DE60038363T2

DE60038363T2 - Detektion von kleinen molekülen mit piezo-elektrischem sensor

Info

Publication number: DE60038363T2
Application number: DE60038363T
Authority: DE
Inventors: Itamar Willner; Zelig Eshhar
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem; Biosensor Applications Sweden AB
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem; Biosensor Applications Sweden AB
Priority date: 1999-01-25
Filing date: 2000-01-25
Publication date: 2009-04-23
Anticipated expiration: 2020-01-26
Also published as: DE60038363D1; IL128212A0; AU2126400A; US7135295B1; ATE389881T1; EP1145006B1; EP1145006A2; WO2000043774A3; IL128212A; WO2000043774A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet von Sensoren und betrifft einen Sensor-Apparat, ein System sowie ein Verfahren zur Verwendung zum Nachweis von kleinen Molekülen in einer Probe.
STAND DER TECHNIK
In der folgenden Beschreibung wird auf mehrere Dokumente aus dem Stand der Technik verwiesen, die in der Liste unten dargestellt sind. Diese Literaturverweise werden im Text verwendet durch Angabe der Nummer aus dieser Liste.
LITERATURVERWEISE

1. Shons, A, Dorman, F., Najarian, J., J. Biomed. Mater Res., 6: 565 (1972).
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11. Muramatsu, H., Kajiwara, K., Tamiya, E. und Karube, I., Anal. Chim. Acta, 188: 257, (1986).
12. Muramatsu, H., Watanabe, Y., Hikuma, M., Ataka, T., Kubo, I., Tamiya, E. und Karube, I., Anal. Lett., 22: 2155, (1989).
13. Konig, B., Gratzel, Anal. Lett., 26: 1567, (1993).
14. Veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 97/04314.
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16. WO 98 57141 A
17. U. NARANG ET AL.: "Multianalyte detection using a capillary-baed flow immunosensor." ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, Bd. 255, Nr. 1, 1. Januar 1998 (1998-01-01), Seiten 13–19.
18. D. FETTEROLF ET AL.: "An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for trinitrotoluene (TNT) residue on hands." JOURNAL OF FORENSIC SCIENCES, Bd. 36, Nr. 2, (1991), Seiten 343–349.
19. PATENT ABSTRACTS OF JAPAN, Bd. 014, Nr. 034 (C-679), (1990) & JP 01 269485 A
20. US-A-4 999 284

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die lineare Beziehung zwischen der Veränderung der Oszillations-Frequenz eine piezoelektrischen Kristalls und der Massenvariation auf dem Kristall als ein Ergebnis des Bindens oder von Absorptions-Phänomenen wird gemeinhin verwendet, um in vorteilhafter Art und Weise eine gravimetrische Überwachung von Antigen-Antikörper-Bindung nachzuweisen. Die mathematische Beziehung zwischen den Frequenzänderungen eines piezoelektrischen Kristalls, Δf, und Massen-Veränderungen, Δm, auf dem Kristall wird durch die folgende Sauerbrei-Gleichung gegeben: Δf = –2,3 × 106fo 2·Δm/A, wobei f₀ die fundamentale Resonanz-Frequenz des Kristalls vor der Massenvariation ist und A die Oberflächen-Fläche der abgeschiedenen Masse. Beispielsweise wird für einen Kristall, der eine fundamentale Frequenz von 9 MHz hat, sowie eine Oberflächen-Fläche von 1 cm², eine Massen-Veränderung auf dem Kristall, die mit 1 × 10^–9 g korrespondiert, eine Frequenz-Veränderung, Δf, von 6 Hz stimulieren.
Die erste klassische Verwendung von piezoelektrischen Kristallen in Bezug auf Antigen-Antikörper (Ag-Ab)-Wechselwirkungen wurde 1972⁽¹⁾ berichtet, wobei ein Nyebar- überzogener Kristall weiter überzogen wurde mit hydrophoben Wechselwirkungen mit bovinem Serum-Albumin (BSA) und die Assoziation des BSA-Ab an dem Kristall wurde überwacht durch die Frequenz-Veränderungen. Seit dieser Zeit wird der piezoelektrische Nachweis von Antigenen und Antikörpern durch piezoelektrische Mittel oder die Quarz-Kristall-Mikrobalance (QCM) in einer Serie analytischer Untersuchungen eingesetzt. Der Fortschritt auf diesem Gebiet wurde in einem Übersichtsartikel dargestellt von Suleiman et al., 1994 (2) sowie Ward et al., 1990⁽³⁾.
Verschiedene Patente beschreiben die Anwendung von QCM für die Analyse von Antigenen und Antikörpern. Die physikalische Adsorption von Antigenen auf ein Kristall wurde verwendet als ein Mittel zum Nachweis von Antigenen durch Wechselwirkung des Kristalls mit einer Mischung des analytischen Antigens und einer vorherbestimmten Menge an Ab⁽⁴⁾. Die Abnahme in der Antigen-Konzentration war umgekehrt proportional zu Antigen-Konzentration in der Probe. In zwei Patenten von Rice^(5,6) wurden Verfahren zum Bestimmen von Abs durch QCM offenbart. Das Antigen wurde immobilisiert auf einem vorab überzogenen mit Polymer Kristall und die Frequenz-Veränderungen als ein Ergebnis der Ab-Assoziation, als Maß für die Analyten-Ab-Konzentration, wurde in der Probe bestimmt. Durch dieses Verfahren wurden menschliches IgG gegen Honigbienenvenom, Phospholipase A und Keyhold-Limpet-Hämocyanin analysiert⁽⁷⁾ Jedoch überlagerte nicht spezifisches Binden an dem Kristall mit diesen Analysen. In einem nachfolgenden Patent⁽⁸⁾ wurde der Nachweis von niedermolekular gewichtigen Komponenten durch einen vorab mit dem Anti-Ab überzogenen Kristall und via kompetitiven Bindungs-Assay (Ab-niedermolekularer Analyt) beschrieben. Alle diese Analysen wurden durchgeführt durch Behandlung der Kristalle in Lösung und nachfolgende Frequenz-Messungen an Luft. Diese zweischrittige Lösungs/Gas-Prozedur ermöglicht das Verbessern der Sensitivität von Resonanz-QCM, bringt aber technische Komplikationen mit sich, sowie die Interferenz des Hydrations-Dehydrations-Phänomens, welche in den Frequenzparametern reflektiert werden.
Die Untersuchung mittels piezoelektrischen Immunoassays in der flüssigen Phase hat wichtige technische Vorteile, da sie die stationäre und die Fluss-Analyse von wässrigen Proben ermöglicht. Das Verfahren leidet jedoch unter der prinzipiellen physikalischen Begrenzung aufgrund von substanziell geringeren Frequenz-Veränderungen des Kristalls als ein Ergebnis der Lösungs-Viskosität. QCM-Immunoassays in Lösung wurden von Roederer⁽⁷⁾ berichtet und in einem nachfolgenden Patent ⁽⁸⁾ adressiert. Der Quarz-Kristall wurde modifiziert mit Glycidoxypropyltrimethoxysilan (GOPS) und der Oberflächen-modifizierte Kristall wurde anschließend weiter modifiziert durch Anti-Human-IgG-Antikörper und anschließend appliziert für die piezoelektrische Detektion von menschlichem IgG. Die Nachweisgrenze der Vorrichtung wurde bestimmt als 13 μg·m^–1. Ein eng damit verwandter Ansatz wurde eingesetzt von Muramatsu et al. ⁽⁹⁾, wobei die Quarz-Kristalle an der Oberfläche modifiziert wurden durch γ-Aminopropyltriethoxysilan und weiter derivatisiert wurden durch Protein A. Die Oberflächen-modifizierten Kristalle wurden dann eingesetzt für die Bestimmung von menschlichem IgG in dem Konzentrations-Bereich von 10^–6–10^–2 mg·ml^–1. Ein damit verwandtes Patent offenbart die piezoelektrische Analyse von Thyroxin unter Verwendung eines Polyamid-6-polymers als Überzug und einem Anti-Thyroxin-Ab als Sensor-Grenzfläche⁽¹⁰⁾.
Die piezoelektrische Analyse von Antigenen von hohem Molekulargewicht, wie z. B. mikrobiologischen Zellen, wurde adressiert unter Verwendung von Quarzkristallen, die mit Antikörpern überzogen sind. C. albicans-Zellen in dem Konzentrationsbereich von 1·10⁶ bis 5·10⁸ Zellen·ml^–1 wurden analysiert unter Verwendung einer Anti-Candida albicans-Ab-Oberfläche⁽¹¹⁾ E. coli mit einer Anti-E. coli-Grenzfläche⁽¹²⁾ und Protein A-überzogene Kristalle dienten als piezoelektrische Sensor-Grenzfläche für eine Vielzahl von Bakterien, einschließend Salmonella, Shigella, Yersinia und E. coli⁽¹³⁾. Verschiedene Schemata, welche die effiziente Verwendung von QCM bei der Untersuchung von Analyten in einem flüssigen Medium ermöglichen, wurden beschrieben in WO 97/04314 ⁽¹⁴⁾.
Quarzkristall-basierte Biosensoren, die überzogen sind mit einem Anti-Analyten-Antikörper wurden offenbart⁽²⁰⁾ ebenso wie ein Biosensor, der einen Quarz-Oszillator umfasst, der Antikörper einschließt, die sensitiv für TNT sind⁽¹⁵⁾.
Einige Anti-TNT-Antikörper sind im Stand der Technik offenbart^(17–19).
QCM-Techniken wurden bislang nur zum Nachweis der Wechselwirkung mit Substanzen von relativ hohem Molekulargewicht eingesetzt, beispielsweise von Proteinen und anderen Makromolekülen. Die QCM-Techniken sind im Allgemeinen für den Fachmann nicht hinreichend sensitiv zum Nachweis von Substanzen von einem niedrigen Molekulargewicht.
GENERELLE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung hat als ihre Aufgabe die Bereitstellung eines Apparates, Systems sowie Verfahrens zum Nachweis von kleinen nachzuweisenden Molekülen in einer Probe.
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind:

