EP2676138A2 - Diagnosekit sowie ein verfahren zur untersuchung einer menschlichen patientenprobe auf das vorhandensein neuromyelitis-optica-spezifischer antikörpern - Google Patents

Diagnosekit sowie ein verfahren zur untersuchung einer menschlichen patientenprobe auf das vorhandensein neuromyelitis-optica-spezifischer antikörpern

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EP2676138A2
EP2676138A2 EP12723592.7A EP12723592A EP2676138A2 EP 2676138 A2 EP2676138 A2 EP 2676138A2 EP 12723592 A EP12723592 A EP 12723592A EP 2676138 A2 EP2676138 A2 EP 2676138A2
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EP
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substrate
starting substrate
aquaporin
autoantibodies
patient sample
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Withdrawn
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EP12723592.7A
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Winfried STÖCKER
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Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Original Assignee
Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
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    • G—PHYSICS
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis

Definitions

  • the neuromyelitis optica (NMO - also Devic syndrome) is an inflammatory autoimmune disease of the central nervous system. Particularly affected are the spinal cord (myelitis) and the optic nerves (neuritis nervi optici). The disease manifests itself with paralysis of the arms and legs, loss of sensation and continence disorders, along with blindness of one or both eyes. Histologically, perivascular deposits of immunoglobulins and complement factors are found in the affected tissue.
  • neuromyelitis optica was considered as a variant of multiple sclerosis. However, it is an isolated disease, as in the serum and in the CSF of most NMO patients certain autoantibodies occur that do not occur in multiple sclerosis. From the publications "Weinshenker BG, Wingerchuk DM, Scottsdale AZ, Lucchinetti CF, Lennon VA (2003): A marker autoantibody discriminates neuromyelitis optica from multiple sclerosis. Speakers abstracts about multiple sclerosis, 55th annual meeting of the American Academy of Neurology, March 29 - April 05, 2003 "," Lennon VA, Kryuzer TJ (Nov 25, 2003):
  • the target antigen is disclosed by EP 1 700 120 B1, in which a method for the diagnosis of neuromyelitis optica by determination of the autoantibodies against aquaporin-4 in serum is described.
  • a common test method for autoantibody determination is indirect immunofluorescence: to identify the most diverse autoantibodies, autoantigen-containing tissue sections or cells are brought into contact with dilute patient serum. mm (first incubation step). In the case of positive samples, the antibodies to be detected bind to the autoantigens. In a subsequent second step, the substrates are incubated with fluorescein-labeled anti-human immunoglobulin antibodies, which can then be identified in the case of a positive result under the fluorescence microscope. The fluorescence image corresponds to the distribution of the target antigens in the respective substrate.
  • the method according to the invention is characterized in that in the investigation of the autoantibodies against aquaporin-4 first an aquaporin-4-containing native substrate is wetted with the, preferably diluted, sample, the bound antibodies are subsequently reacted with components of the complement system and then reacted finally be represented by an indicator reaction.
  • a tissue section is first incubated with a patient serum. This is followed by incubation with a mixture of several normal sera as a standardized complement source and with a fluorescein-labeled anti-complement serum, in particular with anti-C1q, -C3c or -C4c.
  • anti-myelin antibodies anti-neuroendothelial antibodies
  • anti-Hu antibodies anti-Hu antibodies
  • anti-Yo antibodies which in a conventional assay performed a similar fluorescence image on the tissue sections as anti-aquaporin-4 the anti-aquaporin-4 antibodies immediately identifiable via the representation by the complement.
  • incubation of the tissue section with a mixture of several normal sera and a fluorescein-labeled anti-complemente serum with the aim of detecting complement activation is characterized in that not only part of the anti-aquaporin-4 antibodies is detected, as it is of the above-mentioned example of Crohn's disease-associated antibodies against pancreatic antigens. Rather, almost all anti-aquaporin-4 autoantibodies seem to bind complement, so that the complement variant appears to be at least partially superior to the immunofluorescence assay based on aquaporin-4-expressing cells in terms of sensitivity.
  • Non-organ specific antibodies such as antinuclear antigen (ANA) antibodies are often present in samples from NMO patients and cause interfering non-specific immunofluorescence on the neuronal tissue preparations. In complement incubation, however, the immunofluorescence pattern is specific even without preabsorption.
