SE521726C2 - Förfarande för odling av chitin- och chitosanrika trädbildande svampar på sulfitlut jämte förfarande för anrikning av lignosulfonater ur odlingsmediet - Google Patents

Description

30 koncentrationer av svampkulturer som råvara för chitin och chitosan. Här har man behandlat materialet med natriumhydroxid och ättiksyra för att åstadkomma ett så rent chitin/chitosan material som möjligt. Det saknas dock uppgifter på att materialet skulle ha bra absorberande förmåga.

I EP-A-0 494 950 beskrives ett cellväggmaterial från trådsvamp med positiv Zeta-potential vid pH 7, en metod för dess framställning samt vissa användningsområden. Cellväggmaterial från zygomyceter har testats med framgång. Chitin/chitosan utgör en stor andel av sådant cellväggmaterial. Den positiva laddningen erhålles av förekomsten av fria aminogrupperi chitosan, vilket är en polyglukosamin. Zygomyceter är även tilltalande för många tillämp- ningar genom att flera arter, främst Rhizopus oligosporus och Rhizopus oryzae använts i föda (t.ex. i tempe) samt att hyfema (svamptrådama) saknar septa (skiljeväggar) vilket underlättar deras omvandling till mikroskopiska rörsystem.

Svenska patentansökan nr 98013738: avser en pcrös swtmpccllrnaterialstruktur som löser ovan angivna tekniska problem vad avser absorberande material.

Odling av dessa svampar för att åstadkomma detta material kräver emellertid tillgång till sockerinnehållande medium.

Vid framställning av pappersmassa från trä i sulfitprocessen kokas vedflis för att frilägga cellulosafibrema varvid i trämassan föreliggande lignin utlöses som lignosulfonsyra i den så kallade surluten samtidigt som en betydande del av hemicellulosan bryts ned till enkla redu- cerande sockerarter, som mannos, xylos, galaktos, glukos, och arabinos samt organiska syror.

Lignosulfonatet i form av indunstad surlut, så kallad tjocklut (svartlut) har använts som bindemedel för djurfoder och betong. I djurfoder kan ingående socker utnyttjas till en del av de djur som tillföres fodret.

I betong leder emellertid närvaron av socker till en långsammare härdning av betongen. Av detta skäl är det värdefullt att avlägsna socker ur surluten. Sedan åtskilliga år har jäst använts för att genom jäsning omvandla socker till etanol. Emellertid är jästens förmåga att föijäsa vissa sockerarter, särskilt pentosema, ofullständig. Därutöver är både isolering av jästen medelst centrifugering och rening av etanolen genom destillation kostnadskrävande lO 20 25 30 (fl |\D ...x \J FO ON pIOCCSSCI.

Målsättningen med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett förfarande för odling av svampcellkultur som användes för framställning av en porös struktur som absorberar vätska och som dessutom uppfyller ovan uppräknade önskemål på ett sådant material.

Sammanfattning av föreliggande uppfinning Föreliggande uppfinning avser ett förfarande för odling av trådsvampar för framställning av ett svampcellmaterial för åstadkommande av en porös struktur innefattande svampcellväggar med god absorberande, vätsketransporterande, och makromolekyl- och mikroorganismbindande iönnåga. Vidare avser uppfinningen en sockerbefriad avfallslut från massaindustrien.

I ett extraktionstörfarande avlägsnas cellinnehållet och cellväggarna luckras upp, varvid cell- väggen bildar ett finporigt nätverk, eventuellt uppdelat i ctt stort antal mycket fina trådar som omger cellväggstrukturen. Svampcellväggama föreligger huvudsakligen som mikrorör, eftersom materialet är härlett från ett mycelium, dvs man kan karakterisera materialet som filamentöst.

Den porösa strukturen innefattar cellväggmaterial härlett från en svamp, t.ex. tillhörande divisionen Zygomycota innehållande hexosamin. Svampama sönderdelas eventuellt och behandlas i flera extraktionsförfaranden med kemikalier, varpå en suspension bildas. Denna suspension torkas på ett sådant sätt att materialet erhåller en porös struktur, t.ex. med luft- torkning, med spraytorkning eller med företrädesvis frystorkning. Det resulterande materialet erhåller ett unikt kapillärsystem som kan absorbera och även transportera stora mängder vätska samt även adsorbera proteiner, och andra makromolekyler, samt celler, t.ex. bakterier.

