JP2003504337A

JP2003504337A - 多発性硬化症のビタミンｄ化合物療法に対するサプリメントとしての食じ性カルシウム

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Publication number: JP2003504337A
Application number: JP2001508984A
Authority: JP
Inventors: ヘクターエフ．デルーカ，; マルゲリタテイ．カントーナ，; ジーンフンパル−ウインター，
Original assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Current assignee: Wisconsin Alumni Research Foundation
Priority date: 1999-07-08
Filing date: 2000-06-23
Publication date: 2003-02-04
Also published as: WO2001003704A1; DK1196174T3; US20030022873A1; US20030207847A1; DE60035996D1; US20020016313A1; EP1196174B1; AU5634500A; ATE369864T1; EP1196174A1; US6479474B2; DE60035996T2

Abstract

(57)【要約】多発性硬化症の症状を減少させるための方法および組成物が開示される。ある実施態様では、本方法は多発性硬化症の症状を減少させるために有効な量のカルシウムおよびビタミンＤ化合物を投与するステップを備える。もう１つの実施態様では、本発明は多発性硬化症の症状を減少させるために有効な量のカルシウムおよびビタミンＤ化合物を含有してなる薬学的組成物である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願の相互参照） ‐‐

【０００２】（連邦政府資金援助を受けた研究または開発に関する説明） ‐‐

【０００３】（発明の背景）ビタミンＤは、免疫系を調節することが分かっている物質の名簿の新掲載品で
ある。ビタミンＤは、２段階プロセスで血清カルシウム、リンおよび骨を調節す
ることに関する主要因子であるホルモンの１，２５−ジヒドロキシコレカルシフ
ェロール（１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃）¹へ転換される（デルーカ、１９９７）。こ
のホルモンは、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーである
核受容体のビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）を通してのステロイドホルモン様機序で
作用する（パイク、１９９１；ロスら、１９９３）。末梢血リンパ球中における
ＶＤＲの発見（バーラら、１９８３；プロッヴェッディーニら、１９８３）は、
１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃が免疫系の有意な調節剤であるという認識をもたらした要
素である。１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃の免疫系調節剤としての役割に関する最も注目
すべき証拠は生体内実験に由来する。１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃はＥＡＥ（カントー
ナら、１９８６および米国特許第５，７１６，９４６号；レミーレおよびアーチ
ャー、１９９１）および実験的関節炎（カントーナら、１９９８ａ）の発生を防
止することができ、さらに１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃は移植拒否反応を顕著に阻害で
きる（ブーヨンら、１９９５；ヒュレットら、１９９８）。

【０００４】ＥＡＥは、中枢神経系（ＣＮＳ）上に不適切な免疫媒介性攻撃を仕掛けるＣＤ
４＋Ｔ細胞によって媒介される。ＣＮＳ抗原に対して特異的な１型ヘルパー（Ｔ
ｈ１）細胞がこの疾患を誘発し、Ｔｈ１サイトカインインターフェロン（ＩＦＮ
）−γおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αはマウスにおけるＥＡＥに関連してい
る（ホールダーおよびスワンボルク、１９８２；パウェルら、１９９０）。これ
とは逆に、２型ヘルパー（Ｔｈ２）細胞、およびＣＮＳ抗原に反応してインター
ロイキン（ＩＬ）−４および形質転換成長因子（ＴＧＦ）−β１を産生するその
他の細胞型はＥＡＥを改善することが知られている。生体内１，２５−(ＯＨ)₂
Ｄ₃療法は、リンパ球総数における純損失並びにＩＬ−４およびＴＧＦ−β１の
発現における純増加を生じさせる（カントーナら、１９９８ｂ）。これとは逆に
、生体内１，２５−療法はＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−α発現に作用をもたらさな
かった（カントーナら、１９９８ｂ）。もしあるとしても、免疫反応の調節にお
けるカルシウムに対する役割は依然として不明である。

【０００５】（発明の概要）本発明は、多発性硬化症患者をより効果的に治療する方法である。本方法は、
ビタミンＤ化合物がＭＳの症状を予防するかまたは顕著に減少させるのに有効な
量のカルシウムを投与するステップを備える。好ましくは、このカルシウムの量
は患者１人当たり１日当たり０．５〜２ｇである。最も好ましくは、この量は例
えばＣＯ₃ ^2-、ＰＯ₄ ^3-、Ｃｌ₂ ^- 酢酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩等のような
様々な陰イオンを有する塩としての１〜２ｇのカルシウムである。

【０００６】ある実施態様では、前記ビタミンＤ化合物は１α，２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤ₃（１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃）、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤ₂（１９−ノル−１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃）、２４−ホモ−２２−デヒドロ−
２２Ｅ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（２４−ホモ−２２−デヒドロ
−２２Ｅ−１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃）、１，２５−ジヒドロキシ−２４（Ｅ）−デ
ヒドロ−２４−ホモ−ビタミンＤ₃（１，２５−(ＯＨ)₂−２４−ホモ−Ｄ₃）、
または１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２１−エピ−ビタミンＤ₃（１９
−ノル−１，２５−(ＯＨ)₂−２１−エピ−Ｄ₃）である。本発明の最も好ましい
形態では、使用される化合物は１，２５(ＯＨ)₂Ｄ₃である。

【０００７】もう１つの実施態様では、本発明は、所定量のビタミンＤおよびそのビタミン
Ｄ化合物が多発性硬化症の症状を減少させるのに更に有効な量のカルシウムを含
有してなる薬学的組成物である。

【０００８】本発明の目的は、多発性硬化症患者における多発性硬化症の症状をより効果的
に減少させることである。

【０００９】本発明の別の目的は、ＭＳの症状を緩和するために必要なビタミンＤ化合物の
量を減少させることである。

【００１０】本発明の他の特徴、長所および目的は、当業者には明細書、クレームおよび図
面を精査した後に明白になるであろう。

【００１１】（発明の詳細な説明）ビタミンＤ（１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール）の活性形は、強
力な免疫系調節剤である。我々はＢ１０．ＰＬマウスを１，２５−ジヒドロキシ
コレカルシフェロールで治療し、それらのマウスに高カルシウム飼料を与えると
、例えば実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のような実験的自己免疫疾患の誘
発を完全に抑制できることを発見した。Ｂ１０．ＰＬマウスは多発性硬化症のた
めに容認された実験モデルであるので、我々はこれらの試験結果が、カルシウム
サプリメントと一緒にビタミンＤ化合物を用いて患者を治療することによって多
発性硬化症患者をより効果的に治療できることを示していると考える。我々はこ
の組み合わせは、例えば米国特許第５，７１６，９４６号（デルーカら）（参照
してここに組み込まれる）に記載の治療法のようなビタミンＤ化合物単独による
治療より効果的に多発性硬化症を治療するであろうと考える。

