DE60035996T2

DE60035996T2 - Diätetisches kalzium als ergänzung zu vitamin d verbindungen bei der behandlung von multipler sklerose

Info

Publication number: DE60035996T2
Application number: DE60035996T
Authority: DE
Inventors: Hector F. Deerfield DELUCA; Margherite T. State College CANTORNA; Jean Poynette HUMPAL-WINTER
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1999-07-08
Filing date: 2000-06-23
Publication date: 2008-05-15
Anticipated expiration: 2020-06-24
Also published as: EP1196174A1; JP2003504337A; US20030022873A1; WO2001003704A1; EP1196174B1; DK1196174T3; AU5634500A; ATE369864T1; DE60035996D1; US20030207847A1; US20020016313A1; US6479474B2

Description

Vitamin D ist ein neuerer Zuwachs in der Liste von Mitteln, die bekanntermaßen das Immunsystem regulieren. Vitamin D wird in einem zweistufigen Verfahren in das Hormon 1,25-Dihydroxycholecalciferol (1,25-(OH)₂D₃)¹ umgewandelt, welches ein Hauptfaktor bei der Regulation des Serumcalciums, des Phosphors und der Knochen ist (DeLuca, 1997). Dieses Hormon wirkt durch einen Steroidhormon-ähnlichen Mechanismus durch einen nuklearen Rezeptor, dem Vitamin D-Rezeptor (VDR), welcher ein Mitglied der Steroidhormonrezeptor-Superfamilie ist (Pike, 1991; Ross et al., 1993). Die Entdeckung des VDR in peripheren Blutlymphozyten (Bhalla et al., 1983; Provvedini et al., 1983) ist ein Faktor, welcher zu der Erkenntnis führte, dass 1,25-(OH)₂D₃ ein wesentlicher Regulator des Immunsystems ist. Der erstaunlichste Beweis für eine Rolle von 1,25-(OH)₂D₃ als Regulator des Immunsystems kommt von in vivo-Experimenten. 1,25-(OH)₂D₃ kann der Entwicklung von EAE (Cantoma et al., 1996 und US-Patent 5,716,946 ; Lemire und Archer, 1991), experimenteller Arthritis (Cantoma et al., 1998a) vorbeugen und 1,25-(OH)₂D₃ kann eine Transplantatabstoßung deutlich hemmen (Bouillon et al., 1995; Hullett et al., 1998).
EAE wird durch CD4⁺ T-Zellen vermittelt, die einen unangemessenen immunvermittelten Angriff auf das zentrale Nervensystem (ZNS) starten. Helferzellen vom Typ 1 (Th1), welche für ZNS-Antigene spezifisch sind, induzieren die Erkrankung, und bei Mäusen werden die Th1-Zytokine Interferon (IFN)-γ und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-α mit EAE in Verbindung gebracht (Holda und Swanborg, 1982; Powell et al., 1990). Umgekehrt ist bekannt, dass Helferzellen vom Typ-2 (Th2) und andere Zelltypen, welche als Reaktion auf ZNS-Antigene Interleukin (IL)-4 und den transformierenden Wachstumsfaktor (TGF)-β1 produzieren, EAE lindern. In vivo ergeben Behandlungen mit 1,25-(OH)₂D₃ einen Nettoverlust in der Gesamtzahl der Lymphozyten und einen Nettoanstieg bei der Expression von IL-4 und TGF-β1 (Cantorna et al., 1998b). Umgekehrt hatten die in vivo 1,25-Behandlungen keine Wirkung auf die Expression von IFN-γ- oder TNF-α (Cantorna et al., 1998b). Die Rolle von Calcium bei der Regulation der Immunreaktion, falls vorhanden, bleibt unklar.
Von Goldberg P. et al. (Multiple sclerosis: decreased relapse rate through dietary supplementation with calcium, magnesium and vitamin D. Medical Hypotheses, (21. Oktober 1986), 21 (2) 193-200) wird eine Studie mit Patienten mit Multipler Sklerose durchgeführt. Die Patienten werden mit einer diätetischen Ergänzung von Dolomit und Lebertran behandelt. Dolomit ist eine mineralische Ergänzung mit der Formel CaMg(CO₃)₂ und Lebertran enthält beträchtliche Mengen von Vitamin D, Vitamin A und einer Anzahl an essenziellen Fettsäuren.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von Calcium und einer Vitamin D-Verbindung mit der unten dargestellten Formel bereit, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zum Verringern oder Verhindern der Häufigkeit von Symptomen der Multiplen Sklerose, wobei die Menge an Calcium von 0,5 bis 2 g pro Patient pro Tag beträgt, die Menge an Calcium jedoch bevorzugt von 1 bis 2 g Calcium beträgt, als ein Salz mit einer Vielzahl von Anionen, z.B. CO₃ ⁼, PO₄ ⁼, Cl₂ ^–, Acetat, Gluconat oder Citrat.
In einer Ausführungsform ist die Vitamin D-Verbindung 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ (1,25-(OH)₂D₃), 19-nor-1,25-Dihydroxyvitamin D₃ (19-nor-1,25-(OH)₂D₃), 24-homo-22-dehydro-22E-1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ (24-homo-22-dehydro-22E-1,25-(OH)₂D₃), 1,25-dihydroxy-24(E)-dehydro-24-homo-Vitamin D₃ (1,25-(OH)₂)-24-homo D₃) oder 19-nor-1,25-dihydroxy-21-epi-Vitamin D₃ (19- nor-1,25-(OH)₂-21-epi-D₃). In einer am meisten bevorzugten Form der Erfindung ist die verwendete Verbindung 1,25(OH)₂D₃.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Symptome der Multiplen Sklerose bei einem Patienten mit Multipler Sklerose effektiver zu verringern.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Menge einer Vitamin D-Verbindung zu verringern, die zur Linderung von MS-Symptomen benötigt wird.
Andere Merkmale, Vorteile und Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden für einen Fachmann nach der Durchsicht der Beschreibung, der Ansprüche und der Zeichnungen ersichtlich werden.
Kurze Beschreibung der verschiedenen Ansichten der Zeichnungen
1 ist eine graphische Darstellung der Häufigkeit und der Heftigkeit von EAE bei männlichen und weiblichen B10.PL-Mäusen.
2 ist eine graphische Darstellung der 1,25-(OH)₂-D₃-Dosisreaktion von männlichen und weiblichen Mäusen, welche mit Nahrung mit 1 g Calcium/100 g Nahrung gefüttert wurden.
3 ist eine graphische Darstellung der 1,25-(OH)₂D₃-Dosisreaktion von Männchen und Weibchen, welche mit Nahrung mit 470 mg Calcium/100 g Nahrung gefüttert wurden.