2. Ein Protein, welches einen Antigen-bindenden Abschnitt umfasst, ausgebildet durch zwei kooperative Peptidesequenzen, wie sie in SEQ ID Nummern: 6 und 8 dargestellt sind.
3. Ein Protein entsprechend Ausführungsform 1 oder 2, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Monoklonalen Antikörpern, b) IgM Antikörpern, c) IgG Antikörpern, d) einem Fragment eines Antikörpers, der eine Antigenbindungsdomäne umfasst, e) einem Antikörper ohne die Fc Region, und f) einem einzelsträngigen Antikörper.
4. Ein Protein entsprechend Ausführungsform 1, welches ein monoklonaler IgG 1 Antikörper ist, abgeleitet von TNP-KLH-immunisierten Mäusen, hier bezeichnet als der 5B3-monoklonale Antikörper.
5. Ein Apparat zum Nachweis von kleinen Untersuchungs-Molekülen in einer Probe, umfassend: a) Ein Sensor-Element, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst mit zumindest einer Sensor-Oberfläche, welche mit einem Medium Wechselwirken kann, das in Kontakt damit ist, entweder durch Binden eines ersten Indikator-Agens aus dem Medium oder durch Freisetzen eines zweiten Indikator-Agens, das ursprünglich auf der Sensoroberfläche immobilisiert war, in das Medium; wobei das Medium entweder die Probe ist, und in diesem Fall das Untersuchungs-Molekül, wenn es vorliegt, die Freisetzung des zweiten Indikator-Agens verursacht aus der zumindest einen Sensor-Oberfläche, oder eine behandelte Proben-Präparation ist, die erhalten wird durch Umsetzen der Probe mit einer oder beider von einer Reagenz-Lösung oder einer Proben-Verarbeitungs-Hardware, so dass besagtes Medium ein erstes Indikator-Agens oder eine zweite Indikator-Agens-freisetzende Spezies, bei einer Konzentration von besagtem Agens oder besagter Spezies umfasst, welche in Korrelation mit der Konzentration des Untersuchungs-Moleküls in der Probe steht, und die Bindung oder Freisetzung in einer Veränderung der Masse der Sensoroberfläche resultiert; wobei besagte zumindest eine Sensor-Oberfläche Einfang-Agenzien trägt, welche an neutralisierende Agenzien binden, an einer Untersuchungs-Molekül-Bindungsdomäne des neutralisierenden Agens, und wobei besagte Einfang-Agenzien Untersuchungs-Moleküle, -Reste oder -Gruppen darstellen und besagte Neutralisierungs-Agenzien erste Antikörper umfassen, die an die Untersuchungs-Moleküle binden, und wobei besagte erste Antikörper die Proteine der Ausführungsformen 1 oder 2 sind, wobei besagte zumindest eine Sensor-Oberfläche Reste oder Gruppen der Untersuchungs-Moleküle trägt, die an besagte erste Antikörper gebunden sind, welche kompetitiv an lösliche Untersuchungs-Moleküle in einem Medium binden können, das in Kontakt mit zumindest einer Sensoroberfläche steht, wobei in der Gegenwart der Untersuchungs-Moleküle in besagtem Medium die Antikörper freigesetzt werden von der zumindest einen Sensoroberfläche. b) eine Test-Zelle zum Halten des Mediums und zum im Kontakt bringen von besagtem Medium mit besagter zumindest einer Sensoroberfläche; und c) eine elektrische oder elektronische Einheit zum Induzieren von Vibrationen in dem piezoelektrischen Kristall und zum Messen der Resonanz-Frequenz davon, wobei eine Veränderung in der Resonanz-Frequenz nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und dem Medium das Vorliegen der Untersuchungs-Moleküle in der Probe anzeigt.
6. Ein Apparat entsprechend Ausführungsform 5, wobei ein Grad der Veränderung in der Resonanz-Frequenz als ein Maß für das Niveau von besagtem Untersuchungs-Molekül in besagter Probe dient.
7. Ein Apparat entsprechend Ausführungsform 5, wobei besagtes Untersuchungs-Molekül ein explosives Molekül ist.
8. Ein Apparat entsprechend Ausführungsform 5 wobei besagter erster Antikörper das Protein von Anspruch 1 ist.
9. Ein Apparat entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 5 bis 8, wobei die ersten Antikörper gebunden oder komplexiert sind an ein Masse-verstärkendes Agens.
10. Ein Apparat entsprechend Ausführungsform 9, wobei besagtes Masse-verstärkendes Agens einen zweiten Antikörper umfasst, der an besagten ersten Antikörper bindet oder Avidin oder Streptavidin umfasst, gebunden an einen Biotinrest, der mit dem ersten Antikörper konjugiert ist.
11. Ein Apparat entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 5 bis 10, wobei besagtes Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
12. Ein System zum Nachweis kleiner Untersuchungs-Moleküle in einer Probe umfassend: a) ein Sensorelement, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst mit zumindest einer Sensoroberfläche, welche Reste oder Gruppen von besagten Untersuchungs-Molekülen trägt, gebunden an ein Proteinmolekül, welches das Protein von einer der Ausführungsformen 1 oder 2 ist; b) eine Test-Zelle zum Halten eines Mediums und In-Kontakt-Bringen mit besagter zumindest einer Sensoroberfläche, wobei in der Gegenwart des Untersuchungs-Moleküls in dem Medium zumindest einige von besagten Proteinmolekülen in das Medium freigesetzt werden; c) Hardware zum Einbringen der Probe in das Testgefäß; d) e) eine elektrische oder elektronische Einheit zum Induzieren von Vibrationen in dem piezoelektrischen Kristall und Messen der Resonanz-Frequenz davon, wobei eine Reduktion der Resonanz-Frequenzen nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und dem Medium das Vorliegen von besagtem Untersuchungs-Molekül in der Probe anzeigt.
13. Ein System entsprechend Ausführungsform 12, wobei besagtes Untersuchungs-Molekül ein explosives Molekül ist.
14. Ein System entsprechend Ausführungsform 13, wobei besagtes Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
15. Ein System entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 12 bis 14, wobei die Proteinmoleküle an Masse-verstärkende Agenzien gebunden sind.
16. Ein System entsprechend Ausführungsform 15, wobei besagtes Masse-verstärkendes Agens einen zweiten Antikörper umfasst oder Avidin oder ein Streptavidin, welche an eine Biotingruppe binden, die an das Proteinmolekül konjugiert ist.
17. Ein System zum Nachweis kleiner Untersuchungs-Moleküle in einer Probe umfassend: a) Ein Sensor-Element, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst, der zumindest eine Sensoroberfläche aufweist, die Reste oder Gruppen der Untersuchungs-Moleküle trägt; b) ein Reagenz-System umfassend ein Proteinmolekül, welches das Protein von Ausführungsformen 1 oder 2 ist; c) eine Test-Zelle zum Halten eines Mediums und In-Kontakt-Bringen eines Mediums mit besagter zumindest einer Sensor-Oberfläche, wobei in der Gegenwart der Untersuchungs-Moleküle in dem Medium zumindest einige der Proteinmoleküle in das Medium freigesetzt werden; d) eine Anordnung zum In-Kontakt-Bringen der Probe mit besagtem Reagenzsystem, um eine behandelte Probenpräparation zu erhalten und zum Einbringen der behandelten Probepräparation in das Testgefäß; und e) eine elektrische oder elektronische Einheit zum Induzieren von Vibrationen in dem piezoelektrischen Kristall und zum Messen der Resonanz-Frequenz davon, wobei eine Abnahme in der Resonanz-Frequenz nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und der behandelten Proben-Präparation anzeigt, dass die Probe frei von den Untersuchungs-Molekülen ist.
18. Ein System entsprechend Ausführungsform 17, wobei das Untersuchungs-Molekül ein explosives Molekül ist.
19. Ein System entsprechend Ausführungsform 18, wobei das Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
20. Ein System entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 17 bis 19, umfassend ein Masse-verstärkendes Agens zum Binden an besagtes Protein-Molekül.
21. Ein System entsprechend Ausführungsform 20, wobei besagtes Masse-verstärkendes Agens einen zweiten Antikörper umfasst oder Avidin oder Streptavidin, welche an eine Biotingruppe binden, die an das Proteinmolekül konjugiert ist.
22. Ein System zum Nachweis kleiner Untersuchungs-Moleküle in einer Probe umfassender: a) ein Sensorelement, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst mit zumindest einer Sensoroberfläche, welche Einfang-Agenzien trägt zum Binden an ein Proteinmolekül, welches das Protein entsprechend Ausführungsformen 1 oder 2 ist; b) eine Test-Zelle zum Halten eines Mediums und in Kontakt bringen des Mediums mit zumindest einer Sensoroberfläche; c) ein Reagenzsystem, das besagtes Proteinmolekül umfasst, welches an die Untersuchungs-Moleküle binden kann; d) eine Anordnung zum In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem Reagenzsystem unter Bedingungen und für einen Zeitraum, der das Binden von besagtem Proteinmolekül an die Untersuchungs-Moleküle erlaubt, um eine behandelte Probenpräparation zu erhalten; e) ein Filtrationssystem zum Herausfiltern von besagten Proteinmolekülen, das nicht an das explosive Molekül gebunden ist, aus besagter behandelter Probenpräparation, um ein Filtrat zu erhalten, das essentiell frei ist von einem solchen ungebundenen Proteinmolekül; f) eine Anordnung zum Transfer von besagtem Filtrat in besagte Test-Zelle; und g) eine elektrische oder elektronische Einheit zum Induzieren von Vibrationen in den piezoelektrischen Kristall und zum Messen der Resonanzenergie davon, wobei eine Zunahme in der Resonanz-Frequenz nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und dem Filtrat das Vorliegen der Untersuchungs-Moleküle in der Probe anzeigt.
23. Ein System entsprechend Ausführungsform 22, wobei das Untersuchungs-Molekül ein explosives Molekül ist.
24. Ein System entsprechend Ausführungsform 23, wobei das Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
25. Ein System entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 22 bis 24, wobei besagtes Filtrationssystem immobilisierte Reste oder Gruppen von Molekülen des Untersuchungs-Moleküls umfasst.
26. Ein System entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 22 bis 25, wobei besagtes Proteinmolekül konjugiert ist an eine Gruppe, die an besagte Einfang-Agenzien bindet.
27. Ein System entsprechend Ausführungsform 26, wobei besagte Gruppe ein Biotinrest ist und besagtes Einfang-Agens Avidin oder Streptavidin ist.
28. Ein System zum Nachweis kleiner Untersuchungs-Moleküle in einer Probe, umfassend: a) Ein Sensorelement, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst mit zumindest einer Sensoroberfläche, welche Einfang-Agenzien trägt, die an ein Proteinmolekül binden, welches das Protein entsprechend Ausführungsformen 1 oder 2 ist, das konjugiert ist an ein Enzym, welches eine Reaktion katalysieren kann, die zu einem unlöslichen Reaktionsprodukt führt; b) eine Test-Zelle zum Halten eines Mediums und zum In-Kontakt-Bringen mit besagter zumindest einer Sensoroberfläche; c) ein Reagenzsystem umfassend besagtes Proteinmolekül, welches an die Untersuchungs-Moleküle binden kann, wobei besagtes Proteinmolekül an ein Enzym konjugiert ist, welches eine Reaktion katalysieren kann, die zu einem unlöslichen Reaktionsprodukt führt; d) eine Anordnung zum In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem Reagenzsystem unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die das Binden von besagtem Proteinmolekül an die Untersuchungs-Moleküle erlauben, um eine behandelte Probenpräparation zu erhalten; e) ein Filtrationssystem zum Herausfiltern von besagtem Proteinmolekül, das nicht an ein Untersuchungs-Molekül gebunden ist, aus besagter behandelter Probenpräparation, um ein Filtrat zu erhalten, das essentiell frei ist von solchem ungebundenen Proteinmolekül; f) eine Anordnung zum Transfer von besagtem Filtrat in besagte Test-Zelle; g) ein Ensemble von Reagenzien und Bedingungen zum Induzieren von besagtem Enzym, um die Reaktion zu katalysieren, die das unlösliche Reaktionsprodukt erzeugt; und h) eine elektrische oder elektronische Einheit zum Induzieren von Vibrationen in dem piezoelektrischen Kristall und zum Messen der Resonanz-Frequenz davon, wobei eine Zunahme in der Resonanz-Frequenz nach Kontakt zwischen der Sensor-Oberfläche und dem Filtrat oder nach dem Ermöglichen der Katalysierung besagter Reaktion durch das Enzym das Vorliegen des Untersuchungs-Moleküls in der Probe anzeigt.
29. Ein System entsprechend Ausführungsform 28, wobei das Untersuchungs-Molekül ein explosives Molekül ist.
30. Ein System entsprechend Ausführungsform 29, wobei das Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
31. Ein System entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 29 oder 30, wobei besagtes Filtrationssystem immobilisierte Reste oder Gruppen der Untersuchungs-Moleküle umfasst.
32. Ein System gemäß irgendeinem der Ausführungsformen 29 bis 31, wobei besagtes Einfang-Agens ein immobilisierter Antikörper ist, der an eine Gruppe von besagtem Enzym bindet, wobei besagtes Binden nicht mit der katalytischen Aktivität von besagtem Enzym wechselwirkt.
33. Ein System gemäß irgendeinem der Ausführungsformen 28 bis 32, wobei besagtes Enzym ausgebildet aus der Gruppe bestehend aus Meerretichperoxidase, Mikroperoxidase, alkalischer Phosphatase, Glukoseoxidase und Galaktosidase.
34. Ein System gemäß irgendeinem der Ausführungsformen 12 bis 33, wobei besagte Hardware ein Flusssystem umfasst, zum Vorwärtstreiben eines Mediums, das die Probe umfasst, in besagte Zelle.
35. Ein Verfahren zum Nachweis eines kleinen Untersuchungs-Moleküls in einer Probe, umfassend: a) Bereitstellen eines Sensorelements, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst mit zumindest einer Sensoroberfläche, welche Reste oder Gruppen trägt von besagtem Untersuchungs-Molekül, gebunden an ein Proteinmolekül, welches das Protein entsprechend Ausführungsformen 1 oder 2 ist; b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit zumindest einer Sensoroberfläche; c) Induzieren von Vibrationen in dem piezoelektrischen Kristall und Messen der Resonanz-Frequenz davon; und d) Bestimmen, ob eine Zunahme in der Resonanz-Frequenz auftrat nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und dem Medium, wobei eine solche Zunahme das Vorliegen des Untersuchungs-Moleküls in der Probe anzeigt.
36. Ein Verfahren entsprechend Ausführungsform 35, wobei die Untersuchungs-Moleküle explosive Moleküle sind.
37. Ein Verfahren entsprechend Ausführungsformen 35 bis 36, wobei das Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
38. Eine Verfahren entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 35 bis 37, umfassend das Binden eines Masse-verstärkenden Agens an die Antikörper.
39. Ein Verfahren entsprechend Ausführungsform 38, wobei besagtes Masse-verstärkendes Agens einen zweiten Antikörper umfasst oder ein Avidin- oder ein Streptavidin-Molekül, welches an eine Biotin-Gruppe bindet, die an das Proteinmolekül gebunden ist.
40. Ein Verfahren zum Nachweis eines kleines Untersuchungs-Moleküls in einer Probe umfassend: a) Bereitstellen eines Sensor-Elements, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst mit zumindest einer Sensoroberfläche, welche Reste oder Gruppen der Untersuchungs-Moleküle trägt; b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Proteinmolekül, welches das Protein von irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2 ist, und Inkubieren für eine Zeit, die es den Antikörpern erlaubt, an die Untersuchungs-Moleküle zu binden, falls sie in der Probe vorliegen, um eine behandelte Probenpräparation zu erhalten; c) In-Kontakt-Bringen der behandelten Probenpräparation mit der zumindest einen Sensoroberfläche; d) Induzieren von Vibrationen in den piezoelektrischen Kristall und Messen der Resonanz-Frequenz davon; und e) Bestimmen, ob eine Abnahme in der Resonanz-Frequenz nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und der behandelten Probenpräparation auftrat, wobei eine solche Abnahme das Vorliegen des Untersuchungs-Moleküls in der Probe anzeigt.
41. Ein Verfahren entsprechend Ausführungsform 40, wobei das Untersuchungs-Molekül ein explosives Molekül ist.
42. Ein Verfahren entsprechend Ausführungsform 41, wobei das Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
43. Ein Verfahren entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 40 bis 42, umfassend das Binden eines Masse-verstärkenden Antikörpers an das Proteinmolekül.
44. Ein Verfahren entsprechend Ausführungsform 43, wobei besagtes Masse-verstärkendes Agens einen zweiten Antikörper umfasst oder ein Avidin- oder ein Streptavidin-Molekül, welches an eine Biotingruppe bindet, die an das Proteinmolekül gekoppelt ist.
45. Ein Verfahren zum Nachweis eines kleinen Untersuchungs-Moleküls in einer Probe, umfassend: a) Bereitstellen eines Sensorelements umfassend ein piezoelektrisches Kristall mit zumindest einer Sensoroberfläche, welche Einfang-Agenzien trägt, zum Binden an ein Proteinmolekül, welches das Protein entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 1 oder 2 ist; b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit besagtem Proteinmolekül, welches an die untersuchten Moleküle binden kann, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die das Binden besagtem Proteinmolekül an die Untersuchungs-Moleküle erlauben, um eine behandelte Probenpräparation zu erhalten; c) Filtern der behandelten Probenpräparation durch ein Filtrationssystem, um besagtes Proteinmolekül herauszufiltern, das nicht an die Untersuchungs-Moleküle gebunden ist, um ein Filtrat zu erhalten, das essentiell frei ist von solchem ungebundenen Proteinmolekül; d) In-Kontakt-Bringen von besagtem Filtrat mit der zumindest einen Sensoroberfläche; e) Induzieren von Vibrationen in dem piezoelektrischen Kristall und Messen der Resonanz-Frequenz davon; f) Bestimmen, ob eine Zunahme in der Resonanz-Frequenz auftrat nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und der behandelten Probenpräparation, wobei eine solche Zunahme das Vorliegen der Untersuchungs-Moleküle in der Probe anzeigt.
46. Ein Verfahren entsprechend Ausführungsform 45, wobei die Untersuchungs-Moleküle explosive Moleküle sind.
47. Ein Verfahren entsprechend Ausführungsform 46, wobei das Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
48. Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ausführungsformen 45 bis 47, wobei besagtes Filtrationssystem immobilisierte Reste oder Gruppen der Untersuchungs-Moleküle umfasst.
49. Ein Verfahren entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 45 bis 48, wobei besagtes Proteinmolekül eine Gruppe konjugiert ist, die an besagte Einfang-Agenzien bindet.
50. Ein Verfahren entsprechend Ausführungsform 49, wobei besagte Gruppe ein Biotinrest ist und besagtes Einfang-Agens Avidin oder Streptavidin ist.
51. Ein Verfahren zum Nachweis eines kleinen Untersuchungs-Moleküls in einer Probe, umfassend: a) Bereitstellen eines Sensorelements, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst mit zumindest einer Sensoroberfläche, welche Einfangagenzien trägt zum Binden an ein Proteinmolekül, welches das Protein entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 1 oder 2 ist; das konjugiert ist an ein Enzym, welches eine Reaktion katalysieren kann, die zu einem unlöslichen Reaktionsprodukt führt; b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit besagten Proteinmolekül, welches an die Untersuchungs-Moleküle binden kann, wobei besagtes Proteinmolekül an ein Enzym konjugiert ist, das eine Reaktion katalysieren kann, die zu einem unlöslichen Reaktionsprodukt führt, für einen Zeitraum, der das Binden von besagtem Proteinmolekül an die Untersuchungs-Moleküle erlaubt, um eine behandelte Probenpräparation zu erhalten, c) Filtern der behandelten Probenpräparationen durch ein Filtrationssystem, um besagtes Proteinmolekül, das nicht an die Untersuchungs-Moleküle gebunden ist, herauszufiltern, um ein Filtrat zu erhalten, das essentiell frei von solchem ungebundenen Proteinmolekül ist; d) In-Kontakt-Bringen von besagtem Filtrat mit der zumindest einen Sensor-Oberfläche; e) Anwenden von Bedingungen, welche ermöglichen, dass das Enzym die Produktion des unlöslichen Reaktionsproduktes katalysiert; f) Induzieren von Vibrationen in dem piezoelektrischen Kristall und Messen der Resonanz-Frequenz davon; und g) Bestimmen, ob eine Abnahme in der Resonanz-Frequenz nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und besagtem Filtrat auftrat oder nach Anwenden von besagtem Bedingungen, wobei eine solche Abnahme das Vorliegen der Untersuchungs-Moleküle in der Probe anzeigt.
52. Ein Verfahren entsprechend Ausführungsform 51, wobei das Untersuchungs-Molekül ein explosives Molekül ist.
53. Ein Verfahren entsprechend Ausführungsform 52, wobei das Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
54. Ein Verfahren entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 52 bis 53, wobei besagtes Filtrationssystem immobilisierte Reste oder Gruppen von besagtem Untersuchungs-Molekül umfasst.
55. Ein Verfahren entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 52 bis 54, wobei besagtes Einfang-Agens ein immobilisierender Antikörper ist, der an eine Gruppe von besagtem Enzym bindet, wobei solch ein Binden nicht mit der katalytischen Aktivität von besagtem Enzym wechselwirkt.
56. Ein Verfahren entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 52 bis 55, wobei besagtes Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Meerretichperoxidase, Mikroperoxidase, alkalischer Phosphatase, Glucoseoxidase und Galactosidase.
57. Ein Verfahren entsprechend irgendeinem der Ausführungsformen 35 bis 56, wobei der Grad der Veränderung in der Resonanz-Frequenz als ein Maß des Niveaus von besagtem Molekül in besagter Probe dient.