  • ANA antinuclear antigen
  • Non-organism-specific antibodies such as those against antinuclear antigens (ANA) are frequently present in samples from NMO patients and cause interfering non-specific immunofluorescence on the neuronal tissue preparations. This can be seen approximately in Figure 2 B, right column, so after incubation with the serum of a patient with NMO syndrome and with anti-human immunoglobulin antibodies. In the complement incubation, however, the immunofluorescence pattern is specific even without preabsorption, as shown in Figure 2 B, left column, so after incubation with the serum of a patient with NMO syndrome and with C3c complement.
  • ANA antinuclear antigens
  • anti-aquaporin-4 antibodies can be clearly differentiated by means of complement incubation against other autoantibodies diagnostically relevant at least partially for neurology, such as anti-myelin, -Hu, -CV2, -Yo.

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Abstract

Beschrieben wird ein Diagnosekit sowie ein Verfahren zur Untersuchung einer menschlichen Patientenprobe auf das Vorhandensein von Neuromyelitis-optica-spezifischen Antikörpern, bei dem ein Ausgangssubstrat mit menschlichem Probenmaterial inkubiert wird und das inkubierte Ausgangssubstrat mittels indirekter Immunfluoreszenz daraufhin untersucht wird, ob Neuromyelitis-optica-spezifische Antikörper wenigstens teilweise an das Ausgangssubstrat gebunden haben. Die beschriebene Lösung zeichnet sich dadurch aus, dass als Ausgangssubstrat ein Aquaporin-4-haltiges natives Substrat verwendet wird sowie dass die wenigstens teilweise an das Aquaporin-4-haltige Ausgangssubstrat gebundenen Neuromyelitis-optica-spezifischen Antikörper mit Komponenten des Komplementsystems zur Reaktion gebracht werden und die Reaktion des Komplementsystems im Wege einer Indikator-Reaktion nachgewiesen wird.

Description

Diagnosekit sowie ein Verfahren zur Untersuchung einer menschlichen Patientenprobe auf das Vorhandensein von Neuromyelitis-optica-spezifischen Antikörpern
Die Neuromyelitis optica (NMO - auch Devic-Syndrom) ist eine entzündliche Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems. Betroffen sind besonders das Rückenmark (Myelitis) und die Sehnerven (Neuritis nervi optici). Die Krankheit manifestiert sich mit Lähmungen der Arme und Beine, Empfindungsverlust und Störungen der Kontinenz, daneben kommt es zur Erblindung eines oder beider Augen. Histologisch finden sich im betroffenen Gewebe perivasculäre Ablagerungen von Immunglobulinen und Komplementfaktoren.
Lange Zeit wurde Neuromyelitis optica als eine Variante der Multiplen Sklerose angesehen. Es handelt sich aber um ein eigenständiges Krankheitsbild, da im Serum und im Liquor der meisten NMO-Patienten bestimmte Autoantikörper auftreten, die bei Multipler Sklerose nicht vorkommen. Aus den Veröffentlichungen„Weinshenker BG, Wingerchuk DM, Scottsdale AZ, Lucchinetti CF, Lennon VA (2003): A marker autoantibody discriminates neuromyelitis optica from multiple sclerosis. Speakers abstracts about multiple sclerosis, 55th annual meeting of the American academy of neurology, March 29 - April 05, 2003", "Lennon VA, Kryuzer TJ (Nov 25, 2003):
Marker for neuromyelitis optica", "Lennon VA, Wingerchuk DM, Kryzer TJ, Pittock SJ, Lucchinetti CF, Fujihara K, Nakashima I, Weinshenker BG (2004): A serum autoantibody marker of neuromyelitis optica: Distinction from multiple sclerosis. Lancet, 2106- 12" und der US 2010/0 12116 A1 ist dies bekannt.
Aus„Lennon VA, Kryzer TJ, Pittock SJ, Verkman AS, Hinson SR (2005): IgG marker of optic-spinal multiple sclerosis binds to the aquaporin-4 water Channel. J. Exp. Med. 202 (4): 473-7" ist bekannt, dass sich die Autoantikörper gegen Aquaporin-4, einen am transmembranösen Wassertransport beteiligten Bestandteil der astrocytären Zellmembran, richten.
Das Zielantigen wird durch die EP 1 700 120 B1 offenbart, in der ein Verfahren zur Diagnose der Neuromyelitis optica durch Bestimmung der Autoantikörper gegen Aquaporin-4 im Serum beschrieben wird.
