DE60017359T2

DE60017359T2 - Glutathioneanaloge enthaltende therapeutische zusammensetzungen

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Publication number: DE60017359T2
Application number: DE60017359T
Authority: DE
Inventors: Thomas Redelmeier; M. Lawrence KAUVAR; T. Robert LUM; H. Matthew LYTTLE; W. Robert MACSATA; R. Steven SCHOW; O. Hugo VILLAR; R. Michael KOZLOWSKI
Original assignee: Telik Inc
Current assignee: Telik Inc
Priority date: 1999-01-27
Filing date: 2000-01-27
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2020-01-28
Also published as: ATE286741T1; DE60017359D1; HK1043310B; AU2976700A; JP2002535359A; WO2000044366A3; PT1143992E; KR100750842B1; HK1043310A1; ES2231159T3; EP1143992B1; KR20010101775A; JP2007326877A; CA2360795A1; AU778340B2; EP1143992A2; CA2360795C; CN1185008C; WO2000044366A2; CN1342084A

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft Zusammensetzungen, Formulierungen und Verfahren für gewisse Glutathion-Analoga, die mit mindestens einer Glutathion S-Transferase wechselwirken. Die Erfindung betrifft weiter Lipidformulierungen eines Glutathion-Analogons und deren Herstellungsverfahren. Die Lipidformulierungen überwinden das Unlöslichkeitsproblem des Arzneistoffs, wenn er parenteral verabreicht wird, und verringern seine toxischen Wirkungen. Schließlich ist die Erfindung auf die Modulation der Hämatopoese im Knochenmark oder Blut und auf andere nützliche Antworten gerichtet, die von derartigen Zusammensetzungen und Formulierungen bereitgestellt werden.
Hintergrund und Offenbarung der Erfindung
Die Nebenwirkungen von chemotherapeutischen Mitteln, die bei der Behandlung von bösartigen Geschwulsten und anderen Indikationen verwendet werden, sind wohlbekannt. Unter diesen Nebenwirkungen befinden sich Änderungen der Konzentrationen gewisser Blutzellen, einschließlich Neutrophilen, Blutplättchen und Lymphozyten. Die Ergebnisse dieser Wirkungen können Neutropenie, Thrombozytopenie und eine allgemeine Immunsuppression sein. Diese Nebenwirkungen sind nicht nur unangenehm, sondern sie beschränken auch die Wirksamkeit der Krebstherapie und setzen das Subjekt einem ernsthaften Risiko von Infektion und unkontrollierten Blutungen aus.
Derzeit gibt es wenig praktische Abhilfe für diese Wirkungen. Typisch handelt es sich bei den Ansätzen um unterstützende Pflege, große Dosen von Antibiotika oder die Verabreichung von Wachstumsfaktoren. Die Verabreichung von Wachstumsfaktoren, wie Granulozytenkolonie-stimulierendem Faktor (GCSF), Granulozytmakrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (GMCSF) und in jüngerer Zeit entwickelten Faktoren, wie Megakaryozyten-Wachstums- und Entwicklungsfaktor (MGDF) und Thrombopoietin (TPO), ist teuer. Zusätzlich weisen diese ihre eigenen zugehörigen negativen Nebenwirkungen auf.
Die Probleme, die mit derzeitigen Ansätzen zur Handhabung der Nebenwirkungen einer Chemotherapie und zum sonstigen Umgang mit der Suppression der Hämatopoese verbunden sind, werden zumindest teilweise durch die biologische Aktivität gewisser einfacher Tripeptid-Verbindungen gelöst, die Hemmer der verschiedenen Isoenzyme von Glutathion S-Transferase sind.
Wie bei vielen Verbindungen auf der Basis kleiner Peptide spielt die Formulierung derartiger Verbindungen eine wesentliche Rolle bei ihrer Löslichkeit und Wirksamkeit. Es ist bekannt, dass Lipidformulierungen (Liposomes as Drug Carriers, Hsg. G. Gregoriadis, John Wiley and Sons, 1988) und Emulsionen oder Lipid-Mikrokügelchen (Cumrnings, J. et al., Expert Opin. Ther. Pat. (1998), 8(2), 153; Takenaga, M., Adv. Drug Delivery Rev. (1996), 20(2,3), 209; Yamaguchi, T., Adv. Drug Delivery Rev. (1996), 20(2,3), 117; Mizushima, Y. EP 0 432 697 A2 ; Kraft, M. WO 98/05301) als geeignete pharmazeutische Träger verwendet werden können, welche die Löslichkeit erhöhen, das pharmakokinetische Verhalten modulieren, die Bioverteilung modifizieren und Verbindungen vor einem enzymatischen Abbau schützen. Die Erhöhung der Lipophilie der Verbindung unterstützt häufig die Formulierbarkeit von Verbindungen in Emulsionen und Liposomen. Ester, die längere Kohlenstoffketten oder andere lipophile Gruppen enthalten, können so verwendet werden, um Verbindungen maßzuschneidern, welche die Löslichkeit maximieren.
Ein Liposom ist eine vollständig geschlossene Lipid-Doppelschichtmembran, die ein geschlossenes wässriges Kompartiment umgrenzt. Liposomen sind mikroskopische Zufuhrvesikel, die teilweise aus Phospholipiden hergestellt sind, welche geschlossene, Flüssigkeits-gefüllte Kugeln bilden, wenn sie mit Wasser gemischt werden. Liposomen können entweder unilamellar, aus einer Lipid-Doppelschichtmembran bestehend, oder multilamellar, aus mehr als einer Doppelschicht bestehend, sein. Liposomen weisen das Potential der Bereitstellung einer gesteuerten Freisetzung des verabreichten Arzneistoffs über eine ausgedehnte Zeitspanne und der Verringerung der toxischen Nebenwirkungen des Arzneistoffs durch die Begrenzung der freien Konzentration des aktiven Mittels im Blutstrom auf. Liposomen können auch die Gewebeverteilung und – aufnahme von Arzneistoffen ändern, und die geänderte Gewebeverteilung kann die therapeutische Wirksamkeit des Arzneistoffs signifikant erhöhen.
Die WO 96/40205 und WO 95/08563 offenbaren Tripeptid-Verbindungen, die Analoga von Glutathion sind. Sie sind allgemein Hemmer der Glutathion S-Transferase-Aktivität, und die verschiedenen Verbindungen, die in dieser Gruppe enthalten sind, zeigen verschiedene Spezifitäten bezüglich Glutathion S-Transferase-Isoenzymen. In diesen Patenten sind symmetrische Ester mit 1 bis 10 C-Einheiten offenbart, wobei die bevorzugte Ausführungsform der Diethylester ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt Lipidformulierungen bereit, die Verbindungen enthalten, welche bei der Modulation der Hämatopoese allgemein und als Hilfsmittel für die chemotherapeutische Behandlung von Tumoren nützlich sind. Die Erfindung stellt Lipidformulierungen und Verfahren zur Herstellung derartiger Formulierungen bereit. In einem Aspekt ist die Erfindung auf eine Lipidformulierung gerichtet, die eine Verbindung enthält, welche ist:

(i) ein Diester einer Verbindung der Formel A
in der: jeder Ester 1–25 C ist; YCO für γ-Glu oder β-Asp steht; G* Phenylglycin ist; Z für CH₂, O oder S steht; und X ein Kohlenwasserstoffrest ist, der Alkyl (6–8 C), Benzyl oder Naphthyl ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz derselben; oder
(ii) eine Verbindung der Formel I
in der: R₁ und R₂ jeweils unabhängig lineares oder verzweigtes Alkyl (1–25 C), Cycloalkyl (6–25 C), Heterocyclus (6–20 C), Ether oder Polyether (3–25 C) sind oder R₁-R₂ zusammen 2–20 C-Atome aufweisen und einen Makrocyclus mit dem Rest der Formel I bilden; und X wie oben für die Formel A definiert ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz derselben; wobei die Lipide der Lipid-Formulierung Ei-Phosphatidylcholin und Ei-Phosphatidylglycerin in einem Gewichtsverhältnis von 0,75–1,25:0,75–1,25 umfassen.

In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der Lipidformulierung bei der Herstellung eines Medikaments zur Modulation der Hämatopoese und zum Schutz gegen die zerstörerischen Auswirkungen einer Chemotherapie bereit.