Der Begriff "Nachweis", wie er hier verwendet wird, soll entweder die qualitative Bestimmung der Existenz eines explosiven Stoffe in einer Probe kennzeichnen oder eine quantitative Analyse der Menge oder Konzentration solch eines explosiven Stoffes in der Probe oder beides.
Der Begriff "Probe" soll eine flüssige Präparation kennzeichnen, welche entweder eine Probe darstellt, in welcher ein explosiver Stoff nachzuweisen ist, oder ein Fraktionierungs-Produkt sein kann, welches die explosive Substanz, falls sie in einer Probe vorliegt, enthält, oder kann im Allgemeinen jegliche Art von Präparation sein, in welcher der Grad des explosiven Stoffes indikativ ist für das Niveau des explosiven Stoffes in der Probe. Die Proben, welche getestet werden sollen in Übereinstimmung mit der Erfindung, können eine ursprüngliche flüssige Probe sein, d. h. Proben, die aus Wasser-Reservoiren gewonnen wurden, können schlammartige Proben sein oder gasförmige Proben sein. Im Falle von Gasen oder schlammartigen Proben werden diese typischerweise zuerst umgesetzt mit einer Flüssigkeit in einer Art und Weise, dass zumindest einige der explosiven Moleküle, falls sie in der Probe vorliegen, in der Flüssigkeit aufgelöst werden, typischerweise einer wässrigen Lösung.
Der Begriff "kleines Molekül", wie er hier verwendet wird, soll ein Molekül bezeichnen mit einem Molekulargewicht, das so ist, dass sein Binden an eine Sensor-Oberfläche in einer Menge, von der man erwartet, dass sie sich in einer Probe findet, nicht zu einer nachweisbaren Massen-Veränderung der Sensor-Oberfläche führen wird. Insbesondere betrifft der Begriff "kleine Moleküle", wie er hier verwendet wird, Moleküle, die ein Molekulargewicht aufweisen, das unterhalb von ungefähr 5000 Dalton liegt, typischerweise unterhalb von ungefähr 1500 Dalton, gegebenenfalls sogar unterhalb von ungefähr 500 Dalton. Spezifische Beispiele von kleinen Molekülen können nachgewiesen werden in Übereinstimmung mit der Erfindung und sind explosive Moleküle, welche DNT und TNT einschließen, jedoch nicht darauf begrenzt sind.
Explosive Substanzen weisen eine relativ geringe Volalität auf und entsprechend entfällt eine Probe, selbst wenn sie aus der Umgebung eines Explosivstoffes entnommen wurde, typischer weise nur eine kleine Menge solcher Moleküle. Folglich sollte jedes Verfahren, das dazu gedacht ist, das Vorliegen von explosiven Substanzen in einer Probe nachzuweisen, hochsensitiv sein und angepasst sein zum Nachweis einer kleinen Menge der explosiven Moleküle. Dies kann der Fall sein auch mit Blick auf die anderen Typen von niedermolekular gewichtigen Molekülen, die auch untersucht werden können, wie z. B. Wirksubstanzen, (Proben), beispielsweise Heroin, Kokain, etc.
Die vorliegende Erfindung stellt in einem ersten ihrer Aspekte einen Apparat bereit zum Nachweis von kleinen zu untersuchenden Molekülen in einer Probe entsprechend der Ausführungsform (5).
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Verfügung zum Nachweis eines kleinen Moleküls in einer Probe entsprechend den Ausführungsformen 35, 40, 45 und 51.
In Übereinstimmung mit einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das kleine Molekül ein explosiver Stoff. Insbesondere sind nicht limitierende Beispiele von explosiven Stoffen Dinitrololuol (DNT) und 2,4,6-Trinitrotoluol (TNT).
Der Apparat der Erfindung kann so konzipiert sein, dass er eine Ja- oder Nein-Antwort liefert, nämlich eine Angabe, ob das zu untersuchende kleine Molekül in einer Probe vorliegt oder nicht. Alternativ kann der Apparat auch so verwendet werden bzw. konzipiert sein, dass er eine quantitative Antwort bereitstellt, nämlich eine Antwort, die vom Niveau des zu untersuchenden Moleküls in der Probe abhängt.
In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung trägt besagte zumindest eine Sensor-Oberfläche einfangende Agenzien, welche an neutralisierende Agenzien binden auf Bindungs-Domäne eines zu untersuchenden Moleküls. In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform ist das Sensor-Element in Kontakt mit einem Medium, welche die einfangenden Agenzien einschließt, bei einer Konzentration, die invers die Konzentration der zu untersuchenden Moleküle in der Probe reflektiert. In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform wird die Probe zunächst in Kontakt gebracht mit einer Reagenz-Lösung, welche die neutralisierenden Agenzien umfasst, welche dann die zu untersuchenden Moleküle binden, falls solche in der Probe vorliegen. Diese behandelte Präparation wird dann in Kontakt gebracht mit der zumindest einen Sensor-Oberfläche. Die neutralisierenden Agenzien, die an die zu untersuchenden Moleküle gebunden sind, sind nicht mehr frei, an die einfangenden Agenzien zu binden. Folglich wird, wo die Probe frei ist von zu untersuchenden Molekülen, eine relativ große Anzahl von neutralisierenden Agenzien frei sein und so an die einfangenden Agenzien auf der zumindest einen Sensor-Oberfläche binden. Wo die Probe die zu untersuchenden Moleküle enthält, werden weniger neutralisierende Agenzien sein, die frei sind, an die einfangenden Agenzien zu binden. Folglich ist die Abnahme in der Resonanz-Frequenz, indikativ für eine erhöhte immobilisierte Masse auf einer Oberfläche, eine reverse Indikation des Vorliegens des zu untersuchenden Moleküls in der Probe: eine relativ große Abnahme in der Resonanz-Frequenz zeigt die Abwesenheit oder eine kleine Konzentration der zu untersuchenden Moleküle in der Probe und keine oder nur eine geringe Abnahme zeigt das Vorliegen des zu untersuchenden Moleküls in der Probe an. Das Ausmaß der Abnahme in der Resonanz-Frequenz gegen die Kontrolle kann verwendet werden als eine umgekehrte Angabe der Konzentration des zu untersuchenden Moleküls in der Probe. Die einfangenden Agenzien sind typischerweise Reste oder Gruppen der zu untersuchenden Moleküle und die neutralisierenden Agenzien können erste Antikörper umfassen, welche eine relativ hohe spezifische Bindungsaffinität zu den zu untersuchenden Molekülen aufweisen.
Der Begriff "Antikörper", wie er hier verwendet wird, soll Antikörper von verschiedenen Art einschließen, ist jedoch nicht begrenzt auf IgG- oder IgM-Antikörper, die polyklonal oder monoklonal (mAb) sein können. Darüber hinaus schließt der Begriff "Antikörper" auch verschiedene Derivate von Antikörpern ein, welche die Antigen-Bindungs-Domäne des Antikörpers einschließen. Solche Derivate können Fc-freie Antikörper einschließen (Antikörper, denen die konstante Region fehlt), einzelkettige Antikörper, Konstrukte, die nur die variable Region der Antikörper, etc. umfassen.
In Übereinstimmung mit einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung trägt die zumindest eine Sensor-Oberfläche Reste oder Gruppen der untersuchten Moleküle, die an die ersten Antikörper gebunden sind, welche kompetitiv an die löslichen zu untersuchenden Moleküle in einem Medium binden, welches in Kontakt kommt mit zumindest einer Sensor-Oberfläche. In der Gegenwart des zu untersuchenden Moleküls in besagtem Medium werden die Antikörper freigesetzt von der zumindest einen Sensor-Oberfläche, so dass in die zu untersuchenden Moleküle binden. Ein Assay, in dem ein Apparat in Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform verwendet wird, schließt eine essentielle kompetitive Reaktion ein zwischen den zu untersuchenden Molekülen und dem einfangenden Agens um das Binden an das neutralisierende Agens. In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform wird die Probe in Kontakt gebracht direkt mit der zumindest einen Sensor-Oberfläche. In der Ge genwart des zu untersuchenden Moleküls in der Probe werden neutralisierende Agenzien freigesetzt von der Sensor-Oberfläche, so dass sie die zu untersuchenden Moleküle in dieser umgebenden Lösung finden. Folglich wird eine Zunahme in der Resonanz-Frequenz, indikativ für die Abnahme der Masse, die auf der zumindest einen Sensor-Oberfläche immobilisiert ist, nur das Vorliegen des zu untersuchenden Moleküls in der Probe anzeigen. Demgegenüber zeigt das Fehlen einer Veränderung oder nur eine kleine Veränderung in der Resonanz-Frequenz keine oder nur eine geringe Menge des zu untersuchenden Moleküls in der Probe an.
Die ersten Antikörper in beiden der oben genannten Ausführungsformen können gebunden werden oder können komplexiert werden mit einem Masse-erhöhenden Agens zum Zwecke der Vervielfältigung (Amplifikation) der Antwort. Ein Masse-erhöhendes Agens kann beispielsweise ein großer molekularer Komplex sein, wie z. B. ein Protein, das an den Antikörper konjugiert ist, oder ein Kolloid-Partikel, wie z. B. ein Gold-Kolloid, das an den ersten Antikörper gebildet ist. Solch ein zweiter Antikörper kann mit anderen Agenzien konjugiert sein oder an andere Agenzien komplexiert sein, wie z. B. an Kolloid-Partikel, an einen molekularen Komplex, etc. Darüber hinaus kann das Masse-erhöhende Agens in einer bevorzugten Ausführungsform einen zweiten Antikörper umfassen, der an besagtem ersten Antikörper bindet. Darüber hinaus umfasst in noch einer weiteren Ausführungsform das Masse-erhöhende Agens, das irgendeines der Agenzien sein kann, die oben genannt wurden, Avidin oder Streptavidin, welches dann an einem Biotinrest bindet, der mit besagtem ersten Antikörper konjugiert ist. Das Masse-erhöhende Agens kann entweder vor der Befähigung des ersten Antikörpers, an die zumindest eine Sensor-Oberfläche zu binden oder danach hinzugefügt werden. Wo ein Masse-erhöhendes Agens eingesetzt wird, wird die Veränderung in der Masse, falls ein Ergebnis des Bindens zur Freisetzung des neutralisierenden Agens merklich größer sein und konsequenterweise wird ein größeres Signal-zu-Rausch-Verhältnis auftreten.
Wie oben erläutert, ist das zu untersuchende Molekül typischerweise in explosives Molekül, wie z. B. DNT oder TNT. In solch einem Fall sind besagte erste Antikörper, welche typischerweise mAbs sind, vorzugsweise mAbs mit der Bindungs-Charakteristik von 5B3, insbesondere in dem 5B3 mAb selbst.
Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren ein System zur Verfügung zum Nachweis von kleinen zu untersuchenden Molekülen in einer Probe, wie dies dargestellt wird in den Ausführungsformen 12, 17, 22 oder 28.
In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform, welche hier als die "Ersetzungs-Ausführungsform" bezeichnet wird, ist das System eines von Ausführungsform 5.
In Übereinstimmung mit dieser Ersetzungs-Ausführungsform wird die Probe in Kontakt gebracht mit der Sensor-Oberfläche und anschließend werden Vibrationen induziert in dem piezoelektrischen Kristall, um die Resonanz-Frequenz zu messen. Aufgrund einer Bindungs-Kompetition, wenn die Probe zu untersuchende Moleküle umfasst, werden einige der neutralisierenden Agenzien freigesetzt und binden an die zu untersuchenden Moleküle in der Probe mit den Ergebnissen in der Reduktion der Masse von Sensor-Oberfläche und folglich einer Zunahme in der Resonanz-Frequenz. Solch eine Zunahme ist dann indikativ dafür, dass das zu untersuchende Molekül in der Probe vorliegt.
In Überstimmung mit einer anderen Ausführungsform, welche hier als die "Kompetitions-Ausführungsform" ("kompetitive Ausführungsform") bezeichnet wird, ist das System eines gemäß Ausführungsform 17.
In Übereinstimmung mit der Kompetitions-Ausführungsform wird die Probe in Kontakt gebracht mit neutralisierenden Agenzien und inkubiert über einen Zeitraum, der es ermöglicht, dass die neutralisierenden Agenzien an die zu untersuchenden Moleküle binden, falls solche in der Probe vorliegen. Diese behandelte Probenpräparation wird dann in Kontakt gebracht mit zumindest einer Sensor-Oberfläche. In der Gegenwart der zu untersuchenden Moleküle in der Probe werden die neutralisierenden Agenzien diese Moleküle binden und werden folglich nicht frei sein, an die einfangenden Agenzien zu binden. Folglich wird in der Gegenwart der zu untersuchenden Moleküle in der Probe keine oder nur eine geringe Veränderung in der Resonanz-Frequenz des Kristalls auftreten. Falls die Probe frei von den zu untersuchenden Molekülen ist, werden die neutralisierenden Agenzien frei sein, an die einfangenden Agenzien zu binden, was zu einer signifikanten Massen-Zunahme führen wird und folglich zu einer Abnahme in der Resonanz-Frequenz des Kristalls. Folglich wird solch eine Abnahme die Abwesenheit der zu untersuchenden Moleküle aus der Probe anzeigen.
In Übereinstimmung mit einer anderen Ausführungsform, die hier als die "grundlegende Filtrations-Ausführungsform" bezeichnet wird, ist das System ein System von Ausführungsform 22.
In Übereinstimmung mit der grundlegenden Filtrations-Ausführungsform wird die Probe in Kontakt gebracht mit einem neutralisierenden Agens, typischerweise mit einem Antikörper, welcher an die zu untersuchenden Moleküle binden kann. Die Inkubation der Probe mit dem neutralisierenden Agens wird kontaktiert unter Bedingungen und über einen Zeitraum hinweg, die es ermöglichen, dass die neutralisierenden Agenzien an die zu untersuchenden Moleküle binden, wodurch eine behandelte Probenpräparation erhalten wird. Die behandelte Probenpräparation wird dann filtriert durch das Filtrations-System, um die neutralisierenden Agenzien herauszufiltern, welche nicht an die zu untersuchenden Moleküle gebunden sind, um dadurch ein Filtrat zu erhalten, dass essentiell frei ist von solchen ungebundenen neutralisierenden Agenzien. Das Filtrat wird dann in Kontakt gebracht mit der zumindest einen Sensor-Oberfläche. Wo die Probe die zu untersuchenden Moleküle enthielt, werden die neutralisierenden Agenzien durch das Filtrations-System gefiltert und werden eventuell an zumindest eine Sensor-Oberfläche binden, was in einer Massen-Zunahme resultiert. In der Abwesenheit der zu untersuchenden Moleküle in der Probe werden die neutralisierenden Agenzien eingefangen innerhalb des Filtrations-Systems und Kontakt des Filtrats mit der Sensor-Oberfläche wird nicht zu einer Zunahme in der Masse führen. Folglich wird eine Abnahme in der Resonanz-Frequenz, die indikativ ist für das Binden von neutralisierenden Agenzien zu zumindest einer Sensor-Oberfläche, die Präsenz der zu untersuchenden Moleküle in der Probe kennzeichnen.
In Übereinstimmung mit noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung, welche hier bezeichnet wird als "Enzym-Ausführungsform", ist das System ein System von Ausführungsform 28.
Diese Ausführungsform ist in gewisser Weise ähnlich zu der zuvor beschriebenen Ausführungsform, der Unterschied besteht darin, dass eine zusätzliche Amplifikations-Sequenz vorliegt, welche es dem Enzym ermöglicht, eine Reaktion, welche zu unlöslichen Reaktions-Produkten führt, zu katalysieren, was in der Gegenwart des zu untersuchenden Moleküls der Probe eine höhere Zunahme in der Masse ergibt und folglich eine höhere Abnahme in der Resonanz-Sequenz.
Die Erfindung stellt auch in anderen Aspekten ein Protein, wie in Ausführungsform 1 dargestellt, zur Verfügung, beispielsweise einen monoklonalen Antikörper, der hier als 5B3 bezeichnet wird. Die Nukleotid-Sequenz und reduzierte Aminosäure-Sequenz der schweren und leichten veränderlichen variablen Regionen des 5B3-monoklonalen Antikörpers sind in den 3A bzw. 3B dargestellt. Ein Antigen-Bindungs-Abschnitt eines Antikörpers kann fusioniert sein (chemisch oder durch Erzeugen eines fusionierten Gens, welches die kodierende Sequenz einschließt und durch Exprimieren solch einer Sequenz) und zwar in einer Art und Weise, dass besagter Antigen-Bindungs-Abschnitt in resultierenden fusioniertem Protein seine Antigen-Bindungs-Spezifität beibehält. Folglich umfasst die vorliegende Erfindung, wie sie in den Ansprüchen dargestellt ist, in ihrem Umfang jegliche Art von Protein, speziell einen Antikörper, welches einen Antigen-Bindungs-Abschnitt einschließt, der substanziell die gleiche Antigen-Bindungs-Spezifität des 5B3-Antikörpers aufweist und zwei kooperierende Peptid-Sequenzen aufweist, welche die Sequenzen der 3A bzw. 3B sind, oder von einer veränderten Sequenz davon, wie sie unten definiert wird. Solch ein Antikörper kann von irgendeinem bekannten Typ sein, beispielsweise IgM oder IgG, kann ein Fragment darstellen eines Antikörpers, das die Antigen-Bindungs-Domäne umfasst, beispielsweise Fab, ein Antikörper sein ohne die Fc-Region, ein einzelkettiger Antikörper, etc.
Wie leicht von einem Fachmann auf dem Gebiet zugestanden werden wird, ist es möglich, beizeiten den variablen Antigen-Bindungs-Abschnitt zu verändern, um einen veränderten Abschnitt zu erhalten, und zwar durch Hinzufügen von einem oder mehreren Aminosäure-Resten, durch Deletion von einem oder mehreren Aminosäure-Resten oder durch Ersetzen von einem oder mehreren Aminosäure-Reste durch andere Reste, und zwar so, dass der veränderte Abschnitt substanziell die gleiche Antigen-Bindungs-Spezifität des nicht veränderten Abschnittes, d. h. diejenige des 5B3-Antikörpers, beibehält. Folglich sind solche veränderten variablen Regionen, die auch Antikörper oder andere Produkte, welche solche veränderten variablen Regionen einschließen, wobei die veränderte variable Region substanziell die gleiche Antigen-Bindungs-Spezifität der nicht veränderten variablen Region beibehält (nämlich diejenige, die dargestellt wird in den 3A und 3B), auch eingeschlossen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, wie er in den Ausführungsformen 1 oder 2 definiert wird.
Der Begriff "substanziell die gleiche Antigen-Bindungs-Spezifität beibehalten" sollte so verstanden werden, dass er bedeutet, dass der veränderte Abschnitt die Fähigkeit hat, an ein Antigen zu binden (beispielsweise TNT oder DNT), das durch den nicht-veränderten Abschnitt gebunden wird mit einer Affinität, die merklich höher ist (typischerweise durch einige Größenordnung) als die Affinität der Bindung zu anderen Antigenen. Solch ein veränderter Abschnitt kann eine Bindungs-Affinität an das Antigen aufweisen, welche ungefähr die gleiche sein kann, wie diejenige des nicht-veränderten Abschnittes oder mit der Bindungs-Affinität, welche gegebenenfalls etwas höher sein kann oder etwas niedriger sein kann als diejenige des nicht-veränderten Abschnittes.
