DE60030104T2

DE60030104T2 - Kultivierung von zygomyceten aus sulfitablaugen

Info

Publication number: DE60030104T2
Application number: DE60030104T
Authority: DE
Inventors: Lars Edebo
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-04-16
Filing date: 2000-04-14
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2020-04-15
Also published as: US20020025571A1; AU4445200A; SE9901351L; ATE336566T1; EP1171575B1; WO2000063344A1; US6627430B2; DE60030104D1; EP1171575A1; SE521726C2; SE9901351D0

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Chitin-/Chitosanreichen filamentösen Pilzen mit der Kapazität zur Assimilierung von Mannose sowie Xylose, Galactose und Glucose für eine weitere Herstellung einer porösen Struktur, die Zellwände aufweist, die gute Absorptionsfähigkeit haben, sowie eine von Zuckern befreite Schwarzlauge.
Hintergrund
In der traditionellen Biotechnologie ist es das Ziel, einen Organismus zu verwenden, um ein gewerblich oder industriell wertvolles Produkt herzustellen. Dieses könnte eine Substanz mit hoher biologischer Wirksamkeit und hohem Wert wie etwa ein Antibiotikum oder ein Hormon sein. Auch weniger wertvolles Material wie etwa einzelliges Protein oder einzelliges Öl werden hergestellt. Je höher der Wert des Erzeugnisses, um so geringer ist die Wichtigkeit der Kosten des Mediums und der Rückgewinnung von Nebenprodukten. Wenn der Handelswert des Erzeugnisses niedrig ist, wird die Wirtschaftlichkeit des Prozesses verbessert durch die Entwicklung eines Systems, das aus einem billigen Substrat, einem kostengünstigen Herstellungsverfahren und der Verwendung mehrerer Erzeugnisse aus dem Verfahren besteht, und zwar sowohl solchen, die durch die Biosynthese erzeugt werden, als auch solchen, die in dem für die Kultivierung eingesetzten Medium verbleiben, da der Kultivierungsprozeß unerwünschte Komponenten eventuell aus dem Kultivierungsmedium entfernt hat.
Bei dem Herstellungsverfahren für Papierstoff aus Holz im Sulfitverfahren wird ungefähr die Hälfte des Holzes in der Sulfitlauge als Lignosulfonat zu 60%, Zucker zu 20% und anderes Material zu 20% extrahiert. Die hauptsächlichen Zucker sind Mannose, Xylose, Galactose und Glucose. Xylose ist eine Pentose, und die anderen sind Hexosen. Die Hexosen werden ohne weiteres mit Hefe, Saccharomyces cerevisiae, in Ethanol fermentiert, wogegen die Pentosen nur fermentiert werden, wenn die Hefe genetisch modifiziert ist. Xylose ist in Hartholz besonders reichlich vorhanden. Außerdem sind das Entfernen der Hefe mittels Zentrifugierung und die Rückgewinnung von Ethanol durch Destillierung teure Prozesse, so daß der Gesamtprozeß enge Wirtschaftlichkeitsspannen hat.
Lignosulfonat kann durch Verdampfen eingeengt und zum Binden in Tierfutter und Beton eingesetzt werden. In Tierfutter kann ein Teil des Zuckers von dem gefütterten Tier als Nährstoff genutzt werden, aber die Konzentration von zu verwendenden Zuckern ist relativ gering.
Wenn Lignosulfonat zum Binden und zur Dispersion in Beton verwendet wird, verzögert die Anwesenheit von Zuckern die Aushärtung. Daher werden verschiedene Verfahren entwickelt, um die Zucker zu entfernen.
Im Gegensatz zu Hefen wachsen Schimmelpilze als Filamente und können aus flüssigen Medien durch einfaches Absieben geerntet werden. Von Zygomycetes-Schimmelpilzen ist bekannt, daß sie auf feuchtem Holz gut wachsen und Atemwegsallergien bei Sägewerksarbeitern verursachen.
