DE60108651T2

DE60108651T2 - Wärmegelierende, biologisch abbaubare, wäßrige Polymerlösung

Info

Publication number: DE60108651T2
Application number: DE60108651T
Authority: DE
Inventors: Moon Byeong JEONG; Anna Gutowska
Original assignee: Battelle Memorial Institute Inc
Current assignee: Battelle Memorial Institute Inc
Priority date: 2000-09-28
Filing date: 2001-09-27
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2021-09-28
Also published as: EP1320359A2; JP5031974B2; ATE287705T1; EP1320359B1; US6841617B2; US20020173586A1; DE60108651D1; JP2004525194A; WO2002026215A3; CA2423488C; AU2001294828B2; CA2423488A1; AU9482801A; WO2002026215A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine wärmegelierende, biologisch abbaubare wässrige Polymerlösungszusammensetzung und Verfahren zur Verwendung solcher Polymere zur Bereitstellung von biologisch abbaubaren Implantaten, die sich in situ bilden.
Materialien, die in situ gelieren, haben kürzlich als vielversprechende implantierbare Arzneistofffreisetzungssysteme sowie als injizierbare Matrizen für den Gewebeaufbau Beachtung gefunden. Es gibt einen aufkommenden Bedarf für Materialien, die biologisch verträglich sind, die Zellproliferation und die Biosynthese fördern, als Träger für physiologische Mittel wirken und einfach gehandhabt und synthetisiert werden können. Materialien, die in situ gelieren, sind dahingehend vielversprechend, dass sie einfach handhabbar sind und ein Beimpfen mit Zellen ermöglichen, das Vermögen zur Bildung einer beliebigen gewünschten Implantatform bieten und so aufgebaut werden können, dass sie biologisch abbaubar und biologisch verträglich sind.
Eine in situ-Gelierung ist die Basis injizierbarer Systeme, die den Bedarf für chirurgische Vorgänge ausschließen und bietet den Vorteil des Vermögens zur Bildung einer beliebigen gewünschten Implantatform. Die Änderung der Molekülassoziation kann durch Änderungen der Temperatur, des pH-Werts oder der Lösungsmittelzusammensetzung induziert werden. Von den Kandidaten für Systeme, die bezüglich Reizen sensibel sind, werden injizierbare Systeme, die frei von organischen Lösungsmitteln sind, unter Verwendung des wärmeempfindlichen Sol-Gel-Übergangs einer wässrigen Lösung gestaltet. Ein solches System ermöglicht ein leichtes Einschließen biologisch aktiver Mittel.
Um als ideales injizierbares System wirken zu können, sollte die wässrige Lösung eines Polymers eine niedrige Viskosität bei den Formulierungsbedingungen aufweisen und unter physiologischen Bedingungen schnell gelieren. Unter Berücksichtigung der biomedizinischen Anwendungen ist auch die biologische Verträglichkeit der Polymere ein wichtiger Punkt. Daher sollte das Material biologisch abbaubar sein und durch Beibehalten seiner wasserreichen Hydrogeleigenschaften sollte es während des Abbaus keine Gewebereizung induzieren.
Die in situ-Gelierung von wässrigem Poloxamer 407 und N-Isopropylacrylamid-Copolymeren wurde bezüglich potenzieller Materialien für injizierbare Arzneistoff-Freisetzungssysteme und auch für Gewebeaufbauanwendungen untersucht. Diese Materialien sind jedoch nicht biolo gisch abbaubar und Tierstudien zeigten eine Zunahme von Triglycerid und Cholesterin nach der intraperitonealen Injektion der wässrigen Poloxamer 407-Lösung.
Kürzlich haben Jeong et al. biologisch abbaubare, in situ gelierende Poly(ethylenglykol-b-(DL-Milchsäure-co-glykolsäure)-b-ethylenglykol)-Triblockcopolymere (PEG-PLGA-PEG-Triblockcopolymere) beschrieben (vgl. das US-Patent 6,117,949). Diese Triblockcopolymere zeigten vielversprechende Eigenschaften als injizierbares Arzneistofffreisetzungssystem. In vivo-Studien in Ratten zeigten, dass die Copolymergele nach einem Monat immer noch vorhanden waren. Während des Abbaus wurde das ursprünglich transparente Gel aufgrund eines bevorzugten Masseverlusts der hydrophilen PEG-reichen Segmente lichtundurchlässig. Diese Änderung der Morphologie und die Erzeugung einer Grenzfläche oder Phase könnte die Proteinarzneistoffe denaturieren oder eine Zellzerstörung beim Gewebeaufbau verursachen. Die in vitro-Freisetzung von Schweinewachstumshormon (PGH) und Insulin von dem in situ gebildeten Gel stoppte nach der Freisetzung von 40 bis 50% der eingebrachten Proteine.
In neuerer Zeit zeigten mehrere Protein/Peptid-Arzneistoffe in klinischen Versuchen eine hervorragende Effizienz und wurden auf den Markt gebracht. Mit dem Aufkommen der Gentechnik werden Proteine/Peptide bald viel gebräuchlichere Arzneistoffe werden. Aufgrund der kurzen Plasmahalbwertszeit und der Instabilität von Proteinen gibt es jedoch einen dringenden Bedarf für geeignete Freisetzungsvehikel. Bestimmte Arzneistoffformulierungen benötigen ein ein- bis zweiwöchiges Freisetzungssystem. Darüber hinaus kann ein ein- bis zweitägiges Freisetzungssystem erforderlich sein. Beispielsweise wird Ifosfamid, ein Arzneistoff, der für Keimzellen-Hodenkrebs verwendet wird, an fünf aufeinander folgenden Tagen intravenös verabreicht. Diese Behandlung wird alle drei Wochen oder nach der Erholung von einer hämatologischen Toxizität wiederholt. Um ein solches Kurzzeit-Freisetzungssystem herzustellen, wurde ein Poly(ethylenglykol), das mit Poly(milchsäure-co-glykolsäure) gepfropft worden ist (PEG-g-PLGA), wobei hydrophiles PEG als Grundgerüst eingesetzt wird, geschaffen. Es wird erwartet, dass dieses Material verglichen mit PEG-PLGA-PEG ein anderes Gelierungs- und Abbauverhalten und folglich ein anderes Arzneistoff-Freisetzungsprofil zeigt.
In der folgenden Literatur sind Verfahren oder Verbindungen beschrieben, die in diesem Bereich nützlich sind:
US-Patent 5,702,717, US-Patent 5,117,949, J. L. Hill-West, S. M. Chowdhury, M. J. Slepian, J. A. Hubbell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5967–5971, R. A. Stile, W. R. Burghardt, K. E. Healy, Macromolecules, 1999, 32, 7370–7379, G. H. Chen, A. S. Hoffman, Nature, 1995, 373, 49–52, J. L. Thomas, H. You, D. Tirrell, J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 2949–2950, M. Malstom, B. Lindman, Macromolecules, 1992, 25, 5446–5450, J. Yang, S. Pickard, N. J. Deng, R. J. Barlow, D. Attwood, C. Booth, Macromolecules, 1994, 27, 670–680, B. Jeong, Y. H. Bae, D. S. Lee, S. W. Kim, Nature, 1997, 388, 860–862, T. P. Johnston, M. A. Punjabi, C. J. Froelich, Pharm. Res., 1992, 9 (3), 425–434, Z. G. M. Wout, E. A. Pec, J. A. Maggiore, R. H. Williams, P. Palicharla, T. P. Johnston, J. Parenteral Sci. & Tech., 1992, 46 (6), 192–200, B. Jeong, Y. H. Bae, S. W. Kim, J. Controlled Releases, 2000, 63, 155–163, B. Jeong, Y. H. Bae, S. W. Kim, J. Biomed. Mater. Res, 2000, 50 (2), 171–177, B. Jeong, A. Gutowska, J. Am. Chem. Soc., 2000, eingereicht, B. Jeong, unveröffentlichte Daten, 2000, IFEX Prescription, http://www.ifex.com/ifpre.html, A Bristol-Meyers Squibb Co., Princeton, NJ 08543, J. R. Bellare, H. T. Davis, L. E. Scriven, Y. Talmon, J. Electron Microsc. Tech 1988, 10, 87–111, G. Wanka, H. Hoffmann, W. Ulbricht, Colloid Polym. Sci., 1990, 268, 101–117, S. Tanodekaew, J. Godward, F. Heatley, C. Booth, Macromol. Chem. Phys., 1997, 198, 3385–3395, G. Odian, in: Principles of Polymerization, 2. Auflage, John Wiley & Sons, Inc., koreanische Studentenausgabe, Korea, 1981, Seite 513, P. Alexandrisdis, J. F. Holzwarth, T. A. Hatton, Macromolecules, 1994, 27, 2414–2425, B. M. Discher, Y.–Y. Won, D. S. Ege, J. C. M. Lee, F. S. Bates, D. E. Discher, D. A. Hammer, Science, 1999, 284, 1143–1146, Y.–Y. Won, H. T. Davis, F. S. Bates, Science, 1999, 283, 960–963, W. Brown, K. Schillen, M. Almgren, S. Hvidt, P. Bahadur, J. Phys. Chem, 1991, 95, 1850–1858, F. Cau, S. Lacelle, Macromolecules, 1996, 29, 170–178, B. Jeong, Y. H. Bae, S. W. Kim, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 1999, 16, 185–193, Z. Zhou, B. Chu, J. Colloid and Interface Science, 1988, 126 (1), 171–180, Y. Deng, G. E. Yu, C. Price, C. Booth, J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1992, 88 (10), 1441–1446, G. Yu, Y. Deng, S. Dalton, Q. G. Wang, D. Attwood, C. Price, C. Booth, J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1992, 88 (17), 2537–2544, B. Jeong, Y. H. Bae, S. W. Kim, Macromolecules 1999, 32, 7064–7069, J. N. Israelachivili, Intermolecular and Surface Forces, Academic Press, New York, 1985, H. Feil, Y. H. Bae, J. Feijen, S. W. Kim, Macromolecules, 1993, 26, 2496–2500, B. Jeong, D. S. Lee, J. I. Shon, Y. H. Bae, S. W. Kim, J. Polym. Sci. Polym. Chem. 1999, 37, 751–760.
