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Die
Erfindung betrifft Mikroorganismen mit einem Modulator-Effekt der
Oberflächenglycosylierung oder
der Zuckerzusammensetzung auf der Oberfläche von intestinalen Zellen
(Darmzellen) sowie ein Verfahren zur Selektion der genannten Mikroorganismen
und deren Verwendungen auf den Gebieten von Nahrungsmitteln und
der Medizin.
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Die
Magen-Darm-Schleimhaut besteht aus einer einfachen Schicht aus Epithelialzellen,
die zumindest teilweise seitens der Darmöffnung mit einer viskoelastischen
Schicht aus hauptsächlich
Glycokonjugaten bedeckt ist. Die Epithelialzellen synthetisieren
die auf deren Oberfläche
vorliegenden Glycokonjugate, die Zwischenprodukte zahlreicher Wechselwirkungen,
insbesondere mit Lectinen oder Adhäsinen, mit bakteriellen Toxinen
oder mit Antikörpern,
Bakterien, Viren und mit Parasiten, sind. Diese Glycokonjugate stellen
daher wichtige Zwischenprodukte in den Beziehungen zwischen dem
Wirt und der Darmflora dar.
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Diese
Glycokonjugate sind, wie ihr Name besagt, glycosylierte Verbindungen,
d.h., auf die mehr oder weniger lange und gegebenenfalls verzweigte
Zuckerketten gepfropft sind. Im gesunden menschlichen Darm können diese
Zucker Galactose (Gal), Fucose (Fuc), Acetylneuraminsäure oder
Sialinsäure,
N-Acetylglucosamin (GlcNAc), N-Acetylgalactosamin (GalNac) sein,
die miteinander durch unterschiedliche Bindungen verbunden sind.
Drei von ihnen können
in terminaler Position vorliegen; dabei handelt es sich um Galactose,
Fucose und um Sialinsäure.
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Der
Wirt und seine Darmmikroflora fungieren wie ein komplexes System,
worin die Mikroflora eine bedeutsame Wirkung auf den Wirt ausübt. Im Fall
nicht-pathogener oder probiotischer Mikroorganismen ergibt sich
oft eine symbiotische Beziehung oder Kooperation zwischen dem Wirt
und den Mikroorganismen, wobei das Vorhandensein der letzteren für ein gutes
Gleichgewicht und die gute Funktionsweise des Darms des Wirts notwendig
ist. Dagegen kann das Vorhandensein pathogener Mikroorganismen,
seltener, negative Konsequenzen haben, indem das Vorhandensein probiotischer
Mikroorganismen behindert oder verringert ist, und zwar sogar indem
eine parasitäre
Wirkung ausgeübt
wird, die sich ganz direkt für
den Wirt schädlich
auswirkt.
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Das
fragile Gleichgewicht zwischen Wirt und Mikroflora hängt direkt
mit der Darmumgebung und insbesondere mit dem quantitativen und
qualitativen Vorliegen von Oberflächen-Glycokonjugaten zusammen. Tatsächlich weiß man, dass
bestimmte probiotische oder pathogene Mikroorganismen empfindlich
gegenüber bestimmten
Zuckern in terminaler Position sind. Die Darmbakterien können das
Glycosylierungsschema der auf der Oberfläche der Darmzellen vorliegenden
Glycokonjugate modulieren, ohne dass deren Wirkmodus vollkommen
aufgeklärt
wäre, wie
dies nachfolgend noch zu sehen sein wird. Die Bakterien können einerseits das
Vorliegen des einen oder anderen Zuckers bei der Glycosylierung
induzieren und andererseits die in terminaler Position einer Kette
vorliegenden Zucker abbauen, wodurch die in terminaler Position
vorliegenden Zucker qualitativ und/oder quantitativ modifiziert
werden.
