměřeno: 210 (M+H).

Stupeň 3:

KK

K roztoku ketonu JJ (1,465 g, 6,986 mmol) v ethanolu (75 ml) a vodě (25 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (5,36 g, 55,88 mmol, 8 ekv.) a kyanid draselný (1,135 g, 17,46 mmol, 2,5 ekv.). Směs se po dobu 18 hodin zahřívá na teplotu 80-90°C. Ochlazená reakční směs se vakuově zahustí a pevný podíl reaguje s vodou a čtyřikrát se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí vodou, vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí za vzniku spektroskopicky čistého hydantoinu KK ve formě bílého pevného produktu (1,817 g, 93 %).

Hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro Ci₃H₁₄C1N₃O2 vypočteno: 279 naměřeno: 280 (M+H).

Hydantoin KK (1,768 g) se suspenduje ve vodném roztoku hydroxidu sodného (6N, 50 ml) a po dobu 4 dní zahřívá na teplotu 130°C. Po ukončení hydrolýzy, indikovaném vysokorychlostní kapalinovou chromatografií, se reakční směs neutralizuje koncentrovanou HCl na mírně kyselé pH (~6). Vzniklá suspenze se přefiltruje, promyje vodou a vysuší za vzniku kyseliny 4amino-l-(4-chlorfenyl)piperidin-4-karboxylové (C1APPC) ve formě bílého pevného produktu (2,05 g, >než 100% výtěžek, vlhká a kontaminovaná anorganickou solí), která vykázala na vysokorychlostní kapalinové chromatografií jeden pík a byla použita přímo v následujícím stupni.

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro C12H15CIN2O2 vypočteno: 254 naměřeno: 253 (M-H).

Stupeň 5:

Surová kyselina 4-amino-l-(4-chlorfenyl)piperidin-4-karboxylová (4C1APPC) z posledního stupně se suspenduje v dioxanu (100 ml) a 10% vodném roztoku uhličitanu sodného (50 ml), načež reaguje s Fmoc-Cl (2,0 g, 7,75 mmol, • · · ·

153

1,2 ekv.) a přes noc se intenzivně míchá. Reakční směs se poté zahustí, čímž se odstraní dioxan, neutralizuje se 6N HCl na slabě kyselé pH 6 a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad síranem sodným. Po odstranění rozpouštědla vzniká surový produkt, který se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát, dichlormethan/methanol) za vzniku čisté Fmoc-4-ClAPPC (1,18 g, 81 %, dva stupně).

'Η - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-dé, hodnoty δ)

7,87 (d, 2H)

7,71 (d,2H)

7,39 (td, 2H)

7,30 (td, 2H)

7,20 (d, 2H)

6.92 (d, 2H) 3,44 (d, 2H).

2.93 (t, 2H).

hmotnostní spektrum (elektrosprej m/e) pro C27H25N2O4 vypočteno: 476 naměřeno: 477 (M+H).

Příklad 20

Příprava kyseliny Fmoc-4-amino-1 -(4-fenoxyfenyl)piperidin-4-karboxylové (Fmoc-4-PhOAppc-OH)

Stupeň 1:

^hOO ^{+ Pho-}O^_i

LL

154

Kroztoku l-jod-4-fenoxybenzenu (3,15 g, 10,6 mmol), l,4-dioxan-8azaspiro[4.5]dekanu (3,66 g, 3,3 ml, 25,6 mmol, 2,4 ekv.) a terc.butoxidu sodného (2,85 g, 29,7 mmol, 2,8 ekv.) v suchém dioxanu (40 ml) se přidá tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (48,5 mg, 0,053 mmol) a tri-o-tolylfosfm (64 mg, 0,4 mmol). Reakční směs se po dobu 9 hodin zahřívá na teplotu 90°C, načež se vakuově zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl reaguje s vodou a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické vrstvy se sloučí, promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí za vzniku hnědého olejovitého produktu. Tento surový produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 95:5 až 80:20) za vzniku světležlutého čistého pevného produktu LL (2,805 g, 85 %).

’Η - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,26-7,32 (m, 2H)

7,03 (t, ÍH)

6,92-6,97 (m, 6H)

4,00 (s, 4H) 3,26 (t, 4H) 1,86 (t, 4H).

Stupeň 2:

Kroztoku ketalu LL (2,755 g, 8,86 mmol) v acetonu (90 ml) se přidá 6N kyselina chlorovodíková (45 ml) a reakční směs se přes noc zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem, vzniklá reakční směs se zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl se absorbuje v ethylacetátu a neutralizuje 6N vodným roztokem hydroxidu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí za vzniku surového produktu, který se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 90:10 až 70:30) za vzniku žlutého olejovitého produktu MM (2,21 g, 93 %).

Hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro C17H17CINO2 vypočteno: 267 naměřeno: 268 (M+H).

155

Stupeň 3:

K roztoku ketonu MM (2,01 g, 7,52 mmol) v ethanolu (80 ml) a vodě (25 ml) ve skleněné tlakové lahvi se'přidá uhličitan amonný (5,78 g, 60,0 mmol, 8 ekv.) a kyanid draselný (1,22 g, 18,80 mmol, 2,5 ekv.). Směs se po dobu 18 hodin zahřívá na teplotu 80-90°C. Ochlazená reakční směs se vakuově zahustí a pevný podíl reaguje s vodou a čtyřikrát se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí vodou, vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí za vzniku spektroskopicky čistého hydantoinu NN ve formě bílého pevného produktu (2,34 g, 95 %).

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro C19H19N3O3 vypočteno: 337 naměřeno: 338 (M+H).

• · • · · ·

NN

Hydantoin NN (2,28 g, 6,76 mmol) se suspenduje ve vodném roztoku hydroxidu sodného (6N, 60 ml) a po dobu 4 dní zahřívá na teplotu 130°C. Po ukončení hydrolýzy, indikovaném vysokorychlostní kapalinovou chromatografií, se reakční směs neutralizuje koncentrovanou HCl na mírně kyselé pH (~6). Vzniklá suspenze se přefiltruje, promyje vodou a vysuší za vzniku kyseliny 4-amino-l-(4-fenoxyfenyl)piperidin-4-karboxylové (4PhOAPPC) ve formě bílého pevného produktu (2,53 g, >než 100% výtěžek, vlhká a kontaminovaná anorganickou solí), která vykázala na vysokorychlostní kapalinové chromatografii jeden pík a byla použita přímo v následujícím stupni.

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro C18H20N2O3 vypočteno: 312 naměřeno: 313 (M+H).

Stupeň 5:

Surová kyselina 4-amino-l-(4-fenoxyfenyl)piperidin-4-karboxylová (4PhOAPPC) z posledního stupně se suspenduje v dioxanu (50 ml) a 10% vodném roztoku uhličitanu sodného (50 ml) a přes noc se intenzivně míchá. Reakční • · · · směs se poté zahustí, čímž se odstraní dioxan, neutralizuje se 6N HCl na slabě kyselé pH 6 a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad síranem sodným. Po odstranění rozpouštědla vzniká surový produkt, který se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát, dichlormethan/methanol) za vzniku čisté Fmoc-4PhOAPPC (2,18 g, 60 %, dva stupně).

^]H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

7,87 (d, 2H)

7,72 (d, 2H)

7,38 (t, 2H)

7,30 (td, 4H)

7,02 (dt, 1H) 6,86-6,96 (m, 6H) 3,35 (m, 2H)

2,94 (t, 2H).

hmotnostní spektrum (elektrosprej m/e) pro C33H₃₀N2O₅ vypočteno: 534 naměřeno: 535 (M+H).

Příklad 21

Příprava kyseliny Fmoc-4-amino-1 -(2-methylfenvDpiperidin-4-karboxylové (Fmoc-2-MeAppc-OH)

Stupeň 1:

OO • ·· *

Kroztoku 2-jodtoluenu (4,36 g, 2,5ml, 20,0 mmol), l,4-dioxan-8azaspiro[4.5]dekanu (6,88 g, 6,2 ml, 48,1 mmol, 2,4 ekv.) a terc.butoxidu sodného (5,3 g, 55,2 mmol, 2,8 ekv.) v suchém dioxanu (80 ml) se přidá tris(dibenzylidenaceton)dipalladium(0) (91 mg, 0,1 mmol) a tri-o-tolylfosfin (122 mg, 0,40 mmol). Reakční směs se po dobu 26 hodin zahřívá na teplotu 90°C, načež se vakuově zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl reaguje s vodou a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické vrstvy se sloučí, promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí za vzniku hnědého olej ovitého produktu. Tento surový produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 95:5 až 75:25) za vzniku světležlutého čistého pevného produktu II (2,66 g, 57 %).

’Η - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,12-7,18 (m,2H) 2,98 (t, 4H)

6,94-7,06 (m, 2H) 1,88 (t, 4H).

4,01 (s, 4H)

Stupeň 2:

K roztoku ketalu OO (2,66 g, 11,4 mmol) v acetonu (70 ml) se přidá 6N kyselina chlorovodíková (35 ml) a reakční směs se přes noc zahřívá na teplotu 85°C, vzniklá reakční směs se zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl se absorbuje v ethylacetátu a neutralizuje 6N vodným roztokem hydroxidu • *·· sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí.

Surový produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava:

hexan/ethylacetát 90:10 až 70:30) za vzniku žlutého olejovitého produktu PP (2,04 g, 95 %).

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro Ci₂Hi₅NO vypočteno: 189 naměřeno: 190 (M+H).

Stupeň 3:

K roztoku ketonu PP (1,54 g, 8,15 mmol) v ethanolu (60 ml) a vodě (20 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (4,69 g, 48,9 mmol, 6 ekv.) a kyanid draselný (800 g, 12,2 mmol, 1,5 ekv.). Směs se po dobu 18 hodin zahřívá na teplotu 80-90°C. Ochlazená reakční směs se přidá k ledové vodě (300 ml) a 30 minut se intenzivně míchá. Vzniklá sraženina se přefiltruje přes Buchnerovu nálevku, důkladně promyje vodou a vysuší za vzniku hydantoinů QQ ve formě bílého pevného produktu (2,01 g, 95 %).

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro Ci4H₁₇N₃O2 vypočteno: 259 naměřeno: 260 (M+H).

• · · • · · · « • · · · ···· ······· ·· · • · · · · · • · t · · · ·

160

Stupeň 4:

K suspenzi hydantoinu QQ (1,07 g, 4,13 mmol) v suchém THF (25 ml) se postupně přidá di-Zerc-butyldikarbonát (2,25 g, 10,32 mmol, 2,5 ekv.), triethylamin (0,63 ml, 460 mg, 4,54 mmol, 1,1 ekv.) a DMAP (36 mg, 0,29 mmol). Po 15 minutách se reakční směs změní na světležlutý roztok, který se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí za vzniku pevného produktu, který se absorbuje v ethylacetátu (300 ml), promyje IN HCl (3x30 ml), nasyceným vodným roztokem Na₂CO₃ (2x30 ml) a solankou (2x30 ml), vysuší nad bezvodým síranem sodným a za sníženého tlaku se zahustí. Surový světležlutý produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 90:10-» 80:20) za vzniku čistého bis-Boc hydantoinu RR ve formě bílého pevného produktu (1,71 g, 90 %).

Hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C24H₃3N₃O₆ vypočteno: 459 naměřeno: 460 (M+H).

Stupeň 5:

^NHFmoc fco₂H

Bis-Boc hydantoin RR (1,71 g, 3,72 mmol) se rozpustí v DME (23 ml) za vzniku čirého roztoku. K vzniklému roztoku se přidá IN NaOH (33 ml, 33 • · • · · ·

161 mmol) a reakční směs se přes noc míchá při okolní teplotě, přičemž vzniká mírně zakalená směs. Ukončení reakce se prokáže vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, a extrahuje Et₂O. Bez dalšího přečištění vzniklá vodná vrstva, obsahující kyselinu 4-amino-l-(2-methylfenyl)piperidin-4-karboxylovou (2MeAPPC), reaguje s 6N HCl, čímž se docílí hodnoty pH 11-12. Vzniklý roztok (30 ml) se zředí v 1,4-dioxanu (30 ml) a reaguje s Fmoc-Cl (1,28 g, 4,96 mmol,

1,3 ekv.) a směs se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní dioxan, neutralizuje se přídavkem IN HCl, a extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí. Surový produkt se poté přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát, dichlormethan/methanol) za vzniku čistého Fmoc-2-MeAPPC ve formě bílého pevného produktu (1,09 g, 64% výtěžek z bis-Boc hydantoinu RR).

’H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-d₆, hodnoty δ)

7,87 (d, 2H) 7,74 (d, 2H)

7,40 (td, 2H)

7,31 (td, 2H)

7,12 (m, 2H)

6,97 (d, IH) 6,92 (td, IH)

2,72-2,88 (m, 4H) 2,22 (S, 3H).

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro C₂₈H₂₈N₂O₄ vypočteno: 456 naměřeno: 457 (M+H).