Die vorliegende Erfindung stellt eine wärmegelierende, biologisch abbaubare, wässrige Polymerlösung mit einem Polyethylenglykol-Block (PEG-Block) und einem biologisch abbaubaren Polyesterblock bereit, wobei die Blöcke verknüpft sind, um ein Polymer einer allgemeinen Struktur, umfassend die Formel A_n(B), zu bilden, wobei n größer als 2 ist und A aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, B aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, und A unterschiedlich von B ist.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine wärmegelierende, biologisch abbaubare Polymerlösung bereitzustellen, die als Freisetzungssystem für ein biologisch aktives Mittel geeignet ist.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Arzneistoff-Freisetzungssystems, das parenteral injiziert werden kann.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Arzneistoff-Freisetzungssystems, das die Kontrolle der Polymerabbaugeschwindigkeit oder der Gebrauchsdauer eines dauerhaften Gels durch Steuern der Anzahl der Verzweigungen, die mit dem Grundgerüst der Struktur verknüpft sind, oder durch Mischen eines ersten Polymers, das die Formel A_n(B) umfasst, mit mindestens einem anderen Polymer, das die Formel A_n(B) umfasst, wobei das erste Polymer von dem mindestens einen anderen Polymer verschieden ist, ermöglicht.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Arzneistoffabgabesystems, das die Kontrolle der Stabilität von Arzneistoffen und Arzneistoffdosierungen von einem Tag bis zu zwei Monaten ermöglicht.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung von Blockcopolymer-Arzneistofffreisetzungssystemen, die biologisch abbaubar sind.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung von Blockcopolymer-Arzneistofffreisetzungssystemen, welche die gewünschten Freisetzungsraten aufweisen.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung von injizierbaren Blockcopolymer-Arzneistofffreisetzungssystemen, die bei Raumtemperatur oder darunter in Lösung vorliegen und bei oder etwa bei physiologischen Temperaturen gelieren.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung von injizierbaren Arzneistofffreisetzungssystemen, die den Bedarf für chirurgische Verfahren ausschließen und den Vorteil eines Vermögens zur Bildung jeglicher gewünschter Implantatformen bieten.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung von injizierbaren Arzneistofffreisetzungssystemen, die gegenüber Reizen empfindlich sind und frei von organischen Lö sungsmitteln sind, und die durch die Nutzung des wärmeempfindlichen Sol-Gel-Übergangs wässriger Lösungen gestaltet werden.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung einer wässrigen Lösung eines Polymers, die eine niedrige Viskosität bei Formulierungsbedingungen aufweist und unter physiologischen Bedingungen schnell geliert.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung von Arzneistofffreisetzungssystemen, welche die gewünschten Freisetzungsgeschwindigkeiten durch Variieren des Verhältnisses eines Polyethylenglykol-Blocks (PEG-Blocks) und eines biologisch abbaubaren Polyester-Blocks bereitstellen können.
Zusätzliche Aufgaben und Vorteile dieser Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Zusammenfassung und der detaillierten Beschreibung der verschiedenen Ausführungsformen, welche diese Erfindung bilden.
Es gibt einen aufkommenden Bedarf für Materialien, die biologisch verträglich sind, die Zellproliferation und die Biosynthese fördern, als Träger für physiologische Mittel wirken und einfach gehandhabt und synthetisiert werden können. Materialien, die in situ gelieren, sind dahingehend vielversprechend, dass sie einfach handhabbar sind und ein Beimpfen mit Zellen ermöglichen und das Vermögen zur Bildung einer beliebigen gewünschten Implantatform bieten. Die vorliegende Erfindung ist zur Freisetzung von Zellen gut geeignet, wodurch die wärmegelierende, biologisch abbaubare, wässrige Polymerlösung ein Grundgerüst für eine Gewebereparatur und eine Organregenerierung bereitstellt. Die vorliegende Erfindung bietet mehrere Vorteile, die umfassen: Durch die Fließfähigkeit der wärmegelierenden, biologisch abbaubaren, wässrigen Polymerlösungen kann jegliche Form eines Defekts gefüllt werden, die wärmegelierenden, biologisch abbaubaren, wässrigen Polymerlösungen fördern die Gewebeintegration, umschließen leicht lebende Zellen und verschiedene therapeutische Mittel (z.B. Wachstumsfaktoren) und ermöglichen schließlich ein minimal invasives Einbringen.
Daher ist es eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, eine wärmegelierende, biologisch abbaubare Polymerlösung bereitzustellen, die für den Gewebeaufbau geeignet ist.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung einer wärmegelierenden, biologisch abbaubaren Polymerlösung, die als Zellfreisetzungssystem geeignet ist.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Herstellung biologisch abbaubarer Solubilisierungsmittel für hydrophobe Arzneistoffe. Aufgrund der Tensidnatur von PEG-g-PLGA und PLGA-g-PEG kann dieses Polymer als Solubilisierungsmittel für hydrophobe Arzneistoffformulierungen verwendet werden.
Für ein klares und genaues Verständnis der Beschreibung und der Ansprüche, einschließlich des Schutzbereichs solcher Begriffe, werden die nachstehenden Definitionen bereitgestellt: Biologisch aktives Mittel: Ein "biologisch aktives Mittel" soll hier ein beliebiger Arzneistoff, ein beliebiges Molekül, Biomolekül oder eine beliebige Zelle sein.
Arzneistoff: "Arzneistoff" soll hier für jegliche organische Verbindung oder Substanz stehen, die eine biologische Aktivität aufweist und für einen therapeutischen Zweck angepasst ist oder verwendet wird.
Polypeptid: "Polypeptid" soll hier für jegliches Peptid, Polypeptid, Oligopeptid und/oder Protein stehen, das als Arzneistoff verwendet wird und soll nicht durch das Molekulargewicht, die Sequenz, die Länge, die Aktivität oder die Anwendung beschränkt sein.
Parenteral: Verabreichen in den Körper oder in einer Weise, die von einer Verabreichung in den Verdauungstrakt verschieden ist, wie z.B. durch eine intravenöse oder intramuskuläre Injektion.
Ein vollständigeres Verständnis der Erfindung ergibt sich aus der folgenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen, in denen gleiche Bezugszeichen in unterschiedlichen Figuren die gleichen Strukturen oder Elemente darstellen, wobei
1 eine schematische Darstellung der Synthese von PEG-g-PLGA ist,
2 eine graphische Darstellung von NMR-Spektren von Zwischen- und Endprodukten der PEG-g-PLGA-Synthese ist,
3 eine graphische Darstellung eines GPC-Chromatogramms von Polymeren ist, das den Fortschritt von Reaktionen zeigt,
4 ein Cryo-TEM-Bild ist, das die Mizellenbildung des PEG-g-PLGA-Polymers bei einer Konzentration von 1 Gew.-% in Wasser bei 23,7°C zeigt,
5a eine graphische Darstellung von UV-Spektren ist, welche die Bildung einer Kern-Hülle-Struktur von Polymeren in Wasser bei 20°C zeigen, wobei die DPH-Konzentration auf 4 μM festgelegt wurde und die Polymerkonzentration gemäß der Legende variiert wurde,
5b eine graphische Darstellung der CMC-Bestimmung durch Extrapolation der Differenz der Extinktion bei 377 und 392 nm ist,
6 eine graphische Darstellung des Realteils (η') der komplexen Viskosität und des Elastizitätsmoduls (G') wässriger 22 Gew.-%iger Lösungen von PEG-g-PLGA als Funktion der Temperatur ist,
7 eine graphische Darstellung eines Phasendiagramms wässriger PEG-g-PLGA-Lösungen ist,
8 eine graphische Darstellung der Berechnung der Enthalpie des Sol-Gel-Übergangs wässriger PEG-g-PLGA-Lösungen ist,
9 eine graphische Darstellung der ¹³C-NMR-Spektren von PEG-g-PLGA in D₂O (22 Gew.-%) als Funktion der Temperatur ist,
10 eine graphische Darstellung des Speichermoduls von PLGA-g-PEG als Funktion der Temperatur und der Konzentration ist,
11a eine graphische Darstellung einer rheologischen Untersuchung wässriger PLGA-g-PEG-Copolymerlösungen (25 Gew.-%) ist, wobei der Realteil (μ') der komplexen Viskosität der Copolymerlösung als Funktion der Temperatur gemessen worden ist,
11b eine graphische Darstellung einer rheologischen Untersuchung wässriger PLGA-g-PEG-Copolymerlösungen (25 Gew.-%) ist, wobei der Speichermodul (G') der Copolymerlösung als Funktion der Temperatur gemessen worden ist,
12 eine graphische Darstellung von ¹³C-NMR-Spektren (75 MHz) von 25 Gew.-% PLGA-g-PEG-Copolymer in D₂O als Funktion der Temperatur ist, wobei die vergrößerten Spektren (etwa 73 ppm) links gezeigt sind, und
13 eine graphische Darstellung eines Deuterium-NMR ist, das die Reversibilität des Sol-Gel-Übergangs zeigt.
Die vorliegende Erfindung ist eine biologisch abbaubare Polymerlösung, die einen Polyethylenglykol-Block (PEG-Block) und einen biologisch abbaubaren Polyesterblock umfasst, die zur Bildung eines Polymers mit einer allgemeinen Struktur, umfassend die Formel A_n(B), verknüpft sind, wobei n größer als 2 ist und A aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, B aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, und A unterschiedlich von B ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine wärmegelierende, biologisch abbaubare, wässrige Polymerlösung bereit, die eine biologisch abbaubare Polymerlösung, die einen Polyethylenglykol-Block (PEG-Block) und einen biologisch abbaubaren Polyesterblock umfasst, die zur Bildung eines Polymers einer allgemeinen Struktur, umfassend die Formel A_n(B), verknüpft sind, wobei n größer als 2 ist und A aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, B aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, und A unterschiedlich von B ist, und eine wässrige Lösung umfasst.
Die wärmegelierende, biologisch abbaubare, wässrige Polymerlösung ist bevorzugt, wenn sie mit der Formel A_n(B), wie sie vorstehend beschrieben worden ist, hergestellt wird und n zwischen 3 und 10 liegt.
Der biologisch abbaubare Polyester-Block ist vorzugsweise ein Mitglied, das aus der Gruppe bestehend aus Poly(DL-milchsäure), Poly(L-milchsäure), Poly(glykolsäure), Poly(ε-caprolacton), Poly(γ-butyrolacton), Poly(α-valerolacton), Poly(β-hydroxybuttersäure) und deren Copolymeren oder Terpolymeren, ausgewählt ist. Es ist auch bevorzugt, dass die Copolymere und/oder Terpolymere aus der Gruppe bestehend aus Poly(DL-milchsäure-co-glykolsäure), Poly(L-milchsäure-co-glykolsäure), Poly(ε-caprolacton-co-DL-milchsäure), Copoly(ε-caprolacton-co-DL-milchsäure-glykolsäure) ausgewählt sind. Die vorstehend angegebene Auflistung vorgeschlagener biologisch abbaubarer Polyester-Blöcke ist nicht beschränkend aufzufassen. Die biologisch abbaubaren Polyester-Blöcke können ein maximales Molekulargewicht von 100000 aufweisen, wobei ein bevorzugter Bereich bei etwa 1000 bis 30000 und insbesondere zwischen etwa 1000 und 10000 liegt. Die biologisch abbaubaren Polyester-Blöcke sind als Ergebnis des Erfordernisses beschränkt, eine Anpassung an die Löslich keitsgrenze vorzunehmen, und nicht aufgrund der Abbaubarkeit. Es ist bevorzugt, dass der Polyethylenglykol-Block (PEG-Block) ein mittleres Molekulargewicht zwischen etwa 300 und 20000 und mehr bevorzugt zwischen etwa 500 und 10000 aufweist. Ein PEG-Block mit einem höheren Molekulargewicht als 10000 kann durch eine Glomeruli-Filtration nur schwer entfernt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt eine effektive biologisch abbaubare Flüssigkeit zur Freisetzung eines biologisch aktiven Mittels bereit, die eine effektive Menge eines biologisch aktiven Mittels umfasst, das in einer wärmegelierenden, biologisch abbaubaren, wässrigen Polymerlösung enthalten ist, die einen Polyethylenglykol-Block (PEG-Block) und einen biologisch abbaubaren Polyesterblock umfasst, wobei die Blöcke verknüpft sind, um ein Polymer einer allgemeinen Struktur, umfassend die Formel A_n(B), zu bilden, wobei n größer als 2 ist und A aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, B aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, und A unterschiedlich von B ist.