Die zumindest eine Sensor-Oberfläche trägt typischerweise eine Metallplatte, die speziell aus solchen Metallen besteht, welche die Fähigkeit haben, an eine Schwefel enthaltende Gruppe chemisch zu assoziieren, anzubinden oder zu chemisorbieren. Die Metallplatten bestehen vorzugsweise bzw. sind überzogen durch Metalle, wie z. B. Gold, Platin, Silber oder Kupfer. Wo die einfangenden Agenzien auf Metallplatten getragen werden, dienen diese typischerweise folglich für eine zweifache Funktion, nämlich sowohl dazu, dass sie als tragende Matrix für das einfangende Agens dienen, als auch eine Elektrode darstellen für die piezoelektrische Kristall-Vorrichtung.
Die einfangenden Agenzien werden typischerweise auf den Metallplatten immobilisiert mit Hilfe einer Schwefel enthaltenden Gruppe, die daran gebunden ist, beispielsweise in der Art und Weise, wie sie beschrieben wird in WO 97/04314 ⁽¹⁴⁾.
Der Begriff "neutralisierendes Agens", der hier verwendet wird, soll ein Agens bezeichnen, das eine spezifische Bindungsaffinität an die zu untersuchenden Moleküle hat. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform ist das neutralisierende Agens ein Antikörper mit einer spezifischen Bindungsaffinität an das zu untersuchende Molekül. Die Ausführungsform, in welcher das neutralisierende Agens ein Antikörper ist, typischerweise ein monoklonaler Antikörper (mAb) ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. Jedoch schließt der Begriff "neutralisierendes Agens" auch andere Arten von Agenzien ein, die beispielsweise folgende einschließen: eine lösliche Rezeptor-Gruppe, welche eine den Analyten bindende Domäne einschließt, wobei in diesem Fall das zu untersuchende Molekül besagter Analyt ist; eine lösliche Rezeptor-Gruppe, welche die Bindungs-Domäne des Substrates der Enzyme einschließt, wobei das zu untersuchende Molekül besagtes Substrat ist; sowie andere. Darüber hinaus können die neutralisierenden Agenzien auch ein synthetisches Makromolekül darstellen, welches eine Domäne umfasst mit einer Bindungsaffinität an das zu untersuchende Molekül, beispielsweise eine Bindungsdomäne, die abgeleitet ist von einem Antikör per, der gegen das zu untersuchende Molekül gerichtet ist, konjugiert ist oder fusioniert ist an eine makromolekulare Gruppe, beispielsweise ein großes Polypeptid oder Protein. (Die Konjugation oder Fusion kann realisiert werden, wie hinlänglich bekannt ist, durch chemisches Binden, durch Techniken des Genetic Engineering, etc.)
Die Erfindung wird nun des Weiteren illustriert in der folgenden detaillierten Beschreibung von einigen bevorzugten Ausführungsformen, wobei verwiesen wird auf die beigefügten Zeichnungen. Wie eingesehen wird, dient diese Beschreibung zum Zwecke der Illustration allein und soll nicht dazu dienen, begrenzend zu sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN:
1A und 1B zeigen die Struktur von verschiedenen Haptenen, welche TNT-Derivate (1A) oder DNT-Derivaten (1B) sind, die verwendet wurden in den Ausführungsformen, die hier beschrieben werden. In den Figuren bezeichnet die Abkürzung P KLA, FγG oder BSA, die Abkürzung TNP-cap bezeichnet TNP-Capronsäure und die Abkürzung 2,4-DNP-cap bezeichnet 2,4-DNP-Capronsäure.
2A zeigt Inhibitions-Profile des Bindens (durchgeführt durch ELISA, I bezeichnet die Inhibition und B bezeichnet das Binden) des 5B3-Antikörpers an DNS-BSA (DNS gekoppelt an BSA) in der Gegenwart von verschiedenen Inhibitoren – TNT, TNP-Capronsäure (TNP-cap), DNP-Capronsäure (DNP-cap), mDNB, 2,4-DNA, DNS, 2,6-DNT und 2,4-DNP.
2B zeigt Inhibitionsprofile (durchgeführt durch ELISA, I bezeichnet die Inhibition und B bezeichnet das Binden) des Bindens des 5B3-Antikörpers an TNP₂ FγG (TNP gekoppelt an FγG) in der Gegenwart von verschiedenen Inhibitoren – TNT, TNP-Capronsäure (TNP-cap), DNP-Capronsäure (DNP-cap), mDNB, 2,4-DNA, DNS, 2,6-DNT und 2,4-DNP.
3A bzw. 3B zeigen jeweils die Nukleotid-Sequenzen (SEQ ID Nummern. 5 bzw. 7) und die abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen (SEQ ID Nummern 6 und 8) der schweren und leichten variablen Ketten-Regionen von 5B3.
4 zeigt ein chemisches Schema der Herstellung einer Sensor-Oberfläche, die eine Monoschicht von einfangenden Agenzien enthält. Die Abkürzungen EDC, NHS, CYST und 3,5-DNSA, bezeichnen jeweils 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, N-Hydroxysulfosuccinimd, Cystamin und 3,5-Dinitro-salicylilsäure.
5 zeigt die Frequenz-Veränderungen (T/min bezeichnet die Zeit in Minuten) des Kristalls während seiner Inkubation mit dem Cystamin und der Ausbildung eines Systems in einer Monoschicht.
6 zeigt die Frequenz-Änderungen (T/min bezeichnet die Zeit in Minuten) des Kristalls während des Prozesses des Bindens des einfangenden Agens an das System in der Monoschicht.
7 ist eine schematische Darstellung einer prinzipiellen Konfiguration der Ablösungs-Ausführungsform.
8 ist eine schematische, detailliertere Darstellung einer Mess-Zelle mit Messung der Sensitivität in Übereinstimmung einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
9 zeigt die Abnahme der Resonanz-Frequenz (T bezeichnet die Zeit in Sekunden) des Kristalls nach Assoziation der Anti-DNP-Antikörper ("DNP-Ab") an die Sensor-Oberfläche.
10 zeigt die Kristallfrequenz-Veränderungen (T/min bezeichnet die Zeit in Sekunden) während der Inkubation des DNP-Abs, enthaltend die Schicht mit einem Medium, umfassend 2,4-DNT.
11 zeigt die Abnahme in der Resonanz-Frequenz des Kristalls (T/sec zeigt die Zeit in Sekunden) nach Binden des mAb5B3 an eine Monoschicht aus Cystamin/3,5-Dinitrosalicylsäure.
12 zeigt die Zunahme in der Frequenz (T/sec bezeichnet die Zeit in Sekunden) des Kristalls von 11 nach Injektion von 2,4-DNT in die Zelle bei einer Konzentration von 6,25 ng/ml (Kurven A und B) bzw. von 312 pg/ml (Kurve C).
13 zeigt die Frequenz-Zunahme (T/sec bezeichnet die Zeit in Sekunden) nach Injektion von TNT in einer Konzentration von 6,25 pg/ml (Kurve A) bzw. 62,5 pg/ml (Kurve B) des Sensor-Elements der Art, wie sie in 12 eingesetzt wird.
14 zeigt die Resonanz-Frequenz-Abnahme (T/sec bezeichnet die Zeit in Sekunden) der Elektrode, die in 13 eingesetzt wird, nach Wiederaufladung der Monoschicht mit dem 5B3-Antikörper.
15 zeigt die Frequenz-Zunahme (T/sec bezeichnet die Zeit in Sekunden) der Elektrode von 14 nach Kontakt mit einer Probe, die 6,25 pg/ml an TNT enthält.
16 ist eine schematische Darstellung der Konfiguration der Ablösungs-Ausführungsform, in welcher ein Masse-erhöhendes Agens eingesetzt wird.
17 zeigt die Abnahme in der Resonanz-Frequenz eines Kristalls (T/sec bezeichnet die Zeit in Sekunden) nach Zugabe eines biotinylierten Antikörpers zu der Antigen-Monoschicht auf der Sensor-Oberfläche.
18 zeigt die zeitabhängige Frequenz-Abnahme (T/sec bezeichnet die Zeit in Sekunden) eines Kristalls, der beladen ist mit biotinylierten Antikörpern nach Wechselwirkung mit Avidin.
19 zeigt die Zunahme der Kristall-Resonanz-Frequenz (T/sec bezeichnet die Zeit in Sekunden) nach Exposition einer Sensor-Oberfläche, die eine DNT-Antikörper-Avidin-Schicht enthält zu einer 2,4-DNT-Probe.
20 ist eine allgemeine schematische Illustration eines Systems in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
21 zeigt die Frequenz-Änderungen (T/sec bezeichnet die Zeit in Sekunden) nach Wechselwirkung eines einfangenden Agens, welches eine Sensor-Oberfläche mit spezifischen Antikörpern umfasst, in einem System von der Art, die in 20 gezeigt wird.
22 zeigt die Veränderung in der Frequenz des Kristalls, der in 21 gezeigt wird (T/sec bezeichnet die Zeit in Sekunden), nach Exposition gegen eine TNT-enthaltende Probe.
23 ist eine schematische Darstellung einer grundlegenden Konfiguration der kompetitiven Ausführungsform der vorliegenden Erfindung und zwar in der Abwesenheit (–Ag) oder der Gegenwart (+Ag) eines Antigens.
24 illustriert eine Konfiguration der kompetitiven Ausführung, wobei die Verwendung gemacht wird eines Masse erhöhenden Agens und zwar in der Abwesenheit (–Ag) oder in der Anwesenheit (+Ag) eines Antigens.
25 zeigt die Ergebnisse eines Assays, der durchgeführt wird in Übereinstimmung mit der kompetitiven Ausführungsform (T/min bezeichnet die Zeit in Minuten) nach Exposition der Sensor-Oberfläche gegen ein Referenzsystem, welchem Dinitrophenol (Kurve a) fehlt, zu einer DNP-Ab/Anti-Ab-Sonden-Lösung, der das DNP-Antigen fehlt (Kurve b) und nach Exposition gegen die DNP-Ab/Anti-Ab-Sonden-Lösung, welche 3,1 × 10^–12 g an DNT enthält (Kurve c).
26 zeigt die Frequenz-Änderungen in einem Kristall der Art, wie in 25 gezeigt (T/min bezeichnet die Zeit in Minuten), exponiert gegen die DNP-Ab/Anti-Ab-Sonden-Lösung, vermischt mit 2,4-DNT (Kurven a und b) sowie die Exposition gegen eine Sonden-Lösung ohne 2,4-DNT (Kurve c).
27A–27C zeigen die Frequenz-Änderungen des Kristalls (in einem Assay, durchgeführt in Übereinstimmung mit der kompetitiven Ausführungsform, T/sec bezeichnet die Zeit in Sekunden) nach Exposition gegen verschiedene DNT-Isomer-positive (Kurve b in den drei Figuren) sowie in der Anwesenheit von nicht-DNT-kontaminierten Proben (Kurven a in den drei Figuren), wobei die Isomere 2,4-DNT in 27A, 1,4-DNT in 27B bzw. 2,6-DNT in 27C sind.
28 zeigt die Frequenz-Änderungen (T/sec bezeichnet die Zeit in Sekunden) von verschiedenen Elektroden, welche für 7,15 bzw. 28 Tage gelagert wur den (28A, 28B bzw. 28C), und zwar in einem Assay, der in Übereinstimmung mit der Ablösung-Ausführungsform durchgeführt wurde.
29 ist eine schematische Darstellung der grundlegenden Filtrations-Ausführungsform, und zwar in der Abwesenheit (–Ag) oder Anwesenheit (+Ag) von Antigen.
30 zeigt eine schrittweise Modifikation einer Gold-Sensor-Oberfläche, die assoziiert ist mit dem Quarz-Kristall, um eine Biotin-Avidin-Schicht zu erhalten (BNHSE bezeichnet Biotinamidocaproat-N-hydroxysuccinimid-Ester).
31 zeigt die Kristall-Resonanz-Frequenz-Änderungen (T/sec bezeichnet die Zeit in Sekunden) als ein Ergebnis der Beladung einer Biotin-Monoschicht mit Avidin.
32 zeigt eine Veränderung in der Resonanz-Frequenz (T/sec bezeichnet die Zeit in Sekunden) des Kristalls von 31 nach Exposition der Sensor-Oberfläche gegen ein Referenz-System (Kurve a, ohne Analyt) in dem Fall, wo eine Probe 2,4-DNT enthält (Kurve b).
33 und 34 sind schematische Darstellung der Enzym-Ausführungsform (DNT/TNT-SAMP bezeichnet dabei eine Probe, welche DNT und TNT enthält, C-SAMP bezeichnet dabei eine reine Probe, SUB bezeichnet dabei ein Substrat und PROD bezeichnet dabei das Produkt).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Im Folgenden werden einige beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung dargelegt:
1. Anti-TNT-Antikörper
1.1 Antigene/Immunogene
Die folgenden TNP-Proteine wurden eingesetzt: TNP₄₀-KLH, TNP₃₃-BSA, TNP₂-FγG. Um das Antigen, das nachfolgend auf dem QCM-Kristall eingesetzt wurde (siehe unten) zu simulieren, wurde 2,4-Dinitrosalicylsäure (DNS) gekoppelt an BSA eingesetzt. Das Koppeln zwischen dem TNT, DNT und den Derivaten sowie dem Protein wurde durchgeführt unter Ver wendung von EDCI. Die Struktur von TNT und den Derivaten, wie auch diejenige von DNT und den Derivaten, die eingesetzt wurde, ist in den 1A und 1B dargestellt.
Als Immunogen wurde 2,4,6-Trinitrophenyl (TNP) verwendet, das nach Koppeln mit einem Proteincarrier sehr ähnlich mit TNT erscheint. TNP wurde gekoppelt an ein Carrierprotein (keyhold limpet hemocyanine (KLH) als Immunogen oder bovines Serumalbumin (BSA) bzw. fowl gamma globulin (FγG) als Antigen), und zwar durch Vermischen von 100 mg 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) mit 100 mg Protein bei 0,2 M Boratpuffer, pH 9,2 für 2 Stunden bei 37°C. Nach einer extensiven Dialyse gegen PBS wurden die TNP-Proteine filtriert durch einen 45 μm-Filter und das molare Verhältnis von TNP pro Protein wurde bestimmt unter Verwendung des molaren Extinktions-Koeffizienten von 15400 bei 348 nm⁽¹⁾.
1.2 Immunisierung
Weibliche BALG/c-Mäuse von 8–10 Wochen an Alter wurden intradermal immunisiert in die hinteren Fußwurzeln mit 20 μg an TNP-KLH, emulgiert mit vollständigem Freundschen Adjuvans (CFA). Zwei Wochen später wurden die Mäuse subkutan injiziert mit der gleichen Menge an Antigen in CFA. Eine Woche nach diesem Boost wurden die Mäuse zur Ader gelassen und die Anti-TNP-Antikörper-Titer wurden bestimmt in ihren Seren unter Verwendung von ELISA (siehe unten). Einen Monat nach dem zweiten Boost wurden die Mäuse, welche die höchsten Antikörper-Titer aufwiesen, erneut intraperitoneal geboostet mit 10 μg TNP-KLH in PBS am Tage –4 und –3 vor der Zellfusion.
1.3 Herstellung von 5B3-monoklonalem Antikörper
Milz-Zellen einer Maus mit dem höchsten Titer an bindenden Antikörpern (und Spezifität gegen TNT, für die Nachweis-Details siehe unten) wurden fusioniert mit der murinen NSO-Myelom-Zelllinie, wie zuvor beschrieben (Eshhar, Monoclonal antibody strategy and techniques. In: Hybridoma in Biotechnology and Medicine, Springer, T., ed. Plenum Press, S. 1, 1985). Kurz gesagt, wurden 10⁸ Milz-Zellen fusioniert mit 2 × 10⁷ NSO-Myelom-Zellen unter Verwendung von 41% PEG für 2 Minuten bei 37°C. Folgend auf die Entfernung von PEG durch Verdünnung und Zentrifugation wurden die Zellen resuspendiert in DMEM, angereichert mit 10% Pferdeserum und HAT selektivem Medium und in 7 Mikrokulturplatten aufgeteilt. Nach 12 Tagen Inkubation bei 37°C in 10% CO₂, gesättigter Luft, wurden 50 μl Aliquots der Hybridom-Kultur-Überstände entfernt in Duplikat, wobei ein Aliquot untersucht wurde auf Binden gegen TNP-BSA, und das zweite in ähnlicher Weise untersucht wurde, jedoch nach einer Präinkubation in Gegenwart von TNT (10^–5M). (Siehe Bindungs- und Inhibitions-Assays (1.4 und 1.5 unten). Von 672 Wells mit Hybridoma wuchsen 32 mit positivem Score auf TNP-ESA-Binden. Sechs von diesen wurden durch 10^–5 M TNT inhibiert, unter welchen ein Hybridom mit der Bezeichnung 5B3 ausgewählt wurde. Die TNT-spezifischen Hybridomas wurden kloniert und subkloniert für 2–3 Zyklen und verwendet, um Aszites-Flüssigkeit, welches als Quelle für gereinigte Antikörper diente, herzustellen.
Zur Aufreinigung wurde die Immunoglobulin-Fraktion als Aszites-Flüssigkeiten ausgefällt in 45%igem gesättigtem Ammoniumsulfat, gegen PBS dialysiert und auf eine Protein-G-Agarose-Säule geladen (Pharmacia). Monoklonale Antikörper wurden eluiert bei pH 2,7 und gegen PBS dialysiert. Die aufgereinigten Antikörper-Hherstellungen wurden bei –70°C gelagert. Die aufgereinigten Antikörper enthielten mehr als 96% aktive Antikörper, wie verifiziert wurde durch ihre Fähigkeit, an Antigen-Säulen zu binden.
1.4 Bindungs-Assay für Anti-TNT-Antikörper
Ein regulärer ELISA wurde verwendet, um die Anti-TNT-Antikörper-Aktivität zu bestimmen. Mikrotiterplatten (Maxisorb, NUNC) wurden überzogen mit Antigen (TNP-ESA, TNP-FγG, DNS-ESA), dadurch dass sie inkubiert wurden mit 100 μl an 2–10 μg/ml Antigen in PBS für mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur (RT). Nach der Entfernung des Antigens wurden die Platten blockiert durch Inkubation für eine Stunde bei RT mit PBS, supplementiert mit 0,5% BSA und anschließend gewaschen mit PBS, supplementiert mit 0,05% Tween-20 (PBS-Tween). Überstände oder Seren, welche Anti-TNP-Antikörper enthielten, seriell verdünnt in PBS, angereichert mit 0,01% PBS (100 μl) wurden anschließend zu den gewaschenen Platten hinzugefügt und nach 1 Stunde Inkubation bei 37°C wurden die Antikörper entfernt, die Platten dreimal gewaschen mit PBS-Tween und 100 μl Peroxidasegelabelte Anti-Maus-Fab-Antikörper (Jackson Labs.), verdünnt entsprechend der Instruktionen des Herstellers, wurden hinzugegeben. Die Platten wurden inkubiert für eine Stunde bei RT, gewaschen (× 3) und ein Peroxidase-Substrat (2,2'-Azinodi-(ethylbenzthiazolinsulfonsäure)diammoniumsalz (ATBS, Sigma), 1 mg/ml mit 0,003% H₂O₂ in Citrat-Phosphat-Puffer, pH 4,5) wurde hinzugefügt. Die Reaktion wurde gestoppt, sobald eine hinreichende Farbe sich entwickelt hatte durch die Zugabe von 50 μl von 0,2 M Citronensäure und der OD bei 620 nm wurde bestimmt in einem ELISA-Plattenlesegerät.
1.5 Inhibition-Assay
Zur Bestimmung der Spezifität und Affinität der Antikörper (aus Immunseren, Überständen, Aszites-Flüssigkeiten oder aufgereinigt) wurden Antikörper-Verdünnungen, die ungefähr 70% des maximalen Bindens ergaben, unterschiedliche Konzentrationen des Haptens oder Hapten-Analogs für 30–60 min. inkubiert bei RT. Mischungen von Antikörpern und des Inhibitors (das Hapten oder die Haptenanaloge) wurden anschließend auf ELISA-Platten transferiert, die mit einem Antigen überzogen waren (DNS-BSA oder TNP₂-FγG) und die verbleibende Bindungs-Kapazität wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in den 2A und 2B dargestellt. Der Grad der Inhibierung wurde berechnet von 0% Bindung der nicht inhibierten Probe minus Hintergrund-Kontrolle. Als praktisches Maß für die Affinität wurde die Konzentration an Hapten, die 50% Inhibition ergab, (IC₅₀) bestimmt.
1.6 Charakteristika von 5B3-Antikörper
5B3 ist ein IgG1-Antikörper, abgeleitet aus einer TNP-KLH-immunisierten Maus. Einige seiner Bindungs-Charakteristika sind zusammengefasst in der folgenden Tabelle 1, welche die IC₅₀-Werte von verschiedenen Haptenen des Bindens des 5B3-Antikörpers an TNP-Antigen zeigt.
TNP-Antigen. 5B3 mAb weist zwei wichtige zusätzliche Merkmale auf, welche auch in der Tabelle 1 zu sehen sind, die ihn geeignet machen für die Anwendung in Übereinstimmung mit der Erfindung: er bindet nicht merklich an 2,4-DNS, welches in einigen Ausführungsformen verwendet wird, um den QCM-Kristall zu überziehen, und sein Binden entweder an TNP- oder DNS-Antigen kann mit sehr geringen Mengen an TNT blockiert werden. Diese Merkmale zeigten sich in der Tat als sehr bedeutsam, da eine Konzentration von gerade einmal 6 pg von TNT gebundenes 5B3 von QCM-Kristall ablösen konnte und ein reproduzierbares Signal ergab.
1.7 DNA- und Protein-Sequenz von 5B3-Antikörper
cDNA wurde hergestellt aus der gesamten RNA, extrahiert aus dem 5B3-Hybridom unter Verwendung von reverser Transcriptase und Oligo-dT als 3'-Primer (Promega-Kit und Protokollbuch für reverse Transkription (RT)). Um mit PCR die cDNA zu amplifizieren, die für die variable Region der leichten Kette kodiert, wurden N5'VK2 als 5'- und N3'VK als 3'-Oligonukleotid-Primer verwendet. Für die Amplifikation der cDNA, welche für die variable Region der schweren Kette kodiert, wurden N5'VH als 5'- und N3'VH als 3'-Oligonukleotid-Primer verwendet. Diese Oligonukleotid-Primer zeigten die folgenden Sequenzen (SEQ ID Nummern 1 bis 4 wie folgt):
In den oben genannten Primer-Sequenzen haben die folgenden Buchstaben die folgenden Bedeutungen:

R = A oder G K = G oder T

S = C oder G W = A oder T

Y = Coder T M = A oder C
Die ersten und die vierten der oben genannten Primer wurden bereits früher beschrieben (Eshhur et al., PNAS, 90: 720 (1993)).
PCR-Amplifikation wurde durchgeführt wie zuvor beschrieben (The polymerase chain reaction, in: Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 2, Kapitel 15, John Wiley & Sons Inc., 1995).
Die Nukleotid-Sequenzierung wurde direkt durchgeführt aus den PCR-Mischungen, wobei beide Stränge gelesen wurden und die oben beschriebenen Primer verwendet wurden. Automatisierte Sequenzierung unter Verwendung des Taq Dye Deoxy Terminator-Zyklus-Sequenzier-Kits und des ABI PRISM^TM 377 DNA-Sequenzierers wurde durchgeführt. Die Nukleotid-Sequenz sowie die deduzierten Aminosäure-Sequenzen der 5B3-schweren und -leichten Ketten-Variablen-Regionen sind in den 3A bzw. 3B dargestellt.
2. Herstellung einer Schicht aus einfangenden Agenzien auf einem QCM-Kristall
In allen Experimenten, die hier dargestellt werden, wurden Quarz-Kristalle (AT-geschnitten), in Sandwichformat zwischen zwei Gold (Au)-Elektroden eingesetzt, die eine geometrische Fläche von ungefähr 0,2 cm² hatten, mit einem Rauhigkeitsfaktor, der zwischen 1,8 und 15 variierte. Das Kristall hatte eine Resonanz-Frequenz von in etwa 9 MHz.
Das chemische Schema des Ausbildens der Elektroden kann in 4 gesehen werden. Die Elektroden 102, getragen auf einem Kristall 100 wurden durch Inkubation in destilliertem Wasser für 15 min gereinigt, worauf ein Spülen dreifach mit Wasser und ein Trocknen unter Strom-an-Stickstoff folgte. Die Elektroden wurden dann in eine Lösung aus 0,2–0,5 M Cystamindihydrochlorid 104 für 2 Stunden eingetaucht, anschließend in destilliertes Wasser für 15 min eingetaucht und schließlich mit Stickstoff getrocknet. Dies führte zu einer Ausbildung einer Cystamin-Monoschicht 106 auf der Elektrode 102. Dies ergab eine Änderung der Resonanz-Frequenz (Δf) innerhalb des Bereiches von Δf = (–200)–(–500) Hz, wie in 5 gesehen werden kann, die eine Δf-Veränderung zeigt mit der Zeit der Inkubation in Cystamin.
2-5-Dinitrosalicylsäure wurde aufgelöst in einer HEPES-Puffer-Lösung (0,01 M, pH = 7,4), und ergab so eine 0,15 M Lösung. Da die Auflösung von 2,5-Dinitrosalicylsäure langsam voranschreitet, wurde sie unterstützt durch Schallbehandlung. 0,1 M EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid und 0,1 M NaNHS (N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz) wurden aufgelöst in der Antigen-Lösung. Die Cystamin-modifizierten Elektroden 106 (siehe 4) wurden in dieser Lösung für zwei Stunden inkubiert und ergaben so eine Antigen-Cystamin-Monoschicht 108, immobilisiert auf der Elektrode 102. Dies führte zu einer typischen Δf des Kristalls von ungefähr –100 Hz (6).
3. Analyse von kleinen Molekülen in Übereinstimmung mit dem Ablöse-Verfahren
3.1 Allgemeine Übersicht über das Ablöse-Verfahren
Das Schema für die Analyse von einem kleinen zu untersuchenden Molekül ist illustriert in schematischer Form in 7. Die Antigen-Monoschicht 120 wird mit einem Antikörper 122 in Kontakt gebracht, der dann an die Antigen-Gruppe 124 bindet, um so zu einer Antigen-Antikörper-Monoschicht 126 zu führen. Die Messung der Resonanz-Frequenz in diesem Stadium führt zu einer bestimmten Ausgangsfrequenz f₀.
Das Aussetzen der Elektrode gegen eine Probe, die Antigene 128 umfasst, verursacht das Freisetzen von einem Teil der Antikörper 122, und führt so zu einem löslichen Antigen-Antikörperkomplex 130. Dies reduziert die immobilisierte Masse und folglicherweise erhöht sich die Frequenz als ein Ergebnis dieses Antikörper-Ablösens auf eine bestimmte Frequenz f.
Die Abnahme in der Frequenz ist ein Ergebnis von und kennzeichnet das Vorliegen des zu untersuchenden Moleküls 128 in dem Medium; das Ausmaß der Frequenz-Änderung hängt von der Konzentration des zu untersuchenden Moleküls in der Probe ab.
3.2 Assay-Apparat
Ein Assay-Apparat, der im Allgemeinen als 150 bezeichnet wird, ist schematisch in 8 gezeigt. Der Apparat 150 umfasst ein Sensor-Element 152 sowie eine Analyse-Zelle 154. Das Sensor-Element 152 besteht aus dem Quarzkristall 156, eingebracht in einem Sandwich zwischen zwei Gold-Elektroden 158 und 160, welche über eine Verbindungseinheit 162 verbunden sind, mit einer Kontroll-Einheit (nicht gezeigt) zum Induzieren von Strom in den Elektroden 158, 160 und zum Messen der Resonanz-Frequenz des Kristalls 156.
Das Sensor-Element 152 ist in einem Sandwich eingebracht zwischen zwei O-Ringen 162 und 164 und weist eine Elektrode 160, die der Zelle 154 sich gegenüberliegt. Die Elektrode 160 dient auch als Sensor-Oberfläche des Sensor-Elementes 152.
Die Zelle 154, die typischerweise ein Volumen von 1 ml oder weniger aufweist, hat Einlass- und Auslass-Stutzen 170 bzw. 172, welche das Spülen der Zelle 154 erlauben. Der Einlassstutzen 170 wird durch einen Hahn 174 mit einer peristaltischen Pumpe 176 verbunden, welche Flüssigkeit vom Reservoir 178 in die Zelle 154 pumpt; der Auslassstutzen 172 ist mit einem Hahn 180 verbunden, der Flüssigkeit zu einem Abfluss (der nicht gezeigt ist) führt.
Die Zelle 154 weist auch einen flüssigen Injektions-Stutzen 184 zum Injizieren von Proben auf, die untersucht werden sollen. Wie ohne Zweifel eingesehen werden wird, kann die Zelle – anstelle des Injektions-Stutzens – einen anderen Stutzen aufweisen, der das Begasen einer Flüssigkeit in die Zelle direkt aus einer Proben-Vorrichtung (nicht gezeigt) ermöglichen wird.
3.3 Untersuchen von Proben unter Verwendung des Apparates von 8
Das Sensor-Element ist in die Zelle montiert, das Zellvolumen wird mit einer Lösung befüllt, beispielsweise 0,01 M Phosphat-Puffer, pH 7,4, umfassend auch 0,1 M NaCl ("NaCl-enthaltendes PBS"). Man lässt das Sensor-Element zum Äquilibrieren stehen, bis eine konstante Frequenz des Kristalls beobachtet wird.
Die Sensor-Oberfläche in Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform, wo das Neutralisieren des Agens ein Antikörper ist, umfasst eine Antigen-Antikörper-Monoschicht. Die Elektrode 160 kann a priori bestückt werden mit Antikörpern, die daran gebunden sind, obwohl alternativ der Antikörper an die Sensor-Oberfläche in situ gebunden werden kann. Im späteren Fall wird eine Antikörper-Lösung, beispielsweise 50 μl, von einer 1 mg/ml Antikörper-Lösung, in die Zelle injiziert werden und zur Inkubation stehen gelassen mit der Elektrode über einen Zeitraum, der hinreichend ist, um das Binden zu ermöglichen, beispielsweise für 15 Minuten. Die Assoziation des Antikörpers mit der Elektrode kann überwacht werden durch die Abnahme in der Resonanz-Frequenz des Kristalls (siehe 9 und die beigefügte Beschreibung unten). Die Zelle kann dann gespült werden mit mehreren Zell-Volumina, einer Lösung, beispielsweise einer Pufferlösung, begast werden mit Hilfe einer peristaltischen Pumpe 176. Die Elektrode lässt man dann stehen, um sie zu kalibrieren, bis die Resonanz-Frequenz über einen Zeitraum konstant bleibt.
Die Probe kann dann injiziert werden in die Zellen. Das Ablösen des Antikörpers aus der Monoschicht wird nachgewiesen durch eine Frequenz-Zunahme des Kristalls (siehe beispielsweise 10 und die erläuternde Beschreibung unten). Nachdem jede positive Probe gemessen wurde, wird die Zelle mit einer Pufferlösung gespült und man lässt sie erneut reäquilibrieren, um eine konstante Frequenz zu erreichen.
Man fand heraus, dass üblicherweise eine einzelne Elektrode konsekutiv für mehrere positive Proben verwendet werden kann, beispielsweise drei positive Proben. Nach mehreren positiven Proben muss die Antikörper-Monoschicht neu formiert werden.
In dem spezifischen Beispiel, der Antikörper, die unten beschrieben werden sollen, zeigte sich, dass drei positive 2,4-DNT-Proben in dem Konzentrationsbereich von ungefähr 0,3–7 ng/ml analysiert werden können mit einer einzelnen Elektrode vor der Notwendigkeit, die Elektrode mit Antikörpern neu zu beladen. Mit der gleichen Antikörper-Grenzfläche werden typischerweise drei TNT-positive Proben in dem Konzentrationsbereich von 6–65 pg/ml analysierbar mit einer einzelnen Elektrode, bevor die Notwendigkeit auftritt, diese neu zu beladen. Eine einzelne Elektrode kann typischerweise mehrmals neu beladen werden, beispielsweise dreimal, bis das Sensor-Element ausgetauscht werden muss. Es sollte festgehalten werden, dass beim typischen Gebrauch die meisten Proben als negativ zu erwarten sind, und folglich das Erfordernis, gelegentlich die Elektrode neu zu beladen oder das Sensor-Element auszutauschen, kein ernsthafter Nachteil ist.
3.4 Analyse von 2,4-DNT
DNP-Ab wurde auf die Antigen-Monoschicht, wie oben beschrieben, beladen. 9 zeigt die Kristall-Frequenz-Abnahme nach Assoziation des Anti-DNP-Antikörpers (DNP-Ab) auf die Monoschicht. Um die vollständige Beladung der Monoschicht zu erhalten, ließ man die Elektrode mit dem DNP-Ab für 15 Minuten Wechselwirken. Man spülte die Zelle dann mit der Puffer-Lösung.
2,4-DNT wurde aufgelöst in Ethylenglycol-Monomethyl-Ether, 100 μl, und verdünnt mit NaCl-enthaltendem PBS auf 1 ml. Die Lösung wurde wiederholt verdünnt mit der Puffer-Lösung auf die gewünschte Konzentration.
Die Injektion der 2,4-DNT-Probe (50 μl) in die Zelle, die zu einer Zelle mit einer Konzentration von 2,4-DNT von ungefähr 20 ng/ml führt, löst den DNP-Ab ab. Dies kann in 10 gesehen werden, wie die Veränderungen der Kristall-Frequenz zeigt, die auf eine solche Injektion von 2,4-DNT folgt. Eine Zunahme der Frequenz von ungefähr Δf = 16 Hz wurde beobachtet.
3.5 Analyse von 2,4-DNT durch IgG TTDA 5B3-Ab
Eine Elektrode mit einer Antigen-Monoschicht wurde für 15 min behandelt mit dem Ab. Die 11 zeigt die Abnahme der Kristall-Frequenz nach Sättigung der Monoschicht. Eine Abnahme von ungefähr Δf = –100 Hz wurde beobachtet. Die beladene Elektrode wurde für 3 min gespült mit der Puffer-Lösung und ihre Resonanz-Frequenz wurde stabilisiert.
50 ml der Stamm-Lösung von 2,4-DNT, hergestellt, wie unter 3.4 beschrieben, wurden in die Zelle injiziert, um die gewünschte Konzentration zu ergeben. Die Kristall-Frequenz nahm ungefähr Δf = –35 Hz zu, nachdem die Injektion von 2,4-DNT auf eine Konzentration von 6,25 ng/ml in die Zelle erfolgt war, wie in der 12 (Kurve a) gesehen werden kann.
Die Elektrode wurde dann für drei Minuten gespült mit der Puffer-Lösung und ihre Frequenz wurde erneut stabilisiert. Eine Probe von 2,4-DNT wurde wieder in die Zelle injiziert, und führte so zu einer Summenkonzentration von 6,25 ng/ml. Eine Zunahme der Frequenz von ungefähr Δf = –30 Hz wurde beobachtet, wie in 12 (Kurve b) gesehen werden kann. Die Elektrode wurde erneut gespült und ihre Frequenz wurde stabilisiert. Eine 2,4-DNT-Probe wurde in die Zelle injiziert und führte zu einer Konzentration von 312 pg/ml. Die Kristall-Fre quenz nimmt erneut zu, um ungefähr Δf = –15 Hz, wie in 12 gesehen werden kann (Kurve c).
Diese Probe zeigt, dass die Antigen-Monoschicht-Elektrode, die beladen ist mit dem Ab, erneut verfügbar ist für zumindest drei positive Proben von 2,4-DNT.
3.6 Analyse von TNT durch IgG TTDA 5B3-Ab-Grenzfläche
3.6.1 Wiederholte Untersuchung von TNT
Eine Elektrode eines Sensor-Elementes wird mit Ab beladen in einer identischen Art und Weise zu derjenigen, die beschrieben wird unter 3.5.
Eine Stammlösung aus TNT wurde in ähnlicher Art und Weise hergestellt zu der Art und Weise der Herstellung der Stammlösung aus 2,4-DNT in Beispiel 3.5. Eine 50 ml-Probe der TNT-Stammlösung wurde injiziert in die Zelle und ergab so eine Konzentration von 6,25 pg/ml in der Zelle. Dies resultierte in einer zeitabhängigen Frequenz-Zunahme von bis zu ungefähr Δf = 7 Hz (13, Kurve a). Nach dem Spülen der Zelle und nach Stabilisierung der Kristall-Frequenz wurde eine zweite Probe von TNT in die Zelle injiziert, was zu einer Konzentration von 62,5 pg/ml führte. Dies resultierte in einer zeitabhängigen Frequenz-Zunahme des Kristalls von bis zu ungefähr Δf = 16 Hz (13, Kurve b).
Die Analyse von TNT kann wiederholt werden für zumindest dreimal nach Beladen der Monoschicht mit dem Ab.
Dieses Beispiel demonstriert die Möglichkeit der Wiederverwendung der Elektrode für zumindest drei Proben von TNT in diesem Konzentrationsbereich.
3.6.2 Wiederbeladen der Monoschicht mit IgG TTDA 5B3-Ab
Die Monoschicht-Elektrode, die für die Analyse von zwei nachfolgenden TNT-Proben eingesetzt wurde (6,25 und 62,5 pg/ml) wurde gespült und erneut beladen mit IgG TTDA5B3 Ab (siehe 14) wie Beispiel 3.6.1 beschrieben wurde. Die 15 zeigt die Kristall-Frequenz-Zunahme nach Behandeln der Elektrode mit einer TNT-Probe bei einer letztendlichen Konzentration innerhalb der Zelle von 6,25 pg/ml. Eine Zunahme der Frequenz von bis zu ungefähr Δf = 18 Hz wurde beobachtet, was anzeigt, dass der Ab von der Grenzfläche abgelöst worden war als ein Ergebnis des Vorliegens des TNT in der Probe.
Dieses Beispiel demonstriert die Möglichkeit der Wiederbeladung der Elektrode mit dem Ab sowie das Regenerieren der aktiven Grenzfläche für die Analyse von TNT/DNT.
3.7 Amplifikation des Nachweises von 2,4-DNT durch DNP-Ab
Das Konzept für die Amplifikation der DNT/TNT-Analyse wird schematisch in 16 dargestellt. Der mit Antigen-Monoschicht-modifizierte Kristall 210 wird funktionalisiert durch einen biotinylierten DNT/TNT-Ab 212. Avidin 214 wird des Weiteren an die Monoschicht gebunden, was zu einem Komplex aus Ab-Avidin führt in der Monoschicht 216 auf dem Kristall. Das Beladen der funktionalisierten Elektrode mit einem Antigen aus DNT/TNT 218 resultiert in der Ablösung des Ab-Avidin-Komplexes 220 von der Monoschicht als ein Ergebnis des Bindens an das Analyt-Antigen. Die Zunahme in der Masse des dissoziierten Materials aus der Monoschicht ermöglicht den Nachweis von kleinsten Mengen an abgelöstem Antikörper und konsequenterweise vergrößert sich die Sensitivität der Analyse von DNT/TNT. (Die Differenz, Δf, zwischen der ursprünglichen Resonanz-Frequenz, f₀, und derjenigen nach der Dissoziation, f', wird zunehmend).
Wie eingesehen werden wird, ist dieses Beispiel des Nachweises der Explosivstoffe TNT oder DNT lediglich eine Illustration eines allgemeineren Konzeptnachweises von kleinen Molekülen, welche anderweitig explosive Moleküle sein können, wie auch nicht explosive Moleküle.
3.7.1 Herstellung von biotinyliertem DNP-Ab
0,5 mg des DNP-Abs wurden eingebracht in 1 ml an NaCl-enthaltendem PBS. 5 mg Biotinamidocaproat-N-hydroxy-succinimin-ester wurden zur Mischung hinzugegeben. Die Lösung wurde vermischt bei Raumtemperatur für 1 Stunde und anschließend dialysiert gegen den NaCl-enthaltenden PBS für 15 Stunden. Die Dialyse wurde durchgeführt bei 0°C. Die resultierende dialysierte Antikörper-Lösung von 7,5 ml wurde aufkonzentriert auf 2 ml unter Verwendung eines Amicon^TM-Filters (Amicon, USA.).
3.7.2 Das Beladen der Antigen-Monoschicht mit dem DNP-Ab-Avidin-Komplex
Die Antigen-Monoschicht-Elektrode wurde beladen mit dem 0,1 mg/ml biotinylierten DNP-Ab, wie in Beispiel 3.4 beschrieben wird. Nach Beladen der Elektrode mit dem Ab wurde die Zelle gespült mit einer Puffer-Lösung aus PBS (0,01 M, pH = 7,4) für 3 min. Die Elektroden- Frequenz wurde anschließend stabilisiert und 50 μl einer 0,01 M Avidin-Lösung in dem PBS-Puffer wurden in die Zelle injiziert. 17 zeigt die Kristall-Frequenz-Veränderungen nach Assoziation des biotinylierten Abs gegen die Antigen-Monoschicht. Eine Frequenz-Abnahme von ungefähr Δf = –50 Hz wurde beobachtet.
18 zeigt die zeitabhängige Frequenz-Abnahme des Kristalls, beladen mit dem biotinylierten Ab nach Wechselwirkung mit Avidin. Die Abnahme der Kristall-Frequenz von ungefähr Δf = –120 Hz, was Ausbildung des Ab-Avidin-Komplexes auf der Monoschicht anzeigt, wurde festgehalten. Die resultierende beladene Elektrode wurde mit PBS gespült und die Kristall-Frequenz wurde stabilisiert.