Bestimmte Zygomycetes-Spezies, insbesondere Rhizopus oligosporus und R. oryzae, werden seit langer Zeit in Südostasien zur Lebensmittelherstellung eingesetzt, insbesondere für Tempeh, was einem aus Soja hergestellten Camembert ähnelt. Außerdem werden Zygomycetes für die Herstellung einer großen Zahl von extrazellulären und intrazellulären Enzymen eingesetzt. Eine taxonomische Eigenschaft von Zygomycetes ist, daß die Zellfäden (Filamente) keine Septen haben, was sie zu mikroskopischen Röhren macht. Eine andere Eigenschaft ist, daß ihre Zellwände sehr hohe Konzentrationen an Chitin/Chitosan in einem Netzwerk wie einen Mikroschwamm enthalten. Es wurde bereits gefunden, daß diese Zellwände sehr gute Bindungseigenschaften für diverse Arten von biologischem Material, das negativ geladen ist ( EP 0 494 950 B1 ) sowie für Wasser (schwedische Patentanmeldung 9801373-3) haben; das Material hat außerdem eine antimikrobielle Wirkung. Die Wasserbindungsfähigkeit liegt im gleichen Bereich wie superabsorbierendes Polyacrylat. Die Polyacrylate sind petrochemische Erzeugnisse, die durch Kompostieren nur schwer abzubauen sind, wogegen das Zellwandmaterial aus erneuerbaren Quellen besteht und ohne weiteres in der Umgebung abgebaut wird. Infolgedessen wird das Zellwandmaterial für hygienische und infektionshemmende Zwecke genützt (schwedische Patentanmeldung 9801373-3).
Romano et al., Industrial Waste Conference 14 Lafayette 1959, Lafayette, Ind. 1960, S. 711–722, Conversionof Spent Sulphite Liquor Sugars to Fumaric Acid by Thizopus Species, betrifft die Bildung von Fumarsäure unter Einsatz großer Impfstoffmengen, die aus einem glucosehaltigen Medium gezüchtet sind, das 10% des Mediumvolumens entspricht (vgl. Seite 717, nad Tabellen V, VI und VII). Dies bedeutet, daß das Wachstum gering war, was auch in der Tabelle II gezeigt ist, wo das Myzel durch Züchten auf herkömmlich glucosereichem Nährmedium erzeugt ist. Es wurde die Gesamtzuckernutzung, jedoch nicht diejenige der verschiedenen Zucker untersucht unter Einsatz von Sulfitlauge aus Fichtenholz, das eine relativ niedrige Xylosekonzentration hat, so daß aus den angegebenen Daten keine Rückschlüsse in bezug auf die Xylosenutzung gezogen werden können. Mit den zu der Zeit verfügbaren Informationen wurden die oben angegebenen Schlußfolgerungen erhalten.
Applied and Environmental Microbiology, Mai 1999, S. 1078–1082, "Decolorization and detoxification of ..." betrifft im wesentlichen die "Decolorization and Detoxification of Extraction-Stage Effluent from Chlorine Bleaching of Kraft Pulp by Rhizopus oryzae". Dort wird auch eine 50% Reduktion von COD angegeben, aber es werden keine Untersuchungen in bezug auf die Auswirkung auf verschiedene Zucker berichtet, woraus zu entnehmen ist, daß keine Rückschlüsse in bezug auf Xylose gezogen werden können. Das Wachstum des Pilzes war nicht sehr gut, so daß die Forscher verschiedene Kosubstrate getestet haben.
Berezina G. O. et al., Dialog Information services Eile 240, "Production of organic acids from hydrolysate media" betrifft somit die Erzeugung organischer Säuren aus Hydrolysatmedium, hauptsächlich Milchsäure und Oxalsäure. Es sind keine Aussagen über den Verbrauch an Xylose verfügbar.
Chemistry and Biology Research Institute, Ottawa, Nr. 1410, S. 27–31, "Growth of Scytalidium acidophilum on ..." betrifft somit die Züchtung von Scytalidium acidophilum auf definierten Nährmedien, Molke und Sulfitabprodukt. Scytalidium ist derzeit als ein Hyphomycetales (ein Sammelname von Pilzen, in denen keine teleomorphe Phase gefunden wurde; diese Pilze sind hauptsächlich Ascomycetes, einige sind Basidiomycetes; siehe G. S. de Hoog, J. Guarro, J. Gene, M. J. Figueras, Atlas of Clinical Fungi, 2nd edition, 2000, Centralbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands; Universitat Rovira i Virgiii, Reus, Spanien) klassifiziert. Da Scytalidium durch septierte Zellfäden charakterisiert ist, ist es kein Zygomycetes.
Es gibt also Bedarf für ein Verfahren, das die Nachteile der derzeitigen Sulfitablauge umwandeln kann, weil diese ein Umweltproblem ist, wenn sie als solche in die Umgebung abgegeben wird, und für die Nutzung des Lignosulfonats aufgrund der Anwesenheit von Zuckern nicht optimal ist.
Die vorliegende Erfindung nutzt die Züchtung von Zygomycetes unter Verbrauch von Zuckern. Die Zygomycetes-Züchtung wird primär für die Herstellung von Zellwandmaterial genutzt. Die tatsächliche Nutzung eines eßbaren Schimmelpilzes wird jedoch letztlich sowohl eine Reihe von Produkten als auch eine Reihe von Metaboliten brauchbar machen, z.B. könnte Milchsure rückgewonnen werden.
Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung von Zygomycetes für die Herstellung eines Materials, das aus einer porösen Struktur von Zellwänden besteht mit hoher Fähigkeit zum Absorbieren und Transportieren von Flüssigkeit, insbesondere Wasser, und guter Bindungskraft für Biomakromoleküle und Zellen, die Mikroorganismen aufweisen. Bei diesem Verfahren wird die Sulfitablauge aus der Papierstoffindustrie von seinem Zuckergehalt befreit.
Insbesondere ist die Erfindung gekennzeichnet durch die Kultivierung von nichttoxischen filamentösen Zygomycetes-Pilzen mit der Fähigkeit zur Assimilierung von Xylose in Begleitung von Hexosen in einem Medium, das eine Flüssigkeit umfaßt, die aus Pflanzenmaterial bei der Herstellung von Papierstoff extrahiert ist und aus Mannose, Xylose, Galactose und Glucose enthaltender Ablauge besteht, wobei die filamentösen Pilze aus dem Medium isoliert werden, das gelöste Metaboliten umfaßt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das flüssige Pflanzenmaterial-Hydrolysat Papierzellstoffsulfitlauge.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist jedwede antimikrobielle Aktivität, die in den flüssigen Pflanzenmaterial-Hydrolysaten vorliegt, eliminiert worden.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält das flüssige Pflanzenmaterial-Hydrolysat Calcium.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das flüssige Pflanzenmaterial-Hydrolysat als Medium zur Kultivierung der Pilze mit mindestens einer Stickstoff- und mindestens einer Phosphatquelle versetzt worden.
Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Metabolit Ethanol.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Flüssigkeit eine Calcium-Sulfit-Lauge.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Flüssigkeit konzentrierte Sulfit-Lauge (Trockenstoffgehalt 50%), die mit Wasser verdünnt worden und mit mindestens einer Stickstoff- und mindestens einer Phosphatquelle versetzt worden ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Flüssigkeit Ammonium-Sulfit-Papiermühlenlauge, die mit mindestens einer Phosphatquelle versetzt worden ist.
Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die Sulfit-Lauge eine Konzentration an Trockensubstanz von mindestens 20% (Gew./Gew.) auf.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform gehört der Pilz zu der Spezies Rhizopus oryzae und ist vorzugsweise der Stamm Rhizopus oryzae CCUG 28958.
Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Metabolit Lactat.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das Lactat als unlösliches Ca-Lactat gewonnen.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Ca-Lactat faserförmig.
Es wird ein Extraktionsverfahren angewandt, das den Zellgehalt (Protoplasma) entfernt und die Zellwände öffnet, so daß ein mikroporöses Netzwerk gebildet wird; alternativ kann die frühere Zellwand von einer großen Zahl von feinverteilten Filamenten umgeben sein. Die Pilzzellwände existieren hauptsächlich als Mikroröhrchen (Kapillaren), und die große Zahl von Mikroröhrchen verleiht dem Material ein filamentöses Aussehen.
Das poröse Zellwandmaterial wird von einem Pilz erhalten, der beispielsweise zu der Abteilung Zygomycota gehört und einen hohen Anteil an Hexosamin enthält. Das Pilzzellmaterial kann zerfallen sein und wird mit Chemikalien extrahiert, so daß eine Suspension gebildet wird. Alternativ wird das Zellmaterial unmittelbar extrahiert. Die Suspension wird dann auf solche Weise getrocknet, daß das resultierende Material eine poröse Struktur erhält, beispielsweise durch Lufttrocknen, Sprühtrocknen oder bevorzugt Gefriertrocknen. Das resultierende Material erhält ein spezielles Kapillarsystem, das imstande ist, große Flüssigkeitsmengen zu absorbieren und zu transportieren. Es kann außerdem Proteine und andere Makromoleküle sowie Zellen als Bakterien und Hefen adsorbieren. In diesem Zusammenhang bedeutet porös, daß das Material große Mengen an Luft enthält. Somit hat es eine geringe Dichte, 0,1 g/cm³, bevorzugt höchstens 0,05 g/cm³. Da die Bindungsfähigkeit des Materials stark von einem sauren pH-Wert abhängig ist, ist es sehr wichtig, daß das Gegenion (Anion) nichtflüchtig ist. Ein sehr nützliches Anion ist Lactat, da es nichtflüchtig ist und für Anwendungen auf der Haut umfangreich im Einsatz ist. Es wird unter den vorliegenden Bedingungen sogar von Rhizopus produziert.