【００１２】従って、ある実施態様では、本発明はビタミンＤ化合物、好ましくは１，２５
(ＯＨ)₂Ｄ₃またはその類似体が特定の多発性硬化症の症状をより効果的に減少さ
せることを可能にする量のカルシウムを投与することによってヒト多発性硬化症
患者を治療する方法である。本方法は、多発性硬化症患者を選択するステップ並
びにその患者にカルシウムサプリメントおよびその多発性硬化症の症状を和らげ
るために十分な量のビタミンＤ類似体を投与するステップを備える。

【００１３】この反応の特に有益な形態では、前記投与される化合物は１α，２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ₃（１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃）、１９−ノル−１，２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ₂（１９−ノル−１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃）、２４−ホモ−２２
−デヒドロ−２２Ｅ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（２４−ホモ−２
２−デヒドロ−２２Ｅ−１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃）、１，２５−ジヒドロキシ−２
４（Ｅ）−デヒドロ−２４−ホモ−ビタミンＤ₃（１，２５−(ＯＨ)₂−２４−ホ
モ−Ｄ₃）、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２１−エピ−ビタミンＤ₃（
１９−ノル−１，２５−(ＯＨ)₂−２１−エピ−Ｄ₃）、１αヒドロキシビタミン
Ｄ₃または１αヒドロキシビタミンＤ₂である。

【００１４】本発明の別の形態では、前記ビタミンＤ化合物は下記の式を有する、

【００１５】

【化４】

【００１６】［式中、Ｘ¹およびＸ²は各々水素およびアシルからなる群から選択され；Ｙ¹お
よびＹ²はＨであってよく、または炭素数１〜４のＯ−アリール、Ｏ−アルキル
、アリール、アルキルであってよく、あるいはＹ¹およびＹ²は一緒になって

【００１７】

【化５】

【００１８】〔式中Ｂ₁およびＢ₂は、Ｈ、炭素数１〜４のアルキルおよびアリールからなる群
から選択でき、およびβまたはα構造を有していてよい〕で示される構造を有す
るアルケンを形成し得る；Ｚ¹＝Ｚ²＝ＨであるかまたはＺ¹およびＺ²は一緒にな
って＝ＣＨ₂であり；Ｒはアルキル基、ヒドロキシアルキル基もしくはフルオロ
アルキル基であるか、またはＲは下記の側鎖：

【００１９】

【化６】

【００２０】〔式中、（ａ）はＳまたはＲ構造であり、Ｒ¹は水素、ヒドロキシまたはＯ−ア
シルを表し、Ｒ²およびＲ³は各々アルキル、ヒドロキシアルキルおよびフルオロ
アルキルからなる群から選択されるか、またはＲ²およびＲ³は一緒になってｍが
２〜５の値を有する整数である−(ＣＨ₂)_m−基を表しており、Ｒ⁴は水素、ヒド
ロキシ、フッ素、Ｏ−アシル、アルキル、ヒドロキシアルキルおよびフルオロア
ルキルからなる群から選択され、このときＲ⁵がヒドロキシルまたはフルオロの
場合はＲ⁴は水素またはアルキルでなければならず、Ｒ⁵は水素、ヒドロキシ、フ
ッ素、アルキル、ヒドロキシアルキルおよびフルオロアルキルからなる群から選
択されるか、またはＲ⁴およびＲ⁵は一緒になって二重結合酸素を表し、Ｒ⁶およ
びＲ⁷は一緒になって炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ⁸はＨまたはＣＨ₃であっ
てよく、ｎは１〜５の値を有する整数であり、側鎖における第２０、２２または
２３位のいずれか１つの炭素はＯ、ＳまたはＮ原子に置換されてもよい〕を示しうる］。

【００２１】米国特許第５，７１６，９４６号（デルーカら、１９９８年２月１０日発行）
は、ビタミンＤ化合物を用いた多発性硬化症の治療について記載している。好ま
しくは、患者はこの特許に開示されたビタミンＤ治療の説明を使用して治療スケ
ジュールを設計するであろう。本発明の方法においては、人は好ましくは炭酸カ
ルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リ
ン酸カルシウムおよびクエン酸カルシウムから選択されるカルシウム化合物の投
与を用いてこの治療を補うであろう。好ましいのは炭酸カルシウム、酢酸カルシ
ウムおよびクエン酸カルシウムである。

【００２２】好ましくは、人はビタミンＤ化合物治療に患者１人（典型的には体重１６０ポ
ンドの患者）当たり１日当たり０．５〜２ｇのカルシウムを補うであろう。最も
好ましくは、投与はビタミンＤ化合物の投与と同時に行われるであろうが、同時
投与は不可欠ではない。

【００２３】本発明はまた多発性硬化症の症状を減少させるために有効な量のビタミンＤ化
合物およびそのビタミンＤ化合物の投与の作用を増強するために有効な量のカル
シウムを含有してなる薬学的組成物である。好ましくは、ビタミンＤ化合物の用
量は０．２５μｇ〜１０μｇであり、カルシウムの用量は０．５〜２ｇである。
この薬学的組成物はさらに薬学的に容認可能な担体を含有してなる。

【００２４】（実施例）下記で記載する実験では、ＥＡＥを発症するように誘発され、さらに種々の量
のカルシウムおよび１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃を含有する飼料が与え
られたマウスを使用する。測定したパラメーターには、ＥＡＥの発症および重症
度、血清カルシウム、体重、リンパ節内の総細胞数、インターロイキン−４およ
び形質転換成長因子−β１の発現が含まれる。

【００２５】様々なカルシウム治療マウスおよび１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃治療
マウスからの数値を比較した。飼料からカルシウムを除去した場合は、ＥＡＥの
発生率は雄性および雌性の両方で２０％減少した。飼料中のカルシウム濃度が低
いほど、症状を予防するために必要な１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃の用
量は高かった。従って、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃はカルシウム濃度
が適切または高い飼料が与えられたマウスにおいて最も有効である。

【００２６】高食じ性カルシウムが与えられたマウスへの１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ₃治療はリンパ節中の総リンパ球数減少を惹起し、さらにインターロイキン（
ＩＬ）−４および形質転換成長因子（ＴＧＦ）−β１ｍＲＮＡ発現を増加させ
た。飼料からカルシウムを削除すると、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃治
療はＴＧＦ−β１ｍＲＮＡを増加させた。ＩＬ−４ｍＲＮＡ増加およびリン
パ節中のリンパ球数減少は、カルシウムおよび１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ₃が与えられたマウスにおいてのみ発生した。

【００２７】我々の試験結果は、食じ性カルシウムおよび１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ₃がどちらも症候性ＥＡＥの発生および予防に関係していることを証明してい
る。