• · • · · ·

162 • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · · · · ·

Příklad 22

Příprava kyseliny Fmoc-4-amino-1 -(2-isopropylfenyl)piperidin-4-karboxylové (Fmoc-2-iPrAppc-OH)

Stupeň 1:

Kroztoku l-jod-2-z5O-propylbenzenu (10,0 g, 40,7 mmol), l,4-dioxan-8azaspiro[4.5]dekanu (13,3 g, 12,0 ml, 93,0 mmol, 2,3 ekv.) a terc.butoxidu sodného (10,0 g, 104,2 mmol, 2,6 ekv.) v suchém dioxanu (160 ml) se přidá tris(díbenzylidenaceton)dipalladium(0) (180 mg, 0,197 mmol) a tri-o-tolylfosfm (244 mg, 0,80 mmol). Reakční směs se po dobu 26 hodin zahřívá na teplotu 90°C, načež se vakuově zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl reaguje s vodou a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické vrstvy se sloučí, promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí za vzniku hnědého olejovitého produktu. Tento surový produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 95:5 až 75:25) za vzniku světležlutého čistého pevného produktu SS (3,61 g, 35 %).

hmotnostní spektrum (m/z) pro Ci₆H₂₃NO₂ vypočteno: 261 naměřeno: 262 (M+H).

• · • · · · • · · · • · · • ·

163

Stupeň 2:

K roztoku ketalu SS (3,24 g, 12,4 mmol) v acetonu (90 ml) se přidá 6N kyselina chlorovodíková (45 ml) a reakční směs se přes noc zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. Vzniklá reakční směs se zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl se absorbuje v ethylacetátu a neutralizuje 6N vodným roztokem hydroxidu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí. Surový produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 90:10 až 70:30) za vzniku žlutého olejovitého produktu TT (2,42 g, 89 %).

- Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,27 (m, IH) 3,20 (t, 4H)

7,04-7,19 (m,3H) 2,60 (t,4H)

3,58 (m, IH) 1,25 (d, 6H).

hmotnostní spektrum (elektrosprej, m/e) pro Ci₄H₁₉NO vypočteno: 217 naměřeno: 218 (M+H).

• · • «

K roztoku ketonu TT (2,30 g, 10,6 mmol) v ethanolu (90 ml) a vodě (20 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (8,1 g, 84,3 mmol, 8 ekv.) a kyanid draselný (1,72 g, 26,5 mmol, 2,5 ekv.). Směs se po dobu 18 hodin zahřívá na teplotu 80-90°C. Ochlazená reakční směs se přidá k ledové vodě (400 ml) a 30 minut se intenzivně míchá. Vzniklá sraženina se přefiltruje přes Biichnerovu nálevku, důkladně promyje vodou a vysuší za vzniku hydantoinu UU ve formě bílého pevného produktu (2,78 g, 91 %).

hmotnostní spektrum (m/z) pro Ci₆H₂iN₃O2 vypočteno: 287 naměřeno: 288 (M+H).

Stupeň 4:

K suspenzi hydantoinu UU (2,74 g, 9,54 mmol) v suchém THF (100 ml) se postupně přidá di-terc-butyldikarbonát (5,2 g, 24,24 mmol, 2,5 ekv.), triethylamin (1,5 ml, 1,07 g, 10,5 mmol, 1,1 ekv.) a DMAP (46 mg, 0,29 mmol). Po 15 minutách se reakční směs změní na světležlutý roztok, který se přes noc

165 míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí za vzniku pevného produktu, který se absorbuje v ethylacetátu (300 ml), promyje solankou (3x30 ml), vysuší nad bezvodým síranem sodným a za sníženého tlaku se zahustí. Surový světležlutý produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 90:10-* 80:20) za vzniku čistého bis-Boc hydantoinu VY ve formě bílého pevného produktu (4,39 g, 94 %).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C26H₃₇N₃O6 vypočteno: 487 naměřeno: 488 (M+H).

Bis-Boc hydantoin W (2,34 g, 4,8 mmol) se rozpustí v DME (30 ml) za vzniku čirého roztoku. K vzniklému roztoku se přidá IN NaOH (45 ml, 45 mmol) a reakční směs se přes noc míchá při okolní teplotě, přičemž vzniká mírně zakalená směs. Ukončení reakce se prokáže vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, a extrahuje Et₂O. Bez dalšího přečištění vzniklá vodná vrstva, obsahující kyselinu 4-amino-l-(2-isopropylfenyl)piperidin-4-karboxylovou (2iPrAPPC), reaguje s 6N HCl, čímž se docílí hodnoty pH 11-12. Vzniklý roztok (~45 ml) se zředí v 1,4-dioxanu (45 ml) a reaguje s Fmoc-Cl (1,78 g, 6,89 mmol,

1,5 ekv.) a směs se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní dioxan, neutralizuje se přídavkem IN • · · ·

HCl, a extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí. Surový produkt se poté přečistí mžikovou chromatografíí (eluční soustava: hexan/ethylacetát, dichlormethan/methanol) za vzniku čistého Fmoc-2-iPrAPPC ve formě bílého pevného produktu (1,46 g, 63% výtěžek z bis-Boc hydantoinu).

166 hmotnostní spektrum (m/z) pro C3oH3₂N₂0₄Na vypočteno: 507,2260 naměřeno: 507,2263

Příklad 23

Příprava kyseliny Fmoc-4-amino-1 -(3 -methylfenyl)piperidin-4-karboxylové (Fmoc-3 -Me Appc-QH)

Stupeň 1:

Me Me

WW

K roztoku 3-jodtoluenu (4,36 g, 2,6 ml, 20,0 mmol), l,4-dioxan-8azaspiro[4.5]dekanu (6,88 g, 6,2 ml, 48,1 mmol, 2,4 ekv.) a terc.butoxidu sodného (5,3 g, 55,2 mmol, 2,8 ekv.) v suchém dioxanu (80 ml) se přidá tris(dibenzylidenaceton)dipalladíum(0) (91 mg, 0,1 mmol) a tri-o-tolylfosfin (122 mg, 0,4 mmol). Reakční směs se po dobu 26 hodin zahřívá na teplotu 90°C, načež se vakuově zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl reaguje s vodou a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické vrstvy se sloučí, • · ··· « · · · · * • ··· · · · · · · · · • ······· · · ··· · · • · · · · · · «··· • · · ·· «· ·· · ·

167 promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí za vzniku hnědého olejovitého produktu. Tento surový produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 95:5 až 75:25) za vzniku světležlutého čistého pevného produktu WW (3,21 g, 69 %).

Stupeň 2:

K roztoku ketalu WW (1,25 g, 5,36 mmol) v acetonu (20 ml) se přidá 6N kyselina chlorovodíková (10 ml) a reakční směs se přes noc zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. Vzniklá reakční směs se zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl se absorbuje v ethylacetátu a neutralizuje 6N vodným roztokem hydroxidu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí. Surový produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 90:10 až 70:30) za vzniku žlutého olejovitého produktu XX (843 mg, 83 %).

Hmotnostní spektrum (m/z) pro Ci₂Hi₅NO vypočteno: 189 naměřeno: 190 (M+H).

Stupeň 3:

• ·

K roztoku ketonu XX (763 g, 4,03 mmol) v ethanolu (45 ml) a vodě (15 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (3,09g, 32,21 mmol, 8 ekv.) a kyanid draselný (675 mg, 10,38 mmol, 2,5 ekv.). Směs se po dobu 18 hodin zahřívá na teplotu 80-90°C. Ochlazená reakční směs se přidá k ledové vodě (200 ml) a 30 minut se intenzivně míchá. Vzniklá sraženina se přefiltruje přes Buchnerovu nálevku, důkladně promyje vodou a vysuší za vzniku hydantoinu YY ve formě bílého pevného produktu (930 mg, 89 %).

hmotnostní spektrum (m/z) pro C14H17N3O2 vypočteno: · 259 naměřeno: 260 (M+H).

Stupeň 4:

K suspenzi hydantoinu ΥΎ (780 mg, 3,012 mmol) v suchém THF (22 ml) se postupně přidá di-Zerc-butyldikarbonát (1,64 g, 7,52 mmol, 2,5 ekv.), triethylamin (0,42 ml, 305 mg, 3,01 mmol, 1,0 ekv.) a DMAP (20 mg, 0,164 mmol). Po 5 minutách se reakční směs změní na čistý žlutý roztok, který se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí za vzniku pevného produktu, který se absorbuje v ethylacetátu (300 ml), promyje solankou (3x30 ml), vysuší nad bezvodým síranem sodným a za sníženého tlaku se zahustí. Surový světležlutý produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 90:10-» 80:20) za vzniku čistého bis-Boc hydantoinu ZZ ve formě bílého pevného produktu (1,37 g, kvant.).

• · • ·

169 • ······· ·· • · · · · · hmotnostní spektrum (m/z) pro C24H33N₃O₆Na vypočteno: 482,2267 naměřeno: 482,2261 (M+Na).

Stupeň 5:

Me b-ocr

Bis-Boc hydantoin ZZ (1,29 g, 2,818 mmol) se rozpustí v DME (20 ml) za vzniku čirého roztoku. K vzniklému roztoku se přidá IN NaOH (25 ml, 25 mmol) a reakční směs se přes noc míchá při okolní teplotě, přičemž vzniká mírně zakalená směs. Ukončení reakce se prokáže vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, a extrahuje Et₂O. Bez dalšího přečištění vzniklá vodná vrstva, obsahující kyselinu 4-amino-l-(3-methylfenyl)piperidin-4-karboxylovou (3MeAPPC), reaguje s 6N HCl, čímž se docílí hodnoty pH 11-12. Vzniklý roztok (30 ml) se zředí v 1,4-dioxanu (30 ml) a reaguje s Fmoc-Cl (1,46 mg, 5,65 mmol, 2,0 ekv.) a směs se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní dioxan, neutralizuje se přídavkem IN HCl, a extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou a vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí. Surový produkt se poté přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát, dichlormethan/methanol) za vzniku čistého Fmoc-3-MeAPPC ve formě bílého pevného produktu (1,002 g, 78% výtěžek z bis-Boc hydantoinu).

• · · · · • ·

170

Hmotnostní spektrum (m/z) pro C28H₂8N₂O4Na vypočteno: 479,1947 naměřeno: 479,1940 (M+Na).

Příklad 24

Příprava kyseliny Fmoc-4-amino-1 -(3-methoxyfenvl)piperidin-4-karboxylové (Fmoc-3-MeOAppc-OH)

Stupeň 1:

AAA

Kroztoku 3-jodanisolu (4,68 g, 2,4 ml, 20,0 mmol), l,4-dioxan-8azaspiro[4.5]dekanu (6,88 g, 6,2 ml, 48,1 mmol, 2,4 ekv.) a terc.butoxidu sodného (5,3 g, 55,2 mmol, 2,8 ekv.) v suchém dioxanu (80 ml) se přidá tris(dibenzylidenaceton)dípalladium(0) (91 mg, 0,1 mmol) a tri-o-tolylfosfin (122 mg, 0,4 mmol). Reakční směs se po dobu 26 hodin zahřívá na teplotu 90°C, načež se vakuově zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl reaguje s vodou a extrahuje se ethylacetátem. Sloučené organické vrstvy se sloučí, promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí za vzniku hnědého olejovitého produktu. Tento surový produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 95:5 až 75:25) za vzniku světležlutého čistého pevného produktu AAA (3,10 g, 62 %).

Hmotnostní spektrum (m/z, M+H) pro C14H19NO3 vypočteno: 249 naměřeno: 250 (M+H).

• · · ·

171 ♦ * · · · · ·· · • ··· · ···· · · · • ··»···· ·· ··· · · • · · ···· ···· • · · · · ·· · · ··

Stupeň 2:

Kroztoku ketalu AAA (3,10 g, 12,45 mmol) v acetonu (90 ml) se přidá 6N kyselina chlorovodíková (45 ml) a reakční směs se přes noc zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem. Vzniklá reakční směs se zahustí, čímž se odstraní rozpouštědlo. Pevný podíl se absorbuje v ethylacetátu a neutralizuje 6N vodným roztokem hydroxidu sodného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí solankou, vysuší nad síranem sodným a zahustí. Surový produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 90:10 až 70:30) za vzniku žlutého olejovitého produktu BBB (2,53 g, 99 %).

^!H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,20 (m, ÍH)

6,58 (d, ÍH)

6,39-6,56 (m, 2H)

3,80 (s, 3H) 3,59 (m, 4H) 2,58 (m, 4H).

Stupeň 3:

BBB

CCC

O • · * · • · • ·

172

K roztoku ketonu BBB (1,81 g, 8,82 mmol) v ethanolu (60 ml) a vodě (20 ml) ve skleněné tlakové lahvi se přidá uhličitan amonný (6,77g, 70,52 mmol, 8 ekv.) a kyanid draselný (1,14 g, 17,6 mmol, 2,0 ekv.). Směs se po dobu 18 hodin zahřívá na teplotu 80-90°C. Ochlazená reakční směs se přidá k ledové vodě (200 ml) a 30 minut se intenzivně míchá. Vzniklá sraženina se přefiltruje přes Buchnerovu nálevku, důkladně promyje vodou a vysuší za vzniku hydantoinů CCC ve formě bílého pevného produktu (2,23 g, 92 %).

hmotnostní spektrum (m/z) pro Ci₄Hi₇N3O₃ vypočteno: 275 naměřeno: 276 (M+H).