Nach dem Gefriertrocknen enthält das Material einen hohen Luftanteil, der durch Flüssigkeit, Makromoleküle und Zellen, z.B. Mikroorganismen, ersetzt werden kann. Infolgedessen kann die poröse Pilzzellwandstruktur als Absorptionsmittel für Flüssigkeit sowie Moleküle, Partikel und Zellen eingesetzt werden. Nach der Absorption von Wasser behält das Material seine ursprüngliche Form, wie sie vor dem Gefriertrocknen vorgegeben war, und zeigt keine Anzeichen von Zerfall, und zwar auch nicht nach langer Zeit (> 1 Woche). Aufgrund des feinen Kapillarsystems des Materials hat es eine gute Fähigkeit, die Flüssigkeit zu verteilen, ohne daß andere Fasern hinzugefügt werden müssen.
Das Material kann so, wie es ist, getrocknet oder an eine andere Oberfläche gebunden werden. Diese Oberfläche kann ein Schaumstoff, eine Folie oder Fasern sein, z.B. Cellulose- oder synthetische Fasern. Wenn die Faser absorptionsfähig ist, wird hauptsächlich eine Absorptionsfähigkeit für Flüssigkeiten erhalten. Wenn die Faser aus Kunststoff hergestellt ist, tritt die Fähigkeit zur Adsorption von Makromolekülen und Mikroorganismen stärker hervor. Das Material kann auch nach dem Trocknen an einer Oberfläche befestigt werden. Es kann auch nach dem Zersetzen der Zellwandfilamente etwa durch Gefrierpressen an einer Oberfläche adsorbiert werden.
Ferner kann das Material mit polaren oder negativ geladenen Makromolekülen wie etwa bestimmten Proteinen und Polysacchariden dotiert werden. Durch das Dotieren werden dem Material neue Eigenschaften hinzugefügt. Wenn das Material mit einem Enzym dotiert ist, gewinnt das Material eine enzymatische Wirksamkeit.
Genaue Beschreibung der vorliegenden Erfindung
Um Zygomycetes-Stämme mit guter Fähigkeit zur Nutzung der in Sulfit-Lauge vorhandenen Zucker zu finden, wurden 30 Stämme, die 10 Spezies repräsentieren, in bezug auf die Assimilierung von 10 verschiedenen Zuckern einschließlich Mannose, Xylose, Galactose und Glucose getestet. Die Ergebnisse zeigten deutlich, daß es große Unterschiede zwischen den Spezies und auch zwischen Stämmen der gleichen Spezies in bezug auf Wachstum aus den verschiedenen Zuckern gab. Es war außerdem offensichtlich, daß bestimmte Zucker wie Glucose und Mannose von einer großen Zahl von Zygomycetes-Stämmen assimiliert wurden, wogegen andere Zucker weniger leicht assimiliert wurden. Von besonderem Interesse in diesem Zusammenhang war, daß Xylose, die eine Pentose ist und nicht mit den üblichen Hefen fermentiert ist, die für die Ethanolerzeugung eingesetzt werden, von einigen wenigen Zygomycetes-Stämmen assimiliert werden konnte, und zwar auch von solchen, die zu eßbaren Spezies gehörten. Ein besonders nützlicher Stamm ist Rhizopus oryzae CCUG 28958.
Wenn Rhizopus oryzae CCUG 28958 und einige weitere Stämme in mit einer Stickstoffquelle und einer Phosphatquelle versetzte Sulfit-Lauge von verschiedenen Papiermühlen eingeimpft wurde, wurde gefunden, daß die Eigenschaft der Förderung des Wachstums der Zygomycetes-Stämme zwischen verschiedenen Flüssigkeiten erheblich unterschiedlich war. Ferner förderten weder konzentrierte Sulfit-Lauge (Trockengewicht 50%) noch frische Sulfit-Lauge (Trockengewicht 10%) das Wachstum, aber wenn konzentrierte Sulfit-Lauge mit ihrem vierfachen Volumen von Wasser verdünnt wurde (Trockengewicht 10%), fand sehr gutes Wachstum statt, was bedeutet, daß frische Sulfit-Lauge antifungale Substanzen enthielt und der osmotische Effekt von konzentrierter Lauge inhibierend war.
Es ist also möglich gewesen, eßbare, chitin-/chitosanreiche filamentöse Schimmelpilze in Sulfit-Lauge mit überraschend hoher Ausbeute zu kultivieren. Bisher sind nahezu alle Hexosen (ca. 98%) in der Sulfit-Lauge verbraucht worden sowie der größte Teil der Xylose (ca. 80%), wogegen Arabinose, die den kleinsten Anteil zu Beginn bildete, anscheinend unbeeinflußt blieb.