Es sollte beachtet werden, dass die vorliegende Erfindung jegliches biologisch aktives Mittel nutzen kann, wobei es sich um einen beliebigen Arzneistoff, ein beliebiges Molekül, Biomolekül oder eine beliebige Zelle handeln kann. Die vorliegende Erfindung kann auch ein Freisetzungssystem für andere Materialien schaffen, die eine verzögerte Freisetzungsrate erfordern.
Die erfindungsgemäßen wärmegelierenden, biologisch abbaubaren, wässrigen Polymerlösungen sind als Arzneistoff-Freisetzungssysteme nützlich, die einen Träger für Arzneistoffe bereitstellen. Ein Arzneistoff ist eine organische Verbindung oder Substanz, die eine biologische Aktivität aufweist oder für einen therapeutischen Zweck verwendet wird, einschließlich unter anderem Antikrebsmittel, Hormone, Antibiotika, narkotische Antagonisten, Schmerzmittel, entzündungshemmende Mittel, Antidepressiva, Antiepeleptika, Antimalariamittel, Immunaktivatoren, Wachstumsfaktoren, Gentherapiemittel, Oligonukleotide, therapeutische Peptide und Proteine und Kombinationen davon. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein sehr nützliches Freisetzungssystem für Polypeptid- und Protein-Arzneistoffe bereit, die einen kurzen Zeitraum des biologischen Abbaus erfordern, um das Erfordernis einer spezifischen verzögerten Freisetzungsrate aufgrund der kurzen Plasmahalbwertszeit und der Instabilität zu berücksichtigen.
Da die erfindungsgemäßen Polymere aus hydrophoben und hydrophilen Blöcken zusammengesetzt sind und aufgrund der Tensidnatur, können diese Polymere als Solubilisierungsmittel für hydrophobe Arzneistoffformulierungen verwendet werden. Diese Eigenschaften ermöglicht es diesen Polymeren, dass sie als Solubilisierungsmittel für hydrophobe Arzneistoffe verwendet werden können. Typische Krebsarzneistoffe, wie z.B. Taxol, weisen eine gute Effizienz auf, während sie zu einer geringen Wasserlöslichkeit neigen. Die erfindungsgemäßen Polymere können als biologisch verträgliche Solubilisierungsmittel für solche Arzneistoffe verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung ist für die Freisetzung von Antikrebsmitteln gut geeignet. Es ist bevorzugt, dass die Antikrebsmittel aus der Gruppe bestehend aus Adriamycin, Mitomycin, Bleomycin, Cisplatin, Carboplatin, Doxorubicin, Daunorubicin, 5-Fluoruracil, Methotrexat, Taxol, Taxotere und Actinomycin D ausgewählt sind. Es sollte beachtet werden, dass mit dieser Erfindung auch andere Antikrebsmittel gut verwendet werden können, und die vorstehend genannte Auflistung ist nicht beschränkend aufzufassen.
Die vorliegende Erfindung ist genauso gut zur Freisetzung von Polypeptiden geeignet. Es ist bevorzugt, dass die Polypeptide aus der Gruppe bestehend aus Oxytocin, Vasopressin, adrenocorticotropem Wachstumsfaktor (PDGF), Prolactin, Luliberin oder luteinisierendes Hormon freisetzendem Hormon (LHRH), Wachstumshormon, Wachstumshormon freisetzendem Faktor, Insulin, Somatostatin, Glucagonen, Interleukin-2 (IL-2), Interferon-α,β,γ (IFN-α,β,γ), Gastrin, Tetragastrin, Pentagastrin, Urogastron, Sekretin, Calcitonin, Enkephalinen, Endorphinen, Angiotensinen, Thyroliberin (TRH), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Granulozyt-Kolonie-stimulierendem Faktor (G-CSF), Granulozyt-Makrophage-Kolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF), Rennin, Bradykinin, Bacitracinen, Polymixinen, Colistinen, Tyrocidin, Gramicidinen und synthetischen Analoga, Modifikationen und pharmakologisch aktiven Fragmenten davon, monoklonalen Antikörpern und löslichen Vakzinen, ausgewählt wird. Diese Auflistung ist nicht beschränkend aufzufassen und es sollte beachtet werden, dass auch andere Proteine verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung ist zur Freisetzung von Zellen gut geeignet. Die wärmegelierende, biologisch abbaubare, wässrige Polymerlösung, die Zellen umfasst, stellt ein Grundgerüst für die Gewebereparatur und Organregenerierung sowie für die therapeutische Anwendung bereit.
Ein nützlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Freisetzungssystems für ein biologisch aktives Mittel in einer wärmegelierenden Polymermat rix zur kontrollierten Freisetzung des biologisch aktiven Mittels in einen Warmblüter. Wesentlich für diesen Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung einer injizierbaren wärmegelierenden, biologisch abbaubaren, wässrigen Polymerlösung, die einen Polyethylenglykol-Block (PEG-Block) und einen biologisch abbaubaren Polyesterblock umfasst, wobei die Blöcke verknüpft sind, um ein Polymer einer allgemeinen Struktur, umfassend die Formel A_n(B), zu bilden, wobei n größer als 2 ist und A aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, B aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, und A unterschiedlich von B ist. Die wärmegelierende, biologisch abbaubare, wässrige Polymerlösung wird dann mit einer effektiven Menge eines biologisch aktiven Mittels gemischt, um ein Gemisch aus Polymer und biologisch aktivem Mittel, das bei einer Temperatur unter der Geliertemperatur des Polymers gehalten wird, zum Einbringen in einen Warmblüter zu bilden, um bei einer Erhöhung der Temperatur durch die Körpertemperatur des Lebewesens, so dass die Temperatur über der Geliertemperatur des Polymers liegt, ein Geldepot zu bilden. Es sollte beachtet werden, dass dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung verschiedene Anwendungsformen aufweisen kann. Beispielsweise ist dieser Aspekt gut zur Verwendung dieses Herstellungsverfahrens für eine Anwendung geeignet, wenn es gewünscht ist, ein biologisch aktives Mittel an einen Warmblüter während eines chirurgischen Verfahrens zu verabreichen, wenn ein Teil des Körpers des Warmblüters freiliegt. Durch Anwenden des Gemischs aus Polymer und biologisch aktivem Mittel auf einen während der Chirurgie freiliegenden Bereich wird die Bildung eines Depots in einem spezifischen/gewünschten Bereich möglich.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines parenteralen, freisetzenden Systems eines biologisch aktiven Mittels in einer wärmegelierenden Polymermatrix für die kontrollierte Freisetzung des biologisch aktiven Mittels an ein warmblütiges Lebewesen. Wesentlich für diesen Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung einer injizierbaren wärmegelierenden, biologisch abbaubaren, wässrigen Polymerlösung, die einen Polyethylenglykol-Block (PEG-Block) und einen biologisch abbaubaren Polyesterblock umfasst, wobei die Blöcke verknüpft sind, um ein Polymer einer allgemeinen Struktur, umfassend die Formel A_n(B), zu bilden, wobei n größer als 2 ist und A aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, B aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, und A unterschiedlich von B ist. Die injizierbare, wärmegelierende, biologisch abbaubare, wässrige Polymerlösung wird dann mit einer effektiven Menge eines biologisch aktiven Mittels gemischt, um ein Gemisch aus Polymer und biologisch aktivem Mittel zu bilden, das bei einer Temperatur unter der Geliertempe ratur des Polymers gehalten wird, zur Injektion in einen Warmblüter, um bei einer Erhöhung der Temperatur durch die Körpertemperatur des Lebewesens über die Geliertemperatur des Polymers ein Geldepot zu bilden. Dieser Aspekt der Erfindung ist gut geeignet, wenn es gewünscht ist, ein biologisch aktives Mittel mit kontrollierter Freisetzung bereitzustellen, ohne dass der Warmblüter chirurgisch freigelegt werden muss. Das Gemisch aus Polymer und biologisch aktivem Mittel kann parenteral durch verschiedene Injektionswege verabreicht werden, die intradermal oder intrakutan, subkutan oder hypodermal, intramuskulär, intravenös und intraspinal umfassen.
Nachdem die Erfindung beschrieben worden ist, sind nachstehend die folgenden experimentellen Beispiele angegeben. Diese spezifischen Beispiele sind bezüglich der in dieser Beschreibung beschriebenen Erfindung nicht beschränkend aufzufassen.
Experimenteller Teil:
Materialien:
DL-Lactid (Polyscience) und Glykolid (Polyscience) wurden aus Ethylacetat umkristallisiert. Glutarsäureanhydrid (Aldrich), Glutarsäure (Aldrich), Zinn(II)-octoat (Aldrich), Polyethylenglykol mit endständiger Epoxygruppe (Molekulargewicht: 600, Polyscience), Polyethylenglykol (Molekulargewicht: 1000, Aldrich) und 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien (DPH, Aldrich) wurden so verwendet, wie sie erhalten worden sind.
Synthese: Dreistufige Synthese von PEG-g-PLGA (1)
Als erstes wurden PEG's (Molekulargewicht = 1000, 38,28 g, 38,28 mmol) in 90 ml Toluol gelöst. Das Toluol wurde dann bis zu einem Endvolumen von 50 ml abdestilliert, um Wasser durch azeotrope Destillation zu entfernen. PEG mit endständigen Carbonsäuregruppen (CPEG) wurde durch Umsetzen von PEG mit einer Überschussmenge an Glutarsäureanhydrid in der Gegenwart katalytischer Mengen von Glutarsäure hergestellt. Glutarsäureanhydrid (7,255 g, 80,39 mol) und Glutarsäure (0,042 g, 0,40 mmol) wurden zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 6 Stunden bei 120°C gerührt. Die chemischen Verschiebungen (ppm) in den Spektren liegen bei 1,9 (zentrales Methylen von Glutarat), 2,4 (Methylen von Glutarat, das sich neben der Carbonylgruppe befindet), 3,6 (Ethylen von PEG) und 4,2 (Methylen von PEG, das mit Glutarat verbunden ist). Das 1:1-Flächenverhältnis der Peaks bei 1,9 ppm und 4,2 ppm zeigt die quantitative Endgruppenfunktionalisierung. Diethylether wurde dem Reaktionsgemisch zugesetzt, um das PEG mit endständigen Carbonsäuregruppen (CPEG) auszufällen. Das Produkt wurde 48 Stunden unter Hochvakuum (etwa 10^–3 mm Hg) gehalten, um das restliche Lösungsmittel zu entfernen.