Vor der vorliegenden Erfindung wurden Anstrengungen unternommen, die Bioverfügbarkeit der oben beschriebenen Verbindungen durch Herstellung höherer Alkylester zu erhöhen, in denen mindestens eines von R1 oder R2 eine Höheralkyl(mindestens 6 C) Gruppe ist. Dies erwies sich jedoch als schwierigeres und teures Verfahren. Die Erfinder fanden anschließend, dass sie durch Verwendung von Lipidformulierungen, insbesondere Liposomenformulierungen, die Aufnahme der Verbindungen über ein geeignetes Targeting erhöhen und deshalb die Bioverfügbarkeit erhöhen konnten, ohne dass sie auf die oben erwähnte schwierige teure Herstellung von Höheralkylestern zurückgreifen mussten.
Lipidformulierungen oder -zusammensetzungen gemäß der Erfindung umfassen Liposomen, Lipid-Mikrokügelchen und Lipidemulsionen. Lipid-Mikrokügelchen sind kugelförmige Teilchen, die aus einem Lipidkern und/oder einer Lipidmatrix zusammengesetzt sind, welche die Verbindungen der Erfindung enthalten. Liposomen sind Phospholipid-Vesikel, die aus (einer) Lipiddoppelschicht(en) bestehen, die ein wässriges Kompartiment begrent/begrenzen, das die Verbindungen der Erfindung enthält.
Es wurde gezeigt, dass die Verbindungen der Formeln A oder I eine begrenzte Löslichkeit in wässrigen Lösungen, insbesondere in hoch osmotischen Lösungen aufweisen. Es wurde gezeigt, dass diese Verbindungen, wenn sie in Lipiden formuliert werden, eine größere Löslichkeit aufweisen, wenn sie in ein biologisches Medium gegeben werden. Es wurde weiter gezeigt, dass diese Verbindungen, wenn sie in Lipid-Mikrokügelchen formuliert werden, eine größere Beständigkeit gegen Proteasen und eine erhöhte Halbwertszeit in Anwesenheit von Blut aufweisen.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Lipidmediums aus Tröpfchen bereit, welche einen Kern aus Verbindungen der Formeln A oder I umfassen, der mit einem pharmazeutisch verträglichen Öl beschichtet ist. Demgemäß stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Formulierung auf Lipid-Basis bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Liposoms auf Phospholipid-Basis bereit, in dem Verbindungen der Formeln A oder I mit dem Liposom assoziiert gefunden werden.
In einem weiteren Aspekt ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen auf Phospholipid-Basis gerichtet, welche Verbindungen der Formeln A oder I enthalten.
In einem weiteren Aspekt ist die Erfindung auf die Verwendung einer Lipidformulierung der Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments für die Modulation der Hämatopoese und den Schutz gegen die zerstörerischen Auswirkungen einer Chemotherapie gerichtet.
In weiteren Aspekten ist die Erfindung auf Lipidformulierungen, die einen Diester einer Verbindung der Formel A oder einer Verbindung der Formel I enthalten, zur Förderung der Produktion von Neutrophilen, Blutplättchen und Lymphozyten, zur Wiederherstellung von geschädigtem Knochenmark, zum Schutz von Knochenmark vor einer zytotoxischen Therapie und zum Ausüben einer Schutzwirkung gegen Neutropenie, Thrombozytopenie, Lymphozytopenie und Anämie, die von einer Chemotherapie, Infektion oder hämatologischen Krankheiten verursacht werden, und zur Expansion von Zellpopulationen im Verlauf einer Knochenmarktransplantation gerichtet. Eine bevorzugte Ausführungsform ist der Einschluss von Niederalkylestern in Lipidformulierungen. Die Erfindung ist weiter auf die Verwendung von Verbindungen der Erfindung als Tumor-spezifische Chemo- oder Radiosensibilisatoren, was die Wirkung der Behandlung potenziert, und als verallgemeinerte Chemoprotektionsmittel gerichtet. Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist auf ein allgemeines Immunstimulans zur Behandlung von Anämie, Infektionen und dergleichen gerichtet.
Lipidformulierungen, welche die Verbindungen der Formeln A oder I enthalten, können auf die folgende Weise hergestellt werden: (i) Arzneistoff und Lipid werden in einem Alkohol/Wasser-Lösungsmittelgemisch gelöst; (ii) die Mischung wird rasch in einem Puffer verdünnt, um Liposomen zu bilden; (iii) das Liposomen-Präparat wird durch einen oder mehrere gestapelte Filter extrudiert, um unilamellare Vesikel einer definierten Größe zu erzeugen; und (iv) lyophilisiert.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Viele der Verbindungen der Formeln A und I sind nützlich, um die Aktivität von mindestens einer Isoenzym-Unterklasse der Glutathion S-Transferase-Isoenzyme zu hemmen. Zusammensetzungen dieser Verbindungen modulieren auch die Hämatopoese im Knochenmark, selbst in Anwesenheit von Mitteln, die normalerweise einen großen Prozentsatz der Zellen zerstören würden, welche erforderlich sind, um die Hämatopoese aufrecht zu erhalten. Zusätzlich zeigen diese Zusammensetzungen andere hilfreiche Auswirkungen auf das Knochenmark und die Blutzellen.
Verbindungen der Erfindung der Formeln A oder I liegen als Diester vor. Die Esterformen sind im Allgemeinen diejenigen von (1-25 C)-Alkyl-, (1-25 C)-Alkenyl- und (1-25 C)-Arylalkylalkoholen und -aminen. Insbesondere kann jeder der Diester diejenigen mit einer ersten Gruppe mit 1 C-Atom und mit der zweiten Estergruppe mit 1 C-, 2 C-, 3 C-, 4 C-, 5 C-, 6 C-, 7 C-, 8 C-, 9 C-, 10 C-, 11 C-, 12 C-, 13 C-, 14 C-, 15 C-, 16 C-, 17 C-, 18 C-, 19 C-, 20 C-, 21 C-, 22 C-, 23 C-, 24 C- oder 25 C-Atomen einschließen. Ähnlich können sie diejenigen mit irgendeiner der vorangehenden zweiten Estergruppen in Kombination mit einer ersten Gruppe mit 1 C-, 2 C-, 3 C-, 4 C-, 5 C-, 6 C-, 7 C-, 8 C-, 9 C-, 10 C-, 11 C-, 12 C-, 13 C-, 14 C-, 15 C-, 16 C-, 17 C-, 18 C-, 19 C-, 20 C-, 21 C-, 22 C-, 23 C-, 24 C- oder 25 C-Atomen einschließen. Derartige Gruppen können geradkettig sein, oder diejenigen mit einer ausreichenden Zahl von Atomen können eine oder mehrere Verzweigungen aufweisen. Insbesondere kann mindestens eine der Estergruppen irgendeine Zahl von 10 bis 25 C-Atomen aufweisen. Typische Ester, die in der Erfindung nützlich sind, umfassen Dioleyl, Palmityl/Ethyl, Lauryl/Ethyl, Dilauryl, Stearyl/Ethyl und dergleichen. Besonders bevorzugt sind die Palmityl/Ethyl-Formen der Verbindungen der Formeln A oder I, worin X Benzyl ist. Es versteht sich, dass derartige Gruppen und der Rest der Formeln A oder I einen oder mehrere Substituenten aufweisen können, vorausgesetzt, dass derartige Substituenten die Verbindung nicht daran hindern, eine positive pharmazeutische Wirkung (wie mindestens irgendeine der hierin beschriebenen Wirkungen) zu zeigen. Derartige Substituenten können ein oder mehrere (wie zwei oder drei) Halogene oder Hydroxy einschließen.
Ein spezieller Diester der Formeln A oder I (z.B. ein Diester der Formel I) kann eine größere Lipophilie aufweisen als ein entsprechender Diethylester. Dies kann besonders vorteilhaft sein, wenn die Verbindung in einer Liposomenzusammensetzung formuliert wird, welche die Verbindung enthält. Es kann ein Diester ausgewählt werden, der eine erhöhte Potenzierung der Chlorambucil-Zytotoxizität bei menschlichen Zellen im Vergleich zu der entsprechenden freien Disäure-Form der Verbindung zeigt, wie es in Beispiel 1 des U.S. Patents Nr. 5,955,432 beschrieben wird, oder der eine erhöhte Aufnahme durch menschliche Krebszellen, wie HT-29 (Human-Kolon-Adenokarzinom), die in serumfreiem Medium suspendiert sind, gegenüber der entsprechenden freien Disäure-Form der Verbindung zeigt (wie es in Beispiel 1 des vorstehenden Patents beschrieben ist). Es kann ein Diester ausgewählt werden, der für eine erhöhte Differenzierung von Maus- oder Ratten-Knochenmark im Vergleich zu der entsprechenden freien Disäure-Form der Verbindung sorgt (wie im Beispiel 9 des vorstehenden Patents beschrieben).