Ordet porös betyder här att materialet innehåller stora mängder luft och inte att det är skört.

Materialet har låg densitet, högst 0,1 g/cm3, företrädesvis högst 0,05 g/ cm3.

Materialet innehåller stora mängder luft, som dock kan ersättas med vätska, makromolekyler, och celler, t.ex. mikroorganismer. Man kan alltså använda den porösa svampcellväggstruk- turen som en absorbent av vätska och som en adsorbent av partiklar, molekyler, och celler- /organismer. Strukturen hanterar fri svällning, varvid materialet effektivt bibehåller sin 3- 10 t__i U1 20 25 30 dimensionella form och struktur efter fri svällning/absorption i vatten och visar inga tecken till sönderfall/upplösning, inte heller efter lång tid (> l vecka). På grund av strukturens fina kapillärsystem har den även fönnåga att sprida vätska, utan tillsats av extern fiber.

Materialet kan torkas antingen som det är eller bundet till en eller flera ytor. Ytan kan vara ett skum, en film eller en fiber t.ex. cellulosa eller syntetisk fiber. Om fibem är absorberande erhålls ett material med huvudsakligen vätskeabsorberande karaktär. Är fibern t.ex. av plast erhålls ett material med företrädesvis makromolekyl/mikroorganismadsorberande karaktär.

Materialet kan även fästas till en yta efter det att det har torkats. Materialet kan även adsorbe- ras till en yta efter sönderdelning av cellväggtrådama, såsom genom fryspressning.

Materialet kan även dopas med polära eller negativt laddade makromolekyler såsom ett pro- tein eller en laddad polysackarid. Med dopningen tillför man materialet andra egenskaper.

Dopar man materialet med ett enzym erhålls ett material med enzymatisk aktivitet.

Detaljerad beskrivning av föreliggande uppfinning Det har nu överraskande visat sig möjligt att med synnerligen stort utbyte odla chitin och chitosanrika trådbildande svampar med förmåga att assimilera såväl mannos, xylos och galaktos, som glukos, såsom trådsvampar av Zygomyceter, medelst användning av en vätska extraherad från trädmaterial vid pappersmassatillverkning, varefter nämnda trådsvampar isoleras från mediet.

Genom föreliggande uppfinning åstadkommes två värdefulla resultat genom att odla ätligt svampmycel på ett extrakt från trä (sulfitlut, svartlut) vilket extrakt uppkommit som bipro- dukt vid pappersmassatillverkning 1. Odlingen medför att man avlägsnar socker, främst mannos, xylos, galaktos och glukos från sulfitluten, varvid värdet av i luten kvarvarande lignosulfonat som bindemedel i t.ex. betong avsevärt ökas. 2. Odlingen medför vidare framställning av mycel som utgångsmaterial för cellväggsmaterial med absorberande egenskaper enligt ovan. Vidare framställes andra cellkomponenter. Genom att använda ätbara, ogifti ga mögelsvampar kan mycelets olika komponenter användas i nära lO |_| lfl 20 25 30 anslutning till människokroppen.

Den porösa strukturen innefattar svampcellväggar som innehåller polymerer av hexosamin, främst chitin och chitosan (företrädesvis svampcellväggar från divisionen Zygomycota, med släktena Absidia, Mucor och Rhizopus). Svampama underkastas extraktion för att avlägsna lipider, proteiner, nukleinsyror och lösligt chitosan. Svampen kan sönderdelas fysikaliskt för att underlätta extraktionen. Enligt ett lämpligt förfarande underkastas mycelet a) fysikalisk sönderdelning och/eller behandling med ett organiskt lösningsmedel för att avlägsna lipider; och b) behandling med alkali eller ett eller flera enzym för att avlägsna protein och nukleinsyra och, om så önskas, behandling med syra för att avlägsna lösligt chitosan.

Det föreligger även en möjlighet att genomföra extraktionen direkt med alkali och syra.

En materialsuspension erhålles därvid. Metod för framställning av materialsuspensioiieii från vilken man framställer den porösa strukturen, enligt föreliggande uppfinning, beskrivs i svenska patentet SE-C-465678. Denna metod utgör dock endast ett exempel och uppfinning- en är inte begränsad till strukturer framställda med nämnda metod.

Suspensionen torkas på ett sådant sätt att materialet erhåller en porös struktur, t.ex. med luft- torkning eller spraytorkning, men företrädesvis med frystorkning. Låter man materialet t.ex. lufttorka, erhålles vanligen en mindre porös struktur, så att materialet förlorar sin “luftighet”.