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Diese
Modulation des Oberflächen-Glycosylierungsschema
der Epithelialzellen bringt eine Modifikation der Darmumgebung mit
sich, wobei die modifizierte Umgebung die Implantation bestimmter
Mikroorganismen begünstigen
und/oder die Implantation weiterer Mikroorganismen einschränken und
sogar verhindern kann. Eine Modifikation der Umgebung, die gegebenenfalls
durch die Mikroflora erzeugt ist, hat somit eine direkte Auswirkung
auf das Gleichgewicht zwischen Wirt und Mikroflora.
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Es
wäre daher
sehr interessant, über
ein Modell zu verfügen,
mit dem es ermöglicht
ist, Mikroorganismen als Funktion ihrer Wirkung auf das Glycosylierungsschema
rasch und leicht zu selektieren. Auf diese Weise könnte man
Mikroorganismen identifizieren, die das Vorhandensein des einen
oder anderen Zuckers und dadurch eine Implantation vorteilhafter
Mikroorganismen wie z.B. probiotischer Mikroorganismen begünstigen und/oder
die Implantation pathogener Mikroorganismen unterbinden.
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Tatsächlich sind,
nach Kenntnis der Anmelderin, bis zum heutigen Tag Mikroorganismen,
insbesondere Milchsäurebakterien,
nicht identifiziert worden, die die Befähigung aufweisen, ganz fein,
mit Präzision,
auf das Glycosylierungsschema einzuwirken und auf diese Weise mit
Präzision
dieses Glycosylierungsschema und dadurch die Implantation von Mikroorganismen
zu modulieren.
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Derartige
Modulator-Mikroorganismen des Glycosylierungsschema könnten eine
Verwendung insbesondere in pharmazeutischen oder Nahrungsmittel-
oder Nahrungsmittelergänzungszusammensetzungen
finden. Tatsächlich
kann es mit ihnen ermöglicht
werden, die Funktionsweise von Darmzellen und das gute Gleichgewicht
der Mikroflora zu optimieren.
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BioEssays,
1998, 20:336-343, worin u.a. Bezug auf Science 1996, 273:1380-1383,
genommen wird, beschreibt Verfahren, in denen die Mikroorganismen
in vivo inkubiert und die Expression von Genen analysiert werden.
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Diese
Dokumente sowie das Dokument Digestive and Liver Disease, 2000,
32(S1):A29, Kurzfassung Nr.: 100) beschreiben Milchsäurebakterienstämme, die
eine Modulation der Oberflächenglycosylierung
von Darmepithelialzellen induzieren.
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Das
Dokument WO-A-99/29 833 beschreibt die Verwendung eines Milchsäurebakterienstammes
zur Zubereitung einer Nahrungsmittelzusammensetzung. Das Dokument
WO 99/29 833 beschreibt einen neuen Bakterienstamm, der gewisse
Eigenschaften, z.B. antimikrobielle Aktivität, aufweist. Allerdings sind
dessen Wirkmodalitäten
nicht im Detail angegeben, und insbesondere ist die Frage nach der
etwaigen Wirkung des Bakterium auf die Zucker in keiner Weise angesprochen.
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Bry
L. et al. haben in "A
model of host-microbial interactions in an open mammalian ecosystem", Science, Band 273,
S. 1380-1383, 6. Sept. 1996, in vivo (bei der Maus) den Einfluss
von Bakteroiden thetaiotaomicron auf die Fucosylierung untersucht.
Bakteroide thetaiotaomicron sind an der Darmflora beim Mensch und bei
der Maus beteiligt. Das angewandte Modell ist allerdings auf die
Untersuchung der Fucosylierung unter Ausschluss weiterer Glycosylierungstypen
begrenzt. Andererseits stellt es ein in vivo-Modell dar und läuft somit
langwieriger und komplexer als ein in vitro-Modell ab.