Eine gängige Testmethode zur Autoantikörper-Bestimmung ist die indirekte Immunfluoreszenz: Um die verschiedensten Autoantikörper zu identifizieren, werden Autoantigen-haltige Gewebeschnitte oder Zellen in Kontakt mit verdünntem Patientense- mm gebracht (erster Inkubationsschritt). Hierbei binden sich bei positiven Proben die nachzuweisenden Antikörper an die Autoantigene. In einem darauf folgenden zweiten Schritt werden die Substrate mit Fluorescein-markierten Anti-Human- Immunglobulin-Antikörpern inkubiert, die dann im Falle eines positiven Ergebnisses unter dem Fluoreszenzmikroskop identifiziert werden können. Das Fluoreszenzbild entspricht der Verteilung der Zielantigene im jeweiligen Substrat.
Es besteht des Weiteren die in der Diagnostik nur selten genutzte Möglichkeit, festzustellen, ob die im indirekten Immunfluoreszenztest an ihr Zielantigen gebundenen Autoantikörper in der Lage sind, das Komplement-System zu aktivieren. Dazu wird nach dem ersten Inkubationsschritt (Probe) mit einem Gemisch mehrerer Normalseren (standardisierte Komplementquelle), dann mit einem Fluorescein-markierten Anti- Komplementserum (zum Beispiel Anti-C1q, -C3c oder -C4c) inkubiert. Bei der chronischen Darmentzündung Morbus Crohn findet man beispielsweise im Serum häufig Autoantikörper gegen Pankreas-Sekret. Eine positive Komplement-Reaktion dieser Antikörper ist hochsignifikant mit der Krankheitsaktivität korreliert, was aus„Stöcker W, Otte M, Ulrich S, Normann D, Stöcker K, Jantschek G. Autoantikörper gegen exokrines Pankreas und gegen intestinale Becherzellen in der Diagnostik des Morbus Crohn und der Colitis ulcerosa (1984). Dtsch Med Wschr 109(51-52): 1963-1969" bekannt ist.
In NMO-Läsionen konnte aktiviertes Komplement an Ablagerungen von Immunkomplexen nachgewiesen werden. Darüber hinaus ist aus der US 2010/0092478 A1 bekannt, dass Autoantikörper gegen Aquaporin-4 nach Bindung mit dem Antigen Komplement aktivieren können und zur Lyse der Zielzelle führen. Die Fähigkeit der Autoantikörper gegen Aquaporin-4, Komplement zu binden, wurde weiterhin durch„Hin- son SR, Pittock SJ, Lucchinetti CF, Roemer SF, Fryer JP, Kryzer TJ, Lennon VA. Neurology. 2007 Dec 11 ;69(24):2221-31. Epub 2007 Oct 10" beschrieben. Die sich anschließende Veröffentlichung„Waters, P. et al.: Aquaporin-4 Antibodies in Neuro- myelitis Optica and Logitudinally Extensive Transverse Myelitius. In: Arch Neurol. Vol. 65, 2008, Nr. 7, S 913-919" offenbart die Komplementbindungsfähigkeit (C3b) bei 9/10 AQP4-Ab-positiven NMO-Seren unter Verwendung AQP4 exprimierender rekombinanter Zellen.
Die Bestimmung der Autoantikörper gegen Aquaporin-4 ist inzwischen in der NMO Diagnostik etabliert. Die bisher zuverlässigsten Resultate liefert die indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung transfizierter, vom Aquaporin-4 abgeleiteter Proteine exprimierender Säugerkulturzellen als Antigen-Substrat. Hierbei wird das Antigen den Autoantikörpern authentisch präsentiert, da es noch in seiner natürlichen Umgebung integriert ist. Im Vergleich dazu ist die Verwendung vonEnzyme-Linked Immu- nosorbent Assays (ELISA) oder Radioimmunassays (RIA) auf der Basis von Antigen- Extrakten oftmals problematisch, da die Tests weniger empfindlich und spezifisch sind.