DDD

K suspenzi hydantoinů CCC (1,10 g, 4,00 mmol) v suchém THF (50 ml) se postupně přidá di-Zerc-butyldikarbonát (2,18 g, 10,00 mmol, 2,5 ekv.), triethylamin (0,62 ml, 445 mg, 4,4 mmol, 1,1 ekv.) a DMAP (20 mg, 0,164 mmol). Po 15 minutách se reakční směs změní na čistý žlutý roztok, který se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí za vzniku pevného produktu, který se absorbuje v ethylacetátu (300 ml), promyje solankou (3x30 ml), vysuší nad bezvodým síranem sodným a za sníženého tlaku se zahustí. Surový světležlutý produkt se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát 90:10-* 80:20) za vzniku čistého bis-Boc hydantoinů DDD ve formě bílého pevného produktu (1,90 g, kvant.).

4 · 4 ·

4

3,77 (s, 3H)

1,58 (s, 9H)

1,42 (s, 9H)

173 'Η - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,16 (t, 1H)

6,57 (d, 1H)

6,24 (s, 1H)

6,19 (d, 1H)

Hmotnostní spektrum (m/z) pro C24H33N3O7 vypočteno: 475 naměřeno: 476 (M+H).

Bis-Boc hydantoin DDD (1,06 g, 2,23 mmol) se rozpustí v DME (20 ml) za vzniku čirého roztoku. K vzniklému roztoku se přidá IN NaOH (20 ml, 20 mmol) a reakční směs se přes noc míchá při okolní teplotě, přičemž vzniká mírně zakalená směs. Ukončení reakce se prokáže vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní DME, a extrahuje Et₂O. Bez dalšího přečištění vzniklá vodná vrstva, obsahující kyselinu 4-amino-l-(3-methoxyfenyl)piperidin-4-karboxylovou (3MeOAPPC), reaguje s 6N HCl, čímž se docílí hodnoty pH 11-12. Vzniklý roztok (35 ml) se zředí v 1,4-dioxanu (35 ml) a reaguje s Fmoc-Cl (755 mg, 2,93 mmol, 1,3 ekv.) a směs se přes noc míchá při okolní teplotě. Reakční směs se za sníženého tlaku zahustí, čímž se odstraní dioxan, neutralizuje se přídavkem IN HCl, a extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické extrakty se promyjí • í*· · · « 4 · 4 * > »·»···» » * ··« · • · · » · ♦ · ·«· »» * ·· >· ·«

174 solankou a vysuší nad bezvodým síranem sodným a zahustí. Surový produkt se poté přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: hexan/ethylacetát, dichlormethan/methanol) za vzniku čistého Fmoc-3-MeOAPPC ve formě bílého pevného produktu (668 mg, 63% výtěžek z bis-Boc hydantoinu DDD).

'Η - Nukleární magnetickorezonanční spektrum

(CDC13, hodnoty δ)
7,83 (d, 2H)	6,36 (d, 1H)
7,72 (d, 2H)	4,25 (m, 3H)
7,41 (td, 2H)	3,68 (s, 3H)
7,34 (dt, 2H)	3,23-3,40 (m, 2H)
7,16 (t, 1H)	2,96 (t, 2H)
6,52 (d, 1H)	1,86-2,18 (m, 4H).
6,42 (s, 1H)

Hmotnostní spektrum (m/z) pro C28H2sN₂O₅Na vypočteno: 495,1896 naměřeno: 495,1901 (M+Na).

Příklad 25

Příprava kyseliny Fmoc-l-amino-4-cyklohexvlcyklohexan-l-karboxylové (Fmoc-Achc-OH)

Stupeň 1:

EEE ·· to ·· toto ·· w tor· « · < e » • f · * · « to · to · · • · ···« ·« β v · » * » *· * ···· * · · · <·· * to··· ·· >«

175

Směs 4-cyklohexylcyklohexanonu (3,00 g, 16,6 mmol), kyanidu draselného (1,63 g, 25,0 mmol), uhličitanu amonného (9,59 g, 99,8 mmol), ethanolu (75 ml) a vody (15 ml) v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi se po dobu 15 hodin zahřívá v olejové lázni o teplotě 80°C. Po ochlazení na okolní teplotu se bílá suspenze převede do ledové vody a míchá se několik hodin při okolní teplotě. Po přefiltrování a vysušení vzduchem vzniká hydantoin EEE (6,10 g, ještě vlhký, >100 % výtěžek) ve formě bílého pevného produktu.

• to to ’H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-dé, hodnoty δ)

10,52 (IH, br , NH) 0,80-1,80 (20H, m).

8,43 (IH, brs, NH) hmotnostní spektrum (APCI) pro C14H22N2O2 vypočteno: 250 naměřeno: 249 (M-H), 251 (M+H).

Stupeň 2:

Směs hydantoinu EEE (1,39 g, 5,55 mmol) a 6N roztoku hydroxidu sodného (50 ml) se v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi zahřívá po dobu 2 dní v olejové lázni o teplotě 130°C. Reakční směs se ochladí v ledové lázni a neutralizuje se na pH ~7 za použití koncentrované kyseliny chlorovodíkové.

• · · ·

Bílá suspenze se přefiltruje a sraženiny propláchnou vodou za vzniku surové kyseliny 1-amino-cyklohexylcyklohexan-l-karboxýlové (48,3 g, vlhký a kontaminovaný anorganickou solí, >100 % výtěžek).

hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C13H23NO2 vypočteno: 225 naměřeno: 226 (M+H).

Stupeň 3:

Směs surové kyseliny l-amino-4-cyklohexylcyklohexan-l-karboxýlové (48,3 g, 5,55 mmol teoret.), triethylaminu (1,0 ml, 7,17 mmol), 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (Fmoc-Osu, 2,43 g, 7,20 mmol) v acetonitrilu (75 ml) a vodě (75 ml) se po dobu 24 hodin míchá při okolní teplotě. Reakční směs se vakuově zahustí, čímž se odstraní většina acetonitrilu, okyselí se na pH ~3 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a bílá emulze se třikrát extrahuje methylenchloridem. Sloučené organické fáze se promyjí vodou, solankou, vysuší nad síranem hořečnatým. Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový olej ovitý produkt, který se přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: 1-> 5-> 8% methanol/methylenchlorid) za vzniku kyseliny Fmoc-1amino-4-/ra«ó^,-cyklohexylcyklohexan-l -karboxýlové (250 mg, 10% výtěžek ve dvou stupních).

• · · ·

177 hmotnostní spektrum (FAB) pro C28H34NO4 vypočteno: 448,2488 naměřeno: 448,2497 (M+H).

Příklad 26

Příprava kyseliny Fmoc-l-amino-4,4-difenylcyklohexan-l-karboxylové (FmocAdpc-OH)

Stupeň 1:

NH

FFF

Směs 4,4-difenylcyklohexanonu (příprava hydrogenací 4,4difenylcyklohexanonu popsaného v Freeman, P.K. a kol., „J.Org.Chem.“ 1989, 54, str.782-789) (1,55 g, 6,19 mmol), kyanidu draselného (0,65 g, 9,97 mmol), uhličitanu amonného (3,60 g, 37,5 mmol), ethanolu (48 ml) a vody (12 ml) v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi se po dobu 24 hodin zahřívá v olejové lázni o teplotě 80°C. Po ochlazení na okolní teplotu se bílá suspenze převede do ledové vody a míchá se několik hodin při okolní teplotě. Po přefiltrování a vysušení vzduchem vzniká hydantoin FFF (1,89 g, 95 %) ve formě bílého pevného produktu.

H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-dň, hodnoty δ)

10,57 (IH,br,NH)

8,59 (IH, brs, NH)

7,00-7,50 (10H, m, fenyl).

• · · · • · hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro C20H20N2O2 vypočteno: 320 naměřeno: 319 (M-H).

178

Stupeň 2:

Směs hydantoinu FFF (1,88 g, 5,87 mmol), monohydrátu hydroxidu bamatého (5,60 g, 29,6 mmol) a vody (100 ml, zřeď.) se v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi zahřívá po dobu 2 dní v olejové lázni o teplotě 105°C. Přidá se další monohydrát hydroxidu bamatého (5,60 g, 29,6 mmol) a reakční směs se po dobu 24 hodin zahřívá v olejové lázni o teplotě 105°C. Reakční směs se ochladí na okolní teplotu a za stálého míchání okyselí na pH ~3 za použití 4N kyseliny sírové. Suspenze se míchá v lázni s vařící vodou po dobu 2 hodin a zchladí se na okolní teplotu. Bílá suspenze se přefiltruje a sraženiny propláchnou vodou. Sloučený filtrát a zbytky po promývání se vakuově zahustí na objem ~30 ml. Neutralizací nasyceným roztokem hydroxidu amonného vznikají bílé sraženiny, které se přefiltrují, promyjí vodou a přes noc vakuově vysuší za vzniku surové kyseliny l-amino-4,4-difenylcyklohexan-l-karboxylové (0,52g, 30 %) ve formě bílého pevného produktu.

Hmotnostní spektrum (elektrosprej) pro Ci₉H₂iNO₂ vypočteno: 295 naměřeno: 294 (M-H), 296 (M+H).

• ·

Stupeň 3:

Směs surové kyseliny l-amino-4,4-difenylcyklohexan-l-karboxylové (510 mg, 1,73 mmol), triethylaminu (0,37 ml, 2,65 mmol), 9fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (Fmoc-Osu, 880 mg, 2,61 mmol) v acetonitrilu (25 ml) a vody (25 ml) se přes noc míchá při okolní teplotě. Chromatografie na tenké vrstvě prokáže přítomnost výchozí aminokyseliny. Přidá se 9- fluorenylmethylsukcinimidylkarbonát (200 mg) a acetonitril (5 ml) a reakční směs se po dobu 24 hodin míchá při okolní teplotě. Reakční směs se vakuově zahustí, čímž se odstraní většina acetonitrilu, okyselí na pH~3 10% vodným roztokem kyseliny citrónové a bílá emulze se třikrát extrahuje ethylacetátem. Sloučené organické vrstvy se promyjí vodou, solankou a vysuší nad síranem sodným. Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový olej, který se přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: l-> 4-> 8% methanol/methylenchlorid) za vzniku kyseliny Fmoc-l-amino-4,4difenylcyklohexan-1-karboxylové (350 mg, 39% ) ve formě bílého pevného produktu.

hmotnostní spektrum (FAB) pro C34H32NO4 (M+H) vypočteno: 518,2331 naměřeno: 518,231.

180

Příklad 27

Příprava kyseliny Fmoc-1 -amino-4-/ruu5-?-butyl cyklohexan-1 -karboxylové (Fmoc-Abc-OH)

Stupeň 1:

Směs 4-ř-butylcyklohexanonu (2,00 g, 13,0 mmol), kyanidu draselného (1,27 g, 19,5 mmol), uhličitanu amonného (7,48 g, 77,8 mmol), ethanolu (60 ml) a vody (12 ml) v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi se po dobu 15 hodin zahřívá v olejové lázni o teplotě 80°C. Po ochlazení na okolní teplotu se bílá suspenze převede do ledové vody a míchá se několik hodin při okolní teplotě. Po přefiltrování vzniká hydantoin GGG (2,78 g, 96 %) ve formě bílého pevného produktu, který se použije v následujícím stupni bez dalšího přečištění.

^!H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (DMSO-dó, hodnoty δ)

10,52 (IH, br, NH) 0,81 (9H, s, ř-Bu).

8,50 (lH,brs,NH)

Stupeň 2:

GGG • * • ·

Směs hydantoinu GGG (2,78 g, 12,4 mmol), monohydrátu hydroxidu bamatého (11,74 g, 62,0 mmol) a vody (50 ml) se v zapečetěné tlustostěnné tlakové lahvi zahřívá po dobu 2 dní v olejové lázni o teplotě 120°C. Reakční směs se ochladí na okolní teplotu a za stálého míchání okyselí na pH ~3 za použití 4N kyseliny sírové. Suspenze se míchá v lázni s vařící vodou po dobu 1 hodiny a zchladí se na okolní teplotu. Bílá suspenze se přefiltruje a sraženiny propláchnou vodou. Sloučený filtrát a zbytky po promývání se vakuově zahustí na objem ~30 ml. Neutralizací nasyceným roztokem hydroxidu amonného vznikají bílé sraženiny, které se přefiltrují, promyjí vodou a přes noc vakuově vysuší za vzniku kyseliny l-amino-4-řran,s’-Z-butylcyklohexan-l-karboxylové (2,10g, 85 %) ve formě bílého pevného produktu.