【００２８】ヒト多発性硬化症は女性において最も罹患率が高いが（グロースマンら、１９
９１）、他方マウスにおけるＥＡＥの発生率および重症度は系統に依存して雄性
対雌性で相違する（カントーナら、１９９６、クーアら、１９９５）。従って、
この疾患において性別が主要因子であることは既に知られている。今回の試験も
また、１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃が両性において同等に有効であるかどうか、並びに
この疾患の発生および１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃への反応において食じ性カルシウム
濃度が何らかの役割を果たすのかどうかを判定するために設計された。

【００２９】我々の試験結果は、１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃およびカルシウムの両方が免疫反応
を調節すること、そして１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃が食じ性カルシウム濃度の適正も
しくは高い飼料が与えられた対象、特に雌性におけるＥＡＥに対してより効果的
であることを示している。

【００３０】材料および方法動物および飼料。Ｂ１０．ＰＬマウスは、ジャクソン・ラボラトリーズ（Ja
ckson Laboratories）（バーハーバー、メイン州）から入手した繁殖用つがいを
使用して我々のコロニーで繁殖させた。飼育中、マウスには１００ＩＵ／ｇの
コレカルシフェロール（ビタミンＤ₃）を含有するピュリナ（Purina）製飼料５
００８フォーミラブ（Formilab）（リッチモンド、インディアナ州）を与えた。
マウスは、６〜８週齢の時点に実験に使用したが、この時点に雌性マウスは１８
〜２２ｇ、雄性マウスは２２〜２６ｇであった。実験のために、全マウスには下
記に説明する修飾を加えた合成飼料（ヤンら、１９９３；スミスら、１９８７）
を与えた。全実験のために、各マウスには４ｇの実験用飼料を与え（完食した）
、各実験の全期間中に渡って２〜３日毎に飼料を取り替えた。マウスには、各マ
ウスが１日量の１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃を摂取すること及び対照マウスが１，２５
−(ＯＨ)₂Ｄ₃治療マウスより大量に摂取しないことを保証するために、毎日４ｇ
の飼料を与えた。実験用飼料にはビタミンＤが欠けていたが、マウスは通常の光
にさらされていたので、従ってビタミンＤ欠乏性ではなかった。ＥＡＥは全マウ
スにおいて実験食の開始１週間後に誘発された。ＥＡＥの重度の症状を示したマ
ウスに対しては、飼料は小さな皿に入れてケージの底部に置いた。実験終了時に
、マウスの体重を計測し、屠殺し、放血させた。

【００３１】第１実験デザインでは、雄性および雌性マウスに１００ｇの飼料当たり１ｇの
カルシウムを含有する飼料を与え、ＥＡＥを誘発した。第２実験シリーズでは、
８〜１２匹からなるマウス群にビタミンＤを含有しない実験用飼料（対照療法）
または図示されているように様々な濃度の１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃をプラスした実
験用飼料を与えた。雌性マウスには０〜２００ｎｇ／日の範囲内の、そして雄性
マウスには０〜８００ｎｇ／日の範囲内の１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃を与えた。実験
用飼料は３種のカルシウム濃度（図示されているように１００ｇの飼料当たり２
０ｍｇ（低）、４７０ｍｇ（中）または１ｇ（高）のカルシウム）の１つを含有
していた。最終実験デザインでは、対照飼料または１日当たり１００ｎｇの１，
２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃を含有する同一飼料を与えた雄性マウスだけを使用した。これ
らのマウスには、図示されているように低、中、または高カルシウムを含む飼料
を与えた。この飼養プロトコルは各群６〜８匹の雄性マウスを含む６群を生じさ
せた。この用量の１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃を選択したのは、この用量が高カルシウ
ム飼料が与えられた雄性マウスにおいてＥＡＥを完全に予防するためであった。
上記の手順すべては、ウィスコンシン−マディソン大学研究用動物資源センター
実験審査委員会によって１９９４年９月９日に審査かつ承認されており、プロト
コル番号はＡ−０７−３０００−Ａ００７５５−４−０８−９４である。

【００３２】ＥＡＥ疾患の誘発。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）をモルモット脊髄
から単離した（カントーナら、１９９６）。ＭＢＰを凍結乾燥し、−２０℃で貯
蔵した。免疫のために、ＭＢＰを８ｇ／Ｌの濃度で０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸中に溶
解した（カントーナら、１９９６）。マイコバクテリウム・ツベルクローシス（ Mycobacterium tuberculosis）Ｈ３７Ｒａを含有する同等量の完全フロイントア
ジュバント（ＣＦＡ、ディフコ・ラボラトリーズ（Difco Laboratories）製、デ
トロイト、ミシガン州）中に乳化させた０．１ｍｌのＭＢＰ（４００ｍｇ／マウ
ス）を皮下注射することによってエーテル麻酔したマウスを免疫した。さらに、
免疫当日および２日後に、無菌生理食塩液に懸濁させた２００ｎｇの百日咳毒素
（ＬＩＳＴバイオロジカル・ラボラトリーズ（Biological Laboratories）製、
キャンベル、カリフォルニア州）をマウスに腹腔内注射した。この免疫プロトコ
ルは８０〜１００％のマウスにおけるＥＡＥの誘発を生じさせた。様々な免疫反
応を測定するために雄性マウスを免疫後第２１日に屠殺した。ＥＡＥ採点システ
ムは次の通りであった：０＝正常；１＝だらりとした尾；２＝ぎこちない歩行を
伴う不全対麻痺；３＝後肢麻痺；４＝後肢および前肢麻痺；５＝瀕死。

【００３３】リンパ球。６匹のマウスから腋窩、上腕および鼠径のリンパ節（ＬＮ）を採
取してプールし、さらに対照マウスおよび１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃治療マウスから
も免疫後第２１日に採取してプールした。各実験はその全部を３回ずつ繰り返し
た。これらのＬＮを選択したのは、それらが免疫部位から排出するためであった
。採取したＬＮは、２３ｇ針および１組の鉗子を使用して手動で破壊した。ＬＮ
中の総細胞数は、対照マウスおよび１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃治療マウスからのリン
パ球数を計数し、群内のマウスの数で割ることによって測定した。標準プロトコ
ルを使用し、記載されている通りに正確に対照マウスおよび１，２５−(ＯＨ)₂
Ｄ₃治療マウスからＬＮ細胞について蛍光標識細胞集団（Ｔｈｙ−１、クラスII
、ＣＤ４およびＣＤ８）のフローサイトメトリーを実施した（スミスら、１９８
７）。サイトカインＰＣＲ解析のために、総細胞ＲＮＡ単離を行うためにＬＮ細
胞を保存した。