Im zweiten Schritt wurde PEG mit endständigen Epoxygruppen (EPEG)(Molekulargewicht = 600, 5,619 g, 9,36 mmol) 24 Stunden bei 120°C mit CPEG (11,50 g, 9,36 mmol) in Toluol umgesetzt, um PEG mit entlang des PEG-Grundgerüsts gebundenen Hydroxylgruppen (PEGH) herzustellen. Das Gewichtsmittel des Molekulargewichts (M_w) und der Polydispersitätsindex (PDI) des resultierenden PEGH, die mittels GPC bestimmt worden sind, betrugen 3000 bzw. 1,3, bezogen auf Polystyrolstandards. Die Peaks bei 1,9 ppm und 2,4 ppm stammen von Glutarat. Die Peaks bei 3,6 ppm und 4,3 stammen von PEG. Die kleinen überlappten Peaks 3,4 bis 4,2 ppm von PEGH stammen von den verbindenden Methylen- oder Methinresten zwischen CPEG und EPEG (2).
Im dritten Schritt wurden DL-Lactid (19,2 g, 133,3 mmol) und Glykolid (6,4 g, 55,1 mmol) in situ bei 130°C für 24 Stunden unter Verwendung von Zinn(II)-octoat (76 μl, 0,187 mmol) als Katalysator an das vorgeformte PEGH-Grundgerüst polymerisiert. Die Pfropfcopolymere wurden in einem Ethyletherüberschuss ausgefällt und das restliche Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt.
Es gibt zwei Möglichkeiten für das Ringöffnungsmuster der Epoxygruppe während der Reaktion von EPEG und CPEG. Die Nucleophile bevorzugen in der Base-katalysierten Addition den Angriff der sterisch weniger gehinderten Seite der Epoxygruppe, während die Ringöffnung bei der kationischen Polymerisation weniger regiospezifisch ist. Das GPC-Chromatogramm in der 3 zeigt die Zunahme des Molekulargewichts durch die Bildung von PEGH aus CPEG und EPEG. Unter der Annahme eines PEGH-Molekulargewichts von etwa 3000 gibt es etwa 2 bis 3 gebundene Hydroxygruppen pro PEGH.
Das resultierende PEGH wurde als Starter für die Ringöffnungspolymerisation von DL-Lactid und Glykolid in der Gegenwart von Zinn(II)-octoat als Katalysator verwendet. H-NMR-Spektren (2) zeigen eine Ethylenglykoleinheit bei 3,6 ppm, eine Milchsäureeinheit bei 5,3 ppm (Methin) und 1,8 ppm (Methyl) und eine Glykolsäureeinheit bei 4,8 ppm. Die Zusammensetzung des PEG-g-PLGA, die mittels ¹H-NMR berechnet worden ist, betrug 2,98/2,35/1,00 (Ethylenglykol/DL-Milchsäure/Glykolsäure), bezogen auf das Molverhältnis. Die Methylenprotonen der Epoxygruppe erscheinen im H-NMR bei 2,6 ppm und 2,8 ppm. In dem H-NMR-Spektrum von PEGH und PEG-g-PLGA sind die Epoxysignale zu schwach, um quantitativ analysiert zu werden. Das Gewichtsmittel des Molekulargewichts (M_w) und der PDI von PEG-g-PLGA, die mittels GPC bestimmt worden sind, betrugen 11000 bzw. 1,3, bezogen auf Polystyrolstandards.
Gelpermeationschromatographie (GPC):
Ein GPC-System (Waters 515) mit einem Brechungsindexdetektor (Waters 410) und einem Lichtstreuungsdetektor Mini Dawn (Wyatt Technology) wurde verwendet, um das Molekulargewicht und die Molekulargewichtsverteilung zu ermitteln. Styragel^® HMW 6E- und HR 4E-Säulen (Waters) wurden in Reihe verwendet. Tetrahydrofuran (THF) wurde als Elutionslösungsmittel verwendet.
Cryo-Transmissionselektronenmikroskop (Cryo-TEM):
Unter Verwendung eines Cryo-TEM wurde eine 1%ige PEG-g-PLGA-Lösung in Form glasartiger Filme untersucht. Detaillierte Verfahren für die Probenherstellung wurden an anderer Stelle veröffentlicht (Bellare et al., Electron Microsc. Tech. 1999, 10, 87–111). Die flüssigen Filme mit einer Dicke von 10 bis 300 nm, die sich frei über die Mikroporen in einem Kohlenstoff-beschichteten Spitzen-artigen Polymersubstrat spannten, wurden bei 23,7°C unter einer vollständigen Kontrolle der Temperatur und der Feuchtigkeit hergestellt und mit flüssigem Ethan bei dessen Schmelztemperatur (–180°C) rasch vitrifiziert. Die Bildgebung wurde unter Verwendung eines JEOL 1210 durchgeführt, das bei 120 kV betrieben wurde. Ein angemessener Phasenkontrast wurde bei einer Nenn-Unterfokussierung von etwa 6 μm erhalten. Bilder wurden mit einer Gatan 724-Multiscankamera aufgezeichnet und die optischen Dichtegradienten im Hintergrund wurden digital korrigiert.
CMC-Bestimmung:
Ein hydrophober Farbstoff, 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien (DPH) wurde in Methanol mit einer Konzentration von 0,4 mM gelöst. Diese Lösung (20 μl) wurde unter Verwendung einer Mikrospritze in 2,0 ml einer wässrigen PEG-PLGA-Polymerlösung mit verschiedenen Konzentrationen zwischen 0,0032 und 0,26 Gew.-% injiziert und 5 Stunden bei 4°C äquilibriert. Ein UV-VIS-Spektrometer (HP 8453) wurde verwendet, um die UV-VIS-Spektren im Bereich von 280 bis 450 nm bei 20°C zu messen. Die CMC wurde durch das Auftragen der Differenz der Extinktion bei 377 nm und bei 391 nm (A₃₇₇–A₃₉₁) gegen die logarithmische Konzentration bestimmt.
Viskosität:
Die Viskosität einer wässrigen PEG-g-PLGA-Lösung (22 Gew.-%) wurde als Funktion der Temperatur gemessen. Ein Cannon-Fenske-Viskosimeter 200 mit einer Viskosimeterkonstante von 0,0966 Centistokes/s wurde zur Messung der Viskosität der Polymerlösung verwendet.
Dynamisch-mechanische Analyse:
Der Sol-Gel-Übergang der wässrigen Pfropfcopolymerlösung (22 Gew.-%) wurde unter Verwendung eines dynamisch-mechanischen Rheometers (Rheometric Scientific: SR 2000) untersucht. Die Polymerlösung wurde zwischen parallelen Platten mit einem Durchmesser von 25 mm und einem Spaltabstand von 0,5 mm eingebracht. Die Daten wurden bei einer kontrollierten Belastung (4,0 dyn/cm²) und einer Frequenz von 1,0 rad/s gesammelt. Die Heiz- und Kühlgeschwindigkeit betrug 0,2°C/min.
Sol-Gel-Übergang:
Der Sol-Gel-Übergang wurde mit einem Reagenzglas-Umdrehverfahren mit einem Temperaturinkrement von 1°C pro Schritt bestimmt. Wässrige Polymerlösungen (0,5 g) wurden in 4 ml-Fläschchen mit Innendurchmessern von 11 mm hergestellt. Die Fläschchen wurden bei jedem Schritt 15 min in ein Wasserbad eingetaucht. Die Sol-Gel-Übergangstemperatur wurde durch Umdrehen der Fläschchen geprüft, und wenn innerhalb von 30 s kein Fließen stattfand, wurde der Inhalt als Gel angesehen. Die Übergangstemperatur wurde mit einer Genauigkeit von ±1°C bestimmt.
NMR-Untersuchung:
Ein NMR-Spektrometer (Varian^® VXR 300) wurde für ¹H-NMR und ¹³C-NMR verwendet, um die Änderung der Zusammensetzung und der Mikroumgebung während des Sol-Gel-Übergangs zu untersuchen. Für das ¹³C-NMR in D₂O wurde eine 22 Gew.-%ige PEG-g-PLGA-Lösung hergestellt.
Ergebnisse und Diskussion
Mizellenbildung:
PEG-g-PLGA ist ein amphiphiles Copolymer und in Wasser kann eine Kern-Hülle-Struktur erwartet werden. Die hydrophoben PLGA-Seitenketten bilden einen Kern und die hydrophilen PEG-Grundgerüste bilden einen Hüllbereich. Die Bildung der Kern-Hülle-Struktur wurde mittels Cryo-Transmissionselektronenmikroskopie (Cryo-TEM) und eines Farbstoffsolubilisierungsverfahrens untersucht.
Die Bildung von Mizellen wurde direkt mit einem Cryo-TEM-Bild bestätigt. Eine 1 Gew.-%ige PEG-g-PLGA-Lösung bei 23,7°C wurde bei –180°C zu einer vitrifizierten Form abgeschreckt. Das Cryo-TEM-Bild zeigt dicht gepackte kugelförmige Mizellen (die in der 3 mit S bezeichnet sind) auf der linken Seite des schwarzen Streifens. Der Durchmesser einer Mizelle beträgt etwa 9 nm (4).
Bei einer festgelegten Konzentration von DPH wurde die Polymerkonzentration von 0,0032 bis 0,26 Gew.-% erhöht. Der Absorptionskoeffizient des hydrophoben Farbstoffs (DPH) ist in einer hydrophoben Umgebung viel höher als in Wasser. Folglich nahm die Extinktion bei 377 und 356 nm mit steigender Polymerkonzentration zu, was zeigt, dass die Polymere in Wasser eine Kern-Hülle-Struktur bildeten, wodurch eine hydrophobe Umgebung erzeugt wurde (4–a). Die kritische Mizellenkonzentration (CMC) wurde durch Extrapolieren der Extinktion bei 377 nm minus der Extinktion bei 391 nm (A₃₇₇–A₃₉₁) gegen die logarithmische Konzentration (4–b), um den Streueffekt zu kompensieren, bestimmt. Der durch diese Extrapolation bestimmte CMC-Wert ist aufgrund der Unsicherheit bezüglich der Linie nicht genau, jedoch liegt der CMC-Wert in einem Bereich von 0,01 bis 0,05 Gew.-% bei 20°C. Die 5a ist ein UV-Spektrum, das die Bildung einer Kern-Hülle-Struktur von Polymeren in Wasser bei 20°C zeigt. Die DPH-Konzentration wurde auf 4 μM festgelegt und die Polymerkonzentration wurde variiert: 0,0032, 0,01, 0,0178, 0,032, 0,056, 0,010, 0,178, 0,26 Gew.-%. Die Zunahme der Absorptionsbande bei 377 nm bei steigender Polymerkonzentration zeigt die Bildung einer hydrophoben Umgebung, d.h., von Mizellen, in Wasser. Die 5b zeigt eine CMC-Bestimmung durch eine Extrapolation der Differenz der Extinktion bei 377 nm und bei 391 nm.