Somit erzeugt die vorliegende Erfindung mindestens zwei wertvolle Ergebnisse durch die Kultivierung von eßbarem Pilzmyzel auf Sulfit-Lauge, die ein umweltschädigendes Nebenprodukt bei der Herstellung von Papierzellstoff sein kann. Da Sultif-Lauge in geringen Mengen zum Binden von Futter verwendet worden ist, das von für die menschliche Nahrung bestimmten Tieren aufgenommen wurde, scheint der gesamte Prozeß frei von toxischen Verbindungen zu sein und könnte für Nahrungsmittel- und andere Anwendungsgebiete angewandt werden, die mit dem menschlichen und tierischen Körper zusammenhängen.

1. Die Kultivierung resultiert im Entfernen von Zuckern, primär Mannose, Xylose, Galactose und Glucose, aus der Sulfit-Lauge, so daß der Wert des verbleibenden Lignosulfonats, das in bezug auf Molekulargewicht usw. unbeeinflußt scheint – als Verflüssiger und Binder in Beton gesteigert wird.
2. Gleichzeitig erzeugt die Kultivierung Myzel, das als Quelle von Zellwandmaterial mit absorbierenden Eigenschaften, wie oben ausgeführt, verwendet werden kann. Andere Zellbestandteile wie z.B. Enzyme und Omega-3-Fettsäuren können rückgewonnen werden. Da eßbare Pilzarten in einem nichttoxischen Medium kultiviert werden, könnten verschiedene Bestandteile mit Nährstoffeigenschaften, pharmakologischen und katalytischen Eigenschaften rückgewonnen und in enger Verbindung mit dem menschlichen Körper eingesetzt werden. Ferner könnten Metaboliten wie z.B. Milchsäure in das Medium freigesetzt und auf einfache Weise z.B. als unlösliches Ca-Lactat rückgewonnen werden.

Poröses Zellwandmaterial mit hoher Absorptionsfähigkeit für Wasser, Proteine, Zellen und andere negativ geladene Verbindungen sind reich an Chitosan/Chitin, die Polymere von Glucosamin und N-Acetylglucosamin sind. Schimmelpilze, die zu der Abteilung Zygomycota mit den Gattungen Absidia, Mucor und Rhizopus gehören, sind verwendet worden. Nach der Kultivierung wird das Pilzmyzel extrahiert, um Lipide, Proteine, Nucleinsäuren und lösliches Chitosan zu entfernen. Das Myzel könnte z.B. durch Gefrierpressen zerkleinert werden, um die Extraktion zu vereinfachen. Organische Lösungsmittel, z.B. heißes Ethanol, könnten für die Extraktion von Lipiden eingesetzt werden. Heiße alkalische Flüssigkeiten wie Natriumhydroxid könnten eingesetzt werden, um Proteine und Nucleinsäuren zu extrahieren, und diese Extraktion könnte durch den Einsatz von hydrolysierenden Enzymen erleichtert werden. Lösliches Chitosan könnte mit Säuren wie etwa Essigsäure extrahiert werden.
Es ist auch möglich, die Extraktion des Myzels direkt auszuführen, beginnend mit alkalischen Flüssigkeiten bei höheren Temperaturen, gefolgt von Additiven. Dann wird eine Suspension von Zellwandmaterial erhalten. Methoden für die Herstellung der Suspension sind in dem schwedischen Patent SE-C-465678 und der schwedischen Patentanmeldung 9801373-3 beschrieben. Dieses Verfahren ist nur ein Beispiel, und die Erfindung ist nicht auf Strukturen beschränkt, die mit diesem Verfahren erzeugt werden.
Die Suspension wird auf solche Weise getrocknet, daß das Material eine poröse Struktur erhält, z.B. durch Lufttrocknen oder Sprühtrocknen, aber bevorzugt durch Gefriertrocknen. Wenn man das Material an der Luft trocknen läßt, wird gewöhnlich eine weniger poröse Struktur erhalten, so daß das Material seine Leichtheit verliert.
Die Trocknungsbedingungen können verbessert werden durch Einmischen bestimmter Additive in die Suspension. Ein Alkohol wie beispielsweise Isopropanol kann zugefügt werden, was zum Trocknen durch Lösungsmittelaustausch führt. Ein grenzflächenaktives Mittel, beispielsweise Triton X-100, kann zugefügt werden, um die Oberflächenspannung der Suspension zu verringern. Das Material wird gewöhnlich bei sauren pH-Werten, bevorzugt pH 3–5, verwendet, um die Protonierung des Zellwandmaterials zu fördern, und weitere Substanzen können zugegeben werden, um die Ladung und die Polarität des Materials zu beeinflussen. Die Stabilität des Materials an Umgebungsluft wird gefördert, wenn ein nichtflüchtiges Anion, beispielsweise Lactat anstatt des flüchtigen Acetats als Gegenion in dem positiv geladenen Zellwandmaterial verwendet wird.