4 ist eine graphische Darstellung der 1,25-(OH)₂D₃-Dosisreaktion von Männchen und Weibchen, welche mit Nahrung mit 20 mg Calcium/100 g Nahrung gefüttert wurden.
5 ist eine graphische Darstellung der Wirkung von 1,25-(OH)₂D₃ und Calcium auf die gesamten Zellen, welche drei Wochen nach der EAE-Beginn aus den entwässernden LN von Mäusen gewonnen werden konnten.
6 ist eine graphische Darstellung der Wirkung von 1,25-(OH)₂D₃ und Calcium auf die IL-4- und TGF-β1-Transkripte in den LN.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die aktive Form von Vitamin D (1,25-Dihydroxycholecalciferol) ist ein wirksamer Regulator des Immunsystems. Wir haben herausgefunden, dass eine Behandlung von B10.PL-Mäusen mit 1,25-Dihydroxycholecalciferol und Füttern der Mäuse mit Nahrung mit einem hohen Calciumgehalt die Induktion von experimentellen Autoimmunerkrankungen, wie etwa der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) vollständig unterdrücken kann. Da B10.PL-Mäuse ein anerkanntes experimentelles Modell für Multiple Sklerose sind, glauben wird, dass diese Ergebnisse zeigen, dass man Multiple Sklerose-Patienten effektiver behandeln könnte durch eine Behandlung der Patienten mit einer Vitamin D-Verbindung zusammen mit einer Ergänzung durch Calcium. Wir glauben, dass Multiple Sklerose durch diese Kombination effektiver behandelt werden könnte als durch eine Behandlung alleine mit Vitamin D-Verbindungen, wie etwa die im US-Patent 5,716,946 von DeLuca et al. beschriebene Behandlung.
Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung in einer Ausführungsform die Verwendung von Calcium und einer Vitamin D-Verbindung mit der unten dargestellten Formel in der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung zum Verringern oder Verhindern der Häufigkeit von Symptomen der Multiplen Sklerose, wobei die Menge an Calcium von 0,5 bis 2 g pro Patient pro Tag beträgt.
Einem Patienten mit Multipler Sklerose wird eine Calciumergänzung und eine ausreichende Menge des Vitamin D-Analogons so verabreicht, dass die Symptome der Multiplen Sklerose abklingen.
In einer besonders vorteilhaften Form der Reaktion ist die verabreichte Verbindung entweder 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ (1,25-(OH)₂D₃), 19-nor-25-Dihydroxyvitamin D₃ (19-nor-1,25(OH)₂D₃), 24-homo-22-dihydro-22E-1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ (24-homo-22-dehydro-22E-1,25-(OH)₂D₃), 1,25-dihydroxy-24(E)-dehydro-24-homo-Vitamin D₃ (1,25-(OH)₂-24-homo D₃), 19-nor-1,25-dihydroxy-21-epi-Vitamin D₃ (19-nor-1,25-(OH)₂-21-epi-D₃), 1α-hydroxy-Vitamin D₃ oder 1α-hydroxy-Vitamin D₂.
Die Vitamin D-Verbindung weist die Formel
auf, worin X¹ und X² jeweils unabhängig ausgewählt werden aus Wasserstoff und Acyl,
worin Y¹ und Y² H sein können oder eines davon O-Aryl, O-Alkyl, Aryl, C_1-4-Alkyl sein kann, welche zusammen ein Alken mit der Struktur
bilden können, worin B₁ und B₂ jeweils unabhängig ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus H, C_1-4-Alkyl und Aryl, und eine β- oder α-Konfiguration aufweisen können; Z¹=Z²=H oder Z¹ und Z² zusammen =CH₂ sind;
und worin R eine Alkyl-, Hydroxyalkyl- oder Fluoralkylgruppe ist, oder R die folgende Seitenkette darstellen kann:
worin (a) eine S- oder R-Konfiguration aufweisen kann, R¹ Wasserstoff, Hydroxy oder O-Acyl darstellt, R² und R³ jeweils unabhängig ausgewählt werden aus Alkyl, Hydroxyalkyl und Fluoralkyl, oder zusammen die Gruppe-(CH₂)_m- darstellen, worin m eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist, R⁴ Wasserstoff, Hydroxy, Fluor, O-Acyl, Alkyl, Hydroxyalkyl oder Fluoralkyl ist, wobei R⁴ Wasserstoff oder Alkyl ist, wenn R⁵ Hydroxyl oder Fluor ist, R⁵ Wasserstoff, Hydroxy, Fluor, Alkyl, Hydroxyalkyl oder Fluoralkyl ist, oder R⁴ und R⁵ zusammen einen doppelgebundenen Sauerstoff darstellen, R⁶ und R⁷ zusammen eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden, R⁸ H oder CH₃ ist, und worin n eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist, und worin der Kohlenstoff an einer beliebigen der Positionen 20, 22 oder 23 in der Seitenkette durch ein O-, S- oder N-Atom ersetzt werden kann.
Das U.S.-Patent 5,716,946 (DeLuca et al., erteilt am 10. Februar 1998) beschreibt die Behandlung von Multipler Sklerose mit Vitamin D-Verbindungen. Man würde bevorzugt unter Verwendung der Beschreibung der in diesem Patent offenbarten Vitamin D-Behandlung einen Behandlungsplan entwerfen. Bei der vorliegenden Erfindung wird man diese Behandlung ergänzen durch Verabreichung einer Calciumverbindung, bevorzugt ausgewählt aus Calciumcarbonat, Calciumacetat, Calciumgluconat, Calciumhydrogenphosphat, Calciumphosphat und Calciumcitrat. Bevorzugt werden Calciumcarbonat, Calciumacetat und Calciumcitrat.
Bevorzugt wird man die Behandlung mit einer Vitamin D-Verbindung mit zwischen 0,5 und 2 g Calcium pro tag pro humanem Patienten ergänzen (normalerweise ein Patient mit 72,6 kg (160 Pfund)). Am meisten bevorzugt wird eine Verabreichung gleichzeitig mit der Verabreichung einer Vitamin D-Verbindung erfolgen, obwohl eine gleichzeitige Verabreichung nicht erforderlich ist.
Beispiele
In den unten beschriebenen Experimenten werden Mäuse verwendet, bei welchen die Entwicklung von EAE hervorgerufen wird, und welche mit Nahrung mit verschiedenen Mengen an Calcium und 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ gefüttert werden. Die gemessenen Parameter umfassen die EAE-Entwicklung und Heftigkeit, das Serumcalicum, das Gewicht, die Gesamtzellzahlen im Lymphknoten, die Expression von Interleukin-4 und vom transformierenden Wachstumsfaktor-β1.