Sol-Gel-Übergang:
Bei hohen Konzentrationen unterliegt die wässrige PEG-g-PLGA-Lösung bei zunehmender Temperatur einem Sol-Gel-Übergang. Die Viskosität einer wässrigen 22 Gew.-%igen PEG-g-PLGA-Lösung, die mit einem Cannon-Fenske-Viskosimeter gemessen worden ist, betrug 27 Centipoise bei 20°C. Diese Viskosität ist niedrig genug, um eine einfache Formulierung des Polymers mit pharmazeutischen Mitteln zu ermöglichen, die mit einer Nadel der Größe 22 injiziert werden kann. Über der Geliertemperatur ist die Viskosität zu hoch, um durch die Kapillare dieses Viskosimeters fließen zu können. Eine dynamisch-mechanische Analyse von 22 Gew.-%igen wässrigen Polymerlösungen zeigt, dass der Realteil (η') der komplexen Viskosität von 5 auf 500 dyn·s·cm^–2 [P] und der Elastizitätsmodul (G') von 0 auf 100 dyn·cm^–2 zunimmt, während ein Sol-Gel-Übergang stattfindet (6). (η') und (G') sind ein Maß für die abgeführte Energie bzw. die gespeicherte Energie, wenn ein Material einer zyklischen Verformung unterworfen wird. Ferner wurde über 30°C in dem Reagenzglas-Umdrehverfahren praktisch kein Fließen beobachtet, was einen Sol-Gel-Übergang anzeigt. Wenn die beiden Verfahren für die 22 Gew.-%igen wässrigen Polymerlösungen verglichen werden, entspricht die Geliertemperatur, die mit dem Reagenzglas-Umdrehverfahren ermittelt worden ist, der Temperatur, bei der η' von 100 P und G' von 50 dyn/cm² in der dynamisch-mechanischen Analyse erreicht wurden, wenn in beiden Fällen ein thermisches Gleichgewicht angenommen wird.
Das Phasendiagramm von wässrigen PEG-g-PLGA-Lösungen, das mit einem Reagenzglas-Umdrehverfahren ermittelt worden ist, ist in der 6 gezeigt. Der Sol-Gel-Übergang ist von einer abrupten Zunahme der Viskosität begleitet. Die kritische Gelkonzentration (CGC), oberhalb derer die Gelphase erscheint, betrug etwa 16 Gew.-%. Unterhalb der CGC fließt das System, obwohl die Viskosität mit zunehmender Temperatur zunimmt. Die Sol-Gel-Übergangstemperatur, die auf etwa 30°C geschätzt wird, wurde geringfügig von der Konzentration der Polymerlösung beeinflusst. Die Gegenwart der Gelphase etwa bei der Körpertemperatur (37°C) zeigt, dass das Material ein vielversprechender Kandidat für ein injizierbares Arzneistofffreisetzungssystem ist, das bei Raumtemperatur formuliert werden kann und bei der subkutanen oder intramuskulären Injektion in situ ein Gel bilden würde. Die pharmazeutischen Mittel würden dann von dem in situ gebildeten Gel langsam freigesetzt werden.
Eine weitere Analyse des Phasendiagramms veranschaulicht, dass das Gel mit zunehmender Temperatur eine Synärese zeigt, was als graue Dreiecke in der 7 angegeben ist, wobei es sich um eine makromolekulare Phasentrennung handelt, bei der von der Gelphase eine gewisse Menge an Wasser abgegeben wird. Oberhalb der Synäresetemperatur bleibt die Gelphase von dem Wasser getrennt. Daher ist die Solphase bei niedriger Temperatur eine homogene, einphasige Lösung, während die Solphase oberhalb der Synärese ein Zweiphasensystem ist. Der Gelbereich auf der rechten Seite der Trendlinie in dem Phasendiagramm zeigt den Bereich, bei dem eine einheitliche Gelphase vorliegt. Auf der Basis dieses Phasendiagramms (7) werden 21 bis 25 Gew.-%ige wässrige PEG-g-PLGA-Lösungen als injizierbare Formulierungen für die Arzneistofffreisetzung empfohlen.
Die Aggregationszahl einer Mizelle kann aus der Größe der Mizelle unter der Annahme abgeschätzt werden, dass die Mizelle eine harte Kugel ist. Der Radius einer Mizelle kann aus der Gleichung R = (3Ms.D.5ν2/4πNA)1/3 aabgeschätzt werden, wobei M_s.D. das durch eine Zentrifugalsedimentation erhaltene Molekulargewicht einer Mizelle ist, die nahe am Gewichtsmittel des Molekulargewichts (M_w) liegt, ν₂ das partielle spezifische Volumen des Polymers und N_A die Avogadrozahl ist. Die Aggregationszahl einer Mizelle (N_ag) ist durch die Gleichung Nag = M/M0 bgegeben, wobei M und M₀ das Molekulargewicht einer Mizelle bzw. das Molekulargewicht eines Polymers darstellen. Unter der Annahme, dass ν₂ 0,95 beträgt, wobei dieser Wert für einen Polyester oder Polyether typisch ist, und der mittels Cryo-TEM ermittelte R-Wert etwa 4,5 nm beträgt (Durchmesser etwa 9 nm), hat die Mizellenaggregationszahl bei 20°C den Wert 40. Es wird angenommen, dass die Aggregationszahl einer Mizelle für einen Solbereich wie in den Fällen von PEG-PLGA-PEG und Poloxamer 407 praktisch konstant ist. Bei dieser Berechnung wird auch angenommen, dass M gleich M_s.D. ist und dass das Molekulargewicht des PEG-g-PLGA (M₀), das mittels GPC-Daten bestimmt worden ist, 6000 beträgt. Auf der Basis dieser Abschätzung können die thermodynamischen Funktionen wie z.B. die Enthalpie (ΔH⁰), die Gibbs'sche freie Energie (ΔG⁰) und die Gelierentropie (ΔS⁰) berechnet werden. Nachstehend wird angenommen, dass die Standardzustände des Gelierprozesses die Mizellen in einer ideal verdünnten Lösung bei einer Einheitsmolarität und Mizellen in einem Gelzustand sind. ΔG0 = RTgelln Cm c ΔH0 = R[d ln Cm/d(1/Tgel)] d ΔS0 = (ΔG0 – ΔH0)/Tgel e
C_m ist die Konzentration von Mizellen in mol·Liter^–1, die unter der Annahme berechnet wird, dass die Aggregationszahl pro Mizelle 40 ist. T_gel ist die Sol-Gel-Übergangstemperatur. ΔH⁰, die aus der Steigung von ln C_m gegen 1/T_gel berechnet worden ist (8), beträgt 146 kJ mol^–1 (Mizelle) oder ΔH⁰ = 3,65 kJ·mol^–1 (Kette). Dieser Wert ist dem Wert bei der Gelierung von Poloxamer 407 (ΔH⁰ = 1,5 kJ·mol^–1 (Kette)) und von PEG-PLGA-PEG-Triblockcopolymeren (ΔH⁰ = 1,32 kJ·mol^–1 (Kette)) ähnlich. Die Gibbs'sche freie Energie (ΔG⁰) und die Gelierentropie (ΔS⁰) einer 22 Gew.-%igen wässrigen PEG-g-PLGA-Lösung mit einer T_gel von 30°C sind –0,59 kJ·mol^–1 bzw. 1,9 J·mol^–1·K^–1. Diese Berechnung führt zu dem Schluss, dass die Entropie die Gelierung vorantreibt. Es wurde vorgeschlagen, dass die molekulare Herkunft eines solchen, durch die Entropie vorangetriebenen Prozesses in hydrophoben Wechselwirkungen bestehen könnte. Wassermoleküle neigen dazu, das hydrophobe Segment (PLGA) zu umgeben, so dass die freie Energie vermindert wird. Folglich nimmt die Entropie von Wassermolekülen in der Gegenwart von hydrophoben Mitteln ab. Daher wird die Oberfläche hydrophober Moleküle in Wasser minimiert. Solche hydrophoben Wechselwirkungen nehmen mit steigender Temperatur zu und ändern die molekulare Konformation von PEG-g-PLGA, was die Gelierung vorantreiben könnte.