【００３４】定量競合的ＰＣＲによる転写解析。ｍＲＮＡ解析のための細胞は、酸性グア
ニジニウムチオシアネート中に溶解させ、総ＲＮＡはフェノールクロロホルム抽
出法（チョムジンスキーおよびサッキ、１９８７）によって単離した。総細胞Ｒ
ＮＡは製造業者のプロトコル（プロメガ（Promega））に従ってオリゴｄＴプラ
イマーを使用して逆転写し、競合的ＰＣＲによって定量した。グリセルアルデヒ
ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、ＩＬ−４およびＴＧＦ−β１
に対して特異的なプライマーおよび模擬ＤＮＡはクローンテック・ラボラトリー
ズ社（Clontech Laboratories, Inc.）（パロアルト、カリフォルニア州）から
入手した（ジーベルトおよびラリック、１９９２；ジーベルトおよびラリック、
１９９３）。ｃＤＮＡアリコートを試験するために、中性ＤＮＡセグメントに隣
接するＧ３ＰＤＨ、ＩＬ−４およびＴＧＦ−β１プライマー配列を含んでいる競
合的ｃＤＮＡ模擬体を連続的に希釈して添加した（ジーベルトおよびラリック、
１９９２；ジーベルトおよびラリック、１９９３）。ｂｐ（塩基対）のサイズを
模倣するために確実な生成物は、Ｇ３ＰＤＨに対しては９８３／６００、ＩＬ−
４に対しては３０６／５４４およびＴＧＦ−β１に対しては５２５／３９０であ
った。この混合物を規定の最適条件下で増幅させ、生成物を１．５％アガロース
ゲル電気泳動法によって溶解し、臭化エチジウムを用いて染色した。サイトカイ
ン帯域は分子量標準に比較したサイズによって同定した。サイトカイン帯域に適
合する蛍光強度を有する帯域を産生した模擬ＤＮＡ希釈を使用してサイトカイン
ｃＤＮＡコピー数を計算した。Ｇ３ＰＤＨ転写定量は逆転写効率に対する対照と
して機能した。数値はＧ３ＰＤＨｃＤＮＡの１０００コピー当たりのサイトカ
インｃＤＮＡコピーとして報告されている。

【００３５】血清カルシウムおよび１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃解析。５０日後、マウスを屠殺
し、心穿刺により血液を採取し、凝塊形成後に血清を採取した。血清カルシウム
濃度は記載されている通りに正確にパーキン・エルマー（Perkin Elmer）原子吸
光分光計を使用して測定した（モハメドら、１９９５）。１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃ 解析は、記載されている通りに正確に実施した（アーバーら、１９９６）。

【００３６】統計。可能な場合は、報告されている数値は複数のマウスまたは実験からの
平均値である。実験毎のＥＡＥ誘発、ピーク重症度およびサイトカイン遺伝子発
現における変動性のために、一部の数値（図６）は３回の実験の内の代表的な１
回の実験からの数値として報告した。記載されているように全百分率値の統計解
析には、２項比率についての２サンプル試験を使用した（ロスナー、１９８６）
。同様に可能な場合は、統計解析はマッキントッシュ用の統計プログラム（STAT
VIEW STUDENT）を使用して実施した。非対２群スチューデントのｔ検定を実施し
（およびマン・ホイットニーのＵ検定を使用して確認した）、ρ＜０．０５の数
値は統計的有意であると見なした。

【００３７】結果Ｂ１０．ＰＬマウスにおける性別とＥＡＥの発生。食じ性カルシウム含量が
高い場合、ＥＡＥの発生率は雄性については９８％および雌性については９６％
であった。免疫後第５０日までにＥＡＥを発生しなかった雄性および雌性は本試
験から除外した。ＥＡＥを発生したマウスについては、ＥＡＥ最高重症度をＥＡ
Ｅ開始日に対してプロットした（図１）。図１は雄性および雌性Ｂ１０．ＰＬマ
ウスにおけるＥＡＥの発生と重症度のグラフである。雄性マウスは、雌性Ｂ１０
．ＰＬマウスより急速かつ重度にＥＡＥを発生した。雌性マウスの３４％は免疫
２４日後にＥＡＥを発生するが、他方この時点には雄性マウスの１００％がＥＡ
Ｅを発生する（ρ≦０．０００２）。各記号は個々のマウスを表している。雌性
ｎ＝３１、および雄性ｎ＝２０。

【００３８】雄性における最高ＥＡＥ重症度の範囲は３〜５であった。雌性における最高Ｅ
ＡＥ重症度の範囲は２〜５であった。雄性の４７％は５のＥＡＥスコアに達した
が、５のスコアに達した雌性は１７％に過ぎなかった（ρ０．０３）。ＥＡＥ開
始日もまた、雌性（９〜３８日）より雄性（９〜２４日）の方が早かった。（ρ
０．０００２）。雌性の３４％は免疫２４日後にＥＡＥを発生した。雄性マウス
は雌性マウスよりＥＡＥになりやすかった。

【００３９】食じ性カルシウムとＥＡＥ発生率。ＥＡＥ疾患重症度は食じ性カルシウムに
おける変化によって影響を受けなかった。だが、ＥＡＥの発生率は食じ性カルシ
ウムの量に伴って変動した。高カルシウムを含有する飼料は、１００％に近いＥ
ＡＥ発生率値を生じさせた（図２）。

【００４０】図２は１００ｇの飼料当たり１ｇのカルシウムを含有する飼料が与えられた雄
性および雌性マウスの１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃用量反応のグラフである。高カルシ
ウム飼料が与えられたマウスにおけるＥＡＥの発生率は雄性については１００％
および雌性については９９％であった。ＥＡＥは、雌性では６ｎｇ／日の１，２
５−(ＯＨ)₂Ｄ₃最高量および雄性では１００ｎｇ／日の１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃最
低量で完全に防止された。各データポイントは最低６匹および最高３２匹のマウ
スを表している。^「*」は１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃が与えられなかったマウスと比
較して統計的有意に相違する値であることを示している（ρ＜０．０５）。低カ
ルシウム飼料が与えられた雄性および雌性マウスは約８２〜８３％のＥＡＥ発生
率を有した（図２〜４）。低カルシウム飼料が与えられた雄性（ρ０．０７）お
よび雌性（ρ０．０８）両方のＥＡＥ発生率は高カルシウム飼料が与えられたマ
ウスより低かった（統計的有意差なし）。低食じ性カルシウムが１，２５−(Ｏ
Ｈ)₂Ｄ₃の産生を促進することは明確に証明されている（デルーカ、１９８３）
。高カルシウム飼料が与えられたマウスの血漿１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃値の範囲は
０．０６〜０．１８μｍｏｌ／Ｌ（血清）であり、低カルシウム飼料が与えられ
たマウスの数値範囲は０．１０〜０．３６μｍｏｌ／Ｌ（血清）であった。図３
は、１００ｇの飼料当たり４７０ｍｇのカルシウムを含有する飼料が与えられた
雄性および雌性マウスの１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃用量反応のグラフである。中カル
シウム含有飼料が与えられたマウスにおけるＥＡＥの発生率は、雄性については
９８％および雌性については９６％であった。ＥＡＥは、雌性では２００ｎｇ／
日の１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃最高量および雄性では４００ｎｇ／日の１，２５−(
ＯＨ)₂Ｄ₃最低量で完全に防止された。各データポイントは最低６匹および最高
２５匹のマウスを表している。^*１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃が与えられなかったマウ
スに対して統計的有意に相違する（ρ＜０．０５）。