Die Werte von den verschiedenen mit Calcium behandelten und mit 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ behandelten Mäusen wurden verglichen. Als Calcium aus der Nahrung entfernt wurde, war die Häufigkeit der EAE um sowohl bei den Männchen als auch den Weibchen 20% verringert. Je niedriger die Nahrungsmenge an Calcium war, umso höher war die erforderliche Dosis an 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ zur Vorbeugung der Symptome. Somit ist 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ am wirksamsten bei den Mäusen, welche mit einer Nahrung gefüttert werden, welche eine ausreichende oder hohe Calciummenge enthält.
Die Behandlung von Mäusen, welche mit einer Nahrung mit viel Calcium gefüttert wurden, mit 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ bewirkte abnehmende Gesamtzahlen an Lymphozyten in den Lymphknoten und eine erhöhte mRNA-Expression von Interleukin (IL)-4 und transformierendem Wachstumsfaktor (TGF)-β1. Wenn Calcium aus der Nahrung weggelassen wurde, steigerten die Behandlungen mit 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ die TGF-β1 mRNA. Erhöhte IL-4 mRNA und verringerte Lymphozyten in den Lymphknoten traten nur bei Mäusen auf, welche mit Calcium und 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ gefüttert wurden.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl Nahrungscalcium als auch 1,25-Dihydroxyvitamin D₃ an der Entwicklung und Prophylaxe der symptomatischen EAE beteiligt sind.
Die humane Multiple Sklerose kommt bei Frauen besonders häufig vor (Grossman et al., 1991), während sich die Häufigkeit und Heftigkeit der EAE bei Mäusen bei Männchen versus Weibchen in Abhängigkeit vom Stamm unterscheiden (Cantorna et al., 1996; Cua et al., 1995). Somit ist allgemein bekannt, dass das Geschlecht bei dieser Erkrankung einen Hauptfaktor darstellt. Die vorliegende Untersuchung wurde auch konzipiert, um zu bestimmen, ob 1,25-(OH)₂D₃ in beiden Geschlechtern gleich wirksam ist und ob die Nahrungscalciumspiegel bei der Entwicklung der Erkrankung und der Reaktion auf 1,25-(OH)₂D₃ irgendeine Rolle spielen.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl 1,25-(OH)₂D₃ als auch Calcium die Immunreaktion regulieren und dass 1,25-(OH)₂D₃ gegen EAE bei Patienten, insbesondere weiblichen Patienten, welchen ausreichende oder hohe Mengen an Nahrungscalcium zu essen gegeben wurden, wirksamer ist.
Material und Methoden
Tiere und Nahrung. Die B10.PL-Mäuse wurden in unserer eigenen Kolonie unter Verwendung von Zuchtpaaren erzeugt, welchen von Jackson Laborstories (Bar Harbor, ME) erhalten wurden. Während der Zucht wurden die Mäuse mit einer Purina-Nahrung 5008 Formilab (Richmond, IN) gefüttert, welche 100 IU/g Cholecalciferol (Vitamin D₃) enthielt. Die Mäuse wurden im Alter von 6-8 Wochen für die Experimente verwendet, zu diesem Zeitpunkt wogen die Weibchen 18-22 g und die Männchen 22-26 g. Für die Experimente wurden alle Mäuse mit künstlicher Nahrung gefüttert (Yang et al., 1993; Smith et al., 1987), mit den unten beschriebenen Abänderungen. Bei allne Experimenten wurde jede Maus mit 4 g der experimentellen Nahrung (vollständig gegessen) gefüttert und die Nahrung wurde für die Dauer jedes Experiments alle 2-3 Tage ersetzt. Die Mäuse wurden mit 4 g Nahrung täglich gefüttert, um sicherzustellen, das jede Maus ihre tägliche Dosis an 1,25-(OH)₂D₃ erhält, und dass die Kontrollen nicht mehr essen als die mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Mäuse. Obwohl die experimentelle Nahrung ohne Vitamin D war, wurden die Mäuse normalem Licht ausgesetzt und waren deshalb nicht Vitamin D-defizient. EAE wurde in allen Mäusen eine Woche nach dem Beginn der experimentellen Nahrungen hervorgerufen. Bei Mäusen mit schweren EAE-Symptomen wurde die Nahrung in kleinen Schalen auf dem Boden des Käfigs gestellt. Am Ende der Experimente wurden die Mäuse gewogen, getötet und ausgeblutet.
Im ersten experimentellen Konzept wurden männliche und weibliche Mäuse mit Nahrung gefüttert, welche 1 g Calcium pro 100 g Nahrung enthielten, und es wurde EAE wurde hervorgerufen. In einer zweiten Reihe von Experimenten wurden Gruppen von 8-12 Mäusen mit experimenteller Nahrung (Kontrollbehandlung) ohne Vitamin D gefüttert, oder mit experimenteller Nahrung mit verschiedenen Konzentrationen an 1,25-(OH)₂D₃, wie angegeben.
Den Weibchen wurde 1,25-(OH)₂D₃ im Bereich von 0 bis 200 ng/Tag gefüttert und den Männchen wurden 0 bis 800 ng/Tag gefüttert. Die experimentelle Nahrung enthielt eine von drei Calciumkonzentrationen: 20 mg (niedrig), 470 mg (mittel) oder 1 g (hoch) Calcium/100 g Nahrung, wie angegeben. In dem letzten experimentellen Konzept wurden nur Männchen verwendet, welche mit der Kontrollnahrung gefüttert wurden oder mit der gleichen Nahrung mit 100 ng 1,25-(OH)₂D₃/Tag. Diese Mäuse wurden mit Nahrung gefüttert, welche niedrige, mittlere oder hohe Calciummengen enthielten, wie angegeben. Dieses Fütterungsprotokoll ergab 6 Gruppen von jeweils 6-8 männlichen Mäusen. Diese Dosis von 1,25-(OH)₂D₃ wurde gewählt, da sie in männlichen Mäusen, welche mit einer Nahrung mit viel Calcium gefüttert wurden, EAE vollständig verhinderte. Alle die beschriebenen Verfahren wurden am 09.09.1994 durch das Research Animal Resources Center Committee Review Board der Universität von Wisconsin-Madison geprüft und zugelassen, und die Protokollnummer ist A-07-3000-A00755-4-08-94.