3.7.3 Analyse von 2,4-DNT durch die Elektrode, die durch den Ab-Avidin-Komplex (Monoschicht) funktionalisiert worden war
Eine Stamm-Lösung von 2,4-DNT wurde hergestellt wie in Beispiel 3.4 beschrieben. Eine 50 ml-Probe der 2,4-DNT-Stamm-Lösung wurde die Zelle injiziert und ergab so eine Konzentration von 2,7 ng/ml innerhalb der Zelle. 19 zeigt die Zunahme der Kristall-Frequenz nach Wechselwirken der Elektrode, welche die DNP-Ab-Avidin-Schicht enthält mit der Probe aus 2,4-DNT. Eine Zunahme der Frequenz von ungefähr Δf = 30 Hz wird beobachtet, was das Ablösen des Ab-Avidin-Komplexes aus der Monoschicht anzeigt.
Es sollte festgehalten werden, dass ein Sensor der Art, wie er in Beispiel 3.4 verwendet wird, keinerlei Frequenz-Zunahme zeigte nach Wechselwirkung mit 2,4-DNT bei einer Konzentration von 2,7 ng/ml.
Die Frequenz-Zunahme von solch einer Konzentration wird nur beobachtet in der Gegenwart des biotinylierten Ab-Avidin-Komplexes, was anzeigt, dass die komplexierte Ab-Avidin-Schicht die Sensitivität des 2,4-DNT-Nachweises erhöht (ungefähr 10fache Erhöhung der Sensitivität im Vergleich zur DNP-Ab-Monoschicht allein).
3.8 Integrierte Assay-Anordnung
Eine Anordnung 300 in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung, die in einigen Experimenten, die unten dargestellt sind, verwendet wurde, ist in 20 gezeigt. Der Sensor-Apparat 302 wird mit einem Sensor-Element 304 bestückt, mit einem ähnlichen Design, wie dasjenigen des Apparates, der in 8 gezeigt wird, sowie eine Assay-Zelle 306. Der Sensor-Apparat 304 ist verknüpfbar mit einer Oszillator-Schaltungs-Einheit 308, wobei diese beiden Komponenten, die hier gezeigt sind, aus Gründen der Illustration in einer Art und Weise, da sie voneinander abgekoppelt sind. Der Apparat 302 ist eingeschlossen innerhalb eines Faradayschen Käfigs 310.
Die Zelle 306 wird des Weiteren bestückt mit einem Proben-Einlass-Stutzen 312 und einen Flüssigkeits-Auslass-Stutzen 314. Der Einlass-Stutzen 312 wird mit einer Vorlageeinheit 316 verknüpft, die mit einer Pumpe 320 versorgt ist, die unter Flüssigkeits-Kontrolle einer Steuerungseinheit 322 steht. Die Pumpe 320 kann eine Lösung vorlegen, beispielsweise eine Puffer-Lösung, aus dem Reservoir 324 in die Zelle 306. Der Auslass-Stutzen 314 wird durch eine Zufuhrleitung 330 mit einem Flüssigkeitsablauf 332 verbunden.
Die Zelle 306 ist des Weiteren mit einem Proben-Einlass-Stutzen 334 bestückt, der an eine Dreiwege-Injektions-Düse verbunden ist, die mit einer Injektions-Schlaufe für eine 20 μl-Probe verbunden ist (mit einem typischen Design, typisch für Injektions-Spulen, die in der Flüssigkeitschromatografie verwendet werden), die entweder an eine Verteilungsleitung 340 verbunden sein kann, beispielsweise eine, die mit einer Spritzen-Führung 342 bestückt ist, jedoch eine Steuereinheit 344 gesteuert wird. Alternativ kann in einer anderen Ausführungsform die Leitung 340 direkt an das Reservoir 324 gekoppelt sein. Die Spritze (nicht gezeigt) der Spritzen-Leitung 342 wird typischerweise mit einer Puffer-Lösung befüllt. Die Oszillator-Schaltungs-Einheit 308 wird ein QCM-Gerät 350 verbunden, das an einen Computer 352 gekoppelt ist. Der Computer 352 ist auch an Steuereinheiten 322 und 344 gekoppelt.
Im Folgenden sind Beispiele von Experimenten gezeigt, die in einem solchen System durchgeführt werden können.
3.8.1 Beladen der Elektrode in der Mikro-Zelle
Die Elektrode, die modifiziert ist durch die Antigen-Monoschicht wurde in die Mikro-Zelle platziert und das Zell-Volumen (50 μl) wurde befüllt mit dem NaCl-enthaltenden PBS durch Pumpen von Puffer aus dem Puffer-Reservoir bei einer Fließrate von 0,5 ml/min. Die Elektroden-Resonanz-Frequenz ließ man stabilisieren und anschließend wurde die 20 μl-Injektions-Schleife befüllt mit der Lösung von 0,1 mg/ml IgG TTDA5B3 Ab. Die Ab-Lösung wurde in die Zelle injiziert unter Verwendung der Puffer-Lösung in dem Spritzen-Verteiler, um den Schleifen-Inhalt herauszupressen. 50 μl der Puffer-Lösung wurde durch den Spritzen-Verteiler bei einer Rate von 60 μl gepresst. Dieses Volumen ist dasjenige, das benötigt wird, um die Ab-Lösung aus der Schleife zu führen und das Totvolumen der Lösung in dem Verbindungsrohr, das hin zum Analyse-Zell-Volumen führt. 21 zeigt die Veränderungen der Kristall-Frequenz nach Beladen der Elektrode mit dem Ab. Nach ungefähr 10 min der Wechselwirkung war die Elektrode vollständig beladen. Die mit Ab beladene Elektrode und die Injektions-Schleife wurden für 4 min gewaschen mit einer Lösung aus dem Puffer-Reservoir bei einer Fließrate von 0,5 ml/min und man ließ sie äquilibrieren auf eine konstante Frequenz. Die Elektrode war dann fertig für die Analyse der DNT/TNT-Proben.
3.8.2 Analyse von TNT durch die Elektrode in der Mikro-Zelle, die mit den IgG TTDA5B3 Ab modifiziert war
Eine 250 pg/ml TNT-Probe wurde hergestellt durch die Verdünnungs-Prozedur, die in Beispiel 3.6 beschrieben wird. Der 20 μl-Schleifen-Abschnitt in dem Injektor wurde mit der Probe befüllt. Die Probe wurde in die Zelle injiziert durch die Spritzen-Steuerung unter Verwendung von 50 μl der PBS-Lösung durch die Schleife bei einer Fließgeschwindigkeit von 60 μl/s. Wie oben dargestellt, ist dieses Volumen dasjenige, das benötigt wird, um den Inhalt der Schleife in die Zelle zu führen und das Totvolumen des Verbindungs-Rohres zu kompensieren. Die letztendliche Konzentration von TNT innerhalb der Zelle war 100 pg/ml. 22 zeigt die zeitabhängigen Frequenz-Änderungen des Kristalls als ein Ergebnis der TNT-Wechselwirkung mit der Elektrode. Nach 3 min wurde eine Zunahme der Frequenz von ungefähr 15 Hz beobachtet. Die Frequenz-Zunahme zeigte das Ablösen des Antikörpers von der Monoschicht durch den TNT.
Nach Vervollständigung der TNT-Analyse wurden die Injektions-Schleife und die Zelle für 4 min gewaschen mit der Puffer-Lösung aus dem Reservoir bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min, und die Kristall-Frequenz wurde erneut stabilisiert und war fertig für eine weitere Untersuchungs-Sequenz. Es sollte festgehalten werden, dass die Zelle und die Schleife keinerlei Waschen benötigen, falls eine nicht-kontaminierte Probe des erwarteten TNT in die Zelle injiziert wurde.
4. Analyse entsprechend der kompetitiven Ausführungsform
In der Beschreibung unterhalb, betreffend diese Ausführungsform, wird speziell verwiesen auf einen Fall, wo das neutralisierende Agens einen Antikörper darstellt und das zu untersuchende Molekül entweder DNT oder TNT ist. Wie ohne Zweifel eingesehen werden wird, ist dies ein Beispiel, das dazu dienen soll, die Erfindung zu illustrieren und es sollte nicht als limitierend konstruiert werden.
4.1 Grundlegendes Schema
Das allgemeine Schema des kompetitiven Verfahrens ist in 23 dargestellt. Der Quarz-Kristall wird modifiziert mit der Monoschicht aus DNT/TNT-Antigen, und ergibt so ein Sensor-Element 400. Eine Stamm-Lösung, welche den Antikörper 402 einschließt in einer fixierten Konzentration wird als die Proben-Lösung verwendet. Die Analyt-Probe 404 wird mit der Proben-Lösung vermischt. In der Abwesenheit des DNT/TNT-Analyten bleibt der Antikörper frei und die Wechselwirkung der Proben-Lösung mit dem modifizierten Kristall resultiert in der Assoziation des freien Antikörpers mit der Antigen-Monoschicht und ergibt so das Konjugat 406. Dies wiederum resultiert in der Frequenz-Abnahme des Kristalls. Die Wechselwirkung einer Probe, welches das DNT/TNT-Antigen 404 einschließt mit der Antikörper-Proben-Lösung führt zur Assoziation 408 des Antigens an den Antikörper. Die nachfolgende Wechselwirkung der Proben-Lösung mit dem Kristall führt nicht zur Assoziation des Antikörpers mit der Monoschicht-Grenzfläche, da der Antikörper blockiert ist. Keine Frequenz-Änderung des Kristalls wird beobachtet werden. Daher indiziert eine DNT/TNT-freie Probe eine Frequenz-Abnahme des Kristalls, wobei eine DNT/TNT-positive Probe nicht die Kristall-Frequenz beeinträchtigt. Es sollte festgehalten werden, dass vorzugsweise die molare Konzentration des Antikörpers in der Proben-Lösung ungefähr 15% niedriger sein muss und das gewünschte molare Konzentrations-Limit (Sensitivität) dieser Analyse.
4.2 Amplifikation der Analyse durch die kompetitive Ausführungsform
24 stellt das Prinzip der Analyse von DNT/TNT durch Amplifikation der Antwort dar, die in der kompetitiven Ausführungsform erhalten wird. Der Quarz-Kristall wird modifiziert durch die DNT/TNT-Antigen-Monoschicht und ergibt so ein Sensor-Element 420 (im Wesentlichen identisch mit dem Element 400 in 23). Eine Lösung, die aus einer fixierten Konzentration des Antikörpers 422 und einer fixierten Konzentration des Anti-Antikörpers 424 besteht, die an das erhaltene Konjugat 426 binden, wird als Sonden-Lösung verwendet. Die Analyten-Probe wird mit der Sonden-Lösung vermischt und über einen hinreichenden Zeitraum mit dem Ziel der Bindung inkubiert und anschließend mit dem Antigen-modifizierten Kristall zur Wechselwirkung gebracht. Falls die Analyten-Probe kein DNT/TNT enthält, wird der Ab-Anti-Ab-Komplex der Sonden-Lösung mit dem Kristall assoziieren und so einen immobilisier ten Komplex 428 ausbilden, der in einer Frequenz-Abnahme resultiert. Das Vermischen einer positiven DNT/TNT-Probe mit der Sonden-Lösung wird den Antigen-ab-Anti-Ab-Komplex 430 in der Sonde-Lösung erzeugen. Die Wechselwirkung dieser Sonden-Lösung mit dem Antigen-modifizierten Kristall wird die Kristall-Frequenz nicht beeinträchtigen, da der Sensor-Ab mit dem Antigen besetzt ist. Es sollte festgehalten werden, dass die Assoziation des Ab-Anti-Ab-Komplexes an die Antigen-Monoschicht in einer substanziell höheren Frequenz-Veränderungen resultiert im Vergleich zu derjenigen, die durch den Ab allein induziert wird (Beispiel 4.1), da die Masse die assoziierten Komplexes höher ist. Dies ermöglicht die Beobachtung der höheren Werte für Frequenz-Änderungen und die Abnahme der Konzentration des zu analysierenden Antikörpers in der Sonden-Lösung. Die Abnahme der Ab-Konzentration in der Sonden-Lösung ermöglicht, eine geringere Antigen-Konzentration nachzuweisen und so die Sensitivität des Sensor-Nachweises zu erhöhen.
4.3 Experimentelle Ergebnisse
4.3.1 Anordnung der Antigen-Monoschicht auf dem Quarz-Kristall
Die 3,5-Dinitrosalicylsäure wurde kovalent an eine Cystamin-Monoschicht gebunden, die auf den Au-Elektroden angeordnet war, die mit dem Quarz-Kristall assoziiert sind, wie dies in Beispiel 2 beschrieben wird.
4.3.2 Antikörper verwendet in den kompetitiven und amplifizierten kompetitiven Verfahren
Maus-IgE-Anti-Dinitrophenyl (DNP-Ab) wurde als der Sonden-Antikörper verwendet. Ziege-Anti-Maus-Fc-Antikörper wurden verwendet als die amplifizierenden Anti-Abs.
4.3.3 Analyse von 2,4-Dinitrophenol (DNP) durch das kompetitive Verfahren
Die Konfiguration der Ausführungsform wird in 24 dargestellt.
Eine Stamm-Lösung von 0,3 ng/ml Dinitrophenol, in NaCl-enthaltendem PBS wurde hergestellt. Aus der Stamm-Lösung wurden 10 μl entnommen in eine Phiole und 10 μl DNP-Ab-Lösung aus 11 × 10^–10 M Stamm-Lösung wurden zu der Phiole hinzugeben. Die Mischung wurde für 15 min inkubiert. Die gesamte Menge an Dinitrophenol in der Phiole war 3,1 × 10^–12 g. Die resultierende Lösung wurde injiziert in 1 ml an 0,01 M einer wässrigen Phosphat-Puffer-Lösung, welche 0,1 M NaCl, pH = 7,4 enthielt, wurde inkubiert mit 10 μl der 11 × 10^–10 MDNP-Ab-Lösung. Die resultierende Mischung wurde dann in die Zell-Lösung, wie zuvor beschrieben, injiziert und die Frequenz-Änderungen des Kristalls mit der Zeit wurden verfolgt. Das Referenz-System enthielt nicht den Dinitrophenol-Analyten.
25 (Kurve a) zeigt die Frequenz-Änderungen des Kristalls in dem Referenz-System, welchem Dinitrophenol fehlt. Eine Frequenzabnahme von ungefähr Δf = –30 Hz zeigt die Abwesenheit des Analyten in der Probe. Mit dem System, welches 3,1 pg/ml Dinitrophenol enthält, wird nur eine Frequenz-Abnahme von (–5,0)–(–8,0) Hz beobachtet (Ergebnis nicht gezeigt), was zeigt, dass der Sonden-Antikörper besetzt ist.
4.3.4 Analyse von 2,4-Dinitrophenol (DNP) durch das amplifizierte kompetitive Verfahren
Eine Lösung von 6,7 × 10^–6 MDNP-Ab und 6,7 × 10–6 M Anti-Ab wurde vermischt und 15 min inkubiert. Die Lösung wurde wiederholt verdünnt, um zu einer Stamm-Lösung von 11 × 10^–10 M des DNP-Ab/Anti-Ab-Komplexes zu führen, welche wiederum verwendet wurde als die Sonden-Ab/Anti-Ab-Lösung.
10 μl einer DNP-Stamm-Lösung in einem NaCl-enthaltendem PBS wurden mit 10 μl des DNP-Abs inkubiert und Anti-Ab-Stamm-Lösung für 15 min. Die resultierende Mischung wurde in die Zelle injiziert, wie in Beispiel 4.3.3 beschrieben ist.
In einem Referenz-System wurden 10 μl des Phosphat-Puffers mit den 10 μl der DNP-Ab/Anti-Ab-Stamm-Lösung vermischt und die resultierende Mischung wurde in die Zelle injiziert, wie in Beispiel 4.3.3 beschrieben wird.
25 (Kurve b) zeigt die Frequenz-Änderungen des Kristalls nach Injektion des DNP-Ab/ Anti-Ab-Sonden-Lösung, der das DNP-Antigen fehlt. Eine Frequenz-Veränderung von Δf = –85 Hz wird beobacht; dies deutet darauf hin, dass eine Assoziation der vakanten DNP-Ab/Anti-Ab mit der Kristall-Grenzfläche stattfindet. 25 (Kurve c) zeigt die Frequenz-Änderungen des Kristalls nach Injektion der DNP-Ab/Anti-Ab-Sonden-Lösung, welche 3,1 × 10^–12 g an DNP einschließt. Nur eine leichte Frequenz-Änderung von ungefähr Δf = –12 Hz wird beobachtet, was impliziert, dass der DNP-Ab/Anti-Ab-Komplex durch den DNP-Analyten besetzt wird.
4.3.5 Analyse von 2,4-DNT durch das amplifizierte kompetitive Verfahren unter Verwendung von DNP-Ab und Anti-Ab als Sonden
10 mg von 2,4-DNT wurden aufgelöst in 1 ml Ethylenglycol-monomethyl-ether. 100 μl dieser Lösung wurden auf 1 ml verdünnt mit einer 0,01 M Phosphat-Puffer-Lösung, pH = 7,4, welche 0,1 M NaCl enthielt. Diese Lösung wurde wiederholt verdünnt, um die gewünschte Konzentration der Analyt-Probe zu erzielen.
Eine 100 ml einer 54 × 10^–1 M-Lösung des DNP-Ab und des Anti-Ab wurden vermischt und für 15 min inkubiert, um die DNP-Ab/Anti-Ab-Sonden-Lösung zu ergeben.
10 μl der 2,4-DNT-Stamm-Lösung, welche 4,39 × 10^–12 g 2,4-DNT enthielten, wurden vermischt mit 10 μl der DNP-ab/Anti-Ab-Sonden-Lösung und für 15 min inkubiert. Man injizierte die resultierende Mischung in die Mess-Zelle, die 1 ml des Phosphat-Puffers enthielt. Die Frequenz-Änderung des Kristalls als eine Funktion der Zeit ist in 26 dargestellt (Kurve a), welche eine letztendliche kleine Frequenz-Abnahme von ungefähr Δf = –2 Hz zeigt. 26 (Kurve b) zeigt die Ergebnisse eines ähnlichen Experimentes, durchgeführt für eine zweite Wiederholung mit der gleichen Elektrode.
Als ein Referenz-System wurden 10 μl des Phosphat-Puffers behandelt mit DNP-Ab/Anti-Ab-Sonden-Lösung, wie oben beschrieben wurde. Die Mischung wurde dann injiziert in die Mess-Zelle, wie für die oben genannten Beispiele beschrieben. Diesem System fehlt das Analyt-Antigen (2,4-DNT) und folglich bleibt der DNP-Ab/Anti-Ab-Komplex vakant und ist in der Lage, an die Antigen-Monoschicht des Kristalls zu binden. 26 (Kurve c) zeigt die Veränderung der Kristall-Frequenz mit der Zeit nach Injektion dieser Referenz-Lösung. Die Referenz-Lösung wurde in die gleiche Elektrode injiziert, welche zuvor bereits eingesetzt worden war, um zweifach die 2,4-DNT-Analyt-Proben nachzuweisen. Eine Frequenz-Abnahme, welche mit Δf = –18 Hz korrespondierte, wurde beobachtet, was anzeigt, dass der vakante DNP-Ab/Anti-Ab-Komplex mit der Antigen-Monoschicht assoziiert, die auf dem Kristall angeordnet ist.
Eine Schlussfolgerungen können daraus aus dieser Anordnung von Experimenten wie folgt gezogen werden:

(a) Eine 2,4-DNT-enthaltende Probe beeinflusst nicht signifikant die Frequenz des Kristalls. Eine nicht-kontaminierte Analyten-Probe stimuliert eine Frequenz-Veränderung von Δf = –18 Hz. Jegliche Probe, die eine Frequenz-Änderung von weniger als Δf = –5 Hz zeigt, kann als eine 2,4-DNT-verunreinigte Probe betrachtet werden.
(b) Das Verfahren ermöglicht die wiederholte Verwendung der Elektrode für 2,4-DNT-positive Proben. Eine negative 2,4-DNT-Probe ruiniert die Elektrode, da die Sensor-Oberfläche gesättigt ist. Nach jeder negativen Probe muss die Sensor-Elektrode ausgetauscht werden. Die Ausführungsform ist insbesondere bedeutsam in dem Fall, wo angenommen werden muss, dass ein großer Anteil der Proben mit einem Explosivstoff kontaminiert sein kann.

4.3.6 Analyse von DNT-Isomeren durch das amplifizierte kompetitive Verfahren unter Verwendung der Dinitrosalicylsäure-Antigen-Monoschicht und DNP-Ab/Anti-Ab als Sonde
Ein ähnlicher mit einer Antigen-Monoschicht-modifizierter Kristall wurde untersucht als potentielle Sensor-Grenzfläche für andere DNT-Isomere. Der Satz von Experimenten, der in Beispiel 4.3.5 beschrieben wurde, wurde durchgeführt für 2,4-DNT (78 pg/ml^–1), 1,4-DNT (94 pg/ml^–1), 2,6-DNT (78 pg/ml^–1) und 3,4-DNT (75 pg/ml^–1).
27A bis 27C zeigen Frequenz-Änderungen des Kristalls in der Gegenwart unterschiedlicher DNT-Isomere (2,4-DNT, 1,4-DNT und 2,6-DNT) in positiven Proben (Kurven a in all diesen Figuren). Die Frequenz-Änderungen des Kristalls nach ihrer Wechselwirkung mit positiven Proben der unterschiedlichen Isomere und mit den entsprechenden Referenz-Systemen, welche die vakante DNP-Ab/Anti-Ab-Sonden-Lösung einschließen, ist in der folgenden Tabelle 2 gezeigt: Tabelle 2

Analyt Konzentration pg/ml ΔF mit Analyten ΔF ohne Analyten

2,4-DNT 78 –6 –16

1,4-DNT 94 07 –18

2,6-DNT 78 03 –12
Die Resultate ergeben, dass die Isomere 2,4-DNT, 1,4-DNT und 2,6-DNT durch die DNP-Ab/Anti-Ab-Sonden-Lösung erkannt werden.
Ein ähnliches Experiment mit 3,4-DNT zeigt, dass dieses Isomer nicht erkannt wird durch die DNP-Ab/Anti-Ab-Sonden-Lösung. Folglich wird für dieses Isomer ein anderer Antikörper benötigt werden.
4.3.7 Stabilitäts-Untersuchungen des erzeugten Antigen-Monoschicht-modifizierten Kristalls
Eine Serie von 10 Kristallen, welche Au-Elektroden einschließen, wurden parallel behandelt mit einer Art und Weise, wie sie in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die Elektroden wurden getrocknet mit Argonschutzgas und gelagert unter Argon unter 4°C.
Zu unterschiedlichen Zeit-Intervallen wurden unterschiedliche Elektroden untersucht hinsichtlich ihrer Sensor-Aktivität von TNT als Analyt und unter Verwendung der Ablösungs-Ausführungsform als die Sensor-Prozedur. Die entsprechende Elektrode wurde beladen mit dem IgG TTDA5B3-Antikörper und 100 pg/ml an TNT wurden in die Zelle injiziert, wie detailliert in Beispiel 3 dargelegt ist.
Die Frequenz des Kristalls wurde als eine Funktion der Zeit verfolgt, um so das Ablösen des Antikörpers von der Sensor-Grenzfläche zu charakterisieren.
Die 28A–28C zeigen Frequenz-Änderungen von unterschiedlichen Elektroden, welche gelagert wurden für je 7 Tage, 15 Tage bzw. 28 Tage mit TNT (100 pg/ml). Alle Elektroden zeigen vergleichbare Aktivität, was darauf hindeutet, dass die Sensor-Grenzfläche stabil gegenüber Lagerung ist. Elektroden, die für zumindest 75 Tage gelagert wurden unter den gleichen Bedingungen, behielten ihre Sensor-Aktivitäten bei.
5. Analyse von DNT/TNT durch die grundlegende Filtrations-Ausführungsform
Diese Ausführungsform ist im Allgemeinen in 29 dargelegt.
Der Quarz-Kristall wird um Biotin modifiziert und Avidin wird auf der Basis-Monoschicht adsorbiert, um die Biotin-Avidin-Sensor-Grenzfläche 500 zu erzeugen. Eine Filter-Unterlage 502 wird in der Form eines inerten Feststoffes hergestellt, eines Überzuges oder eines Filter-Materials, an welche das Antigen verknüpft ist, beispielsweise durch kovalentes Anbinden.
Der Sonden-Antikörper wird modifiziert, um Biotin, um einen Biotin-funktionalisierten Antikörper 504 zu ergeben. Der biotinylierte Antikörper (Ab-B) 506 wird in einer fixierten Konzentration aufgelöst, um die Sonden-Lösung zu erzeugen.
Für die Analyse von DNT/TNT in Proben wird das Ganze zunächst umgesetzt mit der Antikörper-Sonden-Lösung über einen Zeitraum, der hinreichend ist, um das Binden zwischen den Antikörpern und dem Explosivstoff zu gewährleisten, falls dieser in der Probe vorliegt. Die Probenlösung wird dann mit der Filter-Basis zur Wechselwirkung gebracht bzw. durch selbige passiert und anschließend in die Mess-Zelle eingebracht und mit dem Quarz-Kristall-Sensor-Element zur Wechselwirkung gebracht. Wie auf der linken Seite von 29 illustriert, wird eine reine Analyten-Probe, die kein DNT/TNT aufweist, in der Assoziation des Sonden-Antikörpers 504 mit der Filter-Basis 502 resultieren. Die resultierende Lösung, die in die Zelle eingebracht worden ist, wird den Ab-B 504 nicht aufweisen und die Kristall-Frequenz wird sich nicht verändern. In dem Fall, wo DNT/TNT vorliegt, so wie er auf der rechten Seite von 29 illustriert ist, wird der Antikörper das DNT/TNT-Antigen binden. Die Wechselwirkung der Sonden-Lösung mit dem Kristall resultiert in der Assoziation des Ab-B der Biotin-Avidin-Monoschicht und führt zu einer Frequenz-Abnahme des Kristalls.
Es sollte festgehalten werden, dass die charakteristische hohe Sensitivität der kompetitiven Ausführungsform auch ein Merkmal der grundlegenden Filtrations-Ausführungsform ist. Des Weiteren wird die Sensor-Oberfläche des Kristalls nur bei Vorliegen von DNT/TNT schlechter, falls DNT/TNT in der Probe vorliegt, ähnlich wie in dem Fall der kompetitiven Ausführungsform. Des Weiteren wird eine positive DNT/TNT-Probe reflektiert durch eine Frequenz-Abnahme im Gegensatz zu der kompetitiven Ausführungsform, wo ein positiver Test nicht die Kristall-Frequenz beeinflusst. Dies reduziert die Wahrscheinlichkeit von falsch-positiven Ergebnissen der kompetitiven Ausführungsform.
Im Folgenden werden einige spezifische Beispiele dieser Ausführungsform dargestellt.
5.1 Modifikation des Quarz-Kristalls mit einer Biotin/Avidin-Monoschicht
30 stellt die schrittweise Modifikation der Au-Oberflächen dar, die mit dem Quarz-Kristall assoziiert sind und so die Biotin-Avidin-Schicht ergeben. Die Au-Oberflächen wurden gereinigt und modifiziert durch die primäre Cystamin-Monoschicht, wie dies in Beispiel 2 beschrieben wird. Die Cystamin-modifizierte Elektrode wurde zur Wechselwirkung gebracht mit einer wässrigen Lösung von 0,01 M Biotinamidocaproat-N-hydroxy-succinimid-ester für 1 Stunde. Der resultierende biotinylierte und Monoschicht-modifizierte Kristall wurde gewaschen, getrocknet und in die Mess-Zelle eingebracht, welche 0,01 M Phosphat-Puffer, pH = 7,4 enthielt. Eine Avidin-Lösung wurde injiziert in die Zelle, was zu einer Konzentration von 6,5 × 10^–3 M in der Zelle führte bzw. zu einer Biotin-Avidin-Monoschicht führte. 31 zeigt die Resonanz-Frequenz-Änderung des Kristalls mit der Zeit als ein Ergebnis der Beladung der Biotin-Monoschicht mit Avidin. Das Zell-Volumen wurde anschließend gewaschen mit der Phosphat-Puffer-Lösung. Das System wird nun zur Analyse der DNT/TNT-Analyten beladen.
5.2 Herstellung der Filter-Basen
Zwei unterschiedliche Typen von Filter-Basen wurden hergestellt:

(a) Glaskapillaren, die 8 cm lang waren, 1,5 mm im Durchmesser, wurden mit 0,5 M Lösung an 3-Aminopropyltriethoxysilan in Toluol befüllt und in die gleiche Lösung eingebracht. Die Lösung wurde auf 85°C für 15 Stunden erhitzt. Die resultierenden Kapillaren wurden gewaschen mit Toluol und anschließend gewaschen mit Ethanol und Wasser. Die Kapillaren wurden dann befüllt mit einer wässrigen Phosphat-Puffer-Lösung, pH = 7,4, welche 0,01 M 3,5-Dinitrosalicylsäure, 0,1 M 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminpropyl)carbodiimid (EDC) und 0,1 M N-Hydroxysulfosuccinimid-Natriumsalz enthielt. Die Kapillaren wurden dann zur Umsetzung gebracht mit dieser Lösung für 2 Stunden. Die resultierenden Kapillaren wurden gewaschen mit einer 0,01 M Phosphat-Puffer-Lösung, pH = 7,4 und dann getrocknet.
(b) Die Basis einer Phiole, 0,5 cm an Durchmesser bzw. 1,0 cm an Höhe wurde überzogen mit einer Goldschicht durch Vakuum-Abscheidung. Die Gold-Oberfläche wurde modifiziert durch die 3,5-Dinitrosalicylsäure-Antigen-Monoschicht mit einer Prozedur, die ähnlich zu derjenigen ist, die in Beispiel 2 beschrieben wurde für die Anordnung der Antigen-Monoschicht auf den Gold-Oberflächen, die mit dem Quarz-Kristall assoziiert sind.

5.3 Herstellung biotinyliertem DNP-Ab
Der DNP-Ab wurde modifiziert mit Biotin, wie in Beispiel 3.7.1 beschrieben.
5.4 Analyse von 2,4-DNT durch das kompetitive Verfahren und Filtern der Basis-Patrone
10 μl einer verdünnten 2,4-DNT-Lösung, welche 0,156 ng von 2,4 DNT enthielt, wurden zu 10 μl einer 4,2 × 10^–8 M biotinylierten DNP-Ab-Lösung (DNP-Ab-B) hinzugegeben. Die Mischung wurde für 10 min inkubiert und dann in die modifizierte Glaskapillare eingebracht und zwar für weitere 10 min. Die Lösung aus der Kapillare wurde dann in die Mess-Zelle injiziert und die zeitabhängige Frequenz-Änderungen des Kristalls wurden aufgezeichnet.
Als Referenz-System, dem der DNT-Analyt fehlt, wurde 10 μl der 4,2 × 10^–8 M DNP-Ab-B-Sonden-Lösung eingesetzt und die resultierende Mischung wurde behandelt in der Kapillar-Filter-Säule und in die Zelle in der gleichen Art und Weise, wie oben beschrieben, injiziert.
32 (Kurve a) zeigt Kristall-Frequenz-Veränderung nach Injektion des Referenz-Systems. Keine signifikanten Frequenz-Änderungen wurden beobachtet (Δf < –5,0 Hz), was nahelegt, dass kein DNP-Ab-B mit dem Biotin/Avidin-Monoschicht-modifizierten Kristall assoziierte. Die Ergebnisse zeigen an, dass das DNP-Ab-B durch die Antigen-modifizierte Kapillare filtriert wird. 32 (Kurve b) zeigt die Frequenz-Änderungen des gleichen Kristalls nach Injektion der 2,4-DNT-Analyten-Probe. Eine Frequenz-Abnahme von Δf = –35 Hz wird beobachtet, was anzeigt, dass der mit Antigen besetzte DNP-Ab durch die Filter-Säule passiert wurde und and der Biotin-Avidin-Monoschicht assoziiert.
6. Analyse von DNT/TNT durch die Enzym-Ausführungsform
Diese Ausführungsform ist essentiell eine Modifikation der grundlegenden Filtrations-Ausführungsform, die in Beispiel 5 beschrieben wird und ist in den 33 und 34 dargestellt.
Die Elektrode auf dem Quarz-Kristall 600 wird modifiziert durch den Anti-Meerrettich-Peroxidase-Antikörper (Anti-HRP) 602, um die Sensor-Oberfläche für das HRP-Ab-Konjugat 604 zu erzeugen. Eine Filter-Basis 608 kann eine feste Matrix sein, ein Filter-Material, an welches das Antigen 610 gekoppelt ist.
Der Sonden-Antikörper wird modifiziert durch HRP und ergibt so ein HRP-Ab-Konjugat 612. Das HRP-Ab-Konjugat 612 wird in Lösung gebracht in einer wässrigen Lösung, was zu der Sonden-Lösung führt.
Für die Analyse wird zuerst eine Probe mit der HRP-Ab-Sonden-Lösung in Wechselwirkung gebracht und für einen Zeitraum inkubiert, der hinreichend ist, um das Binden des Antikörpers an die explosiven Moleküle in der Probe zu ermöglichen (falls solche vorliegen). Die Sonden-Lösung wird dann durch die Filter-Basis 608 passiert oder mit ihr in Wechselwirkung gebracht und anschließend in die Mess-Zelle eingebracht und es wird ermöglicht, dass sie mit dem modifizierten Quarz-Kristall wechselwirkt. Der Fall, wo eine klare Probe vorliegt, wird auf der rechten Seite von 33 illustriert, wohingegen der Fall, wo eine DNT/TNT-kontaminierte Probe vorliegt, auf der linken Seite von 33 illustriert wird. Eine klare Probe, der DNT oder TNT fehlt, wird in der Assoziation des Sonden-HRP-Abs an die Filter-Basis 608 resultieren (aufgrund der Bioaffinitäts-Wechselwirkung zwischen dem Antigen, das mit der Filter-Basis assoziiert ist (ein Antikörper, der Teil des HRP-Ab-Konjugats ist). Die resultierende Lösung, die in die Zelle eingebracht wurde, wird keinen HRP-Ab aufweisen und die Masse die Kristalls wird sich folglicherweise nicht verändern. Als eine Konsequenz wird es keine Resonanz-Frequenz-Veränderung geben (siehe den illustrativen Graph 620).
Eine positive DNT/TNT-Probe wird im Binden des Antigens an den Antikörper resultieren, um so das Konjugat 614 in der Sonden-Lösung zu ergeben. Die Filter-Basis wird nicht an den HRP-Ab binden, da er mit dem DNT/TNT-Antigen assoziiert ist. Die Wechselwirkung der Sonden-Lösung mit dem Kristall wird dann in der Assoziation des HRP-Ab-Konjugats 614 an die Anti-HRP-Monoschicht resultieren (aufgrund der Bioaffinitäts-Wechselwirkung zwischen Anti-HRP auf der Oberfläche und dem HRP, das Teil des HRP-Ab-Konjugats ist). Dies resultiert in einer Frequenz-Abnahme des Kristalls (siehe illustrativer Graph 622).
Wenn der Kristall, der den Anti-HRP/HRP-Ab/TNT-Komplex 630 trägt, inkubiert wird in einer Lösung von Wasserstoffperoxid und 4-Chlornaphthol, katalysiert das HRP eine Reaktion 632, in welchem dieses Substrat (4-Chlornaphthol) durch Wasserstoffperoxid oxidiert wird, was zu einem unlöslichen Problem führt, welches ein Präzipitat 634 auf der Oberfläche der Elektrode ausbildet. Die Ausbildung des unlöslichen Produktes senkt dramatisch die Frequenz des Kristalls (siehe illustrativer Graph 640 in 34), was in einer signifikanten Amplifikation des primären Signals resultiert.
Die spezifische biokatalytische Reaktion, zusätzlich zur Amplifikation des primären Signals, dient auch als Bestätigung, um das primäre Signal zu verifizieren. In dem Fall einer nichtspezifischen Adsorption einiger Verunreinigungen wird das sekundäre amplifizierte Signal nicht ansteigen. Folglich kann die sekundäre Abnahme in der Frequenz des Kristalls, die durch das Enzym biokatalysiert ist (in einem spezifischen Beispiel durch HRP) als Bestätigung der Bioaffinitäts-Kopplung des HRP-Ab-Konjugats an die Oberfläche des Kristalls bin den. Eine falsche Veränderung der primären Frequenz, die von der Adsorption von nicht-katalytisch aktiven Spezies herrührt, kann folglich leicht diskriminiert werden. Die Menge des Präzipitats und folglich das Ausmaß der Signal-Amplifikation kann gesteuert werden, entweder durch die Oberflächen-Konzentration des HRPs und die Zeit der Kristall-Inkubation in der sich entwickelnden Lösung, welche Wasserstoffperoxid enthält sowie 4-Chloraphthol. Es ist klar, dass das Ausmaß der Amplifikation folglich leicht gesteuert werden kann durch irgendeinen Parameter der Inkubationszeiten, beispielsweise durch die Zeit, in welcher der HRP zur Katalyse der sich entwickelnden Reaktion in der Lage ist.
Viele unterschiedliche Enzyme und entsprechende Substrate, welche unlösliche Produkte erzeugen, können in dieser Ausführungsform verwendet werden. Im Folgenden seien einige Beispiele genannte:

I. Meerrettichperoxidase (HRP) oder Mikroperoxidase-11 mit verschiedenen Substraten, die 4-Chlornaphthol, 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid oder 3-Amino-9-ethylcarbazol einschließen.
II. Alkalische Phosphatase mit den Substraten: 5-Brom-4-chlor-3'-indolyphosphat-p-toluidin oder Nitro-blue-tetrazoliumchlorid.
III. Glucoseoxidase mit den Substraten: Nitro-blue-tetrazoliumchlorid, Tetranitroblue-tetrazolium.
IV. Galactosidase mit dem Substrat: 5-Brom-4-chlor-D-galactopyranosid.

Offensichtlich sollte, wie leicht einzusehen ist, in jedem Fall die Oberfläche der Elektrode den entsprechenden Anti-Enzym-Antikörper tragen.