Werden bei der indirekten Immunfluoreszenz keine transfizierten Zellen eingesetzt, sondern Gefrierschnitte neurologischer Gewebe, wie Hippocampus oder Kleinhirn verschiedener Spezies, wie es insbesondere aus„Weinshenker BG, Wingerchuk DM, Scottsdale AZ, Lucchinetti CF, Lennon VA (2003): A marker autoantibody discrimina- tes neuromyelitis optica from multiple sclerosis. Speakers abstracts about multiple sclerosis, 55th annual meeting of the American academy of neurology, March 29 - April 05, 2003" bekannt ist, lassen sich Antikörper gegen Aquaporin-4 nur sehr schwer identifizieren. So sinkt die Nachweisempfindlichkeit stark ab, weil die Reaktionsstärke meistens für klare positive Signale nicht ausreicht. Außerdem können einige weitere gegen neurologische Strukturen gerichtete Autoantikörper nicht eindeutig abgegrenzt werden, da sie sich immunhistochemisch mit ähnlichen Mustern darstellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass bei der Untersuchung der Autoantikörper gegen Aquaporin-4 zuerst ein Aquaporin-4-haltiges natives Substrat mit der, vorzugsweise verdünnten Probe benetzt wird, die gebundenen Antikörper darauffolgend mit Komponenten des Komplementsystems zur Reaktion gebracht und diese dann schließlich durch eine Indikator-Reaktion dargestellt werden. Auf bevorzugte Weise wird hierbei zunächst ein Gewebeschnitt mit einem Patientenserum inkubiert. Anschließend erfolgt eine Inkubation mit einem Gemisch mehrerer Normalseren als standardisierter Komplementquelle sowie mit einem Fluorescein- markierten Anti-Komplementserum, insbesondere mit Anti-C1q, -C3c oder -C4c.
Am Beispiel des indirekten Immunfluoreszenztests hat sich gezeigt, dass bei der Komplement-Variante die Reaktionen viel stärker ausfallen als bei einer herkömmlichen Testdurchführung, bei der der Gewebeschnitt mit dem Patientense rum und anschließend mit Fluorescein-markiertem Anti-Human-IgG inkubiert wird. Auf bevorzugte Weise lässt sich mittels der erfindungsgemäßen Auswertung einer Komplementreaktion das Reaktionsmuster der Anti-Aquaporin-4-Antikörper auf den Substraten Hippocampus, Sehrnerv (nervus opticus) sowie Kleinhirn sehr gut darstellen, ohne dass hierfür das Gewebe und/oder das Patientenserumvorbehandelt werden muss. Aus diesem Grund kann die Durchführung eines derartigen Testverfahrens wesentlich effektiver, insbesondere mit einfacheren Mitteln, als die bekannten Tests durchgeführt werden.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil bei der erfindungsgemäßen Durchführung einer Untersuchung auf das Vorhandensein von NMO-spezifischen Autoantikörpern in einer Patientenprobe, insbesondere auf das Vorhandensein von Aquaporin-4- Autoantikörpern, besteht darin, dass durch den Nachweis einer Komplementaktivierung basierend auf der Bindung von Autoantikörpern an das Zielantigen eine sichere Differenzierung gegenüber anderen Autoantikörpern möglich ist. Insbesondere wird zuverlässig sicher gestellt, dass ein Patientenserum zwar über Autoantikörper gegen Aquaporin-4 verfügt, aber keine anderen neurologisch relevanten Autoantikörper, wie etwa Anti-NMDA-Rezeptoren, Anti-AMPA-Rezeptoren, Anti-Glutamatdecarboxylase, Anti-CV-2, Anti-LGI-1 , Anti-CASPR-2, aufweist. Dies ist darauf zurückzuführen, dass Anti-NMDA-Rezeptoren, Anti-AMPA-Rezeptoren, Anti-Glutamatdecarboxylase, Anti- CV-2, Anti-LGI-1 , Anti-CASPR-2 bei einem konventionellen Test ein ähnliches Fluoreszenzbild auf den Gewebeschnitten erzeugen wie Autoantikörper gegen Aquaporin-4, während sich die entsprechenden Fluoreszenzbilder nach einer Inkubation des Gewebeschnitts mit einem Gemisch mehrerer Normalseren und einem Fluorescein- markierten Anti-Komplementserum deutlich unterscheiden. Auch gegenüber anderen Autoantikörper, wie beispielsweise Anti-Myelin-Antikörper, Anti-Neuroendothel- Antikörper, Anti-Hu-Antikörperoder Anti-Yo-Antikörper, die bei einer konventionellen Testdurchführung ein ähnliches Fluoreszenzbild auf den Gewebeschnitten erzeugten wie Anti-Aquaporin-4, waren die Anti-Aquaporin-4-Antikörper über die Darstellung durch das Komplement auf Anhieb identifizierbar.