Die ¹³C-NMR-Analyse der Polymere wurde bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt, um die Struktur des Gels und den Mechanismus der Gelbildung zu ermitteln (9). Spektren von Polymeren, die in Wasser und Chloroform gelöst worden sind, wurden verglichen. Die ¹³C-NMR-Spektren von 22 Gew.-%igem PEG-g-PLGA in D₂O wurden bei 20 (Solzustand), 30 (gerade oberhalb des Sol-Gel-Übergangs), 40 (Gelzustand) und 50°C (Makrophasen-getrennter Zustand) durch einfaches Erhöhen der Temperatur um die Probe ohne Ändern der NMR-Parameter erhalten. Die Äquilibrierungszeit bei jeder Temperatur betrug 15 min. Chloroform (CDCl₃) ist ein unselektives, gutes Lösungsmittel sowohl für PEG- als auch für PLGA-Blöcke, während Wasser (D₂O) ein gutes Lösungsmittel für PEG, jedoch ein schlechtes Lösungsmittel für PLGA ist. Die scharfen Peaks von PEG und von PLGA in Chloroform werden mit einem verkleinerten Peak von PLGA in Wasser in der ersten und zweiten Reihe des ¹³C-NMR verglichen, was eine Kern (PLGA)-Hülle (PEG)-Struktur des Polymers in Wasser zeigt. Die molekulare Bewegung von PEG in Wasser ist aufgrund von Verankerungseffekten durch die hydrophoben PLGA-Segmente verglichen mit der molekularen Bewegung in Chloroform vermindert. Diese Tatsache spiegelt sich in einem verbreiterten Peak von PEG in D₂O bei 20°C wieder. Die Änderung der molekularen Assoziation bei einem Sol-Gel-Übergang umfasst die Änderung der molekularen Bewegung der Polymere. Die Änderung des ¹³C-NMR mit zunehmender Temperatur (20°C bis 50°C) zeigt eine Änderung der Mikroumgebung um das PEG und das PLGA. Der PEG-Peak (72 ppm) bei einem Gelzustand (30°C) ist verglichen mit einem Solzustand (20°C) verbreitert und um die halbe Höhe vermindert, wohingegen ein geringfügiger Anstieg der PLGA-Peakhöhe (20 ppm) bei einem Gelzustand (30°C) stattfindet. Diese Änderungen der Peakhöhen zeigen eine signifikante Abnahme der molekularen Bewegung des PEG-Grundgerüsts, und erhöhte thermische Bewe gungen der PLGA-Seitenketten während des Sol-Gel-Übergangs. Dieses Verhalten unterscheidet sich ziemlich von dem von PLGA-g-PEG. PLGA-g-PEG zeigte eine geringe Änderung des PEG-Peaks während des Sol-Gel-Übergangs im ¹³C-NMR in D₂O. Auf der Basis dieser Beobachtungen kann das folgende Modell für den Sol-Gel-Übergang wässriger PEG-g-PLGA-Copolymerlösungen vorgeschlagen werden. In einem Solzustand ist die Polymerkonformation mizellar, wobei die PEG's die Hülle und die PLGA's den Kern der Mizelle besetzen. Der Assoziationsgrad in einem Solzustand ist zur Bildung eines dreidimensionalen Netzwerks nicht ausreichend. Mit steigender Temperatur nehmen die hydrophoben Wechselwirkungen zu und Assoziationen von Polymeren vermindern die PEG-Molekülbewegung, was zu einer Long-range-Netzwerkbildung, d.h. zu einem Gel führt. Der Assoziationsgrad ist hoch genug, um dessen Integrität in der Gegenwart eines Wasserüberschusses bei einer gegebenen Temperatur wie z.B. 37°C beizubehalten. Daher kann dieses System mit zunehmender Viskosität als Gel anstatt als Lösung definiert werden. Wenn die Temperatur weiter zunimmt, nehmen die Long-range-Wechselwirkungen zwischen den Polymeren zu und es findet eine Phasenmischung zwischen PEG und PLGA statt, was zur einer Makrophasentrennung zwischen Wasser und dem Polymer führt, die bei 50°C auftritt.
Die 22 Gew.-%igen Polymerlösungen (0,5 g) werden in 4 ml-Fläschchen (1,1 cm Durchmesser) injiziert und 5 min in einem 4°C-Wasserbad gehalten. Während dieser Zeit bildet sich das Gel. 3 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (37°C, pH = 7,4) werden zugesetzt und die Fläschchen werden in dem Wasserbad geschüttelt (16 Hübe/min), um Körperbedingungen zu simulieren. Das Gel behält dessen Integrität in vitro eine Woche bei und das anfänglich trübe Gel wird nach 3 bis 7 Tagen transparent. Nach 7 Tagen war das Gel vollständig zerfallen, so dass eine klare Polymerlösung vorlag.
Dieses Material kann für eine Kurzzeitfreisetzung biologisch aktiver Mittel wie z.B. pharmazeutischer Arzneistoffe (z.B. Proteine, Antikrebsarzneistoffe) sowie als Träger oder Freisetzungssystem für biologisch aktive Mittel angewandt werden, die beim Gewebeaufbau verwendet werden. Die Hydrophobie des Arzneistoffs und die Molekülstruktur der Polymere beeinflussen das Ausmaß der Dominanz einer Diffusion oder eines Abbaus im Arzneistofffreisetzungsprofil. Daher kann durch Auswählen des geeigneten Arzneistoffs und der geeigneten Molekülparameter von PEG-g-PLGA auf der Basis dieses Polymer-Hydrogels ein Kurzzeitfreisetzungssystem gestaltet werden.
Synthese: Einstufige Synthese von PLGA-g-PEG
Das Pfropfcopolymer PLGA-g-PEG wurde durch eine einstufige Ringöffnungspolymerisation von DL-Lactid, Glykolid und Polyethylenglykol mit endständiger Epoxygruppe (PEG, Molekulargewicht = 600) unter Verwendung von Zinn(II)-octanoat als Katalysator synthetisiert. Das DL-Milchsäure/Glykolsäure/Ethylenglykol-Molverhältnis, das mittels H-NMR bestimmt worden ist, betrug 3,2/1/2,8. Daher beträgt die Pfropffrequenz von PEG 4,7 Mol-%. Das Gewichtsmittel des Molekulargewichts (Mw) und die Polydispersität (Mw/Mn) der Polymere, die mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) bezogen auf Polystyrolstandards unter Verwendung von Tetrahydrofuran als Elutionslösungsmittel bestimmt worden sind, betragen 4200 bzw. 1,3.
Sol-Gel-Übergang:
Bei Raumtemperatur beträgt die Viskosität der 25 Gew.-%igen wässrigen Lösung etwa 0,3 Poise (g^–1·s^–1), was die Injektion der Lösung unter Verwendung einer Nadel der Größe 25 zulässt. Mit steigender Temperatur unterliegen die wässrigen Lösungen (25 Gew.-%) von PLGA-g-PEG einem Sol-Gel-Übergang bei 30°C. Der Gelzustand wird traditionell mittels eines Reagenzglas-Umdrehverfahrens als nicht-fließender halbfester Zustand definiert. Bei der praktischen Anwendung sollte das Gel seinen im Gleichgewicht gequollenen Zustand beibehalten und sich nicht in einer Überschussmenge an Lösungsmittel lösen. Eine weitere Zunahme der Temperatur der wässrigen PLGA-g-PEG-Lösung (25 Gew.-%) führt zu einer makroskopischen Phasentrennung zwischen dem Gel und Wasser, d.h. bei 50°C findet eine Synärese statt.
Dynamisch-mechanische Analyse:
Der Sol-Gel-Übergang der wässrigen Pfropfcopolymerlösung wurde unter Verwendung einer dynamischen Rheometrie (Rheometric Scientific: SR 2000) in einer ähnlichen Weise wie die wässrigen Poloxamerlösungen untersucht. Die Polymerlösung wurde zwischen parallelen Platten mit einem Durchmesser von 25 mm und einem Spaltabstand von 0,5 mm eingebracht. Die Daten wurden bei einer kontrollierten Belastung (4,0 dyn/cm²) und einer Frequenz von 1,0 rad/s gesammelt. Die Heiz- und Kühlgeschwindigkeit betrug 0,2°C/min. Durch die dynamisch-mechanische Analyse kann der Sol-Gel-Übergang in einer besser reproduzierbaren und quantitativeren Weise als mit dem Reagenzglas-Umdrehverfahren identifiziert werden.
Der Modul der wässrigen PLGA-g-PEG-Lösung ist in der 10 als Funktion der Temperatur und der Konzentration gezeigt. Der Speichermodul nimmt am Sol-Gel-Übergang abrupt zu. Die Gele weisen einen Modul von etwa 50 dyn/cm² auf und werden in einem Bereich von 22 bis 29 Gew.-% geringfügig durch die Konzentration beeinflusst. Die Sol-Gel-Übergänge finden bei etwa 30°C statt, was eine einfache Formulierung bei Raumtemperatur nahe legt.
Um die Reversibilität des Sol-Gel-Übergangs zu bestätigen, wurden wässrige 25 Gew.-%ige PLGA-g-PEG-Lösungen untersucht. Der Realteil (η') der komplexen Viskosität der Polymerlösung, der ein Maß für die abgeführte Energie ist, wenn ein Material zyklisch verformt wird, ist als Funktion der Temperatur in der 11a gezeigt. Während des ersten Heizzyklus (H1) nimmt η' beim Sol-Gel-Übergang um das 1000-fache zu. Die Abkühlungskurve (C1) zeigt, dass die Gelphase im experimentellen Zeitmaßstab über den Temperaturbereich von 43 bis 20°C aufrechterhalten wurde. Diese Tatsache resultiert aus der Schwierigkeit der molekularen Umlagerung in der Gelphase; sobald die Lösung ein Gel gebildet hat, widerstehen die Moleküle einem Zerfall. Bei 15°C nahm η' abrupt ab, und zwar aufgrund eines Gel-Sol-Übergangs während der Abkühlung des Systems. Die zweite Heizkurve (H2) zeigt einen Sol-Gel-Übergang praktisch bei der gleichen Temperatur wie bei der ersten Heizkurve (H1).
Die Speichermodule (G') der wässrigen PLGA-g-PEG-Lösungen (25 Gew.-%), die ein Maß für die gespeicherte Energie sind, wenn ein Material zyklisch verformt wird, sind in einem Solzustand praktisch Null und erscheinen nicht in der Heizkurve (11b, H1). G' nahm während des Sol-Gel-Übergangs bei 32°C abrupt zu, wie es sich aus den Heizkurven ergibt. Der Maximalwert von G' wurde zwischen 35 und 39°C gemessen, woraus sich ergibt, dass es sich um ein vielversprechendes Material für in vivo-Anwendungen (37°C) handelt. Während des Kühlzyklus (C1) nahm der Gelmodul über den Temperaturbereich von 43 bis 20°C zu und zeigte ein Verhalten, das dem Verhalten typischer elastischer Materialien entsprach, und fiel bei 15°C aufgrund eines Gel-Sol-Übergangs abrupt ab. Während des ersten (H1) und des zweiten (H2) Heizzyklus wurde für G' praktisch die gleiche Übergangskurve gemessen, was eine reversible Gelierung zeigt. Die Abnahme von G' bei Temperaturen über 40 bis 45°C kann aufgrund der Zunahme der thermischen Bewegung erwartet werden. Dieser Trend wurde auch mit ¹³C-NMR-Spektren festgestellt (12).
NMR-Untersuchung:
Die ¹³C-NMR-Spektren einer 25 Gew.-%igen Copolymerlösung in D₂O wurden bei verschiedenen Temperaturen aufgenommen. Im Solzustand (20°C) ist der Methylpeak des hydrophoben PLGA (18 ppm) verglichen mit dem PEG-Peak (72 ppm) stark verkleinert und verbreitert, wohingegen in CDCl₃ ein scharfer Peak erscheint, was einen Hinweis auf die Kern-Hülle-Struktur dieses Polymers in Wasser gibt. Die Kern-Hülle-Struktur dieser amphiphilen Copolymere wurde auch durch eine Mizellenbildung in verdünnten wässrigen Lösungen bestätigt. Die kritische Mizellenkonzentration (CMC), die mit einem Farbstoffsolubilisierungsverfahren bestimmt worden ist, betrug 0,03 Gew.-% bei 20°C.