【００４１】中食じ性カルシウムレベルは９５〜９９％の中間ＥＡＥ発生率を生じさせた（
図３）。

【００４２】低カルシウム飼料が与えられて１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃を用いて治療されたマウ
スは、１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃を用いて治療されなかったマウスと比較してＥＡＥ
発生率における４０〜４５％の統計的有意な（雄性ρ＜０．００７および雌性ρ
＜０．０５）低下を示した（図４）。図４は、１００ｇの飼料当たり２０ｍｇの
カルシウムを含有する飼料が与えられた雄性および雌性マウスの１，２５−(Ｏ
Ｈ)₂Ｄ₃用量反応のグラフである。低カルシウムを含有する飼料が与えられたマ
ウスにおけるＥＡＥの発生率は、雄性については８３％および雌性については８
２％であった。ＥＡＥは、雌性では２００ｎｇ／日の１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃最高
量および雄性では８００ｎｇ／日の１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃最低量で完全には防止
されなかった。低用量の１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃は、血清カルシウムの上昇を伴わ
ずにＥＡＥの発生率を雄性では３０％（ρ≦０．００７）および雌性では４５％
（ρ≦０．０５）へ低下させた。各データポイントは最低８匹および最高２２匹
のマウスを表している。^「*」は１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃が与えられなかったマウ
スと比較した統計的有意に相違する数値であることを示している（ρ＜０．０５
）。ＥＡＥ発生率の４０〜４５％の減少は、血清中カルシウム濃度の上昇を伴わ
ずに発生した（０．００２２±０．００２ｍｍｏｌ／Ｌ、図４）。

【００４３】１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃、血清カルシウムおよびＥＡＥの予防。食じ性カルシ
ウム含量が高い場合、雌性においては６ｎｇ／日の１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃でＥＡ
Ｅを予防できたが、雄性においては１００ｎｇ／日の１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃が必
要とされた（図２）。１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃がこれらの用量の場合、血清カルシ
ウム値は上昇した。中食じ性カルシウムレベルでは、ＥＡＥを予防するためには
雌性においては２００ｎｇ／日および雄性においては４００ｎｇ／日の１，２５
−(ＯＨ)₂Ｄ₃が必要とされた（図３）。飼料中のカルシウム含量が低い場合は、
ＥＡＥは１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃が高用量の場合でさえ予防されなかった。これら
の用量の１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃はカルシウム濃度を０．００２０±０．０００１
から０．００３２±０．０００２ｍｍｏｌ／Ｌ（カルシウム）へ統計的有意に上
昇させた（図４）。すべてのレベルの食じ性カルシウムで、持続性高カルシウム
血症には統計的有意な体重減少が結び付いていた（表１）。結局、雄性において
ＥＡＥを予防するためには雌性に比較して少なくとも４倍高い用量の１，２５−
(ＯＨ)₂Ｄ₃、および高カルシウム摂取の場合には１７倍高い用量の１，２５−(
ＯＨ)₂Ｄ₃が必要とされた。１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃治療マウスについては、ＥＡ
Ｅの全症状（開始日、麻痺のスコア）は発生率が低下するにつれて減少した（デ
ータは示されていない）。

【００４４】１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃、血清カルシウムおよび免疫反応。高カルシウム飼料
が与えられていたマウスに対する１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃治療は、リンパ球数の純
減少並びにＩＬ−４およびＴＧＦ−β１の発現上昇を生じさせた（カントーナら
、１９９８ｂ）。ＥＡＥを発生した対照マウスは、彼らの飼料中に含まれるカル
シウム量とは無関係にＬＮ中に３．５〜４．１×１０⁷個の細胞を有していた（
図５）。

【００４５】図５は、ＥＡＥ誘発３週間後のマウスの排出性ＬＮから回収可能な全細胞数に
１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃およびカルシウムが及ぼした作用の棒グラフである。雄性
Ｂ１０．ＰＬマウスから構成される群に、１００ｎｇの１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃を
添加したかまたは添加していない低、中、高カルシウム飼料を与え、ＥＡＥを誘
発した。実験は１群当たり６匹のマウスを用いて３回繰り返した。数値は３回の
実験から入手した数値の平均値±ＳＥである。^「*」は１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃で
治療されなかったマウスの数値と比較して統計的有意に相違する値であることを
示している（ρ＜０．０５）。

【００４６】ＥＡＥを有する１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃治療マウスのＬＮ中の総細胞数は低カル
シウム飼料が与えられた対照マウスと同一であったが、飼料にカルシウムを添加
すると劇的（ρ≦０．００１）に減少した（図５）。細胞表面解析は、食じ性カ
ルシウムまたは１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃治療とは無関係に、Ｔｈｙ−１陽性細胞が
ＬＮの５２〜５７％を構成し、ＣＤ４＋細胞はＬＮの４０〜４４％、さらにＣＤ
８＋細胞はＬＮの１８〜２１％であった。Ｇ３ＰＤＨｍＲＮＡ発現に１，２５
−(ＯＨ)₂Ｄ₃またはカルシウム治療が及ぼす作用は見られなかったので、このた
めＩＬ−４およびＴＧＦ−β１ｍＲＮＡレベルはＬＮ中の細胞当たりのＩＬ−
４およびＴＧＦ−β１レベルを反映している。飼料中のカルシウムの含量とは無
関係に、ＥＡＥを有する対照飼料が与えられたマウスのＬＮ中ではＩＬ−４はほ
とんど検出されなかった（図６）。

【００４７】図６は、ＬＮにおけるＩＬ−４およびＴＧＦ−β１転写に１，２５−(ＯＨ)₂
Ｄ₃およびカルシウムが及ぼした作用の棒グラフである。雄性Ｂ１０．ＰＬマウ
スから構成される群に、１００ｎｇの１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃を添加したかまたは
添加していない低、中、高カルシウム飼料を与え、ＥＡＥを誘発した。Ｇ３ＰＤ
Ｈ発現に１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃またはカルシウム飼料が及ぼす作用は見られなか
った。３回の実験中１回の代表的実験を提示する。各数値は６回のプールされた
マウスからの結果を示している。反応の全体の大きさは実験毎に相違したが、こ
れらは非常に再現可能な結果であった。