Auslösung der EAE-Erkrankung. Basisches Myelinprotein (MBP, "Myelin Basic Protein") wurde aus dem Rückenmark von Meerschweinchen isoliert (Cantorna et al., 1996). Das MBP wurde lyophilisiert und bei –20°C gelagert. Für die Immunisierungen wurde das MBP in 0,1 mol/l Essigsäure mit einer Konzentration von 8 g/l gelöst (Cantorna et al., 1996). Mit Äther anästhesierte Mäuse wurden subkutan mit 0,1 ml MBP (400 mg/Maus) immunisiert, welches in einem gleichen Volumen von komplettem Freund's Adjuvans (CFA, Difco Laborstories, Detroit, MI) mit Mycobacterium tuberculosis H37 Ra emulgiert wurde. Zusätzlich wurde den Mäusen am Tag der Immunisierung und zwei Tage später i.p. 200 ng Perussis-Toxin (LIST Biological Laborstories, Campbell, CA) injiziert, welches in steriler Saline suspendiert wurde. Dieses Immunisierungsprotokoll ergab bei 80-100% der Mäuse die Auslösung von EAE. Männliche Tiere wurden an Tag 21 nach der Immunisierung getötet, um verschiedene Immunreaktionen zu messen. Das EAE-Bewertungssystem war: 0 = normal, 1 = schlaffes hinteres Ende, 2 = Paraparese mit schwerfälligem Gang, 3 = Paralyse der hinteren Extremität, 4 = Paralyse der hinteren und vorderen Extremität, 5 = moribund).
Lymphozyten. Achsellymphknoten, Oberarmlymphknoten und Leistenlymphknoten (LN) von 6 Mäusen wurden an Tag 21 nach der Immunisierung gesammelt und von den Kontrollen und den mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Mäusen zusammengefasst. Jedes Experiment wurde insgesamt 3 mal wiederholt. Diese LN wurden ausgewählt, weil sie die Immunisierungsstelle filtrierten. Die gesammelten LN wurden unter Verwendung einer 23 g Nadel und einer Zange manuell zerstört. Die Gesamtzellzahlen in den LN wurden bestimmt durch Zählen der Lymphozytenzahlen von Kontrollmäusen und mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Mäusen, und Dividieren durch die Zahl der Mäuse in der Gruppe. Eine Durchflusszytometrie der Fluoreszenz-markierten Zellpopulationen (Thy-1, Klasse II, CD4 und CD8) wurde mit LN-Zellen von Kontrollmäusen und von mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Mäusen unter Verwendung von Standardprotokollen und genau wie beschrieben (Smith et al., 1987) durchgeführt. Für eine Zytokin-PCR-Analyse wurden LN-Zellen für eine Isolierung der gesamten zellulären RNA aufbewahrt.
Transkriptanalyse durch quantitative kompetitive PCR. Die Zellen für die mRNA-Analyse wurden in saurem Guanadiniumthiocyanat gelöst und die Gesamt-RNA wurde durch das Phenol-Chlorloform-Extraktionsverfahren (Chomczynski und Sacchi, 1987) isoliert. Die gesamte zelluläre RNA wurde unter Verwendung von Oligo-dT-Primern nach den Protokollen des Herstellers (Promega) revers transkribiert und durch kompetitive PCR quantifiziert. Die Primer und die mimische DNA, spezifisch für Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (G3PDH), IL-4 und TGF-β1 wurden von Clontech Laborstories, Inc. (Palo Alto, CA) (Siebert und Larrick, 1992; Siebert und Larrick, 1993) erhalten. Kompetitive cDNA-Imitationen, welche die G3PDH-, IL-4-und TGF-β1-Primersequenzen neben einem neutralen DNA-Segment enthielten, wurden seriell verdünnt und zu Test-cDNA-Aliquots zugegeben (Siebert und Larrick, 1992; Siebert und Larrick, 1993). Die bp-Größen von authentischem Produkt zur Imitation betrugen 983/600 für G3PDH, 306/544 für IL-4 und 525/390 für TGF-β1. Das Gemisch wurde unter vorher bestimmten optimalen Bedingungen amplifiziert und die Produkte wurden durch eine Elektrophorese mit einem 1,5%igen Agarosegel aufgelöst und mit Ethidiumbromid gefärbt. Die Zytokinbanden wurden durch die Größe im Hinblick auf Molekulargewichtstandards identifiziert. Die mimische DNA-Verdünnung, welche eine Bande mit einer Fluoreszenzintensität ergab, welche mit dem Zytokinband übereinstimmte, wurde verwendet, um die Kopienzahl der Zytokin-cDNA zu berechnen. Die Quantifizierung des G3PDH-Transkripts diente als eine Kontrolle für die Effizienz der Reversen Transkription. Die Werte werden als Kopien der Zytokin-cDNA pro 1000 Kopien G3PDH-cDNA dargestellt.
Serumcalcium und 1,25-(OH)₂D₃-Analyse. Nach 50 Tagen wurden die Mäuse getötet, das Blut wurde durch Herzpunktion gesammelt und das Serum wurde nach einer Gerinnungsbildung gesammelt. Die Serumcalciumkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Atomabsorptionsspektrometers von Perkin Elmer bestimmt, genau wie beschrieben (Mohamed et al., 1995). Eine 1,25-(OH)₂D₃-Analyse wurde genau wie beschrieben durchgeführt (Arbour et al., 1996).
Statistik. Wo möglich, waren die dargestellten Werte Durchschnitte von mehreren Mäusen oder Experimenten. Aufgrund der Variabilität der EAE-Auslösung, der Heftigkeit der Peaks und der Zytokingenexpression von einem Experiment zum anderen wurden manche Werte (6) als die Werte von einem repräsentativen von drei Experimenten dargestellt. Ein Zwei-Probentest für Binominverteilungen wurde für die statistische Analyse aller Prozentwerte verwendet, wie beschrieben (Rosner, 1986). Erneut wurden, falls möglich, statistische Analysen unter Verwendung eines statistischen Programms für Macintosh (STATVIEW STUDENT) durchgeführt. Der ungepaarte Zwei-Gruppen-Student-t-Test (bestätigt unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests) wurde durchgeführt und Werte von p < 0,05 wurden als signifikant betrachtet.
Ergebnisse
Das Geschlecht und die Entwicklung von EAE in B10.PL-Mäusen. Wenn viel Calcium in der Nahrung war, betrug die Häufigkeit der EAE bei Männchen 98% und bei Weibchen 96%. Männchen und Weibchen, welche bis Tag 50 nach der Immunisierung keine EAE entwickelten, wurden aus der Studie ausgeschlossen. Bei den Mäusen, die EAE entwickelten, wurde die maximale EAE-Heftigkeit gegen den Tag des EAE-Beginns Ausbruchs aufgetragen (1). 1 ist eine graphische Darstellung der Häufigkeit und Heftigkeit der EAE in männlichen und weiblichen B10.PL-Mäusen. Männchen entwickelten EAE früher und heftiger als weibliche B10.PL-Mäuse. 34% der weiblichen Mäuse entwickeln EAE nach 24 Tagen der Immunisierung, während 100% der Männchen zu diesem Zeitpunkt EAE entwickeln (p ≤ 0,0002). Jedes Symbol stellt eine einzelne Maus dar. Weibchen n = 31 und Männchen n = 20.