Weiterhin zeichnet sich die Inkubation des Gewebeschnitts mit einem Gemisch mehrerer Normalseren und einem Fluorescein-markierten Anti-Komplementserum mit dem Ziel des Nachweises einer Komplementaktivierung dadurch aus, dass nicht nur ein Teil der Anti-Aquaporin-4-Antikörper erfasst wird, wie man es aufgrund des oben aufgeführten Beispiels der Morbus-Crohn-assoziierten Antikörper gegen Pankreasantigene erwarten würde. Vielmehr scheinen nahezu alle Anti-Aquaporin-4- Autoantikörper Komplement zu binden, sodass die Komplement-Variante dem Immunfluoreszenztest auf der Basis Aquaporin-4 exprimierender Zellen hinsichtlich der Sensitivität zumindest teilweise überlegen erscheint. So haben Versuche gezeigt, dass die Prävalenzen bei NMO bei Einsatz von Immunfluoreszenztests mit Gewebeschnitten, die AQP4-transfizierte Zellen aufweisen, oder ELISA bzw. RIA zwischen 75 und 60% liegen, während bei Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens Prävalenzen von nahezu 100% erzielbar sind. Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Diagnose der Neuromyelitis optica besteht darin, dass im Gegensatz zu bekannten Aquaporin-4 ELISA und RIA sowie zur üblichen indirekten Immunfluoreszenz mit transfizierten Zellen als Substrat keine rekombinanten Antigene erforderlich sind, sondern ein Test mit Hilfe nativer neurologischer Gewebeschnitte durchführbar ist. Somit kann die Neuromyelitis optica mit verhältnismäßig einfachen Mitteln und insbesondere auch in Laboratorien serologisch diagnostiziert werden, die nicht über rekombinante Zellen bzw. entsprechende Testsysteme verfügen. Hinzu kommt, dass unter Verwendung der Komplement- Inkubation im Gegensatz zu dem konventionellen Verfahren keine vorherige Präadsorption der Seren notwendig ist. Die Präadsorption dient der Eliminierung nichtor- ganspezificher Antikörper, ist allerdings mit einer Verringerung der Sensitivität verbunden. Nichtorganspezifische Antikörper wie solche gegen antinukleäre Antigene (ANA) liegen häufig in Proben von NMO-Patienten vor und rufen auf den neuronalen Gewebepräparaten eine interferierende, nicht-spezifische Immunfluoreszenz hervor. Bei der Komplement-Inkubation hingegen ist das Immunfluoreszenzmuster auch ohne Präadsorption spezifisch.
In einer besonderen Weiterbildung wird das erfindungsgemäße Untersuchungsverfahren genutzt, um eine höhere Sensitivität bei der Diagnose von NMO- Erkrankungen zu erreichen. Aus diesem Grund wird in einer speziellen Ausführungsform der Erfindung wenigstens eine Patientenprobe, die die Eigenschaft aufweist, nach Benetzung eines nativen Gewebes mit der Patienten probe und anschließender Inkubation mit Fluorescein-markiertem Anti-Human-igG im Rahmen einer indirekten Immunfluoreszenzuntersuchung kein für eine Bindung von Aquaporin-4- Autoantikörpern an das Gewebe typisches Fluoreszenzmuster zu zeigen. Diese Patientenprobe wird zunächst auf ein Aquaporin-4-haltiges natives Substrat aufgebracht, die im Serum vorhandenen Autoantikörper mit Komponenten des Komplementsystems zur Reaktion gebracht und die Reaktion des Komplementsystems im Wege einer Indikator-Reaktion nachgewiesen. Die Komplementreaktion wird bevorzugt mit C3c-Komplement hervorgerufen.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung werden in einem dreistufigen Untersuchungsverfahren Gefrierschnitte von Geweben des zentralen Nervensystems eingesetzt. Besonders geeignet sind hierbei Gewebeschnitte des Kleinhirns, Hippo- campus und/oder des Sehnervs. Vorzugsweise werden die Gefrierschnitte auf Objektträger aufgezogen, 30 Minuten lang mit verdünntem Patientenserum (1:10 in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, PBS) inkubiert, dann 10 Minuten lang mit un- verdünntem gepooltem Serum gesunder Kontrollpersonen (standardisierte Komplementquelle), und in einem dritten Schritt 30 Minuten lang separat voneinander mit Fluorescein-markierten Antiseren gegen C1q, C3c und C4c vom Kaninchen (Verdünnung 1 :5 in PBS) inkubiert. Nach jedem Schritt werden die Proben dreimal in PBS gewaschen. Zum Schluss wird ein Tropfen gepuffertes Glycerin aufgetragen und ein Deckglas aufgelegt. Die Reaktionen werden mit einem geeigneten Labor-üblichen Fluoreszenzmikroskop beurteilt (Anregungswellenlänge um 488 Nanometer, Emissionswellenlänge über 520 Nanometer, Vergrößerung 200- oder 400-fach).