【００４８】１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃が与えられたマウスにおけるＩＬ−４産生は、それらに
低カルシウム飼料を与えていた場合には対照と相違しなかった。飼料中のカルシ
ウム含量が増加するにつれて産生するＩＬ−４量は増加したが、これは１，２５
−(ＯＨ)₂Ｄ₃を用いて治療されたマウスからの細胞中だけで見られた（図６）。
対照飼料が与えられたマウスのＬＮ中のＴＧＦ−β１レベルは１，２５−(ＯＨ) ₂ Ｄ₃が与えられたマウスにおけるレベルに比較して一様に低かった（図６）。食
じ性カルシウムはＴＧＦ−β１発現には作用を及ぼさなかった（図６）。ＩＬ−
４ｍＲＮＡ発現については、ＬＮ中に最小数の細胞を有するマウス（高カルシ
ウムに加えて１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃で治療された）が最大数のＩＬ−４を発現し
た。ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ発現については、１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃を用いて治
療された全マウスがＬＮ中の細胞数とは無関係に高レベルのＴＧＦ−β１を発現
した。

【００４９】考察食じ性カルシウムおよび１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃の作用はマウスにおけるＥＡＥ
の予防と決定的に関連している。マウスに高カルシウム（未精製飼料で所見され
るものに近い）を含有する飼料を与えると、適切な用量の１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃ はＥＡＥを予防することにおいて１００％有効である。これとは対照的に、飼料
からカルシウムを除去すると、１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃はＥＡＥの発生率を５０％
しか低下させなかった。中間レベルのカルシウムを与えると、１，２５−(ＯＨ) ₂ Ｄ₃の有効性は低カルシウム飼料と高カルシウム飼料との中間である。これらの
結果は、自己免疫疾患の予防および治療における１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃の作用に
カルシウムが関係していることを強く主張している（ホールダーおよびスワンボ
ルク、１９８２；パウエルら、１９９０）。

【００５０】低カルシウム飼料が与えられたマウスにおいて、１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃の用量
が顕性高カルシウム血症を引き起こすにもかかわらず、ＥＡＥの発生率の小さな
減少しか示さないかまたは全く減少を示さないことは興味深い。従って、カルシ
ウムの食じ性起源が欠如している場合、血清中カルシウムの１，２５−(ＯＨ)₂
Ｄ₃媒介性増加はＥＡＥのそれ以上の抑制に対して無効である。他方、高カルシ
ウム血症を惹起しないが、それでもＥＡＥの発生率を減少させる１，２５−(Ｏ
Ｈ)₂Ｄ₃の用量がある。総合すると、我々の試験結果は１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃が
ＥＡＥを抑制するためのカルシウム依存性機序およびカルシウム非依存性機序の
両方によって機能する可能性があることを主張している。

【００５１】食じ性カルシウムだけを操作してもＥＡＥに対する免疫反応に影響を及ぼさな
かった。ＥＡＥを有するマウスのＬＮ中の総細胞数は、１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃治
療マウスにおいて与えられた食じ性カルシウムの量と反比例していた。同様に、
胸腺萎縮が１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃誘発性高カルシウム血症の結果として発生した
（モハメドら、１９９６）。ＬＮ中の細胞数減少は、１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃誘発
性の細胞拡張減少または細胞死の増加が原因である可能性がある。与えられたカ
ルシウムの量に対応して、ＩＬ−４は増加したが、ＴＧＦ−β１は増加しなかっ
た。食じ性カルシウムを添加しなかった場合、１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃はＩＬ−４
拡張に作用を及ぼさなかった。１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃およびカルシウムは、実際
的にＩＬ−４を産生しない細胞の鑑別および／または発現を選択的に阻害する可
能性がある。その結果はＩＬ−４発現の増加であると思われる。このため、ＩＬ
−４発現は変化しなかったが、その代わりにＩＬ−４産生細胞の比率が上昇した
ことが考えられる。これとは逆に、ＴＧＦ−β１は食じ性カルシウムとは無関係
に１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃に反応して増加した。この所見は、ＴＧＦ−β１遺伝子
発現が１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃によって直接に調節される（カントーナら、１９９
８ｂ）ということを示唆した我々の以前の研究と一致している。カルシウムは重
要な細胞内メッセンジャーであるが、食じ性カルシウムが細胞内カルシウムにど
のように影響を及ぼすかについては不明である。免疫系調節剤としての１，２５
−(ＯＨ)₂Ｄ₃とカルシウムとの関係を理解するためにはより詳細な研究が必要と
される。

【００５２】我々は、低食じ性カルシウムがＥＡＥの発生率を減少させるが、同時にＥＡＥ
を予防することにおける１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃の有効性を低食じ性カルシウムは
減少させることに注目した。これらの実験で使用した動物はビタミンＤ欠乏性で
はないので、従ってビタミンＤおよび２５−ヒドロキシビタミンＤの貯蔵を含有
している。低食じ性カルシウムが１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃の産生を顕著に刺激する
ことはよく知られている（デルーカ、１９８３）。この内因性ホルモンは、ＥＡ
Ｅの発生率を低下させることにおいて重要な役割を果たす可能性がある。他方で
は、たとえ大量の１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃であってもこれらのマウスにおいてはＥ
ＡＥを完全には予防できないことは明白である。このため、低食じ性カルシウム
は複数の役割を果たすはずである。

【００５３】

【表１】

【００５４】参考文献アーバー，Ｎ．Ｃ．、ロス，Ｔ．Ｋ．、ツィアオールド，Ｃ．、プラール，Ｊ
．Ｍ．およびデルーカ，Ｈ．Ｆ．、「１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの大規
模測定のための高感受性方法」、Anal. Biochem. ２５５：１４８−１５４，１
９８８．

【００５５】バーラ，Ａ．Ｋ．、アネスト，Ｅ．Ｐ．、クレメンス，Ｔ．Ｌ．、ホリック，
Ｍ．Ｆ．およびクレイン，Ｓ．Ｍ．、「ヒト末梢血単核球中の１，２５−ジヒド
ロキシビタミンＤ₃に対する特異的高親和性受容体：単球中における存在および
活性化後のＴリンパ球における誘発」、J. Clin. Endocrinol. Metab. ５７：１
３０８−１３１０，１９８３．

【００５６】ブーヨン，Ｒ．、オカムラ，Ｗ．Ｈ．およびノーマン，Ａ．Ｗ．、「ビタミン
Ｄ内分泌系における構造機能関係」、Endocrine Rev. １６：２００−２３０，
１９９５．

【００５７】カントーナ，Ｍ．Ｔ．、ヘイズ，Ｃ．Ｅ．およびデルーカ，Ｈ．Ｆ．、「１，
２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃は再発性脳脊髄炎の進行を可逆的に遮断する」
、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９３：７８６１−７８６４，１９９６．

【００５８】カントーナ，Ｍ．Ｔ．、ヘイズ，Ｃ．Ｅ．およびデルーカ，Ｈ．Ｆ．、「１，
２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールはヒト関節炎のマウスモデルにおける
関節炎の進行を阻害する」、J. Nutr. １２８：６８−７２，１９９８ａ．