Die maximale EAE-Heftigkeit bei den Männchen reichte von 3 bis 5. Die maximale EAE-Heftigkeit bei den Weibchen reichte von 2 bis 5. Siebenundvierzig Prozent der Männchen erreichte EAE-Werte von 5, während nur 17% der Weibchen eine 5 erreichten (p = 0,03). Auch der Tag des EAE-Ausbruchs war bei Männchen früher (9-24 Tage) als bei Weibchen (9-38 Tage) (p 0,0002). Vierunddreißig Prozent der Weibchen entwickelte 24 Tage nach Immunisierung eine EAE. Männliche Mäuse waren gegenüber EAE empfänglicher als weibliche Mäuse.
Das Nahrungscalcium und die Häufigkeit von EAE. Die Heftigkeit der EAE-Erkrankung war durch Veränderungen des Nahrungscalciums nicht betroffen. Stattdessen variierte die EAE-Häufigkeit mit der Menge des Nahrungscalciums. Nahrungen mit viel Calcium ergaben EAE-Häufigkeitswerte, die sich 100% annäherten (2).
2 ist eine graphische Darstellung der 1,25-(OH)₂D₃-Dosisreaktion von männlichen und weiblichen Mäusen, welche mit Nahrung mit 1 g Calcium/100 g Nahrung gefüttert wurden. Die Häufigkeit der EAE bei Mäusen, welche mit Nahrung mit hohen Calciummengen gefüttert wurden, betrug für Männchen 100% und für Weibchen 99%. EAE wurde vollständig verhindert bei Weibchen mit 6 ng/Tag 1,25-(OH)₂D₃ oben und bei Männchen mit 100 ng/Tag 1,25-(OH)₂D₃ unten. Jeder Datenpunkt stellt mindestens 6 und bis zu 32 Mäuse dar. "*" kennzeichnet signifikant unterschiedliche Werte im Vergleich mit Mäusen, welchen kein 1,25-(OH)₂D₃ gefüttert wurde. p < 0,05. Männchen und Weibchen, welchen Nahrungen mit niedrigen Calciummengen gefüttert wurden, wiesen EAE-Häufigkeiten von um die 82-83% auf (2-4). Die EAE-Häufigkeit sowohl bei männlichen (p 0,07) als auch weiblichen (p 0,08) Mäusen, welche mit Nahrungen mit einer niedrigen Calciummenge gefüttert wurden, war geringer (obwohl nicht signifikant geringer) als bei Mäusen mit hohen Calciummengen. Es ist gut dokumentiert, dass Nahrung mit wenig Calcium die Produktion von 1,25-(OH)₂D₃ stimuliert (DeLuca, 1983). 1,25-(OH)₂D₃-Plasmawerte von Mäusen mit Nahrung mit hohen Calciummengen lagen im Bereich von 0,06 bis 1,8 μmol/l Serum und die Werte von Mäusen, welche mit niedrigen Calciummengen gefüttert wurden, lagen im Bereich von 0,10-0,36 μmol/l Serum. 3 ist eine graphische Darstellung der 1,25-(OH)₂D₃-Dosisreaktion von Männchen und Weibchen, welche mit Nahrung mit 470 mg Calcium/100 g Nahrung gefüttert wurden. Die Häufigkeit von EAE bei Mäusen, welche mit Nahrung mit mittleren Calciummengen gefüttert wurden, betrug bei Männchen 98% und bei Weibchen 96%. EAE wurde bei Weibchen mit 200 ng/Tag 1,25-(OH)₂D₃ oben und bei Männchen mit 400 ng/Tag 1,25-(OH)₂D₃ unten vollständig verhindert. Jeder Datenpunkt stellt mindestens 6 und bis zu 25 Mäuse dar. * Signifikant unterschiedlich im Vergleich mit Werten von Mäusen, welchen kein 1,25-(OH)₂D₃ gefüttert wurde. p < 0,05.
Ein mittlerer Nahrungscalciumspiegel ergab eine mittlere EAE-Häufigkeit von 95-99% (3).
Mäusen, die mit Nahrung mit einer niedrigen Calciummenge gefüttert wurden und die mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelt wurden, zeigten einen signifikanten (Männchen p < 0,007 und Weibchen p < 0,05) Rückgang der EAE-Häufigkeit von 40-45% im Vergleich zu Mäusen, welche nicht mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelt wurden (4). 4 ist eine graphische Darstellung der 1,25-(OH)₂D₃-Dosisreaktion von Männchen und Weibchen, welche mit Nahrung gefüttert wurden, die 20 mg Calcium/100 g Nahrung enthielt. Die Häufigkeit von EAE bei Mäusen, welche mit Nahrung gefüttert wurden, die eine niedrige Calciummenge enthielt, betrug 83% bei Männchen und 82% bei Weibchen. EAE wurde bei Weibchen mit 200 ng/Tag 1,25-(OH)₂D₃ oben oder bei Männchen mit 800 ng/Tag 1,25-(OH)₂D₃ unten nie vollständig verhindert. Geringere Dosen von 1,25-(OH)₂D₃ senkten die Häufigkeit von EAE auf 30% (p ≤ 0,007) bei Männchen und 45% (p ≤ 0,05) bei Weibchen, ohne Erhöhung des Serumcalciums. Jeder Datenpunkt stellt mindestens 8 und bis zu 22 Mäuse dar. "*" bedeutet signifikant unterschiedliche Werte im Vergleich zu Mäusen, welchen kein 1,25-(OH)₂D₃ gefüttert wurde p < 0,05. Die 40-45%ige Abnahme der EAE-Häufigkeit trat in Abwesenheit eines Anstiegs der Serumcalciumkonzentrationem auf (0,0022 ± 0,002 mmol/l, 4).
1,25-(OH)₂D₃, Serumcalcium und Prophylaxe von EAE. Wenn das Nahrungscalcium hoch war, verhinderten 6 ng/Tag 1,25-(OH)₂D₃ bei Weibchen eine EAE, und für Männchen wurden 100 ng/Tag 1,25-(OH)₂D₃ benötigt (Figur 2). Bei diesen Dosierungen von 1,25-(OH)₂D₃ war das Serumcalcium erhöht. Bei einer mittleren Nahrungscalciummenge wurden bei Weibchen 200 ng/Tag 1,25-(OH)₂D₃ und bei Männchen 400 ng/Tag zur Verhinderung von EAE benötigt (3). Wenn die Calciummenge in der Nahrung niedrig war, wurde EAE selbst bei hohen Dosierungen von 1,25-(OH)₂D₃ nicht verhindert. Diese Dosierungen von 1,25-(OH)₂D₃ erhöhten das Calcium signifikant von 0,0020 ± 0,0001 auf 0,0032 ± 0,0002 mmol/l Calcium (4). Bei allen Nahrungscalciummengen war eine anhaltende Hyperkalzämie mit einem signifikanten Gewichtsverlust verbunden (Tabelle 1). Schließlich war mindestens 4 mal mehr 1,25-(OH)₂D₃ und bei hohen Calciumaufnahmen 17 mal mehr 1,25-(OH)₂D₃ nötig, um EAE in Männchen zu verhindern als bei Weibchen. Bei den mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Mäusen verringerten sich die Gesamtsymptome der EAE (Tag des Beginns, Paralysewerte), wenn die Häufigkeit abnahm (Daten nicht gezeigt).