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Jedenfalls
ist es mit diesem Modell ermöglicht
worden, die Hypothese der Existenz eines löslichen Faktors aufzustellen,
der von B. thetaiotaomicron ausgeschieden wird und die Rolle eines
Signals spielen würde,
um eine Modifikation der Oberflächenglycosylierung
herbeizuführen.
Dieser lösliche
Faktor, der noch nicht identifiziert ist, würde somit wirken, ohne dass
er in direktem Kontakt zwischen den Bakterien und den Zielstellen
stehen würde.
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Gemäß Kenntnis
der Anmelderin ist bis zum heutigen Tag kein Verfahren entwickelt
worden, mit dem es ermöglicht
wäre, auf
leichte und rasche Weise unterschiedliche Mikroorganismen, insbesondere
unterschiedliche Milchsäurebakterienstämme, als
Funktion ihrer präzisen
Wirkung auf das Glycosylierungsschema der Darmepithelialzellen und
ganz präzise
auf die Modulation oder Variation der Zusammensetzung eines jeden
der Zucker in vitro zu selektieren.
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Im
Rahmen des vorliegenden Patents bezeichnet der Begriff "Milchsäurebakterien" Bakterien, die empfänglich sind,
Milchsäure
zu produzieren, und insbesondere nicht-pathogene Bakterien, ausgewählt aus der
Gruppe, umfassend Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium
und Leuconostoc, insbesondere B. breve, B. longum, L. lactis, S.
thermophilus, L. casei, L. helveticus und L. bulgaricus. Gegenstand der
vorliegenden Erfindung ist daher ein in vitro-Selektionsverfahren, das die folgenden
Stufen umfasst:
- – Inkontaktbringen des Kulturüberstands
des Mikroorganismenstamms, insbesondere von Milchsäurebakterien,
mit den Zellen eines Zelllinienmodells, das Darmepithelialzellen
darstellt,
- – Inkubation,
- – Extraktion
der Zellen und Inkubation mit verschiedenen an ein Fluorochrom gekoppelten
Lectinen,
- – Waschen,
- – Messung
der mittleren Fluoreszenzintensität (IFM) jedes Lectins und Vergleich
mit den an einer Vergleichsprobe durchgeführten Messwerten zur Bewertung
der durch die Bakterien induzierten IFM-Abweichung und Selektion
des Stamms von Mikroorganismen, welcher eine Abweichung um mindestens
20 % für
mindestens einen Zucker induziert.
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Diese
letztere Stufe kann insbesondere an Platten durchgeführt werden,
wobei der Messwert für
die IFM mit einer Sonde gemäß für den Fachmann
bekannten Verfahrenstechniken oder mit Fließ-Zytometrie gemessen wird.
Im Fall der Fließ-Zytometrie
kann der Vergleich des erhaltenen Diagramms, das die Entwicklung der
Fluoreszenz als Funktion der Zahl von Zellen darstellt, mit demjenigen
Diagramm erfolgen, das mit einer Vergleichsprobe erhalten wird,
worauf der Stamm von Mikroorganismen selektiert wird, der eine Abweichung des
Gangs des Diagramms induziert.
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Man
verwendet in diesem Selektionsverfahren ein Modell, dessen jedwede
Zelllinie Darmepithelialzellen darstellt. Der Fachmann weiß ein geeignetes
Linien-Modell unter den bekannten Modellen, z.B. den Linien Caco-2
oder HT29-MTX, auszuwählen,
die in Kultur krebsartige Darmepithelialzellen sind. Diese Linien
gelten als Linien, mit denen alle oder ein Teil der Regulationsmechanismen
von in vivo-Systemen und insbesondere die Produktion von Glycokonjugaten
reproduziert werden. Jede Linie, die diese Charakteristik aufweist,
kann im Verfahren gemäß der Erfindung
eingesetzt und verwendet werden. Bezüglich der Linie HT-29-MTX kann Bezug
genommen werden auf Lesuffleur et al., "Growth adaptation to methotrexate of
HT-29 human colon carcinoma cells is associated with their ability
to differentiate into columnar absorptive and mucus-secreting cells", 1990, Cancer Res.