【００５９】カントーナ，Ｍ．Ｔ．、ウッドワード，Ｗ．Ｔ．、ヘイズ，Ｃ．Ｅ．およびデ
ルーカ，Ｈ．Ｆ．、「１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃は２種の抗脳炎誘発
性サイトカインであるＴＧＦ−β１およびＩＬ−４に対する正の調節剤である」
、J. Immunol. １６０：５３１４−５３１９，１９９８ｂ．

【００６０】チョムジンスキー，Ｐ．およびサッキ，Ｎ．、「酸性グアニジニウムチオシア
ネート−フェノール−クロロホルム抽出によるＲＮＡ単離のシングルステップ法
」、Anal. Biochem. １６２：１５６，１９８７．

【００６１】クーア，Ｄ．Ｊ．、ヒントン，Ｄ．Ｒ．およびシュトールマン，Ｓ．Ａ．、「
実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）耐性マウスにおける自己抗原誘発性Ｔｈ
２反応」、J. Immunol. １５５：４０５２−４０５９，１９９５．

【００６２】デルーカ，Ｈ．Ｆ．、「ビタミンＤ−カルシウム軸」、収録：「生体系におけるカルシウム」（ルービン，Ｒ．Ｐ．、ヴァイス，Ｇ．Ｂ．、＆パトニー，Ｊ
．Ｗ．，Ｊｒ．編集）、第４９１−５１１頁、１９８３．

【００６３】デルーカ，Ｈ．Ｆ．、「ビタミンＤの遺伝学および生物学」、収録：医用生物学の原理（Ｅ．Ｅ．ビターおよびＮ．ビター、編集）Greenwich, CT, JAI Press
, Inc.，第６１７−６４１頁、１９９７．

【００６４】グロースマン，Ｃ．Ｊ．、ローゼル，Ｇ．Ａ．およびメンデンホール，Ｃ．Ｌ
．、「自己免疫の性ステロイド調節」、J. Steroid Biochem. Molec. Biol. ４
０：６４９−６５９，１９９１．

【００６５】ヒュレット，Ｄ．Ａ．、カントーナ，Ｍ．Ｔ．、レダエッリ，Ｃ．、クラーゲ
ット−デーム，Ｍ．、ヘイズ，Ｃ．Ｅ．、マッキャリー，Ｌ．、フンパル−ウィ
ンター，Ｊ．、ゾリンガー，Ｈ．Ｗ．およびデルーカ，Ｈ．Ｆ．、「１，２５−
ジヒドロキシビタミンＤ₃による同種移植片生存の延長」、Transplantation ６
６：８２４−８２８，１９９８．

【００６６】レミーレ，Ｊ．Ｍ．およびアーチャー，Ｄ．Ｃ．、「１，２５−ジヒドロキシ
ビタミンＤ₃はマウス実験的自己免疫脳脊髄炎の生体内誘発を防止する」、J. Cl in. Invest. ８７：１１０３−１１０７，１９９１．

【００６７】モハメド，Ｍ．Ｉ．、ベックマン，Ｍ．Ｊ．、ミーハン，Ｊ．およびデルーカ
，Ｈ．Ｆ．、「１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃がマウス胸腺に及ぼす作用
；細胞外カルシウムの役割」、Biochim. Biophys. Acta. １２８９：２７５−２
８３，１９９６．

【００６８】パイク，Ｊ．Ｗ．、「ビタミンＤ₃レセプター：転写における構造および機能
」、Ann. Rev. Nutr. １１：１８９−２１６，１９９１．

【００６９】プロベッディーニ，Ｄ．Ｍ．、ツォーカス，Ｄ．Ｃ．、デフトス，Ｌ．Ｊ．お
よびマノラガス，Ｓ．Ｃ．、「ヒト白血球中の１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ₃レセプター」、Science ２２１：１１８１−１１８３，１９８３．

【００７０】ロスナー，Ｂ．、「仮説試験：生物統計学の基本におけるカテゴリーデータ」
、第２版（ペインＭ．編集）、Boston, Duxbury Press, 第３０２−３１７頁
、１９８６．

【００７１】ロス，Ｔ．Ｋ．、ダルウィッシュ，Ｈ．Ｍ．およびデルーカ，Ｈ．Ｆ．、「ビ
タミンＤ作用の分子生物学」、収録：ビタミン類及びホルモン類（Ｇ．リトヴァ
ック編集）、SanDiego：Academic Press, 第２８１−３２６頁、１９９４．

【００７２】ジーベルト，Ｐ．Ｄ．およびラリック，Ｊ．Ｗ．、「競合的ＰＣＲ」、Nature ３５９：５５７−５５８．

【００７３】ジーベルト，Ｐ．Ｄ．およびラリック，Ｊ．Ｗ．、「ＰＣＲ模擬体：定量的Ｐ
ＣＲにおける内標準として使用するための競合的ＤＮＡフラグメント」、Bio Te chniques １４：２４４−２４９，１９９３．

【００７４】スミス，Ｓ．Ｍ．、レヴィ，Ｎ．Ｓ．およびヘイズ，Ｃ．Ｅ．、「ビタミンＡ
欠乏性マウスにおける免疫不全」、J. Nutr. １１７：８５７−８６５，１９８
７．

【００７５】ヤン，Ｓ．、スミス，Ｃ．、プラール，Ｊ．およびデルーカ，Ｈ．Ｆ．、「ビ
タミンＤ欠乏症は生体内での細胞性免疫を抑制する」、Arch. Biochem. Biophys . ３０３：９８−１０６，１９９３．

【図面の簡単な説明】

【図１】雄性および雌性Ｂ１０．ＰＬマウスにおけるＥＡＥの発生率および重症度のグ
ラフである。

【図２】１００ｇの飼料当たり１ｇのカルシウムを含有する飼料が与えられた雄性およ
び雌性マウスの１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃用量反応のグラフである。

【図３】１００ｇの飼料当たり４７０ｍｇのカルシウムを含有する飼料が与えられた雄
性および雌性マウスの１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃用量反応のグラフである。

【図４】１００ｇの飼料当たり２０ｍｇのカルシウムを含有する飼料が与えられた雄性
および雌性マウスの１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃用量反応のグラフである。

【図５】ＥＡＥ誘発３週間後のマウスの排出性ＬＮから回収可能な総細胞数に１，２５
−(ＯＨ)₂Ｄ₃およびカルシウムが及ぼした作用の棒グラフである。

【図６】ＬＮにおけるＩＬ−４およびＴＧＦ−β１転写に１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃および
カルシウムが及ぼした作用の棒グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 33/42 Ａ６１Ｋ 33/42 Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/00 43/00 １２１ 43/00 １２１ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者カントーナ，マルゲリタテイ．アメリカ合衆国 16803 ペンシルベニアステートカレツジフランクリンストリート 622 (72)発明者フンパル−ウインター，ジーンアメリカ合衆国 53995 ウイスコンシンポイネツトカントリーロードシーエスダブリュ7810 Ｆターム(参考） 4C086 AA01 AA02 DA15 DA16 HA04 HA19 MA02 MA04 MA52 NA05 NA14 ZA02 ZC75