Auch Makomoleküle wie Proteine, z.B. Enzyme oder geladene Polysaccharide wie Heparin können der Suspension zugefügt werden. Dann erhält das Material im Verhältnis zu dem, was hinzugefügt wurde, neue Eigenschaften.
Wenn beispielsweise Enzym hinzugefügt wird, wird Material mit Enzymaktivität erhalten. Das resultierende Material erhält, insbesondere nach dem Gefriertrocknen, ein spezielles Kapillarsystem, das große Flüssigkeitsmengen absorbieren und transportieren kann. Wegen seiner porösen Struktur hat es geringe Dichte, die höchstens 0,1 g/cm³, bevorzugt 0,05 g/cm³ beträgt. Infolgedessen enthält das Material große Luftmengen, die gegen Flüssigkeit oder biologisches Material ausgetauscht werden können. Daher ist die poröse fungale Zellwandstruktur ein ausgezeichnetes Absorptionsmittel. Die Struktur kann freies Quellen vertragen, wobei das Material seine dreidimensionale Gestalt nach freiem Quellen in Wasser beibehält und keine Anzeichen von Zerfall/Auflösung auch nach langer Zeit (> 1 Woche) zeigt. Aufgrund des feinen Kapillarsystems der Struktur hat sie auch die Fähigkeit, die Flüssigkeit zu verteilen, ohne daß zusätzliche Fasern notwendig sind. Das Material absorbiert mindestens 15 ml/g von 1% NaCl.
Das Material kann große Flüssigkeitsmengen rasch transportieren, was in einem Material stattfindet, das weitgehend aus Luft besteht. Das Leervolumen ist wenigstens 80%, bevorzugt wenigstens 90% und stärker bevorzugt 95%.
Gewöhnlich sind solche Materialien mit geringer Dichte durch eine hohe Absorptionsfähigkeit bei aktiver Zugabe von Flüssigkeit, jedoch eine schlechte Kapazität für den Transport und die Verteilung gekennzeichnet. In dem fungalen Zellwandmaterial gibt es ein Netzwerk von untereinander verbundenen Zellwandröhrchen, die ein kontinuierliches System von feinen Kapillarporen bilden, welche die hohe Aufsaugkapazität erreichen. In Kombination mit dem großen Leervolumen, das für die ankommende Flüssigkeit zugänglich ist, erzeugt dies eine signifikante Fähigkeit für einen raschen und voluminösen Flüssigkeitstransport. Die Wassertransportfähigkeit beispielsweise von Zellwandmaterial mit einer Dichte von 0,01–0,03 g/cm³ ist während der ersten Minute in der Horizontalrichtung wenigstens 10 mm, bevorzugt 15 mm, stärker bevorzugt 25 mm, und in der Vertikalrichtung wenigstens 5 mm, bevorzugt 10 mm, stärker bevorzugt 20 mm.
Zusätzlich zu dem Binden und dem Transport von Flüssigkeit hat das Material eine hohe Fähigkeit zum Binden von Mikroorganismen einschließlich Bakterien und Hefezellen, tierischen Zellen, Makromolekülen wie beispielsweise Proteinen und Produkten der Zell-Lyse, z.B. Aggregaten von Molekülen und Partikeln. Rinderserumalbumin und bestimmte andere Proteine können mit gleichem Gewicht oder höher gebunden werden. Aus einer Suspension von 100 Millionen E-coli-Zellen per ml werden 80% der Bakterien gebunden, wenn 1 mg fungales Zellmaterial pro ml verwendet wurde.
Das Zellwandmaterial hat ein positives Zeta-Potential bei pH 7 und/oder ein Zeta-Potential von wenigstens 10 mV bei pH 6, bevorzugt wenigstens 20 mV bei pH 6, wenn das Zellwandmaterial zu Partikeln einer Größe von weniger als 20 μm zerkleinert wurde. Wenigstens 5% (Gew./Gew.) des Zellwandmaterials ist Hexosamin.
Das Material kann entweder im Istzustand getrocknet oder an eine oder mehrere Oberflächen gebunden werden. Die Oberfläche kann ein Schaumstoff, eine Folie oder eine Faser sein, z.B. Cellulose- oder Synthesefaser. In Abhängigkeit von der Eigenschaft der zusätzlichen Oberflächen und der Mengenbeziehungen können Strukturen mit unterschiedlichen Bindungseigenschaften erhalten werden. Das Material kann auch nach dem Trocknen an einer Oberfläche befestigt werden.