50:6334-6343.
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Man
führt eine
Zentrifugation und Filtration des Kulturmedium durch, in welchem
jeder Stamm von Mikroorganismen zum Testen inkubiert worden ist,
um am Ende den Überstand
("Versuch") zu extrahieren.
Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, geht die Anmelderin
davon aus, dass der Überstand
den löslichen Faktor
enthält,
der das Modulationssignal der Glycosylierung konstituiert. Der Überstand
konstituiert somit eine Aktivfraktion des Stamms von Mikroorganismen.
Bei Kontakt mit den Darmepithelialzellen werden die eine oder andere
Glycosylierungsmodifikation als Funktion des getesteten Stamms von
Mikroorganismen herbeigeführt.
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Wie
auch bei Bakteroiden ist der lösliche
Faktor als ein Molekül
mit geringem Molekulargewicht (unterhalb 8 kD) und als wärmeempfindlich
identifiziert worden. Man kann unterstellen, dass der lösliche Faktor eines
anderen Stamms ähnliche,
wenn nicht identische Charakteristika aufweist.
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Der
aus dem Kulturmedium, das nicht in Kontakt mit den Bakterien gestanden
ist, erhaltene Überstand wird
als Bezug ("Vergleich") herangezogen.
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Man
bringt eine geeignete Menge der Überstände "Versuch" und "Vergleich" in das Kulturmedium,
in welches die Zellen des Zelllinien-Modells, z.B. HT29-MTX, gegeben worden
sind, während
einer geeigneten Zeitspanne ein. Diese Zeitspanne kann z.B. 1 bis
15 Tage betragen.
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In
einer besonderen Ausführungsform
kann man, dem Überstand
Bakterien zufügen.
In diesem Fall kann man die Bakterien in Form einer Suspension in
Gegenwart von Penicillin G und eines starken Puffers zugeben, mit
welchem es ermöglicht
ist, die bakterielle Entwicklung ohne Behinderung der Überlebensfähigkeit
der Bakterien und eine Ansäuerung
des Medium zu inhibieren.
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Nach
dieser Inkubationszeit werden die Zellen des Zelllinien-Modells
abgelöst
und erneut suspendiert, und die gleiche Zahl von "Versuch"- und "Vergleich"-Zellen wird getrennt
mit einem Lectin inkubiert, dessen Spezifität gegenüber Zuckern (der Natur des
Zuckers und der Natur der Bindung) bekannt ist.
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Jedes
Lectin, das an ein Fluorochrom gekuppelt ist, wird an den Zucker
fixiert, für
den es spezifisch ist.
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Die "Versuch"- und "Vergleich"-Zellsuspensionen
werden jeweils mehrmals gewaschen, und die Reaktivität jedes
Lectins wird durch Messung der als IFM (mittlere Fluoreszenzintensität) bezeichneten
Fluoreszenz quantitativ bestimmt.
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Diese
Messung kann mit jeder geeigneten Maßnahme, insbesondere mittels
einer Fließ-Zytometrie (FCScan,
Bancton-Dickinson) oder durch direkte fluorimetrische Messungen
auf Platten, erfolgen.
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Bei
Anwendung der Fließ-Zytometrie
erhält
man für
jedes Lectin ein Diagramm, das die Entwicklung der Fluoreszenz als
Funktion der Zahl von Zellen darstellt. Für jedes Diagramm der Fließ-Zytometrie
entspricht die mittlere Fluoreszenzintensität einem Mittelwert.
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Zwei
Vergleiche sind möglich.