Es ist offensichtlich, dass die Tripeptide der Erfindung ein oder mehrere chirale Zentren enthalten. Die oben angegebenen Bezeichnungen richten sich auf die Gattung von Diastereomeren, die aus der Anwesenheit dieser chiralen Zentren resultieren. Die bevorzugten Aminosäuren der Erfindung weisen die L-Konfiguration auf.
Die Zusammensetzungen der Erfindung haben mehrere Eigenschaften, die sie als Hilfsmittel bei einer Chemotherapie und anderen Indikationen nützlich machen. Erstens modulieren sie die Hämatopoese in Knochenmark, dessen Zerstörung eine übliche Nebenwirkung von chemotherapeutischen Mitteln ist. Zweitens hemmen sie gewöhnlich mindestens eine Klasse der GST-Isoenzyme, einschließlich der π-Unterklasse, die besonders häufig in Tumorzellen vorliegt. Schließlich potenzieren die Verbindungen der Formeln A oder I direkt die Wirkung von chemotherapeutischen Mitteln bei der Zerstörung von Tumorzellen. Diese Kombination von Qualitäten macht die Verbindungen der Erfindung sowohl als direkt die Hämatopoese potenzierende Mittel nützlich als auch, um die negativen Auswirkungen von chemotherapeutischen Behandlungen zu verbessern sowie die toxische Wirkung auf die Zielzellen zu verstärken. Wenn sie zur Verwendung in vivo oder in Kontakt mit intakten Zellen formuliert werden, werden die Verbindungen der Formeln A oder I als Diester bereitgestellt.
Formulierungen zur Verabreichung verwenden Standardmethoden, wie diejenigen, die in Remington's Pharmaceutical Sciences, (Mack Publishing Company, Easton, PA) und in Liposome Technology Band III Targeted Drug Delivery and Biological Interaction (1984, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida) beschrieben sind, sowie speziellen Formulierungen, wie beschrieben. Besonders nützliche Formulierungen für Verbindungen der Formeln A oder I sind Lipidzusammensetzungen. Lipidzusammensetzungen umfassen Lipidemulsionen (wie wässrige Lipidemulsionen), Liposomen und Lipid-Mikrokügelchen. Formulierungen in Lipidzusammensetzungen enthalten Phosphatidylcholin und Phosphatidylglycerol.
Eine bevorzugte Zusammensetzung ist diejenige einer Verbindung der Formel I, in der R1 und R2 Ethyl sind, X Benzyl ist, und die in einer Mischung von Ei-Phosphatidylcholin (EPC) und Ei-Phosphatidylglycerol (EPG) formuliert ist.
Die Lipidformulierung kann ein Verhältnis von Lipid zu Verbindung der Formeln A oder I von 3:1 bis 6:1 umfassen. Bevorzugt kann die Lipidformulierung 2:2 Gewichtsteile Ei-Phosphatidylcholin (EPC) : Ei-Phosphatidylglycerol (EPG), 1 Gewichtsteil Verbindung der Formeln A oder I und 7 Gewichtsteile Saccharose umfassen. Am bevorzugtesten kann die Formulierung 2 Gewichtsteile Ei-Phosphatidylcholin (EPC), 2 Gewichtsteile Ei-Phosphatidylglycerol (EPG), 1 Gewichtsteil Verbindung der Formeln A oder I und 7 Gewichtsteile Saccharose umfassen. Weiter können zusätzliche Mittel, wie Citrat-Puffer, zugesetzt werden, um den pH zu steuern. Die Nettoladung der Lipidformulierung kann im Bereich von negativ bis neutral liegen. Bevorzugt ist die Nettoladung der Lipidformulierung negativ. Das Verfahren zur Herstellung der Lipid/Verbindung-Formulierung findet bevorzugt unter Verwendung eines Extruders, gefolgt von Filtration statt, um unilamellare Vesikel einer definierten Größe etwa 50–2000 nm zu erzeugen. Bevorzugter weisen die erzeugten unilamellaren Vesikel eine Größe von etwa 50–1000 nm auf. Am bevorzugtesten weisen die erzeugten unilamellaren Vesikel eine Größe von 400–600 nm auf. Die Liposomen können zur Trockne lyophilisiert werden und mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel wieder gelöst/suspendiert werden.
Vorzugsweise beträgt der Grad der Einkapselung des Arzneistoffs im Liposom mehr als 50 %, bevorzugter mehr als 80 %, und die End-Lyophilisierung kann die Viskosität und Vesikelgröße erhöhen (75–600 nm). Am bevorzugtesten beträgt der Grad der Einkapselung von Arzneistoff zu Liposom etwa 95 %.
Verabreichung und Verwendung
Mit "Modulierung der Hämatopoese im Knochenmark oder peripheren Blut" ist die Änderung der Rate der Blutzellenbildung gemeint, wie durch die Fähigkeit gemessen, Kolonien oder differenzierte Zellen zu bilden. Differenzierte Zellen schließen Neutrophile, Blutplättchen, rote Blutzellen, Lymphozyten, Makrophage, Granulozyten, Granulozytmakrophage und dergleichen ein. Wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, bezeichnet "Modulierung der Hämatopoese im Knochenmark oder peripheren Blut" die Fähigkeit von Knochenmark oder Blut, das mit den Zusammensetzungen der Erfindung behandelt wird, eine Kolonienbildung oder Erzeugung von differenzierten Zellen bei einem Niveau zu zeigen, das von demjenigen von unbehandeltem Knochenmark verschieden ist. Ähnlich zeigen Fraktionen des Knochenmarks oder peripheren Bluts, die geeignete Verläuferzellen enthalten, diesen Effekt. Es sollte bemerkt werden, dass, wie hierin verwendet, "peripheres Blut" speziell Nabelschnurblut einschließt.
Wenn Mittel verwendet werden, die typisch zerstörerische Auswirkungen auf Knochenmark oder auf die Hämatopoese im Blut aufweisen, üben die Zusammensetzungen der Erfindung allgemein eine Schutzwirkung aus. Mit "Schutzwirkung" ist gemeint, dass der resultierende Schaden für das Knochenmark oder Blut geringer ist, wenn die Zusammensetzung verabreicht wird, als wenn sie es nicht wird.
Es gibt eine Anzahl von Situationen, in denen die Schutzwirkung der Zusammensetzungen der Erfindung nützlich ist. Diese umfassen Fälle, bei denen eine Strahlung negative Auswirkungen zum Ergebnis hatte oder voraussichtlich haben kann, Fälle, bei denen ein Patient aus irgendeinem Grund immungeschädigt ist, Fälle, bei denen ein Patient einen Nierenschaden zeigt, und Fälle, bei denen der Patient einer Chemotherapie unterzogen worden ist. Zusätzlich können die Zusammensetzungen der Erfindung in Transplantationsverfahren verwendet werden, um die Zahl der Zellen im Knochenmark eines Donors zu erhöhen; typisch kann in diesem Fall die Verbindung in vivo oder ex vivo verabreicht werden. In diesem Zusammenhang fördern die Zusammensetzungen der Erfindung auch die Bewegung von Vorläuferzellen in das periphere Blut des Donors, was so die Erholung der Zahlen von weißen Zellen im peripheren Blut bei diesem Donor verbessert; ähnlich können die Zusammensetzungen der Erfindung die Erholung der Zahlen von peripheren weißen Blutzellen im Empfänger verbessern. Allgemein verbessern die Zusammensetzungen die Expansion und fördern die letztendliche Einpflanzung von transplantierten Zellen nach Einwirkung der Zusammensetzungen der Erfindung in vivo oder ex vivo. Zusammensetzungen der Erfindung können direkt im Empfänger verwendet werden, um die Erholung zu beschleunigen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können entweder in vitro oder in vivo verwendet werden. Beispielsweise können diese Zusammensetzungen verwendet werden, um hämatopoetische Zellen in Knochenmark vor einer allogenen oder xenogenen Transplantation zu expandieren oder auf andere Weise zu modulieren. Die Behandlung von Subjekten unter Verwendung von Ex-vivo-Techniken, wodurch eine Expansion von relativ undifferenzierten Zellen aus dem Blutstrom bewirkt wird, kann ebenfalls verwendet werden. Die Zusammensetzungen der Erfindung können auch für eine In-vivo-Verabreichung formuliert werden.
Wenn eine Ex-vivo-Verabreichung verwendet wird, können entweder Knochenmark oder peripheres Blut (einschließlich Nabelschnurblut) oder beide direkt mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in Kontakt gebracht werden, oder Fraktionen dieser Materialien können behandelt werden, solange die Fraktionen geeignete Ziel-Vorläuferzellen enthalten.