Man kan då förbättra torkningsegenskapema hos materialet medelst olika tillsatser till sus- pensionen. En alkohol t.ex. isopropanol kan tillsättas, vilket ger ett torkningsförlopp med lösningsmedelsutbyte. En tensid t.ex. Triton Xl00 kan tillsättas om man önskar minska yt- spänningen hos suspensionen. Suspensionen kan surgöras till ett pH under 7, företrädesvis 3- 5 för att främja införande av positiva laddningar i materialet, och man kan även tillsätta andra föreningar för att ändra slut-strukturens laddningsegenskaper och polaritet.

Till suspensionen kan man även sätta makromolekyler såsom proteiner, t.ex. enzym eller laddade polysackarider, t.ex. heparin. Man erhåller då material med ytterligare egenskaper beroende på vad som har tillsats. Tillsätts t.ex. ett enzym erhålls ett material med enzymatisk aktivitet. lO F; (fl 20 25 30 Det resulterande materialet, speciellt det frystorkade, erhåller ett unikt kapillärsystem som kan absorbera och även transportera stora mängder vätska. Materialet har på grund av sin porösa struktur låg densitet, vilken är högst 0,1 g/cm3, företrädesvis högst 0,05 g/ cm3. Mate- rialet består följaktligen av stora mängder luft. Luften kan ersättas med vätska eller biologiskt material. Den porösa svampcellväggstrukturen är därför en utmärkt absorbent. Strukturen hanterar fri svällning, varvid materialet effektivt bibehåller sin 3-dimensionella forrn och struktur efter fri svällning/absorption i vatten och visar inga tecken till sönderfall/upplösning, inte heller efter lång tid (> l vecka). På grund av strukturens fina kapillärsystem har den även förmåga att sprida vätska, utan tillsats av extern fiber. Materialet absorberar minst 15 ml/ g av 1% NaCl (aq).

Materialet transporterar snabbt stora volymer vätska. Detta sker i ett material som till stor del består av luft. Tomvolymen är minst 80%, företrädesvis minst 90% och mer företrädesvis minst 95%. Sådana lågdensitetsmaterial kännetecknas normalt av hög absorptionskapacietet vid aktiv tillförsel av vätska, men med påfallande dålig transportförmäga/spridning. I svamp- cellväggmaterialet föreligger ett utbrett system av med varandra förbundna “cellväggrör” som tillsammans skapar ett kontinuerligt system av fmkapillära porer vilka orsakar den goda “uppsugande” förmågan. I kombination med den stora tomma volymen, som finns tillgänglig för inkommande vätska, leder detta till en anmärkningsvärd förmåga till snabb och voluminös vätsketransport. T.ex. är den vätsketransporterande förmågan av vatten, vid en densitet av 0,01 till 0,03 g/cm3, i horisontell led av minst 10 mm, företrädesvis minst 15 mm, mera före- trädesvis minst 25 mm, under en första absorptionsminut, samt i lodrät led av minst 5 mm, företrädesvis 10 mm, mera företrädesvis 20 mm, under en första absorptionsminut.

Materialet har, förutom förmågan att absorbera och transportera vätska, också fönnåga att binda mikroorganismer, inklusive bakterier och jästceller, animalieceller, makromolekyler t.ex. proteiner samt cellsönderfallsprodukter t.ex. endotoxiner, molekylaggregat och partiklar.

Tex. har materialet en makromolekylbindande förmåga som är minst 0.1 gram bovint serum- albumin per gram svampcellväggmaterial. Exempel på materialets mikroorganism-bindande förmåga är att det binder minst 80% av bakterierna i en suspension innehållande 1 mg svamp- cellväggmaterial och 108 E. coli celler per ml suspension.

Materialet uppvisar vid ett pH värde av 7 en positiv Zeta-potential, och/eller en Zeta-potential 10 *J (fl 20 25 30 c-i .o ._è. w i o b \ 7 av minst l0mV vid pH 6, företrädesvis minst 20 mV vid pH 6, när svampcellväggmaterialet är sönderdelat till en partikelstorlek mindre än 20 um. Hexosamin utgör minst 5 viktsprocent av svampcellväggmaterialet.