Einerseits kann man, wie bei Messung der Fluoreszenzintensität, die "Versuch"-IFM mit der "Vergleich"-IFM quantitativ
vergleichen. Andererseits kann man, im Fall einer Fließ-Zytometrie, auch
in quantitativer Weise das "Versuch"-Ergebnis mit dem "Vergleich"-Ergebnis und präziser das mit
der "Versuch"-Suspension erhaltene
Diagramm mit dem mit der "Vergleich"-Suspension erhaltenen
Diagramm vergleichen, d.h., den Gang der Kurven vergleichen.
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Man
schätzt
eine Verminderung oder Steigerung dieser IFM um mindestens ca. 20
%, vorzugsweise um mindestens ca. 28 % und noch bevorzugter um mindestens
ca. 35 % ab, was eine signifikante Änderung der Reaktivität jedes
Lectins und somit der Zusammensetzung der Zucker der Glycoproteine
aufzeigt, die auf der Epithelialzellenoberfläche vorliegen.
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Mit
diesem Verfahren ist es somit ermöglicht, auf einfache und rasche
Weise das Vorliegen jedes Lectins auf den Zuckerketten zu beobachten
und zu quantifizieren und somit den Zucker quantitativ zu bestimmen, für den das
Lectin spezifisch ist. Man kann sodann die erhaltenen Werte ohne
und mit Mikroorganismen vergleichen und auf diese Weise die Glycosylierungs-Modulatoreffekte
jedes Stamms von Mikroorganismen bewerten, um schließlich die
Stämme
mit dem gewünschten
Effekt zu selektieren: Vermehrung des einen Zuckers, Verminderung
des anderen.
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Die
Erfindung betrifft auch die Stämme
von Mikroorganismen, insbesondere Milchsäurebakterien, die empfänglich sind,
das Oberflächen-Glycosylierungsschema
von Darmepithelialzellen und ganz besonders die Mikroorganismenstämme, insbesondere
Milchsäurebakterien,
zu modulieren, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Abweichung
des Ganges des mit Fließ-Zytometrie erhaltenen
Diagramms und/oder der mittleren Fluoreszenzintensität um mindestens
ca. 25 % für
mindestens einen Zucker, ausgewählt
aus Galactose (Gal), Fucose (Fuc), N-Acetylneuraminsäure, N-Acetylglucosamin
(GlcNAc) und aus N-Acetylgalactosamin (GalNAc), in einem Test induzieren,
der die folgenden Stufen umfasst:
- – Inkontaktbringen
des Kulturüberstands
des Bakterienstamms mit HT29-MTX-Zellen, dem Zelllinien-Modell,
das die Darmepithelialzellen darstellt,
- – Inkubation,
- – Extraktion
der Zellen und Inkubation mit unterschiedlichen an ein Fluorochrom
gekoppelten Lectinen,
- – Waschen,
- – Messung
der mittleren Fluoreszenzintensität (IFM) jedes Lectins und Vergleich
mit den an einer Vergleichsprobe durchgeführten Messungen zur Bewertung
der durch die Bakterien induzierten IFM-Abweichung.
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Mit
diesen Mikroorganismen ist es daher ermöglicht, die Glycosylierung
zu modulieren und dadurch die Darmumgebung zu erneuern oder zu modifizieren,
um am Ende die Implantation probiotischer Mikroorganismen zu begünstigen
und eine Implantation pathogener Mikroorganismen zu unterbinden
oder einzuschränken.
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Man
weiß beispielsweise,
dass der Rezeptor, der die Adhäsion
von Escherichia coli ermöglicht,
Galactose und Sialinsäure
enthält;
für Streptococcus
pyogenes und Listeria monocytogenes handelt es sich um Galactose;
für Helicobacter
pylori handelt es sich um Fucose; und für Entamoeba histolytica handelt
es sich um Galactose und N-Acetylgalactosamin.
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Die
Stämme
des Erfindungsgegenstands können
insbesondere die folgenden Stämme
sein: Hinterlegungsnr.: CNCM I-2492, Hinterlegungsnr.: CNCM 2-2493,
Hinterlegungsnr.: CNCM 2-2494 (CNCM = Collection Nationale de Cultures
de Mikroorganismes – Institut
Pasteur – 28,
rue du Dr. Roux – 75724
Paris Cedex 15 – Frankreich),
hinterlegt am 20. Juni 2000.