Das fungale Zellwandmaterial kann auch in Hygieneartikeln wie Inkontinenzprodukten, Windeln und Tampons und in verschiedenen Arten von Wundverbandartikeln verwendet werden. Absorbierende Artikel wie Windeln sowie Inkontinenzerzeugnisse und Artikel für die weibliche Hygiene bestehen gewöhnlich aus mehreren Lagen. Das fungale Zellwandmaterial kann direkt unter einem Oberflächenmaterial oder unter einer Eintritts-/Transportmembran, z.B. einem hochvoluminösen Material angeordnet sein. Bei Artikeln für die weibliche Hygiene und für Inkontinenz kann das Zellwandmaterial zur Absorption und zum Verteilen sowie zur Geruchshemmung verwendet werden. Bei Wundverbandartikeln kann das Material verwendet werden, um Bakterien und Flüssigkeiten zu bilden; wenn es mit einem Protein wie etwa einem Enzym oder Cytokin dotiert ist, können neue Eigenschaften hinzugefügt werden.
Beispiel: Kultivierung von Schimmelpilzen. Konzentrierte Sulfit-Lauge (Trockengewicht 50% Gew./Gew.) wird mit drei Teilen Wasser verdünnt. 10 g/l Diammoniumhydrogenphosphat und 1 g/l Kaliumchlorid werden hinzugefügt und der pH mit Natriumhydroxid auf 5–7 eingestellt. Das Medium kann bei 120°C sterilisiert und nach dem Abkühlen mit Rhizopus oryzae CCUG 28958, hauptsächlich in Form von Sporen, beimpft werden. Die Pilzkultur wird bei 30°C unter Bewegung und Belüftung für 48 h inkubiert. Sie wird dann über ein Sieb geleitet und gewaschen. Die Naßgewichtsausbeute ist ungefähr 60–70 g pro Liter Medium (10–20 g Trockengewicht je Liter).
Chitosan/Chitin enthaltende Schimmelpilze, die aus der Kultivierung erhalten waren, wurden durch Gefrierpressen zerkleinert und der Protoplasmagehalt durch Waschen entfernt, um Zellwände zu erzeugen. Alternativ wurde die Myzelmasse mit einem organischen Lösungsmittel wie beispielsweise warmem Ethanol extrahiert, um Lipide zu entfernen. Dann wurde das Material mit heißem Natriumhydroxid oder Enzymen aufbereitet, um Proteine und Nucleinsäuren zu entfernen. Essigsäure oder Milchsäure wurden eingesetzt, um lösliches Chitosan zu extrahieren. Die Methode ist im einzelnen in EP 0 494 950 B1 und der schwedischen Patentanmeldung 9801373-3 beschrieben. Es ist auch möglich, die Extraktion nur mit Natriumhydroxid und Säuren auszuführen.
Die Suspension wurde mit einem Gefriertrockner gefriergetrocknet, der eine Trockenkammer hatte und an den eine Vakuumpumpe und ein Kondensator, der auf niedriger Temperatur gehalten wurde, angeschlossen waren. Die Suspension aus Zellwandungen, häufig gel- oder gallertartig, wurde auf Aluminiumplatten bis zur gewünschten Dicke, ungefähr 3–5 mm, aufgetragen, alternativ in Petrischalen aus Polystyrol eingebracht. Die Platten wurden über Nacht oder für einige Tage in Gefriergeräte verbracht. Dann wurden die Platten mit gefrorenem Material in den Gefriertrockner gelegt und über Nacht oder für einige Tage einem Vakuum ausgesetzt. Das Material hatte die gleiche Dicke vor und nach dem Gefriertrocknen. Es war ersichtlich, daß die zum Gefrieren und Trocknen angewandten Bedingungen die Eigenschaften des trockenen Zellwandmaterials beeinflußten. Das Trockenmaterial hatte eine sehr poröse Struktur mit Dichten von ungefähr 0,01–0,1 g/cm³. Die Dichte des Trockenmaterials war ein Ergebnis der Konzentration des Zellwandmaterials in der Suspension. Wenn beispielsweise 10 mg Zellwandmaterial je ml gefroren wurden, hatte das getrocknete Material eine Dichte von 0,01 g/cm³.
Die Kultivierung von Schimmelpilzen mit Sulfit-Lauge als einer Kohlenstoff- und Energiequelle resultiert in einem hohen Zuckerverbrauch, wenn geeignete Stämme eingesetzt werden, so daß mit Lignosulfonat angereicherte Lauge durch Entfernen des Pilzmyzels durch Sieben rückgewonnen werden kann. Bei dem Siebvorgang können außerdem bestimmte wertvolle Metaboliten wie beispielsweise Lactat rückgewonnen werden. Wenn Calciumsulfit-Lauge verwendet wird, kann Ca-Lactat als lange Filamente erscheinen.