1,25-(OH)₂D₃, Serumcalcium und die Immunreaktion. Eine 1,25-(OH)₂D₃-Behandlung von Mäusen mit Nahrung mit viel Calcium ergab einen Nettoverlust der Lymphozyten und die erhöhte Expression von IL-4 und TGF-β1 (Cantorna et al., 1998b). Kontrollmäuse mit EAE besaßen 3,5 – 4,1 × 10⁷ Zellen in dem LN unabhängig von der Menge an Calcium in ihrer Nahrung (5).
5 ist ein Säulendiagramm bezüglich der Wirkung von 1,25-(OH)₂D₃ und Calcium auf die Gesamtzellen, welche von Mäusen drei Wochen nach der EAE-Auslösung aus den ableitenden LN gewonnen werden können. Es wurden Gruppen von männlichen B10.PL-Mäusen wurden mit Nahrung mit niedrigen, mittleren und hohen Calciummengen mit oder ohne Zugabe von 100 ng 1,25-(OH)₂D₃ gefüttert, und es wurde EAE ausgelöst. Das Experiment wurde dreimal mit sechs Mäusen pro Gruppe wiederholt. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung der Werte aus drei Experimenten. "*" kennzeichnet signifikant unterschiedliche Werte im Vergleich mit Werten von Mäusen, welche nicht mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelt wurden p < 0,05.
Die Gesamtzahl der Zellen in dem LN von mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Mäusen mit EAE war der gleiche wie bei Kontrollen, welche mit Nahrung mit wenig Calcium gefüttert wurden, nahm aber dramatisch (p ≤ 0,001) mit der Zugabe von Calcium zur Nahrung ab (5). Eine Zelloberflächenanalyse zeigte, dass ungeachtet des Nahrungscalciums oder einer 1,25-(OH)₂D₃-Behandlung Thy-1 positive Zellen 52-57% der LN ausmachten, CD4+-Zellen 40-44% der LN ausmachten und CD8+-Zellen 18-21% der LN ausmachten. Es gab keine Wirkung der 1,25-(OH)₂D₃- oder Calciumbehandlung auf die G3PDH-mRNA-Expression und deshalb spiegeln die mRNA-Spiegel von IL-4 und TGF-β1 die IL-4- und TGF-β1-Spiegel pro Zelle in dem LN wider. In dem LN der Kontroll-gefütterten Mäuse mit EAE wurde wenig IL-4 nachgewiesen, ungeachtet der Menge an Calcium in der Nahrung (6).
6 ist ein Säulendiagramm bezüglich der Wirkung von 1,25-(OH)₂D₃ und Calcium auf die IL-4- und TGF-β1-Transkripte in dem LN. Gruppen von männlichen B10.PL-Mäusen wurden mit wenig, mittel oder viel Calcium mit oder ohne Zugabe von 100 ng 1,25-(OH)₂D₃ gefüttert und EAE wurde ausgelöst. Es gab keine Wirkung von 1,25-(OH)₂D₃ oder einer Calciumnahrung auf die G3PDH-Expression. Es wird ein repräsentatives Experiment von 3 dargestellt. Jeder Wert stellt das Ergebnis von 6 zusammengefassten Mäusen dar. Obwohl das gesamte Ausmaß der Reaktion von Experiment zu Experiment variierte, waren dies hochreproduzierbare Ergebnisse.
Die IL-4-Produktion bei den mit 1,25-(OH)₂D₃ gefütterten Mäusen unterschied sich nicht von Kontrollen, wenn sie mit Nahrung mit wenig Calcium gefüttert wurden. Die Menge an produziertem IL-4 stieg an, wenn das Calcium in der Nahrung anstieg, aber nur in Zellen von Mäusen, welche mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelt wurden (6). Die TGF-β1-Spiegel in den LN von Kontroll-gefütterten Mäusen waren einheitlich niedrig im Vergleich mit denjenigen von Mäusen, welchen 1,25-(OH)₂D₃ gegeben wurde (6). Nahrungscalcium besaß keine Wirkung auf die TGF-β1-Expression (6). Im Hinblick auf die IL-4-mRNA-Expression exprimierten Mäuse mit den wenigsten Zellen in den LN (viel Calcium plus 1,25-(OH)₂D₃-Behandlung) das meiste IL-4. Hinsichtlich der TGF-β1-mRNA-Expression exprimierten alle Mäuse, welche mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelt wurden, höhere Spiegel an TGF-β1, ungeachtet der Anzahl der Zellen in dem LN.
Diskussion
Die Wirkungen von Nahrungscalcium und 1,25-(OH)₂D₃ stehen bei der Prophylaxe von EAE in Mäusen kritisch in Verbindung. Wenn Mäusen eine Nahrung mit einer hohen Calciummenge gefüttert wird (annähernd soviel wie in nicht gereinigter Nahrung gefunden wird), ist 1,25-(OH)₂D₃ mit ausreichenden Dosierungen bei der Prophylaxe von EAE zu 100% wirksam. Wenn Calcium dagegen aus der Nahrung entfernt wird, verringerte 1,25-(OH)₂D₃ die Häufigkeit von EAE nur um 50%. Wenn eine mittlere Menge an Calcium gefüttert wird, ist die Wirksamkeit von 1,25-(OH)₂D₃ mitten zwischen Nahrung mit wenig Calcium und Nahrung mit viel Calcium. Diese Ergebnisse sprechen stark dafür, dass Calcium an der Wirkung von 1,25-(OH)₂D₃ bei der Prophylaxe und Behandlung dieser Autoimmunerkrankung beteiligt ist (Holda und Swanborg, 1982; Powell et al., 1990).
Es ist von einigem Interesse, dass bei Mäusen, welchen eine Nahrung mit wenig Calcium gegeben wird, Dosierungen von 1,25-(OH)₂D₃, welche trotzdem eindeutig eine Hyperkalzämie erzeugen, eine geringe oder keine weitere Verringerung der EAE-Häufigkeit zeigen. Somit sind in Abwesenheit einer Nahrungsquelle für Calcium durch 1,25-(OH)₂D₃ vermittelte Anstiege des Serumcalciums für die weitere Hemmung von EAE unwirksam. Andererseits gibt es Dosierungen von 1,25-(OH)₂D₃, welche keine Hyperkalzämie verursachen, aber trotzdem die Häufigkeit von EAE verringern. Insgesamt sprechen unsere Ergebnisse darauf hin, dass 1,25-(OH)₂D₃ sowohl durch Calcium-abhängige als auch Calcium-unabhängige Mechanismen bei der Hemmung von EAE fungieren kann.