Unmittelbar über der Sol-Gel-Übergangstemperatur (33°C) einer wässrigen PLGA-g-PEG-Copolymerlösung (25 Gew.-%) werden die ¹³C-NMR-Peakformen sowohl des Methylpeaks des hydrophoben PLGA als auch des Peaks des hydrophilen PEG beibehalten, jedoch wurde der PEG-Peak um etwa 0,3 ppm tieffeldverschoben. Bei einer weiteren Zunahme der Temperatur nimmt die Peakhöhe des PLGA-Methylpeaks zu und der PEG-Peak wird in zwei Peaks aufgespalten, nämlich einen scharfen Peak bei 72,4 ppm und einen breiten Peak bei 72,7 ppm. Es wird angenommen, dass dieses Verhalten durch eine Zunahme der molekularen Bewegung des hydrophoben Grundgerüsts und einer Phasenmischung zwischen PEG und PLGA verursacht wird. Die Phasenmischung zwischen PEG und PLGA oder PLLA wurde bereits beschrieben. Eine weitere Zunahme der Temperatur führte zu einer Makrophasentrennung zwischen Wasser und dem Polymer.
Die Reversibilität des Sol-Gel-Übergangs wird auch durch Deuterium-NMR bestätigt (13). Der Peak bei 4,8 ppm und 20°C (Solzustand) verschob sich bei 33°C (unmittelbar oberhalb des Sol-Gel-Übergangs) zu 4,6 ppm, bei 37°C (Gelzustand) zu 4,58 ppm, bei 40°C zu 4,56 ppm und bei 50°C zu 4,5 ppm (Synärese). Die Änderung der chemischen Verschiebung war während des Sol-Gel-Übergangs (δ = 0,2 ppm) und dann während der Synärese am ausgeprägtesten. Wenn das System auf 20°C gekühlt wird, erscheint der Deuterium-Peak erneut bei 4,8 ppm, was die Reversibilität des Übergangs zeigt. In einem Solzustand bewegt sich Wasser freier als in einem Gelzustand. Während des Sol-Gel-Übergangs wird PEG aufgrund der Dehydratisierung hydrophober und das Ausmaß der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Wassermolekülen und Polymeren ändert sich. Daher wird die zeitlich gemittelte Umgebung um den Deuteriumkern beeinflusst, was zu Änderungen der chemischen Verschiebung von Wasser während des Sol-Gel-Übergangs führt. Diese Erkenntnis legt nahe, dass das Deuterium-NMR ein gutes Verfahren zur Bestimmung des Sol-Gel-Übergangs sein kann.
Die Sol-Gel-Übergangstemperatur konnte durch Ändern der PEG-Länge und -Zusammensetzung von 20°C bis 40°C gesteuert werden. Wenn das PEG-Molekulargewicht von PLGA-g-PEG von 600 auf 1000 zunimmt, fand der Sol-Gel-Übergang bei 40°C statt, während der Sol-Gel-Übergang bei 20°C stattfand, wenn die PEG-Zusammensetzung um 20 Mol-% vermindert wird.
Variieren der Gel-Dauerbeständigkeit
Der Zeitrahmen für die Geldauerbeständigkeit kann durch Einstellen des Verhältnisses der beiden Blöcke in der Formel A_n(B) (wobei n > 2 ist) variiert werden. Um die Dauerbeständigkeit eines Gels zu testen und beispielhaft darzustellen, wurden 0,5 g einer Polymerlösung (vgl. die nachstehende Tabelle) in ein 4 ml-Fläschchen (Innendurchmesser 1,1 cm) injiziert und 5 min bei 37°C gehalten, um die Bildung des Gels zu ermöglichen. Nach der Bildung des Gels werden 3 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (37°C, pH = 7,4) zugesetzt und das Fläschchen wird in einem Schüttelbad platziert (16 Hübe/min). Das Polymer wurde bezüglich eines vollständigen Abbaus täglich überwacht und die obere Schicht des Puffers wurde zum Zeitpunkt der Überwachung ersetzt. Die nachstehende Tabelle zeigt die resultierende Geldauerbeständigkeit für jedes Polymerverhältnis. PEG-g-PLGA hatte ein Molekulargewicht von 11000 und PLGA-g-PEG hatte ein Molekulargewicht von 7800.
Schlussfolgerungen
Die wässrigen Lösungen von PEG-g-PLGA-Copolymeren zeigten einen Sol-Gel-Übergang als Reaktion auf eine Zunahme der Temperatur. Eine Mizellenbildung wurde mittels Cryo-TEM und ein Farbstoffsolubilisierungsverfahren bestätigt. Der Mizellendurchmesser betrug etwa 9 nm und die CMC lag in einem Bereich von 0,01 bis 0,05 Gew.-%. ¹³C-NMR zeigte, dass die molekulare Bewegung von PEG-Grundgerüsten während des Sol-Gel-Übergangs abnimmt, während diejenige von PLGA-Seitenketten während des Sol-Gel-Übergangs zunimmt.
Die 21 bis 25 Gew.-%igen Lösungen zeigen eine niedrige Viskosität bei Raumtemperatur und bilden bei Körpertemperatur ein Gel. Die Gelmorphologie änderte sich von trüb zu transparent und die Integrität des Gels blieb eine Woche lang erhalten, was zeigt, dass es sich um einen vielversprechenden Kandidaten für Kurzzeit-Arzneistofffreisetzungssysteme handelt.
Das wässrige PLGA-g-PEG-System, das durch Temperaturerhöhung einen reversiblen Sol-Gel-Übergang zeigt, wurde durch eine dynamisch-mechanische Analyse und ein NMR-Spektrophotometer untersucht. Die rheologische Untersuchung der Copolymere in wässriger Lösung zeigte, dass die Wärmegelierung bei etwa 30°C stattfand und der Gel-Elastizitätsmodul etwa bei Körpertemperatur (37°C) ein Maximum zeigte. Eine vorläufige in vivo-Studie in einem Rattenmodell bestätigte die in situ-Gelbildung nach einer subkutanen Injektion von 0,5 ml wässriger Lösung. Das Gel lag nach 2 Monaten immer noch an der Injektionsstelle vor. Diese Tatsache unterscheidet dieses Polymer deutlich von Poly(ethylenglykol)-g-poly(DL-Milchsäure-co-glykolsäure) PEG-g-PLGA-Copolymerhydrogelen, die nach einer Woche zerfallen waren.
Das in dieser Studie entwickelte System ist für eine lokale Freisetzung biologisch aktiver Mittel wie z.B. Proteine, Antikrebsarzneistoffe und Antiarthritisarzneistoffe durch eine subkutane, intraperitoneale, okulare, vaginale oder rektale Verabreichung sehr vielversprechend. Die Wärmeempfindlichkeit ermöglicht die in situ-Gelbildung nach der Injektion und daher ist kein chirurgisches Verfahren erforderlich, um das Arzneistofffreisetzungssystem zu implantieren und zur Arzneistoffformulierung ist kein organisches Lösungsmittel erforderlich. Die physikalischen Eigenschaften weicher Hydrogele vermindern die mechanische Reizung des Gewebes, das die Injektionsstelle umgibt. Die Polymere sind auch biologisch abbaubar. Daher besteht kein Bedarf für eine chirurgische Entfernung des Implantats nach der Freisetzung des pharmazeutischen Mittels.
Während die Erfindung im Zusammenhang mit spezifischen Ausführungsformen der Erfindung beschrieben worden ist, sollte beachtet werden, dass die Erfindung weiter modifiziert werden kann und diese Anmeldung soll beliebige Variationen, Anwendungen oder Anpassungen der Erfindung, die im Allgemeinen den erfindungsgemäßen Prinzipien folgen, und auch solche Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung umfassen, die in die Praxis des Fachgebiets fallen, dem die Erfindung angehört, und die auf die vorstehend beschriebenen essentiellen Merkmale angewandt werden können und vom Schutzbereich der beigefügten Ansprüche umfasst sind.

Claims

Wärmegelierende, biologisch abbaubare, wäßrige Polymerlösung, umfassend: a. ein biologisch abbaubares Polymer, umfassend i. einen Polyethylenglykol(PEG)-Block und ii. einen biologisch abbaubaren Polyester-Block, wobei iii. die Blöcke verknüpft sind, um ein Polymer einer allgemeinen Struktur umfassend die Formel A_n(B), zu bilden, wobei n größer als 2 ist und A aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, B aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, und A unterschiedlich von B ist, und b. eine wäßrige Lösung.
Wärmegelierende, biologisch abbaubare, wäßrige Polymerlösung nach Anspruch 1, wobei n zwischen 3 und 10 ist.
Wärmegelierende, biologisch abbaubare, wäßrige Polymerlösung nach Anspruch 1, wobei das Polyethylenglykol (PEG) ein mittleres Molekulargewicht von zwischen etwa 300 und 20.000 aufweist.
Wärmegelierende, biologisch abbaubare, wäßrige Polymerlösung nach Anspruch 1, wobei das Polyethylenglykol (PEG) ein mittleres Molekulargewicht von zwischen etwa 500 und 10.000 aufweist.
Wärmegelierende, biologisch abbaubare, wäßrige Polymerlösung nach Anspruch 1, wobei der Polyester-Block ein mittleres Molekulargewicht von zwischen etwa 1.000 und 30.000 aufweist.
Wärmegelierende, biologisch abbaubare, wäßrige Polymerlösung nach Anspruch 1, wobei der Polyester-Block ein mittleres Molekulargewicht von zwischen etwa 1.000 und 10.000 aufweist.
Wärmegelierende, biologisch abbaubare, wäßrige Polymerlösung nach Anspruch 1, wobei der biologisch abbaubare Polyester-Block aus der Gruppe, bestehend aus Poly(DL-milchsäure), Poly(L-milchsäure), Poly(glykolsäure), Poly(ε-caprolacton), Poly(γ-butyrolacton), Poly(γ-valerolacton), Poly(β-hydroxybuttersäure) und deren Copolymeren oder Terpolymeren, ausgewählt ist.
Wärmegelierende, biologisch abbaubare, wäßrige Polymerlösung nach Anspruch 7, wobei die Copolymere und/oder Terpolymere aus der Gruppe, bestehend aus Poly(DL-milchsäure-co-glykolsäure), Poly(L-milchsäure-co-glykolsäure), Poly(ε-caprolacton-co-DL-milchsäure), Copoly(ε-caprolacton-co-DL-milchsäure-glykolsäure), ausgewählt sind.
Biologisch abbaubares, biologisch aktives Mittel freisetzendes System, umfassend: a. eine wirksame Menge von darin enthaltenem, biologisch aktivem Mittel, b. eine wärmegelierende, biologisch abbaubare, wäßrige Polymerlösung, umfassend i. ein biologisch abbaubares Polymer, umfassend einen Polyethylenglykol(PEG)-Block, einen biologisch abbaubaren Polyester-Block, wobei die Blöcke verknüpft sind, um ein Polymer einer allgemeinen Struktur, umfassend die Formel A_n(B), zu bilden, wobei n größer als 2 ist und A aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, B aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, und A unterschiedlich von B ist, und ii. eine wäßrige Lösung.