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Man
kann solche Mikroorganismen, insbesondere solche Milchsäurebakterien,
oder deren Aktivfraktion, d.h. die Fraktion, die den löslichen
Faktor umfasst, zur Herstellung und Zubereitung von Nahrungsmittelzusammensetzungen
oder Medikamenten oder von Nahrungsergänzungsstoffen verwenden, die
die Oberflächenglycosylierung
der Darmepithelialzellen modulieren. Diese Zusammensetzungen können einen
einzigen Stamm oder mehrere Stämme
von die Glycosylierung modulierenden Mikroorganismen umfassen.
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Somit
verfügt
man über
Zusammensetzungen, mit denen es ermöglicht ist, ein korrektes Gleichgewicht
von Wirt – Darmmikroflora
beizubehalten oder zu erneuern oder die Implantation des einen oder
anderen Stamms von Mikroorganismen zu begünstigen. Sie ermöglichen
daher auch die Funktionsweise von Darmzellen sowie das gute Gleichgewicht
der Mikroflora zu optimieren. Insbesondere kann man die Milchsäurebakterien
nutzen und in Milchprodukte einbringen.
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Die
in den folgenden Versuchen getesteten Stämme sind als nichteinschränkende Beispiele
angegeben.
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Milchsäurebakterien-in
vitro-Versuche
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Man
führt eine
Zentrifugation und Filtration des Kulturmedium durch, worin während einer
Nacht Milchsäurebakterien
(LAB = Lactic Acid Bacteria) inkubiert worden sind, um am Ende den Überstand
("Versuch") zu extrahieren.
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Die
eingesetzten Stämme
von LAB sind die folgenden: Hinterlegungsnr.: CNCM I-2492, CNCM
I-2493 und CNCM I-2494.
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Der
aus dem Kulturmedium, das nicht mit den Bakterien in Kontakt gestanden
ist, erhaltene Überstand wird
als Bezug ("Vergleich") herangezogen.
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Man
bringt eine optimale Menge für
jeden Überstand
(von 10 bis 30 %) von "Versuch" und "Vergleich" in das Kulturmedium
DMEM ("Dulbecco's Modified Eagle's Medium") ein, in das die
Zelllinie HT29-MTX 5 bis 15 Tage lang gegeben worden ist.
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Nach
dieser Behandlung werden die HT29-MTX-Zellen abgelöst und in
einer PBS-Lösung
("Phosphate Buffered
Saline Solution")
erneut suspendiert, und die gleiche Anzahl von "Versuch"- und "Vergleich"-Zellen wird getrennt mit einem Lectin,
das für
den Zucker (die Natur des Zuckers und die Natur der Bindung) spezifisch
ist, mit einer optimalen Konzentration 30 min lang inkubiert.
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Die
handelsüblichen,
verwendeten Lectine und deren Epitop(e) sind die folgenden:
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Jedes
dieser Lectine wird von EY Laboratories Inc. (San Mateo, CA, USA)
in den Handel gebracht, außer
RCA I, das von Sigma Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, Frankreich) in den
Handel gebracht wird.
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Man
erhält
mit Fließ-Zytometrie
für jeden
Stamm von Milchsäurebakterien
und für
die "Vergleich"- und "Versuch"-Zellen die folgenden
mittleren Fluoreszenzintensitätswerte:
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Auf
diese Weise kann man unmittelbar die Glycosylierungs-Modulatorwirkung
jedes Bakterienstamms feststellen. Beispielsweise kann man feststellen,
dass der Stamm CNCM I-2494 eine Erhöhung von Gal und α-L-Fucose
und eine Verminderung von GalNAc herbeiführt.