Claims

Ein Protein, welches einen Antigen-bindenden Abschnitt umfasst, ausgebildet durch zwei kooperative Peptidesequenzen, wie sie in SEQ ID Nummern: 6 und 8 dargestellt sind.
Ein Protein gemäß Anspruch 1, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Monoklonalen Antikörpern, b) IgM Antikörpern, c) IgG Antikörpern, d) einem Fragment eines Antikörpers, der eine Antigenbindungsdomäne umfasst, e) einem Antikörper ohne die Fc Region, und f) einem einzelsträngigen Antikörper.
Ein Protein entsprechend Anspruch 1, welches ein monoklonaler IgG 1 Antikörper ist, abgeleitet von TNP-KLH-immunisierten Mäusen, hier bezeichnet als der 5B3 monoklonale Antikörper.
Ein Apparat zum Nachweis von kleinen Untersuchungs-Molekülen in einer Probe, umfassend: a) Ein Sensor-Element, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst mit zumindest einer Sensor-Oberfläche, welche mit einem Medium Wechselwirken kann, das in Kontakt damit ist, entweder durch Binden eines ersten Indikator-Agens aus dem Medium oder durch Freisetzen eines zweiten Indikator-Agens, das ursprünglich auf der Sensoroberfläche immobilisiert war, in das Medium; wobei das Medium entweder die Probe ist, und in diesem Fall das Untersuchungs-Molekül, wenn es vorliegt, die Freisetzung des zweiten Indikator-Agens verursacht aus der zumindest einen Sensor-Oberfläche, oder eine behandelte Proben-Präparation ist, die erhalten wird durch Umsetzen der Probe mit einer oder beider von einer Reagenz-Lösung oder einer Proben-Verarbeitungs-Hardware, so dass besagtes Medium ein erstes Indikator-Agens oder eine zweite Indikator-Agens-freisetzende Spezies, bei einer Konzentration von besagtem Agens oder besagter Spezies umfasst, welche in Korrelation mit der Konzentration des Untersuchungs-Moleküls in der Probe steht, und die Bindung oder Freisetzung in einer Veränderung der Masse der Sensoroberfläche resultiert; wobei besagte zumindest eine Sensor-Oberfläche Einfang-Agenzien trägt, welche an neutralisierende Agenzien binden, an einer Untersuchungs-Molekül-Bindungsdomäne des neutralisierenden Agens, und wobei besagte Einfang-Agenzien Untersuchungs-Moleküle, -Reste oder -Gruppen darstellen und besagte Neutralisierungs-Agenzien erste Antikörper umfassen, die an die Untersuchungs-Moleküle binden, und wobei besagte erste Antikörper die Proteine von Anspruch 1 sind, wobei besagte zumindest eine Sensor-Oberfläche Reste oder Gruppen der Untersuchungs-Moleküle trägt, die an besagte erste Antikörper gebunden sind, welche kompetitiv an lösliche Untersuchungs-Moleküle in einem Medium binden können, das in Kontakt mit zumindest einer Sensoroberfläche steht, wobei in der Gegenwart der Untersuchungs-Moleküle in besagtem Medium die Antikörper freigesetzt werden von der zumindest einen Sensoroberfläche. b) eine Testzelle zum Halten des Mediums und zum im Kontakt bringen von besagtem Medium mit besagter zumindest einer Sensoroberfläche; und c) eine elektrische oder elektronische Einheit zum Induzieren von Vibrationen in dem piezoelektrischen Kristall und zum Messen der Resonanzfrequenz davon, wobei eine Veränderung in der Resonanzfrequenz nach Kontakt zwi schen der Sensoroberfäche und dem Medium das Vorliegen der Untersuchungs-Moleküle in der Probe anzeigt.
Ein Apparat entsprechend Anspruch 4, wobei ein Grad der Veränderung in der Resonanzfrequenz als ein Maß für das Niveau von besagtem Untersuchungs-Molekül in besagter Probe dient.
Ein Apparat entsprechend Anspruch 4, wobei besagtes Untersuchungs-Molekül ein explosives Molekül ist.
Ein Apparat entsprechend Anspruch 4, wobei besagter erster Antikörper das Protein von Anspruch 1 ist.
Ein Apparat entsprechend irgendeinem der Ansprüche 4 bis 7, wobei die ersten Antikörper gebunden oder komplexiert sind an ein Masse-verstärkendes Agens.
Ein Apparat entsprechend Anspruch 8, wobei besagtes Masse-verstärkendes Agens einen zweiten Antikörper umfasst, der an besagten ersten Antikörper bindet oder Avidin oder Streptavidin umfasst, gebunden an einen Biotinrest, der mit dem ersten Antikörper konjugiert ist.
Ein Apparat entsprechend irgendeinem der Ansprüche 4 bis 9, wobei besagtes Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
Ein System zum Nachweis kleiner Untersuchungs-Moleküle in einer Probe umfassend: a) ein Sensorelement, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst mit zumindest einer Sensoroberfäche, welche Reste oder Gruppen von besagten Untersuchungs-Molekülen trägt, gebunden an ein Proteinmolekül, welches das Protein von Anspruch 1 ist; b) eine Testzelle zum Halten eines Mediums und In-Kontakt-Bringen mit besagter zumindest einer Sensoroberfläche, wobei in der Gegenwart des Untersuchungs-Moleküls in dem Medium zumindest einige von besagten Proteinmolekülen in das Medium freigesetzt werden; c) Hardware zum Einbringen der Probe in das Testgefäß; und d) eine elektrische oder elektronische Einheit zum Induzieren von Vibrationen in dem piezoelektrischen Kristall und Messen der Resonanzfrequenz davon, wobei eine Reduktion der Resonanzfrequenzen nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und dem Medium das Vorliegen von besagtem Untersuchungs-Molekül in der Probe anzeigt.
Ein System entsprechend Anspruch 11, wobei besagtes Untersuchungs-Molekül ein explosives Molekül ist.
Ein System entsprechend Anspruch 12, wobei besagtes Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
Ein System entsprechend irgendeinem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Proteinmoleküle an Masse-verstärkende Agenzien gebunden sind.
Ein System entsprechend Anspruch 14, wobei besagtes Masse-verstärkendes Agens einen zweiten Antikörper umfasst oder Avidin oder ein Streptavidin, welche an eine Biotingruppe binden, die an das Proteinmolekül konjugiert ist.
Ein System zum Nachweis kleiner Untersuchungs-Moleküle in einer Probe umfassend: a) Ein Sensor-Element, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst, der zumindest eine Sensoroberfläche aufweist, die Reste oder Gruppen der Untersuchungs-Moleküle trägt; b) ein Reagenz-System umfassend ein Proteinmolekül, welches das Protein von Anspruch 1 ist; c) eine Testzelle zum Halten eines Mediums und In-Kontakt-Bringen eines Mediums mit besagter zumindest einer Sensor-Oberfläche, wobei in der Gegenwart der Untersuchungs-Moleküle in dem Medium zumindest einige der Proteinmoleküle in das Medium freigesetzt werden; d) eine Anordnung zum In-Kontakt-Bringen der Probe mit besagtem Reagenzsystem, um eine behandelte Probenpräparation zu erhalten und zum Einbringen der behandelten Probepräparation in das Testgefäß; und e) eine elektrische oder elektronische Einheit zum Induzieren von Vibrationen in dem piezoelektrischen Kristall und zum Messen der Resonanzfrequenz davon, wobei eine Abnahme in der Resonanzfrequenz nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und der behandelten Proben-Präparation anzeigt, dass die Probe frei von den Untersuchungs-Molekülen ist.
Ein System entsprechend Anspruch 16, wobei das Untersuchungs-Molekül ein explosives Molekül ist.
Ein System entsprechend Anspruch 17, wobei das Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
Ein System entsprechend irgendeinem der Ansprüche 16 bis 18 umfassend ein Masse-verstärkendes Agens zum Binden an besagtes Protein-Molekül.
Ein System entsprechend Anspruch 19, wobei besagtes Masse-verstärkendes Agens einen zweiten Antikörper umfasst oder Avidin oder Streptavidin, welche an eine Biotingruppe binden, die an das Proteinmolekül konjugiert ist.
Ein System zum Nachweis kleiner Untersuchungs-Moleküle in einer Probe umfassender: a) Ein Sensorelement, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst mit zumindest einer Sensoroberfläche, welche Einfang-Agenzien trägt zum Binden an ein Proteinmolekül, welches das Protein von Anspruch 1 ist; b) eine Testzelle zum Halten eines Mediums und in Kontakt bringen des Mediums mit zumindest einer Sensoroberfläche; c) ein Reagenzsystem, das besagtes Proteinmolekül umfasst, welches an die Untersuchungs-Moleküle binden kann; d) eine Anordnung zum In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem Reagenzsystem unter Bedingungen und für einen Zeitraum, der das Binden von besagtem Proteinmolekül an die Untersuchungs-Moleküle erlaubt, um eine behandelte Probenpräparation zu erhalten; e) ein Filtrationssystem zum Herausfiltern von besagten Proteinmolekülen, das nicht an das explosive Molekül gebunden ist, aus besagter behandelter Probenpräparation, um ein Filtrat zu erhalten, das essentiell frei ist von einem solchen ungebundenen Proteinmolekül; f) eine Anordnung zum Transfer von besagtem Filtrat in besagte Testzelle; und g) eine elektrische oder elektronische Einheit zum Induzieren von Vibrationen in den piezoelektrischen Kristall und zum Messen der Resonanzenergie davon, wobei eine Zunahme in der Resonanzfrequenz nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und dem Filtrat das Vorliegen der Untersuchungs-Moleküle in der Probe anzeigt.
Ein System gemäß Anspruch 21, wobei das Untersuchungs-Molekül ein explosives Molekül ist.
Ein System entsprechend Anspruch 22, wobei das Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
Ein System entsprechend irgendeinem der Ansprüche 21 bis 23, wobei besagtes Filtrationssystem immobilisierte Reste oder Gruppen von Molekülen des Untersuchungs-Moleküls umfasst.
Ein System entsprechend irgendeinem der Ansprüche 21 bis 24, wobei besagtes Proteinmolekül konjugiert ist an eine Gruppe, die an besagte Einfang-Agenzien bindet.
Ein System entsprechend Anspruch 25, wobei besagte Gruppe ein Biotinrest ist und besagtes Einfang-Agens Avidin oder Streptavidin ist.
Ein System zum Nachweis kleiner Untersuchungs-Moleküle in einer Probe, umfassend: a) Ein Sensorelement, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst mit zumindest einer Sensoroberfläche, welche Einfang-Agenzien trägt, die an ein Proteinmolekül binden, welches das Protein von Anspruch 1 ist, das konjugiert ist an ein Enzym, welches eine Reaktion katalysieren kann, die zu einem unlöslichen Reaktionsprodukt führt; b) eine Testzelle zum Halten eines Mediums und zum In-Kontakt-Bringen mit besagter zumindest einer Sensoroberfläche; c) ein Reagenzsystem umfassend besagtes Proteinmolekül, welches an die Untersuchungs-Moleküle binden kann, wobei besagtes Proteinmolekül an ein Enzym konjugiert ist, welches eine Reaktion katalysieren kann, die zu einem unlöslichen Reaktionsprodukt führt; d) eine Anordnung zum In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem Reagenzsystem unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die das Binden von besagtem Proteinmolekül an die Untersuchungs-Moleküle erlauben, um eine behandelte Probenpräparation zu erhalten; e) ein Filtrationssystem zum Herausfiltern von besagtem Proteinmolekül, das nicht an ein Untersuchungs-Molekül gebunden ist, aus besagter behandelter Probenpräparation, um ein Filtrat zu erhalten, das essentiell frei ist von solchem ungebundenen Proteinmolekül; f) eine Anordnung zum Transfer von besagtem Filtrat in besagte Testzelle; g) ein Ensemble von Reagenzien und Bedingungen zum Induzieren von besagtem Enzym, um die Reaktion zu katalysieren, die das unlösliche Reaktionsprodukt erzeugt; und h) eine elektrische oder elektronische Einheit zum Induzieren von Vibrationen in dem piezoelektrischen Kristall und zum Messen der Resonanzfrequenz davon, wobei eine Zunahme in der Resonanzfrequenz nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und dem Filtrat oder nach dem Ermöglichen der Katalysierung besagter Reaktion durch das Enzym das Vorliegen des Untersuchungs-Moleküls in der Probe anzeigt.
Ein System entsprechend Anspruch 27, wobei das Untersuchungs-Molekül ein explosives Molekül ist.
Ein System entsprechend Anspruch 28, wobei das Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
Ein System entsprechend irgendeinem der Ansprüche 28 oder 29, wobei besagtes Filtrationssystem immobilisierte Reste oder Gruppen der Untersuchungs-Moleküle umfasst.
Ein System gemäß irgendeinem der Ansprüche 28 bis 30, wobei besagtes Einfang-Agens ein immobilisierter Antikörper ist, der an eine Gruppe von besagtem Enzym bindet, wobei besagtes Binden nicht mit der katalytischen Aktivität von besagtem Enzym wechselwirkt.
Ein System gemäß irgendeinem der Ansprüche 27 bis 31, wobei besagtes Enzym ausgebildet aus der Gruppe bestehend aus Meerretichperoxidate, Mikroperoxidate, alkalischer Phosphatase, Glukoseoxidase und Galaktosidase.
Ein System gemäß irgendeinem der Ansprüche 11 bis 32, wobei besagte Hardware ein Flusssystem umfasst, zum Vorwärtstreiben eines Mediums, das die Probe umfasst, in besagte Zeile.
Ein Verfahren zum Nachweis eines kleinen Untersuchungs-Moleküls in einer Probe, umfassend: a) Bereitstellen eines Sensorelements, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst mit zumindest einer Sensoroberfläche, welche Reste oder Gruppen trägt von besagtem Untersuchungs-Molekül, gebunden an ein Proteinmolekül, welches das Protein von Anspruch 1 ist b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit zumindest einer Sensoroberfläche; c) Induzieren von Vibrationen in dem piezoelektrischen Kristall und Messen der Resonanzfrequenz davon; und d) Bestimmen, ob eine Zunahme in der Resonanzfrequenz auftrat nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und dem Medium, wobei eine solche Zunahme das Vorliegen des Untersuchungs-Moleküls in der Probe anzeigt.
Ein Verfahren entsprechend Anspruch 34, wobei die Untersuchungs-Moleküle explosive Moleküle sind.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 34 bis 35, wobei das Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
Eine Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 34 bis 36, umfassend das Binden eines Masse-verstärkenden Agens an die Antikörper.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 37, wobei besagtes Masse-verstärkendes Agens einen zweiten Antikörper umfasst oder ein Avidin- oder ein Streptavidin-Molekül, welches an eine Biotin-Gruppe bindet, die an das Proteinmolekül gebunden ist.
Ein Verfahren zum Nachweis eines kleines Untersuchungs-Moleküls in einer Probe umfassend: a) Bereitstellen eines Sensor-Elements, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst mit zumindest einer Sensoroberfläche, welche Reste oder Gruppen der Untersuchungs-Moleküle trägt; b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Proteinmolekül, welches das Protein von irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2 ist, und Inkubieren für eine Zeit, die es den Antikörpern erlaubt, an die Untersuchungs-Moleküle zu binden, falls sie in der Probe vorliegen, um eine behandelte Probenpräparation zu erhalten; c) In-Kontakt-Bringen der behandelten Probenpräparation mit der zumindest einen Sensoroberfläche; d) Induzieren von Vibrationen in den piezoelektrischen Kristall und Messen der Resonanzfrequenz davon; und e) Bestimmen, ob eine Abnahme in der Resonanzfrequenz nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und der behandelten Probenpräparation auftrat, wobei eine solche Abnahme das Vorliegen des Untersuchungs-Moleküls in der Probe anzeigt.
Ein Verfahren entsprechend Anspruch 39, wobei das Untersuchungs-Molekül ein explosives Molekül ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 40, wobei das Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 39 bis 41, umfassend das Binden eines Masse-verstärkenden Antikörpers an das Proteinmolekül.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 42, wobei besagtes Masse-verstärkendes Agens einen zweiten Antikörper umfasst oder ein Avidin- oder ein Streptavidin-Molekül, welches an eine Biotingruppe bindet, die an das Proteinmolekül gekoppelt ist.
Ein Verfahren zum Nachweis eines kleinen Untersuchungs-Moleküls in einer Probe, umfassend: a) Bereitstellen eines Sensorelements umfassend ein piezoelektrisches Kristall mit zumindest einer Sensoroberfläche, welche Einfang-Agenzien trägt, zum Binden an ein Proteinmolekül, welches das Protein von Anspruch 1 ist; b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit besagtem Proteinmolekül, welches an die untersuchten Moleküle binden kann, unter Bedingungen und über einen Zeitraum, die das Binden besagtem Proteinmolekül an die Untersuchungs-Moleküle erlauben, um eine behandelte Probenpräparation zu erhalten; c) Filtern der behandelten Probenpräparation durch ein Filtrationssystem, um besagtes Proteinmolekül herauszufiltern, das nicht an die Untersuchungs-Moleküle gebunden ist, um ein Filtrat zu erhalten, das essentiell frei ist von solchem ungebundenen Proteinmolekül; d) In-Kontakt-Bringen von besagtem Filtrat mit der zumindest einen Sensoroberfläche; e) Induzieren von Vibrationen in dem piezoelektrischen Kristall und Messen der Resonanzfrequenz davon; f) Bestimmen, ob eine Zunahme in der Resonanzfrequenz auftrat nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und der behandelten Probenpräparation, wo bei eine solche Zunahme das Vorliegen der Untersuchungs-Moleküle in der Probe anzeigt.
Ein Verfahren entsprechend Anspruch 44, wobei die Untersuchungs-Moleküle explosive Moleküle sind.
Ein Verfahren entsprechend Anspruch 45, wobei das Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 44 bis 46, wobei besagtes Filtrationssystem immobilisierte Reste oder Gruppen der Untersuchungs-Moleküle umfasst.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 44 bis 47, wobei besagtes Proteinmolekül eine Gruppe konjugiert ist, die an besagte Einfang-Agenzien bindet.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 48, wobei besagte Gruppe ein Biotinrest ist und besagtes Einfang-Agens Avidin oder Streptavidin ist.
Ein Verfahren zum Nachweis eines kleinen Untersuchungs-Moleküls in einer Probe, umfassend: a) Bereitstellen eines Sensorelements, das einen piezoelektrischen Kristall umfasst mit zumindest einer Sensoroberfläche, welche Einfangagenzien trägt zum Binden an ein Proteinmolekül, welches das Protein von Anspruch 1 ist; das konjugiert ist an ein Enzym, welches eine Reaktion katalysieren kann, die zu einem unlöslichen Reaktionsprodukt führt; b) In-Kontakt-Bringen der Probe mit besagten Proteinmolekül, welches an die Untersuchungs-Moleküle binden kann, wobei besagtes Proteinmolekül an ein Enzym konjugiert ist, das eine Reaktion katalysieren kann, die zu einem unlöslichen Reaktionsprodukt führt, für einen Zeitraum, der das Binden von besagtem Proteinmolekül an die Untersuchungs-Moleküle erlaubt, um eine behandelte Probenpräparation zu erhalten, c) Filtern der behandelten Probenpräparationen durch ein Filtrationssystem, um besagtes Proteinmolekül, das nicht an die Untersuchungs-Moleküle gebunden ist, herauszufiltern, um ein Filtrat zu erhalten, das essentiell frei von solchem ungebundenen Proteinmolekül ist; d) In-Kontakt-Bringen von besagtem Filtrat mit der zumindest einen Sensor-Oberfläche; e) Anwenden von Bedingungen, welche ermöglichen, dass das Enzym die Produktion des unlöslichen Reaktionsproduktes katalysiert; f) Induzieren von Vibrationen in dem piezoelektrischen Kristall und Messen der Resonanzfrequenz davon; und g) Bestimmen, ob eine Abnahme in der Resonanzfrequenz nach Kontakt zwischen der Sensoroberfläche und besagtem Filtrat auftrat oder nach Anwenden von besagtem Bedinungen, wobei eine solche Abnahme das Vorliegen der Untersuchungs-Moleküle in der Probe anzeigt.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 50, wobei das Untersuchungs-Molekül ein explosives Molekül ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 51, wobei das Untersuchungs-Molekül DNT oder TNT ist.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 51 bis 52, wobei besagtes Filtrationssystem immobilisierte Reste oder Gruppen von besagtem Untersuchungs-Molekül umfasst.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 51 bis 53, wobei besagtes Einfang-Agens ein immobilisierender Antikörper ist, der an eine Gruppe von besagtem Enzym bindet, wobei solch ein Binden nicht mit der katalytischen Aktivität von besagtem Enzym wechselwirkt.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 51 bis 54, wobei besagtes Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Meerretichperoxidase, Mikroperoxidase, alkalischer Phosphatase, Glucoseoxidase und Galactosidase.
Ein Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 34 bis 55, wobei der Grad der Veränderung in der Resonanzfrequenz als ein Maß des Niveaus von besagtem Molekül in besagter Probe dient.