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】多発性硬化症の症状を減少させるために有効である量の、カ
ルシウムサプリメントおよびビタミンＤ化合物を投与するステップを備える多発
性硬化症患者を治療する方法であって、カルシウムの量がビタミンＤ化合物の投
与の作用を増強するために有効であることを特徴とする前記方法。
【請求項２】前記カルシウムサプリメントの量が患者１人当たり１日当た
り０．５〜２ｇであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記カルシウムの量が少なくとも１ｇであることを特徴とす
る請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記カルシウムおよびビタミンＤ化合物の投与が同時である
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記ビタミンＤ化合物が１α，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ₃（１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃）、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシビタミン
Ｄ₂（１９−ノル−１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃）、２４−ホモ−２２−デヒドロ−２
２Ｅ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（２４−ホモ−２２−デヒドロ−
２２Ｅ−１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃）、１，２５−ジヒドロキシ−２４（Ｅ）−デヒ
ドロ−２４−ホモ−ビタミンＤ₃（１，２５−(ＯＨ)₂−２４−ホモ−Ｄ₃）、１
９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２１−エピ−ビタミンＤ₃（１９−ノル−
１，２５−(ＯＨ)₂−２１−エピ−Ｄ₃）、１αヒドロキシビタミンＤ₃および１
αヒドロキシビタミンＤ₂からなる群から選択されることを特徴とする請求項１
に記載の方法。
【請求項６】前記ビタミンＤ化合物が１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃であることを
特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】前記ビタミンＤ化合物が下記の式を有することを特徴とする
請求項１に記載の方法、【化１】［式中、Ｘ¹およびＸ²は各々水素およびアシルからなる群から選択され；Ｙ¹お
よびＹ²はＨであってよく、または炭素数１〜４のＯ−アリール、Ｏ−アルキル
、アリール、アルキルであってよく、あるいはＹ¹およびＹ²は一緒になって【化２】〔式中Ｂ₁およびＢ₂は、Ｈ、炭素数１〜４のアルキルおよびアリールからなる群
から選択でき、およびβまたはα構造を有していてよい〕で示される構造を有す
るアルケンを形成し得る；Ｚ¹＝Ｚ²＝ＨであるかまたはＺ¹およびＺ²は一緒にな
って＝ＣＨ₂であり；Ｒはアルキル基、ヒドロキシアルキル基もしくはフルオロ
アルキル基であるか、またはＲは下記の側鎖：【化３】〔式中、（ａ）はＳまたはＲ構造であり、Ｒ¹は水素、ヒドロキシまたはＯ−ア
シルを表し、Ｒ²およびＲ³は各々アルキル、ヒドロキシアルキルおよびフルオロ
アルキルからなる群から選択されるか、またはＲ²およびＲ³は一緒になってｍが
２〜５の値を有する整数である−(ＣＨ₂)_m−基を表しており、Ｒ⁴は水素、ヒド
ロキシ、フッ素、Ｏ−アシル、アルキル、ヒドロキシアルキルおよびフルオロア
ルキルからなる群から選択され、このときＲ⁵がヒドロキシルまたはフルオロの
場合はＲ⁴は水素またはアルキルでなければならず、Ｒ⁵は水素、ヒドロキシ、フ
ッ素、アルキル、ヒドロキシアルキルおよびフルオロアルキルからなる群から選
択されるか、またはＲ⁴およびＲ⁵は一緒になって二重結合酸素を表し、Ｒ⁶およ
びＲ⁷は一緒になって炭素−炭素二重結合を形成し、Ｒ⁸はＨまたはＣＨ₃であっ
てよく、ｎは１〜５の値を有する整数であり、側鎖における第２０、２２または
２３位のいずれか１つの炭素はＯ、ＳまたはＮ原子に置換されてもよい〕を示しうる］。
【請求項８】前記カルシウムが炭酸カルシウム、酢酸カルシウム、クエン
酸カルシウムおよびリン酸カルシウムからなる群から選択される形態であること
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】前記患者が女性であることを特徴とする請求項１に記載の方
法。
【請求項１０】前記カルシウムが炭酸カルシウム、酢酸カルシウム、クエ
ン酸カルシウムおよびリン酸カルシウムからなる群から選択される形態であるこ
とを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】前記カルシウムおよびビタミンＤ化合物の投与が同時であ
ることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１２】前記カルシウムサプリメントの量が患者１人当たり１日当
たり０．５〜２ｇであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１３】前記カルシウムの量が少なくとも１ｇであることを特徴と
する請求項７に記載の方法。
【請求項１４】所定量のカルシウムおよびビタミンＤ化合物を含有してな
る薬学的組成物であって、該カルシウムの量が多発性硬化症の症状を減少させる
ためにビタミンＤ化合物の有効性を最大化することを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１５】前記ビタミンＤ化合物が０．５μｇ〜１０μｇで、前記カ
ルシウムが０．５〜２ｇであることを特徴とする請求項１４に記載の薬学的組成
物。
【請求項１６】前記ビタミンＤ化合物が１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃であること
を特徴とする請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】前記ビタミンＤ化合物が１９ノル１，２５ジヒドロキシビ
タミンＤ₂であることを特徴とする請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】前記ビタミンＤ化合物が１αジヒドロキシビタミンＤ₃で
あることを特徴とする請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】前記ビタミンＤ化合物が１αジヒドロキシビタミンＤ₂で
あることを特徴とする請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】前記ビタミンＤ化合物が１α，２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤ₃（１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃）、１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシビタミ
ンＤ₂（１９−ノル−１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃）、２４−ホモ−２２−デヒドロ−
２２Ｅ−１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ₃（２４−ホモ−２２−デヒドロ
−２２Ｅ−１，２５−(ＯＨ)₂Ｄ₃）、１，２５−ジヒドロキシ−２４（Ｅ）−デ
ヒドロ−２４−ホモ−ビタミンＤ₃（１，２５−(ＯＨ)₂−２４−ホモ−Ｄ₃）、
１９−ノル−１，２５−ジヒドロキシ−２１−エピ−ビタミンＤ₃（１９−ノル
−１，２５−(ＯＨ)₂−２１−エピ−Ｄ₃）、１αヒドロキシビタミンＤ₃および
１αヒドロキシビタミンＤ₂からなる群から選択されることを特徴とする請求項
１４に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】前記カルシウムが炭酸カルシウム、酢酸カルシウム、クエ
ン酸カルシウムおよびリン酸カルシウムからなる群から選択される形態であるこ
とを特徴とする請求項１４に記載の薬学的組成物。