Um die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens belegen zu können, wurden 83 Serumproben von 14 Patienten mit klinisch eindeutig diagnostizierter Neuromyelitis optica mit der konventionellen (zweistufigen) Immunfluoreszenztechnik und mit dem erfindungsgemäßen (dreistufigen) Verfahren untersucht. Parallel wurden die Seren von 20 Patienten mit anderen neurologischen Erkrankungen sowie von 20 gesunden Blutspendern analysiert.
Als Antigen-Substrate wurden BIOCHIP-Mosaiken aus Gefrierschnitten und Zellen eingesetzt. Die Mosaiken beinhalteten Primatengewebe (Kleinhirn, Optikusnerv, Unterschenkelnerv, Dünndarm, Pankreas), Rattengewebe (Kleinhirn und Hippocam- pus). Als Vergleichssubstrate wurden BIOCHIPs mit HEK293-Zellen verwendet, die verschiedene andere neurologische rekombinante Autoantigene exprimierten, zum Beispiel Glutamat-Rezeptoren oder Kaliumkanal-assoziierte Proteine. Mit der zweistufigen (herkömmlichen) Technik zeigten alle Seren der Patienten mit NMO mehr oder weniger schwache Reaktionen mit Kleinhirn, Hippocampus und Optikusnerv, während die Kontrollseren negativ reagierten. Lediglich 10% der Kontrollseren zeigten eine schwache, NMO-spezifische Reaktivität.
Wurden die Analysen mit dem dreistufigen, auf einer Komplementaktivierung basierenden Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt, präsentierten für Komplement C4c 81 von 83 Serumproben von sämtlichen Patienten und für Komplement C3c 80 von 83 Seren von 13 der 14 Patienten eine NMO-typische Reaktion.
Horizontalschnitte des Optikusnervs fluoreszierten in einem einzigartigen netzförmigen Muster, während das Kleinhirn und der Gyrus dentatus des Hippocampus eine unverkennbare homogene cytoplasmatische Färbung vorwiegend der Körnerschicht boten. Die stärksten Reaktionen wurden für Komplement C3c beobachtet. Die Fluoreszenzsignale waren bei Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung (dreistufig, mit Komplementfärbung) viel deutlicher und die Muster wesentlich prägnanter als mit dem konventionellen Verfahren. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse im Detail dargestellt:
In Bezug auf die durchgeführten Untersuchungen zeigen die Figuren 1 bis 3 die Fluoreszenzbilder die von den verschiedenen Geweben nach erfolgter Inkubation aufgenommen worden sind.
In Figur 1 sind Fluoreszenzbilder vom Hippocampus einer Ratte, Primatenkleinhirn, Primatensehnerv sowie eines Gewebeschnitts mit transfizierten AQP-4-Zellen einander gegenübergestellt. Die Inkubation der Gewebeschnitte wurde jeweils mit Anti- Human-Immunglobulin-Antikörpern, C1q-Komplement, C3c-Komplement bzw. C4c- Komplement durchgeführt. Die Horizontalschnitte des Primatensehnervs fluoreszierten in einem besonders auffälligen netzförmigen Muster, während das Kleinhirn und ein Teil der Gehirnstruktur des Hippocampus, nämlich der Gyrus dentatus, eine unverkennbare homogene cytoplasmatische Färbung vorwiegend der Körnerschicht boten. Die stärksten Reaktionen wurden für das Komplement C3c beobachtet.