In unseren Untersuchungen wurden ca. 30 Zygomycetes-Stämme, die verschiedene Spezies repräsentieren, kultiviert, und es wurden große Unterschiede zwischen den Stämmen beobachtet in bezug auf die Assimilierung von verschiedenen Zuckern einschließlich Mannose, Galactose, Xylose, Glucose und Arabinose sowie in bezug auf die Fähigkeiten eines Stammes, die oben genannten Zucker zu assimilieren. In gewissem Umfang steht das Assimilierungsmuster mit Spezies in Beziehung, aber Unterschiede bestehen auch zwischen Stämmen, die zur selben Spezies gehören.
Um Sulfit-Lauge als Kultivierungsmedium für Zygomycetes brauchbar zu machen, wurden inhibierende Substanzen aus der ursprünglichen Sulfit-Lauge (Trockenstoffgehalt 10%) entfernt oder neutralisiert. Dies kann mittels Verdampfung erfolgen, wodurch Schwefeldioxid und flüchtige Alkohole eliminiert werden. Aber weder frische Sulfit-Lauge (Trockenstoffgehalt 10%) noch mittels Verdampfung konzentrierte Sulfit-Lauge (Trockenstoffgehalt 50%) unterstützt das Wachstum von Zygomycetes, tut dies jedoch nach 1:4 Verdünnung (Trockenstoffgehalt 12,5%), wenn mit Stickstoff- (z.B. NH3 oder Harnstoff) und Phosphatquellen versetzt wird.
Wenn Ammoniumsulfit-Lauge eingesetzt wird, benötigt man keine zusätzliche Stickstoffquelle. Sulfit-Laugen von verschiedenen Papiermühlen zeigen sehr unterschiedliche Fähigkeiten der Unterstützung des Wachstums der getesteten Zygomycetes.
Bei Durchführung einer kontinuierlichen Kultivierung wird eine geringere Verdünnung benötigt als im Fall von diskontinuierlichen Kulturen, weil das Medium in dem Kulturvolumen verdünnt wird.
Die Temperatur für die Kultivierung von Schimmelpilzen in Medien gemäß der vorliegenden Erfindung ist gewöhnlich 28–37°C. Bei Verwendung von thermophilen Stämmen der Gattung Rhizomucor können jedoch höhere Temperaturen vorteilhaft sein wegen des schnelleren Wachstums, der geringeren Kontaminierungsgefahr und der besseren Wärmebilanz, so daß während der Kultivierung keine Kühlung erforderlich ist.

Claims

Verfahren zur Eliminierung von Xylose und Hexosen aus flüssigen Pflanzenmaterial-Hydrolysaten zur Reduktion der Umweltbelastung durch die verbleibende Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass nicht toxische filamentöse Zygomycetes-Pilze mit der Fähigkeit zur Assimilierung von Xylose in Begleitung von Hexosen in einem Medium kultiviert werden, das einen flüssigen Extrakt aus Pflanzenmaterial umfasst und aus Mannose, Xylose, Galactose und Glucose enthaltender Flüssigkeit besteht, wobei die filamentösen Pilze aus dem Medium isoliert werden, das gelöste Metaboliten und/oder Lignocellulose-Derivate umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das flüssige Pflanzenmaterial-Hydrolysat Papierzellstoffsulfitlauge ist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei jedwede antimikrobielle Aktivität, die in den flüssigen Pflanzenmaterial-Hydrolysaten vorliegt, eliminiert worden ist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das flüssige Pflanzenmaterial-Hydrolysat Calcium enthält.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es flüssige Pflanzenmaterial-Hydrolysat als Medium zur Kultivierung der Pilze mit mindestens einer Stickstoff- und mindestens einer Phosphatquelle versetzt worden ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Metabolit Ethanol ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Flüssigkeit eine Calcium-Sulfit-Lauge ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Flüssigkeit konzentrierte Sulfit-Lauge (Trockenstoffgehalt 50%) ist, die mit Wasser verdünnt worden und mit mindestens einer Stickstoff- und mindestens einer Phosphatquelle versetzt worden ist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Flüssigkeit Ammonium-Sulfit-Papiermühlenlauge ist, die mit mindestens einer Phosphatquelle versetzt worden ist.
Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Sulfit-Lauge eine Konzentration an Trockensubstanz von mindestens 20% (Gew./Gew.) aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Pilz zu der Spezies Rhizopus oryzae gehört, und vorzugsweise der Stamm Rhizopus oryzae CCUG 28958 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Metabolit Lactat ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das Lactat als unlösliches Ca-Lactat gewonnen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei das Ca-Lactat faserförmig ist.