Stupeň 3:

NHj

CO_£H

NHFmoc

CO₂H

Směs surové kyseliny l-amino-4-trans-t-butylcyklohexyl-l-karboxylové (2,10g, 10,54 mmol), 9-fluorenylmethylsukcinimidylkarbonátu (Fmoc-Osu, 6,33 g, 7,20 mmol) v dioxanu (150 ml) a 10% roztok uhličitanu sodného (120 ml) se po dobu 24 hodin míchá při okolní teplotě. Reakční směs se vakuově zahustí, čímž se odstraní většina dioxanu, okyselí na pH~3 3N kyselinou chlorovodíkovou a bílá emulze se dvakrát extrahuje methylenchloridem. Sloučené organické vrstvy se promyjí vodou, solankou a vysuší nad síranem hořečnatým. Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový produkt, který se přečistí sloupcovou chromatografií (eluční soustava: 1—> 4—> 5% • · • · • · · · « · «· · • · « · · • · · · ·

182 methanol/methylenchlorid) za vzniku kyseliny Fmoc-l-amino-4-trans-tbutylcyklohexan-1-karboxylové (1,42 g, 32%).

hmotnostní spektrum (FAB) pro C26H32NO4 (M+H) vypočteno: 422,2331 naměřeno: 422,23

Příklad 28

Příprava 3S,2S-Fmoc-(L)-betamethy(Nin-Mes)tryptofanu, (Fmoc-(L)-ffMe(Nin-Mes)Trp-OH)

Stupeň 1:

HHH

Kroztoku kyseliny trans-3-indolarylové (15,0 g 0,08 mmol) v350 ml suchého tetrahydrofuranu se při teplotě -78°C pomalu přidá 125 ml 1,6M nBuLi v hexanu. Vzniklá suspenze se po dobu 1 hodiny míchá při teplotě -78°C. Poté se pomalu přidá roztok 2-mesitylensulfonylchloridu (21,9 g, 0,1 mmol) v 50 ml suchého tetrahydrofuranu. Směs se zahřeje na okolní teplotu a přes noc míchá. Směs se převede do nasyceného vodného roztoku chloridu amonného. Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se extrahuje ethylacetátem. Sloučená organická vrstva se vysuší nad síranem sodným. Po odstranění rozpouštědel vzniká 14,1 g surového produktu HHH který se použije v následujícím stupni bez dalšího • · · ·

183 přečištění. ^!H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum indikuje v tomto produktu 2,8 g kyseliny 2-mesitylensulfonové.

'Η - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CD₃OD, hodnoty δ)

7,57 (s, 1H)

7,42 (d, 1H)

7,15-7,30 (m,3H)

7,02 (s, 2H)

6,54 (d, 1H) 6,36 (d, 1H) 2,52 (s, 9H) 2,30 (s, 3H).

Stupeň 2:

HHH

III

K roztoku kyseliny N-2-mesitylensulfonyl-trans-3-indolarylové (3,26 g, 8,8 mmol) v 140 ml suchého tetrahydrofuranu se při teplotě -78°C přidá 3,7 ml (3 ekv.) triethylaminu a 2,17 ml (2 ekv.) Me₃CCOCl. Vzniklá směs se po dobu 15 minut míchá při teplotě -78°C a po dobu 1,5 hodin při teplotě 0°C. Směs se ochladí na -78°C a přidá se k ní 5,5 ml 1,6M n-BuLi v hexanu a poté směs (R)4-fenyl-2-oxazolidinonu a n-BuLi v tetrahydrofuranu (příprava přidáním 11 ml 1,6M n-BuLi v hexanu k roztoku (R)-4-fenyl-2-oxazolidinonu (2,87 g, 17,6 mmol) v 70 ml suchého tetrahydrofuranu při teplotě -78°C) přes kanylu. Vzniklá směs se po dobu 2 hodin míchá při teplotě -78°C a přes noc při okolní teplotě. K reakční směsi se přidá 100 ml vodného roztoku chloridu amonného. Po vakuovém odstranění organických rospouštědel se vodný podíl extrahuje ethylacetátem. Sloučená organická vrstva se vysuší nad síranem sodným. Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový produkt, který se přečistí mžikovou • ·

184 chromatografií (eluční soustava: ethylacetát/hexan 1:4) za vzniku produktu III ve formě světlehnědého gumovitého produktu (2,86 g, 63 %).

hmotnostní spektrum (LR, elektrosprej) pro C29H26N2O5 S vypočteno: 514 naměřeno: 515 (M+H).

III JJJ

Ke směsi CuBr.Me₂S (0,84 g, 4,08 mmol) a 5 ml dimethylsulfidu v 10 ml suchého tetrahydrofuranu se při teplotě -4°C přidá 1,36 ml 3M CH₃MgBr v etheru. Po 10 minutách míchání se přidá výše uvedený produkt (1,4 g, 2,72 mmol) v 8 ml suchého tetrahydrofuranu. Vzniklá směs se po dobu 1 hodiny míchá při teplotě -4°C a po dobu 6 hodin při okolní teplotě. Po ochlazení na teplotu -78°C se ke směsi přidá 1,45 g (8,16 mmol) N-bromsukcinimidu v 15 ml suchého tetrahydrofuranu. Směs se po dobu 30 minut míchá při teplotě -78°C a přes noc při okolní teplotě. Směs se převede do 100 ml solanky a extrahuje se ethylacetátem (2x100 ml). Organická vrstva se vysuší nad síranem sodným. Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový produkt, který se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: ethylacetát/hexan 1:4) za vzniku produktu JJJ ve formě světle hnědého gumovitého produktu (0,77 g, 46 %).

^!H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDCI3, hodnoty δ)

7,63 (d, 1H)

4,49 (t, 1H) • · · ·

4,17 (dd, 1H)

3,75 (dt, 1H)

2,54 (s, 9H)

2,31 (s, 3H)

1,59 (d, 3H).

185

7,47 (s, 1H)

7,20-7,37 (m, 8H)

6,98 (s, 2H)

6,16 (d, 1H)

5,13 (dd,lH)

JJJ KKK

Výše uvedený bromid JJJ (0,72 g, 1,18 mmol) se smíchá stetra-nbutylammoniumazidem (1,68 g, 5,9 mmol) a azidem sodným (77 mg, 1,18 mmol) v 10 ml acetonitrilu a směs se míchá po dobu 6 hodin při okolní teplotě, načež se převede do 100 ml vodného roztoku chloridu amonného a extrahuje ethylacetátem (2x100 ml). Organická vrstva se vysuší nad síranem sodným. Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový produkt, který se přečistí mžikovou chromatografií' (eluční soustava: ethylacetát/dichlormethan/hexan 1:2:5) za vzniku produktu KKK ve formě světle hnědého gumovitého produktu (0,55 g, 82 %).

H - Nukleární magnetickorezonanční spektrum (CDC1₃, hodnoty δ)

7,65 (d, 1H)

7,59 (s, 1H) 7,18-7,29 (m, 8H) 6,90 (s, 2H)

4,78 (t, 1H)

4,35 (dd, 1H)

3,62 (kvintet, 1H)

2,43 (s, 9H) • · · · • ·

186

5,54 (d, 1H)

5,50 (dd, 1H)

2.28 (s, 3H)

1.28 (d, 3H).

LLL

KKK

Ke směsi výše uvedeného azidu KKK (0,55 g, 0,96 mmol), vody (4 ml) a tetrahydrofuranu (12 ml) se při teplotě 0°C přidá 0,65 ml 30% peroxidu vodíku a poté 48 mg (2 ekv.) hydoxidu lithného v 1 ml vody. Vzniklá směs se po dobu 2 hodin míchá při teplotě 0°C, načež se k ní přidá 1 g siřičitanu sodného v 6 ml vody. Směs se míchá po dobu 30 minut při okolní teplotě. Po odstranění organického rozpouštědla se vodný roztok zředí 10 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a extrahuje se ethylacetátem (2x30 ml). Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový produkt, který se přečistí mžikovou chromatografií (eluční soustava: HOAc/MeOH/EtOAc 1:10:100) za vzniku produktu LLL ve formě šedobílého pevného produktu (0,34 g, 83 %). Hmotnostní spektrum (LR, elektrosprej) pro C21H22N4O4S vypočteno: 426 naměřeno: 425 (M-H).

Stupeň 6:

LLL

• · · ·

187

Výše uvedená azidokyselina LLL (0,34 g, 0,8 mmol) se rozpustí v 20 ml methanolu. K roztoku se přidá 170 mg 10% palladia na uhlí. Vzniklá směs se po dobu 3 hodin míchá při okolní teplotě pod atmosférou H₂. Po přefiltrování a zahuštění se surový produkt rozpustí ve směsi THF (12 ml) a vody (4 ml). Ke vzniklé směsi se přidá hydrogenuhličitan sodný (254 mg, 3 mmol) a Fmoc-Osu (540 mg, 1,6 mmol). Vzniklá směs se po dobu 18 hodin míchá při okolní teplotě, načež se zředí 30 ml nasyceného roztoku chloridu amonného a extrahuje ethylacetátem (2x30 ml). Po přefiltrování a zahuštění vzniká surový produkt, který se přečistí mžikovou chromatografíí (eluční soustava: HOAc/MeOH/EtOAc 1:10:100) za vzniku 3S,2S-Fmoc-(L-betamethy(NinMes)tryptofanu ve formě šedobílého pevného produktu (0,25 g, 50 %).

hmotnostní spektrum (LR, elektrosprej) pro C₃₆H₃4N₂O6 S vypočteno: 622 o naměřeno: m/z (621 M-H).

o

Jk ⁰

Příklad 29

o fOo

N^N

Příprava Fmoc-Linker-BHA pryskyřice

Zesítěná pryskyřice benzhydrylaminkopolystyren-l%divinylbenzen (10,0 g, 9,3 ekv., 100-200 ASTM mesh, Advancet ChemTech) se nechá nabobtnat ve 100 ml dichlormethanu, načež se přefiltruje a promyje postupně 100 ml dichlormethanu, 6% DIPEA/dichlormethan (dvakrát), dichlormethanem (dvakrát). Pryskyřice poté při okolní teplotě po dobu 24 hodin reaguje s kyselinou p-[(R,S)-a-[ 1 -(9H-fluoren-9-yl)methoxyformamido]-2,4dimethoxybenzylj-fenoxyoctovou (Fmoc-Linker) (7,01 g, 13,0 mmol), Nhydroxybenzotriazolem (2,16 g, 16,0 mmol) a diisopropylkarbodiimidem (2,04

188 ml, 13,0 mmol) v 100 ml 25% DMF/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a promyje postupně 100 ml dichlormethanu (2x), isopropanolu (2x), DMF a dichlormethanu (3x). Kaiserova ninhydrinová analýza je negativní. Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 16,12 g Fmoc-Linker-BHA pryskyřice. Část této pryskyřice (3,5 mg) se podrobí odchránění Fmoc a kvantitativní UV analýza indikuje obsah 0,56 mmol/g.

Příklad 30

Příprava Ac-Nle-cyklofAsp-Lys)-Asp-His-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze postupem výše uvedeným v protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Sedm kondenzačních cyklů se provádí s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg,

1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-His (Trt) (600 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (Obut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Nle (430, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice projde kroky 1-5, uvedenými v protokolu 1, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 1 ml acetanhydridu v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát).

• ·

189

Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g Ac-heptapeptidové pryskyřice. Tato heptapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 μΐ, dimethylsulfidu, 250 μίζ anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 250 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

250 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 250 ml DMF, načež se přidá 600 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 300 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 60 mg (15 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanoveno vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro Cso^N^C^ vypočteno: 1024 naměřeno: m/z (1025 M+H).

• · · ·

Příklad 31

Příprava Penta-cyklofAsp-Lys^-Asp-Apc-ÍDjPhe-Arg-Trp-Lys-NH?

190

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně se nechá proběhnout šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg,

1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), FmocArg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp (Obut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice projde kroky 1-5, uvedenými v protokolu 1, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kyseliny valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,0 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 /iL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku • · • 4

191

220 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění. 220 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 53 mg (13 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C54H72N12O8 vypočteno: 1017 naměřeno: m/z (1018 M+H).

Příklad 32

Příprava penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Lys-NH2

N N • · ·

192

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně se nechá proběhnout šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg,

1,2 mmol), Fmoc-(2)Nal (530 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp (Obut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice projde kroky 1-5 podle protokolu 1, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kyseliny valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,1 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 220 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího precistem.

240 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

. “· : · : :··:· · : ·. · ···..·

193

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac 08 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 55 mg (14 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro 0₅₆Η₇₃Νιι0₈ vypočteno: 1028 naměřeno: m/z (1029 M+H).

Příklad 33

podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádějí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhnou dva kondenzační cykly • · *· «

194 s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc(2)Nal (530 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol).

Po odstranění Fmoc z 2-Nal zbytku se vzniklý amin převede na 2nitrobenzensulfonylový derivát za použití 2-nitrobenzensulfonylchloridu (5 ekv., 426 mg, 1,93 mmol) a DIPEA (5 ekv.) jako báze v DMF. Promývání se provádějí v DMF (6x30 ml) a poté dichlormethanem (3x30 ml) a pryskyřice se vakuově vysuší. Získaný sulfonamid se methyluje za použití trifenylfosfinu (5 ekv., 505 mg, 1,93 mmol), N,N-diethylazodikarboxylátu (5 ekv., 303 μΕ, 1,93 mmol) a methanolu (10 ekv., 156 gL, 3,85 mmol) v THF. Promyje se v DMF (6x30 ml)a poté dichlormethanem (5x30 ml) a pryskyřice se vakuově vysuší. 2nitrobenzensulfonylová skupina se poté odstraní za použití 1,8diazabicyklo[5.4.0]undec-7-enu (3 ekv., 173 /xL, 1,16 mmol) a 2merkaptoethanolu (5 ekv., 135 /xL, 1,93 mmol) v DMF. Promyje se za použití DMF (3x30 ml), isopropanolu (3x30 ml) a poté ethyletheru (3x30 ml) a pryskyřice se vakuově vysuší. Vzniklý N-Me-2-Nal podíl se podrobí čtyřem kondenzačním cyklům s Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), FmocAsp (Obut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice projde kroky 1-5 protokolu 1, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kyseliny valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 /xL ethandithiolu, 100 /xL dimethylsulfidu, 250 /xL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi

195 díly EtaO a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku

235 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího v v » v . v r precisteni.