In Figur 2 sind jeweils die Fluoreszenzbilder von Gewebeschnitten mit AQP4- transfizierten Zellen (AQP4-RC - oberste Reihe), Primatencerebellum (Primate CB - mittlere Reihe) und Primatensehnerv (Primate NO - unterste Reihe) dargestellt, die nach Inkubation mit Patientenserum sowie mit Anti-Human-Immunglobulin- Antikörpern bzw. C3c-Komplement mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops sichtbar gemacht worden sind. Bei den für die Inkubation der unterschiedlichen Gewebeschnitte verwendeten Patientenseren handelt es sich um ein Kontrollserum (E), das Serum eines S-Patienten (D), Seren von Patienten mit NMO-Syndrom (C, B) bzw. eines NMO-Patienten (A). Deutlich zu erkennen ist, dass die Fluoreszenzbilder der jeweils mit Seren von Patienten mit NMO-Syndrom (C, B) bzw. des NMO-Patienten (A) sowie dem C3c-Komplement inkubierten Gewebeschnitte des Primatencerebellum und des Primatensehnervs eins besonders intensive Struktur zeigen.
Weiterhin ist von Bedeutung, dass unter Verwendung der Komplement-Inkubation im Gegensatz zu dem konventionellen Verfahren keine vorherige Präadsorption der Seren notwendig ist. Die Präadsorption dient der Eliminierung nichtorganspezificher Antikörper, ist allerdings mit einer Verringerung der Sensitivität verbunden. Nichtor- ganspezifische Antikörper, wie solche gegen antinukleäre Antigene (ANA), liegen häufig in Proben von NMO-Patienten vor und rufen auf den neuronalen Gewebepräparaten eine interferierende, nicht-spezifische Immunfluoreszenz hervor. Diese ist etwa in Figur 2 B, rechte Spalte, also nach Inkubation mit dem Serum eines Patienten mit NMO-Syndrom und mit Anti-Human-Immunglobulin-Antikörpern, zu erkennen. Bei der Komplement-Inkubation hingegen ist das Immunfluoreszenzmuster auch ohne Präadsorption spezifisch, wie es Figur 2 B, linke Spalte, also nach Inkubation mit dem Serum eines Patienten mit NMO-Syndrom und mit C3c-Komplement, zu entnehmen ist.
Abschließend sind in Figur 3 Fluoreszenzbilder von Gewebeschnitten gezeigt, die mit Anti-Human-Immunglobulin-Antikörpern (obere-Reihe) bzw. mit C3c-Komplement (untere Reihe) inkubiert und anschließend mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops sichtbar gemacht worden sind. Für die Inkubation der Gewebeschnitte wurden unterschiedliche Patientenseren verwendet. So wurde das Serum eines NMO-Patienten (A), Serum eines Patienten mit klinisch isoliertem Syndrom (B) sowie Seren von Patienten mit paraneoplatischem neurologischen Syndrom (C - E) verwendet. Die inkubierten Gewebeschnitte verfügten über jeweils unterschiedliche Antigene. Für die Bilder in Figur 3 A wurde ein Gewebe, an dem AQP4- und Anti-myelin-Autoantikörper binden, verwendet. Für Figur 3 B ein Gewebe, an dem Anti-myelin-Autoantikörper, für Figur 3 C ein Gewebe an dem Anti-CV2-Autoantikörper, für Figur 3 D ein Gewebe an dem Anti-Hu-Autoantikörper und für Figur 3 E ein Gewebe, an dem Anti-Yo- Autoantikörper binden, verwendet. Wiederum deutlich zu erkennen ist, dass das AQP4- und Anti-Myelin-Autoantikörper aufweisende Gewebe das Fluoreszenzbild mit der hellsten und intesivsten Struktur zeigt. Hierbei bietet insbesondere die Inkubation mit C3c-Komplement die Möglichkeit eine eindeutige Diagnose in Bezug auf das Vorhandensein von AQP4-Autoantikörpern im Patientenserum zu stellen. Es wird somit gezeigt, dass Anti-Aquaporin-4-Antikörper mittels Komplement-Inkubation gegenüber anderen zumindest teilweise für die Neurologie diagnostisch relevanten Autoantikör- pern, wie etwa Anti-Myelin, -Hu, -CV2, -Yo deutlich abgrenzt werden können.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung erfolgt eine Untersuchung mittels eines Enzym- oder Lumineszenz-Immuntest. Aus nativem Hippocampus- Gewebe isoliertes Aquaporin-4 wird an die Oberfläche von Magnetbeads gekoppelt. Diese werden mit verdünntem Patientenserum, dann mit unverdünntem gepooltem Serum zehn gesunder Kontrollpersonen (standardisierte Komplementquelle) inku- biert, danach mit Enzym-markierten Antiseren gegen C1q, C3c oder C4c vom Kaninchen inkubiert. Im Anschluss erfolgen wiederum eine Färbereaktion und die photometrische Auswertung. Alternativ können auch Innenwände von Reagenzgefäßen mit Antigen beschichtet und als Grundlage üblicher ELISA oder Lumineszenztests eingesetzt werden, immer mit dem zwischengeschalteten Komplementschritt und der Komplement-spezifischen Anfärbung.