Materialet kan torkas antingen som det är eller bundet till en eller flera ytor. Ytan kan vara ett skum, en film eller en fiber t.ex. cellulosa eller syntetisk fiber. Om t.ex. fibern har absorbe- rande egenskaper erhålls ett material med vätskeabsorberande karaktär. Är fibem en icke- absorberande fiber ökar man materialets protein/bakterie/cell-bindande förmåga. T.ex. om fibern är utav plast erhålls ett material med företrädesvis protein/bakterie/celladsorberande karaktär. På så sätt kan man modifiera strukturen så att man får önskade egenskaper med avseende på absorption av vätska och adsorption av mikroorganismer.

Materialet kan även fästas till en yta efter det att det har torkats.

Svampcellväggrnaterialct kan användas i hygienvårdsprodukter t.ex. blöjor, inkontinens- skydd, bindor och tamponger och i sårvårdsprodukter som t.ex. kompresser och förband.

Absorberande alster såsom blöjor, inkontinensskydd och bindor består normalt av flera skikt.

Svampcellvägg-materialet kan antingen anordnas direkt under ett ytmaterial eller under ett insläppnings/transportskikt, t.ex. ett “high loft” material. I t.ex. blöjor, bindor och inkonti- nensprodukter kan materialet bl.a. användas som absorptions och/eller spridningsmaterial, samt för lukthämning. I förband kan materialet användas för att bl.a. binda bakterier och väts- kor men är materialet dopat med ett protein t.ex. ett enzym kan man också tillföra ytterligare egenskaper.

Ett exempel på förband där svampcellväggmaterialet är lämpligt att använda är ocklusionsför- band. Förbandets förmåga att absorbera vätska kan ändras efter önskemål. Exempelvis kan kapillärkraften som påverkar vätskans transportsträcka i materialet och absorptionshastighe- ten regleras medelst modifiering av den frystorkade svampcellväggmaterialkroppen.

Nedan beskrivs utföiingsexempel av föreliggande uppfinning.

Exempel- Odling av trådsvampar Tjocklut (TS 50 vikt-%) spädes med tre delar vatten. Diammoniumvätefosfat (10 g perl) och 10 |4 (Il 20 25 30 CT! BJ :å \~3 ND Û 8 kaliumklorid (l g perl) tillsättes. pH justeras till mellan 5 och 7 med natriumhydroxid.

Mediet steriliseras genom autoklavering vid l20°C, varefter det ympas med Rhizopus oryzae CCUG 28958, huvudsakligen som sporer. Kulturen inkuberas vid 30°C under omrörning och luftning under två dygn (48 hrs), varefter mycelet silas av och tvättas. Utbyte våtvikt: 60-70 g per liter medium (10 - 20 g torrvikt per liter).

Svampar innehållande chitosan eller chitin och erhållna vid odlingen ovan genomgick fysikalisk sönderdelning och/eller behandlades med ett organiskt lösningsmedel for att avlägsna lipider. Därefter behandlades materialet med natriumhydroxid och/eller enzym för att avlägsna proteiner och nukleinsyra. Därefter extraherades med ättikssyra för att avlägsna lösligt chitosan. Metoden beskrivs närmare i SE-C- 465678.Det är också möjligt att genomföra extraktionen med endast natriumhydroxid och ättikssyra.

Suspensionen frystorkades med en frystork av ostkupemodell. Den består av bl.a. en vakuumpump och ett kylelement, en sk kylfälla.

Svampcellväggsuspensionen spreds till önskad tjocklek, ca 3-5 mm, på plåtar. (Materialet hade samma tjocklek före och efter frystorkningen.) Plåtama var täckta med en film, i det här fallet en silikonfilm, för att undvika att materialet efter torkningen fastnade på plåten. Plåtama placerades i en frysbox över natt. Därefter placerades plåtarna i frystorken någon eller några dagar, eller tills dess att materialet var torrt.

Det erhållna materialet hade en mycket porös struktur med densiteten ca 0.01-0.1 g/cm3.

Materialets densitet berodde på vilken koncentration svampcellväggmaterialet hade i suspen- sionen. T.ex. vid 10 mg svampcellväggmaterial per ml vätska erhölls ett torkat material med densiteten 0,01 g/cm3.

Odling av trådbildande svamp gör det möjligt att åstadkomma en hög sockerkonsumtion genom val av för luten lämpliga svampar samt återvinning av lignosulfonat-befriad restlut genom enkelt avskilj ande av svampmycelet genom silning.