Die Verbindungen können für die Injektion, für die orale Verabreichung oder für alternative Verabreichungsverfahren, wie die transmukosale oder transdermale Verabreichung, formuliert werden. Die Injektion kann auf intravenösem, intraperitonealem, intramuskulärem oder irgendeinem anderen herkömmlichen Weg stattfinden.
Der Prozentsatz des aktiven Verbindungs-Bestandteils (oder an einer Mischung von Verbindungen) in der Formulierung kann über einen großen Bereich variieren, wie von etwa 0,5 % Gew./Gew. bis etwa 95 % Gew./Gew. oder bis zu 100 %. Der bevorzugte Prozentsatz des aktiven Bestandteils hängt von der Natur der Formulierung als solcher ab. So kann eine "pharmazeutische Zusammensetzung" einer Verbindung der vorliegenden Erfindung beispielsweise nur die Verbindung oder die Verbindung und andere (vorzugsweise nicht-toxische) Komponenten enthalten. Der bevorzugte Prozentsatz des aktiven Bestandteils hängt von der Natur der Formulierung als solcher ab. Zusätzlich können die Zusammensetzungen der Erfindung mit anderen vorteilhaften Mitteln, wie Immunstimulantien oder Wachstumsfaktoren, gemischt oder zusätzlich zu diesen verwendet werden.
Die erforderliche Dosierung hängt von der Natur des Subjekts, der Natur des Zustands, der Verabreichungsweise und der Beurteilung des behandelnden Arztes oder Tierarztes ab. Geeignete Dosierungsbereiche werden gemäß diesen Parametern eingestellt. Im Allgemeinen liegen typische Dosen pro Patient im Bereich von 0,1–100 mg/kg pro Tag über 10–40 Tage, bevorzugter 1–10 mg/kg pro Tag über 14–28 Tage. Diese Bereiche sind lediglich erläuternd, und die korrekte Dosierungsoptimierung kann durch Routineverfahren bestimmt werden.
Wenn die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen als Schutzmittel im Hinblick auf eine chemotherapeutische Behandlung verabreicht werden, kann der Zeitpunkt der Verabreichung ebenfalls relevant sein. Der Zeitpunkt hängt jedoch von der Natur des verwendeten chemotherapeutischen Mittels ab. Es liegt klar innerhalb des üblichen Fachwissens, einen geeigneten Zeitpunkt für das spezielle verwendete chemotherapeutische Mittel zu bestimmen.
Es werden Diester gewählt, die vorzugsweise eine höhere Zahl von C-Atomen in mindestens einer Estergruppe aufweisen und die eine niedrigere Hydrolysegeschwindigkeit und eine höhere Halbwertszeit in tierischem oder menschlichem Plasma zeigen, z.B. C16/C2- gegenüber dem entsprechenden C2/C2-Diester. Ähnlich kann ein Diester mit einer höheren Zahl von C-Atomen in mindestens einer Estergruppe gewählt werden (wie der C16/C2-Diester), der eine erhöhte Modulation der Hämatopoese von tierischen oder menschlichen Zellen im Vergleich zu dem entsprechenden Diester mit einer niedrigeren Zahl von Estergruppen-C-Atomen (wie dem C2/C2-Diester) zeigt.
Die Beispiele, die folgen, dienen dazu, diese Erfindung zu erläutern. Weitere Beispiele für spezielle Verbindungen sind im oben erwähnten U.S. Patent Nr. 5,955,432 angegeben, und andere hierin beschriebene Verbindungen können auf analoge Weise verwendet werden. Die Beispiele sollen auf keine Weise den Bereich dieser Erfindung beschränken, sondern werden bereitgestellt, um zu zeigen, wie die Verbindungen dieser Erfindung herzustellen und zu verwenden sind. In den folgenden Beispielen sind alle Temperaturen in Grad Celsius und zeigt RT Raumtemperatur an. Glutathion-Analoga können durch typische, in der Technik wohlbekannte synthetische organische Verfahren hergestellt werden, wie diejenigen, die in der US 5,786,336 beschrieben sind. In einigen Fällen können Schutzgruppen eingeführt und schließlich entfernt werden. Geeignete Schutzgruppen für Amino-, Hydroxy-, Carboxylgruppen sind in Greene et al., "Protective Groups in Organic Synthesis", Zweite Auflage, John Wiley and Sons, New York, 1991, beschrieben. Die Aktivierung der Carbonsäure kann unter Verwendung einer Anzahl von verschiedenen Reagenzien erzielt werden, wie in Larock, "Comprehensive Organic Transformations", VCH Publishers, New York, 1989, beschrieben.
Die Herstellung von Lipidemulsionen und Liposomen wird durch in der Technik wohlbekannte Verfahren bewerkstelligt. Hier ist das Sojabohnenöl, das als Glycerid verwendet wird, gereinigtes Sojabohnenöl mit hoher Reinheit (Reinheit von mindestens 99,9 % als Triglycerid, Diglycerid und Monoglycerid). Das Phospholipid ist gereinigt, wie Eigelb-Lecithin oder Sojabohnen-Lecithin, welche durch ein Abtrennungsverfahren mittels eines gewöhnlichen organischen Lösungsmittels hergestellt werden können. Im Allgemeinen werden vorbestimmte Mengen an Sojabohnenöl, Lipid, einem Glutathion-Analogon und anderen Zusätzen, wie oben erwähnt, gemischt und erwärmt, um eine Lösung zu bilden, und mittels eines gewöhnlichen Homogenisierers (wie eines Homogenisierers vom Druckstrahl-Typ oder eines Ultraschall-Homogenisierers) bei einer Temperatur von 25 bis 90°C einer Homogenisierungsbehandlung unterzogen, um eine Wasser-in-Öl-Dispersion zu erhalten. Dann wird eine erforderliche Menge an Wasser dazugegeben, und die Mischung wird wiederum mittels des obigen Homogenisierers homogenisiert, um sie in eine Emulsion vom Öl-in-Wasser-Typ zu überführen, wodurch die Emulsion der vorliegenden Erfindung hergestellt wird. Abhängig von der Zweckmäßigkeit für die Herstellung können nach der Formulierung der Emulsion Zusätze wie ein Stabilisator oder isotones Mittel zugesetzt werden.
Liposomen können gemäß in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden und sind in Liposome Technology Band III Targeted Drug Delivery and Biological Interaction (1984, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida) beschrieben. Liposomen können auch hergestellt werden, indem man Lipid und die Verbindungen der Formeln A oder I in einem Alkohol/Wasser-Lösungsmittel löst, die Mischung in einem geeigneten Puffer rasch verdünnt, das Produkt durch mindestens ein Filter extrudiert und anschließend das Filtrat lyophilisiert.
Beispiel 1
Herstellung von Glutathion-Analoga
L-Glutaminsäure 1 wird unter Verwendung von Di-t-butyldicarbonat unter basischen Bedingungen geschützt. Die Verbindung 2 wird dann cyclisiert, was durch die Reaktion von Paraformaldehyd und einer katalytischen Menge von p-Toluolsulfonsäure das Oxazolidinon 3 ergibt.
Das Zwischenprodukt 7 (N-a-t-Boc-a-Ethyl-g-glutamyl-S(benzyl)cysteinsuccinimidester) ist in dem obigen Reaktionsschema nicht gezeigt.
Die Verbindung 4 wird durch die Reaktion des Oxazolidinons und von R'ONa hergestellt. Der Succinimidester 5 wird durch DCC-Kupplung mit N-Hydroxysuccinimid und der freien Säure 4 hergestellt, welcher dann mit S-Benzyl-L-cystein für die Bildung des geschützten Dipeptids 6 umgesetzt wird. Der Succinimidester wird durch eine DCC-Kupplung hergestellt, und seine Umsetzung mit Phenylglycin liefert das geschützte Tripeptid 8. Die Entfernung der Schutzgruppe und die Veresterung führt zum Endprodukt 9.