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Untersuchung einer menschlichen Patientenprobe auf das Vorhandensein von Neuromyelitis-optica-spezifischen Antikörpern, bei dem ein Ausgangssubstrat mit menschlichem Probenmaterial inkubiert wird und das inkubierte Ausgangssubstrat mittels indirekter Immunfluoreszenz daraufhin untersucht wird, ob Neuromyelitis-optica-spezifische Antikörper wenigstens teilweise an das Ausgangssubstrat gebunden haben,
dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangssubstrat ein Aquaporin- -haitiges nati- ves Substrat verwendet wird sowie dass die wenigstens teilweise an das Ausgangssubstrat gebundenen Neuromyelitis-optica-spezifischen Antikörper mit Komponenten des Komplementsystems zur Reaktion gebracht werden und die Reaktion des Komplementsystems im Wege einer Indikator-Reaktion nachgewiesen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet, dass die Patientenprobe die Eigenschaft aufweist, nach Benetzung eines nattven Gewebes mit der Patienten probe und anschließender Inkubation mit Fluorescein-markiertem Anti-Human-IgG im Rahmen einer indirekten Immunfluoreszenzuntersuchung kein für eine Bindung von Aquaporin-4- Autoantikörpern an das Gewebe typisches Fluoreszenzmuster zu zeigen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Differenzierung einer AQP4-Autoantikörper enthaltenden Patientenprobe gegenüber anderen, für die Neurologie diagnostisch relevanten Autoantikörpern durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Differenzierung in Bezug auf Anti-Myelin-, Anti- Hu- und/oder Anti-CV-2-Autoantikörpern vorgenommen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Differenzierung in Bezug auf Anti-NMDA- Rezeptor-, Anti-AM PA-Rezeptor-, Anti-Glutamatdecarboxylase-, Anti-LGI-1-, Anti- CASPR-2-Autoantikörper erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als natives Substrat ein zumindest teilweise auf einen Objektträger aufgezogener Gewebeschnitt verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, dass als natives Substrat wenigstens teilweise Gewebe des zentralen Nervensystems verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, dass das native Substrat wenigstens teilweise dem Hippo- campus, Kleinhirn und/oder Sehnerv entnommen ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, dass die gebundenen Neuromyelitis-optica-spezifischen Antikörper unmittelbar oder mittelbar mit Enzym-markierten Antiseren gegen C1q, C3c oder C4c inkubiert werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet, dass Enzym-markierte Antiseren vom Kaninchen verwendet werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, dass nachdem das Ausgangssubstrat mit menschlichem Probenmaterial inkubiert worden ist, eine weitere Inkubation mit unverdünntem Serum wenigstens einer gesunden Kontrollperson vorgenommen wird.
12. Diagnosekit zur Untersuchung einer menschlichen Patientenprobe auf das Vorhandensein von Neuromyelitis-optica-spezifischen Antikörpern, der wenigstens ein Aquaporin-4-haltiges Ausgangssubstrat aufweist,
dadurch gekennzeichnet, dass das Aquaporin-4-haltige Ausgangssubstrat ein Objektträger ist, auf den ein natives biologisches Material aufgebracht ist.
13. Diagnosekit nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet, dass das native biologische Material ein dem Hippocam- pus, Kleinhirn und/oder Sehnerv entnommener Gewebeschnitt ist.
14. Diagnosekit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , der einen Untersuchungsträger aufweist, auf dem wenigstens ein Aquaporin- 4-haltiges Ausgangssubstrat aus nativem biologischen Material sowie wenigstens ein weiteres Substrat angeordnet ist, wobei sowohl das Ausgangssubstrat als auch das weitere Substrat mit einer menschlichen Patientenprobe inkubierbar ist
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