235 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 /JÍL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH^CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 43 mg (10 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovena vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C57H75N11O8 vypočteno: 1042 naměřeno: m/z (1043 M+H).

Příklad 34

Příprava cvklofkys.iantarová-Lysl-kys.iantarová-Apc-fDlPhe-Arg-Trp-Lys-NH?

N

O * «

196

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), anhydridem kyseliny jantarové (600 mg, 6 mmol) v DMF s 1,1 ml DIPEA.

Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,0 g pentapeptidové pryskyřice. Tato pentapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu·, 100 gL dimethylsulfidu, 250 μΥ. anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et20 a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 220 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

220 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr • 4 • a ·*»·

B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce

280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 40 mg (11 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C49H₆₃NnO₇ vypočteno: 918 naměřeno: m/z (919 M+H).

Příklad 35

Příprava cvklo(kvs.maleinová-Lys)-kys.maleinová-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU * 4

Φ ·

Φ *» · • ·

198 • < * ♦ · * · • » · · · · » r · •« * (452 mg, 1,2 mmol), anhydridem kyseliny maleinové (600 mg, 6 mmol) v DMF přidáním HOBT (800 mg, 6 mmol) bez použití DIPEA. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,0 g pentapeptidové pryskyřice. Tato pentapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 μΕ anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et2O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 230 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

230 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografíe se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 38 mg (11 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C4₉H₆iNiiO₇ vypočteno: 916 naměřeno: m/z (917 M+H).

·· ·

199

Příklad 36

Příprava cyklofkys.ftalová-Lysj-kys.flalová-Apc-fDjPhe-Arg-Trp-Lvs-NH?

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), anhydridem kyseliny fialové (660 mg, 6 mmol) v DMF s 1,1 ml DIPEA.

Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,0 g pentapeptidové pryskyřice. Tato pentapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 pL ethandithiolu, 100 /xL dimethylsulfidu, 250 pL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et2O a opět odstředí a toto ···· surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 220 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

220 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 μΤ N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 35 mg (10 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C53H63N11O7 vypočteno: 966 naměřeno: m/z (967 M+H).

Příklad 37

Příprava penta-cyklo(Asp-Lvs)-Asp-4-OHApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2

o • ·

201

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu . Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-OHApc (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp (Obut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice kroky 1-5, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kyseliny valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,1 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 225 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího precistem.

225 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

• · · ·

202

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. Trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. Trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 55 mg (13 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C54H72N12O9 vypočteno: 1033 naměřeno: m/z (1034 M+H).

Příklad 38

Příprava penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-4-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lvs-NH2

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhlo šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), • · • · • · · ·

Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-MeOApc (600 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (Obut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice kroky 1-5, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kyseliny valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,1 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 pL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 235 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího precistem.

235 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 49 mg (12 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C55H74N12O9 vypočteno: 1047 naměřeno: m/z (1048 M+H).

204

Příklad 39

Příprava penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-4-EtOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-EtOApc (640 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (Obut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice kroky 1-5, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kyseliny • · • ·

205 valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 235 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

235 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 60 mg (14 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C56H₇₆Ni₂O₉ vypočteno: 1061 naměřeno: m/z (1062 M+H).

• · · · • · • · • · · · • · ¹ • ·

206

Příklad 40

Příprava penta-cvklo(Asp-Lys)-Asp-4-iPrOAoc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-iPrOApc (660 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (Obut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice kroky 1-5, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kyseliny valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 fiL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 pcL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se • ·

207 odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku

260 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

260 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. triťluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 63 mg (15 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C57H78N12O9 vypočteno: 1075 naměřeno: m/z (1076 M+H).

Příklad 41

Příprava penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-3 -MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-3-MeOApc (600 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp (Obut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice kroky 1-5, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kyseliny valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,1 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 235 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

• · · · • · • ·

209

235 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 pL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 49 mg (12 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C56H73N11O8 vypočteno: 1028 naměřeno: m/z (1029 M+H).

Příklad 42

Příprava penta-cyklo(Asp-Lvs)-Asp-4-ClApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH?

Cl • · · · · ·

210

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-ClApc (560 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp (Obut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice kroky 1-5, promyje sě dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kyseliny valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,0 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 230 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

230 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

• * · · • »

·..· : ........

211

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 49 mg (12 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C54H71N12O8CI vypočteno: 1051 naměřeno: m/z (1052 M+H).

Příklad 43

Příprava penta-cyklo(Asp-Lvs)-Asp-4-MeApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2

podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), • · · »

212

Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-MeApc (590 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (Obut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice kroky 1-5, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridů kyseliny valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 μΣ ethandithiolu, 100 pL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 240 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

240 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 μΣ N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CHsCN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové ·» ··« ·

213 chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 55 mg (14 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C55H74N12O8 vypočteno: 1031 naměřeno: m/z (1032 M+H).

Příklad 44

Příprava penta-cyklofGlu-Lysj-Glu-Apc-fDjPhe-Arg-Trp-Lys-NH?

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Glo (Obut) (510 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg,

1,2 mmol). Peptidová pryskyřice kroky 1-5, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kyseliny valerové v 6% • · · · • · · • · · · • · · · · • ····· · · • · · · • · ·

214

DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,1 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 /xL ethandithiolu, 100 /xL dimethylsulfidu, 250 /xL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 255 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

255 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 /xL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografíí. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografíí.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografíí na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 60 mg (15 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografíí).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro CssF^N^Og vypočteno: 1031 naměřeno: m/z (1032 M+H).

• · • · • · • · · ·

Příprava penta-cyklofAsp-Onri-Asp-Apc-ÍD^lPhe-Arg-Trp-Orn-NH?

215

Příklad 45

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Om (Boc) (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (Obut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg,

1,2 mmol). Peptidová pryskyřice kroky 1-5, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kyseliny valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,15 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi • ·

216 díly Et20 a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 240 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

240 mg surových lineárních peptidú se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 53 mg (13 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C53H70N12O8 vypočteno: 1003 naměřeno: m/z (1004 M+H).

Příklad 46

Příprava penta-cyklo(Asp-Dbr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dbr-NH?

o o

• ·

217

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Dbr (Boc) (540 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (Obut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg,

1,2 mmol). Peptidová pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kyseliny valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,10 g pentyl-hexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 /xL ethandithiolu, 100 /xL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 220 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

220 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 /xL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

• · • · · · • · · • · · · · • · · · • · · • · · ·

218

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 35 mg (9 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C52H₆₈Ni₂O₈ vypočteno: 989 naměřeno: m/z (990 M+H).

Příklad 47

podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Dpr (Boc) (530 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) • · · ·

219 (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (Obut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg,

1,2 mmol). Peptidová pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kyseliny valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,0 g pentyl-hexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 200 mg Šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

200 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 30 * · • · · ···· ··· • * · ·· ·· ·· «·

220 mg (8 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C5iH₆6Ni₂0g vypočteno: 975 naměřeno: m/z (976 M+H).

Příklad 48

Příprava Ac-cykloíAsp-Dprj-Asp-Apc-fDjPhe-Arg-Trp-Dpr-NH?

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Dpr (Boc) (530 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg,

1,2 mmol). Peptidová pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje se dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kyseliny octové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a • · · · • ·

221 dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,1 g acetyl hexapeptidové pryskyřice.

Tato acetylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 200 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

210 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 28 mg (8 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C48H₆₀Ni₂O₈ vypočteno: 933 naměřeno: m/z (934 M+H).

222

Příklad 49

Příprava cvklofkys.ftalová-Dprj-kys-ftalová-Apc-fDjPhe-Arg-Trp-Dpr-NH?

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Dpr (Boc) (530 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a fJBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU <

(452 mg, 0,6 mmol), anhydrid kyseliny fialové (660 mg, 6 mmol) v DMF s 1,1 ml DIPEA. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,0 g pentapeptidové pryskyřice.

Tato pentapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml' kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku • ·

223

220 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

220 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 pL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl 8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CHjCN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 30 mg (8 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnosmí spektrometrie (elektrosprej) pro C50H57N11O7 vypočteno: 924 naměřeno: m/z (925 M+H).

Příklad 50

Příprava cvkloíkys.iantarová-Dprj-kvs.iantarová-Apc-fDjPhe-Arg-Trp-Dpr-NH?

o • ·

224

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Dpr (Boc) (530 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), anhydridem kys.jantarové (600 mg, 6 mmol) v DMF s 1,1 ml DIPEA. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,0 g pentapeptidové pryskyřice.

Tato pentapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 220 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího precisteni.

220 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr • ·

225

Β: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 31 mg (8 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C46H57N11O7 vypočteno: 876 naměřeno: m/z (877 M+H).

Příklad 51

Příprava cvklo(kvs.maleinová-Dpr)-kys.maleinová-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Dpr (Boc) (530 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), anhydridem kys.maleinové (600 mg, 6 mmol) v DMF • ·

226 s přídavkem HOBT (800 mg, 6 mmol), bez použití DIPEA. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,0 g pentapeptidové pryskyřice.

Tato pentapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 p,L dimethylsulfidu, 250 μϊ, anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 230 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

230 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 28 mg (8 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C46H55N11O7 vypočteno: 874 naměřeno: m/z (875 M+H).

• · · · • · · · · • · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · • · · ·

227

Příklad 52

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Cit (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg,

1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,3 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentyl-haxapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 /zL ethandithiolu, 100 μΕ dimethylsulfidu, 250 μΤ anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se • ·

228 odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 300 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího v v · v, v r precisteni.

300 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 /xL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 80 mg (20 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C54H71N11O9 vypočteno: 1018 naměřeno: m/z (1019 M+H).

o * 4

229

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Ala (380 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg,

1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,4 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentyl-haxapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 330 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

330 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

• * ♦ ·«· «

230

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 87 mg (20 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C5iH₆₅N₉O8 vypočteno: 932 naměřeno: m/z (933 M+H).

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne sedm kondenzačních cyklů s Fmoc-Cys (Trt) (710 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (80 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 • to * •

• * * to • e · · · >

·· ·· » tor * * ··· to · ··· · ·· ·

231 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Cys (Trt) (710 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Nle (430 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g Ac-heptapeptidové pryskyřice.

Tato Ac-heptapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 pL dimethylsulfidu, 250 pL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 250 mg šedobílého pevného produktu.

Surový lineární peptid se přečistí preparativní vysokorychlostní chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 45 mg přečištěného lineárního peptidů.

Přečištěný lineární peptid se rozpustí v 2 ml DMSOF, načež se přidá 500 mL vody a pH se upraví na hodnotu 8,0 přidáním hydroxidu amonného. Do roztoku se přibublává kyslík a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Roztok se lyofilizuje a látka rozpustí v kys.octové a zpracuje preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys.

• · · · • · trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CřfiCN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografíe se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 20 mg (4,7 %) přečištěného cyklického peptidu. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C53H70N12O8S2 vypočteno: 1067 naměřeno: m/z (1068 M+H).

Příklad 55

Příprava penta-cyklo(Asp-Lys)-Asp-(D,L)-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lvs-NH2

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D,L)-Atc (510 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU • · • · • · · ·

233 (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,15 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentyl-haxapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 pL ethandithiolu, 100 /xL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 245 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

250 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 pL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 55 mg (14 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

• · · · • ·

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C₅2H₆₈Ni2O8 vypočteno: 989 naměřeno: m/z (990 M+H).

podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Br-(D,L)Atc (620 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,1 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentyl-haxapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 /xL ethandithiolu, 100 /xL dimethylsulfidu, 250 /xL anisolu a ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 240 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

240 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví první hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 26 mg (6 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C52H₆₇N₁₂O₈Br vypočteno: 1068 naměřeno: m/z (1069 M+H).

• ·

podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Br-(D,L)Atc (620 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,1 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentyl-haxapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 /xL ethandithiolu, 100 /xL dimethylsulfidu, 250 /xL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku • · • · • · · ·

240 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

240 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví druhý hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 20 mg (5 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C₅2H₆₇Ni2O₈Br vypočteno: 1068 naměřeno: m/z (1069 M+H).

Příklad 58

Příprava penta-(Asp-Lys)-Asp-5 -ClAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lvs-NH? (pík 1)

n N cí· • ·

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Cl-(D,L)Atc (560 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentyl-haxapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 /xL ethandithiolu, 100 /xL dimethylsulfidu, 250 μΐ^ anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 250 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího precisteni.

250 mg surových lineárních peptidú se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 /xL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

• · • · · · • ·

239

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví první hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 24 mg (6 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C52H67N12O8CI vypočteno: 1024 naměřeno: m/z (1025 M+H).

Příklad 59

Příprava penta-( Asp-Lys)-Asp-5 -ClAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH? (pík 2)

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Cl-(D,L)Atc (560 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU • ·

240 (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentyl-haxapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 250 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

250 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví druhý hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 20 mg (4 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

• ·

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C52H67N12O8CI vypočteno: 1024 naměřeno: m/z (1025 M+H).

Příklad 60

Příprava penta-(Asp-Lys)-Asp-5-MeO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH7

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-MeO-(D,L)Atc (600 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentyl hexapeptidové pryskyřice.