Beispiel 2
N-α-t-Boc-L-Glutaminsäure, 2
Zwei 500 g-Portionen L-Glutaminsäure (6,8 Mol) wurden jeweils in 4 l 10 %-igem THF in Wasser suspendiert. Na₂CO₃-Pulver wurde auf pH 9 dazugegeben, was eine klare Lösung zum Ergebnis hatte. Jede Lösung wurde (über die ersten 10 Stunden während der Zugabe des Boc-Anhydrids)auf 40°C erwärmt, und 1 kg Di-t-butyldicarbonat (4,58 Mol) wurden als Feststoff in 50 g-Portionen alle 30 min in jeden Kolben gegeben, während der pH durch Zugabe von Na₂CO₃ bei 9 gehalten wurde. Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Am folgenden Tag wurde ein zusätzliches 1 kg Di-t-butyldicarbonat wie oben dazugegeben. Am Morgen des dritten Tages wurde jede Lösung jeweils mit zweimal 2 l EtOAc extrahiert (es wurde gefunden, dass die Bildung des Butanols die Reaktion nach der Zugabe von 1 Äq des Boc-Anhydrids stoppte und dass die Extraktion mit EtOAc dieses entfernte und die Ausbeute signifikant erhöhte). Die wässrige Schicht wurde gesammelt, und 1 kg Di-t-butyldicarbonat wurde wiederum wie oben dazugegeben (Erwärmen auf 40°C und Zugabe von 500 g/Tag in 50 g-Portionen in jeden Kolben über eine Zeitspanne von zwei Tagen). Die Gesamt-Reaktionszeit betrug vier Tage mit der Zugabe von 4 kg (18,23 Mol) Di-t-butyldicarbonat. Es wurde gefunden, dass die lange Reaktionszeit und das Erwärmen für annehmbare Ausbeuten wesentlich waren. Die Reaktionsmischungen wurden dann zweimal mit jeweils 2 l EtOAc extrahiert. Jede der wässrigen Schichten wurde gesammelt, in einem Eisbad auf 0°C abgekühlt, tropfenweise mit konz. HCl über 30 min (1 Tropfen/s) auf pH 3 angesäuert. (Es wurde gefunden, dass das BocGlu gegenüber diesem Ansäuerungsschritt empfindlich war. Wenn der pH auf zu kleine Werte gebracht wurde oder wenn die HCl zu schnell zugegeben wurde, fand etwas Entfernung der Schutzgruppe statt, und große Mengen Glutaminsäure fielen aus der Lösung aus.) Nach Beendigung der Ansäuerung bildete sich ein weißliches Gel, was durch die großzügige Zugabe von NaCl bis etwas über den Sättigungspunkt der Lösung hinaus verstärkt wurde. Die resultierende Lösung wurde zweimal mit jeweils 2 l EtOAc extrahiert. Die Entfernung des Boc-L-Glu aus der wässrigen Schicht wurde mittels DSC überwacht. Die EtOAc-Schichten wurden vereinigt, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und am Rotationsverdampfer bei 35°C zu einem klaren gelblichen Öl eingedampft. Dieses wurde über Nacht im Vakuum getrocknet, wodurch man 1097,1 g BocGlu (4,44 Mol) erhielt; 65 % Ausbeute.
(S)-t-Butyloxycarbonyl-5-oxo-4-oxazolidinpropansäure, 3
1077 g (4,36 Mol) Boc-L-Glu, 2, wurden unter Erwärmen in 1 l CH₃CN gelöst. Dieses wurde in einen 5 l-Dreihalskolben gegossen. Zu dieser Lösung wurden 3 l Benzol, 196,6 g (6,54 Mol) Paraformaldehyd und 40 g (0,26 Mol) p-Toluolsulfonsäure gegeben. Man stattete die Rundkolben mit zwei Dean-Stark-Apparaturen, zwei Kühlern bei –10°C und einem mechanischen Rührer aus, brachte die Reaktionsmischung auf 70°C und refluxierte 6 Stunden (100 ml Wasser wurden aus den Dean-Stark-Apparaturen gesammelt, was eine vollständige Reaktion anzeigte). Man ließ die Reaktionsmischungen, klare rötlich-braune Lösungen, auf Raumtemperatur abkühlen und dampfte sie am Rotationsverdampfer zu einem rötlich-braunen Öl ein. Das Öl wurde wieder in 2 l Ether gelöst und dreimal mit jeweils 1 l Wasser extrahiert. Die wässrigen Schichten wurden vereinigt und mit 2 l Ether extrahiert, um das Produkt zu entfernen, das im Wasser vorlag. Beide Etherschichten wurden vereinigt, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und am Rotationsverdampfer zu einem klaren gelben Öl eingedampft. Dieses wurde im Vakuum getrocknet, wodurch man 952 g (3,67 Mol), 84,3 % Ausbeute, unreines 3 erhielt.
3 wurde unter Verwendung einer offenen Säule gereinigt, die aus einem groben 3 1-Sinterglastrichter hergestellt war, welcher mit einer 30 cm-Glasverlängerung modifiziert war. 2 kg Baker Silica Gel, 40 μm Flashchromatographie-Packung, wurden mit 4 l CH₂Cl₂ aufgeschlämmt und in die Säule gegossen. Man ließ das Lösungsmittel ablaufen, bis es das Harzbett erreicht hatte. Zusätzliche 2 l CH₂Cl₂ wurden dazugegeben und bis zum Harzbett ablaufen gelassen, was das Siliciumdioxid absetzte. An diesem Punkt wurde die Verbindung, die (unter sanftem Erwärmen) in 750 ml CH₂Cl₂ gelöst worden war, in die Säule gegossen, und man ließ das Lösungsmittel ablaufen. Als der Lösungsmittelpegel das Harzbett erreicht hatte, wurde ein zusätzlicher 1 l CH₂Cl₂ dazugegeben und ablaufen gelassen, um das Beladen mit dem Produkt zu vervollständigen. Es wurde dann mit 20 l CH₂Cl₂ eluiert und in 400 ml-Fraktionen gesammelt. Es wurde zu einem Öl eingedampft und unter Hochvakuum zu einem weißlich-gelben Schaum getrocknet; 745,7 g (2,88 Mol), 66,2 % Ausbeute, wurden erhalten.
N-α-t-Boc-L-Glutaminsäure-α-ethylester, 4
150 g Natrium-Stäbe (6,5 Mol) wurden in einen Behälter mit 500 ml Toluol gegeben, der Oberflächenüberzug wurde abgekratzt und dünne Quadrate wurden abgeschnitten. Eine 50 g-Portion der Quadrate wurde in einen tarierten Behälter mit 100 ml Toluol eingewogen, das Toluol wurde abgegossen, und das Natrium wurde unter einem N₂-Strom in 3 l reines Ethanol bei 0°C gegeben. Nachdem die Blasenbildung aufgehört hatte, wurde eine weitere 50 g-Portion wie oben präpariert und dazugegeben. Dies wurde wiederholt, bis die gesamten 200 g dazugegeben waren. Die Lösung wurde dann unter N₂ über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, was eine viskose klare Lösung zum Ergebnis hatte. 745,7 g (2,88 Mol) 3 wurden (unter Erwärmen) in 3 l reinem EtOH gelöst und in einen 5 l-Dreihalsrundkolben gegeben, der mit einem mechanischen Rührer ausgestattet war. Zu dieser Lösung wurde unter Verwendung eines Druckausgleich-Tropftrichters unter einem N₂-Strom das NaOEt getropft (1 Tropfen/s). Die Reaktion wurde über Nacht gerührt, was eine gelblich-weiße Lösung mit einer großen Menge eines weißen Niederschlags erzeugte. Die Reaktionsmischung wurde in einem Eisbad auf 0°C abgekühlt, und konz. HCl wurde auf pH 9 (der pH war 13 nach der Reaktion) dazugetropft (1 Tropfen/s). 6 l Wasser wurden dazugegeben, was eine klare Lösung erzeugte. Diese wurde zweimal mit jeweils 3 l einer 1:1-Mischung von Ether:Petrolether extrahiert. Die wässrige Schicht wurde gesammelt, in einem Eisbad auf 0°C abgekühlt, und unter Rühren wurde HCl auf pH 3 dazugetropft (1 Tropfen/s). Die angesäuerte Lösung wurde zweimal mit jeweils 3 l Ether extrahiert. Die Etherschichten wurden vereinigt, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und zu einem klaren gelben Öl eingedampft. Dieses wurde unter Hochvakuum getrocknet, was 609 g (2,11 Mol), 73,5 % Ausbeute, ergab.