Nur alleinige Manipulation des Nahrungscalciums hatte keine Wirkung auf die Immunreaktion gegen EAE. Die Gesamtzellzahl in den LN von Mäusen mit EAE war umgekehrt mit der Menge an Nahrungscalcium verbunden, welche den mit 1,25-(OH)₂D₃ behandelten Mäusen gefüttert wurde. Ebenso ergab sich als Konsequenz von durch 1,25-(OH)₂D₃ induzierter Hyperkalzämie eine Thymusatrophie (Mohamed et al., 1996). Die verringerte Zellzahl in den LN kann den durch 1,25-(OH)₂D₃ hervorgerufene Abnahme der Zellexpansion oder der Zunahm des Zelltods zuzuschreiben sein. IL-4, jedoch nicht TGF-β1 war relativ zur Menge an gefüttertem Calcium erhöht. In Abwesenheit von zugegebenem Nahrungscalcium besaß 1,25-(OH)₂D₃ keine Wirkung auf die IL-4-Expression. 1,25-(OH)₂D₃ und Calcium können die Differenzierung und/oder Expression von Zellen, welche kein IL-4 herstellen, tatsächlich selektiv inhibieren. Das Ergebnis wäre anscheinend ein Anstieg der IL-4-Expression. Deshalb ist es möglich, dass die IL-4-Expression sich nicht verändert hat, aber anstelle dessen der Anteil an Zellen erhöht wurde, welche IL-4 herstellen. Umgekehrt stieg TGF-β1 ungeachtet des Nahrungscalciums als Reaktion auf 1,25-(OH)₂D₃ an. Dieser Befund stimmt mit unseren früheren Arbeiten überein, welche darauf hindeuten, dass die TGF-β1-Genexpression direkt durch 1,25-(OH)₂D₃ reguliert wird (Cantorna et al., 1998b). Calcium ist ein wichtiger intrazellulärer Botenstoff, aber es ist nicht bekannt, wie das Nahrungscalcium das intrazelluläre Calcium beeinflussen könnte. Es ist mehr Arbeit erforderlich, um die Beziehung von 1,25-(OH)₂D₃ und Calcium als Regulatoren des Immunsystems zu verstehen.

Wir stellen fest, dass niedrige Nahrungscalciummengen die EAE-Häufigkeit verringern, während sie gleichzeitig die Wirksamkeit von 1,25-(OH)₂D₃ bei Vorbeugung der EAE verringern. Die in diesen Experimenten verwendeten Tiere sind nicht Vitamin D-depletiert und enthalten somit Speicher 5 von Vitamin D und 25-Hydroxyvitamin D. Es ist allgemein bekannt, dass wenig Nahrungscalcium die Produktion von 1,25-(OH)₂D₃ deutlich stimuliert (DeLuca, 1983). Dieses endogen produzierte Hormon könnte bei der Verringerung der EAE-Häufigkeit sehr gut eine Rolle spielen. Andererseits ist klar, dass sogar große Dosen von 1,25-(OH)₂D₃ EAE in diesen Mäusen nicht vollständig 10 verhindern kann. Deshalb muss eine niedrige Nahrungscalciummenge mehr als eine Rolle spielen. Tabelle 1. Serumcalcium und Gewicht von männlichen Mäusen, gefüttert mit verschiedenen Mengen an Calcium und 100 ng/Tag 1,25-(OH)₂D₃.

Nahrungscalcium	20 mg/100 g		470 mg/100 g		1 g/100 g
1,25-(OH)₂D₃	Gewicht ³ (g)	Serumcalcium (mmol/l)	Gewicht (g)	Serumcalcium (mmol/l)	Gewicht (g)	Serumcalcium (mmol/l)
Ohne	23 ± 2	0,0020±0,0001	26 ± 1	0,0021±0,0001	26 ± 3	0,0023±0,0001
Mittel²	27 ± 3	0,0021±0,0001	23 ± 2	0,0028±0,0001	25 ± 2	0,0030±0,0000*
Hoch	13 ± 3*	0,0032±0,0001*	17 ± 3*	0,0035±0,0002*	15 ± 1*	0,0035±0,0002*

¹ Werte sind Mittelwert ± Standardabweichung von 6-34 Mäusen.
² Mittlere Dosierungen von 1,25-(OH)₂D₃ waren 50-400 ng/Tag gefüttert 20 mg/100 g Nahrungscalcium, 50-200 ng/Tag gefüttert 470 mg/100 g Nahrungscalcium und 10-50 ng/Tag gefüttert 1 g/100 g Nahrungscalcium. Hohe Dosierungen von 1,25-(OH)₂D₃ waren 800 ng/Tag bei 20 mg/100 g Nahrungscalcium, 400 ng/Tag bei 470 mg/100 g Nahrungscalcium und 100-400 20 ng/Tag bei 1g/100 g Nahrungscalcium.
³ Die Mäuse wurden am Ende des 50-tägigen Experiments gewogen. Startgewicht betrug 22-26 g.
* Signifikanter Verlust (bezüglich Gewicht) und signifikant höher (bezüglich Calcium) als bei Mäusen, welchen kein 1,25-(OH)₂D₃ und die äquivalente Menge an Nahrungscalcium gefüttert wurde.

Referenzen

Arbour, N.C., Ross, T.K., Zierold, C., Prahl, J.M. und DeLuca, H.F., "A highly sensitive method for large-scale measurements of 1,25-dihydroxyvitamin D." Anal. Biochem. 255: 148-154, 1988.
Bhalla, A.K., Anesto, E.P., Clemens, T.L., Holick, M.F. und Krane, S.M., "Specific high-affinity receptors for 1,25-dihydroxyvitamin D₃ in human peripheral blood mononuclear cells: Presence in monocytes and induction in Tlymphocytes following activation", J. Clin. Endocrinol. Metab. 57: 1308-1310, 1983.
Bouillon, R., Okamura, W.H. und Norman, A.W., "Structure-function relationships in the vitamin D endocrine system", Endocrine Rev. 16: 200-230, 1995.
Cantorna, M.T., Hayes, C.E. und DeLuca, H.F., "1,25-Dihydroxyvitamin D₃ reversibly blocks the progression of relapsing encephalomyelitis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7861-7864, 1995.
Cantorna, M.T., Hayes, C.E. und DeLuca, H.F., "1,25-Diyhdroxycholecalciferol inhibits the progression of arthritis in murine models of human arthritis." J. Nutr. 128: 68-72, 1998a.