Tato pentyl-haxapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 /zL dimethylsulfidu, 250 ^L anisolu a • · • · • · · ··· ·· • ··· · ···· · · • ······· ·· · · · · ·· · · · · · ··· • · · ·· · · ·· ·

242 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 250 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

250 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 55 mg (13 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C5₃H₇oNi₂09 vypočteno: 1019 naměřeno: m/z (1020 M+H).

• · · · • · • ·

243

Příklad 61

Příprava penta-(Asp-Lvs)-Asp-5-EtO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-EtO-(D,L)Atc (620 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,3 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentyl-haxapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi • · · · • · · ·

244 díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 260 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

260 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 pL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 58 mg (13 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C₅₄H₇₂Ni₂O9 vypočteno: 1033 naměřeno: m/z (1034 M+H).

Příklad 62

Příprava penta-(Asp-Lys)-Asp-5-iPrO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2

-N

O

O

O • ·

245

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-iPrO-(D,L)Atc (620 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentyl-haxapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje -2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 250 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího v ν·ν,ν z precistem.

250 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

• · » · · • · · · · • ···· * · · • · · · · · ·

- , , -- ' .. ·· ·. ··

246

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 58 mg (13 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C55H74N12O9 vypočteno: 1047 naměřeno: m/z (1048 M+H).

Příklad 63

Příprava penta-(Asp-Lys)-Asp-5 -Me-(D.L) Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH?

podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Me-(D,L)Atc (590 mg, 1,2

• ·

247 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentyl-haxapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 260 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího v v · v . v r precistem.

260 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 62 mg (13 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

• z tt 9 99 9

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C₅₃H7oNi20₈ vypočteno: 1003 naměřeno: m/z (1004 M+H).

Příklad 64

Příprava penta-(Asp-Lys)-Asp-5-Et-(D,L) Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH?

podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Et-(D,L)Atc (600 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,3 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

*· «··« » · * · a··· · · · • ·····«· « · ··· · * ·· « · · · · 9 9··

249 ...........

Tato pentyl-haxapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 μΣ ethandithiolu, 100 μΕ dimethylsulfidu, 250 μΕ anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 245 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího v v · v . v r precistem.

245 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 μΕ N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 55 mg (12 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C₅₄H₇₂Ni₂O₈ vypočteno: 1017 naměřeno: m/z (1018 M+H).

·· « ·· · «· ·· ··· · 4 * 4 · 4 • ► ». · · 4 4 4 4 4 4 4 • · 4444 4 4 « w 4 4 4 4 4 • · « · 4 4 · 4 4 4 4 ·· * ·> ·· ·· ·«

250

podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-iPr-(D,L)Atc (600 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi • · • · · ·

251 díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 245 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

245 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 pL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografíí. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografíí.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografíí na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 54 mg (13 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografíí).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C55H74N12O8 vypočteno: 1031 naměřeno: m/z (1032 M+H).

Příklad 66

Příprava penta-(Asp-Lys)-Asp-5 -BrAtc-ÍDjPhe-Cit-Trp-Lys-NHApík 1)

Bi

CT N • ·

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Br-(D,L)Atc (620 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 260 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího precistem.

260 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

• · ·

253 *·

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví první hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 24 mg (5,6 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C₅2H66NiiO₉Br vypočteno: 1069 naměřeno: m/z (1070 M+H).

Příklad 67

Příprava penta-(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH^ (pík 2)

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2

254 • · • · · · • · · · · ······· · • · · · mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Br-(D,L)Atc (620 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,1 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 240 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

240 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografíe se stanoví druhý hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za • · · ·

255 vzniku 22 mg (4,8 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C₅2H₆₆NiiO₉Br vypočteno: 1069 naměřeno: m/z (1070 M+H).

Příklad 68

Příprava penta-(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH^(pík 1)

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Cl-(D,L)Atc (560 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a • · dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 245 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

245 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví první hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 22 mg (5,8 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C52H₆6NiiO₉C1 vypočteno: 1024 naměřeno: m/z (1025 M+H).

• · · ·

257

Příklad 69

Příprava penta-fAsp-Lysj-Asp-S-ClAtc-fDjPhe-Cit-Trp-Lys-Nťbfpík 2)

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-Cl-(D,L)Atc (560 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 pL ethandithiolu, 100 pL dimethylsulfidu, 250 pL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi • · díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 250 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

250 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografn. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví druhý hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 20 mg (5,4 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C₅₂H₆₆NnO₉Cl vypočteno: 1024 naměřeno: m/z (1025 M+H).

Příklad 70

Příprava Ac-Nle-cyklo(Cvs-Cys)-Cys-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2

O

o

+.X,

O.

N • · ·*» )

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne sedm kondenzačních cyklů s Fmoc-Cys (Trt) (710 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D,L)Atc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Cys (Trt) (710 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Nle (430 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,0 g Acheptapeptidové pryskyřice.

Tato Ac-heptapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 240 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího v v · v .v r precistem.

Tento surový lineární peptid se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové • * ··· · chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 55 mg přečištěného lineárního peptidů.

Tento přečištěný lineární peptid se rozpustí v 2 ml DMSO, zředí se 500 ml vody a pH se upraví na hodnotu 8,0 přídavkem hydroxidu amonného. Do roztoku se přibublává kyslík a průběh cyklizace se monitoruje HPLC. Obvykle je cyklizace ukončena během 24-48 hodin. Roztok se lyofylizuje a látka rozpustí v kyselině octové a zpracuje prparativní HPLC na koloně Vydac 08 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 20 mg (5,0%) přečištěného cyklického peptidů. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C₅iH₆₆Ni2O₈S2 vypočteno: 1039 naměřeno: m/z (1040 M+H).

Příklad 71

Příprava penta-cyklo(Cvs-Cys)-Cys-5-Br(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂

S--- ' ----s

Bi

• ·

261 • · ·

4 4

4 4 4

4 4 4 4 4

4 4

4 4

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Cys (Trt) (710 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-5-BrAtc (620 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Cys (Trt) (710 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Peptidová pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,1 g Acheptapeptidové pryskyřice.

Tato pentyl-hexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 240 mg šedobílého pevného produktu.

Tento surový lineární peptid se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 50 mg přečištěného lineárního peptidů.

• · • · • · · · • · • ··· · ···· · · · • ······· · · · · · ·

262 *··* * ·· ·· ·· ··

Tento přečištěný lineární peptid se rozpustí v 2 ml DMSO, zředí se 500 ml vody a pH se upraví na hodnotu 8,0 přídavkem hydroxidu amonného. Do roztoku se přibublává kyslík a průběh cyklizace se monitoruje HPLC. Obvykle je cyklizace ukončena během 24-48 hodin. Roztok se lyofýlizuje a látka rozpustí v kyselině octové a zpracuje preparativní HPLC na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 22 mg (5,2%) přečištěného cyklického peptidu. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C4₈H₆oNn07S2Br vypočteno: 1047 naměřeno: m/z (1048 M+H).

Příklad 72

Příprava pentacyklo-(Asp-Lvs)-Asp- Appc-fDjPhe-Arg-Trp-Lys-NH?

podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních • · ·

263 • · cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Appc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg,

1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 245 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího precistem.

245 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac 08 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce • · • · _Λ . ··· W » W - - - 264 ·· · ·· ··

280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 57 mg (14 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C53H71N13O8 vypočteno: 1018 naměřeno: m/z (1019 M+H).

Příklad 73

Příprava pentacyklo-(Asp-Lys)-Asp-2-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH7

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmoí) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-2-MeAppc (570 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně • · · ·

265 ·· · · · ·· ·· ·· promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 250 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

250 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 61 mg (15 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C₅4H₇₃Ni₃O₈ vypočteno: 1032 naměřeno: m/z (1033 M+H).

• · • · • · · ·

266

Příklad 74

Příprava pentacvklo-(Asp-Lys)-Asp-2-iPrAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH?

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-2-iPrAppc (600 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridů kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 μΕ ethandithiolu, 100 μΕ dimethylsulfidu, 250 μΕ anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi

267 díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 245 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

245 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 μΐ, N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 52 mg (14 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C₅₆H77Ni₃O₈ vypočteno: 1060 naměřeno: m/z (1061 M+H).

Příklad 75

Příprava pentacyklo-(Asp-Lys)-Asp-3 -MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH?

o 'Ν' • · · · · · · ······ ··· · · · · · · • ··· · · · · · · · · • ······· · · ·«· · · _ 1 · · ···· ♦··· 268 ·· · ·· ··

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-3-MeAppc (570 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 pL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 248 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

248 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

269

9 9 ·* 9 9 999999

9a ··· · · · • 9 9 9 · 9 9 9 9 · · · • 9999999 ·· 9 9 9 9 · ·· · 9··· 9999 • 9 9 99 99 99 99

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 55 mg (14 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C₅4H₇₃Ni₃O8 vypočteno: 1032 naměřeno: m/z (1033 M+H).

Příklad 76

Příprava pentacyklo-(Asp-Lys)-Asp-4-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-MeAppc (570 mg, 1,2 mmol) a • · • · # · • · · · · · · · « • · · · · ···· · · · • ··«···· ·· ··· · ·

270 *··* · ·· *· ·· *·

HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 254 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

254 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 57 mg (14 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

• · • · · *

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C54H73N13O8 vypočteno: 1032 naměřeno: m/z (1033 M+H).

271

Příklad 77

Příprava pentacyklo-(Asp-Lys)-Asp-4-ClAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-ClAppc (580 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny • Φ Λ *

ΦΦ ·Φ>·«

Φ φ * » * «· Φ « «► · « φ ΦΦΦ· Φ Φ · φ φ ΦΦΦΦ ΦΦ * · ΦΦΦ Φ ·

Π'ΎΟ Φ « Φ φφφ· · · · · trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 250 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

250 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografíí. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografíí.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografíí na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CHjCN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 55 mg (14 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografíí).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C53H70N13O8CI vypočteno: 1032 naměřeno: m/z (1033 M+H).

Příklad 78

Příprava pentacyklo-(Asp-Lys)-Asp-4-PhOAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2

• · • ·

273 ·· · ........

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-4-PhOAppc (650 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 270 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

270 mg surových lineárních peptidú se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

• · • · · · • ·

274 ...........

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografíe se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 58 mg (13 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C59H75NBO9 vypočteno: 1110 naměřeno: m/z (1111 M+H).

Příklad 79

Příprava penta-(Asp-Lys)-Asp-3-MeQ-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 • · mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-3-MeOAppc (580 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,2 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut pň okolní teplotě s 100 pL ethandithiolu, 100 /xL dimethylsulfidu, 250 /xL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 250 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

250 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 /xL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 54 • · • · ·

276 mg (13 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C54H₇₃Ni3O₉ vypočteno: 1048 naměřeno: m/z (1049 M+H).

Příklad 80

Příprava pentacyklo-(Asp-Lys)-Asp-4-Adpc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Adpc (620 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg,

1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a • « • ·

dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,1 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 242 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

242 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac C18 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 48 mg (11 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro QoHygN^Os vypočteno: 1093 naměřeno: m/z (1094 M+H).

• · · · • · • ·

Příklad 81

podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Achc (560 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg,

1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,1 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 gL dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi

279 díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 250 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

250 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 gL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 52 mg (13 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C54H₇₈Ni₂O8 vypočteno: 1023 naměřeno: m/z (1024 M+H).

Příklad 82

Příprava pentacvklo-(Asp-Lvs)-Asp-Abc-fD)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ o

• · • · • ·

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Abc (530 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg,

1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,3 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 μΕ dimethylsulfidu, 250 gL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 255 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího přečištění.

255 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 pL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

281

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 58 mg (14 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C52H₇₆Ni₂O8 vypočteno: 997 naměřeno: m/z (998 M+H).

Příklad 83

Příprava pentacyklo-(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2S,3S)betamethyl-TrpLys-NH?

Fmoc-Linker-BHA pryskyřice (720 mg, 0,4 mmol) z příkladu 29 se podrobí syntéze v pevné fázi postupem výše uvedeným v Protokolu 1. Veškeré kondenzační reakce se provádí za použití HBTU v DMF jako kondenzačního činidla a DIPEA (3 ekv.) jako báze. Postupně proběhne šest kondenzačních cyklů s Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(2S,3S)betamethyl(nMes)Trp (616 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), • ·

282

Fmoc-(D) Phe (480 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg,

1,2 mmol) a HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Pryskyřice se zpracuje ve stupních 1-5 Protokolu 1, promyje dichlormethanem (třikrát) a reaguje po dobu 30 minut s 2 ml anhydridu kys.valerové v 6% DIPEA/dichlormethan. Pryskyřice se přefiltruje a postupně promyje pokaždé 50 ml dichlormethanu (dvakrát), isopropanolu a dichlormethanu (třikrát). Pryskyřice se vakuově vysuší za vzniku 1,0 g pentylhexapeptidové pryskyřice.