N-α-t-Boc-L-Glutaminsäure-α-ethylester-γ-succinimidester, 5
609 g (2,11 Mol) N-α-t-Boc-L-Glutaminsäure-α-ethylester 4 und 280,4 g N-Hydroxysuccinimid (2,43 Mol) wurden in 3 l CH₂Cl₂ in einem 5 l-Dreihalsrundkolben gelöst, welcher mit einem mechanischen Rührer ausgestattet war. 547,1 g N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (2,65 Mol) wurden in 500 ml CH₂Cl₂ gelöst und unter einem N₂-Strom unter Rühren dazugetropft. Zusätzliche 50 g DCC (0,24 Mol) wurden in 100 ml CH₂Cl₂ gelöst und zu der Reaktionsmischung getropft und über Nacht gerührt. DSC zeigte eine vollständige Reaktion. Der DCC-Harnstoff wurde aus der Reaktionsmischung abfiltriert, und das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer zu einem Öl eingedampft und unter Hochvakuum zu einem Schaum getrocknet; 1042,7 g (2,81 Mol) rohes 5 wurden erhalten.
5 wurde unter Verwendung der offenen Säule gereinigt, die für die Reinigung von 3 verwendet worden war. 1,5 kg Baker Silica Gel, 40 μm Flashchromatographie-Packung, wurden in 4 l CH₂Cl₂ aufgeschlämmt und in die Säule gegossen. Man ließ dies ablaufen, bis der Lösungsmittelpegel das Harzbett erreicht hatte. Zusätzliche 2 l CH₂Cl₂ wurden dazugegeben und zum Harzbett ablaufen gelassen, um das Siliciumdioxid zu packen. Als der Lösungsmittelpegel das obere Ende des Harzbettes erreicht hatte, wurde die Verbindung, die (unter sanftem Erwärmen) in 750 ml CH₂Cl₂ gelöst worden war, in die Säule gegossen, und man ließ sie sich durch Schwerkraft auf die Säule laden. Als das Lösungsmittel das Harzbett erreicht hatte, wurde 1 l CH₂Cl₂ dazugegeben und ablaufen gelassen, um die Beladung mit dem Produkt zu vervollständigen. Das Produkt wurde mit 20 l CH₂Cl₂ eluiert und in 400 ml-Aliquoten gesammelt. Fraktionen wurden zu einem Öl eingedampft und unter Hochvakuum zu einem Schaum getrocknet; 853 g (2,28 Mol), 108,0 % Ausbeute (man bemerke die Reinheit im Nachtrag Nr. 5), wurden erhalten.
N-α-t-Boc-α-Ethyl-γ-glutamyl-S(benzyl)-L-cystein, 6
465 g (2,2 Mol) S(Benzyl)-L-cystein wurden in 4 l einer 20 % THF- und Wasser-Lösung aufgeschlämmt. Na₂CO₃-Pulver wurde unter magnetischem Rühren auf pH 9 in die Lösung gegeben. Dies erzeugt eine teilweise gelöste Aufschlämmung. 853 g (2,28 Mol) 5 wurden unter sanftem Erwärmen in 1,5 l THF gelöst. Dies wurde zu der gerührten Lösung getropft (2 Tropfen/s), während der pH mit Na₂CO₃ bei 9 aufrechterhalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde zweimal mit jeweils 2 l 1:1 Ether:Petrolether extrahiert. DSC wurde überprüft, um sicherzustellen, dass das Produkt aufgrund der großen THF-Menge in der Wasserphase verblieb. Die wässrige Phase wurde abgetrennt und in einem Eisbad auf 0°C abgekühlt. Konzentrierte Salzsäure wurde dazugetropft, während die Lösung magnetisch gerührt wurde, bis der pH 3 erreicht hatte. Der erzeugte ölige Niederschlag wurde dann mit zwei 2 l-Portionen Ether extrahiert. Die Etherschichten wurden vereinigt, auf Na₂SO₄ gegossen, filtriert, zu einem Öl eingedampft und unter Hochvakuum zu einem Schaum getrocknet, was 895,8 g (1,91 Mol), 90,4 % Ausbeute, ergab.
N-α-t-Boc-α-Ethyl-L-γ-glutamyl-L-S(benzyl)cysteinsuccinimidester, 7
895 g (1,91 Mol) 6 und 240,6 g N-Hydroxysuccinimid (2,09 Mol) wurden in 3 l CH₂Cl₂ in einem 5 1-Dreihalsrundkolben gelöst, der mit einem mechanischen Rührer ausgerüstet war. 472,5 g N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (2,29 Mol) wurden in 500 ml CH₂Cl₂ gelöst und unter Rühren unter einem N₂-Strom dazugetropft (2 Tropfen/s). Nach 5 Stunden zeigte ein DSC eine beträchtliche Menge an Ausgangsmaterial. Zusätzliche 50 g (0,24 Mol) DCC wurden in 50 ml CH₂Cl₂ gelöst und zu der Reaktionsmischung getropft und über Nacht gerührt. DSC zeigte eine vollständige Reaktion. Der DCC-Harnstoff wurde aus der Reaktionsmischung abfiltriert, und das Filtrat wurde auf 1 l eingedampft. Ether wurde bis zum Trübungspunkt dazugegeben, und die Lösung wurde in einem Eisbad auf 0°C abgekühlt. Nach Kratzen begannen sich Kristalle zu bilden. Kleine Ethermengen wurden dazugegeben, um den Trübungspunkt aufrechtzuerhalten und das Produkt aus der Lösung zu drängen. Die Lösung wurde über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Die Kristalle wurden durch Filtration gesammelt und unter Hochvakuum getrocknet; 953 g (1,67 Mol), 87,4 % Ausbeute, wurden erhalten.
N-α-t-Boc-α-Ethyl-L-γ-glutamyl-L-S(benzyl)cystenyl-R-phenylglycin, 8
253 g (1,67 Mol) (R)-(–)-Phenylglycin wurden in 4 l einer 20 % THF- und Wasser-Lösung aufgeschlämmt. Na₂CO₃-Pulver wurde auf pH 9 zu der magnetisch gerührten Lösung gegeben, was eine teilweise gelöste Aufschlämmung erzeugte. 359 g (1,67 Mol) 7 wurden unter sanftem Erwärmen in 1,5 l THF gelöst. Dies wurde zu der gerührten Lösung getropft (2 Tropfen/s), während der pH durch Zugabe von Na₂CO₃ bei 9 aufrechterhalten wurde. Die Reaktion wurde 6 Stunden gerührt, was eine klare gelblichorange Lösung zum Ergebnis hatte. Die Reaktionsmischung wurde zweimal mit jeweils 2 l 1:1 Ether:Petrolether extrahiert. DSC wurde überprüft, um sicherzustellen, dass das Produkt aufgrund der großen THF-Menge in der wässrigen Schicht verblieb. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt und in einem Eisbad auf 0°C abgekühlt. Während die Lösung magnetisch gerührt wurde, wurde Salzsäure (konz.) dazugetropft (1 Tropfen/s), bis der pH 3 erreicht hatte. Das Produkt wurde dann zweimal mit jeweils 2 l Ether extrahiert. Die Etherschichten wurden vereinigt, auf Na₂SO₄ gegossen, filtriert, zu einem Öl eingedampft und unter Hochvakuum zu einem Schaum getrocknet, was 853 g (1,45 Mol), 86,8 % Ausbeute, lieferte.
γ-Glutamyl-S(benzyl)cysteinyl-R-phenylglycindiethylester-Hydrochlorid, 9
767,5 g (1,26 Mol) 8 wurden in zwei Portionen aufgeteilt und jeweils in 2,4 l reinem EtOH in 5 1-Dreihalsrundkolben gelöst, die mit mechanischen Rührern ausgestattet waren. Jede Lösung wurde in ein Eisbad gegeben und auf 0°C abgekühlt, während man unter einem Argonstrom rührte. 385 ml (6,32 Mol) (CH₃)₃SiCl wurden zu jeder Lösung getropft (1 Tropfen/s), während die Temperatur bei 0°C aufrechterhalten wurde. Nachdem das (CH₃)₃SiCl dazugegeben war (2,5 h), wurden die Reaktionen aus ihren Eisbädern genommen und sich auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Die Reaktionen werden über Nacht gerührt. Nach 18 Stunden werden die Reaktionsmischungen zu einer weißen festen Masse. Der Feststoff wird dann zerbrochen, um eine Aufschlämmung zu bilden, und jede wird bei 30°C am Rotationsverdampfer auf ein Volumen von jeweils 2 l eingedampft. Während man heftig mit den mechanischen Rührern rührt, werden 2 l wasserfreier Ether über eine Zeitspanne von 2,5 Stunden bei Raumtemperatur zu jeder Aufschlämmung getropft (1 Tropfen/s). Das unlösliche Material wurde durch Filtration gesammelt. Die Filterkuchen werden über Nacht unter Hochvakuum getrocknet, was eine vereinigte Gesamtmenge von 312,8 g 9 liefert. Diese 312,8 g wurden unter Rühren in 7 l heißem CH₃CN (79°C) gelöst, heiß filtriert, um unlösliches Material zu entfernen, und man ließ das Filtrat sich auf Raumtemperatur abkühlen. Als die Lösung abkühlte, begannen sich kleine weiße nadelartige Kristalle zu bilden, und als sie Raumtemperatur erreichte, verfestigte sie sich zu einer festen Masse. Diese wurden zerbrochen, und der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt. Der Filterkuchen wurde 16 Stunden unter Hochvakuum über NaOH-Plätzchen getrocknet. Das getrocknete Material betrug 277,0 g (0,49 Mol), eine Ausbeute von 38,8 % wurde erhalten. Die Verbindungen 10, 11 und 13 werden auf ähnliche Weise erhalten. Die Verbindung 12 wird aus der Verbindung 8 nach Entfernung der t-Boc-Gruppe durch Spaltung mit konzentrierter HCl erhalten.