I föreliggande undersökningar har några tiotal zygomycete-stammar som representerar olika arter odlats, varvid det har konstaterats att det föreligger stora skillnader mellan en stams för- lO }_| (fl 20 521 'i 2 ff» 9 måga att assimilera olika sockerarter inklusive mannos, galaktos, xylos, glukos och arabinos, liksom det föreligger stora skillnader mellan olika stammars förrnâga att assimilera en viss sockerart som mannos, xylos, galaktos, och arabinos. I viss utsträckning är assimilations- mönstret art-relaterat men skillnader föreligger mellan olika stammar tillhörande samma art.

För att surlut skall vara tj änlig som odlingsmedium för zygomyceter måste tillväxthämmande substanser avlägsnas eller neutralieras från den ursprungliga luten (tunnluten) (torrsubstans = 10%). Detta kan ske genom indunstning, varvid bland annat svaveldioxid och flyktiga alko- holer avlägsnas. Dock fungerar inte heller indunstad tjocklut (TS c:a 50%) som tillväxtmedi- um, men efter spädning 1:4 (TS = l2,5%) med samtidig tillförsel av kväve (NHj) och fosfor- källa (P04 3' ) kan god tillväxt ske. Tillväxten kan förbättras åtminstone initialt genom tillsats av vitaminer (jästextrakt) och aminosyror (casamino acids). Om ammoniumsulfitlut användes i kokluten behöver särskild kvävekälla uppenbart ej tillföras.

Surlut från olika pappersbruk uppvisar olika förrnåga att tjäna som odlingsmediuni för dessa svampar.

Temperaturen vid odling av trådsvampar i ett medium i enlighet med föreliggande uppfinning är normalt c:a 28 till 37°C. Emellertid kan det föreligga termofila varianter av ovannämnda trådsvampar, vilka kan odlas vid högre temperatur, vilket förbättrar värrnebalansen i det att kylning av luten inte behöver ske så långt och tillväxten sker snabbare.

Claims (9)

(TI :O .A \\"-' i” Q C lO PATENTKRAV

1. Förfarande för odling av chitin och chitosanrika, trådbildande svamp som utgöres av gruppen zygomyceter, askomyceter, och basidiomyceter med förmåga att assimilera såväl mannos, xylos, galaktos som glukos, kännetecknat av, att trådsvamparna odlas i ett medium omfattande en vätska extraherad från trädmaterial vid pappersmassatillverkning och utgörande en mannos-, xylos-, galaktos och glukos- innehållande koklut, varefter nämnda trådsvampar isoleras från mediet, varvid vätskan utgöres av sulfitlut (tunnlut), vilken är befriad från antimikrobiellt aktiva substanser.

2. Förfarande för odling enligt något av krav 1, kännetecknat av, att vätskan dessutom tillförts minst en kvävekälla, samt minst en fosforkälla.

3. Förfarande för odling enligt krav 1, kännetecknat av, att vätskan utgöres av sulfitlut (tjocklut) vilken spätts med vatten samt dessutom tillförts minst en kvävekälla, och minst en fosforkälla.

4. Förfarande för odling enligt krav 1, kännetecknat av, att vätskan utgöres av ammoniumsulfitbaserad koklut, vilken dessutom tillförts minst en fosforkälla.

5. Förfarande för odling enligt något av kraven 2-4, kännetecknat av, att minst en tillväxtfaktor för nämnda svampar tillföres.

6. Förfarande enligt ett eller flera av kraven 1-5, kännetecknat av, att kokluten uppvisar en torrsubstanshalt av högst 20 vikt-%, företrädesvis 15 vikt-%.

7. Förfarande för odling enligt krav 6, kännetecknat av, att svampen utgöres av Rhizopus oryzae, företrädesvis Rhizopus oryzae CCUG 28958.

8. Förfarande för anrikning av koklut med avseende på lignosulfonat, kännetecknat av, att koklutens innehåll av socker, såsom mannos, xylos, galaktos, glukos, arabinos, och/eller uronsyror, elimineras genom att en chitin och chitosanrik trådbildande svamp odlas i en sådan koklut, varefter kokluten isoleras, varvid kokluten utgöres av sulfitlut (tunnlut), vilken är befriad från antimikrobiellt aktiva substanser. f) ()!,~' v ._:-~_~_ _- .._,-H: H . 11. / f; i.) *'° ' 1 . , . . .. . m . . . . H . il

9. Förfarande för anrikning av iignosulfonat enligt krav 8, kännetecknat av, att lignosulfonatet isoleras från det skum som bildas vid genomluftning av odlingen