Tato pentylhexapeptidová pryskyřice reaguje po dobu 180 minut při okolní teplotě s 100 gL ethandithiolu, 100 /xL dimethylsulfidu, 250 /xL anisolu a 10 ml kyseliny trifluoroctové. Pryskyřice se odfiltruje, promyje ~2 ml kyseliny trifluoroctové a filtráty se vysráží v chlazeném ethyletheru. Sraženiny se odstředí a etherová vrstva dekantuje. Pevný podíl se promyje dvěma nebo třemi díly Et₂O a opět odstředí a surový lineární produkt se vakuově vysuší za vzniku 180 mg šedobílého pevného produktu. Surový peptid se cyklizuje bez dalšího precisteni.

180 mg surových lineárních peptidů se rozpustí v 220 ml DMF, načež se přidá 500 /xL N-methylmorfolinu, čímž se dosáhne hodnoty pH 8,0. Přidá se 280 mg BOP a cyklizace se monitoruje vysokorychlostní kapalinovou chromatografií. Obvykle je cyklizace ukončena během 18-24 hodin. Reakce se ukončí přidáním 10 ml vody, DMF se vakuově odpaří a vzniklá reakční směs se přečistí vysokorychlostní kapalinovou chromatografií.

Tato surová cyklická látka se přečistí preparativní vysokorychlostní kapalinovou chromatografií na koloně Vydac Cl8 (2,5x20 cm), eluční soustava s lineárním gradientem 20-60 % B (pufr A: 0,1 % kys. trifluoroctová/voda, pufr B: 0,1 % kys. trifluoroctová/CH₃CN), 90 min., rychlost toku 8 ml/min., detekce 280 nm. Analýzou jímaných frakcí pomocí vysokorychlostní kapalinové chromatografie se stanoví hlavní pík, který se izoluje a lyofilizuje za vzniku 40 • ·

283 ..........

mg (10 %) bílého amorfního prášku. Tato sloučenina je homogenní (stanovení vysokorychlostní kapalinovou chromatografií).

LR - hmotnostní spektrometrie (elektrosprej) pro C55H74N12O8 vypočteno: 1031 naměřeno: m/z (1032 M+H).

Příklad biologického účinku:

Příklad A: Stanovení agonistického účinku

Postup

Popis: Buňky HEK 293 transfektované buď MC-4 receptorem nebo MC-1 receptorem se kultivují v 96 kultivačních miskách. Buňky jsou stimulovány buď lOOnM NDP-oMSH nebo screeningovými sloučeninami. Cyklický AMP se z buněk extrahuje a koncentrace se stanoví pomocí zkoušky Biotrak-cAMP SPA. Jako agonisté byly stanoveny ty sloučeniny, které způsobily zvýšení cAMP.

Buněčná kultura: Buňky HEK 293 transfektované buď MC-4 receptorem nebo MC-1 receptorem se kultivují v baňkách o objemu 75cm³ v D-MEM doplněném 10% FCS a 500gM/ml G418. Buňky reagují s trypsinem a rozdělí se v poměru 1:3 do 96 kultivačních misek s plochým dnem pro kultivaci tkáňových kultur. Buňky jsou souvisle stimulovány (2-4 dny).

cAMP odezva: Sloučeniny postupně zřeďované ve 100% DMSO se následně zředí v poměru 1:200 (2,5gl dané sloučeniny + 500gl kultivačního prostředí) v D-MEM obsahujícím 10% FBS a 0,1 mM IBMX. U nestimulovaných buněk se přidá 2,5 gl DMSO k 500gl kultivačního prostředí. U buněk stimulovaných • * • ·

NDP-aMSH se 2,5 μί 20μΜ NDP-aMSH ve 100% DMSO přidá k500gl kultivačního prostředí (konečná koncentrace lOOnM). Konečná koncentrace DMSO ve všech kultivačních miskách je 0,5%.

Pozn.: Ke každému vzorku kultivujeme v oddělených miskách jeho duplikát.

Kultivační prostředí se odstraní ze všech 96 kultivačních misek a nahradí se 200μ1 výše uvedených roztoků do příslušných misek. Misky se inkubují po dobu hod při okolní teplotě. Kultivační prostředí se odstraní a misky se lx promyjí 200 μΐ PBS. cAMP se extrahuje přidáním 60 μ\ 70% etanolu (uchovávaného v chladném prostředí). Po 30 min extrakce se 10 μΐ cAMP převede do misek pro stanovení cAMP nebo se uchovává při teplotě -20°C do doby, než se stanovení provádí.

Stanovení cAMP: Extrahované vzorky a všechna činidla necháme dosáhnout okolní teploty. Do kultivační misky OptiPlate (96 jamek) se přidá 10 μΐ etanolového extraktu, 40 μΐ stanovovacího pufru, 50 μΐ [1251] cAMP, 50 μΐ antiséra a 50 μΐ SPA. Celkový objem v miskách bude 200 μί. Misky se neprodyšně uzavřou a nechají inkubovat při okolní teplotě po dobu 15-20 hodin. [125I]cAMP vázaného na SPA se stanoví analýzou obsahu každé misky po dobu min na přístroji Packard TopCount™.

Pozn.: Každá miska obsahovala kontrolní vzorky pro nestimulované buňky a NDP-aMSH pro stimulované buňky.

Výsledky analýzy jsou obsaženy v následující tabulce I.

• · v * · ·

Tabulka I

Příklad	Sloučeniny	MC-1 (EC50nM)	MC-4 (EC50nM)
30	Ac-Nle-cyklo(D-K)-Asp-His-(D)Phe-Arg-TrpLys-NH2	0,6	0,6
31	Pentacyklo(D-K)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lysnh2	654	9,2
32	Pentacyklo(D-K)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2)NalLys-NH2	310	7
34	Cyklo(k.j antarová-K)-k.j antarová- Asp-Apc(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2	985	6,4
35	Cyklo(k.maleinová-K)-k.maleinová- Asp-Apc(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2		2,9
36	Cyklo(k.ftalová-K)-k. ftalová- Asp-Apc-(D)PheArg-Trp-Lys-NH2	2150	3,1
38	Pentacyklo(D-K)-Asp-4-MeOApc-(D)Phe-ArgTrp-Lys-NH2	999,999	8,4
40	Pentacyklo(D-K)-Asp-4-iPrOApc-(D)Phe-ArgTrp-Lys-NH2	50% 50μΜ	6,1
41	Pentacyklo(D-K)-Asp-3-MeOApc-(D)Phe-ArgTrp-Lys-NH2	76	1,5
42	Pentacyklo(D-K)-Asp-4-ClApc-(D)Phe-Arg-TrpLys-NH2	796	2,2
43	Pentacyklo(D-K)-Asp-4-MeApc-(D)Phe-Arg-TrpLys-NH2	719	2,2
44	Pentacyklo(D-K)-Glu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lysnh2	168	1,3
45	Pentacyklo(D-K)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lysnh2	154	1,1
46	Pentacyklo(D-K)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lysnh2	848	2,5
47	Pentacyklo(D-K)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lysnh2	1180	6,9
48	Ac-cyklo(D-K) -Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lysnh2	2969	7,4
59	Pentacyklo(D-K)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Arg-TrpLys-NH2	2130 (PA)	4
60	Pentacyklo(D-K)-As-5-MeO(D,L)Atc-(D)PheArg-Trp-Lys-NH2		4,8
62	Pentacyklo(D-K)-As-5-iPrO(D,L)Atc-(D)PheArg-Trp-Lys-NH2		7,3
64	Pentacyklo(D-K)-As-5-Et(D,L)Atc-(D)Phe-ArgTrp-Lys-NH2	422	8,4
65	Pentacyklo(D-K)-As-5-iPr(D,L)Atc-(D)Phe-ArgTrp-Lys-NH2		6,7
72	Pentacyklo(D-K)-Asp-Appc-(D)Phe-Arg-TrpLys-NH2	268	3,6

* » · ·

286

73	Pentacyklo(D-K)-Asp-2-MeAppc-(D)Phe-ArgTrp-Lys-NtL	213	3,2
74	Pentacyklo(D-K)-Asp-2-iPrAppc-(D,L)Atc(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH2		10
75	Pentacyklo(D-K)-Asp-3-MeApcc-(D)Phe-ArgTrp-Lys-NH2	221	2,6
76	Pentacyklo(D-K)-Asp-4-MeAppc-(D)Phe-ArgTrp-Lys-NH2	770	6,3
77	Pentacyklo(D-K)-Asp-4-ClAppc-(D)Phe-ArgTrp-Lys-NH2	330	9,1
78	Pentacyklo(D-K)-Asp-4-PhOAppc-(D)Phe-ArgTrp-Lys-NH2		6,7
79	Pentacyklo(D-K)-Asp-3-MeOAppc-(D)Phe-ArgTrp-Lys-NH2		4,7
81	Pentacyklo(D-K)-Asp-Achc-(D)Phe-Arg-TrpLys-NH2	160	6,3
82	Pentacyklo(D-K)-Asp-Abc-(D)Phe-Arg-Trp-Lysnh2	941	4,2
83	Pentacyklo(D-K)-Asp-Ape-(D)Phe-Arg-Trp-Lysnh2	510	1,4

Příklad Β: Inj ekčí roztoky mohou mít následuj ící složení:

Sloučenina obecného vzorce I 3,0 mg

Želatina 150,0 mg

Fenol 4,7 mg

Voda pro injekční roztoky ad 1,0 ml

Claims (49)

1. PATENTOVÉ NÁROKY *· **

   I · · ♦ · »

   4 9 4 4 · » ’ ·»»··** * pt/

   287

   1. Sloučenina obecného vzorce ve kterém

   R¹ a R¹² tvoří společně s X a Y fenylový kruh a X je atom uhlíku a Y je atom uhlíku; nebo

   R¹ je atom vodíku, skupina nebo skupina ^R2—c-nh-ch—c-nh—; ; a

   R je atom vodíku, přičemž X a Y jsou buď atomy uhlíku a mezi X a Y je dvojná vazba, nebo X a Y jsou oba skupina CH a mezi X a Y je jednoduchá vazba;

   R je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku nebo alkinylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku;

   R¹⁴ je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku;

   n je 0 nebol; a

   Q je skupina • · • 9 ···· • · ·

   9· * • to toto toto ···· « * · • · · to · · · i „to to · « · to ♦· · · * ·. * ·· ·· · · ¹⁴ . V nebo / \ . R” R'3 přičemž R³, R⁴ a R⁵ jsou nezávisle atom vodíku, atom halogenu, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupina nebo alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž jestliže R⁴ není atom vodíku, R³ a R⁵ jsou oba atomy vodíku; a R⁶ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, alkoxyskupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, fenoxyskupina nebo atom halogenu;

   R¹¹ a R¹³ jsou každý nezávisle atom vodíku, alkylová skupina obsahující 3 nebo 4 atomy uhlíku nebo cykloalkylová skupina obsahující 5 nebo 6 atomů uhlíku nebo R a R jsou oba fenylová skupina;

   R⁷ je atom kyslíku nebo skupina NH;

   R⁸ je atom vodíku nebo methylová skupina;

   R⁹ je skupina

   R¹⁰ je atom vodíku nebo methylová skupina;

   p je 0 nebo 1;

   m je 0,1, 2 nebo 3; a θ

   Z je skupina II nebo —S—s— · a —C—NH—

   R je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina;

   a její farmaceuticky přijatelné soli.

   • ·

   289 • > · · • · ♦ • · · · · • · · · · • · · · • · · ·
2. 2. Sloučenina obecného vzorce

   19

   R a R tvoří společně s X a Y fenylový kruh a X je atom uhlíku a

   Y je atom uhlíku; nebo

   R2-(NH)_n-C-NHR je atom vodíku, skupina Π o

   nebo re—c-nh-ch—c-nh—_: a

   R¹² je atom vodíku, přičemž X a Y jsou buď atomy uhlíku a mezi X a Y je dvojná vazba, nebo X a Y jsou oba CH a mezi X a Y je jednoduchá vazba;

   R je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku nebo alkinylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku;

   R¹⁴ je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku;

   n je 0 nebol,

   R³, R⁴ a R⁵ jsou nezávisle atom vodíku, atom halogenu, alkylová skupina • · • · • · • · • ·

   290 obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, hydroxyskupina nebo alkoxyskupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, přičemž jestliže R⁴ není atom vodíku, R a R jsou oba atomy vodíku;

   R⁷ je atom kyslíku nebo skupina NH;

   Q

   R je atom vodíku nebo methylová skupina;

   R⁹ je skupina

   R¹⁰ je atom vodíku nebo methylová skupina;

   p je 0 nebo 1;

   m je 0, 1, 2 nebo 3; a

   Z je skupina || —C— nh— nebo

   Ύ

   R je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina; a její farmaceuticky přijatelné soli.
3. 3. Sloučenina podle patentového nároku 2 vyznačená tím, že X a Y jsou každý skupina CH a vazba mezi X a Y je jednoduchá vazba; Z je skupina

   O —c—nh— • ·

   291

   R⁷ je atom kyslíku;

   R¹ je skupina

   O lí

   Ft²—C— NH-,

   R je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku; a R¹⁰ a R¹² jsou oba atomy vodíku.
4. 4. Sloučenina podle patentového nároku 3 vyznačená tím, že se jedná o sloučeninu pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH2.
5. 5. Sloučenina podle patentového nároku 2 vyznačená tím, že Z je skupina ₀

   II .

   — C—NHR⁷ je skupina NH;

   R¹ je atom vodíku, skupina nebo

   R² je alkylová skupina; a

   R¹⁰ a R¹² jsou oba atomy vodíku; a n a R¹⁴ mají význam uvedený v patentovém nároku 2.