Cantorna, M.T., Woodward, W.T., Hayes, C.E. und DeLuca, H.F., "1,25-dihydroxyvitamin D₃ is a positive regulator for the two anti-encephalitogenic cytokines TGF-β1 and IL-4", J. Immunol. 160: 5314-5319, 1998b.
Chomczynski, P. und Sacchi, N., "Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction", Anal. Biochem. 162: 156, 1987.
Cua, D.J., Hinton, D.R. und Stohlman, S.A., "Self-antigen-induced Th2 responses in experimental allergic encephalomyelitis (EAE)-resistant mice", J. Immunol. 155: 4052-4059, 1995.
DeLuca, H.F., "The vitamin D-calcium axis", In: Calcium in Biological Systems (Rubin, R.P., Weiss, G.B./Putney, J.W. Jr. eds.) S. 491-511, 1983.
DeLuca, H.F., "The genetics and biology of vitamin D", In: Prinziples of Medical Biology (E.E. Bittar und N. Bittar, eds.), Greenwich, CT, JAI Press, Inc., S. 617-641, 1997.
Grossman, C.J., Roselle, G.A. und Mendenhall, C.L., "Sex steroid regulation of autoimmunity", J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 40: 649-659, 1991.
Hullett, D.A., Cantorna, M.T., Redaelli, C., Clagett-Dame, M., Hayes, C.E., McCary, L., Humpal-Winter, J., Sollinger, H.W. und DeLuca, H.F., "Prolongation of allograft survival by 1,25-diyhdroxyvitamin D₃", Transplantation 66: 824-828, 1998.
Lemire, J.M. und Archer, D.C., "1,25-Diyhdroxyvitamin D₃ prevents the in vivo induction of murine experimental autoimmune encephalomyelitis", J. Clin. Invest. 87: 1103-1107, 1991.
Mohamed, M.I., Beckman, M.J., Meehan, J. und DeLuca, H.F., "Effect of 1,25-dihydroxyvitamin D3 on mouse thymus: role of extracellular calcium", Biochim. Biophys. Acta. 1289: 275-283, 1996.
Pike, J.W., "Vitamin D₃ receptors: Structure and function in transcription", Ann. Rev. Nutr. 11: 189-216, 1991.
Provvedini, D.M., Tsoukas, D.C., Deftos, L.J. und Manolagas S.C., "1,25-Dihydroxyvitamin D₃ receptor in human leukocytes", Science 221: 1181-1183, 1983.
Rosner, B., "Hypothesis Testing: Categorical Data In: Fundamentals of Biostatistics", 2. Auflage (Payne M. Hg.) Boston, Duxbury Press, S. 302-317, 1986.
Ross, T.K., Darwish, H.M. und DeLuca, H.F., "Molecular biology of vitamin D action", In: Vitamins and Hormones (G. Litwack Hg.), San Diego: Academic Press, S. 281-326, 1994.
Siebert, P.D. und Larrick, J.W., "Competitive PCR", Nature 359: 557-558, 1992.
Siebert, P.D. und Larrick, J.W., "PCR MIMICS: Competitive DNA fragments for use as internal standards in quantitative PCR", BioTechniques 14:244-249, 1993.
Smith, S.M., Levy, N.S. und Hayes, C.E., "Impaired immunity in vitamin A deficient mice", J. Nutr. 117: 857-865, 1987.
Yang, S., Smith, C., Prahl, J. und DeLuca, H.F., "Vitamin D deficience suppresses cell-mediated immunity in vivo", Arch. Biochem. Biophys. 303: 98-106, 1993.

Claims

Verwendung von Calcium und einer Vitamin D-Verbindung in der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung zum Verringern oder Verhindern der Häufigkeit von Symptomen der Multiplen Sklerose, wobei die Menge an Calcium von 0,5 bis 2 g Calcium pro Patient pro Tag beträgt und die Vitamin D-Verbindung die Formel
aufweist, wobei X¹ und X² jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder Acyl sind; Y¹ und Y² H sein können oder Y¹ und Y² O-Aryl, O-Alkyl, Aryl, C_1-4 Alkyl sein können, oder Y¹ und Y² zusammen genommen werden, um ein Alken mit der folgenden Struktur zu bilden
wo B₁ und B₂ H, C_1-4 Alkyl oder Aryl sein können und eine α-, β- oder α- Konfiguration aufweisen können; Z¹ = Z² = H oder Z¹ und Z² zusammen = CH₂ sind; und R eine Alkyl-, Hydroxyalkyl- oder Fluoralkylgruppe ist, oder R die folgende Seitenkette darstellen kann:
wobei (a) eine S- oder R-Konfiguration aufweisen kann, R¹ Wasserstoff, Hydroxy oder O-Acyl darstellt; R² und R³ jeweils unabhängig voneinander Alkyl, Hydroxyalkyl oder Fluoralkyl sind, oder, wenn zusammengenommen, die -(CH₂)_m-Gruppe darstellen, wobei m eine ganze Zahl von 2 bis 5 ist; R⁴ Wasserstoff, Hydroxy, Fluor, O-Acyl, Alkyl, Hydroxyalkyl oder Fluoralkyl ist, wobei R⁴ Wasserstoff oder Alkyl ist, wenn R⁵ Hydroxyl oder Fluor ist; R⁵ Wasserstoff, Hydroxy, Fluor, Alkyl, Hydroxyalkyl oder Fluoralkyl ist, oder R⁴ und R⁵ zusammengenommen Sauerstoff mit Doppelbindung darstellen; R⁶ und R⁷ zusammengenommen eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden; R⁸ H oder CH₃ ist; n eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist; und der Kohlenstoff an einer der Positionen 20, 22 oder 23 in der Seitenkette durch ein O-, S- oder N-Atom ersetzt werden kann.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei mindestens ein 1 g Calcium verabreicht werden muss.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Vitamin D-Verbindung 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ (1,25-(OH)₂D₃), 19-nor-1,25-Dihydroxyvitamin D₂ (19-nor-1,25-(OH)₂D₃), 24-homo-22-dehydro-22E-1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ (24-homo-22-dehydro-22E-1,25-(OH)₂D₃), 1,25-dihydroxy-24(E)-dehydro-24-homo-Vitamin D₃ (1,25-(OH)₂-24-homo D₃), 19-nor-1,25-dihydroxy-21-epi-Vitamin D₃ (19-nor-1,25-(OH)₂-21-epi-D₃), 1α-Hydroxyvitamin D₃ oder 1α-Hydroxyvitamin D₂ ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Vitamin D-Verbindung 1,25-(OH)₂D₃ ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Calcium in der Form von Calciumcarbonat, Calciumacetat, Calciumcitrat oder Calciumphosphat vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Symptome für Multiple Sklerose bei einem weiblichen Lebewesen vorhanden sind.