Biologisch abbaubares, biologisch aktives Mittel freisetzendes System nach Anspruch 9, wobei das biologisch aktive Mittel ein Arzneimittel ist.
Biologisch abbaubares, biologisch aktives Mittel freisetzendes System nach Anspruch 10, wobei das Arzneimittel aus der Gruppe, bestehend aus Antikrebsmittel, Hormonen, Antibiotika, narkotischen Antagonisten, Schmerzmitteln, entzündungshemmenden Mitteln, Antidepressiva, Antiepeleptika, Antimalariamitteln, Immunaktivatoren, Wachstumsfaktoren, strahlen-schützenden Mitteln, Vakzinen, Gentherapiemitteln, Oligonukleotiden, Antisense, Peptiden und Proteinen und Kombinationen davon, ausgewählt ist.
Biologisch abbaubares, biologisch aktives Mittel freisetzendes System nach Anspruch 10, wobei das Arzneimittel ein Antikrebsmittel ist.
Biologisch abbaubares, biologisch aktives Mittel freisetzendes System nach Anspruch 12, wobei das Antikrebsmittel ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Adriamycin, Mitomycin, Bleomycin, Cisplatin, Carboplatin, Doxorubicin, Daunorubicin, 5-Fluoruracil, Methotrexat, Taxol, Taxotere und Actinomycin D, ist.
Biologisch abbaubares, biologisch aktives Mittel freisetzendes System nach Anspruch 10, wobei das Arzneimittel ein Polypeptid ist.
Biologisch abbaubares, biologisch aktives Mittel freisetzendes System nach Anspruch 14, wobei das Polypeptid ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Oxytocin, Vasopressin, adrenocorticotropem Wachstumsfaktor (PDGF), Prolactin, Luliberin oder luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon (LHRH), Wachstumshormon, Wachstumshormon freisetzender Faktor, Insulin, Somatostatin, Glucagonen, Interleukin-2 (IL-2), Interferon-α,β,γ (IFN-α,β,γ), Gastrin, Tetragastrin, Pentagastrin, Urogastron, Sekretin, Calcitonin, Enkephalinen, Endorphinen, Angiotensinen, Thyroliberin (TRH), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Granulozyt-Koloniestimulierendem Faktor (G-CSF), Granulozyt-Makrophage-Koloniestimulierendem Faktor (M-CSF), Rennin, Bradykinin, Bacitracinen, Alpha-1-Antitrypsin, Thrombozytenwachstumsfaktor, Albumin, Antithrombin III, Glucocerebrosidase, DNAse, Gewebsplasminogenaktivator, Calcitonin, Gerinnungsfaktoren VII, VIII und IX, LHRH-Antagonisten, Insulin, Erythropoietin, Polymixinen, Colistinen, Tyrocidin, Gramicidinen und synthetischen Analoga, Modifikationen und pharmakologisch aktiven Fragmente davon, monoklonalen Antikörpern und löslichen Vakzinen, ist.
Biologisch abbaubares, biologisch aktives Mittel freisetzendes System nach Anspruch 9, wobei das therapeutische Mittel eine Zelle ist.
Biologisch abbaubares, biologisch aktives Mittel freisetzendes System nach Anspruch 9, wobei die wärmegelierende, biologisch abbaubare, wäßrige Polymerlösung als ein Lösungsvermittler zur Verfügung steht.
Verfahren zur Herstellung eines parenteralen, freisetzenden Systems eines biologisch aktiven Mittels in einer wärmegelierenden Polymermatrix für die kontrollierte Freisetzung des biologisch aktiven Mittels zur parenteralen Injektion der Lösung in einen Warmblüter und zur Bildung eines Gelspeichers des biologisch aktiven Mittels und biologisch abbaubaren Polymers, wenn die Temperatur der Lösung durch die Körpertemperatur des Tieres bzw. Lebewesens erhöht wird, um über der Geliertemperatur des Polymers zu sein, welches umfaßt: a. das Bereitstellen einer injizierbaren, wärmegelierenden, biologisch abbaubaren, wäßrigen Polymerlösung, welche umfaßt i. ein biologisch abbaubares Polymer, umfassend einen Polyethylenglykol(PEG)-Block, einen biologisch abbaubaren Polyester-Block, wobei die Blöcke verknüpft sind, um ein Polymer einer allgemeinen Struktur, umfassend die Formel A_n(B), zu bilden, wobei n größer als 2 ist und A aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, B aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, und A unterschiedlich von B ist, und ii. eine wäßrige Lösung, b. das Mischen der wärmegelierenden, biologisch abbaubaren, wäßrigen Polymerlösung mit einer wirksamen Menge von biologisch aktivem Mittel, um ein Gemisch von Polymer-biologisch aktives Mittel zu bilden, c. das Halten des Gemisches von Polymer-biologisch aktives Mittel bei einer Temperatur unterhalb der Geliertemperatur des Polymers.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das biologisch aktive Mittel ein Arzneimittel ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Arzneimittel ein Antikrebsmittel ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Antikrebsmittel ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Adriamycin, Mitomycin, Bleomycin, Cisplatin, Carboplatin, Doxorubicin, Daunorubicin, 5-Fluoruracil, Methotrexat, Taxol, Taxotere und Aktinomycin D, ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Arzneimittel ein Polypeptid ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Polypeptid ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Oxytocin, Vasopressin, adrenocorticotropem Wachstumsfaktor (PDGF), Prolactin, Luliberin oder luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon (LHRH), Wachstumshormon, Wachstumshormon freisetzender Faktor, Insulin, Somatostatin, Glucagonen, Interleukin-2 (IL-2), Interferon-α,β,γ (IFN-α,β,γ), Gastrin, Tetragastrin, Pentagastrin, Urogastron, Sekretin, Calcitonin, Enkephalinen, Endorphinen, Angiotensinen, Thyroliberin (TRH), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Granulozyt-Kolonie-stimulierendem Faktor (G-CSF), Granulozyt-Makrophage-Kolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF), Rennin, Bradykinin, Bacitracinen, Alpha-1-Antitrypsin, Thrombozytenwachstumsfaktor, Albumin, Antithrombin III, Glucocerebrosidase, DNAse, Gewebsplasminogenaktivator, Calcitonin, Gerinnungsfaktoren VII, VIII und IX, LHRH-Antagonisten, Insulin, Erythropoietin, Polymixinen, Colistinen, Tyrocidin, Gramicidinen und synthetischen Analoga, Modifikationen und pharmakologisch aktiven Fragmente davon, monoklonalen Antikörpern und löslichen Vakzinen, ist.
Verfahren zur Herstellung eines freisetzenden Systems eines biologisch aktiven Mittels in einer wärmegelierenden Polymermatrix für die kontrollierte Freisetzung des biologisch aktiven Mittels zur Bereitstellung des Gemisches von Polymer-biologisch aktives Mittel in einem Warmblüter und zur Bildung eines Gelspeichers des biologisch aktiven Mittels und biologisch abbaubaren Polymers, wenn die Temperatur der Flüssigkeit durch die Körpertemperatur des Tieres bzw. Lebewesens erhöht wird, um über der Geliertemperatur des Polymers zu sein, welches umfaßt: a. das Bereitstellen einer wärmegelierenden, biologisch abbaubaren, wäßrigen Polymerlösung, welche umfaßt: i. ein biologisch abbaubares Polymer, umfassend einen Polyethylenglykol(PEG)-Block, einen biologisch abbaubaren Polyester-Block, wobei die Blöcke verknüpft sind, um ein Polymer einer allgemeinen Struktur, umfassend die Formel A_n(B), zu bilden, wobei n größer als 2 ist, und A aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, B aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, und A unterschiedlich von B ist, und ii. eine wäßrige Lösung, b. das Mischen der wärmegelierenden, biologisch abbaubaren, wäßrigen Polymerlösung mit einer wirksamen Menge von biologisch aktivem Mittel, um ein Gemisch von Polymer-biologisch aktives Mittel zu bilden, c. das Halten des Gemisches von Polymer-biologisch aktives Mittel bei einer Temperatur unterhalb der Geliertemperatur des Polymers.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das biologisch aktive Mittel ein Arzneimittel ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Arzneimittel aus der Gruppe, bestehend aus Antikrebsmitteln, Hormonen, Antibiotika, narkotischen Antagonisten, Schmerzmitteln, entzündungshemmenden Mitteln, Antidepressiva, Antiepileptika, Antimalariamitteln, Immunaktivatoren, Wachstumsfaktoren, strahlen-schützenden Mitteln, Vakzinen, Gentherapiemitteln, Oligonucleotiden, Antisense, Peptiden und Proteinen und Kombinationen davon, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Arzneimittel ein Antikrebsmittel ist.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Antikrebsmittel ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Adriamycin, Mitomycin, Bleomycin, Cisplatin, Carboplatin, Doxorubicin, Daunorubicin, 5-Fluoruracil, Methotrexat, Taxol, Taxotere und Actinomycin D, ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Arzneimittel ein Polypeptid ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Polypeptid ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Oxytocin, Vasopressin, adrenocorticotropem Wachstumsfaktor (PDGF), Prolactin, Luliberin oder luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon (LHRH), Wachstumshormon, Wachstumshormon freisetzender Faktor, Insulin, Somatostatin, Glucagonen, Interleukin-2 (IL-2), Interferon-α,β,γ (IFN-α,β,γ), Gastrin, Tetragastrin, Pentagastrin, Urogastron, Sekretin, Calcitonin, Enkephalinen, Endorphinen, Angiotensinen, Thyroliberin (TRH), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Nervenwachstumsfaktor (NGF), Granulozyt-Kolonie-stimulierendem Faktor (G-CSF), Granulozyt-Makrophage-Kolonie-stimulierendem Faktor (M-CSF), Rennin, Bradykinin, Bacitracinen, Alpha-1-Antitrypsin, Thrombozytenwachstumsfaktor, Albumin, Antithrombin III, Glucocerebrosidase, DNAse, Gewebsplasminogenaktivator, Calcitonin, Gerinnungsfaktoren VII, VIII und IX, LHRH-Antagonisten, Insulin, Erythropoietin, Polymixinen, Colistinen, Tyrocidin, Gramicidinen und synthetischen Analoga, Modifikationen und pharmakologisch aktiven Fragmente davon, monoklonalen Antikörpern und löslichen Vakzinen, ist.
Biologisch abbaubares Polymer, umfassend: a. einen Polyethylenglykol(PEG)-Block und b. einen biologisch abbaubaren Polyester-Block, wobei c. die Blöcke verknüpft sind, um ein Polymer einer allgemeinen Struktur, umfassend die Formel A_n(B), zu bilden, wobei n größer als 2 ist, und A aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, B aus der Gruppe, bestehend aus einem Polyethylenglykol-Block und einem biologisch abbaubaren Polyester-Block, ausgewählt ist, und A unterschiedlich von B ist.