   -NHR2—(NH)_n— _R! Γ l

   R²-C-NH-CH-C-NH-;

   292
6. 6. Sloučenina podle patentového nároku 5 vyznačená tím, že X a Y jsou každý skupina CH a vazba mezi X a Y je jednoduchá vazba; n je 0; a R⁹ je skupina
7. 7. Sloučenina podle patentového nároku 6 vyznačená tím, že se jedná o pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Lys-NH2 nebo pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-N-methyl(2)Nal-Lys-NH₂.
8. 8. Sloučenina podle patentového nároku 5 vyznačená tím, že Z je skupina _o

   C—NH

   R⁷ je skupina NH; R¹ je skupina

   R²-(NH)_n-C--NH—;

   θ

   R² je alkylová skupina; a R¹⁰ a R¹² jsou oba atomy vodíku; R⁹ je skupina

   CH-R¹⁷ má význam uvedený v patentovém nároku 2.

   • · ··· ··· ·· · ···· ····· ·· · • ·····*· ·· ··· · ·

   293 ’·.* t ’«·* *·. .. ··
9. 9. Sloučenina podle patentového nároku 5 vyznačená tím, že X a Y jsou každý skupina CH a vazba mezi X a Y je jednoduchá vazba; a jeden z R³, R⁴ a R⁵ je atom vodíku, atom halogenu nebo alkylová skupina a ostatní jsou atomy vodíku.
10. 10. Sloučenina podle patentového nároku 9vyznačená tím, že se jedná o pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-4-MeApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, pentacyklo(Glu-Lys)-Glu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, pentacyklo(Asp-Om)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Om-NH₂, pentacyklo(Asp-Dbr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dbr-NH₂, pentacyklo(Asp-Dps)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂, nebo

    Ac-cyklo(Asp-Dpr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂.
11. 11. Sloučenina podle patentového nároku 8 vyznačená tím, že

    X a Y jsou každý skupina CH a vazba mezi X a Y je jednoduchá vazba; a R¹ je skupina

    R2 (NH)—jj—NH—;

    O jeden z R³, R⁴ a R⁵ js alkoxyskupina a ostatní jsou atomy vodíku; a n je 0.
12. 12. Sloučenina podle patentového nároku 11 vyznačená tím, že se jedná o pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-4-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, • · pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-4-EtOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-4-iPrOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-3-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-4-OHApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ nebo pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-4-ClApc-(D)Phe-Arg-Trp-LysNH₂.

    294
13. 13. Sloučenina podle patentového nároku 8 vyznačená tím, že každý z R¹, R³, R⁴, R⁵, R⁸ a R¹⁰ je atom vodíku;

    R⁷ je skupina NH;

    R je skupina

    CH-R'⁷ « 17 p je 0; a R má význam uvedený v patentovém nároku 2.
14. 14. Sloučenina podle patentového nároku 13 vyznačená tím, že se jedná o cyklo(k.j antarová-Lys)-k.j antarová-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, cyklo(k.maleinová-Lys)-k.maleinová-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-LysNH₂, cyklo(k.jantarová-Dpr)-k.jantarová-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂, nebo cyklo(k.maleinová-Dpr)-k.maleinová-Apc-(D)Phe-Arg-TrpDpr-NH₂.

    • · • ·

    295
15. 15. Sloučenina podle patentového nároku 2 vyznačená tím, že R¹ a R¹² tvoří společně s X a Y fenylový kruh.
16. 16. Sloučenina podle patentového nároku 15 vyznačená tím, že se jedná o cyklo(k.ftalová-Lys)-k.ftalová-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, cyklo(k. ftalová-Dpr)-k. ftalová- Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂, Ac-Nle-cyklo(Cys-Cys)-Cys-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂ nebo cyklo(k.maleinová-Dpr)-k.maleinová-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH₂.
17. 17. Sloučenina obecného vzorce vyznačena R¹ je atom vodíku,

    R²—(NK)_nskupina nebo skupina rs-^-c-nh-ch—c-nh·

    R je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku nebo alkinylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku;

    • ·

    296

    R¹⁴ je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku;

    n je 0 nebol;

    R⁶ je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomů uhlíku, alkoxyskupina obsahující 1 až 3 atomy vodíku, fenoxyskupina nebo atom halogenu;

    R je atom kyslíku nebo NH skupina;

    R⁸ je atom vodíku nebo methylová skupina;

    R⁹ je

    R¹⁰ je atom vodíku nebo methylová skupina; p je 0 nebol; m je 0,1, 2 nebo 3; a Z je o

    II — C—NH-nebo —S—s—; a

    R¹⁷ je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina a její farmaceuticky přijatelné soli.

    • ·

    297
18. 18. Sloučenina podle patentového nároku 19 vyznačená tím, že Z je O —C—NH— .

    R⁷ je skupina NH;

    R' je

    R2__C—NH- ,

    R² je alkylová skupina;

    R⁸ a R⁹ jsou každý atom vodíku; a R⁹ je skupina

    CH-R1⁷ a

    R¹⁷ je definován v patentovém nároku 2.
19. 19. Sloučenina podle patentového nároku 18 vyznačená tím, že R⁶ je atom vodíku nebo alkylová skupina.

    298 ’··’ · ........
20. 20. Sloučenina podle patentového nároku 19 vyznačená tím, že se jedná o pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-2-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-2-iPrAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-3-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, nebo pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-4-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.
21. 21. Sloučenina podle patentového nároku 19 vyznačená tím, že R⁶ je atom halogenu.
22. 22. Sloučenina podle patentového nároku 23 vyznačená tím, že se jedná o pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-4-ClAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.
23. 23. Sloučenina podle patentového nároku 20 vyznačená tím, že R⁶ je alkoxyskupina nebo fenoxyskupina.
24. 24. Sloučenina podle patentového nároku 20 vyznačená tím, že se jedná o pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-4-PhOAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, nebo pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-3-MeO-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.

    • ·

    299
25. 25. Sloučenina obecného vzorce · r *

    R je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku, nebo alkinylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku;

    R¹⁴ je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku;

    n je 0 nebol;

    R¹¹ a R¹³ jsou každý nezávisle atom vodíku, alkylová skupina obsahující 3 nebo 4 atomy uhlíku, nebo cykloalkylová skupina obsahující 5 nebo 6 atomů uhlíku nebo R¹¹ a R¹³ jsou oba fenylová skupina;

    •7

    R je atom kyslíku nebo skupina NH;

    g

    R je atom vodíku nebo methylová skupina;

    R⁹ je

    9

    R¹⁰ je atom vodíku nebo methylová skupina;

    p je 0 nebol;

    m je 0,1,2 nebo 3; a

    Z je skupina o

    II c NH nebo s S- ; _a

    R¹⁷ je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina a její farmaceuticky přijatelné soli.
26. 26. Sloučenina podle patentového nároku 25 vyznačená tím, že Z je skupina

    O

    II —c—NH—R⁷

    R¹ je skupina NH; je

    R2_

    NH301

    R² je alkylová skupina;

    o 1 Λ

    R a R jsou každý atom vodíku; a R⁹ je skupina

    CH-R¹⁷ ;a

    R¹⁷ je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina.
27. 27. Sloučenina podle patentového nároku 26 vyznačená tím, že jeden z R¹¹ a R¹³ je alkylová skupina nebo cykloalkylová skupina a ten druhý je atom vodíku.
28. 28. Sloučenina podle patentového nároku 27 vyznačená tím, že se jedná o pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-Achc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂₅ pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-Abc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.
29. 29. Sloučenina podle patentového nároku 26 vyznačená tím, že jeden z

    1 τ

    R a R je fenylová skupina a ten druhý je atom vodíku nebo fenylová skupina.
30. 30. Sloučenina podle patentového nároku 29 vyznačená tím, že se jedná o pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-4-Adpc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.

    · • 9

    302

    R2-(NH)

    -NHo 6¹⁴ Q

    R2_—C-NH-CH-C-NH ';

    nebo

    R² je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku, alkenylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku, nebo alkinylová skupina obsahující 2 až 5 atomů uhlíku;

    R¹⁴ je alkylová skupina obsahující 1 až 5 atomů uhlíku;

    n je 0 nebo 1;

    jeden z R³, R⁴, R⁵ a R⁶ je atom vodíku, atom halogenu, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, nebo alkoxyskupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, a ostatní jsou atomy vodíku;

    >i

    R je atom kyslíku nebo skupina NH;

    R⁸ je atom vodíku nebo methylová skupina;

    R⁹ je skupina • ·

    32.

    R¹⁰ je atom vodíku nebo methylová skupina;

    p je 0 nebo 1;

    m je 0, 1, 2 nebo 3; a

    Z je skupina

    O

    II

    C— NHnebo

    -s—sR¹⁷ je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina a její farmaceuticky přijatelné soli.

    Sloučenina podle patentového nároku 31 vyznačená tím, že Z je skupina

    R¹ je skupina o

    R²— c— NH

    304

    R² je alkylová skupina;

    R³, R⁴, R⁵, R⁸ a R¹⁰ jsou každý nezávisle atom vodíku;

    R⁶ je atom vodíku, atom halogenu, alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, nebo alkoxyskupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku; a

    R⁹ je skupina

    CH-R¹⁷ a R¹⁷ je definován v patentovém nároku 31.
31. 33. Sloučenina podle patentového nároku 32 vyznačená tím, že R⁷ je skupina NH.
32. 34. Sloučenina podle patentového nároku 32 vyznačená tím, že R⁶ je atom vodíku nebo alkylová skupina.
33. 35. Sloučenina podle patentového nároku 34 vyznačená tím, že se jedná o pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-(D,L)-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-5-Me-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-5-Et-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, nebo pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-5-iPr-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.

    • · « · • · ·

    305 ...........
34. 36. Sloučenina podle patentového nároku 31 až 33 vyznačená tím, že R⁶ je atom halogenu.
35. 37. Sloučenina podle patentového nároku 36 vyznačená tím, že se jedná o pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂ nebo pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-5 -ClAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂..
36. 38. Sloučenina podle patentového nároku 31 až33vyznačená tím, že R⁶ je alkoxyskupina.
37. 39. Sloučenina podle patentového nároku 38 vyznačená tím, že se jedná o pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-5-MeO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-5-Eto-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, nebo pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-5-iPrO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂.
38. 40. Sloučenina podle patentového nároku 31 nebo 32 vyznačená tím, že R⁷ je atom kyslíku a R⁶ je atom halogenu.
39. 41. Sloučenina podle patentového nároku 40 vyznačená tím, že se jedná o pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂ , nebo pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH₂.

    • * · ·

    306 • · · • · · · · • · · · · • · · · ♦ « ·♦
40. 42. Sloučenina podle patentového nároku 31 vyznačená tím, že Z je skupina -S-S-;

    R¹ je skupina

    R2-(NH)„-jj-NHo nebo

    R2-C-NH-CH-C-NH—~

    R³, R⁴, R⁵, R⁸ a R¹⁰ jsou atomy vodíku;

    R⁶ je atom vodíku, nebo atom halogenu;

    R⁷ je skupina NH;

    R⁹ je skupina

    CH-R¹⁷ přičemž R¹⁷ je definován výše.
41. 43. Sloučenina podle patentového nároku 42 vyznačená tím, že se jedná o

    Ac-Nle-cyklo(Cys-Cys)-Cys-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂, pentacyklo(Cys-Cys)-Cys-5-Br(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH₂, pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH₂, nebo pentacyklo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2S,3S)betamethyl-Trp-LysNH₂.

    ♦ · ··· ·
42. 44. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce vyznačený tím, že

    R¹ až R¹², m , p, Q, X, Y a Z jsou definovány v patentových nárocích 1 až

    43.

    a že zahrnuje tvorbu laktamové vazby nebo disulfidové vazby v pozici Z v lineárních peptidech jako prekurzorech.
43. 45. Farmaceutická kompozice vyznačená tím, že zahrnuje sloučeniny podle kteréhokoli zpatentovách nároků 1 až 43 a terapeuticky inertní nosič.
44. 46. Použití sloučenin podle kteréhokoli z patentových nároků 1 až 43 pro přípravu léčiv užívaných k léčbě a/nebo profylaxi onemocnění souvisejících s účinkem melanokortin-4-receptoru.
45. 47. Způsob léčení a/nebo profylaxe onemocnění souvisejících s účinkem melanokortin-4-receptoru vyznačený tím, že zahrnuje podávání sloučeniny podle kteréhokoli z patentových nároků 1 až 43 člověku nebo zvířeti.

    ·· ····

    308
46. 48. Použití nebo způsob podle patentového nároku 46 nebo 47 vyznačený tím, že onemocněním je obezita.
47. 49. Sloučenina podle kteréhokoli z patentových nároků 1 až 43 vyznačená tím, že je vyráběna postupem podle patentového nároku

    44.
48. 50. Sloučeniny podle kteréhokoli z patentových nároků 1 až 43 vyznačené tím, že jsou užívány jako terapeuticky účinné látky, zejména jako terapeuticky účinné látky pro léčení a/nebo profylaxi onemocnění souvisejících s účinkem melanokortin-4-receptoru.
49. 51. Nové sloučeniny, nové farmaceutické kompozice a postupy, stejně tak jako použití těchto sloučenin výše popsaným způsobem.