Tabelle 1 Beschreibung der Substituenten R1, R2 und R3 in den Verbindungen 9–13
Beispiel 3
Herstellung von Lipid-Mikrokügelchen
30 mg 9, 10 g gereinigtes Sojabohnenöl und 1,8 g gereinigtes Eigelb-Lecithin wurden zusammengegeben, und die Mischung wurde unter Erwärmen mittels eines Homogenisierers geschmolzen. Dann wurden 2,21 g Glycerol und genügend destilliertes Wasser dazugegeben, um das Volumen auf 100 ml zu bringen (etwa 90 ml), gefolgt von einer rohen Emulgierung mittels eines Homogenisierers. Das Produkt wird dann weiter mittels eines Manton-Gaulin-Homogenisierers emulgiert. Die Lösung wird dann durch ein 1,2 μm-Filter geleitet, um eine Endemulsion mit etwa 220 nm-Teilchen zu 300 μg/ml zu liefern. Auf ähnliche Weise werden Lipid-Mikrokügelchen, welche die Verbindungen 10 bis 12 enthalten, hergestellt.
Tabelle 2 Gemessene Merkmale der Lipid-Mikrokügelchen
Die in der obigen Tabelle 2 mitgeteilte Abnahme von K₁ ist eine Anzeige für eine erhöhte Bioverfügbarkeit der Glutathion-Analoga der Erfindung. Abwandlungen und Modifikationen der oben beschriebenen Erfindung sind natürlich möglich. Demgemäß ist die vorliegende Erfindung nicht auf die Ausführungsformen beschränkt, die vorstehend in mehr Einzelheit beschrieben wurden.
Beispiel 4 Liposomen-Herstellungsverfahren
Falls nicht anders angegeben, wird das folgende allgemeine Verfahren verwendet, um die Lipidformulierung herzustellen: (i) 1573 mg Verbindung 9, 3146 mg Ei-Phosphatidylcholin (EPC) und 3146 mg Ei-Phosphatidylglycerol (EPG) werden in 14,3 ml wasserfreiem Methanol und 2,2 ml H₂O durch Mischen bei Umgebungstemperatur gelöst; (ii) die Lösung wird unter Verwendung einer 20 Gauge- Nadel in eine 30 ml Spritze aufgenommen und direkt (innerhalb 1 Minute) in 80,9 ml gerührte 370 mM Saccharose gespritzt, um multilamellare Vesikel (MLVs) zu bilden; (iii) 2,5 ml 1 M Citrat (pH 4,0) werden zu dem gerührten Puffer gegeben; (iv) die Lösung wird unter Verwendung eines 100 ml-EXTRUDER (Lipex Biomembranes, Vancouver, Kanada) zehnmal durch zwei gestapelte 80 nm-Polycarbonat-Filter extrudiert, um unilamellare Vesikel zu bilden; (v) Leiten durch 0,22 μm-Filter, um zu sterilisieren; und (vi) Lyophilisieren, um Wasser und Ethanol zu entfernen. Der Lyophilisierungs-Zyklus beinhaltete ein rasches Einfrieren der Probe (2,5 ml-Füllung eines 10 ml-Fläschchens) auf eine Probentemperatur von –50°C, gefolgt von einer Lyophilisierung über 42 Stunden bei einer Schalentemperatur von –35°C, um primäres Wasser zu entfernen, und über 2 Stunden bei 20°C, um sekundäres Wasser zu entfernen.
Unter Verwendung eines Nicomp Particle Sizer (Modell 270) wurde eine quasielastische Lichtstreuung (QELS) bei den Proben durchgeführt, um die durchschnittliche Vesikelgröße zu bestimmen. Der Grad der Arzneistoffeinverleibung (% Einkapselung) in die Vesikel wird unter Verwendung von zwei unabhängigen Ansätzen bestimmt. Im ersten Ansatz werden 0,1 ml Formulierung auf eine 1,0 ml-Tuberkulin-Spritze gegeben, die hydratisiertes Sephadex G-50 enthält; die Probe wird 5 min bei 2.000 U/min in einer Labortisch-Zentrifuge zentrifugiert, und die Vesikel werden in dem Hohlraumvolumen gewonnen (> 70 %). Nicht-verkapselter oder gefällter Arzneistoff wird durch dieses Verfahren entfernt und verbleibt auf der Gelfiltrationssäule. Der Einkapselungsgrad (%) wird aus dem Arzneistoff/Lipid-Verhältnis vor und nach der Säulenchromatographie berechnet. Ein zweiter Ansatz beruht auf der Abtrennung der Liposomen von nicht-verkapseltem Arzneistoff durch Zentrifugation durch Mikron 30-Filter mit einem MG-Rückhaltevermögen von 30.000 Dalton (Amicon). Der Einkapselungsgrad (%) wird aus 1 – ([Freier Arzneistoff]/[Gesamter Arzneistoff]) * 100 berechnet.
Beispiel 5 Formulierung von 9 in Lipiden unter Verwendung einer Verdünnung aus Ethanol
Die in der nachstehenden Tabelle 3 wiedergegebenen Ergebnisse fassen die Einverleibung von 9 in mehrere Lipidformulierungen als Funktion des Arzneistoff/Lipid-Verhältnisses und der Lipid-Zusammensetzung zusammen. Die Verdünnung der Ethanol-Lösung in einem Saccharose-Puffer hat die spontane Bildung von Liposomen (als multilamellare Vesikel, MLVs, bezeichnet) zur Folge, die relativ groß (durchschnittlicher Durchmesser von 700 nm), heterogen sind, aber keinen sichtbaren Lipid- oder Arzneistoff-Niederschlag enthalten. Die MLVs können unter Verwendung eines EXTRUDER (Lipex Biomembranes, Vancouver, Kanada) (5–10 x) durch gestapelte Polycarbonat-Filter (Porengröße 80 nm) geleitet werden. Dieses Verfahren entfernt die ausgefallene Form des Arzneistoffs (< 2 %) und verringert die Vesikelgröße auf einen durchschnittlichen Durchmesser von 140 nm (+/– 20 nm).
Tabelle 3 Einverleibung der Verbindung 9 in Liposomen durch Ethanol-Verdünnung
Beispiel 6 Effekt der Lyophilisierung und Vesikelgröße
Die in der nachstehenden Tabelle 4 wiedergegebenen Ergebnisse fassen die Beziehung zwischen Lyophilisierungsbedingungen und der resultierenden Vesikelgröße und des Grades der Arzneistoffeinkapselung zusammen. Falls nicht anders angegeben, wurden die Vesikel wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt, steril filtriert und in 2,5 ml-Aliquoten in Fläschchen abgefüllt. Die Fläschchen wurden anschließend auf eine Probentemperatur von –50°C über eine ausreichende Zeit eingefroren, um die Probentemperatur auf die Gestelltemperatur zu verringern. Die Proben wurden dann in Anwesenheit eines Vakuums (50 bis 200 mTorr) über eine ausreichende Zeitspanne der angegebenen Gestelltemperatur, um das primäre Wasser zu entfernen (24 bis 48 Stunden), und anschließend über 2–6 Stunden Umgebungstemperatur ausgesetzt.
Tabelle 4 Einfluss der verschiedenen Lyophilisierungs-Zyklen auf Liposomen mit Verbindung 9
Beispiel 7 Einfluss des Arzneistoff/Lipid-Verhältnisses auf den Einkapselungsgrad
Die in der nachstehenden Tabelle 5 wiedergegebenen Ergebnisse fassen den Einfluss des anfänglichen Arzneistoff/Lipid-Verhältnisses auf den Einkapselungsgrad zusammen. Die Verbindung 9 kann bei einem Arzneistoff/Lipid-Verhältnis von bis zu 0,33 (Gew./Gew.) wirksam in EPC/EPG-Liposomen eingekapselt werden.
Tabelle 5 Einkapselung von Verbindung 9 in EPC/EPG-Liposomen als Funktion des Arzneistoff/Lipid-Verhältnisses
Beispiel 8 Vesikelgrößen-Stabilität
Bei allen überprüften Ansätzen wurde der Einkapselungsgrad durch Lagerung bei 2–8°C bis zu 48 Stunden nicht beeinflusst, wie in der nachstehenden Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6 Stabilität der Vesikelgröße nach Extrusion als Funktion des Ethanol-Gehalts
Beispiel 9 Auswirkung der Lyophilisierungszeit auf die Einkapselung
Die in der nachstehenden Tabelle 7 wiedergegebenen Ergebnisse fassen den Einfluss der Lyophilisierungsbedingungen auf die Einkapselungseffizienz, Viskosität und Größe einer EPC/EPG-Formulierung mit Verbindung 9 zusammen.
Tabelle 7 Einfluss des primären Lyophilisierungs-Zyklus auf die Einkapselung, Vesikelgröße und Viskosität von EPC/EPG-Formulierungen mit Verbindung 9
Beispiel 10 Rattenmodell von durch Chemotherapie induzierter Neutropenie
Verbindung 9, die wie in Beispiel 4 beschrieben formuliert war, beschleunigte die Erholung von durch Chemotherapie induzierter Neutropenie bei Ratten. Männlichen CD-Ratten (250–300 g) wurden intraperitoneal entweder der antineoplastische Arzneistoff Fluoruracil (125 mg/kg) oder ein äquivalentes Volumen von dessen Vehikel (Kochsalzlösung) injiziert. Beginnend am Tag nach der Fluoruracil-Injektion wurden jeder mit Fluoruracil behandelten Ratte 8 tägliche intravenöse Injektionen von entweder Verbindung 9 (35 mg/kg, n = 4), G-CSF (10 μg/kg, n = 5) oder Vehikel (Kochsalzlösung, n = 4) injiziert. Ratten, denen ursprünglich Kochsalzlösung anstelle von Fluoruracil injiziert wurde, erhielten Kochsalzlösung intravenös (n = 7). Vor dem Fluoruracil und alle 1 bis 2 Tage danach über 14 Tage wurden Blutproben zur Messung der Neutrophilen-Konzentrationen entnommen. Die beschleunigte Erholung von durch Fluoruracil induzierter Neutropenie durch Liposomen-formulierte Verbindung 9 ist in 1 gezeigt.
Beispiel 11 Auswirkung der Verbindung 9 auf normale Ratten
Die Verbindung 9, wie in Beispiel 4 beschrieben, (35 mg/kg, i.v.) erhöhte auch die zirkulierende Neutrophilen-Konzentrationen in normalen Ratten (B). Männlichen CD-Ratten (250–300 g) wurden 5 tägliche intravenöse Injektionen von entweder Verbindung 9 (35 mg/kg, n = 9), G-CSF (10 μg/kg, n = 4) oder Vehikel (Kochsalzlösung, n = 11) verabreicht. Es wurden täglich Blutproben zur Messung der Neutrophilen-Konzentrationen entnommen. Die Erhöhung der zirkulierenden Neutrophilen-Konzentrationen durch Lipid-formulierte Verbindung 9 bei der normalen Ratte ist in
2 gezeigt.

Claims

Lipid-Formulierung enthaltend eine Verbindung, welche ist: (i) ein Diester einer Verbindung der Formel A
in der: jeder Ester 1–25 C ist; YCO für γ-Glu oder β-Asp steht; G* Phenylglycin ist; Z für CH₂, O oder S steht; und X ein Kohlenwasserstoffrest ist, der Alkyl (6–8 C), Benzyl oder Naphthyl ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz derselben; oder (ii) eine Verbindung der Formel I
in der: R₁ und R₂ jeweils unabhängig lineares oder verzweigtes Alkyl (1–25 C), Cycloalkyl (6–25 C), Heterocyclus (6–20 C), Ether oder Polyether (3–25 C) sind oder R₁-R₂ zusammen 2 – 20 C-Atome aufweisen und einen Makrocyclus mit dem Rest der Formel I bilden; und X wie oben für die Formel A definiert ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz derselben; wobei die Lipide der Lipid-Formulierung Ei-Phosphatidylcholin und Ei-Phosphatidylglycerin in einem Gewichtsverhältnis von 0,75 – 1,25:0,75 – 1,25 umfassen.
Lipid-Formulierung nach Anspruch 1, in der die Verbindung γ-Glutamyl-S(benzyl)cysteinyl-R-phenylglycindiethylester oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben ist.
Lipid-Formulierung nach Anspruch 1 oder 2, in der das Gewichtsverhältnis von Lipiden zu Verbindung 3,5 – 4,5:0,5 – 1,5 beträgt.
Lipid-Formulierung nach Anspruch 3, in der das Gewichtsverhältnis von Lipiden zu Verbindung 3:1 – 6:1 beträgt.
Lipid-Formulierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, in der die Formulierung eine liposomale Formulierung ist.
Lipid-Formulierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, mit (i) einem mindestens 50%-igen Einkapselungsgrad der Verbindung; und (ii) einer durchschnittlichen Vesikelgröße von 50 – 2000 nm.
Lipid-Formulierung nach Anspruch 6, in der der Einkapselungsgrad über 80% liegt.
Lipid-Formulierung nach den Ansprüchen 6 oder 7, in der die Vesikelgröße 400 – 600 nm beträgt.
Lipid-Formulierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, die eine liposomale Formulierung ist, die aus 1 Gewichtsteil Verbindung, 2 Gewichtsteilen Ei-Phosphatidylcholin, 2 Gewichtsteilen Ei-Phosphatidylglycerin und 7 Gewichtsteilen Saccharose zusammengesetzt ist.
Lipid-Formulierung nach Anspruch 9, die lyophilisierte Liposomen umfasst, welche aus 1 Gewichtsteil γ-Glutamyl-S(benzyl)cysteinyl-R-phenylglycindiethylester oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz desselben, 2 Gewichtsteilen Ei-Phosphatidylcholin, 2 Gewichtsteilen Ei-Phosphatidylglycerin und 7 Gewichtsteilen Saccharose zusammengesetzt sind.
Lipid-Formulierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, die durch Extrusion hergestellt wird.
Verfahren zur Herstellung einer Lipid-Formulierung, die eine Verbindung enthält, welche: (i) ein Diester einer Verbindung der Formel A
in der: jeder Ester 1–25 C ist; YCO für γ-Glu oder β-Asp steht; G* Phenylglycin ist; Z für CH₂, O oder S steht; und X ein Kohlenwasserstoffrest ist, der Alkyl (6–8 C), Benzyl oder Naphthyl ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz derselben; oder (ii) eine Verbindung der Formel I
in der: R₁ und R₂ jeweils unabhängig lineares oder verzweigtes Alkyl (1–25 C), Cycloalkyl (6–25 C), Heterocyclus (6–20 C), Ether oder Polyether (3–25 C) sind oder R₁-R₂ zusammen 2–20 C-Atome aufweisen und einen Makrocyclus mit dem Rest der Formel I bilden; und X wie oben für die Formel A definiert ist; oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz derselben; ist, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Verbindung in eine Lipid-Zusammensetzung formuliert, die Ei-Phosphatidylcholin und Ei-Phosphatidylglycerin in einem Gewichtsverhältnis von 0,75 – 1,25:075 – 1,25 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, in dem die Verbindung γ-Glutamyl-S(benzyl)cysteinyl-R-phenylglycindiethylester oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, in dem die Formulierung eine liposomale Formulierung ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 12 bis 14, weiter umfassend eine Extrusion.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 12 bis 15, weiter umfassend eine Lyophilisierung.
Verfahren nach Anspruch 16, welches umfasst, dass man 1 Teil γ-Glutamyl-S(benzyl)cysteinyl-R-phenylglycindiethylester oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz desselben, 2 Teile Ei-Phosphatidylcholin und 2 Teile Ei-Phosphatidylglycerin in Ethanol/Wasser löst, die Lösung in Wasser einspritzt, das 7 Teile Saccharose enthält, extrudiert, um eine liposomale Formulierung zu bilden, und die liposomale Formulierung lyophilisiert, um lyophilisierte Liposomen zu bilden.
Verwendung der Lipid-Formulierung nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11 bei der Herstellung eines Medikaments für die Modulation der Hämatopoese und zum Schutz gegen die destruktiven Auswirkungen einer Chemotherapie.